JP6886188B2

JP6886188B2 - 白血病細胞増殖抑制用組成物

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Publication number: JP6886188B2
Application number: JP2018130591A
Authority: JP
Inventors: 飯塚　博; 博飯塚; 久保田　真; 真久保田; 幸子小早川
Original assignee: 野田食菌工業株式会社
Priority date: 2018-07-10
Filing date: 2018-07-10
Publication date: 2021-06-16
Anticipated expiration: 2038-07-10
Also published as: JP2020007273A

Description

本発明は、シイタケ菌糸体培養培地抽出物又は該抽出物中に含まれる脂溶性成分を有効成分とする白血病細胞増殖抑制用組成物に関する。

我が国において、癌は、１９８１年より死因の第１位であり、２０１５年には、年間約３７万人が亡くなっている。生涯のうちに、約２人に１人が罹患すると推計され、癌は、国民の生命と健康にとって重大な問題である。

白血病は、他の臓器で言う所の「癌」であって、血液を構成する細胞の異常増殖をきたす疾患である。癌による死因として依然として高い比率を占めているので、予防や治療に用いられ得る細胞の異常増殖を抑制する組成物の開発が望まれており、その安全性の面からも、食用としても摂取できるものを有効成分とすることが望まれている。

食用としても摂取できるものを有効成分とする癌細胞増殖抑制用組成物としては、例えば、特許文献１には、クマザサエキス、プロポリスエキス、霊芝エキス、大豆エキスからなる群から選択される少なくとも１種以上の食品素材を含有し、癌細胞増殖抑制機能を有する抗癌剤が記載されている。

また、特許文献２には、クロカワのレクチンであって、所定の特徴を有するクロカワ由来のレクチンが記載されている。

さらに、特許文献３には、白色ないし黄色鹿角霊芝の子実体から得られ、ヒトに対して生理活性を有する物質を含有する熱水抽出物であって、抗腫瘍効果を有するものが記載されている。

さらにまた、特許文献４には、クロレラ及び／又はスピルリナを含有する原料から調製された培地で、椎茸又はマンネン茸の菌糸体を培養して得られた培養物又は該培養物から調製された抽出物を有効成分として含有することを特徴とする抗癌剤が記載されている。

一方、慢性骨髄性白血病(CML)、KIT (CD117) 陽性消化管間質腫瘍(GIST)、フィラデルフィア染色体陽性急性リンパ性白血病(ALL)などの治療に有効な抗癌剤として、イマチニブが知られている。

特開２００３−１９２６０３号公報特開２００３−２４６７９９号公報特開２０１０−４３０１７号公報特許第５０８１４８５号公報

イマチニブは、特に白血病細胞に対する増殖抑制効果に優れているが、継続的に摂取しているうちに、イマチニブに対して耐性を有する白血病細胞ができてしまい、その効果が持続しにくいという課題があった。上記のような白血病細胞増殖抑制用組成物が報告されているが、新たな有効成分を提供できれば需要者に選択の幅が広がる。

したがって、本発明の目的は、イマチニブに対して耐性を有する白血病細胞に対しても増殖抑制効果を示し、イマチニブと併用することによって、白血病細胞の増殖抑制効果を持続できるようにした白血病細胞増殖抑制用組成物を提供することにある。

本発明者らは、上記目的を達成するため、鋭意研究した結果、シイタケ菌糸体培養培地抽出物又は該抽出物中に含まれる脂溶性成分が、イマチニブに対して耐性を有する白血病細胞に対しても増殖抑制効果を示すこと、またイマチニブと併用することによって白血病細胞の増殖抑制効果を持続できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明の１つは、イマチニブ耐性白血病細胞に対する増殖抑制用組成物であって、シイタケ菌糸体培養培地抽出物又は該抽出物中に含まれる脂溶性成分を有効成分とすることを特徴とする白血病細胞増殖抑制用組成物を提供するものである。上記白血病細胞増殖抑制用組成物によれば、イマチニブ耐性白血病細胞に対しても増殖抑制効果を有するので、イマチニブが効きにくくなった白血病患者などに対しても、治療効果が期待できる。

また、本発明のもう１つは、イマチニブと、シイタケ菌糸体培養培地抽出物又は該抽出物中に含まれる脂溶性成分とを有効成分とすることを特徴とする白血病細胞増殖抑制用組成物を提供するものである。上記白血病細胞増殖抑制用組成物によれば、少ないイマチニブの投与量で白血病細胞増殖抑制効果を有する。また、少ないイマチニブの投与量で済むので、イマチニブ耐性白血病細胞が形成されることを抑制し、白血病細胞増殖抑制効果を、長期間に亘って持続させることができる。

また、本発明のさらにもう１つは、イマチニブと併用投与するための白血病細胞増殖抑制用組成物であって、シイタケ菌糸体培養培地抽出物又は該抽出物中に含まれる脂溶性成分を有効成分とすることを特徴とする白血病細胞増殖抑制用組成物を提供するものである。上記白血病細胞増殖抑制用組成物によれば、少ない投与量のイマチニブと併用投与することでの白血病細胞増殖抑制効果を有する。少ないイマチニブの投与量で済むので、イマチニブ耐性白血病細胞が形成されることを抑制し、白血病細胞増殖抑制効果を、長期間に亘って持続させることができる。

本発明の白血病細胞増殖抑制用組成物の有効成分が含まれる前記培養培地は、バガス及び米糠を含む培地であることが好ましい。

また、本発明の白血病細胞増殖抑制用組成物の有効成分である前記シイタケ菌糸体培養培地抽出物は、シイタケ菌糸体培養培地の熱水抽出物中に含まれるものであることが好ましい。

本発明の白血病細胞増殖抑制用組成物によれば、イマチニブ耐性白血病細胞に対しても増殖抑制効果を有するので、イマチニブが効きにくくなった白血病患者などに対しても、治療効果が期待できる。

また、本発明の白血病細胞増殖抑制用組成物によれば、少ないイマチニブの投与量で白血病細胞増殖抑制効果を有する。また、少ないイマチニブの投与量で済むので、イマチニブ耐性白血病細胞が形成されることを抑制し、白血病細胞増殖抑制効果を、長期間に亘って持続させることができる。

さらに、本発明の白血病細胞増殖抑制用組成物によれば、少ない投与量のイマチニブと併用投与することでの白血病細胞増殖抑制効果を有する。少ないイマチニブの投与量で済むので、イマチニブ耐性白血病細胞が形成されることを抑制し、白血病細胞増殖抑制効果を、長期間に亘って持続させることができる。

本発明の白血病細胞増殖抑制用組成物の有効成分であるシイタケ菌糸体培養培地抽出物又は該抽出物中に含まれる脂溶性成分は、安全性が高いので、医薬品としてのみならず、白血病細胞増殖抑制のための食品として日常的に手軽に摂取することも可能である。

シイタケ菌糸体培養培地抽出物（ＬＥＭ）中に含まれる脂溶性成分の調製方法を示す工程図である。ｍＬ３６１６１０とｍＬ１００１６１０について、逆相カラムを用いたＨＰＬＣによる成分分析の結果を示す図表である。ＬＥＭ（Ａ）、各種薬剤（Ｂ）〜（Ｄ）、及びｍＬ３６１６１０（Ｅ）のＫ５６２細胞に対する細胞増殖抑制効果を示す図表である。ＬＥＭ、各種薬剤、及びｍＬ３６１６１０による、生細胞数の推移を示す図表である。ＬＥＭ及びｍＬ３６１６１０による生細胞数の推移を示す図表である。ＬＥＭ、各種薬剤、及びｍＬ３６１６１０によるＫ５６２細胞内ｐ２７量を示す図表である。Ｋ５６２細胞及びイマチニブ耐性Ｋ５６２細胞に対する、細胞増殖抑制効果を示す図表である。ＬＥＭとイマチニブとを併用した場合の、Ｋ５６２細胞に対する相乗的細胞増殖抑制効果を示す図表である。

本発明の白血病細胞増殖抑制用組成物の有効成分であるシイタケ菌糸体培養培地抽出物は、シイタケ菌糸体を培養した培地から抽出されるものである。

シイタケ菌糸体の培養に用いる培地としては、固体培地、液体培地のいずれも使用できる。培地には植物繊維質原料を用いることが好ましく、さらに植物繊維質原料はリグニンを含有する植物から調製されたものを用いることがより好ましい。リグニンを含有する植物としては、禾本科植物、例えばバガス（さとうきびの搾り粕）、トウモロコシの茎葉、小麦ふすま、米糠、稲藁、及び茅等が好ましく用いられる。特に好ましくは、バガス、熊笹の茎葉、及びトウモロコシの茎から選ばれた少なくとも１種と、米糠とを含む培地が用いられる。

また、培地には、必要に応じて他の栄養成分として、酵母エキス、乾燥酵母、藻類（クロレラ、スピルリナ等）、コーンミール、おから等を添加混合してもよい。藻類（クロレラ、スピルリナ等）は、そのまま原料としてもよいが、細断、破砕、磨砕等の物理的処理や、酸又はアルカリ分解、酵素分解等の化学的処理を施したものを用いることもできる。更に、熱水等で抽出した抽出物を用いることもできる。

シイタケ菌糸体の培養は、上記のような植物繊維質原料を含む培地に、シイタケの菌糸を接種して行う。

固体培地の場合は、水分が６０〜８０質量％となるように調製し、常法に従い高圧蒸気滅菌した後、シイタケ菌糸を接種し、例えば温度が１７〜２５℃に空調された培養室で２〜６か月培養する。培養は、培地中にシイタケ菌糸が蔓延した状態で終了する。培養物を破砕し、必要に応じて少量の水を加え、５０℃以上の熱水に浸潤させ、有効成分を１２〜１８時間熱水抽出する。熱水抽出は、例えば１．２ｋｇ／ｃｍ²の蒸気圧下で１２０℃というような加圧高温下で行うこともできる。

一方、液体培地の場合は、上記のような植物繊維質原料を細かく破砕し、必要に応じて米糠等の他の栄養成分を加え、原料が５〜２０質量％となるように培地を調製した後、通気攪拌培養や振盪培養により、好ましくは２０〜２８℃の温度で７〜６０日間程度培養を行う。培養は、培地のｐＨが３〜４.５に低下し、培地中にシイタケ菌糸が蔓延した状態で終了する。次いで、必要に応じて少量の水を加え、５０℃以上、場合によっては高圧条件下（例えば１．２ｋｇ／ｃｍ²の蒸気圧下）に加熱し、熱水抽出物を採取する。

こうして得られた抽出物を、必要に応じて濾過、遠心分離して濾液、又は上清を採取し、さらに必要に応じて凍結乾燥や噴霧乾燥等の手段によって乾燥し、粉末化することにより、培地の分解物、シイタケ菌糸体の代謝産物、及びシイタケ菌糸体細胞の分解物等を含む抽出物を得ることができる。

なお、培養終了後、熱水抽出を行う前に、培養物は、シイタケ菌糸体に内在する酵素を利用してシイタケ菌糸体を自己消化させてもよい。具体的には、固体培地の場合は培養が終了した培養物を破砕し、必要に応じて少量の水を加え、３０〜６０℃で３〜１２時間処理し、シイタケ菌糸体の酵素反応を進め、自己消化させる。一方、液体培地の場合は、培養物全体を３０〜６０℃で３〜６時間処理し、菌糸体を自己消化させ、液体の懸濁培養物を得る。

得られた抽出物は、糖質を主体とした物質であるが、次のような成分を有していることが確認された。
・糖質：３２〜３９％
・蛋白質：１０〜１２％
・リグニン：３２〜３９％
なお、上記抽出物中の糖質、蛋白質、及びリグニンの組成は、例えば、それぞれフェノール硫酸法、セミミクロケルダール法、アセチルブロマイド法で測定して求めることができる。

さらに、この抽出物から脂溶性成分を抽出する。抽出は、エタノールと酢酸エチルの混合溶媒により行うことが好ましい。

具体的には、培地の分解物、シイタケ菌糸体の代謝産物、及びシイタケ菌糸体細胞の分解物等を含む抽出物の乾燥粉末にエタノールと酢酸エチルの混合溶媒を加え、攪拌する。攪拌終了後、遠心分離し、回収した上清を乾燥させ、粉末化する。上記エタノールと酢酸エチルの混合溶媒は、エタノールと酢酸エチルの含有質量比が、２５：７５〜５０：
５０であることが好ましく、３０：７０〜４０：６０であることがより好ましい。

なお、上記の、エタノールと酢酸エチルの混合溶媒を用いて脂溶性成分を抽出する前処理として、酢酸エチルや、上記よりもエタノール含有量が少ない、エタノールと酢酸エチルの混合溶媒を用いて抽出を行い、その沈殿物を採取して上記エタノールと酢酸エチルの混合溶媒による抽出を行ってもよい。この前処理を行うことで、目的の脂溶性成分以外の不要成分を除去することができるので、最終的に得られる脂溶性成分の純度が高いものとなる。不要成分除去のための前処理に用いる混合溶媒のエタノールと酢酸エチルの含有質量比は、０：１００〜３０：７０であることが好ましく、０：１００〜２５：７５であることがより好ましい。

次に、エタノールと酢酸エチルの混合溶媒で抽出した抽出液から得た上記粉末を、水に溶解させ、さらに水とクロロホルムを加え、攪拌し分液を行う。クロロホルム溶液を回収後、クロロホルムとジエチルエーテルの混合溶媒を加え、攪拌し分液を行う。クロロホルムとジエチルエーテルの混合溶媒溶液を回収後、ジエチルエーテルを加え、攪拌し分液を行う。すべての有機溶媒相を混合し、濃縮後、乾燥させ、粉末化する。

こうして、培地の分解物、シイタケ菌糸体の代謝産物、及びシイタケ菌糸体細胞の分解物等を含む脂溶性成分を含む抽出物を得ることができる。この脂溶性成分は、後述する実施例に示されるように、ポリフェノール類、フラボノイド類、カロテノイド類、及び／又はヒドロキシ基を持たないベンゼン環を含む化合物を含有している。

得られたシイタケ菌糸体培養培地抽出物又は該抽出物中に含まれる脂溶性成分を有効成分とする本発明の白血病細胞増殖抑制用組成物は、所望の形態にして製品化することができる。この場合、製品中に、シイタケ菌糸体培養培地抽出物を１日当たりの摂取量として、乾物換算で０．３〜９ｇ含有させることが好ましく、０．６〜６ｇ含有させることがより好ましい。摂取量が０.３ｇ未満であると白血病細胞増殖抑制効果が十分に得られず、９ｇよりも多いと、軟便が生じることがある。ただし、摂取量が上記より多くても安全性には問題はない。又は上記該抽出物中に含まれる脂溶性成分を１日当たりの摂取量として２.５〜２５０ｍｇ含有させることが好ましく、１０〜６２.５ｍｇ含有させることがより好ましい。この範囲とすることで、効率よく有効成分を摂取することができる。

なお、本発明において、製品中の脂溶性成分の含有量は、後述する実施例に記載された方法に従って採取される有効成分である、mL361610＋mL1001610の合計の含有量を意味するものとする。

製品形態としては、例えば、水薬（水溶液もしくは非水溶液又は懸濁液）、錠剤、巨丸剤、粉末薬、顆粒剤、舌に塗布するためのペースト状等が挙げられる。また、本発明の白血病細胞増殖抑制用組成物は、各種の飲食品の原料として添加して、癌の治療及び／又は予防のための飲食品として製品化することもできる。

本発明の白血病増殖抑制用組成物の１つは、イマチニブ耐性白血病細胞に対する増殖抑制用組成物であって、シイタケ菌糸体培養培地抽出物又は該抽出物中に含まれる脂溶性成分を有効成分とする白血病増殖抑制用組成物である。

本発明の白血病増殖抑制用組成物のもう１つは、イマチニブと、シイタケ菌糸体培養培地抽出物又は該抽出物中に含まれる脂溶性成分とを有効成分とする白血病細胞増殖抑制用組成物である。

本発明の白血病増殖抑制用組成物の更にもう１つは、イマチニブと併用投与するための白血病細胞増殖抑制用組成物であって、シイタケ菌糸体培養培地抽出物又は該抽出物中に含まれる脂溶性成分を有効成分とする白血病細胞増殖抑制用組成物である。

上記において、イマチニブ（imatinib）は、フィラデルフィア染色体の遺伝子産物であるBcr-Ablに対するチロシンキナーゼ阻害薬（Tyrosine Kinase Inhibitor：TKI）であるメシル酸イマチニブ（単に「イマチニブ」）のことをいう。イマチニブ（imatinib）は、商品名「グリベック（Glivec、米国でのみGleevec）」（製造販売元：ノバルティスファーマ株式会社）として販売されており、主に、慢性骨髄性白血病、フィラデルフィア染色体陽性急性リンパ性白血病、KIT (CD117) 陽性消化管間質腫瘍に対する治療薬として用いられている。

イマチニブは、継続使用すると、イマチニブに対して耐性のある白血病細胞が生じやすく、その効力が長く続かないことがあるという問題があった。シイタケ菌糸体培養培地抽出物又は該抽出物中に含まれる脂溶性成分は、このようなイマチニブ耐性白血病細胞に対しても増殖抑制効果を有することがわかった。また、イマチニブと、シイタケ菌糸体培養培地抽出物又は該抽出物中に含まれる脂溶性成分と併用することで、少ないイマチニブの投与量で白血病細胞増殖抑制効果を有する。少ないイマチニブの投与量で済むので、イマチニブ耐性白血病細胞が形成されることを抑制し、白血病細胞増殖抑制効果を、長期間に亘って持続させることができる。さらに、シイタケ菌糸体培養培地抽出物又は該抽出物中に含まれる脂溶性成分は、安全性が高いので、医薬品としてのみならず、白血病細胞増殖抑制のための食品として日常的に手軽に摂取することも可能である。

本発明の白血病細胞増殖抑制用組成物として、シイタケ菌糸体培養培地抽出物又は該抽出物中に含まれる脂溶性成分とイマチニブとを含有する組成物を提供する場合は、該組成物中にイマチニブを１日当たりの摂取量として１００〜８００ｍｇ含有させることが好ましく、２００〜６００ｍｇ含有させることがより好ましい。摂取量が１００ｍｇ未満であると白血病細胞増殖抑制効果が十分に得られず、８００ｍｇを超えると副作用（不耐容と耐性）を生じさせる。不耐容としては、皮疹、消化器症状、血球減少などがある。効果が得られない耐性としては、１８０日頃には現れ始め、１８か月の時点で２２〜４０％に耐性が認められる。

このように副作用が生じない８００ｍｇ未満で、イマチニブと、シイタケ菌糸体培養培地抽出物とを併用投与することによって、イマチニブ耐性白血病細胞が形成されることを抑制し、白血病細胞増殖抑制効果を、長期間に亘って持続させることができる。

本発明の白血病増殖抑制用組成物においては、シイタケ菌糸体培養培地抽出物又は該抽出物中に含まれる脂溶性成分やイマチニブの他に、さらに別の抗癌剤を有効成分として追加することができる。そのような抗癌剤としては、例えば、エルロチニブ、ゲフィチニブ、スニチニブ、セツキシマブ、ソラフェニブ、ダサチニブ、トラスツズマブ、トレチノイン、パニツムマブ、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、リツキシマブ等の分子標的薬；エノシタビン、カペシタビン、カルモフール、クラドリピン、ゲムシタビン、シタラビン、シタラビンオクボスファート、テガフール、テガフールウラシル、ＴＳ−１、ドキシフルリジン、ネララビン、ヒドロキシカルバミド、フルオロウラシル、フルダラビン、ペメトレキセド、ペントスタチン、メルカプトプリン、メトトレキサート等の代謝拮抗剤；ゼヴァリン、イマチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、スニチニブ、セツキシマブ、ソラフェニブ、ダサチニブ、トラスツズマブ、トレチノイン、パニツムマブ、ベバシズマブ、イリノテカン、エトポシド、ソブゾキサン、ドセタキセル、ノギテカン、パクリタキセル等の植物アルカロイド；イホスファミド、シクロフォスファミド、ダカルバシン、テモゾロミド、ニムスチン、ブスルファン、プロカルバジン、メルファラン、ラニムスチン等のアルキル化剤；アクチノマイシンＤ、アクラルビシン、アムルビシン、イダルビシン、エピルビシン、スマンクス、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、ブレオマイシン、ペプロマイシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ドキシル等の抗癌性抗生物質；オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン等のプラチナ製剤等が挙げられる。

また、本発明の白血病増殖抑制用組成物において、上記に記載したシイタケ菌糸体培養培地抽出物又は該抽出物中に含まれる脂溶性成分、イマチニブ、他の抗癌剤の他に、本発明の目的を損なわない限り、他の成分を含有することに特に制限はない。例えば、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、着色剤、発色剤、矯味剤、着香剤、酸化防止剤、防腐剤、呈味剤、酸味剤、甘味剤、強化剤、ビタミン剤、膨張剤、増粘剤、界面活性剤等を添加することができる。

本発明の白血病細胞増殖抑制用組成物のうち、イマチニブと併用摂取されるシイタケ菌糸体培養培地抽出物又は該抽出物中に含まれる脂溶性成分を含む組成物は、医薬品や、機能性表示食品、特定保健用食品、栄養補助食品等の健康食品や、その他の一般の食品等として製品化することができる。

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。

＜製造例１＞
（１）シイタケ菌糸体培養培地抽出物（以下「ＬＥＭ」という。）の調製
バガス９０質量部と、脱脂米糠１０質量部とを配合し、水分７０％となるように調製して固形培地を作り、常法通り高圧蒸気滅菌した。この固体培地にシイタケ菌糸を接種し、２５℃に温度調節した培養室内で３か月培養し、培地中に菌糸体が蔓延した後、温度処理室に移して３５℃で２４時間加温し、次いで１０℃の低温室で３日間処理した。その後、上記培養室で３日間培養し、培地を破砕機で親指程度の大きさに破砕した。

破砕した培地を４０℃で６時間処理し、自己消化を促進させた後、抽出タンクに詰め、６０℃の温水を循環させながら１６時間抽出した。得られた抽出液をカートリッジフィルターで濾過し、更にメンブランフィルターで濾過除菌後、濃縮し、凍結乾燥により褐色の粉末（ＬＥＭ）を得た。

（２）ＬＥＭ中に含まれる脂溶性成分の調製
図１にＬＥＭ中に含まれる脂溶性成分の調製方法の工程図を示した。

ＬＥＭ（１ｇを１ｍＬ換算）に対して、２０倍量の酢酸エチルを加え、２４時間撹拌した。撹拌終了後５０００ｒｐｍで遠心分離し、回収した沈殿物を凍結乾燥器で乾燥させ、粉末化させた。

粉末化した沈殿物（１ｇを１ｍＬ換算）に対して、２０倍量のエタノール：酢酸エチル＝１３質量％：８７質量％の混合溶媒を加え、２４時間撹拌した。撹拌終了後５０００ｒｐｍで遠心分離し、回収した沈殿物を凍結乾燥器で乾燥させ、粉末化させた。

さらに、粉末化した沈殿物（１ｇを１ｍＬ換算）に対して、２０倍量のエタノール：酢酸エチル＝３６質量％：６４質量％の混合溶媒を加え、２４時間撹拌した。撹拌終了後５０００ｒｐｍで遠心分離し、回収した上清を凍結乾燥器で乾燥させ、粉末化したものをｍＬ３６ｓとした。遠心分離で回収した沈殿物は凍結乾燥器で乾燥させ、粉末化したものをｍＬ３６ｐとした。

得られたｍＬ３６ｐ（１ｇを１ｍＬ換算）に対して、２０倍量のエタノールを加え、２４時間撹拌した。撹拌終了後５０００ｒｐｍで遠心分離し、回収した沈殿物を凍結乾燥器で乾燥させ、粉末化したものをｍＬ１００ｓとした。

得られたｍＬ３６ｓを超純水に溶解させ、分液ロートに入れた。その後、超純水と等量のクロロホルムを加え、激しく撹拌させ分液を行った。クロロホルム溶液を回収後、超純水と等量のクロロホルム：ジエチルエーテル＝１：１混合溶媒を加え、激しく撹拌させ分液を行った。クロロホルム・ジエチルエーテル混合溶媒溶液を回収後、超純水と等量のジエチルエーテルを加え、激しく撹拌させ分液を行った。全ての有機溶媒相は混合し、エバポレーターで濃縮後、凍結乾燥器で乾燥させ、粉末化したものをｍＬ３６１６１０とした。

得られたｍＬ１００ｓも同様に分液操作を行い、有機溶媒相を粉末化したものをｍＬ１００１６１０とした。

＜実験例１＞
得られた画分ｍＬ３６１６１０とｍＬ１００１６１０について、ＨＰＬＣによる含有成分の分析を行った。

（１）方法
カラムはWakosil-II 5C18 HG（製品名、富士フィルム和光純薬株式会社）を用い、機器はLC-2010C（製品名、株式会社島津製作所）を使用した。移動相はアセトニトリル、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は４０℃、１−５１％のグラジエントにて逆相クロマトグラフィーを行った。検出波長は２５４、２８０、３５０ｎｍで行った。

（２）結果
図２に、逆相カラムを用いたＨＰＬＣによる成分分析の結果を示した。クロマトチャートの通り、ｍＬ３６１６１０とｍＬ１００１６１０の間に、明確な違いが存在する。メジャーピークとして、ｍＬ３６１６１０では７物質が含有されており、ｍＬ１００１６１０では６物質が含有されている。ｍＬ１００１６１０では、検出波長２５４ｎｍにおける１物質（図２（Ｂ））が完全に消失しており、検出波長３５０ｎｍにおける１物質（図２（Ａ）が１／４以下にまで減少している。従って、この２物質は３６％エタノール／酢酸エチル混合溶媒の極性に溶解した物質であり、残りの物質はエタノールに溶解可能な物質であると結論できる。

検出波長２５４ｎｍは、ヒドロキシ基を持たないベンゼン環を含む化合物、及び／又は一連の共役した結合であるカロテノイド類を検出する。検出波長２８０ｎｍは、ヒドロキシ基を持つ芳香環を検出するため、ポリフェノール類と判断される。検出波長３５０ｎｍは、フラボン構造とフラバン構造を検出するため、フラボノイド類と判断される。

以上のことから、ｍＬ３６１６１０とｍＬ１００１６１０には共通に、ポリフェノール類が含有していると考えられる。一方で、ｍＬ３６１６１０には特異的に、カロテノイド類、フラボノイド類、ヒドロキシ基を持たないベンゼン環を含む化合物、及び／又は一連の共役した結合であるカロテノイド類も含有していると考えられる。

＜実験例２＞
ＬＥＭの、白血病細胞に対する細胞増殖抑制効果を検証した。

（１）方法
サンプルとしては、上記で製造したＬＥＭ、ｍＬ３６１６１０の他に、イマチニブ（製品名：Imatinib (mesylate)、Cayman Chemical）（薬効分類名が抗悪性腫瘍剤の分子標的薬、作用機序はBcr-Ablキナーゼの阻害剤）、アダホスチン（製品名：Adaphostin、SIGMA）分子間相互作用としての作用機序は明確になっていないが、アポトーシスを誘導する薬剤）、LY294002（製品名Cell Signaling Technology）（ＰＩ３Ｋ阻害剤）、及びNutlin-3a（製品名、AdooQ Bioscience）（野生型p53とMDM2の結合阻害剤）を用いた。

ヒト慢性骨髄性白血病由来細胞株Ｋ５６２細胞（RIKEN CELL BANK）は、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地で、３７℃、５％ＣＯ₂存在下で培養した。

細胞を０．６×１０⁴個となる様に９６ｗｅｌｌプレートに播種した後にサンプルを加えたものをＳ、細胞を播種せずサンプルを加えたものをＳＢ、細胞を０．６×１０⁴個となる様に９６ｗｅｌｌプレートに播種した後にサンプル希釈溶媒を加えたものをＣ、細胞を播種せずサンプル希釈溶媒のみを加えたものをＣＢとして、２４及び４８時間後のそれぞれの吸光度を、Cell Counting Kit-8（製品名、同仁化学研究所）を用いて、VersaMax Microplate Reader（製品名、モレキュラーデバイスジャパン株式会社）を使用し４５０ｎｍにて測定した。さらに、下記式で細胞生存率を求め、SoftMax Pro（製品名、モレキュラーデバイスジャパン株式会社）を使用して数値解析した。
細胞生存率（％）＝（Ｓ−ＳＢ）／（Ｃ−ＣＢ）×１００

（２）結果
図３にＬＥＭ（Ａ）、各種薬剤（Ｂ）〜（Ｄ）、及びｍＬ３６１６１０（Ｅ）の、Ｋ５６２細胞に対する細胞増殖抑制解析結果を示す。横軸は添加濃度、縦軸は生細胞の割合を示しており、縦軸の値が小さければ小さいほど効果が高いことを示す。図３（Ａ）〜（Ｃ）、（Ｅ）において、丸は添加２４時間後、四角は添加４８時間後を示し、図３（Ｄ）において、白菱形はLY294002、黒菱形はNutlin-3a（ネガティブコントロール）を添加して、いずれも４８時間後を示す。

その結果、抗癌剤であるイマチニブは添加後の時間が重要であり、どれだけ濃度を増加しても、短時間であれば抗腫瘍効果としての活性は５０％程度であることが判明した。一方ＬＥＭは、濃度依存的に細胞の増殖を抑制するだけでなく、短時間でも比活性として１００％近く得られることが判明した。また、ｍＬ３６１６１０は、ＬＥＭ同様に短時間で１００％近い細胞増殖抑制効果を得ることができるだけでなく、ＬＥＭより少量でも抗腫瘍効果を示すことがわかった。

表１にＬＥＭ及び各種薬剤のＩＣ₅₀を示した。

＜実験例３＞
ＬＥＭ及びｍＬ３６１６１０は、白血病細胞の生細胞数に影響を与えるかを検証した。

（１）方法
サンプルとしては、１ｍｇ／ｍＬＬＥＭ、０．１２５ｍｇ／ｍＬｍＬ３６１６１０、１μＭイマチニブ、１０μＭアダホスチンを用いた。

サンプルを添加後、２４及び４８時間後の細胞を、０．４％トリパンブルー染色液：細胞培養液が１：１の混合液に懸濁し、速やかに血球計算盤を用いて、生細胞の数を計測した。下記式で生細胞割合を求め、細胞数推移を解析した。
生細胞数割合（％）＝（全細胞数−トリパンブルー陽性細胞数）／全細胞数×１００

（２）結果
図４に、ＬＥＭ、各種薬剤、及びｍＬ３６１６１０による、Ｋ５６２細胞に対する細胞数の推移を示す。その結果、ＬＥＭ及びｍＬ３６１６１０は添加２４時間後から、細胞はほとんど増加しないことが判明した。一方イマチニブは、添加後２４時間までは細胞増殖抑制効果が弱く、細胞が増殖しやすい状況が存在すると考えられる。アダホスチンは、アポトーシスを引き起こすことが知られており、添加後から明確に細胞が減少している理由は、細胞死によるものであると考えられる。

図５に、ＬＥＭ及びｍＬ３６１６１０による細胞増殖抑制効果の要因を解析した結果を示す。その結果、ＬＥＭ添加４８時間後でも、ＬＥＭは約６０％、ｍＬ３６１６１０は約７５％の細胞は生存していることが判明した。

以上の結果から、ＬＥＭ及びｍＬ３６１６１０による細胞増殖抑制効果は、細胞毒性と考えられる細胞死ではなく、細胞周期進行の停止を引き起こす分子メカニズムが生じていると判断される。

＜実験例４＞
細胞は細胞周期によって制御されており、細胞増殖のブレーキ役であるｐ２７が細胞内に存在すると、細胞は増殖を停止する。正常細胞では、このｐ２７が分解されずに細胞内で蓄積することで、異常な細胞増殖が発生しない。一方癌細胞では、遺伝子変異や増殖因子等の物質により、細胞増殖を正に動かすシグナル伝達が恒常的に生じ、その結果ｐ２７の分解が引き起こされ、無秩序に細胞が増殖する。また、癌の悪性度とｐ２７には相関があり、細胞内ｐ２７量が少なければ悪性度が高い。さらに、術後の予後もｐ２７と相関があり、細胞内ｐ２７量が少なければ、癌治療を行っても予後不良により短命であることが知られている。

そこで、ＬＥＭがｐ２７の分解抑制による細胞内ｐ２７量の増加に関与していると考え、Ｋ５６２細胞内のｐ２７量を解析した。

（１）方法
Ｋ５６２細胞を、それぞれ１ｍｇ／ｍＬＬＥＭ、０．１２５ｍｇ／ｍＬｍＬ３６１６１０、１μＭイマチニブ、１０μＭアダホスチン存在下で培養した。２４時間後、細胞を５００×ｇで３分間遠心回収し、２回ＰＢＳで細胞を洗浄した。細胞からタンパク質溶液を調整後、ＤＣＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙ（製品名、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いてＢＳＡをスタンダードとしてタンパク定量を行った。ｐ２７量の定量を行うそれぞれのサンプルは、全タンパク質量として全てのサンプルを揃えた。ｐ２７定量の実験手法はＥＬＩＳＡで行った。

（２）結果
図６に、ＬＥＭ、ｍＬ３６１６１０、イマチニブ、アダホスチンによる細胞内ｐ２７量への影響の解析結果を示す。この結果から、何も添加していないコントロールと比較し、ＬＥＭは約２倍、ｍＬ３６１６１０は約３．６倍、細胞内ｐ２７量を増加させることがわかった。

実験例３，４の結果から、ＬＥＭ及びｍＬ３６１６１０による細胞増殖抑制のメカニズムは、細胞内ｐ２７が蓄積することによる、細胞周期進行の停止が要因であると結論する。

＜実験例５＞
既存抗癌剤であるイマチニブは２０００年初頭に開発され、分子標的薬として注目を集めた一方、癌細胞による薬剤耐性も獲得しやすい。研究室レベルでは、半年かからずに耐性細胞の樹立が可能である。また、受容体のキナーゼ阻害剤であるため、徐々に薬剤の効果が減少するだけでなく、癌細胞の細胞増殖を正に動かすシグナル伝達が増加してしまう一因となる。現在のところ、イマチニブ耐性癌細胞に対する、効果的な抗癌剤は存在しない。

そこで、イマチニブ耐性Ｋ５６２細胞を作成し、イマチニブ耐性Ｋ５６２細胞に対しても、ＬＥＭ及びｍＬ３６１６１０は細胞増殖抑制効果があるか解析した。

（１）方法
０．２μＭイマチニブ存在下で、Ｋ５６２細胞を１ヶ月培養した。１ヶ月培養後の生存細胞を用い、０．２５μＭイマチニブ存在下で1週間培養した。その後、濃度を０．０５μＭ増加させる毎に、1週間ずつ培養した。最終的に、０．５μＭイマチニブ存在下で２ヶ月間培養し、生存したＫ５６２細胞をイマチニブ耐性Ｋ５６２細胞（以下、Ｋ５６２−ＳＲｍ細胞という）として実験に使用した。

（２）結果
図７に、通常のＫ５６２細胞及びＫ５６２−ＳＲｍ細胞に対する、細胞増殖抑制解析結果を示す。四角は通常のＫ５６２細胞で、丸はＫ５６２−ＳＲｍ細胞を示す。アダホスチンは細胞死を引き起こすため、イマチニブ耐性細胞にも効果がある薬剤として学術的に使用されており、ＬＥＭ及びｍＬ３６１６１０との比較として用いた。その結果ＬＥＭ及びｍＬ３６１６１０は、Ｋ５６２−ＳＲｍ細胞であっても細胞増殖抑制効果を示し、また、細胞増殖抑制の比活性は悪化しないことが判明した。一方アダホスチンは、Ｋ５６２−ＳＲｍ細胞であっても細胞増殖抑制を示すが、その比活性は悪化し、抑制の活性は通常のＫ５６２と比較して半分に低下することが判明した。

表２にＩＣ₅₀を示した。

図７及び表２から明らかな通り、濃度依存的な薬剤の効果がシグモイド曲線である以上、アダホスチンの様に比活性が低下するということは、薬剤濃度を上げてもそれ以上の効果は期待できない。従って、比活性の悪化がないＬＥＭ及びｍＬ３６１６１０は、抗癌剤抵抗性を獲得した癌細胞に対して、強力で有用な手段となりうる。

＜実験例６＞
イマチニブは添加時間が短い場合は比活性が弱く、また、癌細胞が抵抗性を獲得しやすい。そこでＬＥＭとの併用により、Ｋ５６２細胞に対する細胞増殖抑制効果があるか解析した。

（１）方法
細胞数推移の解析は、サンプルを添加後２４時間後に行った。詳細には、上記実験例２と同様の方法で行った。

（２）結果
図８にＬＥＭをとイマチニブとを併用した場合のＫ５６２細胞に対する細胞増殖抑制解析結果を示す。ＬＥＭの濃度をＩＣ₅₀の８０％として添加した。その結果、いずれの濃度でもＬＥＭによる相乗効果が確認できた。特に、０．５μＭイマチニブ単独の効果が、０．２５ｍｇ／ｍＬＬＥＭと０．１２５μＭイマチニブとの併用と同等の効果が得られることが判明した。学術的にイマチニブ耐性細胞を作製する場合、０．２μＭイマチニブ以下では耐性化が発生しない。以上の結果から、ＬＥＭは、耐性細胞であっても効果を発揮するだけでなく、通常の癌細胞であっても、耐性化が発生しない濃度のイマチニブ併用により、より強力に細胞増殖抑制効果を示すと結論する。

Claims

イマチニブ耐性白血病細胞に対する増殖抑制用組成物であって、シイタケ菌糸体培養培地の熱水抽出物中に含まれる脂溶性成分を有効成分とすることを特徴とする白血病細胞増殖抑制用組成物。
イマチニブと、シイタケ菌糸体培養培地の熱水抽出物中に含まれる脂溶性成分とを有効成分とすることを特徴とする白血病細胞増殖抑制用組成物。
イマチニブと併用投与するための白血病細胞増殖抑制用組成物であって、シイタケ菌糸体培養培地の熱水抽出物中に含まれる脂溶性成分を有効成分とすることを特徴とする白血病細胞増殖抑制用組成物。
前記脂溶性成分はバガス及び米糠を含む培地を用いて培養されたシイタケ菌糸体培養培地の熱水抽出物中に含まれるものである、請求項１〜３のいずれか1項に記載の白血病細胞増殖抑制用組成物。