JP6856546B2 - 低酸素感受性ナノコンポジットを用いたグルコース応答性インスリン送達システム - Google Patents

Description

関連出願の相互参照

本願は、2015年4月21日に出願された米国仮特許出願第62/150,622号の優先権及び利益を主張するものであり、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

この発明は、インスリン及び/又はその生物活性誘導体などの糖尿病治療剤のグルコース応答性送達のための、小胞、ナノ粒子、マイクロニードル及びマイクロニードルアレイなどのシステム及び組成物に関する。本発明はさらに、この組成物を製造する方法、及び糖尿病治療剤を、それを必要とする患者に送達する方法に関する。

真性糖尿病は、血液中のグルコースの蓄積によって特徴付けられる代謝性疾患群である。Pickup et al., Diabetes-Metabolism Research 及び Reviews, 24, 604-610 (2008)及び Stumvoll et al., Lancet, 365, 1333-1346 (2005)を参照されたい。2014年の時点で、世界中で3億8,700万人が糖尿病に罹患しており、その数は2035年までに5億2千2百万人になると推定されている。Mo et al., Chemical Society Reviews, 43, 3595-3629 (2014)及び Tabak et al., Lancet, 379, 2279-2290 (2012)を参照されたい。糖尿病患者の従来の治療法には、血中グルコースレベルを継続的にモニタリングすること、及びその後インスリン注射をして、正常血糖を維持することが含まれている。Owens et al., Lancet, 358, 739-746 (2001).を参照されたい。しかし、このような自己投与は、疼痛及びグルコース制御が限定されることを伴う。Bratlie et al., Advanced Healthcare Materials, 1, 267-284 (2012)及び Ravaine et al., Journal of Controlled Release, 132, 2-11 (2008)を参照されたい。
過去10年にわたって、インスリン送達のためにミクロンケールの複数のニードルを有する経皮注入器具の開発が試みられてきた。Martanto et al., Pharmaceutical Research 21, 947-952 (2004); Narayan, J. Biomedical Nanotechnology, 10, 2244-2260 (2014); Ling et al., Acta Biomaterialia, 9, 8952-8961 (2013); Prausnitz et al., Nature Biotechnology, 26, 1261-1268 (2008)及びYang et al., Nature Communications, 4, (2013), doi 10.1038/ncomms2715.を参照されたい。

しかし、更なるインスリン送達システムやその関連組成物の必要性、特に、血糖の変化に応答して患者にインスリンを迅速に送達することができ、痛みがほとんど又は全くない「閉ループ」送達システムに対する必要性、が依然として存在する。

いくつかの実施態様において、本発明は、以下（a）〜（c）から成る組成物を提供する。（a）低酸素感受性疎水基に結合した親水性ポリマーを含む両親媒性ポリマー材料であって、この低酸素感受性疎水基は、低酸素環境下で還元されて親水性部分を形成することができる低酸素感受性部分を含む、両親媒性ポリマー材料、（b）糖尿病治療剤（任意に、この糖尿病治療剤はインスリン又はその生物活性誘導体であってもよい。）、及び（c）グルコース酸化剤。
いくつかの実施態様において、この親水性ポリマーは生分解性である。いくつかの実施態様において、この親水性ポリマーは、ポリアミノ酸（例えば、ポリグルタミン酸）、合成ブロックコポリマー、又は多糖類であり、任意に、この親水性ポリマーは多糖類であり、さらに任意に、この多糖類はグルコサミノグリカンである。いくつかの実施態様において、この親水性ポリマーはヒアルロン酸である。

いくつかの実施態様において、この低酸素感受性部分はニトロイミダゾールを含む。いくつかの実施態様において、この疎水基はこの親水性ポリマーに共有結合している。いくつかの実施態様において、この両親媒性ポリマー材料は、アミノ置換された疎水基前駆体のアミノ基に結合した親水性ポリマーを含み、それによりこのアミノ基とこの親水性ポリマー上に存在するカルボン酸基との間にアミドを形成する。いくつかの実施態様において、この両親媒性ポリマー材料は、６−（２−ニトロイミダゾール）ヘキシルアミンに結合したヒアルロン酸を含む。
いくつかの実施態様において、このグルコース酸化剤は、グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）である。いくつかの実施態様において、この糖尿病治療剤はインスリン又はその生物活性誘導体であり、このインスリン又はその生物活性誘導体は、ヒトインスリン、組換えヒトインスリン、非ヒト動物由来のインスリン、速効型インスリン、超速効型インスリン類似体、中間型インスリン及び／又は持続型インスリンから選択される。いくつかの実施態様において、この糖尿病治療剤は組換えヒトインスリンである。いくつかの実施態様において、この両親媒性ポリマー材料は、この糖尿病治療剤及びこのグルコース酸化剤をカプセル化する小胞を形成している。

いくつかの実施態様において、本発明は、（a）〜（c）を含むナノ粒子を提供する。（a）低酸素感受性疎水基に結合した親水性ポリマーを含む両親媒性ポリマー材料であって、この低酸素感受性疎水基は、低酸素環境下で還元されて親水性部分を形成することができる低酸素感受性部分を含む、両親媒性ポリマー材料、（b）糖尿病治療剤（任意に、この糖尿病治療剤はインスリン又はその生物活性誘導体であってもよい。）、及び（c）グルコース酸化剤。

いくつかの実施態様において、本発明は、低酸素感受性疎水基に結合した親水性ポリマーを含む両親媒性ポリマー材料から成る小胞であって、この低酸素感受性疎水基は、低酸素環境下で還元されて親水性部分を形成することができる低酸素感受性部分を含み、さらに、（ｉ）糖尿病治療剤（任意に、この糖尿病治療剤はインスリン又はその生物活性誘導体であってもよい。）及び（ｉｉ）グルコース酸化剤はこの小胞内に含まれている、小胞を提供する。いくつかの実施態様において、この親水性ポリマーは、ポリアミノ酸（例えば、ポリグルタミン酸）、合成ブロックコポリマー、又は多糖類（例えば、グルコサミノグリカン）であり、任意に、この親水性ポリマーはヒアルロン酸である。いくつかの実施態様において、この低酸素感受性部分はニトロイミダゾールを含む。いくつかの実施態様において、この糖尿病治療剤は組換えヒトインスリンである。いくつかの実施態様において、このグルコース酸化剤は、グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）である。

いくつかの実施態様において、本発明は、低酸素感受性疎水基に結合した親水性ポリマーを含む両親媒性ポリマー材料から成る小胞であって、この低酸素感受性疎水基は、低酸素環境下で還元されて親水性部分を形成することができる低酸素感受性部分を含み、さらに、（ｉ）糖尿病治療剤（任意に、この糖尿病治療剤はインスリン又はその生物活性誘導体であってもよい。）及び（ｉｉ）グルコース酸化剤がこの小胞内に含まれている、小胞を含むマイクロニードルアレイを提供する。いくつかの実施態様において、このマイクロニードルアレイは、約２０〜約１０００μｍの長さを有する多数のマイクロニードルを含む。いくつかの実施態様において、各マイクロニードルは、約６００μｍの長さを有する。
いくつかの実施態様において、このマイクロニードルアレイは皮膚パッチの一部として提供され、任意に、このパッチは１以上の裏張り層及び／又は皮膚適合性接着剤を含む。

いくつかの実施態様において、本発明は、低酸素感受性疎水基に結合した親水性ポリマーを含む両親媒性ポリマー材料から成る小胞であって、この低酸素感受性疎水基は、低酸素環境下で還元されて親水性部分を形成することができる低酸素感受性部分を含み、さらに、（ｉ）インスリン又はその生物活性誘導体、及び（ｉｉ）グルコース酸化剤がこの小胞内に含まれている、小胞を含むマイクロニードルアレイを含む閉ループインスリン送達システムを提供する。

いくつかの実施態様において、本発明は、糖尿病治療剤を必要とする患者に送達する方法であって、（ａ）低酸素感受性疎水基に結合した親水性ポリマーを含む両親媒性ポリマー材料から成る小胞であって、この低酸素感受性疎水基は、低酸素環境下で還元されて親水性部分を形成することができる低酸素感受性部分を含み、さらに、（ｉ）糖尿病治療剤（任意に、この糖尿病治療剤はインスリン又はその生物活性誘導体であってもよい。）及び（ｉｉ）グルコース酸化剤がこの小胞内に含まれている、小胞を含むマイクロニードルアレイを提供する段階、及び（ｂ）このマイクロニードルアレイをこの患者の皮膚表面に適用する段階から成り、このマイクロニードルアレイはグルコースと接触するとグルコースは酸化され、それにより低酸素環境が作り出され、その結果、この低酸素感受性部分が還元されて親水性部分を形成し、これがこの小胞の破壊及び小胞に含まれる糖尿病治療剤の放出をもたらす、方法を提供する。
いくつかの実施態様において、この糖尿病治療剤の送達は、このマイクロニードルアレイと接触するグルコース濃度に対応する速度で行われる。いくつかの実施態様において、患者は哺乳動物である。いくつかの実施態様において、患者は糖尿病である。

いくつかの実施態様において、本発明は、糖尿病治療剤（任意に、インスリン又は生物活性インスリン誘導体）のグルコース応答性送達のためのマイクロニードルアレイを製造する方法であって、（ａ）低酸素感受性疎水基に結合した親水性ポリマーを含む両親媒性ポリマー材料から成る小胞であって、この低酸素感受性疎水基は、低酸素環境下で還元されて親水性部分を形成することができる低酸素感受性部分を含み、さらに、（ｉ）糖尿病治療剤（任意に、この糖尿病治療剤はインスリン又はその生物活性誘導体であってもよい。）及び（ｉｉ）グルコース酸化剤はこの小胞内に含まれている、小胞の水溶液を用意する段階、（ｂ）複数のマイクロニードルキャビティを含む鋳型内に、この水溶液を分散させて、充填された鋳型を提供する段階、（ｃ）この充填された鋳型を乾燥させて水を除去する段階、及び（ｄ）この鋳型を除去してマイクロニードルアレイを提供する段階、から成る方法を提供する。いくつかの実施態様において、この方法は、更に、このマイクロニードルアレイ内でポリマー材料を架橋させる段階を含む。いくつかの実施態様において、この架橋は、ＵＶ照射に曝すことによって行われる。

いくつかの実施態様において、段階（ｂ）は真空下で行われる。いくつかの実施態様において、段階（ｂ）の後、鋳型を遠心分離してミセルをマイクロニードルキャビティ内に圧縮する。
いくつかの実施態様において、段階（ｃ）の前に、鋳型に追加の親水性ポリマー及び／又は化学的架橋剤を添加する。任意に、追加の親水性ポリマー及び／又は化学的架橋剤の添加後に、鋳型を遠心分離する。更に任意に、追加の親水性ポリマーは、アルキレン変性及び／又はアクリレート変性のヒアルロン酸のような、変性ヒアルロン酸である。いくつかの実施態様において、段階（ｃ）は真空デシケータ内で行われる。いくつかの実施態様において、この鋳型はシリコーンから成る。

したがって、本発明の目的は、インスリン又は生物活性インスリン誘導体のような糖尿病治療剤のグルコース応答性送達のための、組成物、小胞、ナノ粒子、マイクロニードル、マイクロニードルアレイ、システム及び方法、並びにこのマイクロニードルアレイを製造する方法を提供することである。この目的及び他の目的は、本明細書に開示された発明によって完全に又は部分的に達成される。
本発明の１つの目的を上記に述べたが、本発明の他の目的及び利点は、本発明の以下の説明及び非限定的な図や実施例を検討した後、当業者に明らかになるであろう。

低酸素感受性（HS）ヒアルロン酸（HA）を使用して調製され、インスリン及びグルコース酸化酵素（すなわち、グルコースオキシダーゼ(GOx)）が充填された低酸素感受性小胞（グルコース応答性小胞（GRVs）とも呼ばれる）を含むグルコース応答性インスリン送達システムの形成；グルコースオキシダーゼ(GOx)によるグルコースの酸化によって生じる低酸素によって引き起こされ、親水性部分（2-アミノイミダゾール）を形成する、グルコース応答性小胞（GRVs）中の疎水性低酸素感受性部分（すなわち、2-ニトロイミダゾール（NI））の還元；及びそれに続くグルコース応答性小胞（GRVs）の分解及びこのGRVsからのインスリンの放出、を示す概略図である。 高血糖状態によって引き起こされるインビボインスリン送達のためのグルコース応答性小胞（GRVs）を含むマイクロニードルアレイパッチの概略図を示す。このマイクロニードルは、図１Ａについて記載したグルコース応答性小胞（GRVs）を含むことができ、このパッチは皮膚に適用することができる。正常血糖状態では、ほとんどインスリンが放出されないが、高血糖状態では、マイクロニードルからのインスリン放出が引き起こされる。 インスリン及びグルコースオキシダーゼ(GOx)が充填されたグルコース応答性小胞（GRVs）の一連の透過型電子顕微鏡(TEM)像を示す。(i) 400mg/dLのグルコース溶液中でのインキュベーションの前、(ii) 400mg/dLのグルコース溶液中での20分のインキュベーションの後、(iii) 400mg/dLのグルコース溶液中での1時間のインキュベーションの後、(iv) 400mg/dLのグルコース溶液中での24時間のインキュベーションの後。 400mg/dLのグルコース溶液中でのインキュベーションの前のグルコース応答性小胞（GRVs）のサイズ分布を示す棒グラフである。 400mg/dLのグルコース溶液中での24時間のインキュベーションの後のグルコース応答性小胞（GRVs）のサイズ分布を示す棒グラフである。 400mg/dLのグルコース溶液中でのインキュベーションの前の、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)−インスリンが充填されたグルコース応答性小胞（GRVs）の溶液の２．５次元(2.5D)蛍光画像である。 ３７℃で400mg/dLのグルコース溶液中での１時間のインキュベーションの後の、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)−インスリンが充填されたグルコース応答性小胞（GRVs）の溶液の２．５次元(2.5D)蛍光画像である。 異なる濃度のグルコースと酸素濃度分子プローブを含有するグルコース溶液中でインキュベートされたグルコース応答性小胞（GRVs）のリン光寿命プロファイルを示すグラフである。100mg/dLのグルコース溶液中（黒丸）と400mg/dLのグルコース溶液中（黒三角）でインキュベートしたグルコース応答性小胞（GRVs）についてのデータを提供する。比較のために、グルコースを含まないリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中でインキュベートしたグルコース応答性小胞（GRVs）についてのデータも提供する（黒四角）。 ３７℃における様々なグルコース溶液中のグルコース応答性小胞（GRVs）の時間依存的紫外線(UV)吸収(330nm)を示すグラフである。100mg/dLのグルコース溶液中（黒丸）と400mg/dLのグルコース溶液中（黒三角）でインキュベートしたグルコース応答性小胞（GRVs）についてのデータを提供する。比較のために、グルコースを含まないリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中でインキュベートしたグルコース応答性小胞（GRVs）についてのデータも提供する（黒四角）。エラーバーは、３回の標準偏差(s.d.)を示す。 ３７℃における様々な濃度のグルコース溶液中でインキュベートされたグルコース応答性小胞（GRVs）から放出され、インビトロで蓄積されたインスリンを示すグラフである。黒四角は、0mg/dLのグルコース溶液(即ち、PBS)中、黒丸は、100mg/dLのグルコース溶液中、黒三角は、400mg/dLのグルコース溶液中を示す。 グルコース応答性小胞（GRVs）の自己調整プロファイルを示す。白丸は、グルコースオキシダーゼ(GOx)及びインスリンを含むGRVs（「GRV(E+I)」で示す。）、黒丸は、半量のグルコースオキシダーゼ(GOx)及びインスリンを含むGRVs（「GRV(1/2E+I)」で示す。）を示す。インスリンの放出速度は、グルコース濃度の関数として示される（すなわち、100mg/dL、200mg/dL、又は400mg/dL）。 100mg/dLのグルコース溶液に10分間、及びそれに続く100mg/dLのグルコース溶液に10分間の逐次暴露を数回反復されたグルコース応答性小胞（GRVs）の拍動性放出プロファイルを示す。 天然インスリン溶液（白丸）と400mg/dLのグルコース溶液中でインキュベートしたグルコース応答性小胞（GRVs）から放出されたインスリン溶液（黒丸）の円偏光二色性(CD)スペクトルを示す。エラーバーは、３回の標準偏差を示す。 本発明のグルコース応答性小胞（GRVs）が充填されたマイクロニードル（MN）アレイパッチを、シリコーン鋳型から製造する例示的なプロセスの概略図である。 本発明の例示的なマイクロニードル（MN）アレイの写真である。写真の右下にあるスケールバーは１cmを示す。 フルオレセインイソチオシアネート（FITC）で標識されたインスリンを含有するグルコース応答性小胞（GRVs）を充填したマイクロニードル(MNs)のケイ光顕微鏡画像である。挿入図は、マイクロニードルの１つのより近い画像である。スケールバーは200μmを表す。 本発明の例示的なマイクロニードル（MN）アレイの走査型電子顕微鏡（SEM）画像である。スケールバーは200μmを表す。 非架橋及び架橋のグルコース応答性小胞（GRV）充填マイクロニードル（MNs）の機械的挙動を示すグラフである。 左上図は、本発明のマイクロニードル（MN）アレイパッチで経皮的に処置されたマウスの背及び関連皮膚（円内の領域）を示し、右上図は、このマウス皮膚のマイクロニードル（MN）浸透を示すトリパンブルー染色を示し、下図は、１つのマイクロニードル（MN）が浸透したマウス皮膚断面（ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色）を示す。左上図のスケールバーは500μmを表し、下図のスケールバーは100μmを表す。筋肉及び脂肪の組織はそれぞれ「Ｍ」及び「Ｆ」で示され、マイクロニードル（MN）が挿入された領域は破線で示す。 ストレプトゾトシン（STZ）で誘発された糖尿病のマウスにおけるＩ型糖尿病のグルコース応答性小胞（GRVs）充填マイクロニードル（ＭＮ）アレイパッチ処理のインビボ研究の血糖値のグラフを示す。白三角は、ブランクＭＮ（インスリン又は酵素を含まないマイクロニードル（MN））で処置したマウス、黒丸は、ヒト組み換えインスリンのみを含有するグルコース応答性小胞（GRV(I)）を充填したＭＮで処置したマウス、黒四角は、インスリン及びグルコースオキシダーゼ酵素を含有するグルコース応答性小胞（GRV(E+I)）を充填したＭＮで処置したマウス、白四角は、インスリン及び半量の酵素を含有するグルコース応答性小胞（GRV(1/2E+I)）を充填したＭＮで処置したマウス、のデータを示す。対照として、インスリン注射で処置したマウスのデータ（白丸）を示す。 ストレプトゾトシン（STZ）で誘発された糖尿病のマウスにおけるＩ型糖尿病のグルコース応答性小胞（GRVs）充填マイクロニードル（ＭＮ）アレイパッチ処理のインビボ研究の血漿インスリン濃度のグラフを示す。黒三角は、ヒト組み換えインスリンのみを充填したＭＮアレイで処置したマウス、黒四角は、インスリン及びグルコースオキシダーゼ酵素を充填したＭＮアレイで処置したマウス（GRV(E+I)）、黒丸は、インスリン及び半量の酵素を充填したＭＮアレイで処置したマウス（GRV(1/2E+I)）、のデータを示す。 マウス背部に４時間挿入した後のグルコース応答性小胞（GRVs）充填マイクロニードル（MN）アレイパッチの走査型電子顕微鏡（SEM）画像である。このマイクロニードル（MNs）には、インスリン及びグルコースオキシダーゼ酵素を含むグルコース応答性小胞（GRV(E+I)）が充填された。スケールバーは200μmを表す。 グルコース応答性小胞（GRVs）充填マイクロニードル（MN）アレイパッチで処理された糖尿病マウスの、処理後１時間後のインビボ血糖耐性試験で得られたデータ（黒丸）のグラフを示し、そのグルコース応答性小胞（GRVs）は、インスリン及びグルコースオキシダーゼ酵素を含有する（GRV(E+I)）。比較のため、黒四角は、健康なマウスのデータ、黒三角は、インスリンのみを充填したＭＮで処理した糖尿病マウスの処理後１時間後のデータ示す。 図５Ｅの試験を行ったマウスに腹腔内グルコース注射（IPGTT）を行い、それに対する応答性を示すグラフを示す。この応答性は、０分のグルコース読み取り値をベースラインとして、１２０分後の曲線下面積（AUC）に基づいて計算した。 最初（第１）のグルコース応答性小胞（GRVs）充填マイクロニードル（MN）アレイパッチの投与の１時間後に、マイクロニードル（MN）アレイパッチの追加（第２）投与を行ったマウスにおける血糖変化を示すグラフである。最初のGRV充填マイクロニードル（MN）アレイパッチはインスリン及びグルコースオキシダーゼ酵素が充填されたGRVs（GRV(E+I)）を含有する。追加のＭＮアレイパッチ（白四角）は、インスリン及びグルコースオキシダーゼ酵素の両方が充填されたGRVs（GRV(E+I)＋GRV(E+I)）を含む。追加のＭＮアレイパッチ（黒丸）は、インスリン及び半量のグルコースオキシダーゼ酵素が充填されたGRVs（GRV(E+I)＋GRV(1/2E+I)）を含み、追加のＭＮアレイパッチ（白丸）は、インスリンのみが充填されたGRVs（GRV(E+I)＋インスリン）を含む。比較のため、追加のＭＮアレイパッチを受けないマウスのデータ（GRV(E+I)）も示す（黒四角）。黒い矢印は、最初（第１）及び追加（第２）のＭＮアレイパッチの投与時点を示す。 グルコース応答性小胞（GRV）充填マイクロニードル（MN）アレイパッチで処理された健康なマウスの、経時的な血糖変化を示すグラフである。黒丸は、インスリン及びグルコースオキシダーゼ酵素の両方を含有するグルコース応答性小胞（GRV(E+I)）を充填したＭＮで処置したマウス、黒三角は、インスリンのみを含有するグルコース応答性小胞（GRV(I)）を充填したＭＮで処置したマウス、のデータを示す。比較のため、インスリン注射で処置したマウスのデータ（黒四角）を示す。黒矢印は投与時点を示す。 図５Ｈのマウスの低血糖指数の定量化のグラフである。この低血糖指数は、初期と最低の血糖値の差を、最低値に達した時間で割って計算した。インスリンと酵素を充填したGRVsを含むＭＮアレイの処置（GRV(E+I)）は、インスリンを充填したGRVsを含むＭＮアレイの処置（GRV(I)）に対して、p値＜0.05であった。エラーバーは、n=5の標準偏差(s.d.)を示す。

以下、本発明を添付の図及び実施例を参照してより完全に説明するが、そこには代表的な実施態様が示されている。しかし、本明細書に開示された発明は、異なる形態で具体化することが可能で、本明細書に記載された実施態様に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施態様は、ここに開示が完全であり、実施態様の範囲を当業者に完全に伝えるように提供されるものである。これらの図面に特定される構成要素は、必ずしも縮尺通りではなく、ここに開示される発明の原理を（場合によっては概略的に）説明することに重点が置かれている。
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許及びその他参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。
本明細書及び特許請求の範囲の全体にわたって、記載された化学式又は名称は、すべての活性な光学異性体及び立体異性体、並びにこのような複数の異性体及び混合物が存在するラセミ混合物を包含するものとする。

本明細書では以下の略語を用いる：
℃=摂氏； ％=パーセンテージ； μL=マイクロリットル； μm=マイクロメートル又はミクロン； μs=マイクロ秒； a.u.=吸光度単位； BOC = t-ブチルオキシカルボニル； CD =円二色性； DI =脱イオン； dL =デシリットル； DLS =動的光散乱； DMF =ジメチルホルムアミド； EDC = N-（3-ジメチルアミノプロピル）-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩； ELISA =酵素結合免疫吸着剤； FESEM =電界放出型走査型電子顕微鏡； FITC =フルオレセインイソチオシアネート； GOx =グルコースオキシダーゼ； GRV =グルコース応答性小胞； h =時間； HA =ヒアルロン酸； HS =低酸素感受性； IU =国際単位； KCl =塩化カリウム； K₂CO₃ =炭酸カリウム； kDa =キロダルトン； kg =キログラム； KH₂PO₄ =リン酸一カリウム； LC =充填能力； MBA = N、N'-メチレンビスアクリルアミド； mg =ミリグラム； m-HA =アクリレート変性ヒアルロン酸； min=分； mL =ミリリットル； mm =ミリメートル； mM =ミリモル； MN =マイクロニードル； mV =ミリボルト； N =ニュートン； NaCl =塩化ナトリウム； NADPH =ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸； Na₂HPO₄ =リン酸二ナトリウム； NHS = N-ヒドロキシスクシンイミド； NI = 2-ニトロイミダゾール； nm =ナノメートル； NMR =核磁気共鳴； O₂ =酸素； PBS =リン酸緩衝食塩水； pI =等電点； RT =室温； SEM =走査型電子顕微鏡； STZ =ストレプトゾトシン； TEM =透過型電子顕微鏡； UV =紫外線； Zn =亜鉛

Ｉ．定義
以下の用語は、当業者によってよく理解されると考えられるが、以下の定義は、本開示の主題の説明を促進するために説明される。

長年の特許法慣習に従って、特許請求の範囲を含む本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その」は、使用される場合、「１つ以上」を指す。したがって、例えば、「１つ組成物」又は「一つのポリマー」への言及は、複数のそのような組成物又はポリマーを含む、などである。
別段示されない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される、サイズ、反応条件などの量を表す全ての数は、全ての場合において、「約」という用語によって修飾されるものとして理解されたい。したがって、それに反して示されない限り、本明細書及び添付の特許請求の範囲において説明される数的パラメータは、本開示の主題によって得ることが求められる所望される特性によって変動し得る近似値である。

本明細書で使用される場合、値、又はサイズ（すなわち、直径）、重量、濃度、もしくはパーセンテージの量を指す時、「約」は、明記される値から、一例において±２０％又は±１０％、別の例において±５％、別の例において±１％、及び更に別の例において±０．１％の変動を網羅することが意図されるが、これは、そのような変動が開示される方法を実行するのに適切なものであるためである。
本明細書で使用される場合、実体を列挙する文脈で使用される時、「及び／又は」は、単独又は組み合わせで存在する実体を指す。したがって、例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、及び／又はＤ」という語句は、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤを個々に含むが、また、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤの任意ならびに全ての組み合わせ及び部分組み合わせも含む。

「を含む（including）」、「を含有する」、又は「によって特徴付けられる」と同義である「を含む（comprising）」は、包括的又は無制限であり、引用されない追加の要素又は方法ステップを除外しない。「を含む」は、特許請求の言語で使用される専門用語であり、名前を挙げた要素が存在するが、他の要素が追加されてもよく、依然として特許請求の範囲内の構築物又は方法を形成することを意味する。
本明細書で使用される場合、「からなる」という語句は、特許請求の範囲内に明記されないいかなる要素、ステップ、又は成分も除外する。「からなる」という語句が、前文の直後ではなく、特許請求の範囲の本文の条項に出現する場合、それは、その条項内に説明される要素のみを限定し、他の要素は特許請求の範囲全体からは除外されない。
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という語句は、特許請求の範囲を、明記される材料又はステップ、ならびに主張される主題の基本的及び新規の特徴（複数可）に実質的な影響を与えないものに限定する。
「を含む」、「からなる」、及び「から本質的になる」という用語に関して、これら３つの用語のうちの１つが本明細書で使用される場合、本開示の主張される主題は、その他の２つの用語のいずれかの使用を含み得る。

本明細書で使用される場合、「アルキル」は、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、エテニル基、プロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、オクテニル基、ブタジエニル基、プロピニル基、ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基、ヘプチニル基、及びアレニル基を含む、直鎖（ｌｉｎｅａｒ）（すなわち、「直鎖（ｓｔｒａｉｇｈｔ−ｃｈａｉｎ）」）、分岐、又は環状、飽和、もしくは少なくとも部分的に及び場合によっては完全に不飽和（すなわち、アルケニル及びアルキニル）の炭化水素鎖を含む、Ｃ_１−２０を指し得る。「分岐」は、メチル、エチル、又はプロピルなどの低級アルキル基が直鎖アルキル鎖に結合したアルキル基を指す。「低級アルキル」は、１〜約８個の炭素原子、例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８個の炭素原子を有するアルキル基（すなわち、Ｃ_１−８アルキル）を指す。「高級アルキル」は、約１０〜約２０個の炭素原子、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個の炭素原子を有するアルキル基を指す。特定の実施形態において、「アルキル」は、Ｃ_１−８直鎖アルキルを指す。他の実施形態において、「アルキル」は、特に、Ｃ_１−８分岐鎖アルキルを指す。

アルキル基は、任意で、同一であっても、異なってもよい１つ以上のアルキル基置換基で置換され得る（「置換アルキル」）。「アルキル基置換基」は、アルキル、置換アルキル、ハロ、ニトロ、アミノ、アリールアミノ、アシル、ヒドロキシル、アリールオキシル、アルコキシル、アルキルチオ、アリールチオ、アラルキルオキシル、アラルキルチオ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、オキソ、及びシクロアルキルを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、任意で、アルキル鎖に沿って、１つ以上の酸素原子、硫黄原子、又は置換もしくは非置換窒素原子が挿入されてもよく、窒素置換基は、水素、低級アルキル（本明細書では「アルキルアミノアルキル」とも呼ばれる）、又はアリールである。

したがって、本明細書で使用される場合、「置換アルキル」は、本明細書で定義される、アルキル基の１つ以上の原子又は官能基が別の原子又は官能基（例えば、アルキル基、置換アルキル基、ハロゲン基、アリール基、置換アリール基、アルコキシル基、ヒドロキシル基、ニトロ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、硫酸基、及びメルカプト基を含む）で置換される、アルキル基を含む。
「アリール」は、本明細書では、ともに融合された、共有結合された、又は共通の基（メチレン部分もしくはエチレン部分などであるが、これらに限定されない）に連結された、芳香族単環もしくは芳香族多環であり得る、芳香族置換基を指すために使用される。共通の連結基はまた、ベンゾフェノンにおけるようにカルボニルであっても、ジフェニルエーテルにおけるように酸素であっても、ジフェニルアミンにおけるように窒素であってもよい。「アリール」は、ヘテロ環状芳香族化合物を特に網羅する。芳香族環（複数可）は、他の中でも、フェニル、ナフチル、ビフェニル、ジフェニルエーテル、ジフェニルアミン、及びベンゾフェノンを含み得る。特定の実施形態において、「アリール」は、５員炭化水素及び６員炭化水素芳香族環ならびにヘテロ環状芳香族環を含む、約５〜約１０個の炭素原子、例えば、５、６、７、８、９、又は１０個の炭素原子を含む環状芳香族を意味する。

アリール基は、任意で、同一であっても、異なってもよい１つ以上のアリール基置換基で置換され得（「置換アリール」）、「アリール基置換基」は、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アリールオキシル、アラルキルオキシル、カルボキシル、アシル、ハロ、ニトロ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アラルコキシカルボニル、アシルオキシル、アシルアミノ、アロイルアミノ、カルバモイル、アルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、アリールチオ、アルキルチオ、アルキレン、ならびに−ＮＲ'Ｒ''（Ｒ'及びＲ''はそれぞれ独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、及びアラルキルであり得る）を含む。
したがって、本明細書で使用される場合、「置換アリール」は、本明細書で定義される、アリール基の１つ以上の原子又は官能基が別の原子又は官能基（例えば、アルキル基、置換アルキル基、ハロゲン基、アリール基、置換アリール基、アルコキシル基、ヒドロキシル基、ニトロ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、硫酸基、及びメルカプト基を含む）で置換される、アリール基を含む。
アリール基の具体的な例としては、シクロペンタジエニル、フェニル、フラン、チオフェン、ピロール、ピラン、ピリジン、イミダゾール、ベンズイミダゾール、イソチアゾール、イソキサゾール、ピラゾール、ピラジン、トリアジン、ピリミジン、キノリン、イソキノリン、インドール、カルバゾールなどが挙げられるが、これらに限定されない。
「アラルキル」は−アルキル−アリール基を指し、任意に、このアルキル部分及び／又はアリール部分は、１又はそれ以上のアルキル又はアリール置換基を有する。

いくつかの実施態様において、用語「二価」は、他のアルキル、アラルキル、シクロアルキル又はアリール基のような他の２つの基に結合（例えば、共有結合）又は結合し得る基をいう。典型的には、この二価基上の２つの異なる部位（例えば、２つの異なる原子）が、他の分子上の基と結合することができる。例えば、この二価基はアルキレン基であってもよい。

「アルキレン」は、約１〜約２０個の炭素原子、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖の二価脂肪族炭化水素基を指す。アルキレン基は、直鎖であっても、分岐鎖であっても、環状であってもよい。アルキレン基はまた、任意で、１つ以上の「アルキル基置換基」で不飽和及び／又は置換され得る。任意で、アルキレン基に沿って、１つ以上の酸素原子、硫黄原子、又は置換もしくは非置換窒素原子が挿入されてもよく（本明細書では「アルキルアミノアルキル」とも呼ばれる）、窒素置換基は、既述のようにアルキルである。例示的なアルキレン基としては、メチレン（−ＣＨ_２−）；エチレン（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）；プロピレン（−（ＣＨ_２）_３−）；シクロヘキシレン（−Ｃ_６Ｈ_１０−）；−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−；−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ_２−；−（ＣＨ_２）_ｑ−Ｎ（Ｒ）−（ＣＨ_２）_ｒ−（式中、ｑ及びｒのそれぞれは独立して、０〜約２０、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０の整数であり、Ｒは、水素又は低級アルキルである）；メチレンジオキシル（−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−）；及びエチレンジオキシル（−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−）が挙げられる。アルキレン基は、約２〜約３個の炭素原子を有してもよく、６〜２０個の炭素原子を更に有してもよい。

「アリーレン」は、二価のアリール基を表す。
「アミノ」は、−ＮＲ'Ｒ''を表し、Ｒ'及びＲ''はそれぞれ独立して、水素、置換及び非置換のアルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール及びヘテロアリールから成る群から選択される。いくつかの実施態様において、このアミノ基は−ＮＨ_２である。「アミノアルキル」及び「アミノアリール」は−ＮＲ'Ｒ''を表し、Ｒ'は上記アミノにて定義されたとおりであり、Ｒ''は置換及び非置換のアルキル又はアリールである。
「カルボキシレート」及び「カルボン酸」はそれぞれ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ⁻及び−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨを指し得る。いくつかの実施形態において、「カルボキシレート」は、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ⁻基又は−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ基のいずれかを指し得る。
「アミド」は−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ'Ｒ''を表し、Ｒ'及びＲ''はそれぞれ独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アラルキル、置換アラルキル、アリール又は置換アリールである。

用語「ナノスケール」、「ナノ物質」、「ナノメートルスケールのポリマー」、「ナノクラスター」及び「ナノ粒子」は、約1000nm未満である寸法（例えば、長さ、幅、直径など）を有する少なくとも1つの領域を有する構造（例えば、小胞）を指す。いくつかの実施態様において、この寸法はより小さい（例えば、約500nm未満、約250nm未満、約200nm未満、約150nm未満、約125nm未満、約100nm未満、約80nm未満、約70nm未満、約60nm未満、約50nm未満、約40nm未満、約30nm未満、又は約20nm未満でさえも）である。いくつかの実施態様において、この寸法は約10nm未満である。
いくつかの実施態様において、このナノ粒子は、ほぼ球形である。このナノ粒子がほぼ球形である場合、特徴的な寸法はこの球体の直径に対応することができる。ナノ粒子又は他のナノスケール材料は、球形に加えて、円盤状、長方形、多面体、棒状、立方体又は不規則な形状であってもよい。ナノスケールの材料は、不規則な形状であってもよく、又は球体、棒状、円盤状又は立方体のクラスターを含んでもよい。
本明細書で使用する用語「マイクロ」（例えば、「マイクロニードル」において用いられる）は、約1,000μｍ未満の寸法を有する少なくとも1つの領域を有する構造を指す。いくつかの実施態様において、この用語「マイクロ」は、約1μｍ〜約1,000μｍの寸法を有する構造を指す。

用語「直径」は当該技術分野で認識され、本明細書では物理的直径又は流体力学的直径のいずれかを指すために使用される。本質的に球形の粒子の直径は、物理的又は流体力学的直径を意味することができる。本明細書で使用する非球形粒子の直径は、この粒子の表面上の２点間の最大直線距離を指すことができる。複数の粒子に関しては、粒子の直径は、典型的には、この複数の粒子の平均直径を指す。粒径は、動的光散乱などの当技術分野における様々な技術を用いて測定することができるが、これに限定されるものではない。
本明細書で用いられる「単分散」は、全ての粒子が同じ又はほぼ同じサイズである粒子の集団を記載するために使用される。例えば、「単分散」は、分布の90％がメジアン粒径の15％、10％又は5％以内にある粒子分布を指すことができる。

用語「ポリマー」及び「ポリマー性」は、複数の反復単位（すなわち、与えられた化学的基礎構造の複数のコピー）を有する化学構造を指す。本明細書中で使用される場合、ポリマーは、10以上の反復単位及び/又はこの反復単位がメチレン以外の基を有するグループを指すことができる。ポリマーは、重合可能なモノマーから形成することができる。この重合可能なモノマーは、反応して他の分子と結合を形成することができる１以上の反応性部分（例えば、シロキシエーテル、ヒドロキシル、アミン、ビニル基（すなわち、炭素−炭素二重結合）、ハロゲン化物（すなわち、Cl、Br、F、及びI）、活性化エステルなど）を有する分子を指す。一般に、各重合可能なモノマー分子は、２つ又はそれ以上の他の分子と結合することができる。いくつかの場合には、重合可能なモノマーは他の1つの分子のみに結合し、ポリマー材料の末端を形成する。いくつかのポリマーは、生物学的条件下で経年で分解することができるように、エステル又はアミドなどの生分解性結合を含む。

「コポリマー」は、２種以上のモノマーから導かれたポリマーを指す。
本明細書で使用される「ブロックコポリマー」は、ブロック（塊）（すなわち、コポリマー全体の重合性サブセクション）を直線的な順序で含むコポリマーを指す。この 「ブロック」は、マクロ分子の隣接する複数の部分に存在しない少なくとも1つの特徴を有するコポリマーの部分を指す。したがって、「ブロックコポリマー」は、隣接する複数のブロックが構成的に異なるコポリマーを指すことができる。すなわち、各ブロックは、異なる特徴を有する複数のモノマー種に由来する複数の構成単位から成る、又は構成単位の異なる組み合わせ若しくは構成単位の異なる配列分布を有する複数の構成単位から成る。

本明細書で使用される「生体適合性」は、一般に、レシピエントに対して一般的に無毒であり、レシピエントに如何なる重大な有害効果をも引き起こさないような、物質及び代謝物又はこれらの分解産物に関して使用される。
本明細書で使用される「生分解性」は、一般に、患者により代謝、排除、又は排泄されることができるより小さな単位又は化学種に、生理学的条件下で分解又は侵食される物質に関して使用される。いくつかの実施態様において、分解に要する時間は、ポリマー組成及び形態による。適当な分解時間は数日から数週間である。例えば、いくつかの実施態様において、ポリマーは、７日間から２４週間、任意に７日間から１２週間、任意に７日間から６週間、又はさらに任意に７日間から３週間の期間で分解することができる。

用語「親水性」は、水及び／又は水溶液に溶解又は優先的に溶解する基に関して使用されることができる。
用語「疎水性」は、水及び／又は水溶液に有意に溶解しない、及び/又は脂肪及び/又は非水溶液に優先的に溶解する基に関して使用される。
用語「両親媒性」は、親水基及び疎水基の両方を含む分子又はポリマーに関して使用される。
用語「結合体」及び「結合された」は、イオン結合、配位結合又は共有結合などを介して互いに結合した少なくとも2つの異なる化学的部分又は分子（例えば、小分子、ポリマー、タンパク質など）から成る組成物に関して使用される。いくつかの実施態様において、「結合体」は、互いに共有結合している部分又は分子を指す。いくつかの実施態様において、この結合体は、水素結合、ロンドン分散力、ファンデルワールス相互作用などの分子間力を介して互いに結合した２つの異なる化学的部分を含んでもよい。

本明細書で使用される「インスリン」は、ヒト又は他の哺乳動物由来のインスリンを指す。いくつかの実施態様において、「インスリン」はヒトインスリンを指す。いくつかの実施態様において、「インスリン」は組換えヒトインスリンを指す。
本明細書で使用される「生物活性誘導体」とは、１以上のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基によって置換され又は欠失し、そのＡ鎖及び／又はＢ鎖が、そのＮ末端又はＣ末端に１以上のアミノ酸残基の付加することによって伸長されており、及び／又はそのインスリンが１つ以上の化学的置換基の付加によって修飾されている、ヒト又は他の哺乳動物由来のインスリンを指す。この誘導体は、内因性インスリンを置換するように機能し、内在性インスリンの生物学的活性の少なくともいくらかを保持することができる。インスリン誘導体は、内因性インスリンとは異なる薬物動態を有することができる。投与量は、既知の薬物動態に基づくヒトインスリンに対するインスリン誘導体の薬物動態に基づいて、当業者が最適化することができる。

本明細書で使用される「糖尿病治療剤」は、糖尿病若しくはその合併症（例えば、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、緑内障及び糖尿病性ケトアシドーシスなど、但しこれらに限定されない）又は高血糖症をもたらす別のグルコース代謝障害を治療する治療剤を指す。いくつかの実施態様において、この糖尿病治療剤は、インスリン又はその生物活性誘導体又は糖尿病の治療に使用するために当該分野で公知の非インスリンベースの治療剤である。糖尿病の治療に使用するのに適した非インスリンベースの治療剤として、インスリン増感剤、DPP IV阻害剤、グルカゴン様ペプチド1（GLP-1）及びその類縁体、スルホニル尿素などの（但し、これに限定されない）インスリン分泌促進薬、メグリチニド、胃抑制ポリペプチド（GIP）、インスリン受容体活性化剤、ビグアニド、チアゾリジンジオン、α−グルコシダーゼ阻害剤などが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、糖尿病治療剤は、インスリン又はその生物活性誘導体である。

「架橋剤」又は「架橋試薬」は、同じであっても異なっていてもよい少なくとも２つの反応性官能基（又は脱保護若しくは脱ブロックされて反応性官能基を提供することのできる基）を有する化合物を指す。いくつかの実施態様において、この２つの反応性官能基は、異なる化学反応性を有してもよい。例えば、この２つの反応性官能基が、他の分子上の異なるタイプの官能基に対して反応性（例えば、共有結合などの結合を形成する）であるか、又はこの２つの反応性官能基のうちの一方が、他方の反応性官能基よりも別の分子上の特定の官能基とより迅速に反応するようなものであってもよい。したがって、この架橋剤は、２つの他の実体（例えば、分子、ポリマー、タンパク質、核酸、小胞、リポソーム、ナノ粒子、微粒子など）を連結（例えば、共有結合で）させて、架橋結合組成物を形成するために使用されることができる。

「小胞」は、分子又はポリマー（例えば、両親媒性ポリマー）の同心円状の層又は複数の層で囲まれた流体を含む、人工的に形成された粒子（いくつかの実施態様において、ナノ粒子）を指すことができる。この流体中に、１つ又はそれ以上の治療剤（例えば、小分子、タンパク質、核酸など）が溶解又は懸濁されていてもよい。本発明のいくつかの実施態様において、この流体は、水溶液に溶解された、インスリン又はその生物活性誘導体などの糖尿病治療剤、及びグルコースオキシダーゼなどのグルコース酸化剤を含んでもよい。この流体は、インスリン又はその生物活性誘導体、及び糖尿病又はその合併症を治療するための非インスリンベースの薬剤などの別の治療剤の両方のような、２つ以上の治療剤を含んでもよい。いくつかの実施態様において、各治療剤は、水溶性の治療剤であってもよい。

本明細書で使用される「高血糖症」は、健康な個体と比較して、より上昇した量のグルコースが患者の血漿中に循環する状態を指すことができる。高血糖は、空腹時血糖値の測定を含む当技術分野で公知の方法を用いて診断することができる。
本明細書で使用される「高インスリン血症」は、より上昇した量のインスリンが循環すると同時に血糖値が上昇又は正常のいずれかである状態を指すことができる。高インスリン血症は、高トリグリセリド、高コレステロール、高低密度リポタンパク質（LDL）及び低高密度リポタンパク質（HDL）、高尿酸値、多嚢胞性卵巣症候群、２型糖尿病及び肥満などの異常脂質血症に関連するインスリン抵抗性によって引き起こされ得る。

本明細書で使用される「インスリン抵抗性」は、正常量のインスリンが正常な生理学的応答又は分子応答を生成できない状態を指すことができる。いくつかの場合、内因的に産生されるか又は外因的に投与された、超生理学的量のインスリンが、インスリン抵抗性の全部又は一部を克服し、生物学的応答を生じさせることができる。
本明細書で使用される「メタボリックシンドローム」は、高インスリン血症、異常グルコース耐性、肥満、腹部又は上半身コンパートメントへの脂肪の再分布、高血圧、異常フィブリン分解、並びに高トリグリセリド、低密度リポタンパク質（HDL）-コレステロール及び高密度低密度リポタンパク質（LDL）粒子を特徴とする異常脂質血症などを含む（但し、これらに限定されない）形質の関連クラスターを指すことができる。メタボリックシンドロームの患者は、２型糖尿病及び／又は他の障害（例えば、アテローム性動脈硬化症）の発症のリスクがある。
本明細書で使用する用語「グルコース耐性」は、グルコース摂取が変動する場合に、患者が血漿グルコース及び／又は血漿インスリンのレベルを制御する能力を指すことができる。例えば、グルコース耐性は、血漿グルコースのレベルを約１２０分以内にグルコースの摂取前のレベルに戻す能力を包含する。

ＩＩ．一般的考察
血糖の上昇に応答してインスリンを「分泌」することができる人工膵臓様閉ループグルコース応答性インスリン送達システムは、最小限の患者努力で糖血症を調節する望ましい方法、及び糖血症と生活の質の潜在的改善を提供することができる。Bratlie et al., Advanced Healthcare Materials, 1(3):267-284 (2012); Ravaine et al., J. Controlled Release, 132(1):2-11 (2008); 及びWu et al., Chem. Rev., 111(12):7855-7875 (2011)を参照されたい。現在の閉ループシステムは、グルコース監視モジュールとセンサ起動型インスリン放出モジュールとを組み合わせている。Bratlie et al., Advanced Healthcare Materials, 1(3):267-284 (2012); 及びRavaine et al., J. Controlled Release, 132(1):2-11 (2008)を参照されたい。例えば、患者によって調整された連続グルコース監視センサと外部インスリン注入ポンプとを使用する閉ループ電子/機械装置がある。Veiseh et al., Nature Reviews Drug Discovery, 14(1):45-57 (2015)を参照されたい。しかし、このようなデバイスには、正確な信号フィードバックを保証することやバイオファウリングを防止するなどの様々な課題がある。

これらの課題のいくつかを回避する1つの方法に、グルコースを感受する要素を有するインスリン充填マトリックスを利用する化学的アプローチがある。このマトリックスは、グルコース濃度変化に応答して、構造的変形（例えば、収縮、膨張、又は解離）が起こり、グルコース刺激インスリン放出をもたらするように設計することができる。Gordijo et al., Adv. Funct. Mater., 21(1):73-82 (2011); Gu et al., ACS Nano, 7(8):6758-6766 (2013); Katoaka et al., J. Am. Chem. Soc., 120(48):12694-12695 (1998); 及びGu et al., ACS Nano, 7(5):4194-4201 (2013)を参照されたい。合成閉ループデバイスに可能性のあるグルコース感受部分として、フェニルボロン酸（PBA）、グルコース結合タンパク質（GBP）、及びグルコースオキシダーゼ（GOx）が挙げられる。残念なことに、既存の合成閉ループシステムの大部分は、インビトロ研究に限定されており、グルコース感受戦略に関連する特定の問題のためにインビボでの適用性は比較的小さい。例えば、フェニルボロン酸（PBA）及びその誘導体は、グルコースなどのポリオール分子との可逆的相互作用について知られている（Aronoff et al., Carbohydr. Res., 40(2):299-309 (1975) を参照されたい。）。しかし、グルコースとフェニルボロン酸（PBA）との間の効率的な相互作用及びその後のマトリックスの構造変化は、通常、生理学的環境より高い塩基性pHを必要とする。フェニルボロン酸（PBA）結合体の安全性及び毒性もまだ確立されていない。コンカナバリンＡ（Con A）は、一般にその複数の結合部位並びにグルコース及びデキストランとの競合的相互作用に基づいて、インスリン送達のために最も一般的に使用されるグルコース結合タンパク質（GBP）である（マトリックス材料として使用される）。Kim et al., J. Controlled Release, 11(1):193-201 (1990)を参照されたい。しかし、コンカナバリンＡ（Con A）のインビボの毒性及び不安定性は、その臨床応用を制限している。Tiegs et al., J. Clin. Invest., 90(1):196 (1992)を参照されたい。

グルコースオキシダーゼ（GOx）は、酸素の存在下でグルコースをグルコン酸に変換することができる酵素である：

Wu et al., Chem. Rev., 111(12):7855-7875 (2011)参照されたい。従来、グルコースオキシダーゼ（GOx）を用いたグルコース応答性システムは、プロトン化されていてもよいし、グルコース濃度の増加によって促進されるｐＨの局所的な低下によって分解されてもよいｐＨ応答性材料と一体化されていた。しかし、このようなｐＨ低下に依存する方法は、特に緩衝生理学的環境において、応答が遅いことによって損なわれる可能性がある。Veiseh et al., Nature Reviews Drug Discovery, 14(1):45-57 (2015)を参照されたい。

本発明は、（1）正常な膵臓活性に対する薬物動態をよりよく模倣するための、迅速な応答性、（2）投与の容易さ、及び（3）長期間の副作用のない生体適合性、を組み合わせたインスリン送達方法を提供する。より詳細には、本発明は、インスリン（及び/又は別の糖尿病治療剤）及びグルコース酸化剤（例えば、GOx）を含む低酸素感受性小胞に基づくインスリン（及び/又は他の糖尿病治療剤） を送達する装置を提供する。本発明の装置は、酵素的に引き起こされたpH変化を利用する代わりに、インスリン（及び/又は別の糖尿病治療剤）の放出を迅速に促進するために、高血糖へ応答したグルコースの酸化による酸素消費をトリガーとして、これに起因する低酸素の局部的な発生を利用する。酸素の輸送係数は、インビボでの水素イオンの拡散係数よりも遅いことが示されており、これは、低酸素感受性物質をグルコース酸化剤に基づくグルコース応答性処方に組み込めば、より速い応答が可能であることを示唆している。Fletcher, Biophys. J., 29(3):437-458 (1980); Michaels et al. AICHE J., 21(5):985-996 (1975); 及びDowd et al., Journal of Bone and Joint Surgery, British Volume, 65(1):79-83 (1983) を参照されたい。

本発明の実施態様において、低酸素感受性形質導入を達成するために、低酸素感受性物質として２−ニトロイミダゾール（NI）修飾物質を使用した。２−ニトロイミダゾール（NI）は、腫瘍部位における低酸素状態に対する感受性が高いので、がんの画像化によく利用される疎水性成分である。Nunn et al., Eur. J. Nucl. Med., 22(3):265-280 (1995); 及びKrohn et al., J. Nucl. Med., 49(Suppl. 2):129S-148S (2008).を参照されたい。２−ニトロイミダゾール（NI）は、一連のニトロレダクターゼによって触媒される単一電子還元を介して、低酸素環境下で親水性の２−アミノイミダゾールに変換されることができ、生物組織に多く存在するニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADPH）のような生物還元剤に結合する。Nunn et al., Eur. J. Nucl. Med., 22(3):265-280 (1995); Krohn et al., J. Nucl. Med., 49(Suppl. 2):129S-148S (2008); Edwards, J. Antimicrob. Chemother., 31(1):9-20 (1993); 及びTakasawa et al., Stroke, 39(5):1629-1637 (2008). (25-28)を参照されたい。

図１Ａに示すように、アミン官能化２−ニトロイミダゾール（NI）は、生体適合性で生分解性のポリマーであるヒアルロン酸（HA;分子量：300kDa）に結合した。両親媒性低酸素感受性ヒアルロン酸（HS-HA）は、自己集合により、ナノスケールグルコース応答性小胞（GRVs）を直ちに形成することができ、これは、水溶液中で、組換えヒトインスリン（及び/又は別の糖尿病治療剤）及びグルコース酸化剤（GOxなど）をカプセル化することができる。高血糖の存在下では、グルコース酸化剤によって触媒されるグルコース酸化により溶存酸素が急速に消費され、局所的な低酸素環境をもたらす。次いで、低酸素感受性ヒアルロン酸（HS-HA）上の２−ニトロイミダゾール（NI）基は、NADPH及びレダクターゼの存在下で親水性２−アミノイミダゾールに還元され、これはグルコース応答性小胞（GRVs）の解離及びそれに続くインスリン（及び/又は他の糖尿病治療剤）の放出をもたらす。

投与を容易にするために、本発明のグルコース応答性小胞（GRVs）をマイクロニードル（MN）アレイベースのパッチに充填して、糖尿病治療剤（例えば、インスリン）の痛みのない送達に利用することができる。図１Ｂ及び４Ａを参照されたい。例えば、図４Ａに示すように、マイクロニードルのマトリックスは、架橋ヒアルロン酸(HA)から作製することができる。この架橋はマイクロニードルの剛性を改善し、ニードルからグルコース応答性小胞（GRVs）が失なわれることを制限することができる。図１Ｂに示すように、皮下投与すると、マイクロニードルに充填されたグルコース応答性小胞（GRVs）は、血管及びリンパ毛細血管網中の高濃度の間質液グルコースに曝されて分解し、それによって糖尿病治療剤（例えばインスリン）の放出が促進され、これは局所的リンパ管及び毛細血管を通して迅速に吸収される。以下に記載されるように、低酸素感受性のグルコース応答性機構を有する例示的な「スマートインスリンパッチ」は、Ｉ型糖尿病のマウスモデルにおいて、急速なグルコース調節応答性及び低血糖症の確実な回避を示すことができる。

ＩＩＩ．グルコース応答性小胞、関連組成物及びシステム
血糖に応答してインスリンを「分泌する」閉ループインスリン送達システムは、１型及び進んだ２型の糖尿病を治療し、糖尿病患者の生活の質を改善するために非常に有望である。本発明は、いくつかの実施態様において、低酸素感受性小胞を含む無痛のマイクロニードルアレイパッチを使用したインスリン及び/又は別の糖尿病治療剤を送達するためのグルコース応答性送達デバイスを提供し、この低酸素感受性小胞は、高血糖状態でグルコースの酵素酸化によって生成された局所的低酸素環境に曝された場合に、速やかに解離し、閉じ込められていた治療剤（例えば、インスリン）を放出することができる。この「スマートインスリンパッチ」は、迅速な応答で血糖を調節し、低血糖を回避することができる。
いくつかの実施態様において、本発明は、糖尿病治療剤（例えば、インスリン又はその生物活性誘導体）を、例えば、糖尿病又は他の高血糖をもたらすグルコース代謝の障害を制御するために、それを必要とする患者に送達するための組成物に関する。いくつかの実施態様において、本発明の組成物は、それを必要とする患者に、グルコース応答性閉ループ糖尿病治療剤の送達を提供することができ、それにより、より安価で簡単な糖尿病の制御法を提供し、糖尿病の治療における低血糖合併症の予防法を提供することができる。

いくつかの実施態様において、本発明は以下（a）〜（c）から成る組成物を提供する。
（a）低酸素感受性疎水基に結合した親水性ポリマーを含む両親媒性ポリマー材料であって、該低酸素感受性疎水基が、低酸素環境下で還元されて親水性部分を形成することができる低酸素感受性部分を含む、両親媒性ポリマー材料、
（b）糖尿病治療剤（任意に、インスリン又はその生物活性誘導体）、及び
（c）グルコース酸化剤。
この親水性ポリマーは、合成又は天然の生体適合性ポリマーであってもよい。適当な親水性ポリマーは、極性又は荷電した側鎖部分を含んでもよい。いくつかの実施態様において、この親水性ポリマーは生分解性であってもよい。適当な親水性ポリマーとして、ポリアミノ酸（ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸など）、合成ブロックコポリマー（例えば、少なくとも1つのブロックが親水性ポリマー鎖を含む）、及びグルコサミノグリカン（GAGs）などの多糖類が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、この親水性ポリマーは、ヒアルロナン又はヒアルロン酸などのグルコサミノグリカン（GAGs）、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、又はケラチン硫酸である。いくつかの実施態様において、この親水性ポリマーはヒアルロン酸である。

上に示したように、この疎水基は、低酸素感受性部分、例えば、酸素の減少（例えば、この両親媒性ポリマーと接触している溶媒中又は生理学的環境中）に応答して化学反応又は他の構造変化を受ける部分を含む。例えば、この低酸素感受性基は、酸素の減少に応答して１又は複数の還元反応を受けることができる。この還元反応は、酵素によって触媒されてもよい。いくつかの実施態様において、この酸素の減少は、両親媒性ポリマー材料と接触してグルコースを酸化するグルコース酸化剤の活性によって引き起こされる局所的酸素の欠乏の結果であってもよい。したがって、いくつかの実施態様において、この低酸素は、この両親媒性ポリマー材料及びその関連グルコース酸化剤に近いグルコース濃度の増加の副作用である。
代表的な低酸素感受性部分として、ニトロ置換アリール基が挙げられる。いくつかの実施態様において、この低酸素感受性部分は、ニトロイミダゾール（例えば、２−ニトロイミダゾール）である。このニトロイミダゾールは、イミダゾール環上で置換されたニトロ基に加えて、イミダゾール環の炭素及び/又は窒素原子上で置換された１又はそれ以上のアリール基置換基（例えば、アルキル、ハロゲンなど）を含んでもよい。いくつかの実施態様において、この低酸素感受性部分は、２以上のニトロ基を含んでもよい

いくつかの実施態様において、この疎水基はこの親水性ポリマーに共有結合で結合する。例えば、この疎水基は、アミノ基を含む前駆体分子に基づくものであってもよい。この前駆体分子のアミノ基は、この親水性ポリマー上に存在するカルボン酸基とアミド結合を形成してもよい。いくつかの実施態様において、この両親媒性ポリマー材料は、6-（2-ニトロイミダゾール）ヘキシルアミン、5-（2-ニトロイミダゾール）ペンチルアミン、4-（2-ニトロイミダゾール）ブチルアミン、7-（2-ニトロイミダゾール）ヘプチルアミン、8-（2-ニトロイミダゾール）オクチルアミンなどのような（これに限定されるものではない）、2-ニトロイミダゾール置換アルキルアミンに結合したヒアルロン酸（又はカルボン酸側鎖基を含む別の親水性ポリマー）から成ってもよい。
グルコース酸化剤としては、如何なる適当なグルコース酸化剤を使用してもよい。いくつかの実施態様において、このグルコース酸化剤は、グルコースを酸化して過酸化水素及びD-グルコノ-δ-アクトン（グルコン酸の環状形態）を生成するグルコースオキシダーゼ（GOx）（EC1.1.3.4）のような酵素である。いくつかの実施態様において、このグルコース酸化剤は、グルコースオキシダーゼ（GOx）の生物学的に活性な変異体であってもよい。

いくつかの実施態様において、糖尿病治療剤は、ヒトインスリン、組換えヒトインスリン、非ヒト動物源（例えば、ウシ、ブタ）由来のインスリン又はインスリン誘導体を含む他のインスリンなどのインスリン又はその生物活性誘導体である。いくつかの実施態様において、このインスリンは、意図するレシピエントと同じ種のもの（すなわち、ヒトの治療のためにはヒトインスリン）である。このインスリン又はその生物活性誘導体は、異なる複数のインスリン及び/又は誘導体の混合物を含んでもよい。このインスリン又はその生物活性誘導体は、速効型インスリン、超速効型インスリン類似体、中間型インスリン及び/又は持続型インスリンであってもよい。いくつかの実施態様において、このインスリン又はその生物活性誘導体は、速効型インスリン又は超速効型インスリンである。
速効型インスリンは1〜20分以内に作用し始め、約1時間後にピークに達し、その作用は3〜5時間持続する。速効型インスリンは、全身循環に完全に吸収されるまでに約2時間を要する。速効型インスリンとして、正規の組換えヒトインスリン（例えば、Lillyによって販売されるHUMULIN（商標）及びNovoNordiskによって販売されるNOVOLIN（商標）など）が挙げられる。ウシ及びブタのインスリンは、いくつかのアミノ酸がヒトインスリンと異なるが、ヒトにおいて生物活性であり、これらもまた速効型インスリンである。
超速効型インスリンには、吸収速度を高めるために複数のアミノ酸を修飾した又はその位置を変更したインスリンが含まれる。市販の超速効型インスリン類似体として、Lisproインスリン（Hysalil（登録商標）としてEli Lillyによって販売されているリジン−プロリンインスリン）、グリュリシンインスリン（APIDRA（商標）としてSanofi-Aventisによって販売されている）及びaspartインスリン（NOVOLOG（商標）としてNovo Nordiskによって販売されている）の3種類が入手可能である。

中間型インスリンは、短時間作用型のインスリンよりも寿命が長いが、作用開始が遅く、最大強度に達するまでに時間がかかる。中間型インスリンは通常、注射後2〜4時間以内に作用し始め、注射後4〜14時間の間のピークに達し、注射後24時間まで効果がある。中間型インスリンの種類には、NPH（ニュートラルプロタミンハドゴン）インスリンとLENTE（商標）インスリンがある。NPHインスリンは、吸収速度を遅くするプロタミンを含むため、血流に到達するのに時間がかかるが、ピークと寿命が長い。
持続型インスリンとして、Eli Lilly社のHumulin（商標）U（Ultralente（商標）ヒトインスリン（組換えDNAを起源）拡張亜鉛懸濁液）、及びインスリングラルギン（LANTUS（商標）Aventis）が挙げられる。インスリングラルギンは、24時間まで持続可能な組換えヒトインスリン類似体である。それは、21位のアスパラギンの代わりにグリシンを有し、2つのアルギニンがβ鎖のカルボキシ末端に付加されている点で、ヒトインスリンと異なる。LANTUS（商標）は、透明な水性液に溶解したインスリングラルギンからなる（100IU、3.6378mgのインスリングラルギン、30μgの亜鉛、2.7mgのm-クレゾール、20mgのグリセロール85％、及び1mLまでの水）。

本発明の組成物は、これらのインスリン若しくはその生物活性誘導体に追加又はその代替として、糖尿病又はその合併症又は別のグルコース代謝障害を治療するために当該分野で公知の非インスリンベースの活性剤を含んでもよい。したがって、いくつかの実施態様において、本発明の組成物は、以下に列挙する非インスリンベースの糖尿病治療剤を含んでもよい。その非インスリンベースの糖尿病治療剤とは、例えば、グルコゴン様ペプチド1（GLP1）又はその類似体、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤、スルホニルウレア、チアゾリジンジオン又はビグアナイドである。

いくつかの実施態様において、両親媒性ポリマー材料は、糖尿病治療剤（例えば、インスリン若しくはその生物活性誘導体、及び/又は他の糖尿病治療剤）及びグルコース酸化剤を含むナノ粒子を形成し、これらは、ナノ粒子の内部（例えば、ナノ粒子内の細孔又は他の内部空間内）に封入又は捕捉されるか、又はこのポリマー材料と非共有結合する。いくつかの実施態様において、低酸素感受性部分の還元はこのナノ粒子構造を破壊し（例えば、両親媒性ポリマーがより親水性になるにつれて）、糖尿病治療剤（例えば、インスリン又はその生物活性誘導体）をこのナノ粒子から分散させる（例えば、拡散によって）。いくつかの実施態様において、この両親媒性ポリマー材料は、糖尿病治療剤（例えば、そのインスリン又はその生物活性誘導体）及びグルコース酸化剤をカプセル化した小胞を形成する。その低酸素感受性部分の還元（例えば、グルコースの増加によるグルコース酸化剤の活性の増加に起因する低酸素症に応答して）は、小胞の解体及び糖尿病治療剤（例えば、インスリン又はその誘導体）の放出をもたらすことができる。

いくつかの実施態様において、このナノ粒子及び/又は小胞は、約50〜約500nmの平均直径を有する。いくつかの実施態様において、この平均直径は約50〜約250nmである。いくつかの実施態様において、この平均直径は約80〜約160nmである（例えば、約80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155又は160nmである。）。いくつかの実施態様において、このナノ粒子及び/又は小胞は、約118nmの平均直径（例えば、動的光散乱によって測定される）を有する。いくつかの実施態様において、このナノ粒子及び/又は小胞は、単分散又はほぼ単分散であってもよい（例えば、その分布の少なくとも約80％がメジアン粒径の15％、10％又は5％以内にある）。

いくつかの実施態様において、本発明の組成物（例えば、このナノ粒子及び/又は小胞）は、糖尿病治療剤（例えば、インスリン又はその生物活性誘導体）の送達用のマイクロニードル又はマイクロニードルアレイを製造するために使用されることができる。
いくつかの実施態様において、本発明は、複数の小胞及び/又はナノ粒子を含む複数のマイクロニードルを含むマイクロニードルアレイを提供する。この複数の小胞及び/又はナノ粒子は、低酸素感受性疎水基と（例えば、共有結合で）結合した親水性ポリマーを含む両親媒性ポリマー材料を含み、この低酸素感受性疎水基は、低酸素環境下で還元されて親水性部分を形成することができる低酸素感受性部分を含み、さらに、この小胞内には（i）糖尿病治療剤（任意に、インスリン又はその生物活性誘導体）及び（ii）グルコース酸化剤が含まれる。いくつかの実施態様において、このマイクロニードルアレイは、複数のマイクロニードルを含むことができ、この複数のマイクロニードルのそれぞれの長さは、約20μｍ〜約1000μｍの範囲（例えば、約20, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 500, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950、又は約1000μｍ）である。いくつかの実施態様において、この複数のマイクロニードルの各々の長さは約500μｍ〜約700μｍである。いくつかの実施態様において、各マイクロニードルは、ほぼ円錐形又はピラミッド形であってもよい。いくつかの実施態様において、このマイクロニードルの先端は、約100μｍ未満、約75μｍ未満、約50μｍ未満、約40μｍ未満、約30μｍ未満、又は約20μｍ未満であってもよい。いくつかの実施態様において、このマイクロニードルの各々の先端は、約10μｍであってもよい。

このマイクロニードルアレイは、複数のマイクロニードルを含むことができ、このマイクロニードルの基部は、任意の適当な２次元パターンで配置される。このマイクロニードルは、個々のマイクロニードルの間の距離が同じか又は反復様式で変化する規則的な配列（例えば、正方形、長方形、円形、楕円形又は他の形状のパターン）、又は不規則な配列（例えば、個々のマイクロニードル間の距離が、認識不可能な反復様式で変化する）で配置されていてもよい。
いくつかの実施態様において、このマイクロニードルアレイは、皮膚パッチの一部として提供されてもよい。いくつかの実施態様において、このマイクロニードルアレイは、1つ又は複数の裏張り層を有してもよい（例えば、水分又は物理的損傷（例えば、傷）からマイクロニードルアレイを保護するために）。いくつかの実施態様において、このマイクロニードルアレイは、皮膚へのアレイの取り付けを補助するための皮膚適合性接着剤を含む、このアレイから外側に延びる層（例えば、アレイの底面と同一平面の）を有してもよい。
本発明のマイクロニードルアレイは、糖尿病治療剤（例えば、インスリン又はその生物活性誘導体及び/又は別の糖尿病治療剤）をグルコース応答性又は依存性の様式で放出することができる。いくつかの実施態様において、この糖尿病治療剤（例えば、インスリン又は生物活性誘導体）の放出速度は、このアレイと接触するグルコースの濃度に依存する（例えば、このアレイが高濃度のグルコースと接触すると放出速度はより速くなる。）。いくつかの実施態様において、このマイクロニードルアレイは閉ループインスリン送達システムである。

ＩＶ．治療法
いくつかの実施態様において、本発明は、インスリン又は生物活性インスリン誘導体などの糖尿病治療剤を、それを必要とする患者に送達する方法を提供する。この方法は、組成物（例えば、ナノ粒子及び/又は小胞）を患者に投与することを含む。この投与は、任意の適当な経路（例えば、経口、静脈内（i.v.）、腹腔内（i.p.）、皮下、筋肉内、経皮、又は吸入）で行うことができる。本発明の組成物は、任意の適当な薬学的に許容される担体（例えば、水）、ビヒクル又は希釈剤中に治療有効量で含有させて、提供することができる。
この「治療有効量」とは、個体へのその量の投与（単回投与又は一連の投与の一部として）が、患者に対して明らかな効果を生じるのに有効であることを意味する。例えば、この治療有効量は、患者の血中グルコース濃度を低下させるのに必要な量、又はグルコース負荷試験の結果を改善するのに必要な量であってもよい。したがって、治療有効量は、空腹時血漿グルコース（FPG）の任意のレベル（例えば、ベースラインレベル）を低下させるのに十分な量であってもよく、その治療有効量は、例えば、200mg/dLより大きいFPGレベルを200mg/dL未満に低下させるのに十分な量であるか、又は約175mg/dL〜約200mg/dLのFPGレベルを約175mg/dL未満にするのに十分な量である。いくつかの実施態様において、治療有効量は、空腹時血漿グルコース（FPG）レベルを約150mg／dL未満、約125mg／dL未満、約120mg／dL未満、約115mg／dL未満、又は約110mg／dL未満に減少させるのに十分な量である。この治療有効量は、投薬計画及び患者の状態の診断分析結果（例えば、血漿中のグルコース及び/又はインスリンのレベルのモニタリング）に応じて調整してもよい。この治療有効量は、患者の健康状態及び身体状態、患者の体重、所望する疾患の解消程度、インスリン又はインスリン誘導体（又は他の糖尿病治療剤）の活性、グルコース酸化剤の活性、製剤処方などによって変えてもよい。

いくつかの実施態様において、本発明の方法は、本発明のマイクロニードルアレイを準備する段階、及びこのマイクロニードルアレイを患者の皮膚表面に適用する段階から成る。このマイクロニードルアレイがグルコースと接触するとグルコースは酸化され、それにより低酸素環境が作り出され、その結果、両親媒性ポリマー材料の疎水基の低酸素感受性部分が還元されて親水性部分を形成する。この親水性部分を形成は、両親媒性ポリマー材料を含む小胞及び/又はナノ粒子の破壊、ならびに小胞及び/又はナノ粒子に含まれる糖尿病治療剤（例えば、インスリン又は生物活性インスリン誘導体）の放出をもたらすことができる。いくつかの実施態様において、糖尿病治療剤（例えば、インスリン又は生物活性インスリン誘導体）の送達は、マイクロニードルアレイと接触するグルコース濃度に相当する速度で行われる。
いくつかの実施態様において、複数のマイクロニードルアレイを、例えば、同時又は逐次的に患者の皮膚表面に適用することができる。例えば、マイクロニードルアレイを、数時間ごとに順次適用してもよい。いくつかの実施態様において、1つ又は複数のアレイを、患者による食物の摂取の前に、その間に、又はその後数分以内（例えば、約5〜約120分以内）に、適用してもよい。いくつかの実施態様において、患者による食物の摂取前にアレイが適用され、患者による食物の摂取後数分以内に第２のアレイが適用される。

このマイクロニードルアレイは、（例えば、患者の体重に基づいて）処置される患者に適当な糖尿病治療剤（例えば、インスリン又はその生物活性誘導体）の適当な単位投与量及び/又は実際の又は予想される血中グルコース濃度（例えば、被験者による実際の又は予想される食物摂取量（特に炭水化物摂取量）に基づいて）処置されている被験者）。
マイクロニードルアレイは、治療される患者に適した（例えば、対象の体重に基づいて）適切な、及び/又は治療される患者の実際の又は予想される血中グルコース濃度に基づいた（例えば、実際の又は予想される患者の食物摂取量（特に、炭水化物摂取量）に基づいて）適当な単位用量の糖尿病治療剤（例えば、インスリン又はその生物活性誘導体）を含んでもよい。この「単位用量」は、所望の効果又は明らかな効果を生じるのに十分な所定の量のインスリン、グルコース酸化剤及び/又は他の治療剤を含有する個別の単位を指すことができる。
いくつかの実施態様において、小胞内に１以上の追加の治療剤が含まれ、糖尿病治療剤（例えば、インスリン又はその生物活性誘導体）と共に放出されてもよい。いくつかの実施態様において、この追加の治療剤は水溶性である。いくつかの実施態様において、この追加の治療剤は、タンパク質又はタンパク質誘導体である。

いくつかの実施態様において、小胞は、インスリン（又はその生物活性誘導体）及び追加の治療剤の両方を含んでもよく、この追加の治療剤は、糖尿病又はその合併症（例えば、糖尿病性ニューロパチー、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、緑内障、糖尿病性ケトアシドーシス、細菌性又は真菌性感染症）を治療するための別の薬剤である。例えば、いくつかの実施態様において、この追加の治療剤は、当該分野で公知であって、糖尿病（例えば、２型糖尿病）の治療に使用される１又はそれ以上の非インスリンベースの活性剤であってもよい。この非インスリンベースの糖尿病治療剤は、インスリン増感剤、DPP IV阻害剤、及びGLP1類似体、インスリン分泌促進薬を含むいくつかの広範な種類の薬物を含むがこれらに限定されまない。これには、スルホニルウレア、例えば、アセトヘキサミド（DYMELOR）、クロルプロパミド（DIABINESE）、トラザミド（TOLINASE）、トルブタミド（ORINASE）、グリメピリド（AMARYL）、グリピジド（GLUCOTROL）、グリピジド延長放出剤（GLUCOTROL XL）、グリブリド（DIABETA、MICRONASE）、グリブリド微粉化剤（GLYNASE、PRESTAB）、ナテグリニド（STARLIX）及びレパグリニド（PRANDIN）などのメグリチニド、胃阻害ポリペプチド（GIP）、グルカゴン様ペプチド（GLP）-1、モルフィリノグアニドBTS67582、ホスホジエステラーゼ阻害剤及びコハク酸エステル誘導体、インスリン受容体活性化剤;インスリン感受性ビグアニド、例えば、メトホルミン（GLUCOPHAGE）、トログリタゾン（REZULIN）、ピオグリタゾン（ACTOS）、ロージグリタゾン（AVANDIA）、MCC-555、リボグリタゾン、シグリタゾンなどのチアゾリジンジオン（TZD）、非TZDペルオキシソーム増殖因子活性化受容体-γ（PPAR-γ）アゴニストGL262570、α-グルコシダーゼ阻害剤、例えば、アカルボース（PRECOSE）及びミグリトール（GLYSET）、グルコバンス（グリブリドとGLUCOPHAGE）のような組合せ剤、バナジウムのようなチロシンホスファターゼ阻害剤、PTP-1B阻害剤、及び5-アミノイミダゾール-4-カルボキサミドリボヌクレオシド（AICAR）及びその他の薬剤（エキセンディン（EXENATIDE（合成エキセンジン-4））及びアミリン（SYMLIN（商標）（酢酸プラムリンタイド）など）を含むAMPK活性化剤、D-キロイノシトール、変性ペプチドリガンド（NBI-6024）、アネルギーDB複合体、GABA阻害メラノコルチン、グルコース降下剤（ALT-4037）、エアロドース（AEROGEN）、インスリン模倣体、インスリン様成長因子-1単独又はBP3との複合体（SOMATOKLINE）、メトクロプラミドHCL（Emitasol/SPD 425）、モトリル/エリスロマイシン類似体、及びGAG模倣体が含まれる。特定の実施態様において、この非インスリンベースの糖尿病治療剤は、チアゾリジンジオン、例えば、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、トログリタゾン、MCC-555、リボグリタゾン、シグリタゾンなど及びそれらの組み合わせのインスリン増感剤であってもよいが、これらに限定されない。

いくつかの実施態様において、本発明に従って治療される「患者」はヒト患者であるが、本発明の方法は、この「患者」という用語に含まれることが意図される全ての脊椎動物種に対して有効であると理解されるべきである。
より詳細には、本発明が提供するのはヒトや以下の哺乳類のような哺乳類の治療法であり、それには、絶滅危惧種（シベリアトラなど）のため、経済的重要性のため（人間が消費するために農場で飼育された動物）及び/又は社会的重要性のため（ペットや動物園で飼育され鵜動物）に重要な哺乳類が含まれ、例えば、ヒト以外の肉食動物（ネコ、イヌなど）、ブタ類（ブタ、ブタ、イノシシ）、反芻動物（ウシ、ウシ、ヒツジ、キリン、鹿、ヤギ、バイソン、及びラクダなど）及び馬が含まれる。したがって、本発明の方法の実施態様には、家畜（ブタ及び豚）、反芻動物、ウマ、家禽などを含む家畜の治療法が含まれるが、これに限定されない。

一般に、本発明の方法は、糖尿病の患者又は血糖濃度の上昇（すなわち、高血糖症）をもたらすその他のグルコース代謝障害を有する患者を治療するために使用することができる。この用語「グルコース代謝障害」は、健康な個体と比較して、被験者における血糖値の上昇及び/又はインスリンレベルの上昇に関連する一つの臨床症状又は複数の臨床症状の組み合わせによって特徴付けられる如何なる障害をも包含する。グルコース及び/又はインスリンの上昇レベルは、以下の疾患、障害及び状態において現れる可能性がある：高脂血症、II型糖尿病、妊娠糖尿病、I型糖尿病、インスリン抵抗性、耐糖能障害、高インスリン血症、グルコース代謝障害、糖尿病前症候群、他の代謝障害（例えば、シンドロームXとも呼ばれるメタボリックシンドローム）及び 肥満など。

概して、「糖尿病」及び「糖尿病の」という用語は、インスリンの不適当な生成又は利用を伴う進行性の糖代謝疾患を指し、しばしば高血糖及び尿糖を特徴とする。本明細書において使用される「前糖尿病」及び「前糖尿病の」という用語は、患者が、糖尿病で典型的に観察される特徴や症状などは持たないが、未治療のまま放置すると糖尿病に進行することがある特徴や症状などを有する状態を指すことができる。これらの状態の存在は、例えば、空腹時血漿グルコース（FPG）試験又は経口グルコース耐性試験（OGTT）のいずれかを用いて決定されてもよい。これらは両方とも、通常、試験開始前に少なくとも8時間絶食させておく必要がある。

この空腹時血漿グルコース（FPG）試験において、被験者の血糖値は、断食の終了後に測定され、一般に被験者は一晩絶食し、朝被験者が食事をする前に血中グルコースが測定される。健康な被験者のFPG濃度は、一般に約90〜約100mg／dLであり、「前糖尿病」の被験者のFPG濃度は、一般に約100〜約125mg／dLであり、「糖尿病」の被験者のFPG濃度は、一般に約126mg／dLより高い。
この経口グルコース耐性試験（OGTT）において、被験者の血糖値は、絶食後及びグルコースを豊富に含む飲料を飲んだ２時間後に測定される。グルコースを豊富に含む飲料を摂取して２時間後、健康な被験者の血糖濃度は一般に、約140mg／dL未満であり、前糖尿病の被験者の血糖濃度は一般に、約140〜約199mg／dLであり、糖尿病患者の血糖濃度は一般に、約200mg／dL以上である。
上記の血糖値はヒト被験者のものであるが、ネズミにおいては、これら正常血糖、中等度高血糖及び顕在性高血糖はそのスケールが異なる。4時間の絶食後の健康なネズミのFPG濃度は、一般に、約100〜約150mg／dLであり、「前糖尿病」のネズミのFPG濃度は、一般に約175〜約250mg／dLであり、「糖尿病」のマウスのFPG濃度は、一般に約250mg／dLをより高い。

いくつかの実施態様において、この患者は糖尿病である。この患者は、1型又は2型糖尿病を有してもよい。いくつかの実施態様において、この患者は、妊娠糖尿病又は前糖尿病を有してもよい。いくつかの実施態様において、この患者は、糖尿病以外の糖代謝障害（例えば、メタボリックシンドローム、グルコース代謝障害、高インスリン血症など）を有してもよい。本発明の方法を使用する治療の適当な対象は、例えば、血漿グルコース及び/又はインスリンレベルを調べることなどの、当該分野で公知の診断方法を用いて決定することができる。例えば、適当な患者には、空腹時（例えば、断食8〜10時間後）の血漿グルコース濃度が、約100mg／dLより高い、約110mg／dLより高い、約120mg／dLより高い、約150mg／dLより高い、又は約200mg／dLより高いヒトが含まれてもよい。また適当な患者には、食事の２時間後の血中グルコース濃度が、約140mg／dLより高い、約150mg／dLより高い、又は約200mg／dLより高いヒトも含むことができる。グルコース濃度は、mmol/Lの単位で表すこともでき、これはmg/dLの値を18で割ることによって得ることができる。

Ｖ．マイクロニードルアレイの製造方法
いくつかの実施態様において、本発明は、糖尿病治療剤（任意に、インスリン又は生物活性インスリン誘導体）のグルコース応答性送達のためのマイクロニードルアレイを製造する方法を提供する。いくつかの実施態様において、この方法は、
（ａ）本発明の小胞及び/又はナノ粒子の水溶液用意する段階、
（ｂ）複数のマイクロニードルキャビティを含む鋳型内に、この水溶液を分散させて、充填された鋳型を提供する段階、
（ｃ）この充填された鋳型を乾燥させて水を除去する段階、及び
（ｄ）この鋳型を除去してマイクロニードルアレイを提供する段階、から成る。
いくつかの実施態様において、この方法は、更に、このマイクロニードルアレイ内でポリマー材料を架橋させる段階を含んでもよい。例えば、いくつかの実施態様において、化学架橋剤（例えば、N、N-メチレンビスアクリルアミド）及び/又は光開始剤を、乾燥前に鋳型に添加してもよい。いくつかの実施態様において、この架橋は、鋳型が除去された後にUV照射に曝すことによって行われる。

いくつかの実施態様において、乾燥前に、追加のポリマーを鋳型に添加してもよい。この追加のポリマーは、両親媒性ポリマー材料の親水性ポリマーと同じであっても異なってもよい。いくつかの実施態様において、この追加のポリマーは、アルキレン修飾及び/又はアクリレート修飾ヒアルロン酸などの修飾ヒアルロン酸である。
いくつかの実施態様において、段階（b）における鋳型の充填は、真空下で実施してもよく、及び/又は鋳型を遠心分離する段階を含んでもよい（例えば、小胞をマイクロニードルキャビティに効率的に及び/又は高密度に詰め込むための補助として）。
いくつかの実施態様において、この鋳型を、デシケーター又は真空デシケーター内で乾燥させてもよい。
いくつかの実施態様において、この鋳型は、シリコーン（例えば、ポリジメチルシロキサン（PDMS））などのポリマーから成ってもよい。この鋳型は、約10, 50, 100, 250, 500, 1000又はそれ以上のマイクロキャビティを含んでもよい。この マイクロキャビティのチップ間の間隔は、約100μｍ〜約1000μｍ（例えば、約100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950又は約1000μｍ）であってもよい。
いくつかの実施態様において、製造されたマイクロアレイは、例えば保管又は輸送のためにパッケージングされてもよい。例えば、このパッケージングは、湿気及び/又はガス不透過性ポリマーフィルムなどのポリマーフィルムを用いて行ってもよい。この複数のアレイは、個別に、又は複数のアレイのパックでパッケージングされてもよい。

以下に示す実施例は、本発明の代表的な実施態様を実施するために当業者に指針を提供するためのものである。本開示及び当業者の一般的なレベルを考量すれば、当業者は、以下の実施例は例示的なものに過ぎず、ここに開示された本発明の範囲から逸脱することなく、多くの変更、修飾及び改変が可能であることを理解するであろう。
一般に、ここに提示されるインビトロ及びインビボの結果は、平均±平均の標準誤差を示す。統計解析は、スチューデントのt検定又はANOVA検定を用いて行った。p値が0.05未満の場合、実験群と対照群との間の違いは統計的に有意であると考えられる。

実施例１
低酸素感受性ヒアルロン酸の代表的な合成法
アミド形成を介してヒアルロン酸（HA）を6-（2-ニトロイミダゾール）ヘキシルアミンと化学的に結合させることによって低酸素感受性ヒアルロン酸（HS-HA）を合成した。すべての化学物質は、特に明記しない限り、Sigma-Aldrich社 (St. Louis, Missouri, USA)から購入し、受け取ったまま使用した。ヒアルロン酸ナトリウム（分子量300kDa）はFreda Biochem Co., Ltd.（Shandong、China）から購入した。

まず、ヒアルロン酸（HA）のカルボン酸と反応させるために、6-（2-ニトロイミダゾール）ヘキシルアミンを合成した。簡単に記すと、ニトロイミダゾール（NI、0.15g、1.3mmol）をDMFに溶解し、これにK₂CO₃（0.28g、2.0mmol）を加えた。次に、この溶液に6-（tert-ブチルオキシカルボニルアミノ）ヘキシルブロミド（すなわち、6-(BOC-アミノ)ヘキシルブロミド、0.39g、1.4mmol）を滴下し、80℃で4時間撹拌した。フィルターを用いて反応混合物から固体不純物を除去し、これをメタノールで洗浄した。残留溶媒を蒸発させて固体生成物を得、これを脱イオン（DI）水中に懸濁させ、酢酸エチルを用いて抽出した。その有機層を回収して、硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、次いで濃縮した。この生成物を氷上でメタノールに再溶解した。この溶液に、メタノール中濃度が1.25MのHCl(5mL)を添加し、室温（RT）で24時間撹拌した後、回転蒸発器を用いて溶媒を除去して、アミン官能化ニトロイミダゾール（NI)を得た。

次に、N-（3-ジメチルアミノプロピル）-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩（EDC）及びN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）の存在下で、6-（2-ニトロイミダゾール）ヘキシルアミンをヒアルロン酸（HA）に結合させた。簡単に記すと、0.24gのヒアルロン酸（HA）（分子量：約300kDa）を水に溶解し、これにEDC（0.56g、3.4mmol）及びNHS（0.39g、3.4mmol）を添加し、室温で15分間撹拌した。次いで、この混合液に、6-（2-ニトロイミダゾール）ヘキシルアミン（0.18g、0.85mmol）を添加し、室温で24時間保持した。この反応溶液をイオン交換水(DI)とメタノールの1：1混合物で1日間透析し、イオン交換水(DI)で更に2日間透析した。次に、凍結乾燥により低酸素感受性ヒアルロン酸（HS-HA）を得た。次いで¹H NMR（Varian GEMINI 2300; Varian Inc., Palo Alto, California, USA）を用いて特性評価を行った。
6-（2-ニトロイミダゾール）ヘキシルアミン：¹H NMR (DMSO-d₆, 300 MHz, δppm): 1.30-1.78 (m, 8H, NH₂CH₂(CH₂)₄), 2.73 (s, 2H, NH₂CH₂), 4.38 (s, 2H, NCH₂), 7.19 (s, 1H), 7.87 (s, 1H).
低酸素感受性ヒアルロン酸（HS-HA）: ¹H NMR (D2O, 300 MHz, δppm): 1.88-2.40 (m, 8H, NH₂CH₂(CH₂)₄), 2.87-3.19 (m, 4H, NH₂CH₂, NCH₂), 7.19 (s, 1H), 7.48 (s, 1H).

実施例２
グルコース応答性小胞（GRVs）の合成及び特性評価
グルコース応答性小胞（GRVs）を、水溶液中での自己集合により調製した。簡単に記すと、両親媒性の低酸素感受性ヒアルロン酸（HS-HA）20mgを水/メタノール（2/1、v/v）に溶解し、これに10mgのヒトインスリンと1.0mgのグルコースオキシダーゼ(GOx)を添加した。ヒト組換えインスリン（Zn塩、27.5 IU/mg）はLife Technology (Carlsbad, California, USA)から購入した。このエマルジョンを4℃で2時間撹拌した。次いで、イオン交換水(DI)を用いて1日間透析してメタノールを除去した。得られたグルコース応答性小胞（GRV）溶液のpHを5.3（インスリンの等電点（pl））に調整し、10分間の8,000rpmの遠心分離により充填されなかったインスリンを除去し、さらにpH7.4で遠心フィルター（100,000Da分子量カットオフ、Millipore社, Billerica, Massachusetts, USA)を用いて濾過した。得られたグルコース応答性小胞（GRV）溶液を4℃で保存して、後の研究に使用した。
Coomassie Plusタンパク質アッセイ(Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, USA)を用いて充填インスリン含量を測定して、グルコース応答性小胞（GRVs）のインスリン充填能力（LC）を決定した。グルコース応答性小胞（GRVS）のゼータ電位及びサイズ分布をZetasizer(Nano ZS, Malvern Instruments Ltd., Malvern, UK)を用いて測定した。JEOL 2000FX TEM装置（JEOL Inc, USA、Peabody, Massachusetts, USA)を用いて、グルコース応答性小胞（GRVs）の透過型電子顕微鏡（TEM）画像を得た。

このようにして、グルコース応答性小胞（GRV_S）は、組換えヒトインスリン及びグルコースオキシダーゼ(GOx)をコアに封入しながら、低酸素感受性ヒアルロン酸が自己集合することにより形成された。図１Ａを参照されたい。低酸素感受性ヒアルロン酸（HS-HA）は、実施例1に記載したように、３段階のアミン官能化されたニトロイミダゾール(NI)とのアミド結合の形成を介して得られた。疎水性ニトロイミダゾール(NI)基があることにより、誘導されたヒアルロン酸（HA）は両親媒性になり、これが水溶液中のグルコース応答性小胞（GRVs）の形成を可能にする。さらに、ニトロイミダゾール(NI)は、低酸素条件下で生物還元されると予想される低酸素感受性要素を提供する。Nunn et al., Eur. J. Nucl. Med, 22(3):265-280 (1995); 及びTakasawa et al., Stroke, 39(5):1629-1637 (2008)を参照されたい。アミン基を有する還元生成物は水溶性であり、グルコース応答性小胞（GRVS）の分解をもたらす。図１Ａを参照されたい。
このグルコース応答性小胞（GRVs）は、単分散サイズの球形であった。図２Ａの左側の透過型電子顕微鏡（TEM）画像を参照されたい。グルコース応答性小胞（GRVs）の平均直径は、動的光散乱（DLS）によって、118nmと決定されたが（図２Ｂ参照）、これはTEMによる観察と一致する。グルコース応答性小胞（GRVs）のゼータ電位は、ヒアルロン酸（HA）の残留カルボキシル基のため-34.7±0.4mVと測定された。フルオレセインイソチオシアネート（FITC）標識インスリンを含むグルコース応答性小胞（GRVs）のケイ光画像は、更にインスリンのカプセル化の成功を証明した。図２Ｄを参照されたい。グルコース応答性小胞（GRVs）のインスリン充填能力は8.7％と決定された。低酸素条件に曝されなければ、得られたグルコース応答性小胞（GRVs）は非常に安定であり、4℃で1月間保管後に有意な沈殿は観察されなかった。

実施例３
グルコース応答性小胞（GRVs）のインビトログルコース応答性インスリン放出
グルコース応答性小胞（GRVs）のグルコース応答能を評価するために、100μMのNADPHおよび5μg/mlのシトクロムcレダクターゼを含む600μLのPBS緩衝液（NaCl 137mM; KCl 2.7mM; Na₂HPO₄ 10mM; KH₂PO₄ 2mM; pH 7.4）中でグルコース応答性小胞（GRVs）をインキュベートした。様々な量のグルコースを添加して、最終グルコース濃度が0mg/dL、100mg/dL又は400mg/dLの溶液を用意した。400mg/dLのグルコース濃度溶液は典型的な高血糖グルコースレベルを表し、100mg/dLのグルコース濃度溶液は正常血糖レベルを表し、0mg/dLのグルコース濃度溶液は対照として使用した。これらの混合物を、マスフローメーターでの調節によって21％の酸素濃度を有する容器中で37℃でインキュベートした。所定の複数の時間で、各混合物のpH値を、pHメーター(AB15, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, USA)を用いて記録し、このpH値をインスリンの等電点（pl）に調整して、8,000rpmで10分間遠心分離してインスリンを放出させた。

グルコース応答性小胞（GRVs）にカプセル化された残留インスリンの濃度を、クーマシープラスタンパク質アッセイ(Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, USA)を用いて調べた。INFINITE（登録商標）200 PROマルチモードプレートリーダー(Tecan Group Ltd., Zurich, Switzerland)により595nmにおける吸光度を測定し、インスリン含有量をインスリン標準曲線により調整した。グルコース応答性小胞（GRVs）溶液の紫外−可視吸収をプロットするために、設定した複数の時間で、330nmにおける吸光度強度を測定した。異なるpH条件下におけるグルコース応答性小胞（GRVs）からのインスリンの放出プロファイルを評価するために、グルコース応答性小胞（GRVs）を100μMのNADPH及び5μg/mLのシトクロムcレダクターゼの両方の存在下で、pH4.0又はpH7.4のPBS緩衝液中でインキュベートした。放出されたインスリンを上記と同じ方法を用いて測定した。天然インスリン溶液及びグルコース応答性小胞（GRVs）から放出されたインスリン溶液（0.1mg/mL）の遠紫外円二色性（CD）スペクトルを、CD分光計(Aviv Biomedical Inc., Lakewood, New Jersey, USA)を用いて分析した。

グルコースオキシダーゼ(GOx)によって触媒されるグルコースの酸化によって引き起こされる酸素消費を、酸素感受性リン光分子プローブを用いて測定した。Will et al., Nat. Protoc., 1(6):2563-2572 (2006);及びFercher et al., Acs Nano, 5(7):5499-5508 (2011).を参照されたい。高血糖溶液に曝されたサンプルの酸素濃度は、他の2つのサンプルと比較して低かった。図２Ｆを参照されたい。そのサンプルのグラフは10分で急速に平衡に達し、酸素消費速度が溶解速度と平衡に達したことを示唆している。400mg/dLのグルコース溶液中のグルコース応答性小胞（GRVs）の溶液で記録されたpH値は、時間と共に徐々に減少し、グルコースオキシダーゼ(GOx)によって触媒されたグルコースのグルコン酸への変換をさらに実証した。
この低酸素環境において、低酸素感受性ヒアルロン酸（HS-HA）のニトロ基は、還元酵素によって触媒され、NADPHからの電子によって効果的に還元された。グルコース応答性小胞（GRVs）の紫外−可視吸収スペクトルによれば、330nmにおけるニトロイミダゾール(NI)の特徴的なピークが減少し及び2-アミノイミダゾールの特徴的なピークに対応する280nmにおける新しいピークが生成しており、このことは、400mg/dLのグルコース溶液中で2時間インキュベート後、低酸素条件下の還元反応によりニトロイミダゾール(NI)のニトロ基がアミン基に変換されたことを確認した。330nmにおける紫外−可視吸光度を測定することにより、ニトロイミダゾール(NI)の残留濃度をリアルタイムでモニターした。400mg/dLのグルコース溶液と共にインキュベートされたグルコース応答性小胞（GRVs）の対応する吸光度は、経時的に徐々に減少し（図２Ｇ参照）、コア中の疎水性ニトロイミダゾール(NI)基がアミン基で置換されたことを示唆する。

これとは対照的に、100mg/dLのグルコース溶液のサンプルでは、その吸光度のはるかに遅い低下が観察され、グルコースなしの対照サンプル（グルコース濃度0mg/dL）では吸光度の減少は観察されなかった。さらに、これに対応して、グルコース応答性小胞（GRVs）の構造とサイズの変化が、透過型電子顕微鏡(TEM)像及び動的光散乱(DLS)によって観察された。図２Ａ及び図２Ｃを参照されたい。
分解したグルコース応答性小胞（GRVs）からのインスリンの放出をさらに検証するために、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）標識インスリンをグルコース応答性小胞（GRVs）にカプセル化した。1時間後にそのケイ光シグナルは溶液全体に均一に分布していたが、元のグルコース応答性小胞（GRV）溶液は多量のクラスターシグナルを示し、時間の経過とともにFITC標識インスリンが放出されたことを示している。図２Ｅを参照されたい。

400mg/dLのグルコース溶液中でインキュベートされたグルコース応答性小胞（GRVS）においては、グルコース応答性小胞（GRVS）の分解により、急速なインスリン放出プロファイルが得られたが、グルコース濃度が0mg/dL又は100mg/dLのPBS溶液中でインキュベートされたグルコース応答性小胞（GRVS）からは少量のインスリンしか放出されなかった。図３Ａを参照されたい。インスリン放出速度が、pHレベルの低下ではなく酸素レベルの低下の結果としてニトロイミダゾール(NI)基の還元に直接対応しているかどうか検証するために、pH 4.0の溶液中のインスリン放出動態を調べた。その結果、pH 4.0の溶液中でインキュベートしたサンプルのインスリン放出はわずかであり、グルコース応答性小胞（GRVS）が酸性条件下で安定であることが確認された。さらに、グルコース濃度を変化させることにより、変更可能であるインスリンの動態プロフィールが観察された。図３Ｂを参照されたい。グルコース濃度を100mg/dLから400mg/dLに変更すると、インスリン放出速度の最大6.6倍の差異が達成された。これとは対照的に、半量のグルコースオキシダーゼ(GOx)を含有するグルコース応答性小胞（GRVS）は、酸素消費速度が比較的遅いため、インスリンの放出速度が遅く、このことは、酵素（グルコースオキシダーゼ(GOx)）の封入量を変えることによってインスリン放出速度を調整できることを示唆している。

さらに、グルコース応答性小胞（GRVs）のインスリン放出プロファイルは、正常及び高血糖状態に交互に曝された場合（20分ごとに数サイクル状態を変化させた）、拍動パターンを示した。図３Ｃを参照されたい。グルコース応答性小胞（GRVs）は、既存の合成閉ループシステムと比較して、グルコース濃度の変化に迅速に対応した。Mo et al., ChSRv, 43(10):3595-3629 (2014);及びVeiseh et al., Nature Reviews Drug Discovery, 14(1):45-57 (2015)を参照されたい。例えば、低酸素感受性であるグルコース応答性小胞（GRVs）は、過去に報告されたpH応答性誘発グルコース応答性ナノ粒子（Gu et al., ACS nano; 7(5):4194-4201 (2013))と比較して、同じ量の酵素を用いた場合、高血糖レベルに対して有意に速い応答速度を示した。如何なる理論にも拘束されるものではないが、本発明のグルコース応答性小胞（GRVs）の応答速度が速いことは、局所的な酸性環境によって引き起こされるものとは対照的に、局所的な微小な低酸素環境によって引き起こされる剤型の分解のための「構造変換点」により速く到達したことに起因するものと考えられる。
以上をまとめると、以上の結果は、グルコース応答性小胞（GRVs）の分解及びインスリンの放出が、グルコースを媒介した低酸素依存プロセスであることを示唆している。さらに、グルコース応答性小胞（GRVS）から放出されたインスリン（0.1mg/mL）の二次配座構造は、円二色性（CD）スペクトルによって示されるように、天然インシュリンの二次配座構造を維持したものである。図３Ｄを参照されたい。

実施例４
グルコース応答性小胞（GRVs）が充填されたマイクロニードル（MN）アレイパッチの製作と特徴評価
簡便な投与を達成するために、グルコース応答性小胞（GRVs）を含むマイクロニードル（MN）アレイパッチを作製した。このマイクロニードルアレイパッチは、無痛で使い捨て可能である。
簡単に記すと、まず遠心分離によってグルコース応答性小胞（GRVs）をマイクロニードル（MN）用のシリコーン製鋳型の先端に充填し、続いて、これに架橋剤であるN、N'-メチレンビスアクリルアミド（MBA）と光開始剤を含有するアクリレート変性ヒアルロン酸（m-HA）溶液を滴下した。図４Ａを参照されたい。このHAベースのニードルマトリックスはUV照射下で光架橋され、マイクロニードル（MN）の剛性を高め、このニードルからのGRVの望ましくない損失を回避するのに役立つことができる。得られたマイクロニードル（MN）は円錐形であり、これらのニードルは、6×6mmの面積を有する10×10アレイに配置され（図４Ｂ）、これは続いて医療用テープで固定された。各ニードルの底半径は150μm、高さは600μm、及び先端半径は約10μmであった。図４Ｃを参照されたい。図４Ｄは、FITC-インスリンが充填されたグルコース応答性小胞（GRVs）を含む代表的なマイクロニードル（MN）のケイ光画像を示し、これはグルコース応答性小胞（GRVs）がマイクロニードル（MN）内部に均一に分布していることを示す。さらに、引張圧縮機を用いて機械的強度を測定したところ、架橋されたマイクロニードル（MN）の破断力は0.06N/ニードルであったが、非架橋のMNの破断力は僅か0.02N/ニードルであった。図４Ｅを参照されたい。従って、マイクロニードル（MNs）の剛性は架橋によって改善され、これは破壊を起こさずに皮膚への挿入を容易にするのに十分な強度を提供することができる。
マイクロニードル（MNs）に封入されたグルコース応答性小胞（GRVs）がマイクロニードル（MN）作製後にグルコース応答性能を維持しているかどうかを調べるために、グルコース応答性小胞（GRVs）を含むニードルの先端をPBS緩衝液に再溶解し、異なる濃度のグルコース溶液で処理した。その放出プロファイルと、元のグルコース応答性小胞（GRVs）からのインスリンの放出プロファイルとの差異は無視できる程度であった。

実施例５
Ｉ型糖尿病の治療のためのマイクロニードル（MN）のインビボ研究
糖尿病治療のためのマイクロニードル（MN）アレイパッチのインビボの有効性を評価するために、ストレプトゾトシン（STZ）誘発Ｉ型糖尿病マウス（C57B6雄、Jackson Lab, Bar Harbour, Maine, USA)をグループ分けして、その背に異なるパッチサンプルを経皮的に投与した（図５Ａ左上参照）。このグループには、アクリレート変性ヒアルロン酸(m-HA)のみを含有するブランクマイクロニードル（MN）パッチ；ヒト組換えインスリンが充填されたマイクロニードル（MN）パッチ；インスリンと酵素の両方を含むグルコース応答性小胞（GRVS）を充填したマイクロニードル（MN）パッチ（「GRV(E+I)」で表示）;インスリン及び半量の酵素を含有するグルコース応答性小胞（GRVS）が充填されたマイクロニードル（MN）パッチ(「GRV(1/2E+1)」で表示）;及びインスリンのみを含むグルコース応答性小胞（GRVS）を充填したマイクロニードル（MN）パッチ（「GRV(I)」で表示）が含まれる。
各マウスに適用されたインスリン用量は10mg/kgであった。Clarity GL2Plusグルコースメーター（Clarity Diagnostics, Boca Raton, Florida, USA）を用いて、尾静脈サンプル（約3マイクロリットル）から血漿等価グルコースを測定した。マウスのグルコースレベルを投与前の２日間モニターし、異なるパッチの適用する前に、全てのマウスを一晩絶食させた。安定した高血糖に戻るまで、各マウスのグルコースレベルをモニターした（5分後, 15分後, 30分後, 60分後、及びその後1時間に1回）。
インビボの血漿インスリン濃度を測定するために、複数の指定時点において、マウスの尾静脈から25μＬの血液サンプルを採取した。血清を単離し、評価まで-20℃で保存した。血漿インスリン濃度は、製造者のプロトコールに従って、ヒトインスリンELISAキット(Calbiotech, Spring Valley, California, USA)を用いて測定した。

本発明のマイクロニードル（MN）アレイパッチは、トリパンブルー染色（図５Ａ右上参照）及びヘマトキシリン及びエオシン（H＆E）染色によって証明されるように、マウスの背側皮膚に効果的に浸透することができる。図５Ａ下を参照されたい。各グループの処置マウスの血糖を経時的にモニターした。GRV(E+I)充填マイクロニードル（MN）パッチで処置したマウスの血糖は、0.5時間以内に200mg/dL近くまで急速に低下し、4時間まで正常血糖状態（<200mg/dL）を維持し、その後徐々に増加した。図５Ｂを参照されたい。如何なる理論にも拘束されることなく、この速い応答速度は、グルコース応答性小胞（GRVS）の分解を迅速に活性化する局所的低酸素微小環境の迅速な生成によるものであることを示している。一方、水素イオンと比較してインビボの酸素の拡散速度が比較的低いことが、このプロセスをさらに容易にしている。各マウスのマイクロニードル（MNs）の酵素量が少ない場合（1mg/kgから0.5mg/kgへ減少）、GRV(1/2E+1)充填マイクロニードル（MN）パッチで処置したマウスの血糖は0.5時間以内に約350mg/dLに低下したが、その後着実に増加した。酵素が存在しない場合、GRV(I)充填マイクロニードル（MN）パッチを投与したマウスのグルコースは顕著な減少を示さず、グルコース応答性小胞（GRVS）がインビボで安定であることが示された。これと同様に、GRV(E+I)充填マイクロニードル（MN）パッチを投与したマウスは、GRV(1/2E+I)充填又はGRV(I)充填マイクロニードル（MN）パッチを投与したマウスと比較して、少なくとも24時間、一貫して高い血漿インスリン濃度を示した。これらは酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によって定量した。図５Ｃを参照されたい。皮膚に挿入されたGRV(E+I)充填マイクロニードル（MN）パッチのSEM画像は、処置後に先端が潰れたことを示し（図５Ｄ参照）、これは、更に、充填されたグルコース応答性小胞（GRVS）が分解して皮下組織へ溶解することを示唆している。

GRV(E+I)充填マイクロニードル（MN）パッチ及びインスリン充填マイクロニードル（MN）パッチの投与の1時間後のマイクロニードル（MN）に対するインビボのグルコース応答性を確認するために、グルコース負荷試験を行った。簡単に記すと、マウスを一晩絶食させ、GRV(E+I)充填マイクロニードル（MN）パッチ又はインスリン充填マイクロニードル（MN）パッチを適用し（各マウスについてインスリン用量を10mg/kgとした）、続いて全てのマウスにグルコースのPBS溶液を腹腔内に1.5g/kgの用量で注射した。グルコースレベルを、注射の5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100及び120分後にモニターした。対照として健常マウスのグルコース負荷試験を行った。同様に、低血糖を評価するために、健常マウスを利用して、インスリン充填マイクロニードル（MN）パッチ、GRV(I)充填マイクロニードル（MN）パッチ、又はGRV(E+I)充填マイクロニードル（MN）パッチを投与したが、グルコースの投与は行わなかった。
マイクロニードル（MN）パッチ投与の1時間後に行われたグルコース負荷試験において、健康なマウス（対照）では、腹腔内グルコース注入により血糖が急速に上昇し、その後正常血糖に徐々に低下した。図５Ｅを参照されたい。GRV(E+I)充填マイクロニードル（MN）パッチで処置した糖尿病マウスは、グルコース注入後に血中グルコースがゆっくり増加し、その後30分以内に正常状態に急速に低下した。しかし、インスリン充填マイクロニードル（MN）パッチを投与したマウスのグルコースは120分以内に減少することはなかった。この曲線の下の0〜120分の間の面積を計算して、マイクロニードル（MN）反応性を評価した。図５Ｆに示すように、GRV(E+I)充填マイクロニードル（MN）パッチは、グルコースに対して有意に速い応答を示した。

マイクロニードル（MN）のインビボのグルコース制御能をさらに評価するために、マイクロニードル（MN）パッチの連続投与を行った。第１のGRV(E+I)充填マイクロニードル（MN）パッチ（各マウスのインスリン用量：5mg/kg）で処置したマウスのグルコースレベルは、1時間以内に急速に約200mg/dLまで減少した。図５Ｇを参照されたい。しかし、別の（すなわち、第２の）GRV(E+I)充填マイクロニードル（MN）パッチ（各マウスのインスリン用量：5mg/kg）で処置した場合に、グルコースはこれよりも低い血糖レベルまで低下せず、3時間約200 mg/dLのグルコース濃度を維持した。これとは対照的に、第２のGRV(I)充填マイクロニードル（MN）パッチ（各マウスのインスリン用量：5mg/kg）を投与されたマウス、又はさらなるパッチを受けなかったマウスは、3時間で高血糖状態へグルコースの急速な増加を示した。別のマウス群には、続いてインスリン充填マイクロニードル（MN）パッチを投与したところ、その血糖値は低下を続け、低血糖の潜在的リスクに導いた。
健康なマウスに関する研究はさらに、グルコース応答性小胞（GRVS）充填マイクロニードル（MN）パッチにはインスリン漏出がほとんどなく、インスリン充填マイクロニードル（MN）と比較して低血糖リスクを低下させることを示した。図５Ｈを参照されたい。対応する低血糖指数（初期値から最低値に至るまでのグルコースの低下量をこの低下に達した時間で割ったものとして定義される）を計算して、インスリンが低血糖を引き起こす程度を定量的に測定した。グルコース応答性小胞（GRVs）充填マイクロニードル（MN）は、正常血糖状態で投与された場合、インスリン充填マイクロニードル（MN）と比較して、低い低血糖指数を示した。図５Ｉを参照されたい。さらに、ヒアルロン酸（HA）は人体全体に認められ、裸のグルコース応答性小胞（GRVS）は研究された様々な濃度において有意な毒性を示さなかった。

実施例６
実施例１〜５の考察
現行のグルコースオキシダーゼ(GOx)ベースのグルコース応答性インスリン送達システムは、主にpH感受性材料からなるマトリックスを利用している。これは、グルコン酸の酵素的生成によるプロトン化又は分解のいずれかによってインスリンを放出する。しかし、それらの有効性は、特に緩衝生理学的環境下において、血糖変化に対する応答が遅いため制限される可能性がある。本発明のグルコース応答性小胞（GRVs）は、pH感受性製剤ではなくて低酸素感受性製剤に基づくグルコース応答性インスリン送達戦略の最初の実証であると考えられる。酸素感受性リン光プローブによって証明されるように、酸素の酵素的消費により、PBS緩衝溶液中で局所低酸素微小環境が迅速に生成された。これに続いて、低酸素感受性ヒアルロン酸（HS-HA）の疎水性側鎖が親水性鎖に還元され、その結果グルコース応答性小胞（GRVs）の分解が起こり、続いてインスリンの放出速度が増加した。400mg/dLのグルコースを含むPBS緩衝液中でのインキュベーションの20分後に、透過型電子顕微鏡(TEM)により、グルコース応答性小胞（GRVs）の形態の変化が観察され、グルコース応答性小胞（GRVs）の分解を示した。グルコース応答性小胞（GRVs）のインビトロのインスリン放出プロファイルは、過去に報告されたpH感受性に基づくグルコース応答性ナノ粒子よりも速い放出速度を示した。さらに、インスリン放出動態は、インビトロ及びインビボの両方で、酵素量を変えることにより調整することが可能であり、このことは、更に、グルコース応答性小胞（GRVs）からのインスリンの放出がグルコースで媒介されかつ低酸素に依存するプロセスを受けることを意味する。

このグルコース応答性小胞（GRVs）は、便利で無痛で連続的な投与が可能なインスリン送達のために、ヒアルロン酸（HA）に基づくマイクロニードル（MN）アレイパッチに組み込まれた。架橋されたヒアルロン酸（HA）マトリックスは、機械的強度及び皮膚浸透能力を改善するだけでなく、破裂による放出を回避するためにグルコース応答性小胞（GRVs）からのインスリンの損失を制限するとも考えられる。さらに、ニードルパッチ及び小胞の骨格は両方とも、生体適合性の高いヒアルロン酸（HA）から作製されている。
GRV(E+I)充填マイクロニードル（MN）は、より速い反応性で、正常範囲のグルコースを調整することに優れていることを示した。さらに、高感受性小胞の他に、経皮投与によるリンパによる急速な吸収も、この迅速性のメリットに寄与することができる。インビボのグルコース負荷試験は、グルコース応答性小胞（GRVs）充填マイクロニードル（MN）がグルコースに対してより反応性であり、低血糖に対する潜在的なリスクを効率的に回避できることを実証した。さらに、マイクロニードル（MN）を用いた連続投与の結果は、正常範囲のグルコースをより長期間正確に制御することができることを示した。これらの実施例で使用されたヒトインスリンはマウスにおいて比較的感受性ではないことを考慮すると、潜在的なヒトでの使用のための実際の用量を顕著に低することができるかもしれない。本発明の「スマートインスリンパッチ」は、迅速なグルコース応答性で、痛みがなく、安全な方法で、インスリンの閉ループ送達の臨床的機会を提供すると考えられる。

ここに開示された発明の様々な詳細は、本発明の範囲から逸脱することなく変更され得ることが理解されるであろう。さらに、上記の記載は、ただ例証することを目的としたものであり、発明を限定することを目的としたものではない。

Claims (13)

1. 糖尿病治療剤を必要とする患者に糖尿病治療剤を送達するためのマイクロニードルアレイであって、該マイクロニードルアレイは小胞を含み、該小胞は、低酸素感受性疎水基に結合した親水性ポリマーを含む両親媒性ポリマー材料を含む小胞であって、該低酸素感受性疎水基が、低酸素環境下で還元されて親水性部分を形成することができる低酸素感受性部分を含み、該低酸素感受性部分がニトロイミダゾールを含み、さらに、（ｉ）糖尿病治療剤及び（ｉｉ）グルコース感受部分が該小胞内に含まれており、該グルコース感受部分がグルコース酸化剤であり、該マイクロニードルアレイが、それぞれ２０〜１０００μｍの長さを有する多数のマイクロニードルを含む、マイクロニードルアレイ。
2. 前記糖尿病治療剤が、インスリン又はその生物活性誘導体である請求項１に記載のマイクロニードルアレイ。
3. 前記マイクロニードルアレイが皮膚パッチの一部として提供される請求項１又は２に記載のマイクロニードルアレイ。
4. 前記パッチが１以上の裏張り層及び／又は皮膚適合性接着剤を含む請求項３に記載のマイクロニードルアレイ。
5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載のマイクロニードルアレイを含む閉ループ糖尿病治療剤送達システム。
6. 前記親水性ポリマーが生分解性である請求項１〜４のいずれか一項に記載のマイクロニードルアレイ。
7. 前記親水性ポリマーが、ポリアミノ酸、合成ブロックコポリマー、又は多糖類である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のマイクロニードルアレイ。
8. 前記親水性ポリマーが、多糖類であり、該多糖類がグルコサミノグリカンである請求項７に記載のマイクロニードルアレイ。
9. 前記疎水基が前記親水性ポリマーに共有結合で結合している請求項１〜４のいずれか一項に記載のマイクロニードルアレイ。
10. 前記両親媒性ポリマー材料が、アミノ置換された疎水基前駆体のアミノ基に結合した親水性ポリマーを含み、それにより該アミノ基と前記親水性ポリマー上に存在するカルボン酸基との間にアミドを形成する請求項１〜４のいずれか一項に記載のマイクロニードルアレイ。
11. 前記両親媒性ポリマー材料が、６−（２−ニトロイミダゾール）ヘキシルアミンに結合したヒアルロン酸を含む請求項１〜４のいずれか一項に記載のマイクロニードルアレイ。
12. 前記グルコース酸化剤が、グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）である請求項１〜４のいずれか一項に記載のマイクロニードルアレイ。
13. 前記インスリン又はその生物活性誘導体が、ヒトインスリン、組換えヒトインスリン、非ヒト動物由来のインスリン、速効型インスリン、超速効型インスリン類似体、中間型インスリン及び／又は持続型インスリンから選択される請求項２に記載のマイクロニードルアレイ。

Images