CN110198730B - H2o2响应性纳米粒子及其用途 - Google Patents

H2o2响应性纳米粒子及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN110198730B
CN110198730B CN201780082606.6A CN201780082606A CN110198730B CN 110198730 B CN110198730 B CN 110198730B CN 201780082606 A CN201780082606 A CN 201780082606A CN 110198730 B CN110198730 B CN 110198730B
Authority
CN
China
Prior art keywords
glucose
nanoparticle
peroxide
copolymer
insulin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201780082606.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110198730A (zh
Inventor
顾真
胡秀丽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
North Carolina State University
Original Assignee
North Carolina State University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by North Carolina State University filed Critical North Carolina State University
Publication of CN110198730A publication Critical patent/CN110198730A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110198730B publication Critical patent/CN110198730B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0021—Intradermal administration, e.g. through microneedle arrays, needleless injectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/28—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M37/00—Other apparatus for introducing media into the body; Percutany, i.e. introducing medicines into the body by diffusion through the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本文公开了一种纳米粒子，所述纳米粒子包含：共聚物，所述共聚物包含聚乙二醇聚合物、多羟基化聚合物和过氧化物敏感性侧基；葡萄糖响应剂；以及治疗剂；其中所述共聚物包封所述葡萄糖响应剂和所述治疗剂。本文还公开了一种向受试者递送治疗剂的方法，所述方法包括：向所述受试者施用纳米粒子，所述纳米粒子包含：共聚物，所述共聚物包含聚乙二醇聚合物、多羟基化聚合物和过氧化物敏感性侧基；葡萄糖响应剂；以及治疗剂；其中所述共聚物包封所述葡萄糖响应剂和所述治疗剂；以及在高血糖水平的葡萄糖的存在下从所述纳米粒子释放所述治疗剂。在一些实施方案中，所述葡萄糖响应剂在暴露于高血糖水平的葡萄糖时产生过氧化物，从而触发所述纳米粒子的去组装和所包封的治疗剂的释放。

Description

H2O2响应性纳米粒子及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年12月5日提交的美国临时专利申请序列号62/430,273的权益，该专利申请的公开内容以引用的方式明确并入本文。
关于由联邦政府资助的研究或开发的声明
本发明是根据由美国国家科学基金会(National Science Foundation)授予的批准号1160483在政府支持下进行的。政府享有本发明的某些权利。
背景技术
糖尿病是特征为血糖水平升高的慢性代谢紊乱。它已成为最具挑战性的全球健康问题之一，并且糖尿病患者人数急剧增加。1型糖尿病和晚期2型糖尿病患者的传统护理需要频繁或持续监测血糖水平，同时频繁皮下注射长效和短效胰岛素，或使用连续和可变的胰岛素输注来达到维持血糖正常的目标。然而，胰岛素的这种“开环”自我施用始终是痛苦的，并且通常与葡萄糖控制不充分相关联。
这些传统的开环胰岛素递送方法的替代方案是使用与连续葡萄糖监测器集成的闭环胰岛素泵。这种闭环原理可以提高血糖控制的效率并降低低血糖的风险。参见Choudhary等人，Diabetes Care,2011,34:2023；另外参见Russell等人，Engl.J.Med.2014,371:313。然而，关于连续葡萄糖监测器的准确性和胰岛素输注的可靠性，仍然存在若干障碍需要克服。参见Bratlie等人，Adv.Drug Delivery Rev.,2012,1:267；另外参见Stevenson等人，Adv.Drug Delivery Rev.2012,64:1590。此外，当前的系统需要插管和皮下植入套管，这是不方便的并且通常与生物污染相关联。
同时，已经探索了合成的葡萄糖响应性材料用于实现闭环胰岛素释放，从而在没有这些限制的情况下提供胰岛素递送的潜力。参见Wu等人，Chem.Rev.,2011,111:7855。基质通常采用葡萄糖响应性部分(诸如葡萄糖氧化酶(GOx)、苯基硼酸(PBA)或葡萄糖结合蛋白(GBP))通过聚合物降解、结构转换或葡萄糖结合竞争来调节预负载的胰岛素的释放速率。参见Gu等人，ACS Nano 2013,7:6758；Ma等人，Polym.Chem.,2014,5:1503；Brownlee等人，Science,1979,206:1190。然而，理想的系统结合了(i)易用性、(ii)高载药能力、(iii)快速响应性以及(iv)优异的生物相容性，这种理想的系统的论证仍然存在挑战。例如，根据葡萄糖酶促氧化产生葡萄糖酸，掺入GOx的大多数葡萄糖响应性制剂涉及pH敏感性材料。由于体内生理pH快速转变的挑战，这些系统是受限制的。参见Mo等人，Chem.Soc.Rev.,2014,43:3595。开发了实现更快响应的缺氧敏感性制剂。参见Yu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,2015,112:8260。然而，过氧化氢(H2O2)仍然存在于这种缺氧敏感性系统中，这会引起长期的生物相容性问题。参见Saravanakumar等人，Adv.Sci.,2016,4(1):1600124。
发明内容
本文公开了包含治疗剂的纳米粒子组合物以及用于递送治疗剂的方法。
在一个方面，本文公开了一种纳米粒子，该纳米粒子包含：共聚物，其包含聚乙二醇聚合物、多羟基化聚合物和过氧化物敏感性侧基；葡萄糖响应剂；以及治疗剂；其中该共聚物包封葡萄糖响应剂和治疗剂。在一些实施方案中，多羟基化聚合物包括聚丝氨酸。在一些实施方案中，葡萄糖响应剂包括葡萄糖氧化酶。在一些实施方案中，治疗剂包括胰岛素。
在另一方面，本文公开了一种向受试者递送治疗剂的方法，该方法包括向受试者施用纳米粒子，该纳米粒子包含：共聚物，其包含聚乙二醇聚合物、多羟基化聚合物和过氧化物敏感性侧基；葡萄糖响应剂；以及治疗剂；其中该共聚物包封葡萄糖响应剂和治疗剂；以及在高血糖水平的葡萄糖的存在下从纳米粒子释放治疗剂。在一些实施方案中，葡萄糖响应剂在暴露于高血糖水平的葡萄糖时产生过氧化物。在一些实施方案中，该方法还包括在暴露于过氧化物后将过氧化物敏感性侧基从多羟基化聚合物分离。在一些实施方案中，分离步骤增加了共聚物在水中的溶解度。在一些实施方案中，共聚物的水溶性增加使共聚物从治疗剂解离，从而从纳米粒子释放治疗剂。
下面的附图和描述中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。根据描述和附图以及权利要求，本发明的其他特征、目标和优点将显而易见。
附图说明
本公开的其他方面和优点部分将在详细描述和随后的任何权利要求中阐述，并且部分将从详细描述中得出，或者可以通过本公开的各个方面的实践来得知。以下所述优点将借助于所附权利要求中特别指出的要素和组合来实现和达到。应当理解，上述一般描述和以下详细描述均仅出于示例和解释的目的，而不是限制本公开。
包括在本说明书中并构成本说明书的一部分的附图示出了本公开的某些实例，并且连同描述一起用于解释而非限制本公开的原理。在所有附图中，相同的数字表示一个或多个相同的要素。
图1A至图1B是描绘用于葡萄糖触发的胰岛素递送的H2O2响应性纳米粒子的示意图。图1A示出了通过将嵌段共聚物mPEG-b-P(Ser-PBE)自组装成负载有胰岛素和GOx的纳米粒子的纳米粒子概念性构造。纳米粒子在高血糖水平的葡萄糖的存在下解离，这由增加的H2O2水平触发，从而释放胰岛素。图1B示出了基于透明质酸(HA)的微针阵列贴片的概念性构造，该微针阵列贴片负载有纳米粒子，该纳米粒子可施用于皮肤，以便在1型糖尿病的小鼠模型中进行智能胰岛素递送。
图2A至图2B描绘了mPEG-b-P(Ser-PBE)的化学构造。图2A示出了4-(羟甲基)苯基硼酸频哪醇酯(PBE；化合物1)的构造和化学结构，然后将PBE用于在聚丝氨酸上构建侧基，从而形成mPEG-b-P(Ser-PBE)。还示出了mPEG-b-P(Ser-PBE)的过氧化物介导的降解产物。图2B是示出mPEG-b-P(Ser-PBE)的1H NMR光谱的图。
图3A至图3C描绘了葡萄糖响应性聚合物纳米粒子(PV)的粒度表征。图3A是空白聚合物纳米粒子(PV)的TEM图。图3B是包封有GOx酶和胰岛素的PV(PV(E+I))的TEM图。在图3A至图3B中，比例尺表示200nm。图3C是描绘通过动态光散射(DLS)确定的空PV和略大的PV(E+I)的直径分布的图。
图4是描绘通过DLS确定的PV在室温下在PBS中的稳定性的图。
图5A至图5F描绘了荧光标记的胰岛素的包封及其在高血糖水平的葡萄糖中的体外释放。GOx酶(E)和FITC标记的胰岛素被包封在PV中。分别在温育前(图5A)和在37℃下在400mg/dL葡萄糖溶液中温育1小时(图5B)和2小时(图5C)后采集PV(E+I)溶液的2.5D荧光图像。图5A至图5C所示的荧光强度分布以及所示的白色虚线分别在温育前(图5D)和在葡萄糖中温育1小时(图5E)和2小时(图5F)后以任意单位(a.u.)计算和绘制。
图6是描绘在37℃下在不同的H2O2浓度下胰岛素从PV(E+I)体外释放的图。
图7A至图7C描绘了在暴露于高血糖水平(400mg/dL)的葡萄糖时PV随时间推移的粒度表征。在37℃下在葡萄糖溶液中温育1小时(图7A)和2小时(图7B)后PV(E+I)的TEM图中示出了PV形态的变化。在图7A至图7B中，比例尺表示200nm。图7C是描绘通过动态光散射(DLS)确定的在葡萄糖溶液中温育不同时间的PV(E+I)的直径分布的图。
图8A至图8D是示出在不同的葡萄糖水平下纳米粒子的体外胰岛素释放的图。图8A示出了在37℃下在若干种葡萄糖浓度下随时间推移从PV(E+I)释放的胰岛素浓度。图8B示出了作为PV(E+I)和PV(1/2E+I)(与PV(E+I)相比，含有一半量的GOx酶)的媒介物中的葡萄糖浓度的函数的胰岛素释放速率(直线斜率)。图8C示出了当葡萄糖浓度每10分钟在100和400mg/dL之间重复变化时PV(E+I)的脉冲式胰岛素释放曲线。图8D示出了天然、未包封的胰岛素和从用400mg/mL葡萄糖温育的PV释放的胰岛素的圆二色(CD)光谱。误差条表示SD(n＝3)。
图9A至图9C示出了能够施用PV的基于透明质酸(HA)的微针(MN)阵列贴片。图9A示出了负载有含有FITC标记的胰岛素的PV的MN的荧光显微图像。(插图是MN的放大图像)。比例尺表示200μm。图9B示出了用MN阵列贴片经皮处理1小时的小鼠皮肤的台盼蓝染色。图9C示出了MN阵列贴片刺穿的小鼠皮肤的H&E染色切片。皮肤肌肉和脂肪组织区域分别以M和F表示。发生MN贴片插入的区域以黑色虚线表示。
图10A至图10E示出了PV和含有PV的MN贴片的生物相容性。在施用后两天对施用有MN贴片的皮肤切片(图10A)和周围组织(图10B)进行H&E染色。(比例尺：100μm)。在处理后5分钟(图10C)、30分钟(图10D)和6小时(图10E)拍摄皮肤穿刺痕迹的照片。
图11A至图11B是示出用MN[I]和MN[PV(E+I)]处理的糖尿病小鼠中的血糖浓度的图。图11A示出了用单独的含有透明质酸的MN贴片(MN[HA])、负载有胰岛素的MN贴片(MN[I])、负载有包封GOx酶和胰岛素的囊泡的MN贴片(MN[PV(E+I)])以及负载有包封单独的胰岛素的囊泡的MN贴片(MN[PV(I)])处理后的STZ诱导的糖尿病小鼠中的血糖水平。*与MN[I]相比，施用MN[PV(E+I)]的P<0.05。图11B示出了用MN[PV(E+I)]和MN[PV(I)]处理后的STZ诱导的糖尿病小鼠的血浆中的人胰岛素浓度。*与MN[PV(I)]相比，施用MN[PV(E+I)]的P<0.05。
图12A至图12B是示出贴片处理的小鼠的葡萄糖耐受性的图。图12A示出了与健康小鼠相比，施用MN[PV(E+I)]或MN[I]后1小时糖尿病小鼠的体内葡萄糖耐受性测试的结果。*与MN[I]相比，施用MN[PV(E+I)]的P<0.05。图12B示出了通过血糖水平测量的贴片处理的和葡萄糖挑战的糖尿病小鼠的响应性。计算图12A所示的直到150分钟的曲线下面积(AUV)，其中基线设定为0分钟血糖读数。*与健康小鼠相比，施用MN[I]的P<0.05。
图13A至图13B是示出含有PV的MN贴片的降血糖潜力的图。图13A示出了用MN贴片处理的健康(非糖尿病)小鼠随时间推移的血糖变化。*与MN[I]相比，施用MN[PV(E+I)]的P<0.05。图13B示出了低血糖指数的定量，低血糖指数的计算式为初始血糖读数和最低血糖读数之差除以达到最低血糖读数的时间。*与MN[PV(I)]相比，施用MN[PV(E+I)]的P<0.05。误差条表示SD(n＝5)。
具体实施方式
本公开的以下描述以其最好的、目前已知的一个或多个实施方案被提供作为本公开的实施教导。为此，相关领域的技术人员将认识和理解的是，可以对本文描述的本发明的各个实施方案进行许多改变，而仍然获得本公开的有益结果。还将显而易见的是，本公开的一些所需有益效果可以通过选择本公开的某些特征而不利用其他特征来获得。因此，本领域的技术人员将认识到，对本公开的许多修改和改变是可能的，在某些情况下甚至可以是所期望的并且是本公开的一部分。因此，以下描述被提供为本公开的原理的说明，而不是对其进行限制。
术语
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。如本文所用的术语“包含”及其变体与术语“包括”、“含有”及其变体同义地使用，并且是开放的、非限制性术语。尽管本文已经使用术语“包含”、“包括”和“含有”来描述各种实施方案，但是术语“基本上由……组成”和“由……组成”可用于替代“包含”、“包括”和“含有”以提供更具体的实施方案并且也是公开的。
本发明公开了用于制备本发明所公开的组合物的组分以及在本文所公开的方法中使用的组合物本身。本文公开了这些材料和其他材料，应当理解，当公开了这些材料的组合、子集、相互作用、群组等，而没有明确地公开对每个不同的个体和集体组合以及这些化合物的排列的具体提及时，每种情况均得到本文的明确设想和描述。例如，如果公开并讨论了特定的纳米粒子并且讨论了可对该纳米粒子进行的多种修改，那么除非有相反的明确说明，否则明确设想了所述纳米粒子的每一个组合和排列以及可能的修改。因此，如果公开了一类纳米粒子A、B和C以及一类纳米粒子D、E和F并且公开了组合纳米粒子的实例或例如包含A-D的组合纳米粒子，那么即使没有单独列举每一个，也单独和集体设想了每一个，这意味着组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F被视为得到公开。同样，还公开了这些纳米粒子的任何子集或组合。因此，例如，子组A-E、B-F和C-E将被视为得到公开。此概念适用于本专利申请的所有方面，包括但不限于制备和使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以执行的多个附加步骤，则应当理解，这些附加步骤中的每一个都可以使用所公开的方法的任何特定实施方案或实施方案的组合来执行。
应当理解，本文所公开的组合物具有某些功能。本文公开了用于执行所公开的功能的某些结构需求，并且应当理解，存在可执行与所公开的结构有关的相同功能的多个结构，并且这些结构最终将实现相同的结果。
除非另外明确说明，否则决不旨在将本文阐述的任何方法解释为需要以特定顺序执行其步骤。因此，当方法权利要求未实际上叙述待由它的步骤遵循的顺序或未在权利要求或描述中另外明确陈述步骤将限于特定顺序时，在任何方面都决不旨在推断某一顺序。这适用于任何可能的非表达的解释基础，包括：关于步骤安排或操作流程的逻辑问题；从语法组织或标点符号中得出的普通含义；以及说明书中描述的实施方案的数量或类型。
如本说明书和权利要求中所用，除非上下文另外明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代物。例如，术语“药剂”包括多种药剂，包括它们的混合物。
如本文所用，术语“可以”、“任选地”和“可任选地”可互换使用，并且意味着包括条件发生的情况以及条件不发生的情况。因此，例如，制剂“可以包含赋形剂”的陈述意味着包括制剂包含赋形剂的情况以及制剂不包含赋形剂的情况。
如本领域的普通技术人员所理解，术语“约”和“大约”被定义为“接近”。在一些非限制性实施方案中，该术语被定义为在所提供的相关值的10％内。在一些非限制性实施方案中，该术语被定义为在5％内。在另外其他非限制性实施方案中，该术语被定义为在1％内。
向受试者“施用”包括向受试者引入或递送药剂的任何途径。施用可以通过任何合适的途径进行，包括口服、局部、静脉内、皮下、经皮、透皮、肌肉内、关节内、肠胃外、小动脉内、皮内、心室内、颅内、腹膜内、病灶内、鼻内、直肠、阴道、通过吸入、经由植入型药盒、肠胃外(例如，皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、腹膜内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术)等等。如本文所用的“并行施用”、“组合施用”、“同时施用”或“同时地施用”意指化合物在相同时间点施用、在时间上重叠地施用或一个接一个施用。在后一种情况下，两种化合物的施用时间足够接近，使得观察到的结果与在相同时间点施用化合物时所达到的那些结果难以区分。“全身施用”是指经由将药剂引入或递送至受试者身体的广泛区域(例如，超过身体的50％)的途径(例如通过进入循环系统或淋巴系统)向受试者引入或递送药剂。相比之下，“局部施用”是指经由将药剂引入或递送至区域或与施用点紧邻的区域的途径向受试者引入或递送药剂，并且不以治疗上显著的量全身引入药剂。例如，局部施用的药剂可以在施用点局部附近容易地检测到，但是在受试者身体的远侧部分中不可检测到或可检测到的量可忽略。施用包括自我施用和由他人施用。
“生物相容性”通常是指通常对接受者无毒并且不会对受试者造成显著的不利影响的材料及其任何代谢物或降解产物。
如本文所用，术语“包含”意指组合物和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。“基本上由……组成”在用于限定组合物和方法时，应指排除对组合有任何重要意义的其他要素。因此，基本上由如本文所定义的要素组成的组合物将不排除来自分离和纯化方法的痕量污染物以及药学上可接受的载剂，诸如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等等。“由……组成”应指排除超过痕量的其他成分要素和用于施用本发明组合物的基本方法步骤。由这些过渡术语中的每一者限定的实施方案都在本发明的范围内。应当明确地理解，当组合物、系统或方法使用术语“包含”时，说明书还公开了在涉及经修改的要素时使用术语“基本上由……组成”和“由……组成”的相同组合物、系统或方法。
“肽”、“蛋白质”和“多肽”可互换使用，以指包含两个或更多个氨基酸的天然或合成分子，所述氨基酸通过一个氨基酸的羧基基团连接到另一个氨基酸的α氨基基团上。
“药学上可接受的”组分可以指不会在生物学上或其他方面不合需要的组分，例如，该组分可以掺入本发明的药物制剂中并且如本文所述施用于受试者，而不会引起显著的不期望的生物效应或以有害方式与含有它的制剂的任何其他组分相互作用。当结合向人施用来使用时，该术语通常意味着该组分符合毒理学和制造测试的所需标准，或者意味着该组分包括在美国食品药品监督管理局(U.S.Food and Drug Administration)编制的Inactive Ingredient Guide上。
“药学上可接受的载剂”(有时称为“载剂”)意指可用于制备通常安全且无毒的药物或治疗组合物的载剂或赋形剂，并且包括兽医和/或人类药物或治疗用途可接受的载剂。术语“载剂”或“药学上可接受的载剂”可以包括但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如油/水或水/油乳液)和/或各种类型的润湿剂。如本文所用，术语“载剂”涵盖但不限于任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、脂质、稳定剂或本领域已知的用于药物制剂和如本文进一步描述的其他材料。
如本文所用，术语“聚合物”是指相对高分子量的天然或合成有机化合物，该有机化合物的结构可由重复的小单元即单体来表示(例如，聚乙烯、橡胶、纤维素)。合成聚合物通常通过单体的加成或缩聚来形成。如本文所用，术语“共聚物”是指由两个或更多个不同的重复单元(单体残基)形成的聚合物。作为实例而非限制，共聚物可以是交替共聚物、无规共聚物、嵌段共聚物或接枝共聚物。还设想了，在某些方面，嵌段共聚物的各个嵌段区段本身可以包含共聚物。术语“聚合物”涵盖所有形式的聚合物，包括但不限于天然聚合物、合成聚合物、均聚物、杂聚物或共聚物、加成聚合物等。
术语“预防”是指防止或减缓疾病或病症发作或者降低疾病或病症严重程度的治疗。因此，如果治疗可以医治具有疾病症状的受试者的疾病，则它还可以预防尚不患有某些或所有症状的受试者的该疾病。
范围在本文中可以表示为从“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。当表示这种范围时，另一个实施方案包括从一个特定值和/或至另一个特定值。类似地，通过使用先行词“约”将数值表示为近似值时，应当理解，该特定值构成了另一个实施方案。应当进一步理解的是，每个范围的端点对于另一个端点是重要的，并且独立于另一个端点。还应当理解，本文公开了多个值，并且每个值除该值本身之外在本文中还公开为“约”该特定值。例如，如果公开了值“10”，那么也公开了“约10”。
“治疗剂”是指具有有益生物效应的任何组合物。有益生物效应包括治疗效应(例如，治疗疾病或其他不期望的生理学病症)和预防效应(例如，预防疾病或其他不期望的生理病症(例如，1型糖尿病))。该术语还涵盖本文明确提及的有益药剂的药学上可接受的药理学活性衍生物，包括但不限于盐、酯、酰胺、前体药物、活性代谢物、异构体、片段、类似物等等。当使用术语“治疗剂”时，或当明确鉴定特定药剂时，应当理解，该术语包括药剂本身以及药学上可接受的药理学活性盐、酯、酰胺、前体药物、缀合物、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。
如本文所用，治疗剂的“治疗有效量”是指能够有效实现所需治疗结果的量，并且治疗剂的“预防有效量”是指能够有效预防不希望的生理病症的量。给定治疗剂的治疗有效量和预防有效量通常将根据诸如所治疗的病症或疾病的类型和严重程度以及受试者的年龄、性别和体重等因素而变化。
如本文所用的术语“治疗”(treat/treating/treatment)及其语法变型包括部分地或完全地延缓、缓解、缓和或减轻疾病或病症的一个或多个伴随症状的强度和/或缓解、缓和或阻止疾病或病症的一个或多个病因。根据本发明的治疗可以防止性地、预防性地、缓解性地或治疗性地施用。预防性治疗在发作之前(例如，在明显的癌症病征之前)、在早期发作期间(例如，在癌症的初始病征和症状之时)或在癌症的确定发展之后施用于受试者。预防性施用可以在感染症状出现之前数天至数年进行。
葡萄糖和H2O2响应性纳米粒子
应当理解，本公开的纳米粒子可以与本文公开的各种组合物、方法、产品、试剂盒和应用组合使用。
“智能”、自我调节、闭环药物(例如，胰岛素)施用系统对于治疗糖尿病和其他葡萄糖调节疾病将是相当理想的。本文公开了一种葡萄糖响应性药物递送纳米粒子，该纳米粒子具有许多有利性质，包括但不限于作为对高葡萄糖水平(例如，高血糖)的触发响应而产生H2O2，同时还从系统中清除H2O2以避免长期生物相容性问题。聚合物纳米粒子(PV)自组装为共聚物(例如，嵌段共聚物)并且在H2O2的存在下释放所包埋的负荷物(例如，治疗药物)。PV负载有葡萄糖感测酶(例如，葡萄糖氧化酶(GOx))，该葡萄糖感测酶通过葡萄糖氧化来生成H2O2。PV清除GOx介导的针对高血糖的响应中产生的H2O2，并且由于共聚物对H2O2的敏感性，触发了纳米粒子的去组装和药物释放。这些特征允许触发药物递送，同时减少或避免过氧化物介导的组织损伤。无毒的PV对升高的葡萄糖水平快速响应(例如，在十分钟内)，并且药物释放速率随着葡萄糖水平的升高而增加。所公开的PV的另一个重要方面包括有效调节葡萄糖水平同时降低低血糖风险的能力。因此，PV在需要时(例如，在高血糖期间)递送治疗剂，并且当所释放的治疗剂可为不期望的或有害的时(例如，在正常或低血糖期间)，则不会进行递送。PV对H2O2的敏感性也与H2O2浓度成正比，因此通过改变PV中的GOx水平提供了进一步控制药物递送的方式。PV可以与经皮微针(MN)阵列贴片整合，以实现快速响应、优异的生物相容性和无痛施用。
在一个方面，本文公开了一种包含共聚物的纳米粒子。该共聚物包含聚乙二醇聚合物、多羟基化聚合物和过氧化物敏感性侧基。该纳米粒子还包含葡萄糖响应剂。该纳米粒子还包含治疗剂。该纳米粒子的共聚物包封葡萄糖响应剂和治疗剂。
如本文所用，具有相同含义的术语“囊泡”、“聚合物囊泡(PV)”和“纳米粒子”可互换使用。目的是在本文中引用这些术语之一(例如，囊泡)的情况下，可互换的术语(例如，聚合物囊泡、PV、纳米粒子)可以明确地替换而不产生任何含义上的变化。
纳米粒子包含共聚物。该共聚物包含至少两种聚合物，但在一些实施方案中，可以包含至少三种、至少四种或至少五种聚合物。共聚物的分子量可为至少1,000Da。在一些实施方案中，共聚物的分子量可为至少10,000Da、至少20,000Da、至少30,000Da、至少40,000Da、至少50,000Da、至少75,000Da、至少100,000Da、至少150,000Da或至少200,000Da。
单体在共聚物内的排列无严格限制。例如，第一聚合物(例如，聚乙二醇聚合物)的单体单元可以以交替、统计或随机排列方式与第二聚合物(例如，多羟基化聚合物)的单体单元整合。然而，单体嵌段的某些取向可以促进共聚物自组装成囊泡。因此，在一些实施方案中，共聚物可以包括嵌段共聚物。在一些实施方案中，每个聚合物嵌段可以是均聚物，或者含有会破坏聚合物均一性的另外的单体单元。在一些实施方案中，共聚物包含与第二均聚物共价连接的第一均聚物。
共聚物包含聚乙二醇(PEG)聚合物。PEG聚合物可以含有修饰，例如以连接侧基(例如，过氧化物敏感性侧基)。在一些实施方案中，PEG是甲氧基化的。PEG聚合物包含至少五个乙二醇单体。在一些实施方案中，PEG聚合物包含至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少75个或至少100个乙二醇单体。
共聚物包含多羟基化聚合物。多羟基化聚合物含有羟基基团，侧基(例如，过氧化物敏感性侧基)可以连接至该羟基基团上。通常，多羟基化聚合物的单体的至少50％被羟基化。在一些实施方案中，多羟基化聚合物的单体的至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％被羟基化。在一些实施方案中，多羟基化聚合物是羟基化单体的均聚物。多羟基化聚合物包含至少五个羟基化单体。在一些实施方案中，多羟基化聚合物包含至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少75个或至少100个羟基化单体。
共聚物中的羟基化单体的数量与乙二醇单体的数量之比可以在约1:1至约20:1或更大的范围内。在一些实施方案中，共聚物中的羟基化单体的数量与乙二醇单体的数量之比为约20:1或更小、约10:1或更小、约8:1或更小、约6:1或更小、约4:1或更小、约3:1或更小或约2:1或更小。在一些实施方案中，共聚物中的羟基化单体的数量与乙二醇单体的数量之比为约1:1或更小、约0.75:1或更小、约0.5:1或更小、约0.25:1或更小、约0.1:1或更小或约0.05:1或更小。在一些实施方案中，共聚物中的羟基化单体的数量与乙二醇单体的数量之比在约1:1至约2:1、约1.1:1至约1.9:1、约1.2:1至约1.8:1或约1.3:1至约1.5:1的范围内。
多羟基化聚合物可以包含任何类型的含有羟基基团的生物相容性单体。在一些实施方案中，多羟基化聚合物包括聚氨基酸。在一些实施方案中，聚氨基酸包括聚酪氨酸或聚丝氨酸。在一些实施方案中，多羟基化聚合物包括酪氨酸和丝氨酸氨基酸的混合物。
共聚物还包含过氧化物敏感性侧基。在一些实施方案中，过氧化物敏感性侧基连接到多羟基化聚合物上。然而，过氧化物敏感性侧基也可以连接到PEG聚合物上，或连接到多羟基化聚合物和PEG聚合物二者上。在一些实施方案中，过氧化物敏感性侧基连接到多羟基化聚合物的羟基基团上。在一些实施方案中，过氧化物敏感性侧基连接到mPEG聚合物的甲氧基基团上。
过氧化物敏感性侧基可以通过适合于连接到生物相容性共聚物的任何类型的化学键进行连接。然而，过氧化物敏感性侧基应能够在过氧化物的存在下分离。在一些实施方案中，过氧化物敏感性侧基通过碳酸根键来连接。例如，碳酸根键可以通过多羟基化聚合物的羟基基团与苯基硼酸酯的酯基基团之间的共价键来形成。
共聚物含有足够量的过氧化物敏感性侧基以清除过氧化物分子和/或促进纳米粒子自组装。在一些实施方案中，共聚物包含单体的至少20％与过氧化物敏感性侧基缀合的聚合物(例如，PEG聚合物或多羟基化聚合物)。在一些实施方案中，共聚物包含单体的至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或至少75％与过氧化物敏感性侧基缀合的聚合物。
过氧化物敏感性侧基可以包括能够作为侧基结合共聚物的任何分子，具有足够的生物相容性(例如，对施用有纳米粒子的受试者无显著毒性)，并且能够结合过氧化物。在一些实施方案中，过氧化物敏感性侧基可以包括硼酸酯。在一些实施方案中，过氧化物敏感性侧基包括苯基硼酸酯。
过氧化物敏感性侧基还能够发生过氧化物介导的从共聚物的分离(例如，化学切割)。在暴露于过氧化物后，过氧化物敏感性侧基从共聚物分离，形成过氧化物清除离去基团。该机制有助于减少与纳米粒子相邻的区域(这些区域在高血糖条件下产生过氧化氢)中的过氧化物介导的细胞和组织损伤。
通常，共聚物可溶于水。当共聚物暴露于过氧化物和/或酸性pH时，水溶性有助于纳米粒子的去组装。在一些实施方案中，一个或多个侧基的连接可以改变共聚物的水溶性。例如，过氧化物敏感性侧基(例如，苯基硼酸)的连接可以例如通过增加共聚物的两亲性来改变共聚物的水溶性。经改变的溶解度可以促进共聚物自组装成纳米粒子。因此，这种侧基的切割可以促进纳米粒子的去组装或降解。
该纳米粒子还包含葡萄糖响应剂。在一些实施方案中，葡萄糖响应剂包括pH改变剂，该pH改变剂在暴露于葡萄糖时降低pH。在一些实施方案中，葡萄糖响应剂包括葡萄糖响应酶。在一些实施方案中，葡萄糖响应剂包括葡萄糖氧化酶(GOx)。GOx将葡萄糖氧化成葡萄糖醛酸，并产生反应副产物过氧化氢。GOx介导的葡萄糖氧化也会降低pH。在一些实施方案中，增加的酸度可以有助于共聚物的降解，从而促进包封的治疗剂的释放。另外，经由GOx介导的葡萄糖氧化产生的过氧化物可以被过氧化物敏感性侧基清除，从而有助于侧基的分离。
不受限制且不希望受任一种理论机制的束缚，据认为升高的葡萄糖水平有助于增加葡萄糖扩散到纳米粒子中，从而增加用于GOx介导的葡萄糖氧化的葡萄糖底物的量。随着GOx氧化葡萄糖，所产生的过氧化物的量不断增加，并且可以降低纳米粒子腔内的pH。过氧化物敏感性侧基清除所释放的过氧化物，导致过氧化物敏感性侧基从共聚物分离。随着pH降低并且过氧化物敏感性侧基被切割，纳米粒子可能会由于共聚物的水溶性增加而去组装。从而从去组装的纳米粒子中释放包封的治疗剂。以这种方式，纳米粒子在升高的葡萄糖水平(例如，高血糖)的条件下递送一种或多种治疗剂。
纳米粒子还包含治疗剂。治疗剂应具有足够小的尺寸以适合纳米粒子的腔(换句话讲，被纳米粒子包封)。在一些实施方案中，治疗剂治疗葡萄糖失衡和/或失调。在一些实施方案中，治疗剂治疗糖尿病(1型糖尿病和/或II型糖尿病)。在一些实施方案中，治疗剂刺激葡萄糖的组织吸收和/或利用。在一些实施方案中，治疗剂包括胰岛素或衍生自胰岛素的生物活性化合物。在一些实施方案中，纳米粒子包含治疗剂(例如，两种或更多种治疗剂)的组合。
在一些实施方案中，纳米粒子还可以含有用于清除代谢副产物的酶，例如过氧化物代谢酶。例如，纳米粒子可以包含经包封的酶，该经包封的酶可以降解或清除过氧化氢副产物。在一些实施方案中，过氧化物代谢酶可以是过氧化氢酶(CAT)。CAT可以用作过氧化物敏感性侧基的补充物，以缓和广泛的过氧化物产生(例如在非常高的高血糖条件下)的破坏作用。可以使用一定量的CAT，CAT不会干扰过氧化物介导的过氧化物敏感性侧基从共聚物的分离。过氧化氢酶可以为GOx介导的葡萄糖氧化提供另外的有益效果，因为过氧化氢酶可以再生氧以促进另外的葡萄糖氧化。
如本文所用，“高血糖水平的葡萄糖”是指引起临床高血糖或有引起临床高血糖风险的葡萄糖浓度。高血糖、正常血糖和低血糖的严格截止值可以在受试者之间，特别是在患有不同形式或严重程度的糖尿病的受试者之间变化。在一些实施方案中，高血糖水平的葡萄糖包括大于100mg/dL的葡萄糖。在一些实施方案中，高血糖水平的葡萄糖包括125mg/dL或更高、150mg/dL或更高、175mg/dL或更高或200mg/dL或更高的葡萄糖。相反，“正常血糖水平的葡萄糖”是指典型的/正常的，并且通常已知与血糖失衡的临床症状(或严重临床症状)无关的葡萄糖浓度。在一些实施方案中，正常血糖水平的葡萄糖包括约70mg/dL的葡萄糖至低于200mg/dL的葡萄糖。在一些实施方案中，正常血糖水平的葡萄糖包括约70mg/dL的葡萄糖至约175mg/dL的葡萄糖、约70mg/dL的葡萄糖至约150mg/dL的葡萄糖、约70mg/dL的葡萄糖至约125mg/dL的葡萄糖或约70mg/dL的葡萄糖至约100mg/dL的葡萄糖。“低血糖水平的葡萄糖”是指引起临床低血糖或有引起临床低血糖风险的葡萄糖浓度。在一些实施方案中，低血糖水平的葡萄糖包括70mg/dL或更低的葡萄糖。在一些实施方案中，低血糖水平的葡萄糖包括60mg/dL或更低、50mg/dL或更低、40mg/dL或更低或30mg/dL或更低的葡萄糖。在一些实施方案中，高血糖水平的葡萄糖包括200mg/dL或更高的葡萄糖，正常血糖水平的葡萄糖包括约70mg/dL的葡萄糖至低于200mg/dL的葡萄糖，低血糖水平的葡萄糖包括低于约70mg/dL的葡萄糖。
纳米粒子通常具有nm范围内的直径(即约1nm至约1,000nm)。然而，纳米粒子本身不限于nm粒度范围，并且直径可以例如大于1,000nm(例如，最大达1,500nm、最大达2,000nm或最大达3,000nm或更大)。在一些实施方案中，纳米粒子的直径为1,000nm或更小、750nm或更小、500nm或更小、400nm或更小、300nm或更小或200nm或更小。在一些实施方案中，纳米粒子的直径为10nm至小于1,000nm。任选地，纳米粒子的直径为100nm至800nm、100nm至600nm、100nm至400nm或150nm至250nm。应当理解，纳米粒子可以具有在上文所述的任一最小值至任一最大值的范围内的直径。例如，纳米粒子可以具有在100nm至1,000nm或1nm至500nm等的范围内的直径。
纳米粒子的治疗剂包封率可以变化。包封率通常基于包封工序中使用的治疗剂的量以及在从包封溶液中除去纳米粒子之后保留在溶液中的治疗剂的量来计算。纳米粒子可以具有50％或更大的治疗剂包封率。在一些实施方案中，纳米粒子具有60％或更大、70％或更大、75％或更大、80％或更大或82％或更大的治疗剂包封率。
纳米粒子可以通过经包封的治疗剂的量(按重量计)除以纳米粒子的量(按重量计)(称为治疗剂负载百分比)来进一步定义。通常，治疗剂负载百分比为至少1％，但是该百分比取决于治疗剂的类型、尺寸和有效剂量可以更小。在一些实施方案中，治疗剂负载百分比为至少5％、至少10％或至少12％或更大。
纳米粒子被构造为使得纳米粒子的共聚物包封葡萄糖响应剂和治疗剂。所谓“包封”意指在纳米粒子中存在内容物(例如，葡萄糖响应剂和治疗剂)的物理包裹，使得内容物通常不会从纳米粒子中逸出或扩散出来。在一些实施方案中，共聚物包封内容物，但允许葡萄糖扩散到纳米粒子的腔中。当纳米粒子去组装时，内容物不再“被包封”并且可以从纳米粒子的腔中释放。
任选地，纳米粒子可以配制成药物。纳米粒子可以配制成任何合适的药物，包括例如但不限于固体剂型、半固体剂型、液体剂型和气体(吸入)剂型，诸如片剂、丸剂、粉剂、液体溶液剂或悬浮剂、栓剂、注射剂、输注剂、吸入剂、水凝胶、局部凝胶、水凝胶、喷雾剂等等。任选地，药物包含药学上可接受的赋形剂/载剂。任选地，药物包含有效剂量的治疗剂(例如，能够有效纠正葡萄糖失衡或失调的剂量)。
本文还公开了一种装置，该装置包括多个微针，每个微针具有基端和尖端；基板，微针的基端附接到该基板上；以及多个纳米粒子，该纳米粒子包含：共聚物，其包含聚乙二醇聚合物、多羟基化聚合物和过氧化物敏感性侧基；葡萄糖响应剂；以及治疗剂；其中该共聚物包封葡萄糖响应剂和治疗剂。纳米粒子可以是在本发明精神内的任何本文公开的纳米粒子。该装置可以是贴片，例如经皮贴片，该贴片包括插入受试者真皮中的微针(MN)。贴片通常由无毒的生物相容性材料(例如，透明质酸)制成，并且可以提供纳米粒子的快速和低痛/无痛施用。
在一些实施方案中，微针包含透明质酸。除透明质酸之外，微针还可以包含多种材料，包括金属、陶瓷、半导体、有机物、聚合物、复合材料或它们的组合。典型的构造材料包括药用级不锈钢、金、钛、镍、铁、锡、铬、铜、钯、铂、这些或其他金属的合金、硅、二氧化硅和聚合物。代表性的可生物降解的聚合物包括羟基酸的聚合物，诸如乳酸和乙醇酸聚丙交酯、聚乙交酯、聚丙交酯-乙交酯共聚物，以及与PEG、聚酸酐、聚(邻)酯、聚氨酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)和聚(丙交酯-己内酯共聚物)的共聚物。
微针应具有机械强度，以便在插入生物屏障时、在适当位置保留长达数天时以及在被移除时保持完整。在一些实施方案中，微针必须保持完整至少足够长的时间，以便微针用于其预期目的(例如，递送治疗剂)。在一些实施方案中，微针具有的机械强度为至少1牛顿(N)/针、至少2N/针或至少3N/针。
微针可以具有直线或锥形轴。在一个实施方案中，微针的直径在微针的基端处最大，并且逐渐变细至基部远侧的端部处的一点。微针也可以被制成具有包括直线(非锥形)部分和锥形部分的轴。针也可以完全不具有锥形端部，即它们可以仅仅是具有钝的或扁平的尖端的圆柱体。
微针可以垂直于基板取向或与基板成一角度。在一个实施方案中，微针垂直于基板取向，以使得可以提供更大的每单位面积基板的微针密度。微针的阵列可以包括微针取向、高度或其他参数的混合物。
微针可以以在垂直方向上具有圆形横截面的轴形成，或者横截面可以是非圆形的。例如，微针的横截面可以是多边形(例如，星形、正方形、三角形)、椭圆形或其他形状。横截面尺寸可以在约1μm和1000μm之间，以使得基部可以为约100μm至500μm，尖端可以在1μm和20μm之间。在一个实施方案中，微针在基部处可以为大约300μm，在尖端处为大约5μm。
微针的长度通常在约10μm和1mm之间，优选地在400μm和1mm之间。在一个实施方案中，微针的长度(或高度)为约600μm。针对具体应用，并考虑插入部分和未插入部分二者来选择长度。微针的阵列可以包括具有例如不同长度、外径、内径、横截面形状和微针之间的间距的微针的混合物。在一个实施方案中，微针以15×15阵列排列，且尖端至尖端间距为600μm。在一个实施方案中，微针以20×20阵列排列，且尖端至尖端间距为600μm。
微针的壳可被认为是与受试者接触的微针的外侧部分。微针的芯可被认为是朝向每个微针的中心定位的微针部分，并且与微针的壳部分接触的受试者皮肤是分开的。
在一些实施方案中，将纳米粒子配制成水凝胶。在一些实施方案中，将水凝胶涂覆到贴片的MN上。在一些实施方案中，多个微针排列在尺寸为500mm2或更小、250mm2或更小或100mm2或更小的贴片上。在一些实施方案中，多个微针具有约200μm至约800μm的中心至中心间距。在一些实施方案中，多个微针具有约100nm至1.8μm、约300nm至约1,000nm或约400nm至约700nm的高度。在一些实施方案中，多个微针具有约600nm的高度。
使用方法
本文还公开了向受试者递送治疗剂的方法，该方法包括(a)向受试者施用纳米粒子，该纳米粒子包含：共聚物，其包含聚乙二醇聚合物、多羟基化聚合物和过氧化物敏感性侧基；葡萄糖响应剂；以及治疗剂；其中该共聚物包封葡萄糖响应剂和治疗剂；以及(b)在高血糖水平的葡萄糖的存在下从纳米粒子释放治疗剂。
本文公开的方法中的每一种可以包括在本发明精神内的任何本文公开的纳米粒子。
受试者可以是任何哺乳动物受试者，例如人、狗、牛、马、小鼠、兔等。在一些实施方案中，受试者具有葡萄糖失调病症(例如，血糖失衡)。在一些实施方案中，受试者具有高血糖。在一些实施方案中，受试者患有糖尿病(1型糖尿病或2型糖尿病)。
施用步骤可以通过适用于将本文公开的纳米粒子施用于受试者的任何方法来进行。可以全身施用(例如，通过注射)或局部施用纳米粒子。在一些实施方案中，经皮施用纳米粒子。在其中局部施用(例如，通过局部经皮贴片施用)纳米粒子的一些实施方案中，纳米粒子对血糖水平产生全身效应。
施用步骤可以包括至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或至少十种剂量。施用步骤可以在受试者表现出疾病症状之前(例如，预防性)或在疾病症状发生期间或在疾病症状发生之后进行。施用步骤可以在向受试者施用其他药剂之前、同时或之后进行。在一些实施方案中，施用步骤在施用一种或多种另外的诊断剂或治疗剂之前、同时或之后进行。在一些实施方案中，施用步骤根据需要进行，例如当受试者经历高血糖或有成为高血糖的风险时。
在一些实施方案中，纳米粒子在水凝胶中施用。在一些实施方案中，纳米粒子在装置(例如，经皮贴片)中施用，该装置包括：多个微针，每个微针具有基端和尖端；以及基板，微针的基端附接到该基板上。在一些实施方案中，该装置提供纳米粒子的快速和低痛/无痛施用。在一些实施方案中，该装置产生小伤口，该小伤口在6小时或更短的时间内愈合。
该方法包括在高血糖水平的葡萄糖的存在下从纳米粒子释放治疗剂。在一些实施方案中，高血糖水平的葡萄糖有助于纳米粒子的去组装，从而促进治疗剂的释放。在一些实施方案中，葡萄糖被葡萄糖响应剂氧化成葡萄糖醛酸，产生副产物过氧化物。在一些实施方案中，过氧化物产生有助于纳米粒子腔中的pH的降低。在一些或其他实施方案中，过氧化物被过氧化物敏感性侧基清除。
在一些实施方案中，该方法还包括在暴露于过氧化物后将过氧化物敏感性侧基从共聚物分离。在此类实施方案中，据信由葡萄糖响应剂产生的过氧化物有助于过氧化物敏感性侧基从共聚物的切割/分离。在一些实施方案中，分离步骤有助于纳米粒子的去组装，从而从纳米粒子释放治疗剂。
在一些实施方案中，该方法还包括例如通过降低血糖水平来纠正血糖失衡。在一些实施方案中，治疗剂包括胰岛素。在一些实施方案中，该方法将血糖水平从高血糖水平降低至正常血糖水平。该方法还可以避免产生低血糖。因此，在一些实施方案中，将血糖水平降低至不低于正常血糖水平。例如但不限于，当达到正常血糖水平时，纳米粒子可以终止或显著降低葡萄糖氧化或过氧化物产生的速率。类似地，在一些实施方案中，治疗剂释放步骤可以在纳米粒子施用步骤之后延迟的时间进行。例如，纳米粒子可以预防性地施用于具有低血糖或正常血糖的受试者，在该条件下纳米粒子不会降低葡萄糖水平。然而，当受试者随后成为高血糖时，可以启动治疗剂释放步骤，从而在一些实施方案中降低葡萄糖水平。
该方法可以降低血糖水平或维持正常血糖一段时间，该时间比未包封的胰岛素所提供的时间更长。在一些实施方案中，该方法维持正常血糖至少一小时、至少二小时、至少三小时、至少四小时或至少五小时。
本文公开的方法可以避免过氧化物介导的组织损伤。在暴露于过氧化物后，过氧化物敏感性侧基从共聚物分离，形成过氧化物清除离去基团。该机制有助于减少与纳米粒子相邻的区域(这些区域在高血糖条件下产生过氧化氢)中的过氧化物介导的细胞和组织损伤。
本文还公开了使受试者的血糖水平正常化(例如，降低)的方法，该方法包括(a)向受试者施用纳米粒子，该纳米粒子包含：共聚物，其包含聚乙二醇聚合物、多羟基化聚合物和过氧化物敏感性侧基；葡萄糖响应剂；以及治疗剂；其中该共聚物包封葡萄糖响应剂和治疗剂；以及(b)在高血糖水平的葡萄糖的存在下从纳米粒子释放治疗剂。
本文还公开了调节受试者的胰岛素递送的方法，该方法包括(a)向受试者施用纳米粒子，该纳米粒子包含：共聚物，其包含聚乙二醇聚合物、多羟基化聚合物和过氧化物敏感性侧基；葡萄糖响应剂；以及胰岛素；其中该共聚物包封葡萄糖响应剂和胰岛素；以及(b)在高血糖水平的葡萄糖的存在下从纳米粒子释放胰岛素。
试剂盒
本文还公开了包括纳米粒子和用于施用纳米粒子的装置的试剂盒，该纳米粒子包含：共聚物，其包含聚乙二醇聚合物、多羟基化聚合物和过氧化物敏感性侧基；葡萄糖响应剂；以及治疗剂；其中该共聚物包封葡萄糖响应剂和治疗剂。
在本文公开的任一试剂盒中，纳米粒子可以是在本发明精神内的任何本文公开的纳米粒子。类似地，该试剂盒可以用于将纳米粒子施用于任何本文公开的受试者，尤其是人。
该试剂盒包括用于施用纳米粒子的装置。在一些实施方案中，该装置被构造用于经皮施用。在一些实施方案中，该装置包括：多个微针，每个微针具有基端和尖端；以及基板，微针的基端附接到该基板上。该装置还包括在本发明精神内的任何本文公开的纳米粒子。在一些实施方案中，该装置提供多个纳米粒子和药学上可接受的载剂。该装置可以是贴片，例如经皮贴片，该贴片包括插入受试者真皮中的微针(MN)。贴片通常由无毒的生物相容性材料(例如，透明质酸)制成，并且可以提供纳米粒子的快速和低痛/无痛施用。
在一些实施方案中，将纳米粒子配制成水凝胶。在一些实施方案中，将水凝胶涂覆到贴片的MN上。在一些实施方案中，多个微针排列在尺寸为500mm2或更小、250mm2或更小或100mm2或更小的贴片上。在一些实施方案中，多个微针具有约200μm至约800μm的中心至中心间距。在一些实施方案中，多个微针具有约100nm至1.8μm、约300nm至约1,000nm或约400nm至约700nm的高度。在一些实施方案中，多个微针具有约600nm的高度。在一些实施方案中，微针具有的机械强度为至少1牛顿(N)/针、至少2N/针或至少3N/针。
已经描述了本发明的许多实施方案。然而，应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种修改。因此，其他实施方案也在以下权利要求的范围内。
实施例
为了进一步展示本公开的原理，提出以下实施例，以便为本领域的普通技术人员提供如何制备和评价本文要求保护的组合物、制品和方法的完整公开内容和描述。它们仅旨在作为本发明的实施例，并且不旨在限制被本发明人视为其公开内容的范围。这些实施例并非旨在排除对于本领域的技术人员而言显而易见的本发明的等同物和变型形式。除非另外说明，否则温度为℃或处于环境温度下，压力为大气压或接近大气压，并且其他条件应理解为标准条件。可用于优化产物质量和性能的方法条件有许多变化和组合。优化这些方法条件仅仅需要合理和常规的实验。
实施例1：用于葡萄糖介导的胰岛素递送的与经皮贴片整合的H2O2响应性纳米粒子。
PV(也称为聚合物体(polymersome))通常由两亲性嵌段共聚物自组装而成，以形成由水性芯和聚合物双层膜组成的中空结构。参见Tanner等人，Acc.Chem.Res.,2011,44:1039。PV由于其稳固的结构和亲水性分子的大负载能力，为受控药物递送带来了很大希望。在此，PV从与聚乙二醇(PEG)和苯基硼酸酯(PBE)缀合的聚丝氨酸(称为mPEG-b-P(Ser-PBE))结合的嵌段共聚物自组装，并且具有空心球形结构，其中GOx和胰岛素被包封在该空心球形结构内部。选择侧基PBE，因为它在生理条件下易于进行H2O2介导的降解(图1A和图1B)。参见Broaders等人，J.Am.Chem.Soc.,2010,133:756；de Gracia Lux等人，J.Am.Chem.Soc.,2012,134:15758。对于体内施用，纳米粒子还与经皮微针阵列贴片整合。通常具有短于一毫米的针长度的微针由于易用性和改善的患者顺从性已成为具有吸引力的经皮药物递送技术。选择交联的透明质酸(HA)来制备微针以实现优异的生物相容性和足够的硬度。参见Gittard等人，J.Adhes.Sci.Technol.,2013,27:227。当将微针贴片施用于糖尿病小鼠时，葡萄糖扩散穿过膜并与腔中的GOx相互作用，导致葡萄糖被氧化成葡萄糖酸，同时生成H2O2：
参见Yu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,2015,112:8260。由于生成的H2O2，共聚物mPEG-b-P(Ser-PBE)失去其PBE侧链并成为水溶性的，从而导致PV的去组装和随后的预负载的胰岛素的释放。经皮装置提供了所期望的智能胰岛素递送系统，该递送系统具有高药物负载能力、快速响应和无痛施用。
结果
图1A示出了以用于葡萄糖介导的胰岛素释放的H2O2响应性纳米粒子为基础的概念。由PEG聚合物和含有苯基硼酸酯(PBE)侧基的聚丝氨酸组成的二嵌段(deblock)共聚物(mPEG-b-P(Ser-PBE))自组装成聚合物囊泡(PV)。在组装过程中，葡萄糖氧化酶(GOx)和胰岛素可以被包埋在所形成的PV中。随着葡萄糖浓度升高至高血糖水平，更多的葡萄糖扩散到囊泡中，导致被GOx氧化的葡萄糖增加，使得H2O2产生增加。苯基硼酸酯(PBE)清除所产生的H2O2分子，导致从共聚物中切下PBE，随后纳米粒子降解，从而释放所包埋的胰岛素。图1B示出了配备有纳米粒子的微针贴片，该微针贴片可施用于糖尿病小鼠的皮肤以经皮递送纳米粒子。
首先经由胺引发的丝氨酸的N-羧基-α-氨基酸酐(NCA)的开环聚合反应(ROP)合成二嵌段共聚物(mPEG-b-聚丝氨酸)。参见Tai等人，Biomacromolecules,2014,15:3495；Lu等人，Nat.Commun.,2011,2:206；Wang等人，J.Am.Chem.Soc.,2011,133:12906。然后，4-(羟甲基)苯基硼酸频哪醇酯(PBE)经由碳酸根键缀合至丝氨酸残基的侧羟基(图2A)。计算出聚丝氨酸嵌段的聚合度为60，之后75％的丝氨酸侧链羟基与PBE缀合，如通过使用1H NMR峰面积(mPEG的亚甲基峰作为标准)所确定(图2B)。疏水性PBE基团具有至少三个主要功能：1)清除H2O2，2)改变聚合物的溶解度并使得能够在水溶液中形成PV，以及3)提供易于进行的H2O2介导的PV解离以便快速释放胰岛素(图1A)。
使用溶剂蒸发法来进行所得的二嵌段共聚物mPEG-b-P(Ser-PBE)的自组装。通过透射电子显微镜(TEM)和动态光散射(DLS)来表征所得的PV的形态。TEM图显示获得了具有中空结构的球形聚合物纳米粒子(PV)(图3A)。通过DLS确定空PV的平均直径为约200nm(图3C)。空PV的稳定性通过DLS得以证实。在4℃下超过1周未观察到显著的直径变化(图4)。
然后构建PV以包封GOx酶(E)和胰岛素(I)。TEM成像显示在包封GOx和胰岛素(PV(E+I))之后PV的腔被填充(图3B)。此外，DLS显示平均直径增加至220nm(图3C)，与TEM测定的纳米粒子填充一致。测得PV和PV(E+I)的ζ电位分别为-14.4和-14.1mV。
为了进一步证实胰岛素包封，将FITC标记的胰岛素加入PV中。PV的荧光图像中的针状簇证实了FITC标记的胰岛素的成功包封(图5A)。PV的胰岛素负载含量被确定为12.5±0.5％(重量/重量)，并且负载率为82.5±1.0％。
通过在具有不同H2O2浓度(0、50、200μM)的PBS缓冲液中温育纳米粒子，展示了负载有胰岛素的纳米粒子的H2O2响应能力。随着H2O2浓度的增加，胰岛素释放增加(图6)。
通过在葡萄糖浓度为400mg/dL(典型的高血糖水平)的PBS缓冲液中温育纳米粒子并观察相应的尺寸变化来检查由葡萄糖介导的PV的H2O2响应性去组装。如上文所讨论，荧光信号显示具有经包封的FITC-胰岛素的PV在暴露于高血糖水平的葡萄糖之前具有针状簇信号(图5A)。然而，400mg/dL的葡萄糖的添加在一小时内引起簇的膨胀(图5B)，并且在两小时内变得更加均一(图5C)。荧光信号随时间推移的定量如图5D至图5F中所示，分别对应于图A至图C的零小时、一小时和两小时所示的荧光图。定量结果还显示出FITC-胰岛素簇在暴露于葡萄糖时的均一性。这些结果证实了PV的去组装和随后的FITC-胰岛素释放。
分析包封GOx和胰岛素的PV响应于葡萄糖暴露的形态变化。在400mg/dL的葡萄糖溶液中温育一小时后，TEM图显示出PV结构解离，并且一些PV重组成大颗粒和小颗粒(图7A)。在暴露于葡萄糖两小时后，纳米粒子密度(每单位面积的群体)和粒度均进一步减小，并且观察到大量的负荷物泄漏(图7B)。通过DLS测量的纳米粒子直径定量了PV随时间推移响应于葡萄糖暴露的直径变化(图7C)。
通过将纳米粒子与含有不同浓度葡萄糖(包括对照水平(0mg/dL)、正常血糖水平(100mg/dL)和高血糖水平(400mg/dL))的PBS一起温育，进一步评估了纳米粒子响应于不同葡萄糖水平的体外胰岛素释放。在高血糖葡萄糖浓度下观察到显著快速的胰岛素释放速率，而在正常血糖水平和对照水平下观察到有限的胰岛素释放(图8A)。该释放特征与上述解离响应一致。当葡萄糖浓度随时间推移逐渐增加时(零小时为100mg/dL，一小时为200mg/dL，两小时为400mg/dL)，胰岛素的释放速率(斜率)也相应地增加(图8B)。这些结果表明PV通过增加胰岛素释放来响应于葡萄糖浓度的增加。当葡萄糖浓度在100mg/dL和400mg/dL之间进行每个步长10分钟的周期性变化时，观察到脉冲释放模式(图8C)。这些结果表明PV对葡萄糖浓度的变化具有快速响应。此外，当PV中的GOx含量减少一半(PV(1/2E+I))时，胰岛素的释放速率也相应地减少(图8B)。这些结果表明，可以通过改变PV中的GOx含量来调节胰岛素释放速率。值得注意的是，所释放的胰岛素具有与天然、未包封的胰岛素相同的二级结构(图8D)，因此在功能和活性上可能也与天然胰岛素相同。总体来说，这些结果证实了从PV释放胰岛素以具有快速和可适应的响应性的葡萄糖响应方式进行。
为了实现便捷且无痛的施用，使用微模塑方法将负载有胰岛素的PV沉积到基于交联透明质酸(HA)的微针(MN)阵列贴片的尖端中。参见Yu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,2015,112:8260。所得的MN以20×20阵列排列，且100mm2贴片中的尖端至尖端间距为600μm。与负载有FITC-胰岛素的PV整合的MN的荧光成像显示，PV在每个针的尖端区域中均匀分布(图9A)。MN施用于小鼠的背部并且容易和方便地刺穿小鼠皮肤，如小鼠皮肤的台盼蓝染色(图9B)和经切除的小鼠皮肤组织的苏木精和伊红(H&E)染色(图9C)所示。在拉伸压缩机中，MN的机械强度为约3N/针，该机械强度足以插入皮肤而不会造成尖端断裂。参见Gittard等人，J.Adhes.Sci.Technol.,2013,27:227。
为了评价系统的生物相容性，使用3-(4,5)-二甲基噻唑(-z-y1)-3,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)测定法在0.1mg/mL至1.0mg/mL范围内的不同PV浓度下研究PV对HeLa细胞的细胞毒性。在所研究的任何PV浓度下均未观察到PV的显著毒性。贴片细胞毒性的体内评估还表明，与周围组织(图10B)相比，在施用后两天的贴片区域(图10A)中无显著炎症。另外，通过插入尖锐的MN在皮肤上形成的微通道损伤在施用后六小时内恢复(图10E)。这些结果显示，PV和含有PV的MN贴片具有良好的生物相容性。
在链脲佐菌素(STZ)诱导的1型糖尿病小鼠上施用MN阵列贴片，以评价贴片用于1型糖尿病治疗的体内性能。将小鼠随机分成四组，并用不同的MN贴片样品进行经皮处理：1)仅含有交联HA的空MN(MN[HA])；2)负载有胰岛素的MN(MN[I])；3)负载有仅包封胰岛素的PV的MN(MN[PV(I)])；或4)负载有包封GOx酶和胰岛素的PV的MN(MN[PV(E+I)])。每只小鼠的等效胰岛素剂量为10mg/kg。监测每组中经处理的小鼠的血液/血浆葡萄糖水平随时间推移的变化。
用MN[I]和MN[PV(E+I)]处理的小鼠的血糖在1小时内迅速降低至约90mg/dL(图11A)。然而，MN[I]组在随后的一小时内迅速失去对葡萄糖浓度的控制。相比之下，MN[PV(E+I)]组保持在正常血糖范围(<200mg/dL)内达～5小时，随后血糖水平逐渐升高。对照组和MN[PV(I)]组动物显示出葡萄糖的减少不显著，表明需要GOx来进行PV的充分去组装和胰岛素释放。通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)来定量经处理的小鼠的血浆中的胰岛素。用MN[PV(E+I)]处理的小鼠具有比施用MN[PV(I)]达至少24小时的小鼠更高的血浆胰岛素水平(图11B)，再次显示了GOx在PV解离和胰岛素释放中的作用。
在施用MN[PV(E+I)]或MN[I]贴片后一小时，通过在糖尿病小鼠中腹膜内(i.p.)注射1.5g/kg葡萄糖溶液来进行经贴片处理的小鼠的葡萄糖耐受性测试。另外在不进行MN贴片施用的情况下对健康(非糖尿病)小鼠注射葡萄糖溶液。在施用MN贴片后一小时，两组糖尿病小鼠(MN[PV(E+I)]和MN[I])具有与未经处理的健康小鼠相似的起始葡萄糖水平。在腹膜内注射葡萄糖之后，三组的血糖水平稳定增加，经MN[PV(E+I)]处理的糖尿病小鼠、经MN[I]处理的糖尿病小鼠和未经处理的健康小鼠分别在20分钟、30分钟和50分钟时达到峰值(268mg/dL、330mg/dL和470mg/dL)(图12A)。此后，葡萄糖水平逐渐下降。在约120分钟后，MN[PV(E+I)]小鼠恢复至正常血糖范围(<200mg/dL)，而MN[I]小鼠的葡萄糖水平保持在约400mg/dL。为了定量对腹膜内葡萄糖注射的葡萄糖响应，计算图12A中每组的0和150分钟之间的血糖水平曲线下面积。与经MN[I]处理的小鼠相比，经MN[PV(E+I)]处理的小鼠显示出对葡萄糖挑战的耐受性显著改善(图12B)。
用于糖尿病治疗的商业上可接受的纳米粒子应展示出对葡萄糖水平的充分控制，在需要时调节葡萄糖水平并且在不需要时加以抑制。鉴于MN[PV(E+I)]贴片显著降低血糖水平的能力，可以设想贴片还可以在低血糖条件下降低葡萄糖水平。因此，为了评价贴片的降血糖潜力，将MN[PV(E+I)]、MN[PV(I)]和MN[I]施用于健康小鼠。在用MN[I](含有未包封的胰岛素)处理的小鼠中观察到葡萄糖的显著减少，而在用MN[PV(E+I)]或MN[PV(I)]处理的小鼠中发生的变化非常小(图13A)。这些结果表明，与MN[I]相比，MN[PV(E+I)]和MN[PV(I)]发生的胰岛素泄漏可忽略不计，这降低了低血糖的风险。为了定量这些差异和评价低血糖的风险，计算并绘制低血糖指数(图13B)。参见Chou等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,2015,112:2401；Yu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,2015,112:8260。与负载有胰岛素的MN相比，负载有PV的MN展示出显著更低的低血糖指数。
本文提供了一种新型闭环、葡萄糖响应性胰岛素递送平台，该平台使用H2O2响应性聚合物纳米粒子。该纳米粒子可以与无痛经皮MN阵列贴片整合。利用聚合物纳米粒子，将水溶性胰岛素以高容量包封在内腔中。该制剂展示出体外和体内葡萄糖介导的去组装，以在高血糖条件下以快速响应性释放所包封的胰岛素。重要的是，当葡萄糖水平达到正常血糖状态时，胰岛素的释放速率下降，这避免了低血糖的风险。因此，所制备的胰岛素贴片提供了具有新型触发机制的临床闭环胰岛素递送，以模拟胰腺β细胞以葡萄糖响应性方式释放胰岛素的功能。此外，该H2O2响应性人工纳米粒子可用作用于递送各种治疗剂以治疗其他疾病的有用平台。参见Lu等人，Nat.Rev.Mater.,2016,1:16075。
材料和方法
化学品.除非另外说明，否则所有化学品均购自Sigma–Aldrich，并按原样使用。透明质酸钠(分子量为300kDa)购自中国山东福瑞达生物化工有限公司(FredaBiochem Co.,Ltd.(Shandong,China))。人重组胰岛素(27.5IU/mg Zn盐)购自Life Technology(U.S.A.)。聚(乙二醇)胺(PEG2000-NH2)购自Laysan Bio,Inc.(U.S.A.)。通过MilliporeNanoPure纯化系统获得去离子水(电阻率>18.2MΩ.cm)。用于合成和分析的所有有机溶剂均购自Fisher Scientific Inc.，并按原样使用。
丙烯酸酯改性的透明质酸(m-HA)的合成和表征。根据文献合成m-HA。参见Wang等人，Nano Letters,2016,16:2334。简而言之，在4℃下将2.0g透明质酸溶解于100mL去离子水中，向其中逐滴添加1.6mL甲基丙烯酸酐(MA)。通过添加5N NaOH将反应溶液调整至pH 8-9，并在4℃下搅拌24小时。通过在丙酮中沉淀来获得所得的聚合物。将产物重新溶解于去离子水中，将溶液对去离子水透析2天。通过冻干获得m-HA(收率：86％)。通过比较5.74ppm和6.17ppm处的质子峰(甲基丙烯酸酯质子)与1.99ppm处的峰(透明质酸的N-乙酰基葡糖胺)的峰下面积的比率，计算出改性程度为15％。m-HA:1H NMR(D2O,300MHz,δppm):1.85-1.96(m,3H,CH2＝C(CH3)CO),1.99(s,3H,NHCOCH3),5.74(s,1H,CH1H2＝C(CH3)CO),6.17(s,1H,CH1H2＝C(CH3)CO)。
硼酸酯功能化嵌段共聚物的合成。根据文献制备4-(咪唑基氨基甲酸酯)苯基硼酸频哪醇酯(1)。Broaders等人，J.Am.Chem.Soc.,2010,133:756。简而言之，将4-(羟甲基)苯基硼酸频哪醇酯(PAPE)(4g，17.1mmol)溶解于干燥的200mL烧瓶中的干燥二氯甲烷(CH2Cl2)(20mL)中。然后将羰基二咪唑(CDI)(5.54g，34.2mmol)添加到该溶液中并搅拌1小时。将该混合物真空浓缩，重新溶解于乙酸乙酯(200mL)中并用H2O洗涤(3×10mL)。用MgSO4干燥有机物，并使用旋转蒸发仪浓缩，得到纯白色固体1(3.90g，收率：70.0％)。1:1HNMR(400MHz,CDCl3)δ1.33(s,12H),5.42(s,2H),7.05(s,1H),7.43(m,3H),7.85(d,2H),8.14(s,1H)。
首先根据文献合成mPEG44-b-聚丝氨酸60(1.0g，7.5mmol OH)。参见Tai等人，Biomacromolecules,2014,15:3495。然后将聚合物溶解于50mL烧瓶中的无水CH2Cl2(20mL)中。添加4-(咪唑基氨基甲酸酯)苯基硼酸频哪醇酯(2.5g，7.5mmol)，然后添加DMAP(0.9g，7.5mmol)，并将该混合物溶液在室温下搅拌过夜。通过在冷乙醚中沉淀和真空干燥来获得产物mPEG-b-P(Ser-PBE)。
通过该方法，4-(羟甲基)苯基硼酸频哪醇酯被CDI活化成活性形式4-(咪唑基氨基甲酸酯)苯基硼酸频哪醇酯。在与丝氨酸缀合之后，聚合物变为4-(羟甲基)苯基硼酸频哪醇酯(PBE)缀合的聚合物。
聚合物纳米粒子的制备。通过溶剂蒸发法来制备聚合物纳米粒子(PV)。简而言之，将40mg mPEG-b-P(Ser-PBE)溶解于5mL THF中，然后向其中注入溶解有或未溶解有7.5mg人胰岛素和0.75mg GOx的10mL去离子水。将混合物在室温下搅拌30分钟，然后通过用N2鼓泡来除去THF。通过用离心过滤器(25,000Da分子量截留，Millipore)以4000×g离心10分钟来除去未负载的胰岛素，并用PBS缓冲液洗涤几次。将获得的PV悬浮液储存在4℃下以进行进一步研究。使用Coomassie Plus蛋白质测定法来测试胰岛素的负载含量和负载率。在Infinite 200PRO多模式读板器(Tecan Group Ltd.,Switzerland)上检测595nm处的吸光度，并从胰岛素标准曲线进行浓度内插。使用Zeta分级器(Nano ZS；Malvern)来测量PV的粒度分布和ζ电位。使用JEOL 2000FX TEM来获得TEM图。
机械强度测试。通过在MTS 30G拉伸试验机上将MN阵列压靠于不锈钢板上来测试MN的机械强度。MN尖端与不锈钢板之间的初始计量设定为2.00mm，负载传感器量程为10.00N。顶部不锈钢板向MN阵列贴片移动的速度为0.1mm/s。当针开始弯曲时，记录MN的破坏力。
体外胰岛素释放研究。将8mg聚合物纳米粒子添加到具有不同葡萄糖浓度(0、100mg/dL或400mg/dL)的PBS(1mL)中，并在回旋振荡器上在37℃下温育以评价胰岛素的释放。在预定时间点处，采集50μL样品进行分析，然后将50μL新鲜培养基添加到孔中以保持恒定体积并放回培养箱中。通过595nm处的吸光度测量并借助胰岛素标准曲线来测定所采集样品中的胰岛素含量。为了获得PV对葡萄糖水平变化的响应性，首先在100mg/dL的葡萄糖溶液中温育PV10分钟，然后通过离心过滤器(100,000Da分子量截留，Millipore)来分离PV，然后在400mg/dL的葡萄糖中再温育PV 10分钟。重复该循环几次并测量所释放的胰岛素。
通过向具有不同H2O2浓度(0、50μm、200μm)的PBS(1mL)中添加8mg聚合物纳米粒子来测试纳米粒子的H2O2响应性能力，并在回旋振荡器上在37℃下温育以评价胰岛素的释放。按照上述方法来测试所释放的胰岛素。
生物相容性分析。使用针对HeLa细胞的MTT测定法来测试PV的体外细胞毒性。简而言之，将HeLa细胞以6000个细胞/孔的密度接种到96孔板中。在含有10％胎牛生长血清(FBS)的200μL杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium,DMEM)中温育24小时后，将0.1mg/mL至1mg/mL范围内的PV系列稀释液添加到孔中。在温育24小时后，将噻唑蓝溶液(5mg/mL)添加到孔中并与细胞一起再温育4小时。在除去培养基后，将紫色甲晶体溶解于150μL DMSO中。在多模式读板器上测量570nm处板的吸光度，该吸光度与活细胞数成正比。
使用组织学分析来评价MN贴片的体内生物相容性。简而言之，将空白透明质酸MN(不含PV、E或I的由透明质酸形成的MN)、MN[PV(E+I)]和MN[I]经皮刺入小鼠的背部达10小时。在24小时后，通过CO2窒息使小鼠安乐死，并切除周围组织。将组织固定在10％福尔马林中，然后包埋在石蜡中，切成5μm切片，并用苏木精和伊红(H&E)染色以及荧光TUNEL染色进行组织学分析。
使用STZ诱导的糖尿病小鼠的体内研究。在STZ诱导的成体糖尿病小鼠(雄性C57B6，20-25g，Jackson Lab)上评估所制备的MN阵列贴片的体内性能，以便进行糖尿病控制。动物研究方案经北卡罗来纳州立大学和北卡罗来纳大学教堂山分校的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee at North CarolinaState University and University of North Carolina at Chapel Hill)批准。将小鼠随机分成四组，每组五只小鼠，并分别用仅含m-HA的空MN、负载有胰岛素的MN MN[I]、负载有包封胰岛素和酶的PV的MN MN[PV(E+I)]或负载有仅包封胰岛素的PV的MN MN[PV(I)]进行经皮处理。每只小鼠的胰岛素剂量为10mg/kg。通过从尾静脉采集血样(～3μL)来监测每组中小鼠随时间推移(10分钟、20分钟、40分钟和60分钟，之后每小时一次)的血浆葡萄糖水平，并使用Clarity GL2Plus血糖仪(Clarity Diagnostics,Boca Raton,Florida)来测定血浆葡萄糖水平，直至恢复稳定的高血糖。为了测量体内血浆胰岛素浓度，从尾静脉采集血样(25μL)。根据制造商的方案(Calbiotech,U.S.A.)，使用人胰岛素ELISA试剂盒分离血清并储存于-20℃下以便进行血浆胰岛素测定。进行腹膜内葡萄糖耐受性测试(IPGTT)以验证MN施用后1小时MN的体内葡萄糖响应性。简而言之，给小鼠施用MN[PV(E+I)]和MN[I](每只小鼠的胰岛素剂量为10mg/kg)，然后给每只小鼠腹膜内注射溶于PBS缓冲液的葡萄糖溶液(葡萄糖剂量为1.5g/kg)，并且监测随时间推移的血糖水平。通过施用MN[PV(E+I)]、MN[PV(I)]和MN[I]来评估MN对健康小鼠的副作用。
统计学.所提供的所有数据均为平均值±标准偏差。使用Student’s t检验进行统计学分析。在P值<0.05时，实验组与对照组之间的差异被认为具有统计学显著性。
本文引用的出版物据此全文以引用方式明确并入，并且至少用于引用其的材料。
应当理解，虽然已经关于本公开的某些例示性和特定方面详细提供了本公开，但是不应将其视为仅限于此，因为在不脱离如所附权利要求中所定义的本公开的广泛精神和范围的情况下可以进行多个修改。因此，所附权利要求旨在覆盖落入本发明的真实精神和范围内的所有此类等同变化形式。

Claims (11)

1.一种纳米粒子，其包含：
共聚物，所述共聚物包含聚乙二醇聚合物、多羟基化聚合物和过氧化物敏感性侧基；所述过氧化物敏感性侧基包括硼酸酯；
葡萄糖响应剂；以及
治疗剂；
其中所述共聚物包封所述葡萄糖响应剂和所述治疗剂，所述葡萄糖响应剂代谢葡萄糖以产生过氧化物，所述过氧化物敏感性侧基在暴露于过氧化物后从所述共聚物分离，所述过氧化物敏感性侧基的分离促进了所述纳米粒子的去组装，从而从所述纳米粒子释放所述治疗剂。
2.如权利要求1所述的纳米粒子，其中所述多羟基化聚合物包括聚氨基酸。
3.如权利要求2所述的纳米粒子，其中所述多羟基化聚合物包括聚丝氨酸。
4.如权利要求1-3中任一项所述的纳米粒子，其中所述过氧化物敏感性侧基通过碳酸根键附接到所述共聚物。
5.如权利要求1-3中任一项所述的纳米粒子，其中所述葡萄糖响应剂包括葡萄糖氧化酶。
6.如权利要求1-3中任一项所述的纳米粒子，其中所述治疗剂包括胰岛素。
7.如权利要求1-3中任一项所述的纳米粒子，其中所述纳米粒子在高血糖水平的葡萄糖的存在下释放所述治疗剂。
8.一种药物，其包含如权利要求1-7中任一项所述的纳米粒子以及药学上可接受的赋形剂。
9.一种装置，其包括：
多个微针，所述多个微针各自具有基端和尖端；
基板，所述微针的基端附接到所述基板；以及
多个如权利要求1-7中任一项所述的纳米粒子。
10.一种权利要求1-7中任一项所述的纳米粒子在制备用于治疗葡萄糖高血糖水平患者的药物中的应用。
11.如权利要求10所述的应用，其中所述患者具有高血糖。
CN201780082606.6A 2016-12-05 2017-12-05 H2o2响应性纳米粒子及其用途 Active CN110198730B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662430273P 2016-12-05 2016-12-05
US62/430,273 2016-12-05
PCT/US2017/064725 WO2018106697A1 (en) 2016-12-05 2017-12-05 H 2o 2-responsive nanoparticles and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110198730A CN110198730A (zh) 2019-09-03
CN110198730B true CN110198730B (zh) 2023-10-03

Family

ID=62492127

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780082606.6A Active CN110198730B (zh) 2016-12-05 2017-12-05 H2o2响应性纳米粒子及其用途

Country Status (3)

Country Link
US (1) US11331277B2 (zh)
CN (1) CN110198730B (zh)
WO (1) WO2018106697A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018106696A1 (en) * 2016-12-05 2018-06-14 North Carolina State University Core-shell microneedle devices and uses thereof
CN112842333A (zh) * 2020-12-31 2021-05-28 华中科技大学 一种可视化葡萄糖浓度检测微针贴片、制备方法及应用
CN113599506B (zh) * 2021-05-31 2023-07-21 长沙理工大学 一种铂纳米酶/葡萄糖氧化酶@透明质酸复合抗菌材料及其制备和应用
CN114504727B (zh) * 2022-04-02 2022-08-23 广州纳丽生物科技有限公司 一种聚多巴胺光热转换效应微针及其制备方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101227940A (zh) * 2005-07-25 2008-07-23 纳米技术维多利亚有限公司 微阵列装置
CN113350489A (zh) * 2015-04-21 2021-09-07 北卡罗来纳州立大学 使用缺氧敏感性纳米复合材料的葡萄糖响应性胰岛素递送系统

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A Glucose-Responsive Complex Polymeric Micelle Enabling Ｒepeated On-Off Ｒelease and Insulin Protection;Liu G，等;《Soft Matter》;20131231;第9卷(第5期);第1636-1644页 *
Bio-inspired synthetic nanovesicles for glucose responsive release of insulin;Wanyi Tai等;《Biomacromolecules》;20141231;第15卷;第3495-3502页 *
Phenylboronic aicd-based complex micelles with enhanced glucose-responsiveness at physiological pH by complexation with glycopolymer;R.Ma等;《Biomacromolecules》;20121231;第13卷;第3409-3417页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110198730A (zh) 2019-09-03
US20190298659A1 (en) 2019-10-03
US11331277B2 (en) 2022-05-17
WO2018106697A1 (en) 2018-06-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110198730B (zh) H2o2响应性纳米粒子及其用途
Li et al. Glucose and H 2 O 2 dual-sensitive nanogels for enhanced glucose-responsive insulin delivery
US20230364402A1 (en) Core-shell microneedle devices and uses thereof
US11351230B2 (en) Patch loaded with dual-sensitive vesicles for enhanced glucose-responsive insulin delivery
Yang et al. Glucose-responsive insulin release: analysis of mechanisms, formulations, and evaluation criteria
AU2016252738A1 (en) Glucose-responsive insulin delivery system using hypoxia-sensitive nanocomposites
Hsu et al. On-skin glucose-biosensing and on-demand insulin-zinc hexamers delivery using microneedles for syringe-free diabetes management
Wang et al. Recent advances of nanomedicine-based strategies in diabetes and complications management: Diagnostics, monitoring, and therapeutics
US20230381096A1 (en) Core-shell microneedle patch for h2o2 and ph cascade-triggered insulin delivery
EP3416621A1 (en) Methods and compositions related to physiologically responsive microneedle delivery systems
Wang et al. Glycopolypeptide nanocarriers based on dynamic covalent bonds for glucose dual-responsiveness and self-regulated release of insulin in diabetic rats
Zong et al. Glucose-responsive insulin microneedle patch based on phenylboronic acid for 1 diabetes treatment
WO2020041787A1 (en) Microneedle-array patches with glucose-responsive matrix for closed-loop insulin delivery
Wang et al. Dual responsive block copolymer coated hollow mesoporous silica nanoparticles for glucose-mediated transcutaneous drug delivery
CN116867509A (zh) 用于葡萄糖响应性胰岛素递送的可注射可生物降解的聚合物复合物
Gu et al. H 2 O 2-responsive nanoparticles and uses thereof
Ma et al. PVA-based bulk microneedles capable of high insulin loading and pH-triggered degradation for multi-responsive and sustained hypoglycemic therapy
CN115317437B (zh) 一种基于胆红素纳米材料的胰岛素递送微针及其制备方法
Su et al. A review of glucose-responsive particles for insulin delivery as a method of treating type 1 diabetes
CN114569706B (zh) 双重响应双层交联的胰岛素可控输送微针及其制备方法
CN113197838B (zh) 一种无酶糖敏微针贴及其温和制备方法
Sánchez-Trasviña et al. Transdermal microneedle patches as a promising drug delivery system for anti-obesogenic molecules
CN115998669A (zh) 一种硫化铜纳米酶-抗菌肽-透明质酸复合微针及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant