JP6829075B2 - ブロック面イメージング用の小型連続セクショニングミクロトーム - Google Patents
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Description
本出願は、2014年5月12日に出願された米国仮出願第61/991,929号の恩典を主張するものであり、これを参照により本明細書に組み入れる。
本開示は、ミクロトームデバイスおよびその使用方法に関し、特に、光学または電子ベースのイメージングを含むブロック面イメージングの用途で使用するために設計されたミクロトームデバイスに関する。
ブロック面イメージング技術の1つの用途は、連続ブロック面走査電子顕微鏡法(SBEM、SBSEMおよび/またはSBFSEMと呼ばれることもある)であり、これは、第3次元に沿って連続する平面でサンプルの複数の2次元画像を作成し、それによって該サンプルの3次元構造に関するデータを生み出すプロセスを指す。SBSEM技術は、多くの異なるタイプの生物試料を研究するために使用することができ、多くの場合は脳組織の研究に使用されている。それは、例えば脳および神経回路の接続性における軸索をマッピングする場合に、高解像度の解剖学的データを収集するために特に有用である。1つのSBSEMプロセスは、二次電子および後方散乱電子を収集することによって2次元画像を得るための走査電子顕微鏡(SEM)と、連続する画像間でサンプルの最上部のごく薄い(例えば、数十ナノメートルの範囲の)部分を除去するためのミクロトーム(「超ミクロトーム」と呼ばれることもある)の使用を含む。ミクロトームを走査電子顕微鏡の真空チャンバに取り付けることによって、このプロセスはより効率的に行うことができる。以前のミクロトームは、本明細書でさらに説明するように、さまざまな欠点を有している。したがって、ミクロトーム技術の改良が必要とされている。
いくつかの実施形態において、サンプルの最上部の薄い部分を除去するためのミクロトームは、ベースプレート;ペデスタルが撮像位置から切断位置に移動することができるようにベースプレートに連結されたペデスタル、ここで、該ペデスタルはサンプルを取り付けることができる露出面を有する;ブレードとベースプレートとの間の距離を選択的に変化させるために、ペデスタルが撮像位置にあるときペデスタルの露出面に垂直な方向にブレードを移動させることによって、ベースプレートに対するブレードの位置を調整することができるように、ベースプレートに連結されたブレード;を含んでなり、この場合、切断位置は撮像位置よりもブレードの近くにある。
サンプルの最上部の薄い部分を除去するためのミクロトームであって、
ベースプレート;
撮像位置から切断位置に移動することができるようにベースプレートに連結され、かつサンプルを取り付けることができる露出面を有する、ペデスタル;
ブレードとベースプレートとの間の距離を選択的に変化させるために、ペデスタルが撮像位置にあるときにペデスタルの露出面に垂直な方向にブレードを移動させることによって、ベースプレートに対するブレードの位置を調整することができるようにベースプレートに連結されたブレード;
を含んでなり、切断位置が撮像位置よりもブレードの近くにある、ミクロトーム。
[本発明1002]
カメラを用いてサンプルの表面を画像化するように構成された蛍光顕微鏡に取り付けられている、本発明1001のミクロトーム。
[本発明1003]
カメラを用いてサンプルの表面を画像化するように構成されたカソードルミネッセンス顕微鏡に取り付けられている、本発明1001のミクロトーム。
[本発明1004]
カメラを用いてサンプルの表面を画像化するように構成された光電子顕微鏡に取り付けられている、本発明1001のミクロトーム。
[本発明1005]
前記ブレードが、ベースプレートに連結された第1のコンピュータ制御リニアアクチュエータに取り付けられている、本発明1001〜1004のいずれかのミクロトーム。
[本発明1006]
前記ペデスタルが、ピボットベアリングによってベースプレートに連結されたレバーに取り付けられている、本発明1005のミクロトーム。
[本発明1007]
前記ペデスタルが、ベースプレートに連結された第2のコンピュータ制御リニアアクチュエータの作動によって、ピボットベアリングの周りを回転することができる、本発明1006のミクロトーム。
[本発明1008]
前記第1のアクチュエータが、ブレードの移動を指示する制御信号を受信するように構成されており、前記ミクロトームが、
第1のアクチュエータに連結され、かつベースプレートに対するブレードの位置を示す出力信号を生成するように構成されたセンサ;および
センサからの出力信号を受信し、センサからの出力信号に少なくとも部分的に基づいて制御信号を生成して、その制御信号を第1のアクチュエータに送信するように構成されたコンピュータプログラム;
をさらに含んでなる、本発明1007のミクロトーム。
[本発明1009]
ペデスタル上に配置されたサンプルをさらに含む、本発明1001〜1008のいずれかのミクロトーム。
[本発明1010]
サンプルと走査電子顕微鏡の磁極片との間の作動距離が、利用可能な作動距離の範囲から選択され得る、本発明1009のミクロトーム。
[本発明1011]
電圧がサンプルに印加される、本発明1009または1010のミクロトーム。
[本発明1012]
サンプルがミクロトームから電気的に絶縁されている、本発明1011のミクロトーム。
[本発明1013]
前記ブレードが圧電制御振動ダイヤモンドブレードである、本発明1001〜1012のいずれかのミクロトーム。
[本発明1014]
プロセッサおよびメモリを含むコンピューティング装置をさらに含んでなり、該メモリが、サンプルの複数の画像を組み合わせて該サンプルの3次元描写を作成するためのコンピュータ読み取り可能命令を格納している、本発明1001〜1013のいずれかのミクロトーム。
[本発明1015]
ベースプレートに対してブレードの位置を変えることなく容量センサをリセットするように構成されたリニアピエゾステージをさらに含む、本発明1001〜1014のいずれかのミクロトーム。
[本発明1016]
ペデスタルに連結され、かつファラデーカップを保持するように構成されたポリマーマウントをさらに含む、本発明1001〜1015のいずれかのミクロトーム。
[本発明1017]
ペデスタルとベースプレートに連結され、かつサンプルがペデスタルに取り付けられている間ベースプレートに対してペデスタルを静止状態に保持するように構成されたクランプをさらに含む、本発明1001〜1016のいずれかのミクロトーム。
[本発明1018]
アクチュエータに連結されたブレードであって、ここで、アクチュエータは、走査電子顕微鏡のビーム軸に平行な方向にステージに対してブレードを移動させることができるように走査電子顕微鏡のステージに連結され、かつアクチュエータは、ブレードの移動を指示する制御信号を受信するように構成されている、ブレード;
アクチュエータに連結され、かつベースプレートに対するブレードの位置を示す出力信号を生成するように構成されたセンサ;および
センサからの出力信号を受信し、センサからの出力信号に少なくとも部分的に基づいて制御信号を生成して、その制御信号をアクチュエータに送信するように構成されたコンピュータプログラム;
を含んでなる、走査電子顕微鏡内に設置されるように構成されたミクロトーム。
[本発明1019]
ビーム軸上の撮像位置からビーム軸を外れた切断位置まで移動することができるようにステージに連結されたペデスタルをさらに含み、該切断位置が撮像位置よりもブレードの近くにある、本発明1018のミクロトーム。
[本発明1020]
以下の工程:
走査電子顕微鏡内のミクロトーム上の撮像位置にサンプルを配置する工程であって、ここで、撮像位置は走査電子顕微鏡のビーム軸上にある、工程;
サンプルの第1の露出表面を画像化する工程;
ミクロトームのブレードの高さを設定する工程;
サンプルを撮像位置から切断位置に移動させる工程であって、ここで、切断位置は撮像位置よりもブレードの近くにあり、かつビーム軸上にはない、工程;
ブレードを横切ってサンプルを移動させてサンプルの一部を除去し、サンプルの第2の露出表面を出現させる工程;
サンプルを撮像位置に移動させる工程;および
サンプルの第2の露出表面を画像化する工程;
を含んでなる方法。
[本発明1021]
ブレードの高さを設定した後、フィードバック制御下でブレードの高さを維持する工程をさらに含む、本発明1020の方法。
[本発明1022]
第2の露出表面を画像化する前に、走査電子顕微鏡の電子ビームを第2の露出表面で集束させる工程をさらに含む、本発明1020または1021の方法。
[本発明1023]
第2の露出表面を画像化する前に、ビーム軸に沿ってサンプルを調整する工程をさらに含む、本発明1020〜1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
ビーム軸に沿ってサンプルを調整した後、走査電子顕微鏡の電子ビームを第2の露出表面で集束させる工程をさらに含む、本発明1023の方法。
[本発明1025]
サンプルの第1の露出表面を画像化する動作が、
走査電子顕微鏡を使用して、第1の露出表面の複数の構成画像を取り込むこと;および
複数の構成画像を互いにつなぎ合わせて、第1の露出表面の合成画像を形成すること;
を含む、本発明1020〜1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
ビーム軸がサンプルの露出表面に垂直でないようにミクロトームを傾斜させる工程をさらに含む、本発明1020〜1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
ミクロトームを回転させる工程をさらに含む、本発明1020〜1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
スタイロフォームクリーニングロッドでブレードをクリーニングする工程をさらに含む、本発明1020〜1027のいずれかの方法。
[本発明1029]
前記ミクロトームが、走査電子顕微鏡のビルトインステージに取り付けられている中間ステージに取り付けられている、本発明1020〜1028のいずれかの方法。
[本発明1030]
サンプルに対してナイフの位置を変えることなく容量センサをリセットする工程をさらに含む、本発明1020〜1029のいずれかの方法。
[本発明1031]
ペデスタルに連結されたポリマーマウントにファラデーカップを取り付ける工程をさらに含む、本発明1020〜1030のいずれかの方法。
[本発明1032]
サンプルがペデスタルに取り付けられている間ベースプレートに対してペデスタルを静止状態に保持するために、ペデスタルとベースプレートの間にクランプを固定する工程をさらに含む、本発明1020〜1031のいずれかの方法。
開示された技術の上記のおよび他の特徴ならびに利点は、添付図面を参照して進められる、いくつかの実施形態の以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。
本明細書に記載のミクロトームは、走査電子顕微鏡法、光ベース(光学、例えば蛍光)顕微鏡法、カソードルミネッセンス顕微鏡法などにおいて、またはこれらの技術を組み合わせて、顕微鏡分析のためのさまざまな技術に使用することができる。例えば、サンプルは、通常の光ベース(光学)(例えば、蛍光)顕微鏡の対物レンズの下に直接取り付けることができる、以下に記載するようなミクロトーム上に載置され得る。このような実施形態は、大気条件で、かつ走査電子顕微鏡の不在下で操作することができる。こうした技術は、当技術分野で知られている種々の蛍光顕微鏡技術(例えば、多光子顕微鏡法、超解像顕微鏡法など)をうまく利用することができる。
Claims (25)
- サンプルの最上部の薄い部分を除去するための、走査電子顕微鏡内に設置されるように構成されたミクロトームであって、
ベースプレート;
撮像位置から切断位置に移動することができるようにベースプレートに連結され、かつサンプルを取り付けることができる露出面を有する、ペデスタル;
ブレードとベースプレートとの間の距離を選択的に変化させるために、ペデスタルが撮像位置にあるときにペデスタルの露出面に垂直な方向にブレードを移動させることによって、ベースプレートに対するブレードの位置を調整することができるようにベースプレートに連結されたブレード;
を含んでなり、
切断位置が撮像位置よりもブレードの近くにあり、
ペデスタルが、ピボットベアリングによってベースプレートに連結されたレバーに取り付けられており、ベースプレートに連結された第2のコンピュータ制御リニアアクチュエータの作動によって、ピボットベアリングの周りを回転することができ、
該ミクロトームにおいては、ブレードがサンプルの最上部を横切って移動するためのスペースがサンプルと走査電子顕微鏡の検出器との間にないように、走査電子顕微鏡のビーム軸上の該撮像位置にあるサンプルは、走査電子顕微鏡の検出器および走査電子顕微鏡の磁極片の直下に配置され得る、
ミクロトーム。 - 前記ブレードが、ベースプレートに連結された第1のコンピュータ制御リニアアクチュエータに取り付けられている、請求項1記載のミクロトーム。
- 前記第1のアクチュエータが、ブレードの移動を指示する制御信号を受信するように構成されており、前記ミクロトームが、
第1のアクチュエータに連結され、かつベースプレートに対するブレードの位置を示す出力信号を生成するように構成された容量センサ;
容量センサからの出力信号を受信し、容量センサからの出力信号に少なくとも部分的に基づいて制御信号を生成して、その制御信号を第1のアクチュエータに送信するように構成されたコンピュータプログラム;および
ベースプレートに対してブレードの位置を変えることなく容量センサをリセットするように構成されたリニアピエゾステージ;
をさらに含んでなる、請求項2記載のミクロトーム。 - ペデスタル上に配置されたサンプルをさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項記載のミクロトーム。
- サンプルと走査電子顕微鏡の磁極片との間の前記作動距離が、利用可能な作動距離の範囲から選択され得る、請求項4記載のミクロトーム。
- 電圧がサンプルに印加される、請求項4または5記載のミクロトーム。
- サンプルがミクロトームから電気的に絶縁されている、請求項6記載のミクロトーム。
- 前記ブレードが圧電制御振動ダイヤモンドブレードである、請求項1〜7のいずれか一項記載のミクロトーム。
- プロセッサおよびメモリを含むコンピューティング装置をさらに含んでなり、該メモリが、サンプルの複数の画像を組み合わせて該サンプルの3次元描写を作成するためのコンピュータ読み取り可能命令を格納している、請求項1〜8のいずれか一項記載のミクロトーム。
- ペデスタルに連結され、かつファラデーカップを保持するように構成されたポリマーマウントをさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項記載のミクロトーム。
- ペデスタルとベースプレートに連結され、かつサンプルがペデスタルに取り付けられている間ベースプレートに対してペデスタルを静止状態に保持するように構成されたクランプをさらに含む、請求項1〜10のいずれか一項記載のミクロトーム。
- 走査電子顕微鏡内に設置されるように構成されたミクロトームであって、
ピボットベアリング周りのペデスタルの回転により走査電子顕微鏡のビーム軸上の撮像位置からビーム軸を外れた切断位置までペデスタルが移動することができるように、ピボットベアリングによってミクロトームのベースプレートに連結されたレバーに取り付けられている、走査電子顕微鏡のサンプルを保持するためのペデスタル;
アクチュエータに連結されたブレードであって、ここで、アクチュエータは、ビーム軸に平行な方向にベースプレートに対してブレードを移動させることができるようにベースプレートに連結され、かつアクチュエータは、ブレードの移動を指示する制御信号を受信するように構成されている、ブレード;
アクチュエータに連結され、かつベースプレートに対するブレードの位置を示す出力信号を生成するように構成されたセンサ;および
センサからの出力信号を受信し、センサからの出力信号に少なくとも部分的に基づいて制御信号を生成して、その制御信号をアクチュエータに送信するように構成されたコンピュータプログラム;
を含んでなり、
該ミクロトームにおいては、ブレードがサンプルの最上部を横切って移動するためのスペースがサンプルと走査電子顕微鏡の検出器との間にないように、走査電子顕微鏡のビーム軸上の該撮像位置にあるサンプルは、走査電子顕微鏡の検出器および走査電子顕微鏡の磁極片の直下に配置され得る、
ミクロトーム。 - 走査電子顕微鏡内に設置されたミクロトームにおいて実行されるように構成された方法であって、該ミクロトームが、ピボットベアリングによってミクロトームのベースプレートに連結されたレバーに取り付けられている、サンプルを保持するためのペデスタルと;ベースプレートに対するナイフブレードの位置を調整することができるようにベースプレートに連結されたナイフブレードと;を含んでなり、該ナイフブレードがサンプルの最上部を横切って移動するためのスペースが、サンプルと走査電子顕微鏡の検出器との間にないように、走査電子顕微鏡のビーム軸上の撮像位置にあるサンプルは、走査電子顕微鏡の検出器および走査電子顕微鏡の磁極片の直下に配置され、該方法が、以下の工程:
該ミクロトーム上の撮像位置にサンプルを配置する工程であって、ここで、撮像位置はビーム軸上にある、工程;
サンプルの第1の露出表面を画像化する工程;
ナイフブレードの高さを設定する工程;
サンプルを撮像位置から切断位置に移動させる工程であって、ここで、切断位置はビーム軸上にはない、工程;
ナイフブレードを横切ってサンプルを移動させてサンプルの一部を除去し、サンプルの第2の露出表面を出現させる工程;
サンプルを撮像位置に移動させる工程;および
サンプルの第2の露出表面を画像化する工程;
を含んでなり、サンプルはピボットベアリング周りのペデスタルの回転により移動する、方法。 - ナイフブレードの高さを設定した後、容量センサから出力される出力信号に少なくとも部分的に基づきフィードバック制御下でナイフブレードの高さを維持する工程をさらに含む、請求項13記載の方法。
- 第2の露出表面を画像化する前に、走査電子顕微鏡の電子ビームを第2の露出表面で集束させる工程をさらに含む、請求項13または14記載の方法。
- 第2の露出表面を画像化する前に、ビーム軸に沿ってサンプルを調整する工程をさらに含む、請求項13〜15のいずれか一項記載の方法。
- ビーム軸に沿ってサンプルを調整した後、走査電子顕微鏡の電子ビームを第2の露出表面で集束させる工程をさらに含む、請求項16記載の方法。
- サンプルの第1の露出表面を画像化する動作が、
走査電子顕微鏡を使用して、第1の露出表面の複数の構成画像を取り込むこと;および
複数の構成画像を互いにつなぎ合わせて、第1の露出表面の合成画像を形成すること;
を含む、請求項13〜17のいずれか一項記載の方法。 - ビーム軸がサンプルの露出表面に垂直でないようにミクロトームを傾斜させる工程をさらに含む、請求項13〜18のいずれか一項記載の方法。
- ミクロトームを回転させる工程をさらに含む、請求項13〜19のいずれか一項記載の方法。
- スタイロフォームクリーニングロッドでナイフブレードをクリーニングする工程をさらに含む、請求項13〜20のいずれか一項記載の方法。
- 前記ミクロトームが、走査電子顕微鏡のビルトインステージに取り付けられている中間ステージに取り付けられている、請求項13〜21のいずれか一項記載の方法。
- サンプルに対してナイフブレードの位置を変えることなく容量センサをリセットする工程をさらに含む、請求項14〜22のいずれか一項記載の方法。
- ペデスタルに連結されたポリマーマウントにファラデーカップを取り付ける工程をさらに含む、請求項13〜23のいずれか一項記載の方法。
- サンプルがペデスタルに取り付けられている間ベースプレートに対してペデスタルを静止状態に保持するために、ペデスタルとベースプレートの間にクランプを固定する工程をさらに含む、請求項13〜24のいずれか一項記載の方法。
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