CN107505339B - 一种连续超薄切片的制备和自动收集方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种连续超薄切片的制备和自动收集方法，包括以下步骤：通过切片机进行连续超薄切片的制备；根据切片机的切片速度，对超薄切片收集器的收集速度进行调整；通过超薄切片收集器对切片机制备的连续超薄切片进行自动收集；在对超薄切片收集器的收集速度进行调整过程中，通过对超薄切片收集器上的收集带、以及在收集带上的超薄切片进行实时图像采集，来对超薄切片和所述收集带上孔洞的位置进行分析，进而手动或自动调整所述切片机的切片速度，以及在收集全过程实时自动调节所述超薄切片收集器的收集速度。本方法能够大大拓展连续超薄切片收集和图像采集方法的适用性和多样性，非常适合于在电子显微成像或光学显微成像实验室进行推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及实验装置领域，特别涉及一种连续超薄切片的制备和自动收集方法。
背景技术
传统的连续超薄切片电子显微成像技术必须依赖熟练的专业技术员以手动方法通过单孔铜网来收集成百上千张的连续切片。由于在收集过程中易出现丢片、切片次序错乱、因切片停顿造成信息丢失等问题，加之收集速度慢和实验周期长的缺点，故限制了连续切片在较大尺度生物样品三维重构中的应用。近些年，国际上对该项技术的改进已有了重大突破。
其中，由哈佛大学Jeff Lichtman等人研发的自动化带式收集切片的超薄切片机(Automatic Tape-Collecting Ultramicrotome,ATUM)的基本原理是用普通钻石刀对树脂包埋的样品进行连续切片后，用连续转动的带子进行收集，然后将收集好的切片带粘贴到硅片上，转移至扫描电镜中通过背散射电子成像，获取系列图像。这种连续切片自动收集的方法可实现大面积(毫米级)生物样品切割，样品便于长期保存、反复成像，从而使珍贵的样品可以像图书馆里的图书一样反复“查阅”。科研人员可对感兴趣的区域进行分次成像研究，可实现多台设备的并行成像，从而提高图像采集效率和灵活度，大大缩短实验周期。
但是该方法收集的连续切片只能用于扫描电镜获取二维的图像，而扫描电镜较之透射电镜成像速度较慢，分辨率较低。因此，不能满足在透射电镜上获取高分辨率图像的需求，采集大尺度的图像实验周期也较长。
发明内容
针对上述现有技术存在的不足之处，本发明提供了一种连续超薄切片的制备和自动收集方法。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一种连续超薄切片的制备和自动收集方法，包括以下步骤：
通过切片机进行连续超薄切片的制备；
根据所述切片机的切片速度，对超薄切片收集器的收集速度进行调整；
通过所述超薄切片收集器对所述切片机制备的所述连续超薄切片进行自动收集；
在对所述连续超薄切片收集器的收集速度进行调整过程中，通过对所述超薄切片收集器上的收集带、以及在所述收集带上的所述超薄切片进行实时图像采集，来对所述超薄切片和所述收集带上孔洞的位置进行分析，进而手动或自动调整所述切片机的切片速度，以及在收集全过程实时自动调节所述超薄切片收集器的收集速度，使每张所述超薄切片均能覆盖在所述收集带的孔洞中心上。
进一步的，在所述超薄切片收集器对所述切片机制备的连续所述连续超薄切片进行自动收集前，通过对所述超薄切片收集器进行位置调整，使所述超薄切片收集器上的带有所述收集带的切片导引机构伸入到所述切片机的切片刀水槽内，进而使在所述切片刀水槽内的所述超薄切片通过所述切片导引机构运送到所述收集带上。
进一步的，调节所述切片导引机构在所述切片刀水槽中的位置调整，使在所述切片刀水槽内的所有所述超薄切片与所述收集带上的孔洞在同一直线上。
进一步的，在实时自动调节所述超薄切片收集器的收集速度前，通过手动或自动对所述收集带的收集速度与所述切片机的切片速度进行配合的预调整，使所述超薄切片能够一片一片的依次被收集到所述收集带上；其中，通过微调所述收集带的收集速度，使所述收集带上每两个所述超薄切片的间隔与所述收集带上孔洞的间隔保持一致。
进一步的，在所述超薄切片收集器对所述连续超薄切片进行自动收集时，通过打开设置在所述超薄切片收集器上的静电消除器的电源，来消除所述超薄切片在切片过程中产生的静电荷。
进一步的，在所述超薄切片收集器对所述连续超薄切片进行自动收集时，通过设定间歇式自动补水器的单次补水量和补水间隔时间，使所述切片刀水槽内可进行自动补水。
进一步的，还包括通过所述超薄切片收集器对薄片进行收集；
所述超薄切片收集器包括：
切片收集装置，包括一侧与四维调节台相连接的壳体，以及设置在所述壳体另一侧的收集带轮系和轮系驱动机构；以及
切片导引机构，其后端靠近所述切片收集装置的收集带轮系并固定在所述壳体上，前端远离所述收集带轮系且前端的水平高度低于后端的水平高度，所述切片导引机构随所述四维调节台进行位置调整后，其前端伸入所述切片机的切片刀水槽内；
收集带，其设置在所述切片收集装置的收集带轮系上，所述收集带上设置有等间距的孔洞；
图像采集装置，其设置在所述切片导引机构前端的上方，所述图像采集装置用于采集所述收集带、以及在所述收集带上的所述超薄切片的实时图像；所述图像采集装置上设置有位置分析模块，所述位置分析模块用于对所述超薄切片和所述收集带上孔洞的位置进行分析后，将位置分析结果发送给收集器电机控制器，所述收集器电机控制器调节所述超薄切片收集器的收集速度，使每张所述超薄切片均能覆盖在所述收集带的孔洞中心上。
进一步的，还包括通过在所述超薄切片收集器上设置电机控制器，实现所述电机控制器对所述轮系驱动机构上的电机的转速调整。
进一步的，还包括通过在所述壳体上还设置静电消除器，以消除所述超薄切片在切片过程中产生的静电荷。
进一步的，还包括通过在所述超薄切片收集器上设置间歇式自动补水器，使所述切片刀水槽内可进行自动补水。
本发明提供的一种连续超薄切片的制备和自动收集方法，通过对超薄切片收集器上的收集带、以及在收集带上的超薄切片进行实时图像采集，来对超薄切片和收集带上孔洞的位置进行分析，进而调节切片机的切片速度和所述超薄切片收集器的收集速度，以便准确的把收集到的超薄切片覆盖在收集带的孔洞上，不但可以提高收集成功率，而且还能保证收集好的超薄切片用于透射电镜成像，进而提高成像速度和图像的分辨率，收集到的超薄切片也可以用于扫描电镜成像，同时还可以用于电子断层成像获得切片的三维结构数据。总而言之，本方法能够大大拓展连续超薄切片收集和图像采集方法的适用性和多样性，非常适合于在电子显微成像或光学显微成像实验室进行推广应用。
附图说明
图1为本发明示例性实施例的一种连续超薄切片的制备和自动收集方法的示意流程图；
图2为本发明示例性实施例的超薄切片收集器对超薄切片连续收集的示意流程图；
图3为本发明实施例的一种超薄切片收集器的结构示意图；
图4为本发明示例性实施例的一种超薄切片收集器在停留位置的结构示意图；
图5为本发明示例性实施例的切片导引机构局部放大的结构示意图；
图6为本发明示例性实施例的切片导引机构局部放大的结构示意图；
图7为本发明示例性实施例的切片收集装置的壳体内部的结构示意图；
图8为本发明示例性实施例的供带轮系的阻尼机构的结构示意图；
图9为本发明示例性实施例的带有超薄切片的收集带的结构示意图。
图中：1-底座，2-壳体，3-切片导引机构，4-升降台，5-水平旋转台，6-水平调节台，7-静电消除器，8-供带盘，9-第一导向惰轮，10-第二导向惰轮，11-收带盘，12-第三导向惰轮，13-主动牵引胶辊，14-从动牵引胶辊，15-电机，16-第一传动轴，17-第二传动轴，18-蜗杆，19-第一蜗轮，20-第二蜗轮，21-第一皮带轮，22-第二皮带轮，23-皮带，24-第三传动轴，25-供带盘支架，26-收带盘支架，27-挡片，28-阻尼摩擦块，29-阻尼调节弹簧，30-阻尼调节旋钮，31-供带盘连接轴，32-第四传动轴，33-收集带，34-图像采集装置，301-第一引导面，302-第二引导面，303-第三引导面，304-第四引导面，305-滚轴。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
在超薄切片的制备和收集之前，首先将超薄切片收集器的底座固定在切片机的基座上，然后把带有孔洞的收集带安装在超薄切片收集器上。
如图1所示，一种连续超薄切片的制备和自动收集方法，包括以下步骤：
步骤S101、通过切片机进行连续超薄切片的制备；
步骤S102、根据所述切片机的切片速度，对超薄切片收集器的收集速度进行调整；
步骤S103、通过超薄切片收集器对切片机制备的连续超薄切片进行自动收集；
在对超薄切片收集器的收集速度进行调整过程中，通过对超薄切片收集器上的收集带、以及在收集带上的超薄切片进行实时图像采集，来对超薄切片和收集带上孔洞的位置进行分析，进而手动调整切片机的切片速度，以及在收集全过程实时自动调节超薄切片收集器的收集速度，使每张超薄切片均能覆盖在收集带的孔洞中心上。
其中，在切片机进行超薄切片的连续制备之前，需要调整切片机的稳定性，即为：把样品安装到切片机的样品夹头上，并把切片刀安装在切片机的刀架上，调整好切片刀和样品之间的位置和角度，再在切片刀水槽内注水，进行切片刀的预切片，等切片稳定后，暂停切片。
如图2所示，在超薄切片收集器对切片机制备的连续超薄切片进行自动收集过程中，还包括：
步骤S1021、超薄切片收集器对切片机制备的连续超薄切片进行自动收集前，通过对超薄切片收集器进行位置调整，使超薄切片收集器上的带有收集带的切片导引机构伸入到切片机的切片刀水槽内，进而使在切片刀水槽内的超薄切片通过切片导引机构运送到收集带上；其中，调节切片导引机构在切片刀水槽中的位置，使在切片刀水槽内的所有超薄切片与收集带上的孔洞在同一直线上；
步骤S1022、超薄切片收集器对切片机制备的连续超薄切片进行自动收集前，通过手动对收集带的收集速度与切片机的切片速度进行配合的预调整，使超薄切片能够一片一片的依次被收集到收集带上；其中，通过微调收集带的收集速度，使收集带上每两个超薄切片的间隔与收集带上孔洞的间隔保持一致；
步骤S1023、超薄切片收集器对切片机制备的连续超薄切片进行自动收集时，通过打开设置在超薄切片收集器上的静电消除器的电源，来消除超薄切片在切片过程中产生的静电荷；
步骤S1024、超薄切片收集器对切片机制备的连续超薄切片进行自动收集时，通过设定间歇式自动补水器的单次补水量和补水间隔时间，使切片刀水槽内可进行自动补水。
本发明实施例提供的一种连续超薄切片的制备和自动收集方法是通过基于超薄切片收集器来实施的。
如图3所示，一种超薄切片收集器，包括底座1、切片收集装置、收集带33和图像采集装置34；底座1通过定位安装孔与螺栓的配合固定在切片机的基座上，使超薄切片收集器和切片机形成一个整体；切片收集装置通过四维调节台与底座1相连接，其包括一侧与四维调节台相连接的壳体2，以及设置在壳体2另一侧的收集带轮系和轮系驱动机构和切片导引机构3；切片导引机构3的后端靠近切片收集装置的收集带轮系并固定在壳体2上，切片导引机构3的前端远离收集带轮系，且前端的水平高度低于后端的水平高度，切片导引机构3随四维调节台进行位置调整后，其前端伸入切片机的切片刀水槽内；收集带33设置在切片收集装置的收集带轮系上，如图9所示，收集带33上设置有等间距的孔洞，收集带33上的孔洞能够使每张超薄切片恰好覆盖在其上方，以方便在透射电镜观察过程中，电子束穿透超薄切片来观察样品，孔洞上也可铺一层对电子束透明的薄膜；图像采集装置设置35在切片导引机构3前端的上方，图像采集装置34用于采集收集带33、以及在收集带33上的超薄切片的实时图像；图像采集装置34上设置有位置分析模块，位置分析模块用于对超薄切片和收集带33上孔洞的位置进行分析后，将位置分析结果发送给收集器电机控制器，收集器电机控制器调节超薄切片收集器的收集速度，使每张超薄切片均能覆盖在收集带33的孔洞中心上。
其中，四维调节台包括与底座1相连接的升降台4、与壳体2相连接的水平旋转台5，以及两端分别与升降台4和水平旋转台5相连接的水平调节台6，四维调节台通过升降台4和水平旋转台5的设计提高了装置的使用灵活性，可最大限度满足切片收集装置的位置调节的需要，并且水平旋转台5还可以使切片收集装置有两个位置的实现，即为工作位置和停留位置，水平旋转180°到达停留位置(图4所示)，以空出前面的空间便于其他切片操作，不影响切片机其他工作的使用。
如图5和6所示，切片导引机构3包括第一引导面301、第二引导面302、第三引导面303和第四引导面304，第一引导面301和第二引导面302的两侧分别通过第三引导面303和第四引导面304固定，第三引导面303和第四引导面304均与第一引导面301和第二引导面302形成收集带导轨。切片导引机构3靠近四维调节台的一端设置有切片收集导引头，切片收集导引头的前端为靴状并且其内部设置有滚轴305，滚轴305用来减小收集带子在切片收集导引头的前端的受力和摩擦情况。
如图3所示，收集带轮系包括供带轮系和收带轮系，供带轮系包括：设置在壳体2一端的供带盘8、第二导向惰轮10、靠近第四引导面304的第一导向惰轮9，第一导向惰轮9靠近切片导引机构3的第四引导面304，以保证收集带的入水角度；收带轮系包括：设置在壳体2一端且位于供带盘8上方的收带盘11、靠近切片导引机构3的后端的牵引胶辊组、以及设置在收带盘11和牵引胶辊组之间的第三导向惰轮12，牵引胶辊组包括主动牵引胶辊13和从动牵引胶辊14，主动牵引胶辊13靠近切片导引机构3的后端，主动牵引胶辊13与从动牵引胶辊14通过摩擦力驱动收集带，使收集带33恒速运动。从动牵引胶辊14上设置有凹槽，凹槽的宽度在切片的宽度和收集带33的宽度之间，防止运行在切片收集过程中，牵引胶辊组压坏收集带33上的切片。其中，收集带33的安装步骤如下：把绕满收集带33的供带盘8安装到供带盘支架25上，将收集带33的一端抽出，依次经过第二导向惰轮10、第一导向惰轮9、切片收集导引头305的前端、主动牵引胶辊13和从动牵引胶辊14之间、第三导向惰轮12，最后缠绕在收带盘11上。
如图3、4和7所示，轮系驱动机构包括设置在壳体2内部第一转动驱动机构和第二转动驱动机构，第一转动驱动机构包括伺服电机15、与主动牵引胶辊13相连接的第一传动轴16、与壳体相连接的第二传动轴17,以及与从动牵引胶辊14相连接的第四传动轴32，伺服电机15上的蜗杆18设置在第一传动轴16和第二传动轴17之间，第一传动轴16和第二传动轴17上分别设置有第一蜗轮19和第二蜗轮20，伺服电机15上的蜗杆18转动带动第一蜗轮19和第二蜗轮20转动，第一蜗轮19带动第四传动轴32转动；第二转动驱动机构包括第一皮带轮21、第二皮带轮22、皮带23、以及与收带盘11相连接的第三传动轴24，第一皮带轮21设置在第一传动轴16的末端，第二皮带轮22和第三传动轴24的末端通过摩擦传动机构相连接，皮带23分别与第一皮带轮21和第二皮带轮22相连接。主动牵引胶辊13和从动牵引胶辊14通过摩擦力驱动收集带，使收集带恒速运动，主动牵引胶辊13和从主动牵引胶辊14通过伺服电机15通过第一蜗轮19、第二蜗轮20和蜗杆18配合驱动，因此主动牵引胶辊13和从主动牵引胶辊14速度通过伺服电机15可调，通过收集带轮系上的各轮的均为匀速旋转，大大简化了结构的复杂性，提高了设备的稳定性。其中，还包括通过在超薄切片收集器上设置电机控制器，实现电机控制器对轮系驱动机构上的电机15的转速调整，从而精确调节收集带的转速。
供带盘8和收带盘11分别通过供带盘支架25和收带盘支架26可拆卸的设置在超薄切片收集器上，并且供带盘8和收带盘11的前方均设置有挡片27，用来防止供带盘8和收带盘11在运行中滑落。
如图8所示，供带轮系还包括阻尼机构，阻尼机构包括阻尼摩擦块28、阻尼调节弹簧29、阻尼调节旋钮30，阻尼摩擦块28的一端与供带盘8的供带盘连接轴31相连接，阻尼摩擦块28的另一端通过阻尼调节弹簧29与阻尼调节旋钮30相连接。供带盘8连续稳定的提供收集带，同时阻尼结构使收集带在运行中处于绷紧的状态，不同类型的收集带需要的绷紧张力不同，通过调节阻尼调节旋钮30来改变阻力实现。
还包括通过在壳体2上还设置静电消除器7，并且使静电消除器7的尖端靠近切片导引机构3的前端通过在壳体2上还设置静电消除器，以消除超薄切片在切片过程中产生的静电荷，以大大提高长时间切片的稳定性。
还包括通过在超薄切片收集器上设置有间歇式自动补水器，并通过间歇式自动补水器设定单次补水量和补水间隔时间，使切片刀水槽内可进行自动补水。
本发明提供的一种超薄切片收集器，通过四维调节台的设计，提高了其使用的灵活性，方便了切片导引机构的前端伸入装有待收集的切片的切片刀水槽内，进而方便了其对超薄切片的收集；本装置可以集成到切片机上，对切片机加工的切片进行收集，由于本装置固定在切片机基座上，和切片机一起放置在减震台上，因此大大提高了装置的稳定性和连续切片收集的成功率；由于图像采集装置实时反馈切片在收集带上的位置，获得超薄切片和收集带小孔的位置，以便准确的把收集到的切片覆盖在收集带的孔洞上，进而可以提高其收集成功率。总而言之，不但可以在空间上进行位置调节，而且结构简单，运行稳定可靠，大大提高了切片收集的稳定性、灵活性、抗干扰能力以及各种收集带的适用性，非常适合于在光学显微成像或电子显微成像实验室进行推广应用。
本发明仅以上述实施例进行说明，各部件的结构、设置位置及其连接都是可以有所变化的，在本发明技术方案的基础上，凡根据本发明原理对个别部件进行的改进和等同变换，均不应排除在本发明的保护范围之外。
Claims (9)
1.一种连续超薄切片的制备和自动收集方法，其特征在于，包括以下步骤：
通过切片机进行连续超薄切片的制备；
根据所述切片机的切片速度，对超薄切片收集器的收集速度进行调整；
通过超薄切片收集器对所述切片机制备的所述连续超薄切片进行自动收集；
在对所述连续超薄切片收集器的收集速度进行调整过程中，通过对所述超薄切片收集器上的收集带、以及在所述收集带上的所述超薄切片进行实时图像采集，来对所述超薄切片和所述收集带上孔洞的位置进行分析，进而手动或自动调整所述切片机的切片速度，以及在收集全过程实时自动调节所述超薄切片收集器的收集速度，使每张所述超薄切片均能覆盖在所述收集带的孔洞中心上；
所述超薄切片收集器包括：
切片收集装置，包括一侧与四维调节台相连接的壳体（2），以及设置在所述壳体（2）另一侧的收集带轮系和轮系驱动机构；以及
切片导引机构（3），其后端靠近所述切片收集装置的收集带轮系并固定在所述壳体（2）上，前端远离所述收集带轮系且前端的水平高度低于后端的水平高度，所述切片导引机构（3）随所述四维调节台进行位置调整后，其前端伸入所述切片机的切片刀水槽内；
收集带（33），其设置在所述切片收集装置的收集带轮系上，所述收集带（33）上设置有等间距的孔洞；
图像采集装置（34），其设置在所述切片导引机构（3）前端的上方，所述图像采集装置（34）用于采集所述收集带（33）、以及在所述收集带（33）上的所述超薄切片的实时图像；所述图像采集装置（34）上设置有位置分析模块，所述位置分析模块用于对所述超薄切片和所述收集带（35）上孔洞的位置进行分析后，将位置分析结果发送给收集器电机控制器，所述收集器电机控制器调节所述超薄切片收集器的收集速度。
2.根据权利要求 1 所述的一种连续超薄切片的制备和自动收集方法，其特征在于，在所述超薄切片收集器对所述切片机制备的所述连续超薄切片进行自动收集前，通过对所述超薄切片收集器进行位置调整，使所述超薄切片收集器上的带有所述收集带的切片导引机构伸入到所述切片机的切片刀水槽内，进而使在所述切片刀水槽内的所述超薄切片通过所述切片导引机构运送到所述收集带上。
3.根据权利要求 2 所述的一种连续超薄切片的制备和自动收集方法，其特征在于，调节所述切片导引机构在所述切片刀水槽中的位置，使在所述切片刀水槽内的所有所述超薄切片与所述收集带上的孔洞在同一直线上。
4.根据权利要求 2 所述的一种连续超薄切片的制备和自动收集方法，其特征在于，在实时自动调节所述超薄切片收集器的收集速度前，通过手动或自动对所述收集带的收集速度与所述切片机的切片速度进行配合的预调整，使所述超薄切片能够一片一片的依次被收集到所述收集带上；其中，通过微调所述收集带的收集速度，使所述收集带上每两个所述超薄切片的间隔与所述收集带上孔洞的间隔保持一致。
5.根据权利要求 1 所述的一种连续超薄切片的制备和自动收集方法，其特征在于，在所述超薄切片收集器对连续所述超薄切片进行自动收集时，通过打开设置在所述超薄切片收集器上的静电消除器的电源，来消除所述超薄切片在切片过程中产生的静电荷。
6.根据权利要求 1 所述的一种连续超薄切片的制备和自动收集方法，其特征在于，在所述超薄切片收集器对连续所述超薄切片进行自动收集时，通过设定间歇式自动补水器的单次补水量和补水间隔时间，使所述切片刀水槽内可进行自动补水。
7.根据权利要求 1 所述的一种连续超薄切片的制备和自动收集方法，其特征在于，还包括通过在所述超薄切片收集器上设置电机控制器，实现所述电机控制器对所述轮系驱动机构上的电机（15）的转速调整。
8.根据权利要求 1 所述的一种连续超薄切片的制备和自动收集方法，其特征在于，还包括通过在所述壳体（2）上设置静电消除器（7），以消除所述超薄切片在切片过程中产生的静电荷。
9.根据权利要求 1 所述的一种连续超薄切片的制备和自动收集方法，其特征在于，还包括通过在所述超薄切片收集器上设置间歇式自动补水器，使所述切片刀水槽内可进行自动补水。
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