CN106461515B - 用于块面成像的微型串行分割切片机 - Google Patents

Abstract

本公开内容涉及切片机设备的实施方案及其使用方法。在一些实施方案中，切片机可以安装在扫描电子显微镜的内置平台上并且用于执行串行块面扫描电子显微术。在一些情况下，安装在扫描电子显微镜中的切片机可以在离开扫描电子显微镜的电子束轴的位置处切割样品。在一些情况下，切片机可以包括可以测量切片机的刀片的位置的电容传感器，并且切片机可以通过在MATLAB中实施的程序进行计算机控制。

Description

用于块面成像的微型串行分割切片机

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年5月12日提交的美国临时申请No.61/991,929的权益，所述美国临时申请以引用的方式并入本文。

技术领域

本公开内容涉及切片机(microtome)设备及其使用方法，具体来说涉及被设计用于块面成像应用(包括基于光学或电子的成像)的切片机设备。

背景技术

块面成像技术的一种应用是串行块面扫描电子显微术(有时被称为SBEM、SBSEM和/或SBFSEM)，其是指沿着第三维度在连续平面上产生样品的多个二维图像，由此产生关于样品的三维结构的数据的过程。SBSEM技术可以用于研究许多不同类型的生物标本，并且经常用于研究脑组织。其特别用于收集高分辨率的解剖数据，例如当映射大脑中的轴突和神经元回路连接时。一个SBSEM过程包括使用扫描电子显微镜(SEM)来通过收集二次和背散射电子获得二维图像，以及使用切片机(有时被称为“超薄切片机”)来去除在连续图像之间的样品顶部的非常薄(例如，在几十纳米范围内)的部分。通过在扫描电子显微镜的真空室中安装切片机，可以使该过程更有效。先前的切片机具有各种缺点，如本文进一步所述。因此，需要切片机技术的改进。

发明内容

在一些实施方案中，一种用于去除样品的顶部的一个薄的部分的切片机包含：基板；基座，联接到基板，使得基座能够从成像位置移动到切割位置，其中基座具有能够在上面安装样品的暴露表面；刀片，联接到基板，使得当基座处于成像位置时，能够通过在垂直于基座的暴露表面的方向上移动刀片来调整相对于基板的刀片位置，以选择性地改变刀片和基板之间的距离，其中切割位置比成像位置更靠近刀片。

在一些实施例中，切片机安装在被配置成使用相机对样品的表面成像的荧光显微镜上。在一些实施例中，切片机安装在被配置成使用相机对样品的表面成像的阴极发光显微镜上。在一些实施例中，切片机安装在被配置成使用相机对样品的表面成像的光电发射电子显微镜上。在一些实施例中，刀片安装在联接到基板的第一计算机控制的线性致动器上。在一些实施例中，基座安装在杆上，所述杆通过枢转轴承联接到基板。在一些实施例中，通过联接到基板的第二计算机控制的线性致动器的致动，基座能够围绕枢转轴承旋转。

在一些实施例中，第一致动器被配置成接收控制信号以引导刀片的运动，切片机进一步包含：传感器，所述传感器联接到第一致动器并且被配置成产生指示相对于基板的刀片位置的输出信号；以及，计算机程序，被配置成接收来自传感器的输出信号，至少部分地基于来自传感器的输出信号产生控制信号，并且将控制信号传输到第一致动器。

在一些实施例中，切片机进一步包含定位在基座上的样品。在一些实施例中，能够从可用工作距离的范围中选择扫描电子显微镜的样品和极片之间的工作距离。在一些实施例中，电压被施加到样品。在一些实施例中，样品与切片机电隔离。在一些实施例中，刀片是压电控制的振荡金刚石刀片。在一些实施例中，切片机进一步包含包括处理器和存储器的计算装置，存储器存储用于组合样品的多个图像以创建样品的三维表示的计算机可读指令。

在一些实施方案中，一种被配置成安装在扫描电子显微镜内的切片机包含：联接到致动器的刀片，其中致动器联接到扫描电子显微镜的平台，使得致动器能够在平行于扫描电子显微镜的射束轴的方向上相对于平台移动刀片，并且其中致动器被配置成接收控制信号以引导刀片的运动；传感器，联接到致动器并且被配置成产生指示相对于基板的刀片位置的输出信号；以及，计算机程序，被配置成接收来自传感器的输出信号，至少部分地基于来自传感器的输出信号产生控制信号，并且将控制信号传输到致动器。

在一些实施例中，切片机进一步包含基座，所述基座联接到平台，使得基座能够从射束轴上的成像位置移动到离开射束轴的切割位置，其中切割位置比成像位置更靠近刀片。

在一些实施方案中，一种方法包含：将样品定位在扫描电子显微镜内的切片机上的成像位置处，其中成像位置在扫描电子显微镜的射束轴上；对样品的第一暴露表面成像；设置切片机的刀片的高度；将样品从成像位置移动到切割位置，其中切割位置比成像位置更靠近刀片并且不在射束轴上；移动样品穿过刀片，以去除样品的一部分并露出样品的第二暴露表面；将样品移动到成像位置；以及对样品的第二暴露表面成像。

在一些实施例中，方法进一步包含在设置刀片的高度之后，在反馈控制下保持刀片的高度。在一些实施例中，方法进一步包含在对第二暴露表面成像之前，将扫描电子显微镜的电子束聚焦在第二暴露表面处。在一些实施例中，方法进一步包含在对第二暴露表面成像之前，沿着射束轴调整样品。在一些实施例中，方法进一步包含在沿着射束轴调整样品之后，将扫描电子显微镜的电子束聚焦在第二暴露表面处。

在一些实施例中，对样品的第一暴露表面成像的动作包含使用扫描电子显微镜来捕获第一暴露表面的多个组成图像，以及将多个组成图像拼接在一起以形成第一暴露表面的合成图像。在一些实施例中，方法进一步包含使切片机倾斜，使得射束轴不垂直于样品的暴露表面。在一些实施例中，方法进一步包含使切片机旋转。在一些实施例中，方法进一步包含用聚苯乙烯泡沫塑料清洁杆清洁刀片。在一些实施例中，切片机安装在中间平台上，并且中间平台安装在扫描电子显微镜的内置平台上。

通过参考附图进行的几个实施方案的以下详细描述，所公开的技术的前述和其他特征和优点将变得更加显而易见。

附图说明

图1是示例性切片机的俯视立体图。

图2A至图2C以更大的比例示出图1的切片机的部分。

图2D图示使用图1的切片机的方法。

图3A至图3O是在串行块面扫描电子显微术期间产生的组织样品的几个连续扫描电子显微镜图像，以及图示组织样品的连续扫描电子显微镜图像之间的计算差异的图像。

图4A是示出当几次移动组织样品穿过刀片时，测量切片机刀片的竖向位置的电容传感器的输出的曲线图。

图4B是示出彼此重叠的图4A的数据序列的曲线图。

图5是示出多个组成扫描电子显微镜图像的位置的图解。

图6A至图6C是在不同工作距离下拍摄的相同样品的扫描电子显微镜图像。

图7是其中电压已施加到电隔离样品的切片机的侧视图。

图8A至图8C图示使用扫描电子显微镜中的切片机(诸如图1的切片机)控制样品的倾斜的能力。

图9A至图9E是另一示例性切片机的不同视图。

图10A和图10B分别图示使用所公开的切片机切割的15纳米薄的组织切片的XY和XZ视图。

图11是又一示例性切片机的立体图。

具体实施方式

本文所述的切片机可以用于各种显微分析技术，诸如用于扫描电子显微术、基于光的(光学的，例如荧光的)显微术、阴极发光显微术，或用于这些技术的组合。例如，样品可以安装在如下所述的切片机上，该切片机可以直接安装在普通的基于光的(光学)(例如，荧光)显微镜的物镜下。这些实施方案可以在大气条件下和在没有扫描电子显微镜的情况下操作。这些技术可以利用本领域中已知的各种荧光显微技术(例如，多光子显微术、超分辨率显微术等)。

在一些实施例中，本文所述的切片机可以用于光学和/或阴极发光显微术和扫描电子显微术，并且可以捕获和存储连续暴露表面的图像。也可以对图像进行数字分析和重组，以在高度的显微分辨率下提供组织的三维图像或表示，例如，以确定或映射对象的神经元回路。在一些实施方案中，这可以通过使用例如荧光检测器、相机或CMOS传感器经由扫描电子显微镜的内部真空室中的观察孔对样品成像来实现。在一些情况下，可以在SBEM过程期间对样品的每个暴露表面拍摄荧光镜和/或阴极发光图像，使得每个扫描电子显微镜图像具有相应的荧光镜和/或阴极发光图像。以下描述的部分参考在SBEM过程中使用切片机进行，但是本公开内容通常适用于在任何应用中使用切片机。

本文所述的切片机可以用于研究各种类型的样品材料中的任何一种并用于各种目的，包括用于细胞生物学、癌症生物学和/或免疫学研究的组织标本的检查。切片机特别适用于塑料包埋的生物组织样品，诸如塑料包埋的脑组织。

扫描电子显微术允许样品的非常高分辨率的成像，这导致了其在各种领域中的使用。许多商业扫描电子显微镜包含内部可接近的真空室，样品被定位在该真空室中用于通过显微镜成像。内部腔室通过显微镜侧面的门来接近，门被关闭以向腔室提供气密密封。内部腔室然后被排空空气以减少对成像过程的干扰(例如，通过气体分子对电子束的散射)。

许多扫描电子显微镜也包含在上面定位要成像的样品的平台，并且沿着或相对于三个轴(例如，与显微镜的电子束对准的z轴，以及垂直于z轴的x轴和y轴)线性平移平台。平台也可以围绕z轴旋转并围绕x轴和y轴中的至少一个倾斜，使得平台的面可以相对于电子束旋转和倾斜。在一些电子显微镜中，平台可以围绕z轴旋转360°并且围绕x轴和y轴中的一个在90°的范围内倾斜。围绕z轴旋转切片机可以用于在电子束下对准样品。

在材料特别是生物组织的研究中，描述样品的三维结构的数据可能是非常需要的。为了获得三维数据，已经开发了可以安装在扫描电子显微镜的真空室内的切片机。样品安装在切片机上并被定位成通过显微镜成像。一旦对样品的暴露表面成像，则使用切片机来去除样品顶部的非常薄的部分，从而暴露要成像的新表面。该过程可以重复，直到已拍摄所需数量的图像，或直到对样品的所需的厚度已成像。如此拍摄的一系列图像可以说明样品的三维结构。

已知的切片机设备具有各种缺点。作为一个实施例，已知的切片机使刀片移动穿过样品以去除样品顶部的薄的部分。因为样品直接位于显微镜的检测器和极片下面，所以来自样品切片的碎片可能接触或粘附到检测器和/或电子柱的极片，从而干扰显微镜的操作。在一些情况下，在电子显微镜的极片的入口处存在压力差，从而增加了碎片进入电子柱的机会并加剧了这个问题。此外，为了允许刀片在样品顶部移动的空间，必须在样品和检测器之间提供足够的空间，由此减小可能的工作距离的范围。特别地，这限制了可以减小工作距离的程度，这转而可以限制可以获得的数据的质量。例如，减小样品和检测器之间的工作距离可以提高所得数据中的信噪比。

作为另一实施例，已知的可从宾夕法尼亚州Warrendale的Gatan公司获得的切片机被安装在定制的钢门上。为了在扫描电子显微镜中安装该切片机，必须去除显微镜的原始平台和门，并且将定制的钢门安装在原始位置。这使得切片机相对较重并且难以安装。此外，该切片机仅允许样品沿x轴、y轴和z轴平移，但不允许样品像内置平台所允许的一样倾斜或旋转。此外，该设备沿着x轴和y轴提供的平移不是真正的直线。相反，应当理解，Gatan切片机提供沿着大抛物线弧的平移，使得平移接近但不完全是直线的。已知的切片机具有其他缺点，这将在下面更详细地描述。

本文所述的切片机设备允许在从电子束轴去除的位置处切割样品，从而减少来自碎片的干扰的机会，并且允许在更大的工作距离范围内成像。通过允许工作距离比已知的设备中进一步减小并且提供更大范围的工作距离以供选择，这可能是有利的。本文所述的切片机设备也可以是相对较轻的并且因此更容易安装，并且在一些实施方案中被设计成安装在各种扫描电子显微镜的内置平台上，使得可以沿着三个轴真正的直线平移(在许多厘米的范围内)并且围绕两个旋转轴精细控制样品的位置和取向。本文所述的切片机能够从样品顶部可再现地切割非常薄的部分。本文所述的切片机具有额外的优点，这将在下面更详细地描述。

图1和图2A至图2C示出适合用于扫描电子显微镜中的示例性切片机100。当在其中使用切片机100时，将切片机100安装在扫描电子显微镜的平台上，以控制切片机100的平移和旋转。切片机100可以与显微镜的平台齐平地安装，或者可以联接到平台并且通过多个柱与平台间隔开。切片机100可以与各种市售的扫描电子显微镜中的任一种结合使用，这些扫描电子显微镜具有足够大的内部腔室以在其中适配切片机(下文提供切片机100的示例性总体尺寸)。例如，切片机100可以用于可商购自Hillsboro，OR的FEI公司的NOVA NANOSEM50系列扫描电子显微镜。一种合适的扫描电子显微镜是FEI NanoSEM 450设备。

切片机100包括联接到平台的基板102。支架106联接到基板102并且包括竖向表面108，线性致动器110安装到该竖向表面108。可以使用各种合适的线性致动器中的任一种。作为实施例，具有NEXACT驱动器的N-661微型线性平台(之前可商购自PhysikInstrumente)，以及其替代产品线性压电平台LPS-45(目前可商购自PhysikInstrumente)，结合其相关控制器单元，是合适的线性致动器。线性致动器110可以产生其平台110B相对于其主体110A的平移。

具有两个竖向柱112A和中央横杆112B的H形安装元件112安装到平台110B的暴露表面。包括竖向部分114A和两个水平突出臂114B的刀片支撑件114安装到中央横杆112B。臂114B彼此间隔开并且彼此平行地远离竖向部分114A延伸，使得刀片116可以安装在其终端之间。合适的刀片在本领域中是已知的。特别适用于切片机100的刀片包括压电控制的振荡金刚石刀片，诸如在Studer等人的Minimal Compression of Ultrathin Sections withuse of an Oscillating Diamond Knife，Journal of Microscopy，第197卷，第1部分，第94-100页(2000年1月)中所描述的刀片。各种特别合适的市售刀片由DiATOME U.S提供。

如图2B和图2C中更详细地所示，刀片116安装在臂114B的终端之间，并且螺钉144穿过臂114B并拧紧，使得刀片116被夹在臂114B之间。压电致动器146通过螺钉148联接到刀片支撑件114的竖向部分114A，螺钉148通过与压电致动器146相对的螺钉148的端部上的螺母固定到刀片支撑件114。刀片支撑件114可以联接到弯曲元件150，弯曲元件150将刀片支撑件114联接到切片机100的其余部分。弯曲元件可以是具有足够柔性的窄的、柔韧的金属元件，使得压电致动器146的致动引起刀片支撑件114随着弯曲元件150弯曲来回振荡。弯曲元件150可以具有1mm的宽度。压电致动器146可以被配置成以弯曲元件150上的刀片支撑件114的谐振频率振荡。一种合适的压电致动器是可从PI Ceramic获得的高真空兼容的PD080.31通孔压电致动器，以及可从Physik Instrumente获得的相关的信号放大和调节设备。

切片机100也包括传感器组件118(图1)，其包括用于将传感器保持在适当位置的传感器钳120、包括轴122和电容传感器模块124的电容传感器，以及联接到基板102的靶板126。各种合适的电容传感器是市售的，其中一个实施例是可从Physik Instrumente获得的D-510PISECA电容传感器和相关的信号调节设备，其能够以纳米分辨率进行测量。电容传感器可以提供指示电容传感器模块124的暴露底表面和靶板126的暴露上表面之间的距离的输出信号。传感器组件118联接到安装元件112的竖向柱112A，因此，在知道切片机100的各种部件的尺寸的情况下，输出信号可以指示刀片116相对于样品136的高度。

来自电容传感器的输出信号可以通过数据调节和/或采集系统诸如可商购自National Instruments Corporation的18位、625kS/s、NI USB-6289M系列多功能DAQ系统来运行，并且运行到软件程序中诸如可商购自Mathworks公司的MATLAB中实施的程序中。程序可以被配置成接收来自电容传感器的输出信号，接收来自用户的输入(例如，刀片116的所需的高度)，并且向致动器110提供输出信号以控制平台110B的运动。在接收到指示刀片116将被移动到所需的高度的输入后，程序可以计算平台110B的指定高度，从而将刀片116定位在所需的高度。然后，程序可以向致动器110发送包括移动到指定高度的命令的信号。程序可以进一步监测来自电容传感器的信号，以确定刀片是否实际移动到并保持在指定高度。

如果来自电容传感器的信号指示实际刀片高度低于所需的刀片高度，则程序可以向致动器110发送新信号，该新信号包括移动到大于指定高度的新高度的命令。如果来自电容传感器的信号指示实际刀片高度高于所需的刀片高度，则程序可以向致动器110发送新信号，该新信号包括移动到小于指定高度的新高度的命令。该过程可以连续运行，从而基于来自电容传感器的信号创建将刀片116保持在所需的高度的闭合控制回路(或反馈回路)(例如，使用PID控制回路反馈机制)。这可以帮助提高切片机系统的精度，包括切片机系统从样品136的顶部去除材料的精度和均匀性。

切片机还包括：两个枢转支撑元件128，其彼此间隔开并且联接到基板102；枢转轴承130，其安装到枢转支撑元件128并且跨越在枢转支撑元件128之间；以及，可旋转杆132，其安装在枢转轴承130上以用于围绕枢转轴承的轴线旋转。枢转轴承130包括：固定部分，其刚性联接到枢转支撑元件128并由枢转支撑元件128支撑；以及，可旋转部分，其相对于刚性联接到杆132并且支撑杆132的固定部分可自由旋转。可以使用各种合适的市售枢转轴承，诸如可商购自Riverhawk公司的6016-800枢转轴承。在可旋转杆132的顶部，切片机100包括可以在上面安装待研究的样品136的基座134。合适的基座包括用于扫描电子显微镜的试样架，诸如可商购自Electron Microscopy Sciences的EMS铝试样桩75638-10。

切片机100也包括联接到基板102的钳138，以及夹紧在钳138内的线性致动器140。可以使用各种市售线性致动器中的任一种，其中一个特别合适的致动器是可从PhysikInstrumente获得的N-381NEXACT线性致动器、操纵器、压电步进器产品和相关控制器。线性致动器140联接到可旋转杆132，使得致动器140可以控制杆132围绕枢转轴承130的旋转。更具体来说，致动器140终止于滚珠轴承，该滚珠轴承与位于杆132内部的蓝宝石垫接合。蓝宝石垫可以提供用于接合致动器140的非常平坦和耐用的表面。合适的蓝宝石垫包括由Thorlabs公司以型号P25SK2-Polaris-Kl出售的蓝宝石垫。

在一些情况下，杆132可以被偏置(例如，杆132可以被加重)以围绕枢转轴承130旋转远离刀片116。致动器140可以推压蓝宝石垫以致动杆132将样品136移动朝向刀片116。在一个具体实施方案中，杆132可以被加重，使得其被偏置成以围绕枢转轴承130约1度的旋转搁置为比扫描电子显微镜的电子束更远离刀片116。致动器140可以接合蓝宝石垫以使杆132朝向刀片116旋转1度，使得样品136定位在扫描电子显微镜的电子束中。致动器140可以接合蓝宝石垫以使杆132旋转约10度，使得样品136定位在刀片116的区域内。

为了防止致动器140使样品136在刀片116和致动器110的方向上旋转太远，切片机也包括枢转止动件142，该枢转止动件142联接到枢转支撑元件128并且在杆132和致动器110之间延伸。切片机100也可以包括重物152(诸如钢块)，以向致动器110增加额外的重量来稳定刀片116，并且在样品136平移穿过刀片116时保持刀片116的位置。

致动器140可以用于移动样品136穿过刀片116，例如，以去除样品136的暴露表面的一部分。例如，上述MATLAB程序可以被配置成从用户接收关于样品136的所需的运动的输入，并且向致动器140提供输出信号以控制杆132的运动并且因此控制样品136的运动。在接收到指示样品136将被移动到所需的位置的输入后，程序可以计算将样品定位在所需的位置的致动器140的指定位置。然后，程序可以向致动器140发送包括移动到指定位置的命令的信号。

在一些情况下，可以将待研究的样品嵌入塑料(例如，环氧树脂)中以促进样品的精确切割和成像。制备用于串行块面扫描电子显微术的切片机中的样品的方法在本领域中是已知的。作为这种方法的一个实施例，可以将待研究的组织样品切割成一定尺寸，然后在模具中嵌入液体环氧树脂中，之后可以在烘箱中固化环氧树脂。样品和嵌入有样品的环氧树脂可以从模具中切出并胶合到其将被支撑在切片机上的底座或基座。例如，可以使用嵌入有样品的相同环氧树脂将样品胶合到基座。

一旦将样品胶合到基座，可以使用商业超薄切片机去除样品的不需要的部分，由此产生组织暴露在其侧面的截棱锥形或梯形棱柱形样品。这些形状提供了相对刚性和稳定的样品，其可以比其他形状的样品更准确和一致地切割。然后可以将样品涂覆在诸如金的导电材料中，以便将样品的侧面接地到基座，从而允许从样品中耗散电子并防止在成像期间静电电荷的累积。然后可以从样品的顶部去除涂层，以暴露样品的上表面来在扫描电子显微镜中成像。

图2A示出切片机100的部分的放大视图，其中样品136位于极片下方和扫描电子显微镜的射束轴上。图2B示出在MATLAB程序向致动器140发送命令，并且致动器140通过致动杆132将样品136移动朝向刀片116并且从极片下方移出并远离扫描电子显微镜的射束轴来响应于该命令之后，图2A的切片机的部分的放大视图。

本文所述的切片机能够从样品的顶部可再现地切割非常薄的部分。切片机可以切割厚度等于电容传感器的分辨率的切片，该厚度可以小于10纳米。在切片机用于扫描电子显微镜中的情况下，切片厚度受到施加到样品和样品的塑料包埋材料的电子剂量的限制，如上所述，这可能改变塑料包埋材料的材料性质(例如，通过断裂塑料聚合物中的键)，因此使得切割样品更加困难并且导致振颤和/或不一致的切片厚度。已经发现，30纳米是用于减小这种效应的合适的切片厚度。因此，在SBEM应用中，本文所述的切片机是足够精确的，使得其不是限制切片厚度减小的因素。在切片机用于光学显微镜中的情况下，可以使用与电容传感器的分辨率一样小的切片厚度。

本文所述的切片机的部件可以由包括铝、钛和/或不锈钢的各种合适材料中的任何一种制造。切片机可以包括热电偶以监测部件的温度，从而根据需要减轻热效应。已经发现，上述切片机可以具有小于1kg的重量、235mm的总宽度、73mm的深度和75mm的高度，并且可以构造成比已知的市售切片机显著更便宜。可以进行切片机的元件的略微重排以调整切片机的尺寸，例如，以适应特定的SEM真空室。基于其重量，这种切片机可以比其他已知的切片机更容易安装在扫描电子显微镜中。基于其总体尺寸，切片机可以容易地配合在扫描电子显微镜的30cm真空室内。这种切片机也与光学显微镜兼容，并且可以由非磁性材料(例如，铝、铂)制造，以便防止或减少在浸没透镜操作模式下对SEM的磁场的干扰。

图2D图示使用切片机100的示例性方法250。在252，切片机100可以安装在扫描电子显微镜的真空室中。在254，可以制备样品用于研究并将样品安装在切片机100上。在256，可以使用扫描电子显微镜对样品的暴露表面成像。在258，可以在反馈控制下设置和保持刀片高度，并且可以致动压电致动器146以引起刀片的振荡。在260，样品可以平移穿过刀片以去除样品的薄的部分，并且可以中断压电致动器146的致动以暂停刀片的振荡。在262，可以使刀片向上缩回远离样品。在264，样品可以在扫描电子显微镜的电子柱下被平移回到其原始成像位置。

一旦样品已返回到成像位置，由于通过刀片去除样品的顶部，所以样品的暴露表面处于比用于步骤256的成像稍低的位置。因此，在样品在264返回到成像位置之后，可以调整系统来补偿该变化。这种调整可以在266A通过将扫描电子显微镜的电子束重新聚焦在新的暴露表面来实现。替代地(或另外)，这种调整可以在266B通过平移扫描电子显微镜的内置平台以向上移动样品来实现，使得样品的暴露表面处于与用于步骤256的成像相同的位置。在268，可以使用扫描电子显微镜对样品的暴露表面成像，并且该过程可以重复，直到已收集到足够的数据。

在一些情况下，当样品平移穿过刀片时，碎片可能积聚在刀片上，从而降低其精度和一致性，和/或保留在样品的暴露表面上，从而潜在地将误差引入到对表面拍摄的图像中。为了防止碎片积聚在刀片116上，一块聚苯乙烯泡沫塑料或其他合适的材料可以安装到样品136后面的基座134，即，使得样品136在样品处于成像位置时在材料和刀片116之间。因此，杆132可以朝向致动器110移动，使得样品136被切割，并且杆132可以进一步移动，使得材料接触刀片116以去除残留在上面的任何碎片。

如果暴露表面的扫描电子显微镜图像显示碎片存在于表面上，则可以采取步骤从表面去除碎片，以便然后可以获得更完整的图像。为了去除残留在样品136的暴露表面上的碎片，样品136可以例如第二次移动穿过刀片116，使得刀片116可以扫除任何碎片离开样品136的面。这可以通过将刀片116保持在与初始切割相同的高度，或者通过首先将刀片116远离样品136的暴露表面移动一小段距离来完成，使得不会无意地去除样品136的额外部分。

图3A和图3B是通过使用如上所述的切片机从样品顶部去除厚度为40纳米的切片，在串行块面扫描电子显微术期间产生的组织样品的连续暴露表面的扫描电子显微镜图像。对于某些实施方案，也可以去除较薄的切片，诸如低至15纳米的薄切片，如图10A和图10B中所示。图3C是图示图3A和图3B的连续图像之间的计算差异的图像。在图3C中，较暗区域指示连续图像之间的较小差异，并且较亮区域指示连续图像之间的较大差异。如图3C中所示，连续图像很大程度上相似，这表明组织样品的结构仅在切片机从样品顶部去除的切片的厚度上稍微改变，反映了切片机去除样品的非常小的部分的能力。也如图3C中所示，连续图像之间的差异在图像的整个范围内相对一致，这表明从样品去除的部分的厚度在样品的表面上类似地一致。这些结果说明了本文所述的切片机以高度一致性去除样品的非常薄的部分的能力，例如，没有刀片跳过样品的表面(有时被称为“振颤”)。

图3D是与图3B相同的显微摄影图像。图3D和图3E是如上所述产生的样品的连续暴露表面的扫描电子显微镜图像。图3F是图示图3D和图3E的连续图像之间的计算差异的图像。图3G是与图3E相同的显微摄影图像。图3G和图3H是如上所述产生的样品的连续暴露表面的扫描电子显微镜图像。图3I是图示图3G和图3H的连续图像之间的计算差异的图像。图3J是与图3H相同的显微摄影图像。图3J和图3K是如上所述产生的样品的连续暴露表面的扫描电子显微镜图像。图3L是图示图3J和图3K的连续图像之间的计算差异的图像。图3M是与图3K相同的显微摄影图像。图3M和图3N是如上所述产生的样品的连续暴露表面的扫描电子显微镜图像。图3O是图示图3M和图3N的连续图像之间的计算差异的图像。图3F、图3I、图3L和图3O中所示的结果与图3C中所示并如上所述的结果相当。

图4A是示出当十四次移动组织样品穿过刀片时，来自测量切片机刀片的竖向位置的上述电容传感器的多个数据序列中的输出的曲线图。图4B是示出彼此重叠的图4A的数据序列的曲线图。如图4A至图4B中所示，曲线图的y轴图示刀片的高度，并且曲线图的x轴图示当样品移动穿过刀片时的时间增量。参考图4A的数据序列402，在440可以看出，刀片最初被降低到所需的位置。一旦刀片根据需要被定位，样品可以移动穿过刀片。图4A中给出的数据显示，在前六次中样品移动穿过刀片，如数据序列402、404、406、408、410和412中所示，样品未与刀片接触。

参考图4A的数据序列414，在450可以看出，样品在其移动穿过时接触刀片。样品和刀片之间的接触的开始导致刀片被向上推动，之后反馈回路有机会校正刀片并使刀片向下回到所需的位置。进一步参考图4A的数据序列414，可以看出，在460，样品停止与刀片接触。样品和刀片之间的接触的停止导致刀片从样品的端部脱落，之后反馈回路有机会校正刀片并使刀片向上回到所需的位置。在接触开始时刀片被向上推动、反馈回路校正以使刀片向下移动、在接触停止时刀片下降以及反馈回路校正以使刀片向上移动的特征模式可以在整个剩余的数据序列416、418、420、422、424、426和428中看到。

该数据提供了优于使用现有切片机获得的明显优点。例如，在已知的切片机中，没有用于精确确定刀片相对于样品的位置的简单方法。因此，在许多情况下，制备用于SBEM应用的切片机需要研究者对样品的表面成像，使刀片移动穿过样品，对样品的表面再次成像，并且比较两个图像以确定样品的任何部分是否被去除。如果没有部分被去除，则刀片将移动小的距离以更靠近样品，并且将重复该过程。重复该过程，直到通过比较连续图像，确定样品的一部分已被去除。该过程可能是非常耗时和低效的以及容易出错的，并且将必须被经常执行，因为任何延长的不使用切片机的时段可能使刀片和样品的精确相对位置未知。此外，该过程向样品引入大的电子剂量，这可能改变塑料涂层的材料性质(例如，通过断裂塑料聚合物中的键)，因此使得切割样品更加困难并且导致振颤和/或不一致的切片厚度。因此，本文所述的切片机提供了校准和中断恢复的更高效和有效的方法。

图示彼此重叠的图4A的数据序列的图4B图示了数据序列的一致性，并且因此图示了当切片机从样品的表面去除一系列部分时切片机的性能的一致性。

在一些情况下，扫描电子显微镜能够对不大于50微米×50微米的表面的区域成像。然而，使用SBEM技术研究的样品经常可以具有在500微米×500微米的范围内的尺寸。因此，在一些情况下，在同一平面上拍摄的多个扫描电子显微镜图像被拼接在一起以产生样品表面的更大的合成图像。例如，如图5中所示，扫描电子显微镜可以用于在第一位置拍摄样品的暴露表面的第一区域501的第一图像。然后使用扫描电子显微镜的内置平台将样品从第一位置平移到第二位置，并且扫描电子显微镜可以用于拍摄第二区域502的第二图像。然后可以例如使用后处理软件将两个图像拼接在一起。在一些情况下，第一图像中示出的样品的区域可以具有与第二图像中示出的样品的区域重叠的区域，并且重叠区域503可以由后处理软件用来将两个图像拼接在一起以形成合成图像。

一旦已经拍摄了两个图像，可以如上所述去除样品的顶部，可以将样品返回到其第一位置，并且可以通过对具有重叠区域506的第一区域504和第二区域505成像来对新暴露的表面重复该过程。可以对第三暴露表面的第一区域507、第二区域508和重叠区域509，以及对第四暴露表面的第一区域510、第二区域511和重叠区域512重复该过程。

为了使这种技术有效地与SBEM过程结合，平台优选地具有足以确保样品停留在相同位置以用于对每个连续暴露表面成像的精度。此外，第一区域501和第二区域502之间的重叠区域503优选足够大，以确保在考虑到切片机平移的一些误差的情况下，存在至少一些重叠区域以允许将第一图像和第二图像拼接在一起。因此，更精确的平台可以允许更小的重叠区域并且因此允许更大的合成图像。基于典型的扫描电子显微镜的内置平台，已经发现，约1微米的重叠区域在许多情况下是足够的。

已经发现，FEI NanoSEM 450扫描电子显微镜的内置平台具有足够的精度来实现这些目的。然而，如果发现扫描电子显微镜的内置平台不够精确，则可以在内置平台上安装中间线性平移平台，并且可以将切片机安装在中间平台上。一个合适的中间平台是可商购自Physik Instrument的P-625.2XY压电平台。在这种情况下，内置平台可以提供粗调并且中间平台可以提供微调。

图6A是在3.1mm的工作距离处拍摄的组织样品的扫描电子显微镜图像。图6B是在4.0mm的工作距离处拍摄的相同组织样品的扫描电子显微镜图像。图6C是在4.9mm的工作距离处拍摄的相同组织样品的扫描电子显微镜图像。总的来说，图6A至图6C中所示的图像说明了通过减小工作距离，可以获得组织样品的更高的信噪比图像。这说明了上述切片机的一个优点在于，其可以允许在比现有切片机更短的工作距离处拍摄扫描电子显微镜图像。

在典型的扫描电子显微镜中，可以提供具有2kV的加速电压的电子束，并且使样品如上所述接地。在这种情况下，由检测器收集的电子几乎为2kV，或在一些情况下为约1.9kV。图7图示其中电压被施加到样品702的替代切片机700。这可以通过将样品702与基座704电隔离并且例如通过涂覆到样品702上的镀金层向样品702施加电压来实现。这也可以通过提供绝缘体706以电隔离基座704，并且例如通过在708施加电压来向基座704施加电压来实现。在这种情况下，将电压施加到基座704会产生电场线710。

图7图示从扫描电子显微镜的极片出射并且沿着扫描电子显微镜的射束轴引导到带电样品702的电子束712，以及从样品702收集二次和背散射电子的检测器714。在一个具体实施方案中，可以提供具有6kV的加速电压的电子束712，并且可以提供具有-4kV电压的样品702。在这种情况下，电子束712由于束减速而以与上述接地样品情况相同的能量(2kV)与样品702碰撞，但是由于束加速，由检测器714收集的电子具有接近6kV的能量，或者在一些情况下为约5.9kV，并且更多数量的电子被引导回到检测器714。因此，由图7中所示的实施方案收集的数据可以具有更高的质量，并且可以具有改善的信噪比。

在一些实施方案中，可以使用电子断层成像来改善结果。电子断层成像是其中电子束以围绕其中心的各种旋转度被引导到样品的技术。图8A至图8C示出适用于电子断层成像应用的扫描电子显微镜的切片机800和检测器802的不同配置。图8A示出处于0°倾斜的切片机800和位于样品804上方的检测器802。图8B示出处于20°倾斜的切片机800和位于样品804上方的检测器802。图8C示出处于20°倾斜的切片机800和位于样品804的侧面以增加电子检测效率的检测器802。20°被图示为示例性倾斜角，并且实际上该角度可以在宽范围的合适角度上变化。

所得电子的收集允许重建样品804的详细的三维结构。这种技术的一个优点是其可以允许更详细地研究样品804的三维结构，或者其可以允许使用较不精确的切片机进行类似的详细研究(因为从样品804的表面去除的材料切片不需要一样薄)。因为这种技术需要旋转样品804的能力，所以其不能与不允许样品804旋转的已知的切片机结合使用。关于本文所述的切片机，样品804的旋转可以通过扫描电子显微镜的平台(并且因此整个切片机800)的旋转，或通过基座围绕枢转轴承的旋转来实现。

图9A至图9E示出另一示例性切片机900。切片机900包括上文关于切片机100描述的许多部件。切片机900包括将刀片支撑件904联接到线性致动器906的竖向弯曲元件902。竖向弯曲元件902是有利的，因为其在刀片908来回振荡时最小化刀片908的竖向运动。切片机900也包括用于电隔离样品914的绝缘体910。绝缘体910可以由聚醚醚酮(PEEK)或其他真空兼容材料制成。切片机900也包括狭槽912，聚苯乙烯泡沫塑料清洁杆(未图示)位于狭槽912内以允许在切割样品914之后清洁刀片908。切片机900也包括散热器916。当散热器916用于真空室中时，散热器916提供来自线性致动器140的额外的散热。

图9B从另一个角度图示了切片机900。图9C图示成像配置中的切片机900，其中样品位于扫描电子显微镜的电子束下。图9D图示切割配置中的切片机900，其中刀片908切割样品914。图9E图示清洁配置中的切片机900，其中可以用狭槽912中的聚苯乙烯泡沫塑料清洁杆清洁刀片908。

图10A和图10B是通过使用本文所述的切片机从样品去除厚度为15纳米的切片，在串行块面扫描电子显微术期间产生的组织样品的暴露表面的扫描电子显微镜图像。图10A示出通过一堆数据的XY视图，而图10B示出通过一堆数据的XZ视图。

图11示出另一示例性切片机1000。切片机1000包括上文关于切片机900描述的许多部件。切片机1000包括将刀片支撑件1004联接到线性致动器1006的竖向弯曲元件1002。竖向弯曲元件1002是有利的，因为其在刀片1008来回振荡时最小化刀片1008的竖向运动。切片机1000也包括用于电隔离样品1014的绝缘体1010。绝缘体1010可以由聚醚醚酮(PEEK)或其他真空兼容材料制成。切片机1000也包括狭槽1012，聚苯乙烯泡沫塑料清洁杆(未图示)可以位于狭槽1012内以允许在切割样品1014之后清洁刀片1008。切片机1000也包括散热器1016。当散热器1016用于真空室中时，散热器1016提供来自线性致动器的额外的散热。

切片机1000也包括线性平台或压电平台1020，以将电容传感器重置到其范围的顶部。电容传感器可以具有约600微米的范围。在切穿600微米的组织之后，线性平台1020可以将传感器升高到电容传感器范围的顶部，而不改变刀1008相对于样品1014的位置。这有效地将沿着Z轴的切割范围从600微米增加到线性平台1020的范围(例如，到约25mm)。

切片机1000也可以包括位于样品1014旁边的聚合物支架1022，法拉第杯可以安装或固定在聚合物支架1022上。支架1022的添加可以允许通过使用SEM平台偶然在电子束下平移法拉第杯来监视电子束电流。

切片机1000也可以包括钳1024，以在安装样品时使基座保持静止(例如，因此基座在安装样品时不会无意地枢转)。一旦数据收集开始，就可以去除钳1024。

为了本描述的目的，本文描述了本公开内容的实施方案的某些方面、优点和新颖特征。所公开的方法、装置和系统不应被解释为以任何方式进行限制。相反，本公开内容单独地以及在彼此的各种组合和子组合中涉及各种公开的实施方案的所有新颖的和非显而易见的特征和方面。方法、装置和系统不限于任何特定方面或特征或其组合，所公开的实施方案也不要求存在任何一个或多个特定优点或解决问题。

结合本发明的特定方面、实施方案或实施例描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团应理解为适用于本文所述的任何其他方面、实施方案或实施例，除非与其不相容。在本说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中公开的所有特征，和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤可能以任何组合进行组合，除了这些特征和/或步骤中的至少一些相互排斥的组合。本发明不限于任何前述实施方案的细节。本发明延伸到本说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中公开的特征的任何新颖的一个或任何新颖的组合，或如此公开的任何方法或过程的步骤的任何新颖的一个或任何新颖的组合。

尽管为了方便呈现以特定的顺序次序描述了所公开的方法中的一些方法的操作，但是应当理解，这种描述方式包括重新排列，除非特定语言需要特定排序。例如，按顺序描述的操作可以在一些情况下被重新排列或同时执行。此外，为了简单起见，附图可能不示出所公开的方法可以与其他方法结合使用的各种方式。如本文所使用的，术语“一”和“至少一个”包括一个或多个指定的元素。即，如果存在两个特定元素，则这些元素中的一个也存在，并且因此存在“一”元素。术语“多个”和“复数个”是指指定元素中的两个或更多个。

如本文所使用的，在元素列表的最后两个之间使用的术语“和/或”是指所列出的元素中的任何一个或多个。例如，短语“A、B和/或C”是指“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”或“A、B和C”。

如本文所使用的，术语“联接”通常是指物理地、磁性地、化学地、电地或以其他方式联接或链接，并且不排除在没有特定相反语言的情况下联接元件之间存在中间元件。

鉴于可以应用本文公开的原理的许多可能的实施方案，应当认识到，所示的实施方案仅仅是实施例，并且不应被视为对本公开内容的范围的限制。相反，本公开内容的范围至少与由以下权利要求定义的本发明一样宽广。因此，要求保护落入这些权利要求的范围内的所有发明。

Claims (32)

1.一种用于去除样品的顶部的一个薄的部分的切片机，包含：

基板；

基座，联接到所述基板，使得所述基座能够从成像位置移动到切割位置，其中所述基座具有能够在上面安装所述样品的暴露表面；

刀片，联接到所述基板，使得当所述基座处于所述成像位置时，能够通过在垂直于所述基座的所述暴露表面的方向上移动所述刀片来调整相对于所述基板的刀片位置，以选择性地改变所述刀片和所述基板之间的距离；

其中所述切割位置比所述成像位置更靠近所述刀片。

2.根据权利要求1所述的切片机，其中所述切片机安装在荧光显微镜上，所述荧光显微镜被配置成使用相机对所述样品的表面成像。

3.根据权利要求1所述的切片机，其中所述切片机安装在阴极发光显微镜上，所述阴极发光显微镜被配置成使用相机对所述样品的表面成像。

4.根据权利要求1所述的切片机，其中所述切片机安装在光电发射电子显微镜上，所述光电发射电子显微镜被配置成使用相机对所述样品的表面成像。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的切片机，其中所述刀片安装在第一计算机控制的线性致动器上，所述第一计算机控制的线性致动器联接到所述基板。

6.根据权利要求5所述的切片机，其中所述基座安装在杆上，所述杆通过枢转轴承联接到所述基板。

7.根据权利要求6所述的切片机，其中通过联接到所述基板的第二计算机控制的线性致动器的致动，所述基座能够围绕所述枢转轴承旋转。

8.根据权利要求7所述的切片机，其中所述线性致动器被配置成接收控制信号以引导所述刀片的运动，所述切片机进一步包含：

传感器，联接到所述线性致动器并且被配置成产生指示相对于所述基板的所述刀片位置的输出信号；以及

计算机程序，被配置成接收来自所述传感器的所述输出信号，至少部分地基于来自所述传感器的所述输出信号产生所述控制信号，并且将所述控制信号传输到所述线性致动器。

9.根据权利要求1至4中任一项所述的切片机，进一步包含定位在所述基座上的样品。

10.根据权利要求9所述的切片机，其中能够从可用工作距离的范围中选择扫描电子显微镜的所述样品和极片之间的工作距离。

11.根据权利要求9所述的切片机，其中电压被施加到所述样品。

12.根据权利要求11所述的切片机，其中所述样品与所述切片机电隔离。

13.根据权利要求1至4中任一项所述的切片机，其中所述刀片是压电控制的振荡金刚石刀片。

14.根据权利要求1至4中任一项所述的切片机，进一步包含包括处理器和存储器的计算装置，所述存储器存储用于组合所述样品的多个图像以创建所述样品的三维表示的计算机可读指令。

15.根据权利要求1至4中任一项所述的切片机，进一步包含线性压电平台，所述线性压电平台被配置成重置电容传感器而不改变所述刀片相对于所述基板的位置。

16.根据权利要求1至4中任一项所述的切片机，进一步包含聚合物支架，所述聚合物支架联接到所述基座并且被配置成固定法拉第杯。

17.根据权利要求1至4中任一项所述的切片机，进一步包含钳，所述钳联接到所述基座和所述基板，并且被配置成在样品安装到所述基座时，使所述基座相对于所述基板保持静止。

18.一种被配置成安装在扫描电子显微镜内的切片机，包含：

联接到致动器的刀片，其中所述致动器联接到所述扫描电子显微镜的平台，使得所述致动器能够在平行于所述扫描电子显微镜的射束轴的方向上相对于所述平台移动所述刀片，并且其中所述致动器被配置成接收控制信号以引导所述刀片的运动；

传感器，联接到所述致动器并且被配置成产生指示相对于所述切片机的基板的刀片位置的输出信号；以及

计算机程序，被配置成接收来自所述传感器的所述输出信号，至少部分地基于来自所述传感器的所述输出信号产生控制信号，并且将所述控制信号传输到所述致动器。

19.根据权利要求18所述的切片机，进一步包含基座，所述基座联接到所述平台，使得所述基座能够从所述射束轴上的成像位置移动到离开所述射束轴的切割位置，其中所述切割位置比所述成像位置更靠近所述刀片。

20.一种方法，包含：

将样品定位在扫描电子显微镜内的根据权利要求1至19任一所述的切片机上的成像位置处，其中所述成像位置在所述扫描电子显微镜的射束轴上；

对所述样品的第一暴露表面成像；

设置所述切片机的刀片的高度；

将所述样品从所述成像位置移动到切割位置，其中所述切割位置比所述成像位置更靠近所述刀片并且不在所述射束轴上；

移动所述样品穿过所述刀片以去除所述样品的一部分并露出所述样品的第二暴露表面；

将所述样品移动到所述成像位置；以及

对所述样品的所述第二暴露表面成像。

21.根据权利要求20所述的方法，进一步包含在设置所述刀片的所述高度之后，在反馈控制下保持所述刀片的所述高度。

22.根据权利要求20或权利要求21所述的方法，进一步包含在对所述第二暴露表面之前成像，将所述扫描电子显微镜的电子束聚焦在所述第二暴露表面处。

23.根据权利要求20至21中任一项所述的方法，进一步包含在对所述第二暴露表面成像之前，沿着所述射束轴调整所述样品。

24.根据权利要求23所述的方法，进一步包含在沿着所述射束轴调整所述样品之后，将所述扫描电子显微镜的电子束聚焦在所述第二暴露表面处。

25.根据权利要求20至21中任一项所述的方法，其中对所述样品的第一暴露表面成像的动作包含：

使用所述扫描电子显微镜来捕获所述第一暴露表面的多个组成图像；以及

将所述多个组成图像拼接在一起以形成所述第一暴露表面的合成图像。

26.根据权利要求20至21中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包含使所述切片机倾斜，使得所述射束轴不垂直于所述样品的所述暴露表面。

27.根据权利要求20至21中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包含使所述切片机旋转。

28.根据权利要求20至21中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包含用聚苯乙烯泡沫塑料清洁杆清洁所述刀片。

29.根据权利要求20至21中任一项所述的方法，其中所述切片机安装在中间平台上，并且所述中间平台安装在所述扫描电子显微镜的内置平台上。

30.根据权利要求20至21中任一项所述的方法，进一步包含重置电容传感器而不改变刀相对于所述样品的位置。

31.根据权利要求20至21中任一项所述的方法，进一步包含将法拉第杯安装至聚合物支架，所述聚合物支架联接到所述基座。

32.根据权利要求20至21中任一项所述的方法，进一步包含将钳固定在所述基座和所述基板之间，以在样品安装到所述基座时使所述基座相对于所述基板保持静止。