JP6759126B2 - 新規な酸化発色性化合物及び酸化発色試薬 - Google Patents
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Description
R1、R2、R3、R4は、それぞれ独立して、炭素数1〜6の直鎖又は分岐鎖アルキル基であり、
Xは、親水性の官能基であり、
Lは、下記の一般式(II)〜(IV)のいずれかで表される原子団であり、
−(CH2)j− (II)
−(CH2CH2O)k− (III)
−(CH2)m−Z−(CH2)n− (IV)
前記一般式(II)において、jは2〜10の整数であり、
前記一般式(III)において、kは1〜10の整数であり、
前記一般式(IV)において、m及びnは、それぞれ独立して1〜10の整数であり、Zは、−N+(CH3)2−、−CONH−、−NHCO−、−COO−、−OCO−、−NHCOO−、−OCONH−、−NHCONH−及び−(CH2NHCO)q−(qは1〜3の整数)からなる群より選択される原子団である。
上記の式(A)、(B)、(C)及び(D)で表される化合物(以下、それぞれ、「(本発明)化合物A」、「(本発明)化合物B」、「(本発明)化合物C」、「(本発明)化合物D」という。)の合成は、下記のスキーム(I)〜(X)にしたがって行った。
上記のスキーム(I)にしたがい、ロイコメチレンブルーを次のように合成した。3Lナスフラスコにメチレンブルー81.5g(0.218mol)、純水1.3Lを加え超音波照射しながら加温溶解した。マグネチックスターラーで攪拌しながらクロロホルム1.3Lを加えNaBH4水溶液を滴下した。分液し、クロロホルム層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、ひだ折りろ紙でろ過した。クロロホルム層を濃縮乾固し、淡青色粉末65gを得た。本中間体はA、B、C及びDで使用した。
上記のスキーム(III)にしたがい、本発明化合物Bの中間体であるメチルエステル体を次のように合成した。100mLナスフラスコに、合成したロイコメチレンブルー985mg(3.45mmol)、DMF50mLを加えマグネチックスターラーで攪拌溶解した。別途、β-アラニンメチルエステル塩酸塩1.45g(10.35mmol)とトリホスゲン1.02g(3.45mmol)より調製したイソシアネートβ-アラニンメチルエステルを加え3時間撹拌を継続した。反応後、反応液を濃縮乾固し、カラムクロマトグラムで精製した。カラム精製後、濃青色粉末1.317gを得た。
上記のスキーム(V)にしたがい、本発明化合物Cの中間体であるエチルエステル体を次のように合成した。500mLナスフラスコに合成したロイコメチレンブルー2.77g(9.69mmol)、DMF300mLを加え、マグネチックスターラーで攪拌溶解した。別途、4−アミノブタン酸エチル塩酸塩3249mg(19.38mmol)とトリホスゲン1.92g(6.46mmol)より調製したイソシアネートブタン酸エチルエステルを加え、3時間撹拌を継続した。反応後、反応液を濃縮乾固し、カラムクロマトグラムで精製した。カラム精製後、濃青色粉末4.36gを得た。
上記のスキーム(VII)にしたがい、本発明化合物Cの中間体であるグリシルグリシンメチルエステル体を次のように合成した。500mLナスフラスコにグリシルグリシン5000mg(37.84mmol)、メタノール200mL、p−トルエンスルホン酸一水和物7167mg(41.62mmol)を加え超音波照射し溶解した。反応液を濃縮乾固した。濃縮乾固後、メタノール100mLに溶解し、再度濃縮乾固した。この操作を3回行った。白色結晶11.5gを得た。
1H-NMR(400 MHz, D2O)δ:2.64(s, 12H), 3.63(s, 2H), 3.69(s, 2H), 6.62-6.69(m, 4H, J=28 Hz), 7.14-7.17 (d, 2H, J=8 Hz)
本発明に従う酸化発色性化合物として、化合物A、B、C、Dと、既存酸化発色試薬であるDA−67の比較を以下の項目について行った。
光照射下における溶液安定性を次のように試験した。本発明化合物A、B、C、D及びDA−67のそれぞれを50mM MESバッファー(pH6.5)で0.25mMとなるように調製した。調製した各試薬を蛍光灯下に静置して、650nmの吸光度の経時変化を追跡した。その結果を図1に示す。光安定性は、DA−67≒本発明化合物B≒本発明化合物C<本発明化合物A<本発明化合物Dの順に安定であり、本発明化合物のすべてが、DA−67と同等、もしくはそれ以上に安定であることが分かった。
夾雑物として溶血ヘモグロビン(Hb)、ビリルビン−F(BIL−F)、及びビリルビン−C(BIL−C)を用いてその干渉の程度をチェックした。各溶液の調製は次のように行った。
本発明化合物A、B、C、D及びDA−67について、pH5.5、6.5、7.5それぞれにおける650nmの吸光度を測定し、pHの影響を評価した。各溶液の調製は次のように行った。
本発明化合物A、B、C、D及びDA−67のGSH(還元型グルタチオン)の影響を評価した。各溶液の調製は次のように行った。
本発明化合物A、B、C、D及びDA−67のBSA(牛血清アルブミン)の影響を評価した。各溶液の調製は次のように行った。
DA-67は光安定性に加え、水溶性が悪い問題を抱えている。本発明化合物A、B、C、D及びDA−67の水溶性の違いを評価した。各溶液の調製は次のように行った。
<カラム> Inertsil ODS−3,φ4.6×150mm
<温度> 40℃
<溶離液> 0.1%TFA水溶液/アセトニトリル=20/80
<流速> 1.0mL/分
<検出器> UV 254nm
<サンプル量> 5μL注入
<検出時間> 15分
UA濃度0〜20mg/dLの範囲での直線性を比較した。採取したデータを専用アルゴリズムで演算処理して吸光度に換算した。その結果を図7〜11に示す。各化合物のブランク発色の経時変化を図12に示す。直線性に関しては、本発明化合物A、B、C、Dの全てにおいてDA−67と同等であった。ブランク発色に関しては本発明化合物A、B、C、Dの全てがDA−67より優秀であった。
夾雑物として溶血ヘモグロビン(Hb)、アスコルビン酸、及び、ビリルビン−C(BIL−C)を用いてその干渉の程度をチェックした。直線性試験で得た3次回帰式を用いて濃度換算し、各夾雑物質濃度に対する、換算濃度の5回平均値の変動関係を求めて比較した。その結果を図13に示す。アスコルビン酸、ビリルビン−C(BIL−C)においては低濃度、高濃度においても本発明化合物のすべてはDA−67と同等であった。溶血ヘモグロビン(Hb)においては、高濃度では本発明化合物のすべてはDA−67と同等であったが、低濃度では本発明化合物のすべてがDA−67より優秀であった。
40℃環境に保管した試薬(アルミ包装)を、7、14、21、28日経過時に取り出して室温に戻し、冷凍保管した試料を取り出し、室温下で自然解凍した後にボルテックス撹拌してから測定に使用した。直線性測定時と同様の操作を行って吸光度を求めた。その結果を図14に示す。UA高濃度域(18.13mg/dL)での加速安定性は、本発明化合物はすべてDA−67と同等であった。UA低濃度域(2.1mg/dL)での加速安定性は、本発明化合物A>本発明化合物D≒DA−67>本発明化合物B>本発明化合物Cの順に安定であった。
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