JP6738449B2 - Ａｐｌｎｒモジュレーター及びその使用 - Google Patents

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Description

配列表
本出願は、参照により、２０１４年１１月２０日に作成されたファイル７４１０ＷＯ０１＿ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ（１２６，００５バイト）として、コンピュータ読取り可能な形式で提出された配列表を組込む。
本発明は、ヒトＡＰＬＮＲに特異的な、抗体、抗体融合タンパク質またはその抗原結合断片であるアペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）モジュレーター、及びその使用方法に関する。
プレプロアペリンは、ヒトのＣＮＳ及び例えば、肺、心臓、及び乳腺などの、末梢組織で発現される７７アミノ酸のタンパク質である。変動するサイズのアペリンペプチドのＣ末端断片を含むペプチドは、Ｇタンパク質共役受容体、ＡＰＪ受容体（現在ＡＰＬＮＲとして知られる）を活性化することが示された（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。多くの研究が、アペリンペプチド及び類似体は、内皮依存性血管拡張など、ＡＰＪ受容体（ＡＰＬＮＲ）との相互作用を通じて、心臓血管及び血管新生作用を伝えることを示している（非特許文献５）。
アペリン系は、病態生理学的血管形成に役割を果すと思われる。アペリンは、低酸素誘導性網膜血管新生に関与し得ることが研究により示されている（非特許文献６）。いくつかの報告においては、病的血管新生をブロックすることができ、従って腫瘍増殖または網膜における血管新生を阻害するのに有用であるＡＰＬＮＲ阻害剤（非特許文献７；非特許文献８）などの、ある特定の組成物は、アペリン／ＡＰＪ経路を阻害することによって血管新生を阻害することができる（例えば、特許文献１参照）。従って、アペリン媒介シグナル伝達の妨害も増殖性糖尿病網膜症の早期予防に有益であり得る（非特許文献９；非特許文献１０）。
アペリンは、インスリンの調節及び糖尿病及び肥満関連障害の機構でも報告されている。肥満のマウスモデルでは、アペリンは脂肪細胞から放出され、インスリンによって直接アップレギュレートされる（非特許文献１１）。アペリンノックアウトマウスはインスリン感受性の減少を示す（非特許文献１２）。
さらに、アペリン誘導性血管拡張及び血管新生は、虚血再灌流障害において保護作用があり、うっ血性心不全、心筋梗塞、及び心筋症などの病態において心機能を改善することができる。アペリンペプチドの治療的投与は、報告によると、血管新生及び虚血からの機能回復の促進に寄与する（非特許文献１３；非特許文献１４）。
ＡＰＬＮＲシグナル伝達及びその調節は、様々な疾患及び障害の要因として関与しており（例えば、２００４年９月２３日に公開された特許文献２）、とＡＰＬＮＲ生物学的活性を調節する治療薬の必要性が依然として存在する。
米国特許第７，７３６，６４６号 ＷＯ２００４０８１１９８Ａ２
Ｈａｂａｔａ，ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １４５２：２５−３５ Ｈｏｓｏｙａ，ｅｔ ａｌ．，２０００，ＪＢＣ，２７５（２８）：２１０６１−６７ Ｌｅｅ， ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ７４：３４−４１ Ｍｅｄｈｕｒｓｔ，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ８４：１１６２−１１７２ Ｔａｔｅｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｒｅｇｕｌ Ｐｅｐｔ ９９：８７−９２ Ｋａｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｉ ３０：２１８２−２１８７ Ｋｏｊｉｍａ，Ｙ．ａｎｄ Ｑｕｅｒｔｅｒｍｏｕｓ，Ｔ．，２００８，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ；２８；１６８７−１６８８ Ｒａｙａｌａｍ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．２０１１，Ｒｅｃｅｎｔ Ｐａｔ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ６（３）：３６７−７２ Ｔａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０， Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｍｏｌ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５１：４２３７−４２４２ Ｌｕ，Ｑ．ｅｔ ａｌ，２０１３，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８（７）：ｅ６９７０３ Ｂｏｕｃｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １４６：１７６４−７１ Ｙｕｅ，ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ２９８：Ｅ５９-Ｅ６７ Ｅｙｒｉｅｓ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ １０３：４３２-４４０ Ｋｉｄｏｙａ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｂｌｏｏｄ １１５：３１６６-３１７４
本発明は、ヒトアペリン受容体（「ＡＰＬＮＲ」）に結合するＡＰＬＮＲモジュレーターを提供する。本発明のＡＰＬＮＲモジュレーターは、とりわけ、ＡＰＬＮＲ媒介シグナル伝達を活性化または阻害するため並びにＡＰＬＮＲ活性及び／またはシグナル伝達に関連する疾患及び障害を治療するために有用である。
本発明のＡＰＬＮＲモジュレーターは、抗体、抗体融合タンパク質またはその抗原結合断片を含む。
本発明の抗体及び抗体融合タンパク質は完全長であることができるか（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４抗体）、または抗原結合部分のみ含むことができ（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２またはｓｃＦｖ断片）、及び、例えば、残留エフェクター機能を排除するために、機能性に影響を与えるように修飾することができる（Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１９２５−１９３３）。
本発明は、配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、及び２１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、または、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む、
抗体、抗体融合タンパク質またはその抗原結合断片を提供する。
本発明は、配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、及び２１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、または、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む、抗体、抗体融合タンパク質または抗体の抗原結合断片も提供する。
本発明は、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、及び２１０／２１８からなる群から選択されるＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）配列対を含む抗体、抗体融合タンパク質またはその抗原結合断片も提供する。
本発明は、配列番号８、２４、４０、５６、７２、８８、１０４、１２０、１３６、１５２、１６８、１８４、２００、及び２１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）ドメイン、または、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列；及び配列番号１６、３２、４８、６４、８０、９６、１１２、１２８、１４４、１６０、１７６、１９２、２０８、及び２２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）ドメイン、または、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列、を含む抗体、抗体融合タンパク質または抗体の抗原結合断片も提供する。
ある特定の実施形態では、抗体、抗体融合タンパク質または抗体の抗原結合部分は、配列番号８／１６、２４／３２、４０／４８、５６／６４、７２／８０、８８／９６、１０４／１１２、１２０／１２８、１３６／１４４、１５２／１６０、１６８／１７６、１８４／１９２、２００／２０８、及び２１６／２２４からなる群から選択されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む。
本発明は、配列番号４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８、１６４、１８０、１９６、及び２１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）ドメイン、または、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列；配列番号６、２２、３８、５４、７０、８６、１０２、１１８、１３４、１５０、１６６、１８２、１９８、及び２１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）ドメイン、または、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列；配列番号１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６、１７２、１８８、２０４、及び２２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）ドメイン、または、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列；並びに配列番号１４、３０、４６、６２、７８、９４、１１０、１２６、１４２、１５８、１７４、１９０、２０６、及び２２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）ドメイン、または、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列、をさらに含む抗体、抗体融合タンパク質またはその断片も提供する。
本発明のある特定の非限定的な例示的な抗体、抗体融合タンパク質及び抗原結合断片は、以下：配列番号４−６−８−１２−１４−１６（例えば、Ｈ１Ｍ９２０７Ｎ）；２０−
２２−２４−２８−３０−３２（例えば、Ｈ２ａＭ９２０９Ｎ）；３６−３８−４０−４４−４６−４８（例えば、Ｈ２ａＭ９２２２Ｎ）；５２−５４−５６−６０−６２−６４（例えば、Ｈ２ａＭ９２２７Ｎ）；６８−７０−７２−７６−７８−８０（例えば、Ｈ２ａＭ９２２８Ｎ）；８４−８６−８８−９２−９４−９６（例えば、Ｈ２ａＭ９２３０Ｎ）；１００−１０２−１０４−１０８−１１０−１１２（例えば、Ｈ２ａＭ９２３２Ｎ）；１１６−１１８−１２０−１２４−１２６−１２８（例えば、Ｈ４Ｈ９０９２Ｐ）；１３２−１３４−１３６−１４０−１４２−１４４（例えば、Ｈ４Ｈ９０９３Ｐ）；１４８−１５０−１５２−１５６−１５８−１６０（例えば、Ｈ４Ｈ９１０１Ｐ）；１６４−１６６−１６８−１７２−１７４−１７６（例えば、Ｈ４Ｈ９１０３Ｐ）；１８０−１８２−１８４−１８８−１９０−１９２（例えば、Ｈ４Ｈ９１０４Ｐ）；１９６−１９８−２００−２０４−２０６−２０８（例えば、Ｈ４Ｈ９１１２Ｐ）；及び２１２−２１４−２１６−２２０−２２２−２２４（例えば、Ｈ４Ｈ９１１３Ｐ）からなる群から選択されるアミノ酸配列、をそれぞれ有する、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３ドメインを含む。
関連する実施形態では、本発明は、特異的にＡＰＬＮＲに結合する抗体の抗体、抗体融合タンパク質または抗原結合断片を含み、ここにおいて、抗体、抗体融合タンパク質または抗原結合断片は、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、及び２１０／２１８からなる群から選択される重鎖及び軽鎖可変領域（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）配列に含有される重鎖及び軽鎖ＣＤＲドメインを、含む。ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを識別するための方法及び技術は、当該技術分野で周知であり、本明細書に開示された特定のＨＣＶＲ及び／またはＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを識別するのに使用することができる。ＣＤＲの境界を識別するのに使用することができる例示的な規則は、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、及びＡｂＭ定義を含む。一般的には、Ｋａｂａｔ定義は配列変動性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は構造ループ領域の位置に基づき、及びＡｂＭ定義は、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａのアプローチの間の妥協である。例えば、Ｋａｂａｔ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒ
ｅｓｔ，”Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓ
ｄａ，Ｍｄ．（１９９１）；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８；及びＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：９２６８−９２７２参照。公共デ
ータベースも、抗体内のＣＤＲ配列を識別するのに利用可能である。
本発明は、さらにアペリンペプチドを含む抗体融合タンパク質またはその断片も提供する。本発明のある特定の非限定的な例示的な抗体融合タンパク質は、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、及び２１０／２１８からなる群から選択される重鎖及び軽鎖可変領域（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）配列を含み；さらに、例えば、配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９もしくは配列番号２３０の断片または類似体などのアペリンペプチド配列を含む。ある特定の実施形態では、アペリンペプチド配列、またはその断片もしくは類似体は、配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９、配列番号２３０、配列番号２６２、配列番号２６９、配列番号２７０、配列番号２７１、配列番号２７２、配列番号２７３、配列番号２８３、配列番号２８４、及び配列番号２８５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
本発明は、配列番号２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２５３、２５５、２５７、２５９、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、及び
２８２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）、または、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む、抗体融合タンパク質またはその抗原結合断片を提供する。
本発明は、配列番号２３５、２３７、２４９、及び２５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）、または、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む、抗体融合タンパク質または抗体融合タンパク質の抗原結合断片も提供する。
本発明は、配列番号１３０／２３５、１３０／２３７、２３９／１３８、２４１／１３８、２４３／１３８、２４５／１３８、２４７／１２２、１１４／２４９、１１４／２５１、２５３／２６、２５５／２６、２５７／２６、２５９／２６、２７４／１３８、２７５／１３８、２７６／１３８、２７７／１３８、２７８／１３８、２７９／２６、２８０／２６、２８１／２６、及び２８２／２６からなる群から選択されるＨＣ及びＬＣ（ＨＣ／ＬＣ）アミノ酸配列対を含む抗体融合タンパク質またはその抗原結合断片も提供する。
ある特定の非限定的な、例示的抗体融合タンパク質は、（ｉ）免疫グロブリン（Ｉｇ）分子及び（ｉｉ）アペリンペプチド、またはその類似体、を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、ＩｇＧ分子は抗ＡＰＬＮＲ抗体である。さらなる実施形態では、アペリンペプチドは、配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９または配列番号２３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９または配列番号２３０からなる群から選択されるアミノ酸配列の断片または類似体を含む。
本発明の別の態様は、Ｎ’−Ｐ１−Ｘ１（ｎ）−Ａ１−Ｃ’またはＮ’−Ａ１−Ｘ１（ｎ）−Ｐ１−Ｃ’を含むタンパク質を提供し、式中、Ｎ’はポリペプチドのＮ末端でありＣ’はポリペプチドのＣ末端であり；Ｐ１は、ＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、重鎖、軽鎖、及びＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ ＳｃＦｖ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；Ａ１は
アペリンペプチド、またはその類似体を含み；及びＸ１はペプチドリンカーであり；式中ｎ＝０〜１０である。
いくつかの実施形態では、アペリンペプチド、またはその類似体は、アペリン４０〜７７（アペリン−３８）、アペリン４２〜７７（アペリン−３６）、アペリン４３〜７７（アペリン−３５）、アペリン４７〜７７（アペリン−３１）、アペリン５９〜７７（アペリン−１９）、アペリン６１〜７７（アペリン−１７）、アペリン６３〜７７（アペリン−１５）、アペリン６４〜７７（アペリン−１４）、アペリン６５〜７７（アペリン−１３）、アペリン６６〜７７（アペリン−１２、またはＡ１２）、アペリン６７〜７７（アペリン−１１）、アペリン６８〜７７（アペリン−１０）、アペリン７３〜７７（アペリン−５）、アペリン６１〜７６（アペリン−Ｋ１６Ｐ）、アペリン６１〜７５（アペリン−Ｋ１５Ｍ）、アペリン６１〜７４（アペリン−Ｋ１４Ｐ）、または［Ｐｙｒ１］アペリン−１３、を含む。
ある特定の実施形態によれば、抗体融合タンパク質またはその抗原結合断片は、配列番号１３０及び２３５（例えばＨ４Ｈ９０９３Ｐ−１−ＮＶＫ３）、１３０及び２３７（例えばＨ４Ｈ９０９３Ｐ−２−ＣＶＫ３）、２３９及び１３８（例えばＨ４Ｈ９０９３Ｐ−３−ＮＶＨ３）、２４１及び１３８（例えばＨ４Ｈ９０９３Ｐ−４−ＮＶＨ０）、２４３及び１３８（例えばＨ４Ｈ９０９３Ｐ−５−ＮＶＨ１）、２４５及び１３８（例えばＨ４Ｈ９０９３Ｐ−６−ＮＶＨ２）、２４７及び１２２（例えばＨ４Ｈ９０９２Ｐ−１−ＮＶＨ３）、１１４及び２４９（例えばＨ４Ｈ９０９２Ｐ−２−ＮＶＫ３）、１１４及び２５
１（例えばＨ４Ｈ９０９２Ｐ−３−ＣＶＫ３）、２５３及び２６（例えばＨ４Ｈ９２０９Ｎ−１−ＮＶＨ０）、２５５及び２６（例えばＨ４Ｈ９２０９Ｎ−２−ＮＶＨ１）、２５７及び２６（例えばＨ４Ｈ９２０９Ｎ−３−ＮＶＨ２）、２５９及び２６（例えばＨ４Ｈ９２０９Ｎ−４−ＮＶＨ３）、２７４及び１３８（例えばＨ４Ｈ９０９３Ｐ−ＡＰＮ９−（Ｇ４Ｓ）３）、２７５及び１３８（例えばＨ４Ｈ９０９３Ｐ−ＡＰＮ１０−（Ｇ４Ｓ）３）、２７６及び１３８（例えばＨ４Ｈ９０９３Ｐ−ＡＰＮ１１−（Ｇ４Ｓ）３）、２７７及び１３８（例えばＨ４Ｈ９０９３Ｐ−ＡＰＮ１１＋Ｓ−（Ｇ４Ｓ）３）、２７８及び１３８（例えばＨ４Ｈ９０９３Ｐ−ＡＰＮＶ５−１１−（Ｇ４Ｓ）３）、２７９及び２６（例えばＨ４Ｈ９２０９Ｎ−ＡＰＮ９−（Ｇ４Ｓ）３）、２８０及び２６（例えばＨ４Ｈ９２０９Ｎ−ＡＰＮ１０−（Ｇ４Ｓ）３）、２８１及び２６（例えばＨ４Ｈ９２０９Ｎ−ＡＰＮ１１−（Ｇ４Ｓ）３）、または２８２及び２６（例えばＨ４Ｈ９２０９Ｎ−ＡＰＮ１１＋Ｓ−（Ｇ４Ｓ）３）のアミノ酸配列によってコードされる重鎖及び軽鎖配列を含む。
別の態様では、本発明は、抗ＡＰＬＮＲ抗体、抗体融合タンパク質またはその抗原結合断片をコードする核酸分子を提供する。本発明の核酸を担持する組換え発現ベクター及びそのようなベクターが導入されている宿主細胞も本発明に包含され、これは、抗体の産生を可能にする条件下で宿主細胞を培養することによって抗体または抗体融合タンパク質を産生し、産生された抗体または抗体融合タンパク質を回収する方法と同様である。
一実施形態では、本発明は、配列番号１、１７、３３、４９、６５、８１、９７、１１３、１２９、１４５、１６１、１７７、１９３、及び２０９からなる群から選択される核酸配列、または、その少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によってコードされるＨＣＶＲを含む抗体、抗体融合タンパク質またはその抗原結合断片を提供する。
本発明は、配列番号９、２５、４１、５７、７３、８９、１０５、１２１、１３７、１５３、１６９、１８５、２０１、及び２１７からなる群から選択される核酸配列、または、その少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によってコードされるＬＣＶＲを含む抗体、抗体融合タンパク質またはその抗原結合断片も提供する。
本発明は、配列番号７、２３、３９、５５、７１、８７、１０３、１１９、１３５、１５１、１６７、１８３、１９９、及び２１５からなる群から選択される核酸配列、または、その少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によってコードされるＨＣＤＲ３ドメイン；並びに配列番号１５、３１、４７、６３、７９、９５、１１１、１２７、１４３、１５９、１７５、１９１、２０７、及び２２３からなる群から選択される核酸配列、または、その少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によってコードされるＬＣＤＲ３ドメイン、を含む抗体、抗体融合タンパク質または抗体の抗原結合断片も提供する。
本発明は、配列番号３、１９、３５、５１、６７、８３、９９、１１５、１３１、１４７、１６３、１７９、１９５、及び２１１からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または、その少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によってコードされるＨＣＤＲ１ドメイン；配列番号５、２１、３７、５３、６９、８５、１０１、１１７、１３３、１４９、１６５、１８１、１９７、及び２１３からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または、その少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によってコードされるＨＣＤＲ２ドメイン；配列番
号１１、２７、４３、５９、７５、９１、１０７、１２３、１３９、１５５、１７１、１８７、２０３、及び２１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または、その少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によってコードされるＬＣＤＲ１ドメイン；並びに配列番号１３、２９、４５、６１、７７、９３、１０９、１２５、１４１、１５７、１７３、１８９、２０５、及び２２１からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または、その少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によってコードされるＬＣＤＲ２ドメイン、をさらに含む抗体、抗体融合タンパク質またはその抗原結合断片も提供する。
ある特定の実施形態によれば、抗体、抗体融合タンパク質またはその抗原結合断片は、配列番号１及び９（例えばＨ１Ｍ９２０７Ｎ）、１７及び２５（例えばＨ２ａＭ９２０９Ｎ）、３３及び４１（例えばＨ２ａＭ９２２２Ｎ）、４９及び５７（例えばＨ２ａＭ９２２７Ｎ）、６５及び７３（例えばＨ２ａＭ９２２８Ｎ）、８１及び８９（例えばＨ２ａＭ９２３０Ｎ）、９７及び１０５（例えばＨ２ａＭ９２３２Ｎ）、１１３及び１２１（例えばＨ４Ｈ９０９２Ｐ）、１２９及び１３７（例えばＨ４Ｈ９０９３Ｐ）、１４５及び１５３（例えばＨ４Ｈ９１０１Ｐ）、１６１及び１６９（例えばＨ４Ｈ９１０３Ｐ）、１７７及び１８５（例えばＨ４Ｈ９１０４Ｐ）、１９３及び２０１（例えばＨ４Ｈ９１１２Ｐ）、または２０９及び２１７（例えばＨ４Ｈ９１１３Ｐ）の核酸配列によってコードされる重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列を含む。
一実施形態では、本発明は、配列番号２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２５２、２５４、２５６、及び２５８からなる群から選択される核酸配列、または、その少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によってコードされる重鎖（ＨＣ）を含む抗体、抗体融合タンパク質またはその抗原結合断片を提供する。
本発明は、配列番号２３４、２３６、２４８、及び２５０からなる群から選択される核酸配列、または、その少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によってコードされる軽鎖（ＬＣ）を含む抗体、抗体融合タンパク質またはその抗原結合断片も提供する。
ある特定の実施形態によれば、抗体、抗体融合タンパク質またはその抗原結合断片は、配列番号１２９及び２３４（例えばＨ４Ｈ９０９３Ｐ−１−ＮＶＫ３）、１２９及び２３６（例えばＨ４Ｈ９０９３Ｐ−２−ＣＶＫ３）、２３８及び１３７（例えばＨ４Ｈ９０９３Ｐ−３−ＮＶＨ３）、２４０及び１３７（例えばＨ４Ｈ９０９３Ｐ−４−ＮＶＨ０）、２４２及び１３７（例えばＨ４Ｈ９０９３Ｐ−５−ＮＶＨ１）、２４４及び１３７（例えばＨ４Ｈ９０９３Ｐ−６−ＮＶＨ２）、２４６及び１２１（例えばＨ４Ｈ９０９２Ｐ−１−ＮＶＨ３）、１１３及び２４８（例えばＨ４Ｈ９０９２Ｐ−２−ＮＶＫ３）、１１３及び２５０（例えばＨ４Ｈ９０９２Ｐ−３−ＣＶＫ３）、２５２及び２５（例えばＨ４Ｈ９２０９Ｎ−１−ＮＶＨ０）、２５４及び２５（例えばＨ４Ｈ９２０９Ｎ−２−ＮＶＨ１）、２５６及び２５（例えばＨ４Ｈ９２０９Ｎ−３−ＮＶＨ２）、または２５８及び２５（例えばＨ４Ｈ９２０９Ｎ−４−ＮＶＨ３）の核酸配列によってコードされる重鎖及び軽鎖配列を含む。
他の実施形態では、抗体融合タンパク質は、配列番号１３０及び２３５（例えばＨ４Ｈ９０９３Ｐ−１−ＮＶＫ３）、１３０及び２３７（例えばＨ４Ｈ９０９３Ｐ−２−ＣＶＫ３）、２３９及び１３８（例えばＨ４Ｈ９０９３Ｐ−３−ＮＶＨ３）、２４１及び１３８（例えばＨ４Ｈ９０９３Ｐ−４−ＮＶＨ０）、２４３及び１３８（例えばＨ４Ｈ９０９３Ｐ−５−ＮＶＨ１）、２４５及び１３８（例えばＨ４Ｈ９０９３Ｐ−６−ＮＶＨ２）、２
４７及び１２２（例えばＨ４Ｈ９０９２Ｐ−１−ＮＶＨ３）、１１４及び２４９（例えばＨ４Ｈ９０９２Ｐ−２−ＮＶＫ３）、１１４及び２５１（例えばＨ４Ｈ９０９２Ｐ−３−ＣＶＫ３）、２５３及び２６（例えばＨ４Ｈ９２０９Ｎ−１−ＮＶＨ０）、２５５及び２６（例えばＨ４Ｈ９２０９Ｎ−２−ＮＶＨ１）、２５７及び２６（例えばＨ４Ｈ９２０９Ｎ−３−ＮＶＨ２）、２５９及び２６（例えばＨ４Ｈ９２０９Ｎ−４−ＮＶＨ３）、２７４及び１３８（例えばＨ４Ｈ９０９３Ｐ−ＡＰＮ９−（Ｇ４Ｓ）３）、２７５及び１３８（例えばＨ４Ｈ９０９３Ｐ−ＡＰＮ１０−（Ｇ４Ｓ）３）、２７６及び１３８（例えばＨ４Ｈ９０９３Ｐ−ＡＰＮ１１−（Ｇ４Ｓ）３）、２７７及び１３８（例えばＨ４Ｈ９０９３Ｐ−ＡＰＮ１１＋Ｓ−（Ｇ４Ｓ）３）、２７８及び１３８（例えばＨ４Ｈ９０９３Ｐ−ＡＰＮＶ５−１１−（Ｇ４Ｓ）３）、２７９及び２６（例えばＨ４Ｈ９２０９Ｎ−ＡＰＮ９−（Ｇ４Ｓ）３）、２８０及び２６（例えばＨ４Ｈ９２０９Ｎ−ＡＰＮ１０−（Ｇ４Ｓ）３）、２８１及び２６（例えばＨ４Ｈ９２０９Ｎ−ＡＰＮ１１−（Ｇ４Ｓ）３）、または２８２及び２６（例えばＨ４Ｈ９２０９Ｎ−ＡＰＮ１１＋Ｓ−（Ｇ４Ｓ）３）からなる群から選択される重鎖及び軽鎖のアミノ酸対をコードする核酸分子を含む。
他の実施形態によれば、本発明は、一緒に抗体融合タンパク質をコードする第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドを提供する。本発明はさらに、一緒に抗体融合タンパク質コードする第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。いくつかの実施形態では、第１及び第２ポリヌクレオチドは、細胞中の同じ核酸分子または異なる核酸分子の一部である。
ある特定の実施例では、第１ポリヌクレオチドは、（ｉ）配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、及び２１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに、（ｉｉ）配列番号２２７のアミノ酸配列を有するプレプロアペリンポリペプチドの断片または類似体であるアペリンペプチド、を含むポリペプチドをコードし；及び第２ポリヌクレオチドは、配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、及び２１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含むポリペプチドをコードする。
他の実施形態では、第１ポリヌクレオチドは、配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、及び２１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含むポリペプチドをコードし、第２ポリヌクレオチドは、（ｉ）配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、及び２１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、並びに、（ｉｉ）配列番号２２７のアミノ酸配列を有するプレプロアペリンポリペプチドの断片または類似体であるアペリンペプチドを含むポリペプチドをコードする。
本発明は、修飾グリコシル化パターンを有する抗ＡＰＬＮＲ抗体及び抗体融合タンパク質を含む。いくつかの用途において、望ましくないグリコシル化部位を除去するための修飾が有用であることができ、または、オリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を欠く抗体は、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を高めるために有用であることができる（Ｓｈｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，２００２，ＪＢＣ ２７７：２６７３３参照）。他の用途
では、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を改変するためにガラクトシル化の修飾を行うことができる。
別の態様では、本発明は、ＡＰＬＮＲに特異的に結合する組換えヒト抗体、抗体融合タンパク質またはその断片及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。関連する態様では、本発明は、抗ＡＰＬＮＲ抗体または抗体融合タンパク質と第２の治療薬と
の組合せである組成物を特徴とする。一実施形態では、第２の治療薬は、抗ＡＰＬＮＲ抗体または抗体融合タンパク質と有利に組合せられる任意の薬剤である。抗ＡＰＬＮＲ抗体と有利に組合せることができる例示的な薬剤は、限定なく、ＡＰＬＮＲ活性を阻害する他の薬剤（他の抗体またはその抗原結合断片、融合タンパク質、ペプチドアゴニストまたはアンタゴニスト、小分子、などを含む）、及び／またはＡＰＬＮＲに直接結合しないが、それにもかかわらず、ＡＰＬＮＲ媒介シグナル伝達を妨害し、ブロックしまたは減衰させる薬剤を含む。抗体融合タンパク質と有利に組合せることができる例示的な薬剤は、限定なく、ＡＰＬＮＲ活性を活性化する他の薬剤（他の融合タンパク質、抗体またはその抗原結合断片、ペプチドアゴニストまたはアンタゴニスト、小分子、などを含む）、及び／またはＡＰＬＮＲシグナル伝達または下流の細胞効果を活性化する薬剤を含む。本発明の抗体及び抗体融合タンパク質を含む追加の併用療法及び共製剤は、本明細書の他の個所に開示される。従って、医薬組成物は、本発明に従って、任意の１つまたは複数の抗体、抗体融合タンパク質またはその抗原結合断片を含んで提供される。
さらに別の態様では、本発明は、本発明のＡＰＬＮＲモジュレーターを使用してＡＰＬＮＲ活性を阻害するための治療方法を提供し、ここで該治療方法は、本発明の抗体、抗体融合タンパク質または抗体の抗原結合断片を含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む。治療される障害は、ＡＰＬＮＲ活性またはシグナル伝達の除去、阻害または低減によって改善され、改良され、阻害されまたは防止される任意の疾患または病態である。本発明の抗ＡＰＬＮＲ抗体、抗体融合タンパク質または抗体断片は、ＡＰＬＮＲとＡＰＬＮＲ結合パートナー（例えば、アペリンペプチドなどのＡＰＬＮＲ受容体リガンド）との間の相互作用をブロックするように機能するか、または別の方法でＡＰＬＮＲのシグナル伝達活性を阻害する。
さらに別の態様では、本発明は、本発明のＡＰＬＮＲモジュレーターを使用してＡＰＬＮＲ活性を活性化するための治療方法を提供し、ここで該治療方法は、本発明の抗体、抗体融合タンパク質またはその抗原結合断片を含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む。治療される障害は、ＡＰＬＮＲ活性またはシグナル伝達の活性化、刺激または増幅によって改善され、改良され、阻害されまたは防止される任意の疾患または病態である。本発明の抗ＡＰＬＮＲ抗体、抗体融合タンパク質または抗体断片は、ＡＰＬＮＲとＡＰＬＮＲ結合パートナー（例えば、アペリンペプチドなどのＡＰＬＮＲ受容体リガンド）との間の相互作用を強化するように機能し得るか、または別の方法でＡＰＬＮＲのシグナル伝達活性を活性化するかまたは増強し得る。
本発明は、患者におけるＡＰＬＮＲ活性に関連したまたはそれによって引起される疾患または障害の治療のための医薬の製造における、本発明の抗ＡＰＬＮＲ抗体、抗体融合タンパク質または抗体の抗原結合部分の使用も含む。本発明はさらに、心臓血管疾患、急性非代償性心不全、鬱血性心不全、心筋梗塞、心筋症、虚血、虚血／再灌流傷害、肺高血圧症、糖尿病、神経損傷、神経変性、のぼせ症状、体液ホメオスタシス、ＨＩＶ感染症、肥満、癌、転移性疾患、網膜症、線維症、及び病的血管新生からなる群から選択される疾患または障害などの、患者におけるＡＰＬＮＲ活性に関連したまたはそれによって引起される疾患または障害の治療のための医薬の製造において使用するための抗体組成物を提供する。
本発明はさらに、心臓血管疾患、急性非代償性心不全、鬱血性心不全、心筋梗塞、心筋症、虚血、虚血／再灌流傷害、肺高血圧症、糖尿病、神経損傷、神経変性、のぼせ症状、体液ホメオスタシス、ＨＩＶ感染症、肥満、癌、転移性疾患、網膜症、線維症、または病的血管新生を治療する方法を提供し、該方法は、それを必要とする対象に、本発明に係る任意の抗体、抗体融合タンパク質またはその抗原結合断片を含む医薬組成物を投与することを含む。
他の実施形態は、以下の詳細な説明の閲覧から明らかになるであろう。
ＲＶＤモデルにおける抗ＡＰＬＮＲ抗体の効果の統計解析を示す。アンタゴニスト抗ＡＰＬＮＲ抗体、Ｈ２ａＭ９２３２Ｎは、発生中のマウス網膜における対照（ｈＦｃ）と比較して、網膜血管の成長で約３０％の統計的に有意な平均減少を生じ、ＡＰＬＮＲブロックが有意な抗血管新生効果を有することを示した（＊＊ｐ＜０．００５；両側ｐ値＝０．００１４；ｔ＝４．１２３、ｄｆ＝１２）。 切断されたアペリン融合抗体、Ｈ４Ｈ９２０９Ｎ−ＡＰＮ１１−（Ｇ４Ｓ）３（図２Ａ）またはＨ４Ｈ９２０９Ｎ−ＡＰＮ１１＋Ｓ−（Ｇ４Ｓ）３（図２Ｂ）の血清に０、６及び２４時間暴露した後の質量分析の無傷のアペリンペプチドのピークのパターンを描いている。対象のペプチドは、血清曝露後の融合抗体のＬｙｓ−Ｃ消化の後、ＱＲＰＲＬＳＨＫの配列を有し、１００４における質量電荷比のピークを報告している。アペリン−ｃｔｅｒ１１融合抗体は、血清暴露２４時間後に残留アペリンピークを有する。 ０、６及び２４時間の時点でβ−アレスチン活性アッセイ（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ βアレスチン活性アッセイ））において希釈した血清に暴露したアペリン−抗体融合物（Ｈ４Ｈ９０９３Ｐ−３−ＮＶＨ３、Ｈ４Ｈ９２０９Ｎ−ＡＰＮ１１−（Ｇ４Ｓ）３、またはＨ４Ｈ９２０９Ｎ−ＡＰＮ１１＋Ｓ−（Ｇ４Ｓ）３）の活性を示す。アペリン−Ｃｔｅｒ１１及びアペリン−Ｃｔｅｒ１１＋Ｓを有する抗体融合物は、それらのＣ末端で、血清暴露後６時間にβアレスチン活性を保持する。６時間の時点の値は、０時間の時点に対するパーセント活性化、すなわち、Ｈ４Ｈ９０９３Ｐ−３−ＮＶＨ３、Ｈ４Ｈ９２０９Ｎ−ＡＰＮ１１−（Ｇ４Ｓ）３、またはＨ４Ｈ９２０９Ｎ−ＡＰＮ１１＋Ｓ−（Ｇ４Ｓ）３、に対してそれぞれ２．４％、７０．４％及び３３．６％を表す。
本発明を説明する前に、本発明は、特定の方法及び実験条件は変化し得るので、それらに限定されるものではないということが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためのものであり、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。
別途定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、一般的に、本発明が属する技術分野の当業者によって理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、用語「約」は、特定の列挙数値に関して使用される場合、その値が列挙された値から１％以下だけ変化し得ることを意味する。例えば、本明細書で使用される場合、表現「約１００」は、９９及び１０１及びそれらの間のすべての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、など）を含む。
本明細書に記載のものと同様または同等の任意の方法及び材料が本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料は以下に記載される。本明細書で言及される全ての特許、出願及び非特許刊行物は、その全体が参照により本明細書に組込まれる。
定義
表現「アペリン受容体」、「ＡＰＬＮＲ」、「ＡＰＪ受容体」などは、本明細書で使用される場合、配列番号２２５のアミノ酸配列、または配列番号２２５と実質的に類似のアミノ酸配列を有するヒトＡＰＬＮＲタンパク質を指す。本明細書におけるタンパク質、ポリペプチド及びタンパク質断片へのすべての参照は、明示的に非ヒト種（例えば、「マウスＡＰＬＮＲ」、「サルＡＰＬＮＲ」、など）由来のものであるとして指定されなければ
、それぞれのタンパク質、ポリペプチドまたはタンパク質断片のヒトバージョンを指すように意図される。
本明細書で使用される場合、「ＡＰＬＮＲに結合する抗体または抗体融合タンパク質」または「抗ＡＰＬＮＲ抗体」は、ＡＰＬＮＲタンパク質の可溶性断片に結合する免疫グロブリン分子、抗体、抗体融合タンパク質及びその抗原結合断片を含む。可溶性ＡＰＬＮＲ分子は、天然ＡＰＬＮＲタンパク質並びに例えば、単量体及び二量体のＡＰＬＮＲ構築物などの組換えＡＰＬＮＲタンパク質変異体を含む。
用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、４つすべてがジスルフィド結合によって相互に連結することができる、一対の軽（Ｌ）鎖及び一対の重（Ｈ）鎖の、二組のポリペプチド鎖からなる構造的に関連する糖タンパク質のクラスを指す。免疫グロブリンの構造は十分に特徴付けられている。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））参照。本発明のタンパク質は、任意の免疫グロブリン領域またはドメインに由来するものなど、免疫グロブリン分子に由来し得るアミノ酸配列を含む。
用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、特定の抗原（例えば、ＡＰＬＮＲ）に特異的に結合するか、またはそれと相互作用する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む任意の抗原結合分子または分子複合体を意味する。用語「抗体」は、本明細書に記載されるように、ジスルフィド結合によって相互に連結された２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖の４つのポリペプチド鎖を含む免疫グロブリン分子、並びにその多量体（例えば、ＩｇＭ）、並びに１つまたは複数の重鎖の断片または１つまたは複数の軽鎖の断片、（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２またはｓｃＦｖ断片）、を含む免疫グロブリン分子、を包含する。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略す）と重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略す）と軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ及びＶＬ領域はさらに、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に細別することができる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ以下の順序で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。本発明の異なる実施形態では、抗ＡＰＬＮＲ抗体（またはその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖細胞系列配列と同一であってもよく、または天然にもしくは人工的に修飾されてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの比較分析に基づいて定義され得る。
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は完全抗体分子の抗原結合断片も含む。抗体の「抗原結合部分」、または抗体の「抗原結合断片」などの用語は、本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然に存在する、酵素的に得られる、合成、もしくは遺伝子操作されたポリペプチド、または糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合断片は、例えば、抗体可変ドメイン及び任意選択で定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現を伴う、タンパク質分解消化、または組み換え遺伝子操作技術などの、任意の適切な標準的技術を用いて、完全な抗体分子から誘導され得る。そのようなＤＮＡは公知であり、及び／もしくは、例えば、市販の供給源、ＤＮＡライブラリー（たとえば、ファージ−抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であるか、または合成することができる。ＤＮＡは、化学的に、または例えば、１つまたは複数の可変及び／もしくは定常ドメインを適切な構造に配置させるか、またはコドンを導入し、システイン残基を作製し、アミノ酸を修飾、付加、もしくは欠失等させる分子生物学技術を用いることによって配列決定され及び操作され得る。そのような技術は、完全抗体分子由来の抗原結合断片を含む任意の抗体融合分子を合成するのにも使用することができる。
抗原結合断片の非制限的な例には以下が含まれる：（ｉ）Ｆａｂ断片：（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）Ｆｄ断片；（ｉｖ）Ｆｖ断片；（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂ断片；及び（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））を模倣するアミノ酸残基または拘束されたＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチドからなる最小認識単位。ドメイン特異的抗体、シングルドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価のナノボディ、二価のナノボディ、など）、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、及びサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどの他の操作される分子も、本明細書において使用される場合、「抗原結合断片」という表現に包含される。
抗体の抗原結合断片は、典型的には、少なくとも１つの可変ドメインを含むであろう。可変ドメインは、任意の大きさまたはアミノ酸組成のドメインであることができ、一般的に、１つまたは複数のフレームワーク配列に隣接するかまたはそれとともにフレーム内にある少なくとも１つのＣＤＲを含むであろう。ＶＬドメインに結合したＶＨドメインを有する抗原結合断片において、ＶＨ及びＶＬドメインは、任意の適切な配置で互いに対して配置され得る。例えば、可変領域は二量体であって、ＶＨ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬ、またはＶＬ−ＶＬ二量体を含み得る。あるいは、抗体の抗原結合断片は、単量体のＶＨまたはＶＬドメインを含み得る。
ある特定の実施形態では、抗体の抗原結合断片は、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合した少なくとも１つの可変ドメインを含み得る。本発明の抗体の抗原結合断片内で見出され得る可変及び定常ドメインの非限定的な例示的な構造には、以下が含まれる：（ｉ）ＶＨ−ＣＨ１；（ｉｉ）ＶＨ−ＣＨ２；（ｉｉｉ）ＶＨ−ＣＨ３；（ｉｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２；（ｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｖｉ）ＶＨ−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｖｉｉ）ＶＨ−ＣＬ；（ｖｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１；（ｉｘ）ＶＬ−ＣＨ２；（ｘ）ＶＬ−ＣＨ３；（ｘｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２；（ｘｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｘｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ２−ＣＨ３；及び（ｘｉｖ）ＶＬ−ＣＬ。上記の例示的な構成の任意のものを含む可変及び定常ドメインの任意の構成において、可変及び定常ドメインは、互いに直接連結され得るか、または完全もしくは部分的なヒンジもしくはリンカー領域によって連結され得る。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子において隣接する可変ドメイン及び／または定常ドメインの間に柔軟なまたは半分柔軟な連結をもたらす、少なくとも２個（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０個以上）のアミノ酸からなり得る。さらに、本発明の抗体の抗原結合断片は、互いに及び／または１つまたは複数の単量体ＶＨまたはＶＬドメインと非共有結合した（例えば、ジスルフィド結合によって）、上記の可変及び定常ドメイン構成の任意のもののホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含み得る。
完全な抗体分子と同様に、抗原結合断片は、単特異性または多重特異性（例えば、二重特異性）であり得る。抗体の多重特異性抗原結合断片は、典型的には、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含むであろうが、ここにおいて各可変ドメインは、別個の抗原または同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することができる。本明細書に開示される例示的な二重特異性抗体フォーマットを含む任意の多重特異性抗体フォーマットは、当技術分野で利用可能な所定の技術を用いて、本発明の抗体の抗原結合断片との関連で使用するために適合させることができる。
語句「抗体融合タンパク質」は、本明細書に記載されるように、抗体または抗原結合断片を含むように操作された本発明の抗体に由来する組換えポリペプチド及びタンパク質を含む。例えば、「抗体−アペリン融合タンパク質」は、アペリンペプチドまたは類似体の
アミノ酸配列に融合した抗ＡＰＬＮＲ抗体由来のアミノ酸配列を含むキメラタンパク質を含む。アペリンペプチド成分は、ペプチドリンカーありまたはなしで、抗体の軽鎖または重鎖のＮ末端またはＣ末端のいずれかにおいて抗ＡＰＬＮＲ抗体または抗原結合断片に融合させることができる。語句「融合させた」は、本明細書で使用される場合、２つの遺伝子が１つの連続したポリペプチドをコードするように、複数の配列を組合せることによって作製されるキメラ遺伝子の発現によって、典型的には第２の遺伝子を有するフレーム内の発現ベクターに１つの遺伝子をクローニングすることによって、形成されるポリペプチドを意味する（しかしこれには限定されない）。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び制限エンドヌクレアーゼクローニングなどの組換えクローニング技術は、当該技術分野において周知である。組換え技術によって作成されることに加えて、ポリペプチドの部分は、化学反応の手段、またはカスタムポリペプチドの産生のための当技術分野で公知の他の手段によって互いに「融合させる」ことができる。
いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質の成分またはアミノ酸は、リンカー（または「スペーサー」）ペプチドで分離されている。そのようなペプチドリンカーは、当該技術分野で周知であり（例えば、ポリグリシンまたはＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー）、一般的に抗体融合タンパク質の成分のうちの１つまたは両方の適切な折り畳みを可能にする。リンカーは、分子の２つの端部が独立して移動できるように、融合タンパク質の成分の柔軟な接合領域を提供し、２つの部分の適切な機能のそれぞれを保持するのに重要な役割を果し得る。従って、接合領域は、場合によって、２つの部分を結合するリンカー、及び２つの部分のそれぞれが独自の生物学的構造を形成し、他の部分と干渉しないことを可能にするスペーサーとして、両方の機能をする。さらに、接合領域は、対象の免疫システムにおいて異物として認識されない、言い換えると、免疫原性とみなされない、エピトープを作成する必要がある。リンカーの選択は、融合タンパク質の結合活性、従って生物活性にも影響を及ぼし得る。（Ｈｕｓｔｏｎ，ｅｔ ａｌ，１９８８，ＰＮＡＳ，８５：１６：５
８７９−８３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＆ Ｂａｔｅｓ，１９９８，ＰＮＡＳ ９５（１１）：
５９２９−３４；及びＡｒａｉ，ｅｔ ａｌ．２００１，ＰＥＤＳ，１４（８）：５２９
−３２；Ｃｈｅｎ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉ
ｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６５：１３５７-１３６９参照）。一実施形態では、アペリン
ペプチドは、１つまたは複数のペプチドリンカーを介して、抗体またはその抗原結合断片の軽鎖もしくは重鎖のＣ末端にもしくはＮ末端に連結される。
本発明の抗体及び抗体融合タンパク質は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して機能することができる。「補体依存性細胞傷害」（ＣＤＣ）は、補体の存在下で、本発明の抗体による抗原発現細胞の溶解を指す。「抗体依存性細胞媒介細胞傷害」（ＡＤＣＣ）は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が標的細胞上で結合した抗体を認識し、それによって標的細胞の溶解をもたらす、細胞媒介反応を指す。ＣＤＣ及びＡＤＣＣは、当該技術分野において周知であり、利用可能であるアッセイを用いて測定することができる。（例えば、米国特許第５，５００，３６２号及び同第５，８２１，３３７号、並びにＣｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ） ９５：６５２−６５６参照）。抗体ま
たは抗体融合タンパク質の定常領域は、補体を固定し、細胞依存性細胞傷害を媒介する抗体の能力において重要である。従って、抗体のアイソタイプは、抗体が、細胞傷害性を媒介することが望ましいかどうかに基づいて選択することができる。
別の態様では、抗体または抗体融合タンパク質は、抗体の所望の薬物動態学的特性に影響を与えることなく、通常のＦｃエフェクター機能のすべてまたは一部を活性化するか、または全く活性化しないように、そのＦｃドメインで操作することができる。従って、Ｆｃ受容体結合を改変した操作されたＦｃドメインを有する抗体または抗体融合タンパク質
は、副作用の低下を有し得る。従って、一実施形態では、タンパク質は、キメラまたは別の方法で修飾されたＦｃドメインを含む。キメラＦｃドメインの一例については、その全体が参照により本明細書に組込まれる２０１４年８月７日に公開されたＰＣＴ国際公開第ＷＯ／２０１４／１２１０８７Ａ１号参照。
本発明のある特定の実施形態では、本発明の抗ＡＰＬＮＲ抗体及び抗体融合タンパク質はヒト抗体である。用語「ヒト抗体」は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含むことを意図している。本発明のヒト抗体は、例えばＣＤＲにおいて及び特にＣＤＲ３において、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムまたは部位特異的変異誘発によって、またはインビボでの体細胞変異によって導入された変異）を含むことができる。しかしながら、用語「ヒト抗体」は、本明細書で使用される場合、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲがヒトフレームワーク配列にグラフトされている抗体を含むことを意図するものではない。
本発明の抗体及び抗体融合タンパク質は、いくつかの実施形態では、組換えヒト抗体であることができる。用語「組換えヒト抗体」は、本明細書で使用される場合、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現した抗体（以下にさらに記載される）、組換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体（以下にさらに記載される）、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５参照）、またはヒト免疫グロ
ブリン遺伝子配列から他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う任意の他の手段によって調製され、発現させられ、作成されもしくは単離された抗体、などの、組換え手段によって調製され、発現させられ、作成されもしくは単離されるすべてのヒト抗体及びその融合タンパク質を含むことを意図している。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有する。しかし、ある特定の実施形態では、そのような組換えヒト抗体は、インビトロ突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列に対してトランスジェニックである動物が使用される場合は、インビボ体細胞突然変異誘発）に供され、従って、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のＶＨ及びＶＬ配列に由来し関連するが、インビボでヒト生殖細胞系列レパートリー内に天然には存在することができない配列である。
ヒト抗体は、ヒンジ不均一性に関連している２つの形態で存在することができる。１つの形態では、免疫グロブリン分子は、二量体が鎖間重鎖ジスルフィド結合によって一緒に保持されている約１５０〜１６０ｋＤａの安定した四鎖構築物を含む。第２の形態では、二量体は、鎖間ジスルフィド結合を介して連結されておらず、約７５〜８０ｋＤａの分子が共有結合的に結合された軽鎖及び重鎖から構成されて形成される（半抗体）。これらの形態は、親和性精製の後でも、分離することは極めて困難であった。
様々な無傷のＩｇＧアイソタイプ中の第２の形態の出現頻度は、抗体のヒンジ領域のアイソタイプに関連した構造上の相違に起因するが、これらに限定されない。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域内の単一のアミノ酸置換は、第２の形態（Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３０：１０５）の出現を、ヒトＩｇＧ１ヒンジを使用して典型的に観察されるレベルへ有意に減少させることができる。本発明は、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３領域内に１つまたは複数の変異を有する抗体を包含するが、これは、例えば、製造において、所望の抗体形態の収率を改善するのに、望ましいことであり得る。
本発明の抗体及び抗体融合タンパク質は、単離された抗体であり得る。用語「単離され
た抗体」は、本明細書で使用される場合、その天然の環境の少なくとも１つの成分から識別及び分離及び／または回収された抗体を意味する。例えば、生物の少なくとも１つの成分から、あるいは抗体が天然に存在するもしくは天然に産生される組織または細胞から分離または除去された抗体は、本発明の目的のために「単離された抗体」である。単離された抗体は、組換え細胞内のその場の抗体も含む。単離された抗体は少なくとも１つの精製または単離ステップに供されている抗体である。ある特定の実施形態によれば、単離された抗体は、他の細胞物質及び／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。
本発明は、抗ＡＰＬＮＲ抗体及び抗体融合タンパク質を中性化及び／またはブロックすることを含む。「中性化」抗体または「ブロック」抗体は、本明細書で使用される場合、ＡＰＬＮＲへのその結合が：（ｉ）ＡＰＬＮＲまたはＡＰＬＮＲ断片とＡＰＬＮＲ受容体成分（例えば、アペリンペプチド、など）の間の相互作用を妨害する：及び／または（ｉｉ）ＡＰＬＮＲの少なくとも１つの生物学的機能の阻害をもたらす、抗体を指すことを意図している。ＡＰＬＮＲ中性化抗体またはブロック抗体によって引起される阻害は、それが適切なアッセイを用いて検出可能である限り、完全である必要はない。
用語「アンタゴニスト」は、本明細書で使用される場合、アゴニスト（例えば、内因性リガンド）と同じ部位または同じ部位の近傍で受容体に結合するが、典型的には受容体の活性形態によって開始される細胞内応答を活性化せず、従ってアゴニストまたは部分アゴニストによる細胞内応答を阻害または中性化する、部分を指す。いくつかのケースでは、アンタゴニストは、アゴニストまたは部分アゴニストの非存在下でベースライン細胞内応答を減少させない。アンタゴニストは、必ずしも競合的結合阻害剤として機能する必要はないが、アゴニストを隔離するか、または間接的に下流の効果を調節することによって動作し得る。
本発明は、ＡＰＬＮＲを活性化するが、アペリンペプチドなどのＡＰＬＮＲの完全アゴニストによって示される活性化より少ない程度に活性化する、抗ＡＰＬＮＲ抗体及び抗体融合タンパク質を含む。例えば、そのような「活性化」抗体は、本明細書で使用される場合、ＡＰＬＮＲへのその結合が：（ｉ）ＡＰＬＮＲまたはＡＰＬＮＲ断片とＡＰＬＮＲリガンド（例えば、アペリンペプチド、など）の間の相互作用を増強する；及び／または（ｉｉ）ＡＰＬＮＲの少なくとも１つの生物学的機能の活性化をもたらす、抗体を指すことを意図している。抗ＡＰＬＮＲによって引起される活性化は、それが適切なアッセイを用いて検出可能である限り、完全である必要はない。この目的のために、活性化抗体はＡＰＬＮＲの部分または逆アゴニストとして機能することができる。
用語「アゴニスト」は、本明細書で用いられる場合、受容体と相互作用して（直接または間接的に結合して）それを活性化し、内因性リガンドに結合した場合など、その受容体に特徴的な生理学的または薬理学的応答を開始する、部分を指す。例えば、ＡＰＬＮＲに結合すると、アペリンは、受容体を内在化する受容体を活性化する。ＡＰＬＮＲ−アペリン結合は、アデニル酸シクラーゼ活性を低下させ、従って細胞内のｃＡＭＰの蓄積を阻害するＡＰＬＮＲも活性化する。
用語「ＥＣ５０」または「ＥＣ５０」は、本明細書で使用される場合、半最大有効濃度を指し、これは、特定の暴露時間後のベースラインと最大値の中間で、応答、例えば、細胞応答を誘導するリガンドの濃度を含む。ＥＣ５０は、本質的に、その最大効果の５０％が観察されるリガンドの濃度を表わす。従って、細胞シグナル伝達に関して、ＥＣ５０値、すなわち半最大有効濃度値の減少とともに受容体活性の増加が観察される（より大きな応答を生成するためにより少ないリガンドが必要とされる）。
用語「ＩＣ５０」または「ＩＣ５０」は、本明細書で使用される場合、細胞応答の半最
大阻害濃度を指す。言い換えると、生物学的または生化学的受容体の機能の阻害における特定の部分（例えば、タンパク質、化合物または分子）の有効性の尺度であり、ここにおいてアッセイが所与の生物学的プロセスを阻害するのに必要なそのような部分の量を定量する。従って、細胞シグナル伝達に関して、ＩＣ５０値の減少とともにより大きな阻害活性が観察される。
ＡＰＬＮＲの活性化及び阻害の検出のための例示的なアッセイは、本明細書の使用実施例に記載される。
本明細書に開示される抗ＡＰＬＮＲ抗体及び抗体融合タンパク質は、抗体が由来する対応する生殖細胞系列配列と比較して、重鎖及び軽鎖可変ドメインのフレームワーク及び／またはＣＤＲ領域において、１つまたは複数のアミノ酸の置換、挿入及び／または欠失を含み得る。そのような変異は、本明細書に開示されたアミノ酸配列を、例えば、公共の抗体配列データベースから入手可能な生殖細胞系列と比較することによって、容易に確認することができる。本発明は、本明細書に開示された任意のアミノ酸配列に由来する抗体及びその抗原結合断片を含み、ここにおいて、１つもしくは複数のフレームワーク及び／もしくはＣＤＲ領域内の１つまたは複数のアミノ酸は、抗体が由来する生殖細胞系列配列の対応する残基に、または別のヒト生殖細胞系列配列の残基に、または対応する生殖細胞系列残基の保存的アミノ酸置換（そのような配列の変更は、本明細書において「生殖細胞系列変異」と総称される）に、変異する。当業者は、本明細書に開示された鎖及び軽鎖の可変領域配列で開始して、１つまたは複数の個々の生殖細胞系列変異またはその組合せを含む多数の抗体及び抗原結合断片を容易に生成することができる。ある特定の実施形態では、ＶＨ及び／またはＶＬドメイン内のすべてのフレームワーク及び／またはＣＤＲ残基が、抗体が由来する元の生殖細胞系列配列に見出される残基に復帰変異する。他の実施形態では、ある特定の残基のみ、例えば、ＦＲ１の最初の８個のアミノ酸内もしくはＦＲ４の最後の８個のアミノ酸内に見出される変異した残基のみ、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３内に見出される変異した残基のみが、元の生殖細胞系列配列に復帰変異する。他の実施形態では、１つまたは複数のフレームワーク及び／またはＣＤＲ残基が、異なる生殖細胞系列配列（すなわち、抗体が元々由来した生殖細胞系列配列と異なる生殖細胞系列配列）の対応する残基に変異する。さらに、本発明の抗体及び抗体融合タンパク質は、フレームワーク及び／またはＣＤＲ領域内の２つ以上の生殖細胞系列変異の任意の組合せを含むことができ、例えば、ここにおいてある特定の個々の残基は、元の生殖細胞系列配列とは異なるある特定の他の残基が維持されたまま、特定の生殖細胞系列配列の対応する残基に変異するか、または異なる生殖細胞系列配列の対応する残基に変異する。一旦得られると、１つまたは複数の生殖細胞系列変異を含む抗体及び抗体融合タンパク質及び抗原結合断片は、結合特異性の改善、結合親和性増加、（場合に応じて）アンタゴニストまたはアゴニストの生物学的特性改善または強化、免疫原性の低下、などの１つまたは複数の所望の特性について容易に試験することができる。この一般的方法で得られた抗体及び抗体融合タンパク質及び抗原結合断片は、本発明に包含される。
本発明は、１つまたは複数の保存的置換を有する本明細書に開示のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲアミノ酸配列の任意のものの変異体を含む抗ＡＰＬＮＲ抗体及び抗体融合タンパク質も含む。例えば、本発明は、本明細書に開示のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかに対して、例えば、１０個以下、８個以下、６個以下、４個以下、などの保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＡＰＬＮＲ抗体を含む。
用語「エピトープ」は、パラトープとして知られている抗体分子の可変領域内の特定の抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は、複数のエピトープを有することができる。従って、異なる抗体は、抗原上の異なる領域に結合することができ、異
なる生物学的効果を有することができる。エピトープは立体配座または線状のいずれかであり得る。立体配座エピトープは、線状ポリペプチド鎖の異なるセグメントから空間的に並置されたアミノ酸によって生成される。線状エピトープは、ポリペプチド鎖において隣接するアミノ酸残基によって生成されるものである。ある特定の状況では、エピトープは、抗原上の糖の部分、ホスホリル基、またはスルホニル基を含み得る。
核酸またはその断片に言及する場合、用語「実質的同一性」または「実質的に同一」は、別の核酸（またはその相補鎖）との適切なヌクレオチド挿入または欠失によって最適に配列させた場合、以下に考察されるように、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐなどの配列同一性の任意の周知のアルゴリズムによって測定されるとき、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％、のヌクレオチド配列同一性が存在するということを示す。参照核酸分子と実質的な同一性を有する核酸分子は、ある特定の場合において、参照核酸分子によってコードされるポリペプチドと同一または実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
ポリペプチドに適用される場合、用語「実質的な類似性」または「実質的に類似」は、２つのペプチド配列が、デフォルトギャップウェイトを使用してプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによるなど、最適に整列した場合に、少なくとも９５％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％または９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基で置換されているものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変えない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、パーセント配列同一性または類似性の程度は、置換の保存的性質を補正するように上向きに調整され得る。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、参照により本明細書に組込まれる、Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９４，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１参照。類似の化学
的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の基の例には、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；（２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリン及びトレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン；（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、及びヒスチジン；（６）酸性側鎖：アスパラギン酸及びグルタミン酸、及び（７）システイン及びメチオニンである硫黄含有側鎖、が含まれる。好ましい保存的アミノ酸置換基は以下である：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、及びアスパラギン−グルタミン。あるいは、保存的置換は、参照により本明細書に組込まれるＧｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３−１４４５に開示され
ているＰＡＭ２５０対数尤度行列において正の値を有する任意の変更である。「中程度に保存的な」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度行列において負でない値を有する任意の変更である。
配列同一性とも呼ばれる、ポリペプチドの配列類似性は、典型的には配列解析ソフトウェアを用いて測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失、及び他の修飾に割り当てられる類似性の尺度を用いて、類似した配列を一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアはＧａｐ及びＢｅｓｔｆｉｔなどのプログラムを含み、これは、生物の異なる種に由来する相同性ポリペプチドなどの密接に関連したポリペプチド間の、または野生型タンパク質とその突然変異タンパク質の間の配列相同性または配列同一性を決定するためにデフォルトパラメーターとともに使用することができる。例えば、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１参照。ポリペプチド配列は、ＧＣＧ Ｖｅｒｓ
ｉｏｎ ６．１のプログラムである、デフォルトまたは推奨パラメーターを使用するＦＡ
ＳＴＡを用いて比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、クエリと検索の配列の間で最もよく重なる領域のアラインメント及びパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９４、上記参照）。本発明の配列を、異なる生物由来の多数の配列を含むデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメーターを使用するコンピュータープログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−４０２参照、それぞれ、参照により本明細書に組入れられる。
ＡＰＬＮＲモジュレーターの生物学的特性
本発明は、ヒトＡＰＬＮＲと結合し、ＡＰＬＮＲ媒介シグナル伝達を阻害するかまたは減衰させる抗ＡＰＬＮＲ抗体及びその抗原結合断片を含む。抗ＡＰＬＮＲは、例えば、抗体が以下からなる群から選択される１つまたは複数の特性を示す場合、「ＡＰＬＮＲ媒介シグナル伝達を阻害するかまたは減衰させる」とみなされる：（１）ｃＡＭＰの蓄積の増加など、細胞ベースのバイオアッセイにおけるＡＰＬＮＲ媒介シグナル伝達の阻害；（２）ＥＲＫのＡＰＬＮＲ誘導リン酸化の阻害；（３）内在化のブロックを含む、ＡＰＬＮＲ媒介βアレスチン相互作用の阻害。
本発明は、ヒトＡＰＬＮＲと結合し、ＡＰＬＮＲ媒介シグナル伝達を活性化させる抗体融合タンパク質を含む。抗体融合タンパク質は、例えば、抗体が以下からなる群から選択される１つまたは複数の特性を示す場合、「ＡＰＬＮＲ媒介シグナル伝達を活性化させる」とみなされる：（１）ｃＡＭＰの阻害など、細胞ベースのバイオアッセイにおけるＡＰＬＮＲ媒介シグナル伝達の活性化または検出；（２）ＥＲＫのＡＰＬＮＲ誘導リン酸化の活性化；（３）内在化のブロックを含む、ＡＰＬＮＲ媒介βアレスチン相互作用の活性化。
細胞ベースのバイオアッセイにおけるＡＰＬＮＲ媒介シグナル伝達の阻害または活性化は、抗ＡＰＬＮＲ抗体、抗体融合タンパク質またはその抗原結合断片が、例えば、本明細書に記載のアッセイフォーマット、またはＡＰＬＮＲ細胞シグナル伝達を測定するための実質的に類似のアッセイを使用して、ＡＰＬＮＲ受容体及びＡＰＬＮＲ結合に応答して検出可能なシグナルを生じるレポーター要素を発現する細胞において生成されるシグナルを修飾することを意味する。ＡＰＬＮＲはＧタンパク質共役受容体、具体的にはＧｉ／ｏ共役受容体であり、一方、受容体の刺激はアデニル酸シクラーゼ活性の阻害をもたらし、これは次いでサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）または他の細胞シグナル伝達のイベントの蓄積をもたらす。
例えば、本発明は、例えば、本明細書の実施例５、８、９、または１１で定義されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して、細胞ベースのブロックまたは阻害バイオアッセイで測定した場合、約２０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約９００ｐＭ未満、約８００ｐＭ未満、約７００ｐＭ未満、約６００ｐＭ未満、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、約３５０ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２５０ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１５０ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約９０ＰＭ未満、約８０ｐＭ未満、約７０未満ＰＭ、約６０未満ＰＭ、約５０ｐＭ未満約４０ｐＭ未満、約３０ｐＭ未満、約２０ｐＭ未満、または約１０ｐＭ未満のＩＣ５０で、ヒトＡＰＬＮＲを発現する細胞においてアペリン媒介シグナル伝達をブロックまたは阻害するそのＡＰＬＮＲモジュレーターを含む。
トランスフェクトした細胞におけるＡＰＬＮＲ誘導リン酸化ＥＲＫ１／２（ｐＥＲＫアッセイ）の阻害は、例えば、実施例６または１０のアッセイシステム、または実質的に類
似のアッセイを使用して測定した場合、ＡＰＬＮＲモジュレーターは、ヒトアペリンの存在下でヒトＡＰＬＮＲを発現する細胞中のｐＥＲＫ１／２対全ＥＲＫの比率を阻害するかまたは減少させることを意味する。例えば、本発明は、例えば、本明細書の実施例６または１０で定義されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して、ＡＰＬＮＲ誘導ｐＥＲＫアッセイで測定した場合、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約９００ｐＭ未満，約８００ｐＭ未満、約７００ｐＭ未満、約６００ｐＭ未満、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満または約３００ｐＭ未満のＩＣ５０で、アペリンの存在下で、ｐＥＲＫのＡＰＬＮＲ媒介比率を阻害するＡＰＬＮＲモジュレーターを含む。
しかし、他の実施形態では、本発明のある特定のＡＰＬＮＲモジュレーターは、ＡＰＬＮＲ媒介シグナル伝達を阻害するかまたは減衰させる能力を有するにもかかわらず、ＡＰＬＮＲとアペリンの相互作用をブロックしないかまたは部分的にのみブロックする。そのような抗体、抗体融合タンパク質及びその抗原結合断片は、「間接ブロッカー」と呼ぶことができる。理論によって拘束されることなく、本発明の間接ブロッカーは、ＡＰＬＮＲのＮ末端リガンド結合ドメインと、重なる、または部分的にのみ重なるエピトープでＡＰＬＮＲに結合することによって機能するが、それにもかかわらず、ＡＰＬＮＲ／アペリン相互作用を直接ブロックすることなくＡＰＬＮＲ媒介シグナル伝達を妨害すると考えられる。
別の実施形態では、ＡＰＬＮＲモジュレーターは、部分アゴニストまたは逆アゴニストである。完全アゴニストは、最大程度まで受容体を活性化する。完全アゴニストよりも低い効果を有する化合物は、シグナル変換を刺激するが、完全アゴニストより少ない程度であるので、部分アゴニストと呼ばれる。逆アゴニストは、受容体に結合すると、測定可能または検出可能なシグナルのベースレベルを低下させ、内因性活性を妨害またはブロックすることを示す。言い換えると、いくつかの逆アゴニストは、構成的活性を阻害することにより、ある特定の受容体の活性を低下させる。
ある特定の実施形態では、本発明は、例えば、本明細書の実施例５、８、９、または１１で定義されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して、細胞ベースのＡＰＬＮＲ活性化バイオアッセイで測定した場合、約１００ｎＭ未満、約７５ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約９００ｐＭ未満、約８００ｐＭ未満、約７００ｐＭ未満、約６００ｐＭ未満、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、約３５０ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２５０ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１５０ＰＭ未満、約１００ｐＭ未満、約９０ｐＭ未満、約８０ｐＭ未満、約７０ｐＭ未満、約６０ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、約４０ｐＭ未満、約３０ｐＭ未満、約２０ｐＭ未満、または約１０ｐＭ未満のＥＣ５０で、ヒトＡＰＬＮＲを発現する細胞においてシグナル伝達を活性化するかまたは増加させるそのＡＰＬＮＲモジュレーターを含む。
トランスフェクトした細胞におけるＡＰＬＮＲ媒介リン酸化ＥＲＫ１／２（ｐＥＲＫ）の活性化は、例えば、実施例６または１０のアッセイシステム、または実質的に類似のアッセイを使用して測定した場合、ＡＰＬＮＲモジュレーターは、ヒトＡＰＬＮＲを発現する細胞中のｐＥＲＫ１／２対全ＥＲＫの比率を増加させることを意味する。例えば、本発明は、例えば、本明細書の実施例６または１０で定義されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して、ＡＰＬＮＲ誘導ｐＥＲＫアッセイで測定した場合、約１００ｎＭ未満、約７５ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約９００ｐＭ未満，約８００ｐＭ未満、約７００ｐＭ未満、約６００ｐＭ未満、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満または約３００ｐＭ未満のＥＣ５０で、アペリンの存在下で、ｐＥＲＫのＡＰ
ＬＮＲ媒介比率を増加させるＡＰＬＮＲモジュレーターを含む。
本発明は、高い親和性及び／または特異性で可溶性ＡＰＬＮＲ分子と結合するＡＰＬＮＲモジュレーターを含む。例えば、本発明は、例えば、本明細書の実施例４で定義されるアッセイフォーマットを使用して、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）アッセイによって測定した場合、約２０超の結合比でＡＰＬＮＲと結合する抗体及び抗体の抗原結合断片を含む。ある特定の実施形態では、例えば、ＦＡＣＳ、または実質的に類似のアッセイによって測定した場合、本発明の抗体または抗原結合断片は、約１５超、約２０超、約１００超、約２００超、約３００超、約４００超、約５００超、約１０００超、約１５００超、または約２０００超の結合比でＡＰＬＮＲと結合する。
本発明は、例えば、周知のＢＩＡｃｏｒｅ（商標）アッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して、２５℃または３７℃で表面プラズモン共鳴によって測定した場合、約１０分超の解離半減期（ｔ１／２）でＡＰＬＮＲに特異的に結合する抗ＡＰＬＮＲ抗体及びその抗原結合断片も含む。
本発明の抗体は、上記の生物学的特性の1つまたは複数、またはそれらの任意の組合せ
を有することができる。本発明の抗体の他の生物学的特徴は、本明細書の使用実施例を含む本開示の閲覧から、当業者には明らかであろう。
受容体アッセイ
ＡＰＬＮＲなどの、Ｇｉ／ｏ共役受容体の細胞シグナル伝達経路は、様々なバイオアッセイによって測定され得る。ＥＲＫ１／２のリン酸化は、Ｇｉ／ｏ共役ＧＰＣＲの活性化の直接的な生理学的、機能的な読み出しを提供する。Ｇｉ／ｏ共役ＧＰＣＲの活性化の一般的な試験方法は、細胞内に蓄積するｃＡＭＰレベルのフォルスコリン刺激の減少の測定を必要とするアデニル酸シクラーゼ活性の阻害である。
活性化Ｇｉ／ｏ共役受容体の活性化は、ＧαサブユニットＧｉまたはＧｏを介して、アデニル酸シクラーゼ活性の減少、従って細胞内のｃＡＭＰの阻害をもたらす。阻害シグナルを最大にするために、フォルスコリン（アデニル酸シクラーゼの直接的活性化剤）が、アッセイにおけるアデニリルシクラーゼ、従ってｃＡＭＰを刺激するのに典型的に利用され、それによって阻害シグナルをより容易に検出可能にする。細胞内ｃＡＭＰの蓄積を測定するのに、Ｒａｄｉｏｍｅｔｒｉｃ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＳＰＡ（商標）（Ｐ
ｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）及びＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｆｌａｓｈ−Ｐｌａｔｅ（商標）ｃＡＭＰ アッセイ、並びに蛍光または発光に基づく均質アッセイ（例えば
、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）、ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ ＨｉｔＨｕｎｔｅｒ（商標）（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ）、及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｄｅｖｉｃｅｓ ＦＬＩＰＲ（登録商標）（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ））が利
用可能である
［３５Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイは、Ｇｉ／ｏが、ほとんどの細胞中で最も豊富なＧタンパク質であり、他のＧタンパク質よりも速いＧＤＰ−ＧＴＰ交換レートを持っているので、Ｇｉ／ｏ共役受容体には一般的に有用である（Ｍｉｌｌｉｇａｎ Ｇ．，２００３，Ｔ
ｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ，２００３，２４：８７−９０）。ＡＰＬＮＲ媒介グアニンヌクレオチド交換は、ＡＰＬＮＲを発現する細胞から調製された原形質膜への［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの結合を測定することによってモニターされる。市販のシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ（商標））キットは、所望の［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合αサブユニット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）の測定を可能にする。
ｃＡＭＰレベルを調節するＧＰＣＲの作用は、ＡＰＬＮＲのように、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）によって細胞内ルシフェラーゼ転写に関連し得る。ＣＲＥ−ｌｕｃ構築物（ＣＲＥ応答性ルシフェラーゼ）は、ＣＲＥ転写応答エレメント（ＴＲＥ）のプロモーター及びタンデムリピートの制御下でルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードする。受容体の活性化に続いて、細胞内ｃＡＭＰの蓄積は、化学発光検出試薬の添加後、細胞内で発現したルシフェラーゼの量によって測定される。ＡＰＬＮＲ、及び他のＧｉ共役受容体については、フォルスコリンがｃＡＭＰを誘導するために添加され、ＣＲＥ活性（化学発光）の低下は、ＧＰＣＲの活性化を示す。様々な市販のキットが、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）、ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｑｉａｇｅｎ社、Ｖａｌ
ｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）、などから、入手可能である。
リン酸化ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）は、ＡＰＬＮＲ活性化を決定するためにＡＰＬＮＲ受容体を発現する細胞からの細胞溶解物で測定することができる。内因性細胞外シグナル調節キナーゼ１及び２（ＥＲＫ１及びＥＲＫ２）は、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼの保存ファミリーに属し、様々な刺激に関連する細胞シグナル伝達イベントに関与している。ＥＲＫタンパク質のキナーゼ活性は、ＥＲＫ１のスレオニン２０２／チロシン２０４、及びＥＲＫ２のスレオニン１８５／チロシン１８７で、二重リン酸化によって調節される。ＭＥＫ１及びＭＥＫ２は、この経路においてＥＲＫ１／２の原因となる主要な上流キナーゼである。ＥＲＫ１／２の多くの下流の標的は、他のキナーゼ、及び転写因子を含んで、識別されている。一実施例では、ｐＥＲＫ１／２アッセイは、組換えまたは内因性受容体を発現する細胞培養物の細胞溶解物中のＥＲＫ１の特異的リン酸化を測定するための、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法を利用する。別の実施例では、ｐＥＲＫ１／２アッセイは、ＥＲＫ１のリン酸化Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４またはＥＲＫ２のリン−Ｔｈｒ１８５／Ｔｙｒ１８７を認識する一次（非結合）抗体、及び一時抗体を認識する二次結合抗体を使用するが、二次結合ｍＡｂは、外因的に添加した基質と反応する複合体などの検出方法を提供する。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）ＳｕｒｅＦｉｒｅ（商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）など
、様々な市販キットが利用可能である。
いくつかの例では、受容体に結合するアゴニストは、Ｇタンパク質媒介シグナル伝達をトリガーすることなく、アレスチン媒介シグナル伝達を開始することができるか、またはＧタンパク質媒介シグナル伝達を遅らせることができる。細胞表面でのベータ−アレスチン（βアレスチン）のＧＰＣＲとの相互作用は、受容体に対してヘテロ三量体Ｇタンパク質を切り離し、他の細胞のシグナル伝達カスケードに導くことができる。βアレスチンは、ＥＲＫ経路のエンドサイトーシス及び活性化をトリガーすることが知られている。一実施例のアッセイでは、生物発光共鳴エネルギー移動すなわちＢＲＥＴが、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕ）に融合したＧＰＣＲの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に融合したβアレスチンとの相互作用を研究するために使用されてきた。この実施例では、ＢＲＥＴは、組換えの発現したＧＰＣＲ−ＲｌｕとβアレスチンＧＦＰ間のエネルギーの移動に、それらがルシフェラーゼ基質セレンテラジンの添加後に近接している場合、基づいており、従って、全細胞におけるこれらのタンパク質−タンパク質相互作用のリアルタイム評価の測定を可能にする。
βアレスチンの活性化ＧＰＣＲとの相互作用を検出することにより、ＧＰＣＲ活性を直接測定するＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）ＧＰＣＲアッセイ（ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ
Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ）などの、他のアッセイが開発されている。簡潔には、ＧＰＣＲは、小さな酵素断片ＰｒｏＬｉｎｋ（商標）とフレーム内で融合し、βアレスチンの融合タンパク質とβガラクトシダーゼの欠失変異体（すなわち、β−ｇａｌ、酵素アクセプター、またはＥＡ）を安定的に発現する細胞において共発現している。
ＧＰＣＲの活性化は、ＰｒｏＬｉｎｋタグ化ＧＰＣＲへのβアレスチンの結合を刺激し、２つの酵素断片の補完は活性β−ｇａｌ酵素の形成をもたらす。酵素活性の増加（すなわち、ＧＰＣＲの活性化）は、化学発光検出試薬を用いて測定することができる。
βアレスチン分子は、ＡＰＬＮＲなどのＧＰＣＲの活性化に続いてＧＰＣＲの内在化（すなわち、エンドサイトーシス）を調節することが示されている。ＧＰＣＲのアゴニスト活性化は、細胞表面からの受容体隔離を媒介するために、構造変化、受容体のリン酸化、及びβアレスチン、または他の経路の活性化をもたらす。隔離機構は、脱感作（すなわち、受容体は内在化に続いて分解する）または再感作（すなわち、受容体は細胞表面に再循環される）の手段であり得る。概説については、例えば、Ｃｌａｉｎｇ，Ａ．，ｅｔ ａ
ｌ．２００２，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６６：６１-７９参照。
ＡＰＬＮＲアンタゴニストは、受容体の内在化をブロックし得る。ＡＰＬＮＲアゴニストはＡＰＬＮＲの内在化及び／または再感作を誘導し得る（Ｌｅｅ，ＤＫ，ｅｔ ａｌ．
２０１０，ＢＢＲＣ，３９５：１８５-１８９）。いくつかの実施形態では、内在化アッ
セイによって測定されるように、ＡＰＬＮＲアゴニストは、ＡＰＬＮＲの再感作の増加を示すかまたは誘導する。他の実施形態では、内在化アッセイにおいて測定されるように、ＡＰＬＮＲアゴニストは、ＡＰＬＮＲの細胞表面の受容体のコピーの増加を示すかまたは誘導する。任意の内在化アッセイにおける容受体の内在化の程度（増加など）の測定は、非内在化測定（すなわち、アゴニストへの事前の暴露のない細胞）とアッセイにおけるアゴニストで得られる測定の間の差を決定することによって行われる。
アペリン受容体隔離、従ってアペリン受容体コピー、は当該技術分野で周知の多数の方法で測定することができる。ＡＰＬＮＲアゴニスト刺激が特定の細胞の表面上の受容体コピーの増加または減少をもたらし得る。例えば、アペリン受容体アゴニストは、血圧に影響を有し得るＡＰＬＮＲ内在化を誘導する。受容体の内在化アッセイは通常、例えば、蛍光標識もしくは放射性標識したリガンド、または免疫蛍光標識（蛍光タグ付き抗受容体抗体）を使用し、続いて顕微鏡及びデジタルイメージング技術によって行われる（例えば、Ｅｌ Ｍｅｓｓａｒｉ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，９０：１２９０−１３０１；Ｅｖａｎｓ，Ｎ．，２００４，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ Ｉ
ｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ-Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔ
ｏｒｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．２４：
１２．６．１-１２．６．２２参照）。
アペリンペプチド
アペリンは、７７アミノ酸のプレプロペプチドとして産生され、これは切断されていくつかの短い生物学的に活性な断片、またはアペリンペプチドを生成する。本明細書に記載されるように、抗ＡＰＬＮＲ抗体はアペリンペプチドのＡＰＬＮＲへの結合をブロックするかまたは妨害し得る。アペリンペプチドを含む抗体融合タンパク質は、ＡＰＬＮＲを活性化するかまたはＡＰＬＮＲ活性を増加させることができる。任意のアペリンペプチドは、プレプロアペリンポリペプチド（配列番号２２７）に由来することができ、本発明の抗ＡＰＬＮＲ抗体に融合し得る。アペリンペプチドはＣ末端の欠失を有するアペリンペプチドの断片を含み、そのいくつかは細胞活性を保持することが見出されている（Ｍｅｓｓａｒｉ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，９０：１２９０−１３０１）。ア
ペリンペプチドは、本明細書に記載されるように、アペリンの内因性の活性と比較して変化した活性を付与する置換及び／または修飾されたアミノ酸も含む。従って、アペリン類似体は、潜在的な切断部位を除去するか、または別途タンパク質を安定化させる置換または修飾されたアミノ酸を含み得る。従って、アペリン−Ｆｃ融合タンパク質のアペリンペプチドへの１つもしくは複数のＣ末端アミノ酸の欠失または付加は、分解に対する耐性な
ど、安定性の増加を付与することができる。そのようなアペリンペプチドの修飾は、ＡＰＬＮＲを活性化する能力を変化させない。例えば、配列番号２６１、配列番号２６２、配列番号２７０、配列番号２７１、配列番号２７２、及び配列番号２７３の、例示的修飾アペリンペプチドは、表９及び１０Ａ〜Ｄに含まれている。そのような修飾アペリンペプチドを含む本発明の例示的アペリン融合タンパク質は、本発明に含まれる。
いくつかの実施形態では、アペリンペプチドは、プレプロアペリンポリペプチド（配列番号２２７）の断片または類似体を含む。本明細書で使用される場合、「アペリンペプチド」は、例えば、アミノ酸６〜７７、４０〜７７、４２〜７７、４３〜７７、４７〜７７、５９〜７７、６１〜７７、６３〜７７、６４〜７７、６５〜７７、６６〜７７、６７〜７７、７３〜７７、１〜２５、６〜２５、４２〜６４、６１〜６４、６１〜７４、６１〜７５、６１〜７６、６５〜７６、６５〜７５、６６〜７６、６７〜７６、６６〜７５、６７〜７５、４２〜５８、４２〜５７、４２〜５６、４２〜５５、４２〜５４、４２〜５３、またはピログルタミル化アペリン６５〜７７（［Ｐｙｒ１］アペリン−１３）を含むアペリンペプチドなど、プレプロアペリンポリペプチド（配列番号２２７）の、当該技術分野で公知の非限定的例示的アペリン断片及び類似体を含む。例えば、２００２年１２月１０日に発行された米国特許第６，４９２，３２４号、及び上記のＭｅｓｓａｒｉ ｅｔ ａｌ．２００４参照、これらは両方とも参照により本明細書に組込まれる。
いくつかの実施形態では、アペリンペプチドは、アペリン４０〜７７（アペリン−３８）、アペリン４２〜７７（アペリン−３６）、アペリン４３〜７７（アペリン−３５）、アペリン４７〜７７（アペリン−３１）、アペリン５９〜７７（アペリン−１９）、アペリン６１〜７７（アペリン−１７）、アペリン６３〜７７（アペリン−１５）、アペリン６４〜７７（アペリン−１４）、アペリン６５〜７７（アペリン−１３）、アペリン６６〜７７（アペリン−１２、またはＡ１２）、アペリン６７〜７７（アペリン−１１）、アペリン６８〜７７（アペリン−１０）、アペリン７３〜７７（アペリン−５）、アペリン６１〜７６（アペリン−Ｋ１６Ｐ）、アペリン６１〜７５（アペリン−Ｋ１５Ｍ）、アペリン６１〜７４（アペリン−Ｋ１４Ｐ）、及び［Ｐｙｒ１］アペリン−１３からなる群から選択される。ある特定のアペリンペプチドはプレプロアペリンポリペプチド（配列番号２２７）の切断産物であり、様々な長さのプレプロアペリンのＣ末端を生成する。従って、配列番号２２７のアミノ酸４２〜７７からなるアペリンペプチドはアペリン−３６と呼ばれ；配列番号２２７のアミノ酸６１〜７７からなるアペリンペプチドはアペリン−１７と呼ばれ；配列番号２２７のアミノ酸６５〜７７からなるアペリンペプチドはアペリン−１３と呼ばれ；配列番号２２７のアミノ酸６７〜７７からなるアペリンペプチドはアペリン−１１と呼ばれる；など。
いくつかの実施形態では、アペリンペプチド、またはその類似体は、アペリン−３６（配列番号２３０）、アペリン−１７（配列番号２２９）、アペリン−１３（配列番号２２８）及び［Ｐｙｒ１］アペリン−１３からなる群から選択される。別の実施形態では、アペリンペプチドはアペリン−１３（配列番号２２８）、またはその断片もしくは類似体を含む。
プレプロアペリンポリペプチドのＣ末端のアペリンペプチドのさらなる修飾は、ペプチドの酵素切断、例えばＡＣＥ２切断を排除または妨害することができる。いくつかの実施形態では、アペリンペプチドは分解を最少にし、血清安定性を高めるように修飾される。ある実施形態では、修飾アペリンペプチドは、配列番号２７０（アペリン−Ｃｔｅｒ９）、配列番号２７１（アペリン−Ｃｔｅｒ１０）、配列番号２６２（アペリン−Ｃｔｅｒ１１）、配列番号２７２（アペリン−Ｃｔｅｒ１１＋Ｓ）、配列番号２７３（アペリン−Ｖ５−１１）、配列番号２６９（アペリン−１３＋５Ｇ）、配列番号２８３（アペリン−１３＋Ｒ）、配列番号２８４（アペリン−１３＋Ｓ）、及び配列番号２８５（アペリン−１
３＋Ｈ）からなる群から選択される。本発明のアペリン−抗体融合物は、これらの修飾ペプチドの任意のもの、特に抗体の重鎖または軽鎖のＮ末端につながれ得る。
アペリンペプチドは循環から急速に除去され、８分以下の短い血漿半減期を有する（Ｊａｐｐ，ｅｔ ａｌ，２００８，Ｊ ｏｆ Ａｍｅｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇ
，５２（１１）：９０８−１３）。本発明のアペリン融合タンパク質は、アペリンペプチドに比べて増加した半減期を有する。
他の実施形態では、アペリンペプチド、またはその断片もしくは類似体は、抗体の１つまたは両方の重鎖の５’（Ｎ末端）末端または３’（Ｃ末端）末端に融合している。さらに他の実施形態では、アペリンペプチド、またはその類似体は、抗体の１つまたは両方の軽鎖の５’（Ｎ末端）末端または３’（Ｃ末端）末端に融合している。
さらに他の実施形態では、アペリンペプチド、またはその断片もしくは類似体は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、ｄＡｂ断片、及び単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）からなる群から選択されるＡＰＬＮＲ結合断片などの抗原結合断片を含む、免疫グロブリン分子の５’（Ｎ末端）末端または３’（Ｃ末端）末端に融合している。
本発明に含まれるのは、非標準のアミノ酸または修飾されたアミノ酸を含むように修飾されたアペリンの類似体である。非天然の、または天然であるが非コード化されたアミノ酸を含むそのようなペプチドは、１つまたは複数のモードのコドンが、標準的なアミノ酸の１つではないアミノ酸をコードするために割り当てられている、人工的に修飾された遺伝子コードによって合成され得る。例えば、遺伝子コードは２０個の標準アミノ酸をコードするが、さらに３つのタンパク質構成アミノ酸が特定の状況下で天然に存在する：セレノシステイン、ピロリジン及びＮ−ホルミル−メチオニン（Ａｍｂｒｏｇｅｌｌｙ，ｅｔ
ａｌ．２００７，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３：２９−３５；
Ｂoｃｋ，Ａ．ｅｔ ａｌ，１９９１，ＴＩＢＳ，１６（１２）：４６３−４６７；及びＴｈeｏｂａｌｄ−Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，Ａ．， ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｃｈｉｍｉ
ｅ，８７（９−１０）：８１３−８１７）。カルボキシグルタミン酸（γ−カルボキシグルタミン酸）、ヒドロキシプロリン、及びハイプシンなどの、翻訳後修飾アミノ酸も含まれる。他の非標準アミノ酸には、シトルリン、４−ベンゾイルフェニルアラニン、アミノ安息香酸、アミノヘキサン酸、Ｎα−メチルアルギニン、αアミノ−ｎ−酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、アロイソロイシン、ｔ−ロイシン、α−アミノ−ｎ−ヘプタン酸、ピペコリン酸、α，β−ジアミノプロピオン酸、α，γ−ジアミノ酪酸、オルニチン、アロトレオニン、ホモアラニン、ホモアルギニン、ホモアスパラギン、ホモアスパルティック酸（ｈｏｍｏａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）、ホモシステイン、ホモグルタミン酸、ホモグルタミン、ホモイソロイシン、ホモロイシン、ホモメチオニン、ホモフェニルアラニン、ホモセリン、ホモチロシン、ホモバリン（ｈｏｍｏｖａｌｉｎｅ）、イソニペコチン酸、β−アラニン、β−アミノ−ｎ−酪酸、β−アミノイソ酪酸、γ−アミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、イソバリン、サルコシン、ナフチルアラニン、ニペコチン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−プロピルグリシン、Ｎ−イソプロピルグリシン、Ｎ−メチルアラニン、Ｎ−エチルアラニン、Ｎ−メチルβ−アラニン、Ｎ−エチルβ−アラニン、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸、ペニシラミン、ピログルタミン酸、サルコシン、ｔ−ブチルグリシン、テトラヒドロ−イソキノリン−３−カルボン酸、イソセリン、及びα−ヒドロキシ−γ−アミノ酪酸が含まれるが、これらに限定されない。遺伝コードを拡張するための様々なフォーマットが、当該技術分野で知られており、本発明の実施に使用することができる。（例えばＷｏｌｆｓｏｎ，Ｗ．，２００６，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ，１３（１０）
：１０１１−１２参照）。
そのような非標準のアミノ酸または翻訳後修飾を組込むアペリン類似体は、公知の方法により合成することができる。例示的なアペリン類似体には、Ｎα−メチルアルギニン−アペリン−Ａ１２類似体、［Ｎｌｅ７５、Ｔｙｒ］アペリン−３６、［Ｇｌｐ６５Ｎｌｅ７５、Ｔｙｒ７７］アペリン−１３、（Ｐｙｒ１）［Ｍｅｔ（Ｏ）１１］−アペリン−１３、（Ｐｙｒ１）−アペリン−１３、［ｄ−Ａｌａ１２］−Ａ１２、及びＮ−α−アセチル−ノナ−Ｄ−アルギニンアミド酢酸が含まれる。
本発明には、切断、例えば、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）による切断に耐性があるように修飾された抗体融合タンパク質のアペリン成分の類似体も含まれる。そのようなアペリン類似体は、虚血に対する心筋応答のインビボモデルにおける未修飾アペリンリガンドに比べて、有効性の顕著な増加を有することが示されている（Ｗａｎｇ，ｅｔ
ａｌ．Ｊｕｌｙ １，２０１３，Ｊ Ａｍ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃ．２：ｅ０００２４９
）。
そのような切断保護された抗体融合タンパク質は、置換変異体、すなわちタンパク質内の１つまたは複数の切断部位で１つのアミノ酸を他のものと交換することによって作られる変異体、を含むように修飾されるアペリンペプチドを含む。そのようなアミノ酸置換は、タンパク質の他の機能または特性を失うことなく安定性の増加を付与すると想定される。他の切断保護された抗体融合タンパク質は、末端アミドまたはアセチル基を含むように修飾されたアペリンペプチドを含む。いくつかの実施形態では、切断保護された抗体融合タンパク質は、タンパク質構成アミノ酸、非標準のアミノ酸または翻訳後修飾アミノ酸を含む。いくつかの修飾アペリンペプチドは、ＡＰＬＮＲを活性化する能力を変更することなく、１つまたは複数のＣ末端アミノ酸を欠失及び／または付加するように修飾される。本発明の例示的アペリン融合タンパク質は、配列番号２７０（アペリン−Ｃｔｅｒ９）、配列番号２７１（アペリン−Ｃｔｅｒ１０）、配列番号２６２（アペリン−Ｃｔｅｒ１１）、配列番号２７２（アペリン−Ｃｔｅｒ１１＋Ｓ）、配列番号２６９（アペリン−１３＋５Ｇ）、配列番号２８３（アペリン−１３＋Ｒ）、配列番号２８４（アペリン−１３＋Ｓ）、及び配列番号２８５（アペリン−１３＋Ｈ）を含む。２０１４年９月２５日に公開され、参照により本明細書に組込まれる、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１４／１５２９５５Ａ１号も参照。
抗体融合タンパク質
本発明は、アペリンペプチド配列に融合した抗ＡＰＬＮＲ抗体を含む抗体融合タンパク質またはその断片も提供する。本明細書に記載され、当該技術分野で公知の任意のアペリンペプチドまたは類似体は、プレプロアペリンポリペプチド（配列番号２２７）由来であり得る。アペリンペプチドは、タンパク質分解切断に対する耐性または金属イオン関連の切断に対する耐性を改善するように、通常の分子生物学的技術及び合成化学を使用して修飾することができる。そのようなポリプチドの類似体は、１つのアミノ酸の別のものとの交換、または天然に存在するＬ−アミノ酸以外の残基、例えばＤ−アミノ酸または非天然の合成アミノ酸との置換によって作られる置換変異体を含む。
本発明のある特定の非限定的な例示的抗体融合タンパク質は、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、及び２１０／２１８からなる群から選択される重鎖及び軽鎖可変領域（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）配列を含み；及びさらにアペリンペプチド配列、例えば、配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９もしくは配列番号２３０の断片または類似体を含む。
本発明の一態様では、アペリン受容体（ＡＰＮＬＲ）モジュレーターは、アペリンペプチド成分及びＩｇＧ分子などのＩｇ分子を含む。従って、アペリンペプチド成分は、Ｉｇ
分子の重鎖のＮ末端またはＣ末端にインフレームで融合させることができる。抗体−アペリン融合タンパク質（別途抗体−アペリン融合物として知られる）は、抗体の１つまたは両方の重鎖のＮ末端またはＣ末端にインフレームで融合した２つの同一の重鎖ドメインとアペリンペプチド成分を含むホモ二量体を含むことができる。他の例では、抗体−アペリン融合タンパク質は、抗体の１つまたは両方の軽鎖のＮ末端またはＣ末端にインフレームで融合した２つの同一の重鎖ドメインとアペリンペプチド成分を含むホモ二量体であり得る。いくつかの実施形態では、Ｉｇ分子は抗ＡＰＬＮＲ抗体であり、従って、重鎖及び軽鎖可変領域（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）はＡＰＬＮＲに結合することができる。本発明の例示的抗体融合タンパク質は、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、及び２１０／２１８からなる群から選択される重鎖及び軽鎖可変領域（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）配列を含む。他の実施形態では、抗体−アペリン融合物は、例えば、本明細書でアペリンペプチドまたは類似体に融合すると記載される可変領域を含む、抗原結合断片を含むことができる。従って、抗体−アペリン融合物は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２またはｓｃＦｖ断片を含む。当業者は、本明細書に開示の重鎖及び軽鎖可変領域配列で開始して、１つまたは複数のそのアペリンペプチドを含む様々な抗体−アペリン融合物を容易に産生することができる。
抗体分子と同様に、抗体−アペリン融合物は、単一特異性または多重特異性（例えば、二重特異性）であり得る。多重特異性抗体−アペリン融合物は、典型的には、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、ここにおいて１つの可変ドメインは、ＡＰＬＮＲに特異的に結合することができ、第２の可変ドメインは同じ抗原（すなわちＡＰＬＮＲ）上の異なるエピトープに結合するかまたはアペリンなどの、異なる抗原に結合することができる可能性がある。任意の多重特異性抗体フォーマットは、当該技術分野で利用可能な通常の技術を用いて、本発明の抗体融合タンパク質の関連において使用するために適合させることができる。
いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質の成分またはペプチドは、リンカー（または「スペーサー」）ペプチドで分離されている。そのようなペプチドリンカーは、当該技術分野で周知であり（例えば、ポリグリシン）、典型的には、融合タンパク質の１つまたは両方の成分の適切な折り畳みを可能にする。リンカーは、融合タンパク質の成分の柔軟な接合領域を提供して、分子の２つの端部が独立して移動できるようにし、２つの部分の適切な機能のそれぞれを保持するのに重要な役割を果し得る。従って、接合領域は、いくつかの場合には、２つの部分を一緒に結合するリンカーとして、及び２つの部分のそれぞれが独自の生物学的構造を形成することを可能にし、他の部分と干渉しないスペーサーとして、両方の機能をする。さらに、接合領域は、対象の免疫システムによって異物として認識されない、言い換えると、免疫原性とみなされない、エピトープを作り出す必要がある。リンカーの選択は、融合分子の結合活性にも影響を与え得る。（Ｈｕｓｔｏｎ，ｅｔ ａｌ，１９８８，ＰＮＡＳ，８５：１６：５８７９−８３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＆ Ｂ
ａｔｅｓ，１９９８，ＰＮＡＳ ９５（１１）：５９２９−３４；Ａｒａｉ，ｅｔ ａｌ．２００１，ＰＥＤＳ，１４（８）：５２９−３２；及びＣｈｅｎ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，２
０１３，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６５：１３５７-１３６９参照）。一実施形態では、アペリンペプチドは、１つまたは複数のペプチドリ
ンカーを介して、抗体融合ポリペプチドまたはその断片のＮ末端またはＣ末端に連結されている。
リンカー鎖の長さは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上のアミノ酸残基であり、典型的には５と２５残基の間であり得る。リンカーの例には、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（２Ｇｌｙ）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（３Ｇｌｙ）、４Ｇｌｙ、５Ｇｌｙ、６Ｇｌｙ、７Ｇｌｙ、８Ｇｌｙまたは９Ｇｌｙなどのポリグリシンリンカー
が含まれる。リンカーの例にはＳｅｒ−Ｇｌｙ（ＳＧ）、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ＧＳ）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｇ２Ｓ）、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＳＧ２）、Ｇ３Ｓ、ＳＧ３、Ｇ４Ｓ、ＳＧ４、Ｇ５Ｓ、ＳＧ５、Ｇ６Ｓ、ＳＧ６、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（Ｓ４Ｇ）ｎ、式中、ｎ＝１〜１０、などのＧｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカーも含まれる。（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３は（Ｇ４Ｓ）３（配列番号２３３）としても知られ、式中、ｎ＝３は、特定の配列が３回繰返されることを示す。本明細書に記載のリンカーの任意の１つを、必要に応じてリンカーを長くするために繰返すことができる。
本発明のそのような一実施形態では、アペリンペプチドは、１つまたは複数のＧｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカーを介して、抗体融合タンパク質、またはその断片のＮ末端もしくはＣ末端に連結されている。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）１（配列番号２３１）、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）２（配列番号２３２）、及び（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３（配列番号２３３）からなる群から選択される。
他の実施形態では、シグナルペプチドは、発現ベクター中の抗体融合タンパク質の上流にコードされる。ある特定の実施形態では、リンカーまたはスペーサーは、シグナルペプチドのＣ末端と抗体融合タンパク質のＮ末端の間にインフレームで融合される。このようなシグナルペプチドは当該技術分野で知られており、ポリペプチドを細胞の分泌経路に指向させるのに使用することができる。
本発明の例示的なアペリン融合タンパク質は、アペリンペプチド単独よりも安定である。本発明のいくつかのアペリン融合タンパク質は、酵素分解に対して耐性である。本発明の例示的な抗体融合タンパク質は、アペリンペプチド及び任意選択でリンカーに融合した重鎖及び軽鎖可変領域（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）配列を含み、配列番号１３０／２３５、１３０／２３７、２３９／１３８、２４１／１３８、２４３／１３８、２４５／１３８、２４７／１２２、１１４／２４９、１１４／２５１、２５３／２６、２５５／２６、２５７／２６、２５９／２６、２７４／１３８、２７５／１３８、２７６／１３８、２７７／１３８、２７８／１３８、２７９／２６、２８０／２６、２８１／２６、及び２８２／２６からなる群から選択される。
エピトープマッピング及び関連技術
本発明は、ＡＰＬＮＲの１つまたは複数のアミノ酸と相互作用する抗ＡＰＬＮＲ抗体及び抗体融合タンパク質を含む。例えば、本発明は、ＡＰＬＮＲの細胞外または膜貫通ドメイン内に位置する１つまたは複数のアミノ酸と相互作用する抗ＡＰＬＮＲ抗体を含む。抗体が結合するエピトープは、ＡＰＬＮＲの３以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上）のアミノ酸の単一の連続した配列からなることができる。あるいは、エピトープは、ＡＰＬＮＲの複数の非連続のアミノ酸（またはアミノ酸配列）からなることができる。
抗体がポリペプチドまたはタンパク質内の「１つまたは複数のアミノ酸と相互作用する」かどうかを決定するために、当業者に公知の様々な技術を使用することができる。例示的な技術は、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．，ＮＹ）
に記載されるようなルーチンのクロスブロッキングアッセイ、アラニンスキャニング突然変異解析、ペプチドブロット解析（Ｒｅｉｎｅｋｅ，２００４，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８：４４３−４６３）、及びペプチド切断解析を含む。さらに、エピトー
プ切除、エピトープ抽出及び抗原の化学修飾などの方法を使用することができる（Ｔｏｍ
ｅｒ，２０００，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：４８７−４９６）。抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を識別するのに使用することができる別の方法は、質量分析によって検出される水素／重水素交換である。一般的には、水素／重水素交換法は、対象のタンパク質の重水素標識化に続いて、重水素標識されたタンパク質への抗体の結合を含む。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移送し、抗体によって保護された残基（重水素標識のまま）を除く全ての残基で水素−重水素交換を起こさせる。抗体の解離後、標的タンパク質は、プロテアーゼ切断及び質量分析に供され、それにより抗体が相互作用する特定のアミノ酸に対応する重水素標識残基を明らかにする。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７（２）：２５２−２５９；Ｅｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ−２６５Ａ参照。
本発明はさらに、本明細書に記載の特定の例示的な抗体の任意のものと同じエピトープに結合する抗ＡＰＬＮＲ抗体を含む（例えばＨ１Ｍ９２０７Ｎ、Ｈ２ａＭ９２０９Ｎ、Ｈ２ａＭ９２２２Ｎ、Ｈ２ａＭ９２２７Ｎ、Ｈ２ａＭ９２２７Ｎ、Ｈ２ａＭ９２２８Ｎ、Ｈ２ａＭ９２３０Ｎ、Ｈ２ａＭ９２３２Ｎ、Ｈ４Ｈ９０９２Ｐ、Ｈ４Ｈ９０９３Ｐ、Ｈ４Ｈ９１０１Ｐ、Ｈ４Ｈ９１０３Ｐ、Ｈ４Ｈ９１０４Ｐ、Ｈ４Ｈ９１１２Ｐ、Ｈ４Ｈ９１１３Ｐ、など）。同様に、本発明は、本明細書に記載の特定の例示的な抗体の任意のものとＡＰＬＮＲへ結合するために競合する抗ＡＰＬＮＲ抗体も含む（例えばＨ１Ｍ９２０７Ｎ、Ｈ２ａＭ９２０９Ｎ、Ｈ２ａＭ９２２２Ｎ、Ｈ２ａＭ９２２７Ｎ、Ｈ２ａＭ９２２７Ｎ、Ｈ２ａＭ９２２８Ｎ、Ｈ２ａＭ９２３０Ｎ、Ｈ２ａＭ９２３２Ｎ、Ｈ４Ｈ９０９２Ｐ、Ｈ４Ｈ９０９３Ｐ、Ｈ４Ｈ９１０１Ｐ、Ｈ４Ｈ９１０３Ｐ、Ｈ４Ｈ９１０４Ｐ、Ｈ４Ｈ９１１２Ｐ、Ｈ４Ｈ９１１３Ｐ、など）。
抗体が、参照抗ＡＰＬＮＲ抗体と同じエピトープに結合するか、結合するためにそれと競合するかどうかは、当該技術分野で公知であり、本明細書に例示されるルーチンの方法を使用して容易に決定することができる。例えば、試験抗体が本発明の参照抗ＡＰＬＮＲ抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定するために、参照抗体は、ＡＰＬＮＲタンパク質に結合させられる。次に、ＡＰＬＮＲ分子に結合する試験抗体の能力を評価する。試験抗体が、参照抗ＡＰＬＮＲ抗体との飽和結合に続いてＡＰＬＮＲに結合することができる場合、試験抗体は参照抗ＡＰＬＮＲ抗体とは異なるエピトープに結合すると結論することができる。一方、試験抗体が、参照抗ＡＰＬＮＲ抗体との飽和結合に続いてＡＰＬＮＲ分子に結合することができない場合、試験抗体は本発明の参照抗ＡＰＬＮＲ抗体によって結合されたエピトープと同じエピトープに結合し得る。追加のルーチンの実験（例えば、ペプチドの突然変異及び結合解析）を、試験抗体の結合の観察された欠失が実際に参照抗体と同じエピトープへの結合によるかどうか、立体的ブロッキング（または別の現象）が観察された結合の欠失の原因であるのかどうか、を確認するために、次いで、実施することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）、フローサイトメトリー、または当該技術分野において利用可能な任意の他の定量的もしくは定性的な抗体−結合アッセイ、を使用して行うことができる。本発明のある特定の実施形態によれば、例えば、競合結合アッセイで測定されたとき、１、５、１０、２０または１００倍過剰の一方の抗体が他方の結合を少なくとも５０％だけ、しかし好ましくは７５％、９０％または９９％でも阻害する場合、２つの抗体は同一の（またはオーバーラップする）エピトープに結合する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：１４９５−１５０２参照）。あるいは、一方の抗体の結合を減少さ
せるかまたは排除する抗原内の本質的にすべてのアミノ酸変異が、他方の結合を減少させるかまたは排除する場合、２つの抗体は同じエピトープに結合するとみなされる。一方の抗体の結合を減少させるかまたは排除するサブセットのアミノ酸変異のみが、他方の結合を減少させるかまたは排除する場合、２つの抗体は「オーバーラップするエピトープ」を有するとみなされる。
抗体が結合のために参照抗ＡＰＬＮＲ抗体と競合する（または結合のために交差競合する）かどうか、を決定するために、上記の結合方法は、２つの配向で行われる：第一の配向では、参照抗体は飽和条件下でＡＰＬＮＲタンパク質に結合させ、続いてＡＰＬＮＲ分子への試験抗体の結合の評価を行う。第二の配向では、試験抗体は飽和条件下でＡＰＬＮＲ分子に結合させ、続いてＡＰＬＮＲ分子への参照抗体の結合の評価を行う。両方の配向において、第一（飽和）抗体のみがＡＰＬＮＲ分子に結合することができる場合、試験抗体と参照抗体はＡＰＬＮＲに結合するために競合すると結論付けられる。当業者によって理解されるように、結合するために参照抗体と競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同じエピトープに結合しないであろうが、オーバーラップまたは隣接するエピトープに結合することによって参照抗体の結合を立体的にブロックし得る。
ヒト抗体の調製
完全ヒトモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体を生成するための方法は当技術分野で公知である。任意のそのような公知の方法は、ヒトＡＰＬＮＲに特異的に結合するヒト抗体を作るために、本発明の関連において使用することができる。
例えば、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術、または完全ヒトモノクローナル抗体を生成するための任意の他の公知の方法を使用して、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有するＡＰＬＮＲに対する高親和性キメラ抗体が、最初に、単離される。以下の実験の節のように、抗体は、親和性、選択性、エピトープ、などを含む所望の特性に対して特徴付けられ、選択される。必要であれば、完全ヒト抗ＡＰＬＮＲ抗体を生成するために、マウス定常領域は、所望のヒト定常領域、例えば野生型または修飾されたＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４、で置換される。選択された定常領域は特定の使用に応じて変化し得るが、高親和性抗原結合及び標的特異性特性が可変領域に存在する。ある特定の例では、完全ヒト抗ＡＰＬＮＲ抗体は、抗原陽性のＢ細胞から直接単離される。
生物学的同等物
本発明の抗ＡＰＬＮＲ抗体及び抗体断片は、記載された抗体のものとは異なるが、ヒトＡＰＬＮＲに結合する能力を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。そのような変異体抗体及び抗体断片は、親配列と比較して、１つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失、または置換を含むが、記載された抗体のものと本質的に同等である生物学的活性を示す。同様に、本発明の抗ＡＰＬＮＲ抗体をコードするＤＮＡ配列は、開示された配列と比較して、１つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、または置換を含む配列を包含するが、本発明の抗ＡＰＬＮＲ抗体または抗体断片と本質的に生物学的に同等である抗ＡＰＬＮＲ抗体または抗体断片をコードする。そのような変異体アミノ酸及びＤＮＡ配列は上記で考察されている。
２つの抗原結合タンパク質、または抗体は、例えば、それらが、単回用量または複数回用量のいずれかで、同様の実験条件下で同じモル用量で投与されたとき、吸収の速度と程度が有意の差を示さない薬学的同等物または薬学的代替物である場合、生物学的に同等とみなされる。いくつかの抗体は、吸収の程度において同等であるが、吸収速度においては同等ではなくても、同等物または薬学的代替物とみなされるであろうが、それにもかかわらず、吸収速度のそのような差異は意図的なものであって標識化に反映されており、例えば、慢性使用への効果的な体内薬剤濃度の達成には不可欠なものではなく、研究された特定の薬品には医学的に重要ではないとみなされるので、生物学的に同等とみなされ得る。
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、安全性、純度、及び効力において臨床的に意味のある差異がない場合、生物学的に同等である。
一実施形態では、患者が、そのような切替のない継続的な治療法と比較して、臨床的に有意な免疫原性の変化、または有効性の減少を含む副作用のリスクの予想される増加なしに、参照製剤と生物学的製剤の間で１回または複数回切替えることができる場合、２つの抗原結合タンパク質は生物学的に同等である。
一実施形態では、２つ抗原結合タンパク質は、それらが両方とも、使用の条件（１つまたは複数）に対する作用の共通のメカニズム（１つまたは複数）によって、そのようなメカニズムが知られる程度に、作用する場合、生物学的に同等である。
生物学的同等性は、インビボ及びインビトロの方法で明示することができる。生物学的同等性の測定は、例えば、（ａ）、抗体またはその代謝物の濃度が、時間の関数として血液、血漿、血清、または他の生物学的流体中で測定される、ヒトまたは他の哺乳動物におけるインビボ試験；（ｂ）ヒトのインビボでの生物学的利用可能性データと相関し、及びそれを合理的に予測するインビトロ試験；（ｃ）抗体（またはその標的）の適切な急性の薬理学的効果が時間の関数として測定される、ヒトまたは他の哺乳動物におけるインビボ試験；及び（ｄ）抗体の安全性、有効性、または生物学的利用可能性または生物学的同等性を確立する、よく管理された臨床試験における測定、を含む。
本発明の抗ＡＰＬＮＲ抗体の生物学的に同等な変異体は、例えば、生物学的活性に必要でない、残基もしくは配列の様々な置換を行うか、または末端もしくは内部残基もしくは配列を欠失させることによって、構築され得る。例えば、生物学的活性に必須ではないシステイン残基は、または再生時に不必要なまたは不正確な誤った分子内ジスルフィド架橋の形成を防ぐために、欠失させるかまたは他のアミノ酸と置換することができる。他の関連では、生物学的に同等な抗体は、抗体のグリコシル化特性、例えば、グリコシル化を排除または除去する変異を修飾するアミノ酸の変化を含む、抗ＡＰＬＮＲ抗体変異体を含むことができる。
種選択性と種交差反応性
本発明は、ある特定の実施形態によれば、ヒトＡＰＬＮＲに結合するが、他の種からのＡＰＬＮＲには結合しない抗ＡＰＬＮＲ抗体を提供する。本発明は、ヒトＡＰＬＮＲ及び１つまたは複数の非ヒト種からのＡＰＬＮＲに結合する抗ＡＰＬＮＲ抗体も含む。例えば、本発明の抗ＡＰＬＮＲ抗体は、ヒトＡＰＬＮＲに結合し得るし、場合によっては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザルもしくはチンパンジーのうちの１つまたは複数のＡＰＬＮＲに、結合するかまたは結合しないこともあり得る。本発明のある特定の例示的な実施形態によれば、ヒトＡＰＬＮＲ（配列番号２２５）及びカニクイザル（例えば、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ
））のＡＰＬＮＲ（配列番号２２６）に特異的に結合する、抗ＡＰＬＮＲ抗体が提供される。
免疫複合体
本発明は、細胞毒、化学療法薬、免疫抑制剤または放射性同位元素などの治療部分に結合した抗ＡＰＬＮＲモノクローナル抗体（「免疫複合体」）を包含する。細胞毒性剤は、細胞に有害な任意の薬剤を含む。免疫複合体の形成に適した細胞毒性剤及び化学療法剤の例は、当該技術分野で公知である（例えば、ＷＯ０５／１０３０８１参照）。
多重特異性抗体
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性または多重特異性であり得る。多重特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的であり得るか、または複数の標的ポリペプチドに対して特異的な抗原結合ドメインを含有することができる。例
えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９；Ｋｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８
−２４４参照。本発明の抗ＡＰＬＮＲ抗体は、別の機能分子、例えば、別のペプチドもしくはタンパク質に連結されるか、またはそれと共発現させられ得る。例えば、抗体またはその断片は、第２の結合特異性を有する二重特異性または多重特異性抗体を生成するための別の抗体または抗体断片などの、１つまたは複数の他の分子実体へ、（例えば、化学的結合、遺伝子融合、非共有結合によりまたは別の方法で）機能的に連結させることができる。例えば、本発明は、二重特異性抗体を含み、ここにおいて免疫グロブリンの１つのアームはヒトＡＰＬＮＲまたはその断片に特異的であり、免疫グロブリンの他のアームは第２の治療標的に特異的であるか、または治療的部分に結合される。
本発明の関連において使用することができる例示的な二重特異性抗体フォーマットは、第１免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメイン及び第２Ｉｇ ＣＨ３ドメインの使用を含み
、ここにおいて、第１及び第２のＩｇ ＣＨ３ドメインは少なくとも１つのアミノ酸だけ
互いに異なり、及び、少なくとも１つのアミノ酸の相違は、アミノ酸の相違を欠く二重特異性抗体と比較して、二重特異性抗体のタンパク質Ａへの結合を減少させる。一実施形態では、第１Ｉｇ ＣＨ３ドメインは、タンパク質Ａに結合し、第２Ｉｇ ＣＨ３ドメインは、Ｈ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエクソン番号番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）などのタンパク質Ａ結合を減少させるかまたは撤廃する変異を含む。第２のＣＨ３はさらにＹ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＹ４３６Ｆ）を含み得る。第２のＣＨ３内に見出され得るさらなる修飾には以下が含まれる：ＩｇＧ１抗体の場合、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、及び８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、及びＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２抗体の場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、及びＶ４２２Ｉ）；並びにＩｇＧ４抗体の場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、及びＶ４２２Ｉ）。上述の二重特異性抗体フォーマットの変形は、本発明の範囲内で企図されている。例えば、２０１０年１２月３０日に公開され、参照により本明細書に組込まれる米国特許出願公開第ＵＳ２０１００３３１５２７Ａ１号参照。
いくつかの態様では、抗体、抗体融合タンパク質または抗原結合断片は二重特異性抗体であり、そのような分子または抗体の各抗原結合断片は、ＬＣＶＲ領域と対になったＨＣＶＲを含む。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、第１抗原結合断片及び第２抗原結合断片を含み、ＬＣＶＲ領域と対になった、異なる、明確なＨＣＶＲをそれぞれ含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、第１抗原に対する第１抗原由来のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を含む、第１抗原と特異的に結合する第１抗原結合断片、及び第１抗体由来のＬＣＶＲ（例えば、第１抗体の抗原結合断片に含まれる同じＬＣＶＲ）と対になった第２抗原に対する第２抗体由来のＨＣＶＲを含む、第２抗原と特異的に結合する第２抗原結合断片、を含んで構築される。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体における少なくとも１つの抗体、すなわち、第１抗体または第２抗体または両方の抗体の重鎖は、修飾された重鎖定常領域を含む。
本発明のいくつかの態様では、異なる特異性を有する、２つの抗体、または２つの重鎖は、二重特異性抗体の同じ軽鎖を使用する。いくつかの実施形態では、単離を容易にするために、重鎖の少なくとも１つはＣＨ３ドメインにおいて修飾され、二重特異性抗体の各重鎖及びタンパク質Ａなどの親和性試薬の間の差分親和性をもたらす。別の実施形態では、そのような二重特異性抗体における少なくとも１つの重鎖は、ＩＭＧＴ番号付けシステムにおけるｉ）９５Ｒまたはｉｉ）９５Ｒ及び９６Ｆ（ＥＵ番号付けシステムにおける４３５Ｒ及び４３６Ｆに相当する９５Ｒ及び９６Ｆ）でのアミノ酸修飾を含む。
さらに他の態様では、抗体は二重特異性抗体であり、その二重特異性抗体は以下を含む：（ａ）第１標的抗原を認識してそれに結合することができる抗原結合断片を含む第１重鎖、（ｂ）第２標的抗原を認識してそれに結合することができる抗原結合断片を含む第２重鎖、（ｃ）第１または第２標的抗原を認識してそれに結合することができる共通の軽鎖抗原結合断片。別の態様では、上記のような二重特異性抗体における（ａ）または（ｂ）の重鎖の少なくとも１つは、ＩＭＧＴ番号付けシステムにおけるアミノ酸修飾（ｉ）９５Ｒまたは（ｉｉ）９５Ｒ及び９６Ｆ［（ｉ）４３５Ｒまたは（ｉｉ）４３５Ｒ及び４３６Ｆ（ＥＵ番号付け）］を含む。
例示的な二重特異性のフォーマットを、本明細書に記載のＨＣＶＲ及び／またはＬＣＶＲ配列の任意のものを含む本発明の関連において使用することができる。いくつかの実施形態では、第１抗原はｈＡＰＬＮＲ上の第１エピトープであり、第２抗原はｈＡＰＬＮＲ上の第２エピトープである。他の実施形態では、第１抗原はＡＰＬＮＲであり、第２抗原は、アペリンである。ある特定の実施形態では、第１抗体は、本明細書に記載の抗ＡＰＬＮＲ抗原結合断片を含む。他の実施形態では、第２抗体は、抗アペリン抗原結合断片を含む。そのような抗アペリン抗原結合断片は、当該技術分野で公知である（例えば、参照によって本明細書に組込まれる、２０１３年１月２４日公開のＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１３／０１２８５５号参照）。
本発明の関連で使用できる他の例示的な二重特異的なフォーマットには、限定されないが、例えば、ｓｃＦｖベースのまたはディアボディの二重特異的フォーマット、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合物、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）−Ｉｇ、Ｑｕａｄｒｏｍａ、ノブイントゥホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）、共通の軽鎖（例えば、ノブイントゥホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）を有する共通の軽鎖）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ボディ、ロイシンジッパー、Ｄｕｏｂｏｄｙ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）−ＩｇＧ、Ｍａｂ２二重特異的フォーマット（前述のフォーマットの概説に関しては、例えば、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１２，ｍＡｂｓ
４：６，１−１１、及びそこで引用された文献を参照）などが含まれる。二重特異性抗
体は、ペプチド／核酸結合を使用して構築することもでき、例えば、その場合、直交性化学反応性を有する非天然アミノ酸を使用して部位特異的な抗体−オリゴヌクレオチド結合体を生成し、次いで決められた組成、原子価、及び幾何学的配置で多量体の複合体に自己集合させる。（例えば、Ｋａｚａｎｅ ｅｔ ａｌ．２０１３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９；１３５（１）：３４０−６［電子出版：２０１２年１２月２１日］参照）。
本発明の関連において使用することができるさらなる例示的多重特異性フォーマットは、限定なしに、例えば、標的分子と特異的に結合する第１抗原結合ドメイン、及び内在エフェクタータンパク質と特異的に結合する第２抗原結合ドメインを含むことを含み、ここにおいてそのような第２抗原結合ドメインは、ＡＰＬＮＲを活性化し、内在化することができる。（２０１３年９月１９日に公開され、参照により組込まれる、米国特許出願公開第２０１３／０２４３７７５Ａ１号参照）。
ｐＨ依存性結合
本発明は、ｐＨ依存性の様式でＡＰＬＮＲと結合する抗体、抗体融合タンパク質及びその抗原結合断片を提供する。例えば、本発明の抗ＡＰＬＮＲ抗体は、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨでＡＰＬＮＲへの結合の減少を示し得る。あるいは、本発明の抗ＡＰＬＮＲ抗体は、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨでその抗原への結合の増強を示し得る。
ある特定の例において、「中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨでＡＰＬＮＲへの結合の減少
」は、酸性ｐＨでＡＰＬＮＲを発現する細胞に対する抗体の結合比の、中性ｐＨでＡＰＬＮＲを発現する細胞に対する抗体の結合比に対する結合割合（またはその逆）の意味において表現されている。例えば、抗体またはその抗原結合断片が、約３．０以上の酸性／中性結合割合を示す場合、抗体またはその抗原結合断片は、本発明の目的に対して、「中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨでＡＰＬＮＲへの結合の減少」を示すとみなされ得る。ある特定の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片に対する、酸性／中性結合割合は、約３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、２０．０．２５．０、３０．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、１００．００以上であることができる。
あるいは、「中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨでＡＰＬＮＲへの結合の減少」は、酸性ｐＨでのＡＰＬＮＲに対する抗体の結合のＫＤ値の、中性ｐＨでのＡＰＬＮＲに対する抗体の結合のＫＤ値に対する比（またはその逆）の意味で表現されている。用語「ＫＤ」（Ｍ）は、本明細書で使用される場合、特定のリガンド−受容体相互作用の解離平衡定数を指す。ＫＤと結合親和性の間には逆の関係があり、従って、ＫＤ値が小さい程、親和性は高くなる。従って、用語「より低い親和性」は、相互作用するより低い能力、従って、より大きなＫＤ値に関する。例えば、抗体またはその抗原結合断片が、約３．０以上の酸性／中性ＫＤ比を示す場合、抗体またはその抗原結合断片は、本発明の目的に対して、「中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨでＡＰＬＮＲへの結合の減少」を示すとみなされ得る。ある特定の実施形態では、発明の抗体または抗原結合断片の酸性／中性ＫＤ比は、約３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、２０．０．２５．０、３０．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、１００．００以上であることができる。
ｐＨ依存性結合特性を有する抗体は、中性ｐＨと比較して、例えば、酸性ｐＨでの特定の抗原への結合の減少（または増加）に対して抗体の集団をスクリーニングすることによって、得ることができる。また、アミノ酸レベルでの抗原結合ドメインの修飾は、ｐＨ依存性特性を有する抗体を生成することができる。例えば、抗原結合ドメイン（例えば、ＣＤＲ内の）の１つまたは複数のアミノ酸をヒスチジン残基と置換することによって、中性ｐＨに対して酸性のｐＨでの抗原結合減少を有する抗体を得ることができる。本明細書で使用される場合、表現「酸性ｐＨ」は、約６．０以下、約５．５以下、または約５．０以下のｐＨを意味する。表現「酸性ｐＨ」は、約６．０、５．９５、５．９、５．８５、５．８、５．７５、５．７、５．６５、５．６、５．５５、５．５、５．４５、５．４、５．３５、５．３、５．２５、５．２、５．１５、５．１、５．０５、５．０、またはそれ以下のｐＨ値を含む。本明細書で使用される場合、表現「中性ｐＨ」は、約７．０〜約７．４のｐＨを意味する。表現「中性ｐＨ」は、約７．０、７．０５、７．１、７．１５、７．２、７．２５、７．３、７．３５、及び７．４のｐＨ値を含む。
治療用製剤及び投与
本発明は、本発明の抗ＡＰＬＮＲ抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、適切な担体、賦形剤及び移送、送達、耐性などを改善する他の薬剤と共に製剤化される。多数の適切な製剤は、全ての薬剤師に公知の処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕ
ｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡの中に見出すことができる。こ
れらの製剤には、例えば粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（カチオン性またはアニオン性）含有ベシクル（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）など、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＤＮＡ接合体、無水吸収ペ
ースト、水中油型の及び油中水型のエマルジョン、エマルジョン カーボワックス（様々
な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル並びにカーボワックスを含有する半固体混合物が含まれる。Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ，１９
９８，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８−３１１も参照。
患者に投与される抗体の用量を患者の年齢及び大きさ、標的とする疾患、症状、投与経路等に応じて変えることができる。好ましい用量は、典型的には、体重または体表面積に従って算出される。成人の患者においてＡＰＬＮＲ活性と関連した病態または疾患を治療するために本発明の抗体が用いられる場合、通常は約０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．０２〜約７、約０．０３〜約５または約０．０５〜約３ｍｇ／ｋｇ体重の単回用量で本発明の抗体を静脈内投与することが好都合であり得る。病態の重症度に応じて治療の頻度及び継続期間を調整することができる。抗ＡＰＬＮＲ抗体の投与に効果的な投薬量及びスケジュールを経験的に決定することができ、例えば患者の経過を周期的な評価でモニタリングし、モニタリングに基づいて用量を調整することができる。さらに、当該技術分野で周知の方法を用いて用量の種間スケーリングを実施することができる（例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．８：１３５１）。
様々な送達系、例えばリポソーム、微粒子、マイクロカプセルへの封入、変異ウイルスを発現できる組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシスが公知であり、本発明の医薬組成物の投与に用いることができる（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ． Ｂｉｏ
ｌ． Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２参照）。導入法には皮内、筋肉内、腹腔内
、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外及び経口経路が含まれるが、これらに限定されない。任意の好適な経路により、例えば点滴またはボーラス注入により、上皮もしくは粘膜皮膚の内膜（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸の粘膜、など）を介した吸収により組成物を投与することができ、及び別の生物学的活性な薬剤と共に組成物を投与することができる。投与は、全身性または局所的であることができる。
標準的な針及びシリンジにより、皮下にまたは静脈内に本発明の医薬組成物を送達することができる。さらに、皮下送達に関して、本発明の医薬組成物の送達にペン型送達デバイスが容易に適用される。そのようなペン型送達デバイスは再使用可能であり、または使い捨てであり得る。再使用可能なペン型送達デバイスは、医薬組成物を含有する交換可能なカートリッジを一般的には利用する。カートリッジ内の全ての医薬組成物が投与されてカートリッジが空になると、空のカートリッジを容易に廃棄し、医薬組成物を含有する新しいカートリッジと交換することができる。その後、ペン型送達デバイスを再使用することができる。使い捨てペン型送達デバイスでは交換可能なカートリッジがない。正確には、使い捨てペン型送達デバイスは、デバイス内のリザーバ中に収容される医薬組成物が予め充填されている。リザーバの医薬組成物が空になると、デバイス全体が廃棄される。
本発明の医薬組成物の皮下送達において、多数の再使用可能なペン型及び自己注射型送達デバイスが適用される。ほんの数例を挙げると、例には、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ，ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩ
Ｃ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｅｒｇｄｏｒｆ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ ＭＩＸ ７５／２５（商標）ペン、
ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）
、ＮＯＶＯＰＥＮ ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒ
ａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、及びＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（ｓ
ａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、が含まれるが、これらに限定されない。ほんの数例を挙げると、本発明の医薬組成物の皮下送達において適用される使い捨てペン型送達デバイスの例には、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、
及びＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）自己
注射器（Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈ
ａｓｅｌｍｅｉｅｒ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ，Ｌ．Ｐ．）、並びにＨＵＭＩＲＡ（商標）ペン（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ ＩＬ）、が含まれるが、これらに限定されない。
ある特定の状況では、医薬組成物を制御された放出システムにおいて送達することができる。一実施形態では、ポンプを用いてもよい（Ｌａｎｇｅｒ，上記参照；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１）。別の
実施形態では、ポリマー材料を使用することができる；Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓ
ｅ（ｅｄｓ．），１９７４，ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ参照。さらに別の実施形態では、制御された放出システムを組成物の標的の近くに設置することができ、従って、全身用量の一部のみ必要とされる（例えばＧｏｏｄｓｏｎ，１９８４，前記Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅのｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８参照）。別の制御された放出システムは、Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３による概説で
考察されている。
注射可能な調製物は、静脈内、皮下、皮内及び筋肉内注射、点滴、などのための剤形を含むことができる。これらの注射可能な調製物は公知の方法で調製することができる。例えば、注射可能な調製物は、例えば、注射用に従来用いられる滅菌の水性媒体または油性媒体に、上記の抗体もしくはその塩を、溶解、懸濁、もしくは乳化することによって調製することができる。注射用の水性媒体として、例えば、生理食塩水、グルコース及び別の助剤、などを含有する等張液があり、これは、アルコール（例えば、エタノール）、多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（硬化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）添加物）］、などの適切な可溶化剤と組合せて使用することができる。油性媒体として、例えば、ゴマ油、大豆油、などが使用され、これは、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール、などの可溶化剤と組合せて使用することができる。このように調製された注射剤は、好ましくは適切なアンプル中に充填される。
好適には、上記の経口用途または非経口用途の医薬組成物は、活性成分の用量に合うように適合された単位用量で剤形に調製される。そのような単位用量の剤形は、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル剤）、坐剤、などを含む。含有される上記の抗体の量は、一般的に単位用量の剤形当たり約５〜約５００ｍｇである；特に注射剤の形態では、上記の抗体は約５〜約１００ｍｇで含有され、別の剤形では約１０〜約２５０ｍｇで含有されることが好ましい。
抗体の治療的使用
本発明者らによって行われたような、マウスモデル系を用いた実験は、ＡＰＬＮＲの拮抗作用によって治療、予防及び／または改善され得る、様々な疾患及び病態の識別に貢献してきた。例えば、アペリン（−／−）ノックアウトマウスは、目の正常な発達の血管形成の明らかな障害を示す。さらに、ＡＰＬＮＲ（−／−）マウスには、体液の恒常性変化
と浸透圧ストレスへの応答変化がある（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｅｍ ｅｔ ａｌ．２００９，Ｊ
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ２０２：４５３−４６２； Ｒｏｂｅｒｔｓ，ＥＭ，ｅｔ ａｌ．２０１０，Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ２２：３０１−３０８）。別の例では、ＡＰＬＮＲ−／−マウスは、正常なベースライン血圧及び心拍数を示したが、アペリンに対する血圧降下応答を欠く（Ｃｈａｒｏ，ｅｔ ａｌ．２００９，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９７：Ｈ１９０４-Ｈ１９１３［２００９年９月１８日電子出版］）。さらに、典型的な抗ＡＰＬＮＲ抗体は受容体のアンタゴニストであり、網膜血管の発達（ＲＶＤ）モデルで測定される目の脈管構造におけるＡＰＬＮＲ媒介抗血管新生効果を示す。
アペリン−１３をそのＣ末端フェニルアラニン（Ｆ）でアラニン（Ａ）（すなわちアペリン−１３（Ｆ１３Ａ））に修飾することによって誘導された機能的アンタゴニストなどの受容体のアンタゴニストは、ＡＰＬＮＲの血圧降下作用をブロックすることが示された（Ｌｅｅ，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ２００５，１４６（１）：２３１−２３６）。
アペリンペプチドは、脂肪組織の拡大による肥満を促進し得る。アペリンは低酸素症によって誘導され、拡大する脂肪組織の低酸素内部の血管新生を駆動する。（Ｋｕｎｄｕｚｏｖａ Ｏ，ｅｔ ａｌ．，２００８，ＦＡＳＥＢ Ｊ，２２：４１４６-４１５３）。抗ＡＰＬＮＲ抗体は、組織特異的に、このメカニズムの抑制剤として作用して、体重減少を促進するか、または肥満を治療することができる。従って、抗ＡＰＬＮＲ抗体は、肥満を治療するために及び体重減少を促進するために投与することができる。
腫瘍増殖もしくは網膜における血管新生の促進に関与する病的血管新生は、アペリンまたはＡＰＬＮＲアンタゴニストに応答することができる。（Ｋｏｊｉｍａ，Ｙ．ａｎｄ
Ｑｕｅｒｔｅｒｍｏｕｓ，Ｔ．，２００８，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ，２８：１６８７−１６８８；Ｒａｙａｌａｍ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．２０１１，Ｒｅｃｅｎｔ Ｐａｔ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ６（３）：３
６７−７２）。従って、抗ＡＰＬＮＲ抗体は、腫瘍の増殖もしくは転移を遅くするか、または癌及び転移性疾患を治療するために投与され得る。
アペリンは、ＶＥＧＦ及びＧＦＡＰの進行的な過剰発現と関連付けることができ、増殖期への糖尿病性網膜症（ＤＲ）の進行中のアペリン媒介シグナル伝達の役割を示唆する。抗ＡＰＬＮＲ抗体は、ＤＲの早期の予防及び治療のために投与され得る（Ｌｕ，Ｑ．ｅｔ
ａｌ，２０１３，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８（７）：ｅ６９７０３）。
ＡＰＬＮＲアンタゴニストは、線維性組織におけるように、病原性の疾患によって引起される過活性アペリン系の影響を改善することにより、血管新生を減少させ、機能を改善することもできる（Ｐｒｉｎｃｉｐｅ，ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ
，４８（４）：１１９３−１２０１；Ｒｅｉｃｈｅｎｂａｃｈ，ｅｔ ａｌ．，２０１２
，ＪＰＥＴ ３４０（３）：６２９−６３７）。任意の１つの理論に拘束されることなく
、アペリン系をブロックすると、肝硬変などの病的状態におけるように、修復もしくは反応過程における臓器または組織における過剰な線維性結合組織の形成を、遅くすることができる。従って、抗ＡＰＬＮＲ抗体は、線維症の進行を遅らせるかもしくは予防する、または線維症を治療するために投与される阻害剤として使用することができる。
本発明の抗体は、ＡＰＬＮＲの発現、シグナル伝達もしくは活性によって関連付けられる、もしくは媒介される任意の疾患または障害、またはＡＰＬＮＲとＡＰＬＮＲリガンド（例えば、アペリン）間の相互作用を遮断すること、もしくは別の方法でＡＰＬＮＲ活性及び／もしくはシグナル伝達を阻害することにより治療可能な任意の疾患または障害の治
療、予防並びに／または改善のために、とりわけ、有用である。例えば、本発明は、肥満、癌、転移性疾患、網膜症、線維症、及び病理学的な血管新生からなる群から選択される疾患または障害を治療する方法を提供する。一実施形態では、ＡＰＬＮＲモジュレーターは体重減少を促進する。別の実施形態では、ＡＰＬＮＲモジュレーターは、病的血管新生または血管新生を減少させる。他の実施形態では、ＡＰＬＮＲモジュレーターは腫瘍の増殖を減少させるかまたは阻害する。
動物モデル系を用いた実験を含む他の状況では、様々な疾患及び病態の治療は、ＡＰＬＮＲアゴニズムまたは部分的アゴニズムにより有効であることが示されている。アペリンなどのＡＰＬＮＲのアゴニストは、強心薬、特に陽性変力薬など、心血管状態の管理のために投与されてきた。特定の理論に拘束されることなく、陽性変力薬は、心筋の収縮性を増加させ、うっ血性心不全、心筋梗塞、心筋症、及びその他などの病態において心臓機能をサポートするために使用される。（Ｄａｉ，ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈ
ａｒｍａｃｏｌ ５５３（１−３）：２２２−２２８；Ｍａｑｕｉｒｅ，ｅｔ ａｌ，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．２００９；５４：５９８−６０４；及びＢｅｒｒｙ， Ｍ．，．
ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１１０：ＩＩ１８７−ＩＩ１９３参照）。アペリン誘導性血管拡張は、虚血再灌流障害において保護的であり得る。アペリンペプチドによる血管新生の促進及びより大きな非漏出性血管の誘導は、虚血からの機能回復に寄与することができる。（Ｅｙｒｉｅｓ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｉｒｃ Ｒｅ
ｓ １０３：４３２-４４０；Ｋｉｄｏｙａ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｂｌｏｏｄ １
１５：３１６６-３１７４）。
アペリン受容体アゴニストは、心拍出量を増加させ、心機能を改善し、心機能を安定化させ、心機能の低下を制限し、または心臓または他の組織の虚血性または損傷領域に新たな血管の成長を促進するために投与される、血管新生促進薬と考えられている。従って、本発明のアゴニストＡＰＬＮＲモジュレーターは、例えば、四肢虚血、末梢虚血、腎虚血、目の虚血、脳虚血、または任意の虚血性疾患を治療するために、血管新生を促進し、従って、虚血を治療し、虚血性臓器や組織への血流を回復するのに有用である。
アペリンは、肥満インスリン耐性マウスでは、筋肉組織によって、グルコース耐性を改善し、グルコース利用を促進することも示されている（Ｄｒａｙ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ ８：４３７-４４５）。アペリンＫＯマウスではインスリン感受
性は減少している（Ｙｕｅ ａｔ ａｌ．，２０１０，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏ
ｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ２９８：Ｅ５９-Ｅ６７）。従って、アゴニストのような抗体
−アペリン融合タンパク質は、インスリン耐性糖尿病の治療におけるグルコース耐性を改善することができ、従って、糖尿病に関連した代謝状態の管理のために投与することができる。
筋肉のアペリンｍＲＮＡレベルの変化は、全身インスリン感受性の改善にも相関している（Ｂｅｓｓｅ−Ｐａｔｉｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ａｕｇ ２７，Ｉｎｔ Ｊ Ｏ
ｂｅｓ（Ｌｏｎｄ）．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｉｊｏ．２０１３．１５８，［印刷前電子出版］）。筋肉組織におけるそのような代謝の改善、及びアペリン誘導性血管拡張により、アゴニストのような抗体−アペリン融合タンパク質は、筋肉の成長と持久力を刺激するためにも投与することができる。
一次ＨＩＶ−１分離株は、共同受容体としてＡＰＬＮＲも使用できることが示されており、合成アペリンペプチドは、ＣＤ４−ＡＰＬＮＲ発現細胞へのＨＩＶ−１の侵入を阻害した（Ｃａｙａｂｙａｂ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：１
１９７２−１１９７６）。アゴニストのような抗体−アペリン融合タンパク質は、ＨＩＶ感染も治療することができる。アペリン−神経防護作用が、アペリンペプチドが神経細胞
の生存を促進するためにシグナル伝達経路を介して作用する場合にも見られる（Ｃｈｅｎｇ，Ｂ，ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，３７（１）：１７１−３）。従っ
て、抗体−アペリン融合タンパク質は、神経細胞の生存を促進するかもしくは増加させ、または神経損傷または神経変性を治療することができる。アペリン受容体アゴニストは、ホットフラッシュ抑制剤として記載されている。（２０１２年１０月４日公開のＷＯ２０１２／１３３８２５参照）従って、本発明の抗体−アペリン融合タンパク質は、対象のホットフラッシュの症状を治療、改善または抑制するためにも投与することができる。
本発明の抗体融合タンパク質は、とりわけ、ＡＰＬＮＲの発現、シグナル伝達、もしくは活性を活性化または刺激することと関連付けられるか、もしくはそれによって媒介される任意の疾患または障害の治療、予防及び／または改善に有用である。例えば、本発明は、心血管疾患、急性非代償性心不全、鬱血性心不全、心筋梗塞、心筋症、虚血、虚血／再灌流傷害、肺高血圧症、糖尿病、神経細胞傷害、神経変性、ホットフラッシュ症状、体液の恒常性、及びＨＩＶ感染からなる群から選択される疾患または障害を治療するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＡＰＬＮＲモジュレーターは、虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）損傷を制限するかまたは心臓組織の壊死の発症を遅延させるなど、虚血及び再灌流障害を治療または軽減するのに有用であり、または例えば、虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害から心臓を保護し、心機能を改善し、もしくは進行性心筋梗塞を制限するための予防的治療を提供するために、有用である。
本明細書に記載される治療方法の関連では、ＡＰＬＮＲモジュレーターは、単独療法として（すなわち、唯一の治療薬として）、または、１つまたは複数の追加の治療薬と組合せて（それらの実施例は本明細書の他の個所に記載される）、投与され得る。
併用療法及び製剤
本発明は、１つまたは複数の追加の治療的に活性な成分と組合せた本明細書に記載のＡＰＬＮＲモジュレーターの任意のものを含む組成物及び治療用製剤、並びに、それを必要とする対象に、そのような組合せ物を投与することを含む治療方法、を含む。
本発明のＡＰＬＮＲモジュレーターは、例えば、小分子血管新生阻害剤を含むＶＥＧＦ阻害剤、及びＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−２６などのサイトカインに結合する抗体、またはそれらの各受容体のアンタゴニストと、共製剤化することができ及び／または組合せて投与することができる。他の追加の治療的に活性な成分は、血圧薬、カルシウムチャネルブロッカー、ジギタリス、抗不整脈薬、ＡＣＥ阻害剤、抗凝固剤、免疫抑制剤、鎮痛剤、血管拡張剤、などを含み得る。
追加の治療的に活性な成分は、本発明のＡＰＬＮＲモジュレーターの投与の直前、と同時に、またはその少し後に投与することができる；（本開示の目的に対し、そのような投与レジメンは、追加の治療的に活性な成分「との組合せで」のＡＰＬＮＲモジュレーターの投与とみなされる）。本発明は、本発明のＡＰＬＮＲモジュレーターが本明細書の他の個所に記載の１つまたは複数の追加の治療的に活性な成分と共製剤化される医薬組成物を含む。
投与レジメン
本発明のある特定の実施形態によれば、ＡＰＬＮＲモジュレーター（またはＡＰＬＮＲモジュレーターと、本明細書に記載の追加の治療的に活性な薬剤の任意のものの組合せを含む医薬組成物）の複数回の用量が、決められた時間経過で対象に投与され得る。本発明のこの態様に係る方法は、本発明のＡＰＬＮＲモジュレーターの複数回の用量を対象に連
続投与することを含む。「連続投与」は、本明細書で使用される場合、異なる時点で、例えば、所定の間隔（例えば、数時間、数日、数週間または数ヶ月）だけ隔てられて異なる日に、ＡＰＬＮＲモジュレーターの各用量を対象に投与することを意味する。本発明は、１回の初回用量のＡＰＬＮＲモジュレーター、それに続いて１回または複数回の第２の用量のＡＰＬＮＲモジュレーター、及び任意選択で、それに続いて１回または複数回の第３の用量のＡＰＬＮＲモジュレーターを患者に連続投与することを含む方法を包含する。
用語「初回用量」、「第２の用量」、及び「第３の用量」は、本発明のＡＰＬＮＲモジュレーター投与の時系列を指す。従って、「初回用量」は、治療レジメンの最初に投与される用量であり（「ベースラインの用量」とも呼ばれる）；「第２の用量」は、初回用量の後に投与される用量であり；「第３の用量」は、第２の用量の後に投与される用量である。初回、第２、及び第３の用量は、全て同じ量のＡＰＬＮＲモジュレーターを含み得るが、一般的には、投与回数に応じて互いに異なり得る。しかし、ある特定の実施形態では、初回、第２、及び／または第３の用量に含まれるＡＰＬＮＲモジュレーターの量は、治療の経過で互いに異なる（例えば、必要に応じて上方または下方に調節される）。ある特定の実施形態では、治療レジメンの最初に「負荷用量」として複数回（例えば２回、３回、４回、または５回）の用量が投与され、続いて次の用量はそれより少ない回数で（例えば「維持量」で）投与される。
本発明のある特定の例示的な実施形態では、第２及び／または第３の用量のそれぞれは、すぐ前の投与から１週間後から２６週間後（例えば、１、１ １／２、２、２ １／２、３、３ １／２、４、４ １／２、５、５ １／２、６、６ １／２、７、７ １／２、８、８ １／２、９、９ １／２、１０、１０ １／２、１１、１１ １／２、１２、１２ １／２、１３、１３ １／２、１４、１４ １／２、１５、１５ １／２、１６、１６ １／２、１７、１７ １／２、１８、１８ １／２、１９、１９ １／２、２０、２０ １／２、２１、２１ １／２、２２、２２ １／２、２３、２３ １／２、２４、２４ １／２、２５、２５ １／２、２６、２６ １／２週間、またはそれ以後）に投与される。語句「すぐ前の投与」は、本明細書で使用される場合、一連の複数回投与において、その順番において次の用量が投与される前に、介在する投与なしに患者に投与されるＡＰＬＮＲモジュレーターの投与を意味する。
本発明のこの態様に係る方法は、患者に、任意の回数の第２及び／または第３の用量のＡＰＬＮＲモジュレーターを投与することを含み得る。例えば、ある特定の実施形態では、１回のみの第２の用量が患者に投与される。別の実施形態では、複数回の（例えば、２、３、４、５、６、７、８回、またはそれ以上）の第２の用量が患者に投与される。同様に、ある特定の実施形態では、１回のみの第３の用量が患者に投与される。他の実施形態では、複数回（例えば、２、３、４、５、６、７、８回、またはそれ以上）の第３の用量が患者に投与される。
複数回の第２の用量を含む実施形態では、各第２の用量は、他の第２の用量と同じ頻度で投与され得る。例えば、各第２の用量は、すぐ前の投与から１〜２週間後または１〜２ヶ月後に患者に投与され得る。同様に、複数回の第３の用量を含む実施形態では、各第３の用量は、他の第３の用量と同じ頻度で投与され得る。例えば、各第３の用量は、すぐ前の投与から２〜１２週間後に患者に投与され得る。本発明のある特定の実施形態では、第２及び／または第３の用量が患者に投与される頻度を、治療レジメンの経過中に変えることができる。臨床検査後の個々の患者の必要性に応じて、処置の経過中に医師が投与頻度を調節することもできる。
本発明は、２〜６負荷用量が、患者に第１の頻度で（例えば、１週間に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、月に一度、２ヶ月毎に一回、など）投与され、より少ない頻度
ベースでの患者への複数の維持用量の投与が続く、投与レジメンを含む。例えば、本発明のこの態様によれば、負荷用量が月に１度の頻度で投与される場合、次いで、維持用量が、６週間毎に１回、２ヶ月毎に１回、３ヶ月毎に１回、など、患者に投与され得る。
抗体の診断使用
本発明の抗ＡＰＬＮＲは、例えば、診断目的で、サンプル中のＡＰＬＮＲまたはＡＰＬＮＲ発現細胞を検出及び／または測定するのに使用することもできる。例えば、抗ＡＰＬＮＲ、またはその断片は、ＡＰＬＮＲの異常発現（例えば、過剰発現、過少発現、発現の欠損、など）によって特徴付けられる病態または疾患を診断するのに使用することができる。ＡＰＬＮＲに関する例示的な診断アッセイは、例えば患者から得たサンプルを本発明の抗ＡＰＬＮＲ抗体と接触させることを含むことができ、ここにおいて抗ＡＰＬＮＲ抗体は検出可能な標識またはレポーター分子で標識されている。本発明の抗体融合タンパク質は、アペリン融合成分または抗体成分が検出可能な標識またはレポーター分子で標識されるようなアッセイにおいて使用することができる。あるいは、それ自体が検出可能に標識されている２次抗体と組み合わせて、標識されていない抗ＡＰＬＮＲ抗体を診断用途で使用することができる。検出可能な標識またはレポーター分子は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓもしくは１２５Ｉなどの放射性同位体；フルオロセイン イソチオシアネートもし
くはローダミンなどの蛍光部分もしくは化学発光部分；またはアルカリ ホスファターゼ
、ベータ−ガラクトシターゼ、西洋ワサビ ペルオキシダーゼもしくはルシフェラーゼな
どの酵素であることができる。サンプル中のＡＰＬＮＲを検出または測定するのに使用することができる特定の例示的なアッセイには、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が含まれる。
本発明に係るＡＰＬＮＲ診断アッセイで用いることができるサンプルには、正常な状態下または病的状態下で、検出可能な量のＡＰＬＮＲタンパク質またはその断片を含む患者から得ることができる、任意の組織または液体サンプルが含まれる。一般には、健康な患者（例えば、異常なＡＰＬＮＲのレベルまたは活性に関連する疾患または病態に罹患していない患者）から得られた特定のサンプル中のＡＰＬＮＲのレベルが、最初にベースラインまたは標準のＡＰＬＮＲレベルが確立するために測定されるであろう。次いで、このベースラインレベルのＡＰＬＮＲを、ＡＰＬＮＲに関連した疾患または病態を有する疑いがある個体から得たサンプルで測定したＡＰＬＮＲのレベルと比較することができる。
以下の実施例は、本発明の方法及び組成物を作成し、使用する方法の完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示されており、発明者が発明として考えていることの範囲を限定することを意図するものではない。使用される数（例えば、量、温度、など）に関する精度を確実にするために努力がなされているが、いくつかの実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。別途示されなければ、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏の度数であり、圧力は大気圧またはその近傍である。
実施例１．ヒトＡＰＬＮＲに対するヒト抗体の生成
ヒトＡＰＬＮＲを含む免疫原を、ヒト免疫グロブリン重鎖及びκ軽鎖の可変領域を含むＤＮＡをコードするＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスに、免疫応答を刺激するためのアジュバントと共に、直接投与した。抗体の免疫応答は、抗ＡＰＬＮＲイムノアッセイによってモニターした。所望の免疫応答が達成されたときに脾細胞を採取し、それらの生存率及び形態ハイブリドーマ細胞株を維持するためにマウス骨髄腫細胞と融合させた。ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングし、抗ＡＰＬＮＲ抗体を産生する細胞株を識別するために選択した。この技術を用いて、いくつかの抗ＡＰＬＮＲキメラ抗体（すなわち、ヒト可変ドメイン及びマウス定常ドメインを有する抗体）を得た。このような方法で生成された例示的な抗体を以下のように指定した：Ｈ１Ｍ９２０７Ｎ、Ｈ２ａＭ９２３０Ｎ
、及びＨ２ａＭ９２３２Ｎ。キメラ抗体からのヒト可変ドメインを、次いで、本明細書に記載の完全ヒト抗ＡＰＬＮＲ抗体を作成するために、ヒト定常ドメインにクローニングした。
２００７年１２月６日に公開された米国特許出願公開第２００７／０２８０９４５Ａ１号に記載されるように、抗ＡＰＬＮＲ抗体を、骨髄腫細胞と融合させることなく、抗原陽性Ｂ細胞からも直接単離した。この方法を使用して、いくつかの完全ヒト抗ＡＰＬＮＲ抗体（すなわち、ヒト可変ドメイン及びヒト定常ドメインを有する抗体）を得た。この方法で生成された例示的な抗体を以下のように指定した：Ｈ４Ｈ９０９２Ｐ、Ｈ４Ｈ９０９３Ｐ、Ｈ４Ｈ９１０１Ｐ、Ｈ４Ｈ９１０３Ｐ、Ｈ４Ｈ９１０４Ｐ、Ｈ４Ｈ９１１２Ｐ、及びＨ４Ｈ９１１３Ｐ。
この実施例の方法に従って生成された例示的な抗ＡＰＬＮＲ抗体のある特定の生物学的特性は、以下に記載する実施例において詳細に記載される。
実施例２．重鎖及び軽鎖可変領域アミノ酸配列
表１は、選択された抗ＡＰＬＮＲ抗体及びそれらの対応する抗体の識別子の、重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列対、並びにＣＤＲ配列を記載する。
Figure 0006738449
抗体は、典型的には、本明細書では以下の命名法に従って言及される：Ｆｃ接頭語（例えば「Ｈ１Ｍ」または「Ｈ４Ｈ」）、続いて数値識別子（例えば表１に示されるように「９２０７」、「９２０９」または「９２３０」）、続いて接尾語「Ｐ」または「Ｎ」。従って、この命名法によれば、抗体は本明細書では、例えば、「Ｈ１Ｍ９２０７Ｎ」、「Ｈ
２ａＭ９２０９Ｎ」、「Ｈ４Ｈ９１１３Ｐ」などと言及される。本明細書で使用される抗体呼称のＨ１Ｍ、Ｈ２ａＭ、及びＨ４Ｈ接頭語は、抗体の特定のＦｃ領域アイソタイプを示す。例えば、「Ｈ１Ｍ」抗体はマウスＩｇＧ１ Ｆｃを有し、「Ｈ２ａＭ」抗体はマウスＩｇＧ２ａ Ｆｃを有するが、一方「Ｈ４Ｈ」抗体はヒトＩｇＧ４ Ｆｃを有する。当業者によって理解されるように、特定のＦｃアイソタイプを有する抗体は、異なるＦｃアイソタイプを有する抗体に変換することができる（例えば、マウスＩｇＧ１ Ｆｃを有する抗体は、ヒトＩｇＧ４を有する抗体に変換することができる、など）が、いずれにしても、表１に示される数値識別子で示される可変ドメイン（ＣＤＲを含む）は同じままであり、結合特性は、Ｆｃドメインの性質にかかわらず同一または実質的に同様であると考えられる。一実施例では、Ｈ２ａＭ９２０９Ｎと呼称される抗体は、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域を有するように操作された。従って、本明細書でＨ４Ｈ９２０９Ｎと呼称される抗体は、ヒトＩｇＧ４ドメインを有し、及び同じ重鎖（ＨＣ）または軽鎖（ＬＣ）、従って抗体Ｈ２ａＭ９２０９Ｎと実質的に同じ結合及び細胞活性特性を有する。
実施例３．抗体融合タンパク質の生成
本発明の抗体融合タンパク質をコードする核酸を製造するために、選択された抗ＡＰＬＮＲ抗体の重鎖及び軽鎖可変領域アミノ酸配列対、及びＣＤＲ配列は、ポリメラーゼ連鎖反応を介して増幅され、重鎖（ＨＣ）または軽鎖（ＬＣ）のいずれかは、アペリン−１３（配列番号２２８）をコードする配列、またはＣ末端を切断したアペリン−Ｃｔｅｒ９（配列番号２７０）、アペリン−Ｃｔｅｒ１０（配列番号２７１）、もしくはアペリン−Ｃｔｅｒ１１（配列番号２６２）などの、修飾されたアペリンペプチドに結合された。表２Ａ及び表２Ｂのアペリン含有抗体融合タンパク質をコードする連続した核酸配列は、標準的なＰＣＲ及び制限エンドヌクレアーゼクローニング技術を使用して、発現ベクターにクローニングされた。
表２Ａは、選択された抗体融合タンパク質及びそれらの対応する抗体融合物命名法の、重鎖及び軽鎖可変領域アミノ酸配列対、重鎖Ｆｃ領域、並びにアペリン融合パターンを特定する。いくつかの例示の抗体融合タンパク質では、アペリンペプチドは重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）に融合され、他の実施例では、アペリンペプチドは軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）または軽鎖（軽鎖定常領域を含んでも含まなくてもよい）に融合される。いくつかの実施例では、アペリンペプチドは、リンカーを介してポリペプチドに融合される。表２Ｂは、ある特定の例示的な配列ペアを示し、例えば重鎖または軽鎖配列のいずれかは、アペリン配列（融合物）に融合される。
Figure 0006738449
Figure 0006738449
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これらの方法に従って生成された例示的抗体融合タンパク質のある特定の生物学的特性は、以下に記載の実施例において詳細に記載される。
実施例４．ＦＡＣＳ解析により決定されるヒトＡＰＬＮＲに結合する抗体及び抗体融合タンパク質
精製抗ＡＰＬＮＲモノクローナル抗体に結合するヒトＡＰＬＮＲの結合比を、結合アッセイ、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）結合アッセイによって決定した。ルシフェラーゼレポーター［ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ、４Ｘ）−ルシフェラーゼ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ］とともに、完全長ヒトＡＰＬＮＲ（ｈＡＰＬＮＲ；配列番号２２５）または完全長カニクイザルＡＰＬＮＲ（ＭｆＡＰＬＮＲ；配列番号２２６）を安定に発現するＨＥＫ２
９３細胞株を、周知の方法によって生成した。得られた安定な細胞株、ＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ｌｕｃ／ｈＡＰＬＮＲ及びＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ｌｕｃ／ＭｆＡＰＬＮＲを、ｈＡＰＬＮＲ細胞に対して１００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢまたはＭｆＡＰＬＮＲ細胞に対して５００μｇ／ｍＬのＧ４１８のいずれかとともに、１０％ＦＢＳ、ＮＥＡＡ、及びペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中に保持した。
ＦＡＣＳ解析に関しては、ＨＥＫ２９３親、ＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ｌｕｃ／ｈＡＰＬＮＲ、及び、ＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ｌｕｃ／ｍｆＡＰＬＮＲ細胞を無酵素解離試薬（＃Ｓ−００４，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて解離し、１０６細胞／ウェルを、１％ＦＢＳを含むＰＢＳ中で９６ウェルＶ底プレート上に播種した。次いで、細胞を、１０μｇ／ｍＬの抗ＡＰＬＮＲ抗体または陰性アイソタイプ対照抗体で、４℃で３０分間インキュベートし、続いて、１％ＦＢＳを含有するＰＢＳで洗浄し、４μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ６４７（＃１１５−６０７−００３，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉ
ｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）との結合抗マウス
ＩｇＧ抗体またはＡｌｅｘａ４８８（＃１０９−５４７−００３，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍ
ｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）との結合抗ヒトＩｇＧ抗体のいずれかで、４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を濾過し、Ａｃｃｕｒｉ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で分析した。未染色及び二次抗体単独の対照は、すべての細胞株への結合についても試験した。結果は、ＦｌｏｗＪｏバージョン９．５２ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．，Ａｓｈｌａ
ｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）を用いて解析し、生細胞に対する蛍光の幾何平均を決定した。次いで、各細胞タイプ：ＨＥＫ２９３（親）、ＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ｌｕｃ／ｈＡＰＬＮＲ及びＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ｌｕｃ／ＭｆＡＰＬＮＲ毎に、抗体の相対結合（結合比）を得るために、各抗体の蛍光の幾何平均（Ｇｅｏｍ．ｍｅａｎ）を、非染色細胞の幾何平均に対して正規化した。
異なる抗ＡＰＬＮＲモノクローナル抗体に対する結合比を、表３及び４に示す。表３に示されるように、７つの抗ＡＰＬＮＲ抗体は、４５２〜４０９８倍の範囲の結合比でＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ｌｕｃ／ｈＡＰＬＮＲ細胞に、及び３１〜１４３８倍の範囲の結合比でＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ｌｕｃ／ＭｆＡＰＬＮＲ細胞に結合した。試験した抗ＡＰＬＮＲ抗体は、２〜９倍の範囲の結合比でＨＥＫ２９３親細胞に結合した。抗マウスＩｇＧ二次抗体単独及びマウスＩｇＧ（ｍＩｇＧ）対照抗体は１〜７倍の範囲の結合比で細胞に結合した。表４に示されるように、さらなる７つの抗ＡＰＬＮＲ抗体は、２〜６１倍の範囲の結合比でＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ｌｕｃ／ｈＡＰＬＮＲ細胞に、及び１〜３１倍の範囲の結合比でＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ｌｕｃ／ＭｆＡＰＬＮＲ細胞に結合した。試験した抗ＡＰＬＮＲ抗体は、１〜３倍の範囲の結合比でＨＥＫ２９３親細胞に結合した。抗ヒトＩｇＧ二次抗体単独及びアイソタイプ対照抗体は、１〜２倍の範囲の結合比で細胞に結合した。
Figure 0006738449
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表３及び４に示されるように、本発明のいくつかの抗ＡＰＬＮＲ抗体は、ＡＰＬＮＲに特異的に結合する。
さらに、Ｎ末端またはＣ末端で融合したアペリンを有する１３個の抗体を、それらのＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ｌｕｃ／ｈＡＰＬＮＲ及びＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ｌｕｃ／ＭｆＡＰＬＮＲ細胞に結合する能力について試験した。表５に示されるように、Ｎ末端またはＣ末端に融合したアペリンを有するＨ４Ｈ９０９３Ｐは、３１〜１５１倍の範囲の結合比でＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ｌｕｃ／ｈＡＰＬＮＲ細胞に、及び１６〜５４倍の範囲の結合比でＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ｌｕｃ／ＭｆＡＰＬＮＲ細胞に結合することを示し、一方親抗体、Ｈ４Ｈ９０９３Ｐは、６１倍の結合比でＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ｌｕｃ／ｈＡＰＬＮＲ細胞に、及び３１倍の結合比でＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ｌｕｃ／ＭｆＡＰＬＮＲ細胞に結合した。表５に示されるように、Ｎ末端またはＣ末端に融合したアペリンを有するＨ４Ｈ９０９２Ｐは、１６〜７９倍の範囲の結合比でＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ｌｕｃ／ｈＡＰＬＮＲ細胞に、及び６〜３１倍の範囲の結合比でＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ｌｕｃ／ＭｆＡＰＬＮＲ細胞に結合することを示し、一方親抗体、Ｈ４Ｈ９０９２Ｐは、３７倍の結合比でＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ｌｕｃ／ｈＡＰＬＮＲ細胞に、及び２０倍の結合比でＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ｌｕｃ／ＭｆＡＰＬＮＲ細胞に結合した。表５に示されるように、Ｎ末端に融合したアペリンを有するＨ４Ｈ９２０９Ｎは、１０６〜１２１倍の範囲の結合比でＨ
ＥＫ２９３／ＣＲＥ−ｌｕｃ／ｈＡＰＬＮＲ細胞に、及び４３〜５２倍の範囲の結合比でＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ｌｕｃ／ＭｆＡＰＬＮＲ細胞に結合することを示し、一方親抗体Ｈ４Ｈ９２０９Ｎは、８２倍の結合比でＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ｌｕｃ／ｈＡＰＬＮＲ細胞に、及び４２倍の結合比でＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ｌｕｃ／ＭｆＡＰＬＮＲ細胞に結合した。
抗体−アペリン融合物及び対照抗体は、２〜１６倍の範囲の結合比でこのアッセイのＨＥＫ２９３親細胞へ結合することを示した。単独の抗ヒトＩｇＧ二次抗体、Ｎ末端でアペリンへ融合した抗ｍｙｃ抗体、及びアイソタイプ対照抗体は１〜１２倍の範囲の結合比率で細胞に結合した。
Figure 0006738449
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表５に示されるように、本発明のいくつかの抗体融合タンパク質は、ＡＰＬＮＲに特異的に結合する。
実施例５．抗ＡＰＬＮＲ抗体はＡＰＬＮＲを介して細胞のシグナル伝達を調節する
ｈＡＰＬＮＲ媒介細胞シグナル伝達を活性化する抗ＡＰＬＮＲ抗体の能力を、サイクリックＡＭＰアッセイを用いて測定した。ｈＡＰＬＮＲは、７回膜貫通型Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である。その内因性リガンド、アペリンによって活性化されると、それは、ｃＡＭＰ産生を阻害し阻害性Ｇタンパク質（Ｇｉ）に結合されていることを示唆する（Ｐｉｔｋｉｎ ｅｔ ａｌ，２０１０，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．６２（３）：３３１−３４２）。アペリンはプレプロペプチドから多数のアイソフォームに処理され、ピログルタミルアペリン−１３、（Ｐｙｒ１）アペリン−１３（この実施例では「アペリン」と呼ばれる）は、ｈＡＰＬＮＲを活性化することが知られているより強力なアイソフォームの１つである。
ＨＥＫ２９３細胞株を、ルシフェラーゼレポーター［ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ、４Ｘ−ルシフェラーゼ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ］）と一緒に、安定に完全長ヒトｈＡＰＬＮＲ（受託番号ＮＰ＿００５１５２．１のアミノ酸１〜３８０；配列番号２２５）を発現するようにトランスフェクトした。得られた細胞株、ＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ｌｕｃ／ｈＡＰＬＮＲは、１０％ＦＢＳ、ＮＥＡＡ、ペニシリン／ストレプトマイシン、及び１００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢを含むＤＭＥＭ中に保持した。
ｈＡＰＬＮＲによるＧｉ共役活性化を試験するために、ＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ｌｕｃ／ｈＡＰＬＮＲ細胞を、０．１％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、及びＬ−グルタミンを含むＯＰＴＩＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃３１９８５−０７０）中で２０，０００細胞／ウェルで９６ウェルアッセイプレート上に播種し、５％ＣＯ２中で３７℃で一晩インキュベートした。翌朝、フォルスコリン誘導ｃＡＭＰの阻害を介してｈＡＰＬＮＲの活性化を測定するために、アペリン（（Ｐｙｒ１）アペリン−１３， Ｂａｃｈ
ｅｍ，＃Ｈ−４５６８）を１００ｎＭから０．００２ｎＭ（アペリンを含まない対照サンプルを含む）に連続的に希釈し（１：３）、５μＭ、７．５μＭ、または１０μＭのフォルスコリン（Ｓｉｇｍａ， ＃Ｆ６８８６）とともに細胞に添加した。抗体またはアペリ
ン−抗体融合物（実施例９も参照）のｈＡＰＬＮＲを活性化する能力を測定するために、抗体は、５００ｎＭから０．０３ｎＭへ１：３、１００ｎＭから０．００２ｎＭへ１：３、１００ｎＭから０．０００１ｎＭへ１：４、１０ｎＭから０．００００１ｎＭへ１：４のいずれかで、連続的に希釈し、次いで、５μＭ、７．５μＭ、または１０μＭのフォルスコリンと混合し、外因性アペリンなしに細胞に添加した。抗体の試験は、抗体なしの対照を含んだ。抗体またはアペリン−抗体融合物のｈＡＰＬＮＲを阻害する能力を測定するために、抗体は、抗体なしの対照を含んで、５００ｎＭから０．０３ｎＭへまたは１００ｎＭから０．００２ｎＭへ１：３、１００ｎＭから．０００１ｎＭへ１：４、１０ｎＭか
ら０．００００１ｎＭへ１：４のいずれかで、連続的に希釈し、室温で１時間、細胞とともにインキュベートした。インキュベーション後、５μＭフォルスコリンと１００ρＭアペリンの混合物を、細胞に添加した。３７℃、５％ＣＯ２でのインキュベーションの５．５時間後、続いて、ＯｎｅＧｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ，＃Ｅ６０５１）を加えた後にＶｉｃｔｏｒ Ｘ装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）でルシフェラーゼ活性を検出した。
全てのアッセイの結果を、Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）内の非線形回帰（４−パラメーターロジスティクス）を用いて解析した。抗体による活性化を、アペリン用量応答で見られる最大活性化のパーセンテージとして計算した。抗体による阻害を、０〜１００ρＭアペリンのＲＬＵ範囲のパーセンテージとして、それぞれの抗体の最大と最小ＲＬＵ値の差として計算した。
未修飾抗ＡＰＬＮＲ抗体を、ＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ｌｕｃ／ｈＡＰＬＮＲ細胞におけるフォルスコリン活性の調節を測定することによって、ｈＡＰＬＮＲを活性化するそれらの能力について試験した。表６Ａに示されるように、１４個のうち１３個の未修飾の抗ＡＰＬＮＲ抗体は、アペリンなしに試験したとき、試験した最高抗体用量の１００ｎＭでｈＡＰＬＮＲの活性化を示さなかったが、一方１個の抗体、Ｈ２ａＭ９２２７Ｎは、１００ｎＭで最大アペリン活性化の１２％を示した。表６Ｂに示されるように、５個のうち４個の未修飾の抗ＡＰＬＮＲ抗体は、アペリンなしに試験したとき、試験した最高抗体用量の５００ｎＭで最大アペリン活性化の２１〜５２％のｈＡＰＬＮＲの活性化を示したが、一方１個の抗体、Ｈ２ａＭ９２３２Ｎは、試験した任意の濃度で、ｈＡＰＬＮＲの測定可能な活性化を何ら示さなかった。アペリン単独は、表６Ａ及び６Ｂに示されるように、３５ρＭ〜４４ρＭの範囲のＥＣ５０値でｈＡＰＬＮＲを活性化した。アイソタイプ対照抗体のいずれも、ｈＡＰＬＮＲの活性化を何ら示さなかった。
未修飾抗ＡＰＬＮＲ抗体を、１００ρＭアペリンの存在下でのＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ｌｕｃ／ｈＡＰＬＮＲ細胞におけるフォルスコリン活性の調節を測定することによって、ｈＡＰＬＮＲを阻害するそれらの能力について試験した。表６Ｃ及び６Ｄに示されるように、いくつかの未修飾抗ＡＰＬＮＲ抗体は、アペリンの存在下で試験した場合、１００ρＭアペリン活性化の２６〜９８％の阻害（２．４ｎＭ〜１００ｎＭ超の範囲のＩＣ５０値）を示した。試験した３つの抗体、Ｈ２ａＭ９２０９Ｎ、Ｈ２ａＭ９２２２Ｎ、及びＨ４Ｈ９０９３Ｐは、６〜１１％の範囲のアペリンの弱い最大ブロックを示したが、ＩＣ５０値を決定することはできなかった。試験した６個の抗体（Ｈ４Ｈ９０９２Ｐ、Ｈ４Ｈ９１０１Ｐ、Ｈ４Ｈ９１０３Ｐ、Ｈ４Ｈ９１０４Ｐ、Ｈ４Ｈ９１１２Ｐ、及びＨ４Ｈ９１１３Ｐ）は、ｈＡＰＬＮＲのシグナル伝達の測定可能なブロックを何ら示さなかった。アペリン単独は、表６Ｃ及び６Ｄに示されるように、４１ρＭ〜４４ρＭの範囲のＥＣ５０値でｈＡＰＬＮＲを活性化した。アイソタイプ対照抗体のいずれも、ｈＡＰＬＮＲの活性化を何ら示さなかった。
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実施例６．ｐＥＲＫで測定される抗ＡＰＬＮＲ抗体によるＡＰＬＮＲ媒介受容体シグナル伝達
本発明の抗ＡＰＬＮＲ抗体のＡＰＬＮＲシグナル伝達経路に及ぼす効果をさらに測定するために、ＡＰＬＮＲ発現細胞株からのリン酸化ＥＲＫ１／２（ｐＥＲＫ１／２）及び全ＥＲＫの量を定量するためのアッセイ（本明細書では「ｐＥＲＫアッセイ」と呼ばれる）が使用された。完全長ヒトＡＰＬＮＲ（ｈＡＰＬＮＲ；配列番号２２５）を安定に発現させるために、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株をトランスフェクトした。得
られた細胞株、ＣＨＯ／ｈＡＰＬＮＲは、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、及び２５０μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢを含むハムＦ１２中に保持した。
アッセイのために、ＣＨＯ／ｈＡＰＬＮＲ細胞を、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、及び２５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含有するハムＦ１２中で、１０，０００細胞／ウェルで９６ウェルアッセイプレートに播種した。翌日、ＡＰＬＮＲの発現を誘導し、ｐＥＲＫのアッセイのための細胞を調製するために、プレートを洗浄し、次いで１％ＢＳＡ、０．１％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン及び０．５μｇ／ｍｌのドキシサイクリンを含むハムＦ１２中で一晩インキュベートした。インキュベーション後、細胞を再び洗浄し、抗ＡＰＬＮＲ抗体の１×１０−６〜１×１０−１３Ｍの範囲の連続希釈液、アペリン−１３ペプチド（Ｃｅｌｔｅｋペプチドカスタム合成、ロット＃１１０７１２）、またはアイソタイプ対照抗体を細胞に加えた。細胞を、５％ＣＯ２中３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、ＥＬＩＳＡＯｎｅ溶解緩衝液ミックス（カタログ＃ＥＢＦ００１，ＴＧＲ Ｂ
ｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｄｅｌａｉｄｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）をプレートに加え、３００ｒｐｍで振とうしながら室温で１０分間インキュベートした。次いで、四十μＬ（４０μＬ）の細胞溶解物を、一方はｐＥＲＫ１／２を測定するために及び一方は全ＥＲＫを測定するために、各ＥＬＩＳＡプレートに移した。ｐＥＲＫ１／２（ＥＬＩＳＡＯｎｅ
＃ＥＫＴ００１，ＴＧＲ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）を検出し及び全ＥＲＫ（ＥＬＩＳＡ
Ｏｎｅ ＃ＥＫＴ０１１，ＴＧＲ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）を検出するためのＥＬＩＳＡは、製造業者の仕様書に従って行った。次いで、蛍光シグナルは、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，Ｕ
ＳＡ）を使用して測定した。測定ｐＥＲＫ１／２対測定全ＥＲＫの比を計算し、結果は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して解析した。
表７に示されるように、試験した２つの抗ＡＰＬＮＲ抗体、Ｈ２ａＭ９２２２ＮとＨ２ａＭ９２２８Ｎは、４７．６１ｎＭと６４．１２ｎＭのＥＣ５０値で、それぞれ、ｐＥＲＫ１／２対全ＥＲＫ１／２の比率を増加させ、一方アペリン−１３単独はＥＣ５０値３８．８６ρＭでｐＥＲＫ１／２対全ＥＲＫ１／２の比率を増加させた。２つの抗体のｐＥＲＫ１／２対全ＥＲＫ１／２の比率の最大の増加は、アペリン−１３のそれよりも少なかった。１つの抗ＡＰＬＮＲ抗体、Ｈ２ａＭ９２３２Ｎは、２０８．７ｎＭのＩＣ５０値で、ｐＥＲＫ１／２対全ＥＲＫ１／２の比率を減少させた。
Figure 0006738449
実施例７．盲検網膜血管の開発（ＲＶＤ）モデルにおける抗ＡＰＬＮＲアンタゴニスト抗体の全身投与（５０ｍｇ／ｋｇ）の効果
本発明の選択した抗ＡＰＬＮＲ抗体のインビボでの特性を評価するために、目の血管系
におけるＡＰＬＮＲ媒介血管新生をブロックする能力を測定した。
網膜血管の発達（ＲＶＤ）モデルは、マウスＡＰＬＮＲ（ヒト化ＡＰＬＮＲマウス）の代りのヒトＡＰＬＮＲの発現のための混合バックグラウンド株（７５％Ｃ５７ＢＬ６及び２５％ＳＶ１２９）及びホモ接合体である、仔マウスの正常な発達網膜における血管成長に及ぼすアンタゴニスト抗ＡＰＬＮＲ抗体の効果を評価するために使用された。仔マウスが、生後２日目（Ｐ２）に、５０ｍｇ／ｋｇの抗ＡＰＬＮＲアンタゴニスト抗体Ｈ２ａＭ９２３２Ｎ、または無関係のヒトＦｃ（ＨＦＣ）対照を皮下注射された。試薬をマスクし、実験者のバイアスを防止するために、溶液Ａ及び溶液Ｂと標識した。生後５日目に、組織サンプルを回収し、次いで４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中に固定した。固定された組織サンプルをＰＢＳで１５分間３回洗浄し、続いてＧＳレクチンＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，＃ＦＬ−１１０１）で染色し、網膜血管系を可視化する
ために、０．２５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ １００中に１％ＢＳＡを含む１×ＰＢＳ中で、
２５℃で一晩１：２００に希釈した。次の日に、染色されたサンプルをそれぞれ１５分間ＰＢＳで３回すすぎ、スライド上にフラットマウントし、続いてＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌ
ｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃Ｐ３６９３０）を使用してカバースリップを取付けた。画像は、落射蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ８０）を使用して２０倍の倍率で撮影した。網膜における血管新生領域を、拡張Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ６を使用して、このアッセイから取得した画像から測定した。ＩｇＧ対照抗体とＨ２ａＭ９２３２Ｎ処理されたサンプルから得られた結果の間の統計的な差を、両側の、対応のないスチューデントＴ検定（＊＊、Ｐ＜０．００１）を使用して評価した。網膜血管系の面積測定と統計解析が完了した後にのみ、サンプル識別をアンマスクした。
Figure 0006738449
図１に示されるように、抗体アンタゴニスト抗ＡＰＬＮＲ、Ｈ２ａＭ９２３２Ｎの単回皮下注射は、発生中のマウス網膜の網膜血管成長において約３０％の統計的に有意な平均減少を生じ、ＡＰＬＮＲブロックが生後５日目で有意な抗血管新生効果を有することを示した。
表８に示されるように、アンタゴニスト抗ＡＰＬＮＲ抗体、Ｈ２ａＭ９２３２Ｎを注射したマウスから採取した目は、約２．２３〜３．５７ｍｍ２の範囲の網膜血管の成長を示した。対照的に、ヒトＦｃを注射したマウスから採取した目は、約３．２４〜４．９５ｍｍ２の範囲の網膜血管の成長を示した。
実施例８−ＣＲＥアッセイにおける修飾アペリンペプチドの有効性と効力
Ｎ末端もしくはＣ末端を欠失または付加した１つまたは複数のアミノ酸を有するアペリン−１３ペプチドなどの修飾アペリン−１３ペプチドが、ｈＡＰＬＮＲの活性化を検出するために開発されたバイオアッセイにおけるＡＰＬＮＲの活性化に対する、それらの相対的効力について試験された。（２０１４年９月２５日に公開され、参照により本明細書に組込まれるＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１４／１５２９５５Ａ１号参照。）以下の実施例９に示されるように、選択した抗ＡＰＬＮＲ抗体のＮ末端またはＣ末端につながれた、アペリン−１３または修飾アペリンペプチドを有する様々な抗体融合タンパク質も作成し、活
性化について試験した。
簡潔には、ＨＥＫ２９３細胞株を、ルシフェラーゼレポーター［ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ、４Ｘ−ルシフェラーゼ］）と一緒に、安定に完全長ヒトｈＡＰＬＮＲ（受託番号ＮＰ＿００５１５２．１のアミノ酸１〜３８０）を発現するようにトランスフェクトした。得られた細胞株、ＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ｌｕｃ／ｈＡＰＬＮＲは、１０％ＦＢＳ、ＮＥＡＡ、ペニシリン／ストレプトマイシン、及び１００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢを含むＤＭＥＭ中に保持した。バイオアッセイのために、ＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ｌｕｃ／ｈＡＰＬＮＲ細胞を、０．１％ＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミンを補充した８０μＬのＯＰＴＩＭＥＭ中で２０，０００細胞／ウェルで９６ウェルアッセイプレートに播種し、５％ＣＯ２中で、３７℃で１６時間インキュベートした。翌朝、ｈＡＰＬＮＲ活性化を介してフォルスコリン誘導ｃＡＭＰ産生の阻害を測定するために、未修飾アペリンペプチド及び修飾アペリンペプチド（表９参照）を連続的に希釈し（１：３）次いでアッセイバッファー（５μＭ最終フォルスコリン濃度）中でフォルスコリン（Ｓｉｇｍａ，＃Ｆ６８８６）と混合し、細胞に加えた。５％ＣＯ２中３７℃での５時間のインキュベーションの後、Ｏｎｅ Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，＃Ｅ６０５１
）の添加後にＶｉｃｔｏｒ Ｘ装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して発光を測定した。データはＰｒｉｓｍ ５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）による４パラメーターロ
ジスティック式に非線形回帰により当てはめた。
表９に示されるように、アペリン−１３は、Ｎ末端とＣ末端の両方からのアミノ酸の欠失を許容することができるが、まだＣＲＥアッセイにおける完全な有効性を維持し、アペリン−１３と比較して異なる程度の効力の減少を示す。さらに、アペリン−１３は、そのＣ末端に、５グリシン残基（例えば、アペリン−１３＋５Ｇ）など、アミノ酸残基の付加を許容することができ、まだ完全な有効性を維持するが、アペリン−１３に対して効力は減少している。
Figure 0006738449
実施例９．抗体融合タンパク質はＡＰＬＮＲを活性化する
抗体−アペリン融合の、ｈＡＰＬＮＲ媒介細胞シグナル伝達を活性化する能力を、実施例５で上述したアッセイと同様に、サイクリックＡＭＰアッセイを使用して測定した。抗体のＮ末端またはＣ末端で３つの異なる抗ＡＰＬＮＲ抗体（Ｈ４Ｈ９０９２Ｐ、Ｈ４Ｈ９０９３ＰとＨ４Ｈ９２０９Ｎ）に融合した様々な長さのアペリンペプチド、及び対照抗体（抗ｍｙｃ）のＮ末端に融合したアペリンを、ＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ｌｕｃ／ｈＡＰＬＮＲ細胞におけるフォルスコリン活性の調節を測定することによって、ｈＡＰＬＮＲを活性化するそれらの能力について試験した。いくつかのアペリン−抗体融合物は、アペリンと同様の活性化のレベルでｈＡＰＬＮＲの活性化を示した。アペリン−抗体融合物は、それぞれ表１０Ａ及び１０Ｂに示されるように、１０μＭまたは７．５μＭフォルスコリンで２７ρＭ〜２９ｎＭの範囲のＥＣ５０値を有していた。アペリン単独は、１０μＭフォルスコリンで２５ρＭ及び７．５μＭフォルスコリンで３９ρＭのＥＣ５０値でｈＡＰＬＮＲを活性化した。リンカーなしの２つのアペリン−抗体融合物は、ｈＡＰＬＮＲの測定可能な活性化を何ら示さなかった。さらに、アペリン−ｃｔｅｒ１１、及びアペリン−ｃ
ｔｅｒ１１＋セリンの融合物は、完全な活性化を誘導した（７．５μＭフォルスコリンで試験）。しかし、アペリンペプチドが１０アミノ酸にＣ末端で切断されると、活性化は減少する傾向にあり、アペリン長がそのＣ末端で９アミノ酸に減少すると、活性化は見られなかった。別個の実験では、無関係な抗体（抗ｍｙｃ抗体）に融合したアペリンは、１００ｎＭで３７％と５３％の活性化を示し、無関係な抗体に融合したアペリンは活性化するが、アペリン単独または抗ＡＰＬＮＲ抗体に融合したアペリンと比較して弱いことを示した。
アペリン−抗体融合物は、ＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ｌｕｃ／ｈＡＰＬＮＲ細胞におけるフォルスコリン活性の調節を測定することによって、ｈＡＰＬＮＲを阻害するそれらの能力についても試験した。表１０Ｃ及び１０Ｄ参照。５アペリン−抗体融合物は、試験した最高濃度で１３〜２９％の間のｈＡＰＬＮＲの弱いブロックを示した。無関係な抗体（抗ｍｙｃ抗体）及びアイソタイプ対照のＮ末端に融合したアペリンは、ｈＡＰＬＮＲの測定可能な阻害を何ら示さなかった。
Figure 0006738449
Figure 0006738449
Figure 0006738449
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Figure 0006738449
Figure 0006738449
Figure 0006738449
Figure 0006738449
実施例１０：ｐＥＲＫアッセイにおける抗体融合タンパク質によるＡＰＬＮＲ媒介受容体シグナル伝達の活性化
上述の実施例６に本質的に示される通りに、実験を行った。表１１に示されるように、本発明の２つの抗体−アペリン融合物は、５４２．２ρＭ及び２７１．４ρＭのＥＣ５０値でｐＥＲＫ１／２対全ＥＲＫ１／２の比率を増加させ、一方アペリン−１３は３２．４８ρＭのＥＣ５０値でｐＥＲＫ１／２対全ＥＲＫ１／２の比率を増加させた。
Figure 0006738449
実施例１１：βアレスチンアッセイにおける抗体融合タンパク質によるＡＰＬＮＲ媒介受容体シグナル伝達の活性化
ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）ｅＸｐｒｅｓｓ ＡＧＴＲＬ１ ＣＨＯ−Ｋ１ β−
アレスチンＧＰＣＲ細胞ベースのアッセイ（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ，＃９３−０２５０Ｅ２）を、活性化ヒトアペリン受容体（ｈＡＰＬＮＲ）によってβアレスチンの補充を介してシグナル伝達を評価するのに使用した。ｈＡＰＬＮＲの活性化の際のβアレスチン補充を試験するために、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）ｅＸｐｒｅｓｓ ＡＧＴＲＬ１ ＣＨＯ−Ｋ１ βアレスチン細胞を製造業者のプロトコルに従って８５００細胞／ウェルで９
６ウェルアッセイプレートに播種し、５％ＣＯ２中３７℃で二夜インキュベートした。アッセイの日に、アペリン、ピログルタミルアペリン−１３、（Ｂａｃｈｅｍ，＃Ｈ−４５６８）を５００ｎＭから０．０８ｎＭ（アペリンを含まない対照試料を含む）に連続的に希釈し（１：３）、細胞に加えた。
ｈＡＰＬＮＲを活性化するアペリン−抗体融合物及び抗体の能力を測定するために、外因性アペリンなしで、アペリン−抗体融合物及び抗体を５００ｎＭから０．０８ｎＭに連続的に希釈し（１：３）、細胞に加えた。アペリン−抗体融合物及び抗体の試験は、抗体なしの対照を含んだ。５％ＣＯ２中３７℃でのインキュベーションの１．５時間後、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）検出試薬の添加後、Ｖｉｃｔｏｒ Ｘ装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で化学発光活性を検出した。
全てのアッセイの結果は、Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）内の非線
形回帰（４−パラメーターロジスティクス）を使用して解析した。抗体及びアペリン−抗体融合物による活性化を、アペリン用量応答で見られる最大活性化のパーセンテージとして計算した。ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）ｅＸｐｒｅｓｓ ＡＧＴＲＬ１ ＣＨＯ−Ｋ１ βアレスチン細胞ベースのアッセイでは、試験したアペリンペプチドに融合したす
べての１１個の抗ＡＰＬＮＲ抗体は、最大アペリン活性化の２〜６４％の範囲の活性化を有するｈＡＰＬＮＲの部分的活性化と、９７０ρＭ〜１００ｎＭ超の範囲の対応するＥＣ５０値を示した。アペリン融合なしの抗ＡＰＬＮＲ抗体は、活性化をほとんど示さなかった。アペリンは、１．５ｎＭのＥＣ５０値でｈＡＰＬＮＲを活性化した。無関係な抗ｍｙｃ抗体に融合したアペリンは、測定可能なＥＣ５０なしに、５００ｎＭの試験した最高濃度で６％のｈＡＰＬＮＲの弱い活性化を示したが、アイソタイプ対照は、抗体は、このアッセイにおいて測定可能な活性化を何ら示さなかった。
Figure 0006738449
実施例１２−抗体−アペリン１１融合物は血清中の安定性の増加を示す
血清中のアペリンペプチド融合抗体の安定性及び活性を測定するために、融合抗体を、異なる時間（０、６、２４時間）マウス血清に曝露した。血清から抗体を精製した後、アペリン断片の存在を評価するために、サンプルを質量分析法によって分析した。露出されたアペリン−抗体融合物の活性を試験するために、未精製抗体融合物で希釈した血清を、
βアレスチン活性アッセイでも試験した。雄のＣ５７Ｂｌ／６マウスから得られた血清を、ＰＢＳにより１：１の比で希釈した。合計１００μｇのアペリン−抗体融合物を、血清に加えた。２５０μｌすなわち２５％のこの混合物を直ちに除去し、−２０℃に置いた（ｔ＝０時点）。残りの混合物を、３７℃のインキュベーターに入れ、２５０μｌの混合物を６及び２４時間後に除去した。
プロテインＡビーズ：Ｄｙｎａｂｅａｄ（商標）プロテインＡビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ＃１０００１Ｄ）を介して精製サンプルをＰＢＳで３回洗浄した。２５μ
ｌのＤｙｎａｂｅａｄ（商標）スラリーを、２２５μｌの血清とアペリン−抗体融合物の混合物に加えた。新たな混合物を３時間回転させながら４℃でインキュベートし、抗体融合物をタンパク質Ａビーズへ結合させた。インキュベーション後、ビーズをＰＢＳで３回洗浄した。６０μｌのＬａｅｍｉｌｌｉ染料／バッファーを、洗浄してペレット化したプロテインＡビーズに加えた。この混合物を９０℃で５分間インキュベートし、精製抗体をプロテインＡビーズから解離させた。
質量分析の準備：５μｌのβ−メルカプトエタノールを精製抗体に加え、９５℃で１０分間変性させた。精製された抗体の全体積を、トリス−グリシンゲル上にロードし、１５０Ｖで１時間動作させた。ゲルを染色するためにＣｏｏｍａｉｓｅ青を使用した。重鎖断片に対応する５０ｋＤａのバンドをゲルから切り出し、微細にチョップした。切除されたバンドは、２つの５００μｌの試験管に分けた。１００μｌの１００ｍＭの重炭酸アンモニウム／５０％アセトニトリルを加え、ゲルを脱色するために３７℃で１時間インキュベートした。脱色液を除去し、１００μｌの１００％アセトニトリルを加え、周囲温度で５分間、ゲルを脱水する。脱水溶液をゲルから除去し、７５μＬの５０ｍＭ重炭酸アンモニウム中の１０ｍＭ ＤＴＴを加え、タンパク質を減少させるために３７℃で３０分間イン
キュベートする。還元溶液を除去し、７５μｌの５０ｍＭの重炭酸アンモニウム中の５５ｍＭのヨードアセトアミドを加え、タンパク質をアルキル化するために暗所で、周囲温度でインキュベートする。アルキル化溶液を除去し、１００μｌの５０ｍＭの重炭酸アンモニウムを、ゲルを洗浄するために加える。洗浄溶液を除去し、１００μｌの１００％アセトニトリルを、周囲温度で５分間、ゲルを脱水するために加える。脱水溶液を除去し、３０μｌのＬＹＳ−Ｃ酵素混合物を加え、３７℃で一晩消化させる。一晩消化の後、試料を、１０ｍｇ／ｍｌのアルファ−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸／７０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ溶液中ＺｉｐＴｉｐフィルターを用いて精製し、ＭＡＬＤＩ標的上にスポット溶出し、質量分析計で読み取る。
質量分析：アペリンペプチドをＡＰＬＮ−Ｒ抗体のＮ末端部分に融合させる。Ｌｙｓ−Ｃがアミノ酸リシンのＣ末端側で認識し、タンパク質を消化する。対象のペプチドは、融合抗体のＬｙｓ−Ｃ消化後に、ＱＲＰＲＬＳＨＫの配列（配列番号２２８のアミノ酸残基番号１〜８）を有し、１００４における質量電荷比のピークを報告する。
Figure 0006738449
表１３に示されるように、切断されたアペリン融合抗体は、６時間の血清暴露後に質量分析にそのままのアペリンペプチドのピークを報告している。アペリン−ｃｔｅｒ１１融合抗体は、２４時間の血清暴露後に残留アペリンピークを有する。図２も参照。
暴露アペリン−抗体融合物の活性を試験するために、実施例１１（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ
βアレスチン活性アッセイキットに基いたプロトコル）で上述したように、未精製抗体
融合物（Ｈ４Ｈ９０９３Ｐ−３−ＮＶＨ３、Ｈ４Ｈ９２０９Ｎ−ＡＰＮ１１−（Ｇ４Ｓ）３、またはＨ４Ｈ９２０９Ｎ−ＡＰＮ１１＋Ｓ−（Ｇ４Ｓ）３）で希釈した血清を、βアレスチン活性アッセイで試験した。各未精製アペリン−抗体融合物の処理濃度１μｇ／ｍＬであった。
Ｃ末端にアペリン−Ｃｔｅｒ１１とアペリン−Ｃｔｅｒ１１＋Ｓを有する抗体融合物は、６時間の血清暴露後であっても、βアレスチンの活性を保持する。時点０、６及び２４時間におけるβアレスチンの活性の結果は図３に示されている。６時間の時点の値は、０時間の時点に対するパーセント活性化、すなわちＨ４Ｈ９０９３Ｐ−３−ＮＶＨ３、Ｈ４Ｈ９２０９Ｎ−ＡＰＮ１１−（Ｇ４Ｓ）３、またはＨ４Ｈ９２０９Ｎ−ＡＰＮ１１＋Ｓ−（Ｇ４Ｓ）３に対して、それぞれ、２．４％、７０．４％及び３３．６％を表す。
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲を限定されるものではない。実際、本明細書に記載したものに加えて、本発明の様々な変更が、前述の説明及び添付の図面から当業者に明らかになるであろう。そのような変更は、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図されている。

Claims (16)

  1. （ｉ）免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の重鎖可変領域および軽鎖可変領域アミノ酸配列対（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）、ならびに（ｉｉ）配列番号２２８のアミノ酸配列を含むアペリンペプチドを含むタンパク質であって、Ｉｇ分子のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲは、配列番号１８／２６、１１４／１２２、および１３０／１３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、アペリンペプチドは、リンカーを介してＩｇ分子のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲに融合している、前記タンパク質。
  2. 前記Ｉｇ分子のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲは、配列番号１８／２６のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のタンパク質。
  3. 前記Ｉｇ分子のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲは、配列番号１１４／１２２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のタンパク質。
  4. 前記Ｉｇ分子のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲは、配列番号１３０／１３８のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のタンパク質。
  5. 前記アペリンペプチドは重鎖可変領域のＮ末端またはＣ末端で前記Ｉｇ分子のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲに融合している、請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質。
  6. 前記アペリンペプチドは軽鎖可変領域のＮ末端またはＣ末端で前記Ｉｇ分子のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲに融合している、請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質。
  7. リンカーは（Ｇ４Ｓ） n リンカーを含み、式中、ｎ＝１〜１０である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質。
  8. Ｇ４ＳリンカーはＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号２３１）である、請求項７に記載のタンパク質。
  9. Ｇ４ＳリンカーはＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号２３２）である、請求項７に記載のタンパク質。
  10. Ｇ４ＳリンカーはＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号２３３）である、請求項７に記載のタンパク質。
  11. インビトロアッセイで測定したとき、ｈＡＰＬＮＲ媒介細胞シグナル伝達を活性化する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のタンパク質。
  12. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載のタンパク質、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、医薬組成物。
  13. それを必要とする対象において、血管拡張および／または血管新生を誘導するための、請求項１２に記載の医薬組成物。
  14. それを必要とする対象において、虚血再灌流障害を治療するための、請求項１２に記載の医薬組成物。
  15. それを必要とする対象において、心機能を改善するための、請求項１２に記載の医薬組成物。
  16. 対象は、うっ血性心不全、心筋梗塞、または心筋症から選択される病態に罹患している、請求項１５に記載の医薬組成物。
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