JP6731240B2

JP6731240B2 - 蛋白質架橋分解剤

Info

Publication number: JP6731240B2
Application number: JP2015233779A
Authority: JP
Inventors: 雅之八木; 和利篠田
Original assignee: 株式会社アンチエイジングコミュニケーション; 株式会社ひかわ
Priority date: 2015-11-30
Filing date: 2015-11-30
Publication date: 2020-07-29
Anticipated expiration: 2035-11-30
Also published as: JP2017100970A

Description

本発明は、蛋白質の糖化により形成される蛋白質間の架橋結合を分解する蛋白質架橋分解剤及び、当該蛋白質架橋分解剤を含有する食品などに関する。

蛋白質糖化反応は、Ｌ．Ｃ．Ｍａｉｌｌａｒｄがアミノ酸と還元糖を加熱すると褐色の色素が生成することを発見したことからメイラード反応として知られるようになった。現在では、メイラード反応は蛋白質糖化反応の一態様と位置付けられている。近年、この蛋白質糖化反応が老化現象、認知症、癌、高血圧、シミなどの皮膚疾患、動脈硬化症などにも関与していることが明らかになっている。

また、蛋白質の糖化反応による最終生成物であるＡＧＥｓ（ａｄｖａｎｃｅｄｇｌｙｃａｔｉｏｎｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ）は、とくに糖尿病患者において血液中に蓄積され神経障害や網膜症などの合併症をもたらすとされている。このように、ＡＧＥｓの生成に至る蛋白質の糖化反応は人体に好ましくない影響を及ぼすものであり糖化反応の阻害などついて様々な研究がなされている。

図１は、蛋白質の糖化反応によるＡＧＥｓの生成過程の概略を示す図である。蛋白質とグルコースの反応に端を発し、反応の進行に応じて生成される「糖化反応中間体」と「ＡＧＥｓ（糖化反応最終生成物）」の一例を示している。

ここで、ＡＧＥｓの生成に至る中間体である糖化反応中間体として例示したグリオキサール（ＧＯ）、メチルグリオキサール（ＭＧ）、３−デオキシグルコソン（３ＤＧ）は、いずれも分子内に２つのカルボニル基（ｃ＝０）を有するα−ジカルボニル化合物である。

このα−ジカルボニル化合物は反応性に富んでおり蛋白質間に架橋を形成し、例えば生体内のコラーゲン分子間で架橋を形成する。正常な状態の皮膚や骨は、酵素の作用を介して遺伝的に規定された部位に秩序立って形成される架橋（生理的架橋）により皮膚や骨の適正な柔軟性や強度を維持しているが、α−ジカルボニル化合物による無秩序で余分に形成される架橋は皮膚の硬化や骨の脆弱化をもたらす。

このようなα−ジカルボニル化合物を分解することは、ＡＧＥｓの生成及び蓄積を抑制するとともに、糖化反応により形成された無秩序で余分な架橋を分解し、皮膚の硬化や骨の脆弱化などを回復させるために有効であると考えられる。

α−ジカルボニル化合物を分解することのできる物質として、Ｎ−フェナシルチアゾリウムブロミド（ｐｈｅｎａｃｙｌ−ｔｈｉａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ；ＰＴＢ）が知られているが、副作用などの問題があると言われている。安全に摂取するという観点から、天然物由来であってα−ジカルボニル化合物を分解することのできる物質が求められるところだが、そのような物質としてユズなどの柑橘類が報告されている（特許文献１）。また、健康茶として飲用されている植物の抽出物についても、例えば、月見草、グァバ、ビワ、クマザサなどが、α−ジカルボニル化合物の分解作用を有することが報告されている（特許文献２）。ここでいう健康茶とは、ハーブティー、野草茶などのように植物を乾燥させた後、熱水等で煮出して飲用する食品を示す。

特許第４３１５６５０号公報特開２００７−１１９３７３号公報

健康茶の原料となる植物抽出物は、例えば、ドクダミ、ルイボス、トチュウ、高麗ニンジンなどいずれも独特の風味があり、飲みやすいとは言えないものが多い。そこで、一般的に製造販売されている健康茶は、様々な植物抽出物をブレンドし飲みやすくする工夫を行っている。

ところで、このように複数の植物抽出物を合わせてブレンド茶とした場合において、個々の原料が有するα−ジカルボニル化合物の分解作用がブレンド茶にどのように反映されるかについての研究は十分でなかった。そこで、ブレンドすることにより個々の原料の上記分解作用を上回ることのできる原料の組み合わせを得ることを本発明の課題とする。

上記課題を解決するための手段として、以下の発明などを提供する。すなわち、テンヨウケンコウシ、カキノキ、クマザサ、バナバの各抽出物を含む混合物を有効成分として含有する蛋白質架橋分解剤を提供する。また、テンヨウケンコウシ、カキノキ、クマザサ、バナバの各抽出物を含む混合物を有効成分として含有するペントシジン生成阻害能を有する上記蛋白質架橋分解剤を提供する。また、上記蛋白質架橋分解剤を含有する食品、食品添加物、医薬品、医薬部外品及び化粧品を提供する。

本発明により、ブレンドすることにより個々の原料の蛋白質架橋分解作用を上回ることのできる原料の組み合わせによってなる蛋白質架橋分解剤を提供することができる。

蛋白質の糖化反応によるＡＧＥｓの生成過程の概略を示す図試験結果を示す図甜茶、柿の葉茶、クマザサ茶、バナバ茶を組み合わせたブレンド茶のＡＧＥｓ等生成阻害作用を示す図甜茶、ドクダミ茶、柿の葉茶、ガァバ茶を組み合わせたブレンド茶のＡＧＥｓ等生成阻害作用を示す図

以下、本発明の実施例について説明する。なお、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるべきものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において、種々なる態様で実施し得る。
＜実施例＞
＜概要＞

本実施例の蛋白質架橋分解剤は、テンヨウケンコウシ、カキノキ、クマザサ、バナバの各抽出物を含む混合物を有効成分として含有するものである。
＜構成＞

本実施形態において、「蛋白質架橋分解剤」とは、蛋白質の糖化反応により生じる３ＤＧなどのα−ジカルボニル化合物を分解することにより、３ＤＧなどにより形成される架橋を分解することができる剤を意味する。

「テンヨウケンコウシ（Ｒｕｂｕｓｓｕａｖｉｓｓｉｍｕｓ）」は、バラ科キイチゴ属の植物である。発酵後乾燥させたテンヨウケンコウシの葉を煮出して甜茶として飲まれている。

「カキノキ（Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓｋａｋｉ）」は、カキノキ科カキノキ属の植物である。乾燥させた葉を煮出して柿の葉茶として飲まれている。

「クマザサ（Ｓａｓａｖｅｉｔｃｈｉｉ）」は、イネ科ササ属の植物である。乾燥させた葉を煮出してクマザサ茶として飲まれている。

「バナバ（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｅｍｉａｓｐｅｃｉｏｓａ）」は、ミソハギ科サルスベリ属の植物である。葉を煮出してバナバ茶として飲まれている。

上述した各植物の抽出物を得るための溶媒は、抽出物を含有する製品の種類や態様に応じて定法に則して適宜選択することができ、例えば、精製水、エタノール、メタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブタノール、プロピレングリコールなどの種々の溶媒を用いることができる。茶のように各植物を煎じて飲用とする場合には水を用いて抽出することが簡便で好ましい。また、液体として抽出物を得た後にさらに乾燥等を施し粉体や粒体として得てもよい。

上記の各植物の抽出物を有効成分とする本実施形態の蛋白質架橋分解剤は、さらに既知の方法を用いることにより、当該蛋白質架橋分解剤を含有する食品、食品添加物、医薬品、医薬部外品、化粧品などとして提供することが可能である。

例えば、医薬品とする場合には、本実施形態の蛋白質架橋分解剤を粉体や粒体としカプセルに充填したり、あるいは、賦形剤、結合剤、崩壊剤などを添加して打錠機等を用いて製造することができる。また、食品とする場合には、各植物を適宜乾燥や破砕等を湯で煮出すことで提供できる。また、医薬品のようにカプセルや錠剤のような形態で提供してもよいし、他の飲料、調味料、菓子等の各種の食品にコラーゲン架橋分解剤を添加した態様で提供することもできる。

また、美容液、クリーム、ローションなどの化粧品とすることもできる。例えば、美容液とする場合には、本実施形態のコラーゲン架橋分解剤の他、水、コメヌカ油、ペンチレングリコール、グリセリン、スクワラン、パルミチン酸セチル、ダイマージリノール酸などを主成分とし、ヒアルロン酸Ｎａ、水添ナタネ油アルコール、カルボマー、キサンタンガム、水酸化Ｋ、ジメチコン、ポリソルベート−６０、ステアリン酸グリセリル、水添ヒマシ油、フェノキシエタノール、尿素、アルギニン、アルブチン、クエン酸などを添加剤とする。そして、各成分を水溶性原料・油溶性原料に分けて溶解してから、それらを加熱して混合・乳化する。これを冷却しながらエキスなどの添加物を配合し、さらに低温になったところで精油や香料などの揮発性の高いものを添加する。その後、所定の安全性の検査（菌、ｐＨ、温度安定性、粘度等）を行い、瓶などに充填して製品として提供することができる。
＜試験＞

本試験は、上述した各植物を水を用いて抽出した抽出物をサンプルとして、蛋白質架橋分解活性を、α−ジカルボニル化合物の分解活性を有することが既知のＮ−フェナシルチアゾリウムブロミド（以下、ＰＴＢ）に対する相対値として示す。測定方法は、Ｖａｓａｎｓらの方法（Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３８２，ｐ．２７５−２７８，１９９６）に準拠し、ＡＧＥs架橋のモデル化合物である１−ｐｈｅｎｙｌ−１,２−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｎｅ（ＰＰＤ）中のαジケトン構造のＣ−Ｃ結合を分解した時に生成する安息香酸をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）で測定する。

本試験のサンプルとして、健康茶として比較的著名で入手が困難ではないと考えられる以下のものを選択した。上述の甜茶（テンヨウケンコウシ）、カキノキ（柿の葉茶）、クマザサ（クマザサ茶）、バナバ（バナバ茶）の他に、ほうじ茶、ジャスミン茶、プーアール茶、ドクダミ茶、ルイボス茶、サンザシ茶、ハマ茶、サラシア茶、トチュウ茶、ウーロン茶、ローズヒップ茶、緑茶も用いた。また各サンプルは、株式会社ひかわにより煎じて飲用する茶の茶葉として製造されたものを用いた。サンプル調製及び試験方法、結果などについて以下に詳述する。なお、茶にはチャノキ以外の植物の葉、芽、花、樹皮、根などを材料として煎じたいわゆる茶外茶を含むものとする。

（１）サンプルの調製
８０℃に加熱した蒸留水４０ｍＬ中に各茶葉２ｇを加えて、８０℃に設定したウォーターバス中で１時間抽出した。

（２）ＡＧＥｓ架橋分解作用の測定
ＡＧＥｓ架橋分解作用の測定は上記の通りＶａｓａｎらの方法に準拠した。ＡＧＥｓ架橋モデルの反応基質としては５０％ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅで溶解した１−ｐｈｅｎｙｌ−１,２−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｎｅ（ＰＰＤ）を用いた。１ｍｏｌのＰＰＤが分解すると１ｍｏｌの安息香酸が遊離する。ＡＧＥｓ架橋分解作用の測定には、試料５００μＬ、１０ｍｍｏｌ／ＬＰＰＤ１００μＬ，０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液４００μＬを混合し、３７℃で８時間反応させた。その後、反応液には２ｍｏｌ／ＬＨＣｌを２００μＬ加えて反応停止させ、１０，０００ｒｐｍ（９，１７０ g）で２分間遠心分離した上清中の安息香酸量をＨＰＬＣで測定した。

ＨＰＬＣは島津ＬＣ‐１０Ａシステム（島津製作所）にＣａｄｅｎｚａＣＤ−Ｃ１８７５ｘ４．６ｍｍＩＤ（Ｉｍｔａｋｔ，）を接続して使用した。分析条件は溶離液：２ｍｍｏｌ／Ｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ, ｄｉｓｏｄｉｕｍｓａｌｔ, ｄｉｈｙｄｒａｔｅ（ＥＤＴＡ−２ＮＡ）を含む０．２％酢酸／ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ（７０／３０）、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、検出波長：ＵＶ２７０ｎｍ、インジェクション量：５０μＬとした。

（３）ＡＧＥｓ架橋分解率の算出
ＰＰＤは１分子が分解されると、１分子の安息香酸を生成する。このためＨＰＬＣで測定した反応液中の安息香酸量を、反応液中に添加したＰＰＤ量で除した値をＡＧＥｓ架橋分解率とした。なお反応液中の安息香酸量は、予め試料中の安息香酸量を同様の方法で測定して測定値から減じた。ＡＧＥｓ架橋切断率は、０．４ｍｍｏｌ／ＬＰＴＢのＡＧＥｓ架橋切断率を１００としたときの相対値を算出した。

（４）結果
図２は、上記試験の結果を示すものであり、分解率の高い順に示している。図示するように、最も分解率が優れていたのは、ほうじ茶でありＰＴＢとの相対値は１７９であった。また、最も分解率が劣っていたのは、トチュウ茶でありＰＴＢとの相対値は１７であった。

そして、各サンプルのうち任意の３種ないし４種を組み合わせて混合したブレンド茶を複数調製し、それらについても同様の試験を行った。なお、試料の調製は、ブレンド茶を構成する個々のサンプルを等量で混合し５００μＬとなるようにした。

測定した複数のブレンド茶のうち、顕著に優れたＡＧＥs架橋切断率を示したのは、「甜茶、柿の葉茶、クマザサ茶、バナバ茶」を組み合わせて混合してなるブレンド茶であった。このブレンド茶の特定結果を下記の表１に示す。

表１に示すように、このブレンド茶のＡＧＥｓ架橋切断率は、７４．７８±６．２２（％）であり、ＰＴＢとの相対値は３２５であった。このブレンド茶を構成する各サンプルのＰＴＢ相対値は「甜茶１４０、柿の葉茶９２、クマザサ茶７３、バナバ茶２３」であったことから、組み合わせることによって個々のサンプルが示す架橋切断作用をはるかに超える作用を生じ得ることが分かった。

なお、今回測定した他の組み合わせによるブレンド茶においては、上記組み合わせによって認められたような相乗効果を示すものは見出されなかった。
＜効果＞

以上のように、「甜茶、柿の葉茶、クマザサ茶、バナバ茶」を組み合わせることで、個々のＡＧＥs架橋切断作用をはるかに超える優れたＡＧＥs架橋切断作用を奏することが分かった。
＜実施例２＞

上述の通り、「甜茶、柿の葉茶、クマザサ茶、バナバ茶」を組み合わせて混合してなるブレンド茶が、個々の作用を超えるＡＧＥs架橋切断作用を奏することが分かった。そこで、ＡＧＥｓの生成抑制作用についても試験を行った。
＜試験＞

上記のブレンド茶を構成する各茶及びブレンド茶のＡＧＥs生成抑制作用及び抗糖化活性（ＩＣ₅₀）を測定した。具体的には、生体蛋白質であるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及びコラーゲン（Ｃｏｌ）をターゲットとし、生体内で生成する糖化反応中間体である３ＤＧ（３−デオキシグルコソン）、糖化反応最終生成物である蛍光性ＡＧＥｓ、ペントシジン、ＣＭＬ（カルボキシメチルリジン）の生成抑制作用を測定した。

（１）サンプルの抽出
恒温水槽中で８０℃に加温した蒸留水１５０ｍＬ中に、各サンプルの茶葉３．７５ｇを加えて１時間インキュベートした。その後、４，５００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を回収した。回収したサンプル抽出液は５ｍＬずつアルミ製トレイに入れ、１２０℃に加温したインキュベーター内に１時間入れて水分を完全に蒸発させた後、固形分重量を測定した。

（２）サンプルの調製
各サンプル抽出液を原液、１０倍希釈液、１００倍希釈液の３つの濃度に調製した。また、ブレンド茶については、各構成の混合比率を同比率（１：１：１：１）として上記３つの濃度に調製した。また、比較対象とした公知の糖化反応阻害剤であるアミノグアニジン（塩酸アミノグアニジン和光純薬工業社製：ｃｏｄｅ６３２８−２６４３２，Ｌｏｔ．ＥＰＮ０１８０）は１０．０ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ水溶液を調整した。

（３）ｉｎｖｉｔｒｏ糖化反応
０．０５ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、８ｍｇ／ｍＬヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）または０．６ｍｇ／ｍＬコラーゲンタイプIウシ真皮由来（Ｃｏｌ）（株式会社ニッピ）、０．２ｍｏｌ／Ｌグルコース反応液中に、サンプル調製した各濃度のサンプルを１／１０濃度になるように添加し、６０℃でＨＳＡの場合４０時間、コラーゲンの場合１０日間インキュベートした。陰性対照としてはサンプルの代わりに蒸留水を添加したものを用いた。各種ＡＧＥｓ量の測定にはインキュベート後の各反応液を使用した。

（４）蛍光性ＡＧＥｓ生成抑制作用および抗糖化活性の測定
蛍光性ＡＧＥｓは、所定の方法（北野貴大、八木雅之、埜本慶太郎、堀未央、庄野繁一、米井嘉一、原高明、原英郎、山路明俊：食用紫菊花の蛋白糖化最終生成物（ＡＧＥｓ）生成抑制作用の研究, ＮｅｗＦｏｏｄＩｎｄｕｓｔｒｙ, ５３（６）, １−１０（２０１１））に従い、サンプル反応液のＡＧＥｓ由来の蛍光（励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍ）を測定した。蛍光値は５μｇ／ｍＬの硫酸キニーネ０．１Ｎ硫酸水溶液の蛍光値を１０００とした時の相対値として算出した。

ＡＧＥｓ由来蛍光生成抑制率（％）は、サンプルを添加した反応液（Ａ）、グルコース水溶液の代わりに蒸留水を添加したもの（Ｂ）、サンプルを添加しない溶液のみを添加してインキュベーションしたもの（Ｃ）、ブランクとしてグルコースの代わりに蒸留水を添加したもの（Ｄ）として、以下の式に従って算出した。

（式１）蛍光性ＡＧＥｓ生成抑制率（％）=｛１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）｝×１００

抗糖化活性はＩＣ_５０（５０％生成阻害濃度：固形分濃度あたり）を算出し小数点以下３桁まで表示した。ここで、ＩＣ_５０反応による物質の生成を５０％抑制する被験物質濃度で、この値が小さいほど阻害活性が強いことを示す。

（５）３ＤＧ生成抑制作用および抗３ＤＧ活性の測定
サンプル反応液中に生成した３ＤＧは、上記参考文献１の方法に従い、２，３−ｐｅｎｔａｎｅ−ｄｉｏｎｅを内部標準物質とした、２．３−ｄｉａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎプレラベル化ＨＰＬＣ法により定量した。

３ＤＧ測定には、各サンプル２００μＬに蒸留水３００μＬと内部標準物質として２０ｍｇ／ｍＬの２，３−ｐｅｎｔａｎｅｄｉｏｎｅ（和光純薬工業株式会社）２５μＬを添加して撹拌混合した。次いで６．０％過塩素酸（和光純薬工業株式会社）５００μＬを加え撹拌後、１２，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。遠心分離後、上清８００μＬを別の容器に分注し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（和光純薬工業株式会社）１０００μＬを加えて撹拌した。その後、ラベル化剤として１．０ｍｇ／ｍＬの２．３−ｄｉａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ（株式会社同仁化学研究所）１００μＬを加えて撹拌し、２５℃で１日間靜置した後、以下の条件でＨＰＬＣへ導入して３ＤＧを測定した。

カラムはＹＭＣ−ＰａｃｋＣＮ１５０ｘ４．６ｍｍＩ.Ｄ.（株式会社ワイエムシィ）を使用した。測定条件は、溶離液を５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸：アセトニトリル：メタノール=７０：１７：１３、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度３５℃、検出波長ＵＶ２６８ｎｍとした。抗３ＤＧ活性はＩＣ_５０（５０％生成阻害濃度：固形分濃度あたり）を算出し小数点以下３桁まで表示した。

（６）ペントシジン生成抑制作用および抗ペントシジン活性の測定
サンプル反応液中に生成したペントシジンは、上記参考文献１の方法に従い、ＦＳＫペントシジンキット（株式会社伏見製薬所）によるＥＬＩＳＡ法で定量した。

各サンプル５０μＬと１００μＬのプロナーゼ溶液を混合し、５５℃で９０分間インキュベーションした後、沸騰水中で１５分間加熱してプロナーゼを不活化し、キットに添付の補助液を５０μＬ添加した。その後、５０μＬのサンプルまたはペントシジン標準液と、キットに添付の抗ペントシジンモノクローナル抗体溶液５０μＬをマイクロプレートの各ウェルに分注し、３７℃で６０分間反応させた。次いで各ウェルをキットに添付の洗浄液２００μＬで３回洗浄後、キットに添付の３'５，５'−ｔｅｔｒａ−ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）を含む溶液を各ウェルに１００μＬ分注して１０分間反応させた。その後、キットに添付の反応停止液１００μＬを加え、１０分以内に４５０ｎｍ（主波長）／６３０ｎｍ（参照波長）における吸光度を測定した。サンプル中のペントシジン濃度はペントシジン標準液で作成した検量線から算出した。抗ペントシジン活性はＩＣ_５０（５０％生成阻害濃度：固形分濃度あたり）を算出し小数点以下３桁まで表示した。

（７）ＣＭＬ生成抑制作用および抗ＣＭＬ活性の測定
サンプル反応液中に生成したＣＭＬは、上記参考文献１の方法に従い、ＣｉｒｃｕＬｅｘＣＭＬ/Ｎ^ε−（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｌｙｓｉｎｅＥＬＩＳＡＫＩＴ（株式会社サイクレックス）によるＥＬＩＳＡ法で定量した。

まず測定キットに添付の濃縮洗浄液５０ｍＬに４５０ｍＬの精製水を加え（１０倍希釈）５００ｍＬの洗浄液を調製した、さらにキットに添付の抗ＣＭＬモノクローナル抗体（一次抗体）に３ｍＬの精製水を加えて十分攪拌し、１０分間静置した。このうち６００μＬを取り出し、５．４ｍＬの精製水を加え（１０倍希釈）計６ｍＬのＦｉｒｓｔＡｎｔｉｂｏｄｙｗｏｒｋｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎを作った。またキットに添付のＣＭＬ−ＨＳＡＳｔａｎｄａｒｄには５００μＬの精製水を加え、ＣＭＬ‐ ＨＳＡＭａｓｔｅｒＳｔａｎｄａｒｄ（２０μｇ／ｍＬ）を調製して検量線の作成に使用した。

ＣＭＬの測定には、各サンプル３０μＬにキットに添付のＳａｍｐｌｅｄｉｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒを９０μＬ加えた後、さらに調製したＦｉｒｓｔＡｎｔｉｂｏｄｙｗｏｒｋｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎを１２０μＬ加えて攪拌し、１００μＬをマイクロプレート上の各ウェルに分注した。その後、室温で60分間攪拌しながら反応させた。その後、各ウェルの反応液を捨て調製した洗浄液２００μＬで４回洗浄した。さらに各ウェルにキットに添付のＨＲＰｃｏｎｊｕｇａｔｅｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎＡｎｔｉｂｏｄｙ（二次抗体）１００μＬを分注し、室温で６０ｍｉｎ攪拌しながら反応させた。反応終了後、上記と同様の洗浄操作を行った。各ウェルにキットに添付のＳｕｂｓｔｒａｔｅＲｅａｇｅｎｔを１００μＬ分注し、１分間攪拌した後、アルミホイルでプレートを包み遮光し、１０分間静置した。その後、各ウェルにキットに添付のＳｔｏｐｓｏｌｕｔｉｏｎを１００μＬ分注して１分間攪拌し、直ちにマイクロプレートリーダーで４５０ｎｍ（主波長）／５４０ｎｍ（参照波長）で測定した。抗ＣＭＬ活性はＩＣ_５０（５０％生成阻害濃度：固形分濃度あたり）を算出し小数点以下３桁まで表示した。

（８）結果
図３は、各サンプルの抗糖化活性（ＨＳＡ，Ｃｏｌ）、抗ＣＭＬ活性、抗ペントシジン（Ｐｅｎｔ）活性及び抗３ＤＧ活性を一覧に示したものである。

この結果から、ブレンド茶の活性度合は、ブレンド茶を構成する茶のなかで最も活性の強い茶の活性度合が概ね反映されるということが分かる。例えば、抗糖化（ＨＳＡ）では、ブレンド茶の活性度合（０．０４５）は甜茶の活性度合（０．０４６）が反映されている。また、抗ＣＭＬ活性では、ブレンド茶の活性度合（０．０００２）はバナバ茶の活性度合（０．０００３）が反映されている。また、抗３ＤＧ活性では、ブレンド茶の活性度合（０．０２０）はバナバ茶の活性度合（０．０２０）が反映されている。そして、抗ペントシジン活性についても、ブレンド茶の活性度合（０．００７）は柿の葉茶の活性度合（０．００５）が反映されている。

ところが、抗ペントシジン活性については、このような結果を得たことは本発明者らにとって初めてのことであった。すなわち、本発明者らのこれまでの知見によれば、抗ペントシジン活性は、ブレンド茶を構成する個々の茶に抗ペントシジン活性を有するものが含まれている場合においても、ブレンド茶については抗ペントシジン活性が認められないことが多かったのである。そのような例を図４に示す。

図４は、甜茶、ドクダミ茶、柿の葉茶、ガァバ茶を組み合わせてブレンド茶を作るにあたり、個々の茶及び種々の組み合わせにおける抗糖化活性等を測定した結果を示すものである。

図示するように抗ペントシジン活性については、ドクダミ茶を除き活性が認められるものの、２種以上を組み合わせた場合には測定結果が「ＮＣ（算出不能）」となるケースが多数であった。つまり、２種以上を組み合わせると、個々の茶に活性があるのにもかかわらず活性が生じなくなることが多い。

このような抗ペントシジン活性の特異性を鑑みると、「バナバ茶、甜茶、クマザサ茶、柿の葉茶」の組み合わせからなるブレンド茶が、優れた抗ペントシジン活性（０．００７）を備えることは特異なことであると考えられる。
＜効果＞

バナバ茶、甜茶、クマザサ茶、柿の葉茶を混合したブレンド茶は、ＡＧＥｓ、ＣＭＬ、３ＤＧの生成阻害作用を有するだけでなく、複数の茶を組み合わせた場合に個々の阻害活性作用が反映されにくいペントシジンに対しても有効な生成阻害活性を有することが分かった。すなわち、この組み合わせによるブレンド茶は、ＡＧＥｓ等に対して広範な生成阻害作用を有するといえる。

Claims

テンヨウケンコウシ、カキノキ、クマザサ、バナバの各抽出物を含む混合物を有効成分として含有する蛋白質架橋分解剤。
請求項１に記載の蛋白質架橋分解剤を含有する蛋白質架橋分解用医薬品。
請求項１に記載の蛋白質架橋分解剤を含有する蛋白質架橋分解用医薬部外品。
請求項１に記載の蛋白質架橋分解剤を含有する蛋白質架橋分解用食品。
請求項１に記載の蛋白質架橋分解剤を含有する蛋白質架橋分解用食品添加物。
請求項１に記載の蛋白質架橋分解剤を含有する蛋白質架橋分解用化粧品