JP6696176B2

JP6696176B2 - タンパク質吸着用繊維及びタンパク質吸着用カラム

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Publication number: JP6696176B2
Application number: JP2015549103A
Authority: JP
Inventors: 淳一粕谷; 尚利富田; 上野　良之; 良之上野
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2014-09-16
Filing date: 2015-09-16
Publication date: 2020-05-20
Anticipated expiration: 2035-09-16
Also published as: KR20170059966A; EP3195930A1; CN106714961A; JPWO2016043223A1; US9982369B2; EP3195930A4; WO2016043223A1; CN106714961B; US20170253999A1; CA2961454A1; EP3195930B1

Description

本発明は、タンパク質吸着用繊維及びタンパク質吸着用カラムに関するものであり、血液や血液成分等のタンパク質を含む処理液から被吸着物質を吸着する用途に好適に用いられる。

血液等の処理液を体外に取り出し、処理液中の病因物質などを吸着カラムによって除去し、浄化してから戻す治療としては、人工透析以外に、アフェレシスと呼ばれる血液浄化療法が普及している。アフェレシス療法としては主に単純血漿交換療法、二重濾過血漿交換療法、血液から血漿を分離した後で血漿の有害物質を除去する血漿吸着療法、全血のまま有害物質を除去する血液吸着療法が知られている。

実際に、血漿吸着療法においては、自己抗体を吸着除去する吸着カラム、低密度リポ蛋白質を吸着除去する吸着カラムが実用化されている。血液吸着療法においては、エンドトキシンを吸着除去する吸着カラムや、β_２−ミクログロブリン（以下、β_２−ＭＧ）を吸着除去する吸着カラムが実用化されている。これらはいずれも除去対象物質と相互作用するリガンドが固定化された吸着担体である。

ここで、炎症性サイトカインを吸着する材料として、アミノ基を有するリガンドをポリスチレンあるいはポリスルホンからなる水不溶性担体の表面に固定化したタンパク質吸着用担体が開示されている（特許文献１）。またアミノ基を有するリガンドをポリエチレン若しくはポリプロピレン等のポリオレフィン、ポリエチレンテレフタレート若しくはポリブチレンテレフタレート等のポリエステル、ポリ（ｐ−フェニレンエーテルスルホン）等のポリスルホン系重合体、ポリエーテルイミド、ポリイミド、ポリアミド、ポリエーテル、ポリフェニレンサルファイド、ポリスチレン（以下、「ＰＳ」）又はポリアクリロニトリル系ポリマーあるいはこれら高分子化合物の誘導体又はこれら高分子化合物をブレンド、アロイ化したものからなる水不溶性担体の表面に固定化したタンパク質吸着用担体が開示されている（特許文献２）。

また、ポリマーに対して所望の官能基を、該官能基を有するアルデヒド又はケトンを用いて固定化したタンパク質吸着用担体が開示されている（特許文献３）。当該文献ではポリマーとしてポリスチレン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン及びポリカーボネートなどの芳香環を含むものを開示している。

これらの文献が開示するタンパク質吸着用担体では、リガンドの固定化により高い吸着性能が付与されている。

特開２００６−２７２０７５号公報特開２０１２−５８２７号公報国際公開２０１３／０２２０１２号

しかしながら、ある種のタンパク質吸着用担体では、リガンドを固定化する工程によって担体の物理的強度が低下し、担体の一部が微粒子として発生し、分離する可能性があった。

そこで本発明は、高い被吸着物質の吸着性能を持たせるとともに、微粒子発生の可能性が低いタンパク質吸着用繊維及びタンパク質吸着用カラムを提供することを課題とする。

本発明者らは上記課題を達成するため鋭意検討を進めた結果、以下の構成のタンパク質吸着用繊維を発明にいたった。すなわち、本発明は、以下の構成を有する。
本発明者らは上記課題を達成するため鋭意検討を進めた結果、以下の構成のタンパク質吸着用繊維を発明にいたった。すなわち、本発明は、以下の構成を有する。
（１）吸水率が１〜５０％であり、芳香族炭化水素又はその誘導体を繰り返し単位に含み、上記繰り返し単位が有する芳香環の一部が下記一般式（Ｉ）で示される構造を介して架橋されているポリマーを含有する、タンパク質吸着用繊維。

（式中、Ａは脂肪族基、芳香族基及びアミノ基から選ばれる。波線は、芳香環との結合位置を表す。）
本発明の好ましい態様として以下の構成がある。
（２）式中、Ａが、以下の一般式（Ａ−１）、（Ａ−２）又は（Ａ−３）である、（１）記載のタンパク質吸着用繊維。

（式中、Ｒ^１〜Ｒ^５は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜１０の炭化水素基を表し、波線は、結合位置を表す。）］
（３）上記ポリマーは、ポリスチレン、ポリスルホン及びそれらの誘導体からなる群から選択されるポリマーである、（１）又は（２）記載のタンパク質吸着用繊維。
（４）上記繊維の単糸径が０．１〜１０００μｍである、（１）〜（３）のいずれか記載のタンパク質吸着用繊維。
（５）上記架橋されているポリマーが有するすべての芳香環の数に対する、一般式（Ｉ）で示される芳香環の数が、４〜７０％である、（１）〜（４）のいずれか記載のタンパク質吸着用繊維。
（６）サイトカイン吸着用である、（１）〜（５）のいずれか記載のタンパク質吸着用繊維。
そしてタンパク質吸着用繊維の使用方法として、上記（１）〜（６）のいずれか記載のタンパク質吸着用繊維を吸着担体として含むタンパク質吸着用カラムである。

本発明のタンパク質吸着用繊維及びタンパク質吸着用カラムは、高い被吸着物質の吸着性能を持たせるとともに、繊維からの微粒子の発生を減らすことが可能なため、血液、生体の体液及び生体の排液等のタンパク質を含む処理液からβ_２−ＭＧやサイトカイン等のタンパク質を吸着除去する用途に好適に用いることができる。

本発明のタンパク質吸着用繊維は、吸水率が１〜５０％である。またこの繊維は、芳香族炭化水素又はその誘導体を繰り返し単位とし、上記繰り返し単位が有する芳香環の一部が下記一般式（Ｉ）で示される構造を介して架橋されているポリマー（以下、「ポリマーＢ」という。）を含有する。
（式中、Ａは脂肪族基、芳香族基及びアミノ基から選ばれる。波線は、ポリマーが有する芳香環との結合位置を表す。）

さらに式中Ａが、以下の一般式（Ａ−１）、（Ａ−２）又は（Ａ−３）であることが好ましい。

（式中、Ｒ^１〜Ｒ^５は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜１０の炭化水素基を表し、波線は、結合位置を表す。）］
「芳香族炭化水素又はその誘導体を繰り返し単位とするポリマー」（以下「ポリマーＣ」という。）とは、繰り返し単位に芳香族炭化水素又はその誘導体が含まれるポリマーをいう。芳香族炭化水素がベンゼン環であれば、繰り返し単位の中又は側鎖にベンゼン骨格が含まれるポリマーとなる。ポリマーＣは単独重合体、共重合体のいずれであっても構わない。

「芳香族炭化水素又はその誘導体」としては、以下のものが例示される。
炭化水素基の芳香環であるベンゼン、ナフタレン、アントラセン。
複素芳香環であるフラン、チオフェン、ピロール。
非ベンゼン系芳香環であるアズレン、シクロペンタジエン。

その中でもベンゼン環が好ましい。本発明のポリマーＣとしては、ポリスチレン、ポリスルホン、それらの誘導体が好ましい。ポリスチレンの構造単位やポリスルホンの構造単位と他の構造単位との共重合体も使用できる。共重合体としてはランダムであってもブロックであってもいい。またポリマーＣとしては１種である必要はなく、異なる構造のものを２種以上使用することができる。芳香族炭化水素の誘導体を繰り返し単位とするポリマーとしては、ポリα−メチルスチレン、ポリ(スチレン-ジビニルベンゼン)等のスチレン系ポリマー、並びに、ポリエーテルスルホン、ポリアリ−ルエーテルスルホン及びポリフェニルスルホン等のスルホン基を有するポリマーが例示される。

ポリマーＣはポリマーＢになる前の原料であるが、原料としてのポリマーＣの重量平均分子量としては１万から１００万のものが好ましい。ポリマーＣの重量平均分子量としては１０万から５０万のものがさらに好ましい。ここで重量平均分子量は、テトラヒドロフランを溶媒して４０℃でゲルパーピエションクロマトグラフィを用いて測定したポリスチレン換算で算出されたものである。

「繰り返し単位が有する芳香環の一部が一般式（Ｉ）で示される構造を介して架橋されている」とは、ポリマーＣが有する一の芳香環と、他のポリマーＣが有する他の芳香環とが、上記一般式（Ｉ）で示される構造を介して共有結合し、ポリマーＣ同士が化学的に架橋されている状態をいう。

官能基Ａは脂肪族基、芳香族基又はアミノ基である。式中Ａが複数芳香環に結合していてもよい。脂肪族基の場合、炭素数が１〜３１であることが好ましい。芳香族基の場合、炭素数が６〜１０であることが好ましい。アミノ基の場合、炭素数が０〜２０であることが好ましい。上で定義した官能基Ａが存在することにより一般式（Ｉ）の構造が嵩高くなり、本発明の効果が大きくなる。さらに芳香族基が結合すればさらに効果があがる。

官能基Ａとしては、一般式（Ａ−１）、（Ａ−２）及び（Ａ−３）から選ばれる１種以上であることが好ましい。ここでＲ^１〜Ｒ^５は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜１０の炭化水素基である。

一般式（Ａ−１）で示される官能基としては、イソプロピル基、ｔｅｒｔ−ブチル基が好ましい。一般式（Ａ−２）で示される官能基としては、ジエチルアミノ基が好ましい。

繊維にタンパク質を吸着させようとした場合、繊維の化学構造のみならず、物理構造も重要である。例えば、タンパク質は繊維表面に吸着するが、その際、繊維表面に柔軟な層が形成されているほうが、タンパク質は吸着されやすい。一方、繊維表面に柔軟な層を形成するためには、繊維表面の親水性を高めることが一般的であるが、繊維の親水性が高い場合、液中での繊維表面が有するポリマーの運動性が高くなるため、タンパク質は表面に吸着されにくくなるだけでなく、繊維の物理的強度が低下し微粒子が発生しやすくなる。

そこで、本願発明者らが鋭意検討した結果、芳香族炭化水素又はその誘導体を繰り返し単位とする１種類以上のポリマーの芳香環同士が、上記一般式（Ｉ）で示される構造を介して共有結合されてなり、吸水率が１〜５０％である繊維が、タンパク質を吸着するために有用であることを見出した。タンパク質は繊維の表面に吸着するが、その際、繊維の吸水率が高いほうが、繊維表面に柔軟な分子層が形成される。一方で繊維表面の親水性を高めた場合や、繊維表面に存在するポリマーの運動性を高めた場合などは、タンパク質は吸着されにくくなる。しかしながら、吸水率が１〜５０％となるように、ポリマーの芳香環同士が、上記一般式（Ｉ）で示される構造を介して結合されている場合、該繊維表面は上記一般式（Ｉ）に含まれる芳香環によって疎水性が向上するとともに、一般式（Ｉ）で示される構造によって架橋され、３次元のポリマーネットワーク構造が形成される。これによって、化学的に親水性を強く高めることがなくても、繊維に柔軟な分子層が形成されるため、繊維からの微粒子の発生を減らすことが可能となる。また繊維がタンパク質と相互作用しやすくなるため、タンパク質の吸着性能が上昇する。

また、タンパク質吸着用繊維用のポリマーＢでは、ポリマーＣが有する全ての芳香環から架橋されている必要はない。ポリマーＢのすべての芳香環の数に対する、上記一般式（Ｉ）で示される構造に含まれる芳香環の数の割合が４〜７０％であることが好ましく、２０〜５０％であることがより好ましい。

この割合が低過ぎると、吸水率が増加しやすくなるため繊維が膨潤しやすくなり、繊維強度が低下して、繊維からの発生する微粒子が多くなる傾向がある。また一方、この割合が高過ぎると、吸水率が低くなり、繊維表面の柔軟な分子層も薄くなるため、タンパク質の吸着性能が低くなる。

ポリマーＣの芳香環同士が、上記一般式（Ｉ）で示される構造を介して共有結合されるためには、アルキル基、フェニル基、ヒドロキシ基、メルカプト基、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基及びスルホニル基から選ばれる官能基を有する芳香環に対して、ベンジルアルデヒド基を有した化合物で架橋させることが好ましい。ポリスチレン、ポリスルホン系ポリマー及びそれらの誘導体から選ばれるポリマーを含有する繊維に対して、ベンジルアルデヒド基を有した化合物でポリマーを架橋させることがより好ましい。ベンジルアルデヒド基を有した化合物を用いることで、上記の一般式（Ｉ）で示される構造単位を有する繊維を得ることができる。

繊維の吸水率を制御するためには、架橋剤として、反応性の低い官能基を有する化合物を用いて架橋することが好ましく、アルキル基、アルキレン基などの脂肪族基又は芳香環が結合したベンジルアルデヒドを用いて架橋することがより好ましい。アミノ基等の電子供与性官能基が結合したベンジルアルデヒドで架橋した場合、架橋の程度は高くなる。ただ繊維の吸水率が高くなりやすくなるため、繊維の物理的強度が低下し、微粒子発生の低減効果は上述の官能基ほどではない。また、電子吸引性であるニトロ基等の電子吸引性官能基が結合したベンジルアルデヒドを有した化合物を用いて架橋した場合、架橋の程度は低くなる。

また、架橋剤として、ホルムアルデヒドのような化合物を用いた場合、架橋後の繊維は、芳香環同士が上記一般式（Ｉ）で示される構造を介して共有結合されないため、繊維は水による膨潤形態を取らずに、多孔質構造化する。その理由としては、ホルムアルデヒドで架橋した場合は、立体的な障害が少ないため、架橋反応に用いる溶媒が繊維表面の材料に対すて浸食する量が大きくなり、架橋していないポリマー部分が溶脱されるためと考えられる。

ポリマーＣに対して、ベンジルアルデヒド基を有した化合物を用いて、架橋反応させるための溶媒としては、ポリマーＣとして好ましく使用されるポリスチレンやポリスルホン系ポリマーを溶解や膨潤させる溶媒を用いることが好ましい。これは架橋反応のとき、溶媒によって溶解や膨潤して疎になった繊維表面のポリマーの分子構造が、適度に架橋され、３次元のポリマーネットワークが形成されるからである。具体的な溶媒としては、ニトロベンゼン、ニトロプロパン又はＮ−メチル−２−ピロリドン等が好ましい。また、触媒として酸を加えることが好ましい。加える酸としては、硫酸が好ましい。

また、タンパク質吸着用繊維は、ポリマーＢ以外のポリマーを含んでいてもよく、例えばポリエチレン、ポリプロピレンなどのポリオレフィン；ポリエーテルケトン；ポリカーボネート；ポリエチレンテレフタレートなど芳香族ポリエステルが挙げられる。タンパク質吸着繊維の全てのポリマーに対するポリマーＢ以外のポリマーの比率は、特に限定されるものではないが、８０質量％以下、さらには４０％質量以下が好ましい。

ポリマーＢ以外のポリマーを繊維に含有させ、これらの量を調整することにより吸水率を調整することができる。ポリマーＢが繊維全体に対して１〜５０質量％であることが好ましく、１１〜３０質量％であることがより好ましい。

また、タンパク質吸着用繊維の繊維径は、細すぎると繊維強度が低下し、また、繊維径が太すぎると、繊維重量あたりの表面積が少なくなるため、繊維重量あたりのタンパク質吸着性能が低下することから、繊維径は０．１〜１０００μｍであることが好ましく、０．５〜２０μｍであることがより好ましい。

本発明のタンパク質吸着用繊維は吸着担体として例えばカードリッジの中に充填され血液などの体液のタンパク質吸着用カラムとして使用することができる。

以下実施例と比較例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。

１．タンパク質吸着繊維及びカラムの作製：
（１）繊維の作製：
（参考例１）繊維状担体の作製：
海成分としてポリスチレン（重量平均分子量１８．１万）９０質量％、ポリプロピレン１０質量％の混合ポリマー、島成分としてポリプロピレンを用い、複合口金を用いて溶融紡糸を行いからなる島数１６個、海／島比率５０／５０質量％、繊維径２０μｍである海島複合繊維を作製し、さらに３．１倍に延伸した後、機械捲縮を付与して繊維を設けた。該繊維を筒編状にし、繊維状担体（引度目５８−６０ｍｍ／５０ｃ）を得た（以下、「繊維状担体Ａ」という。）。

なおここでの繊維径とは、繊維状担体の小片試料１０片をランダムに採取して、走査型電子顕微鏡（Ｓ−８００；日立製作所）を用いて倍率２０００倍の写真をそれぞれ撮影し、各写真あたり１０箇所（計１００箇所）の繊維の直径を測定した値の平均値をいう。

（参考例２）繊維状担体の作製：
芯成分として、ポリスチレン（重量平均分子量２６．１万）３５質量％、ポリポリプロピレン３５％質量％の混合ポリマー、鞘成分としてポリスチレン（重量平均分子量２６．１万）３０質量％を用い、複合口金を用いて溶融紡糸を行い、芯成分がポリスチレンが海、ポリプロピレンが島となっている被覆型海島複合繊維（島数１６個、繊維径２６μｍ）を得た。溶融紡糸法で作製したものを筒編状にし、編地の繊維（引度目９５ｍｍ／５０ｃ）を得た（以下、「繊維状担体Ｂ」という。）。

（参考例３）不織布Ａの作製
以下の組成ポリマーを用いて、複合口金を用いて、紡糸速度８００ｍ／分、延伸倍率３倍で溶融紡糸を行い、３６島の海島複合繊維を得た。島成分は内部が芯鞘構造となっている。
島の芯成分：ポリプロピレン
島の鞘成分：ポリスチレン（重量平均分子量２６．１万）９０質量％、ポリプロピレン１０質量％
海成分：エチレンテレフタレート単位を主たる繰り返し単位とし、共重合成分として５−ナトリウムスルホイソフタル酸を共重合ポリエステルに対して３質量％含む共重合ポリエステル
質量比率：島の中の芯／島の中の鞘／海＝４５／４０／１５。

この繊維８５質量％と直径２０μｍのポリプロピレン繊維１５質量％とからなる不織布（目付１３３．７ｇ/ｍ^２）を作製した後、この不織布２枚の間にシート状のポリプロピレン製ネット（厚み０．５ｍｍ、単糸径０．３ｍｍ、開口部２ｍｍ角、目付７０．３ｇ/ｍ^２）を挟み、ニードルパンチすることによって３層構造の不織布（以下、「ＰＰ製不織布」）を得た。

ＰＰ製不織布を９５℃、３質量％の水酸化ナトリウム水溶液で処理し、海成分を溶解することによって、芯鞘繊維の直径が５μｍで、嵩密度が０．０２ｇ／ｃｍ^３の不織布（ＰＳｔ＋ＰＰ製不織布）（以下、「不織布Ａ」）を作製した。

（２）リガンド導入反応：
（実施例１）タンパク質吸着繊維Ａの作製
ニトロベンゼン１８．１ｍＬ、硫酸１１．９ｍＬ、４−イソプロピルベンズアルデヒド０．８ｇを５０℃で混合、撹拌、溶解し、反応液を３０ｍＬ調製した。この反応液に１ｇの繊維状担体Ａを浸漬し、反応液を５０℃に保ったまま１時間反応させた。その後、反応液から反応後の繊維を取り出し、４０ｍＬのニトロベンゼンに浸漬し洗浄した。続いて繊維をメタノールに浸漬し洗浄を行い、さらに水に浸漬して洗浄を行い、４−イソプロピルベンズアルデヒドにより架橋を行ったタンパク質吸着繊維（以下、「タンパク質吸着繊維Ａ」という。）を得た。芳香環同士が、官能基を介して結合している構造を表１に示す。

（実施例２）タンパク質吸着繊維Ｂの作製：
ニトロベンゼン１８．１ｍＬ、硫酸１１．９ｍＬ、４−イソプロピルベンズアルデヒド０．４ｇを５０℃で混合、撹拌、溶解し、反応液を３０ｍＬ調製した。この反応液に１ｇの繊維状担体Ａを浸漬し、反応液を５０℃に保ったまま１時間反応させた。その後、反応液から反応後の繊維を取り出し、４０ｍＬのニトロベンゼンに浸漬し洗浄した。続いてメタノールに浸漬し洗浄を行い、さらに水に浸漬して洗浄を行い、４−イソプロピルベンズアルデヒドにより架橋を行ったタンパク質吸着繊維（以下、「タンパク質吸着繊維Ｂ」という。）を得た。タンパク質吸着繊維Ｂが有する、芳香環同士が、官能基を介して結合している構造を表１に示す。

（実施例３）タンパク質吸着繊維Ｃの作製：
ニトロベンゼン１８．１ｍＬ、硫酸１１．９ｍＬ、４−イソプロピルベンズアルデヒド１．６ｇを５０℃で混合、撹拌、溶解し、反応液を３０ｍＬ調製した。この反応液に１ｇの繊維状担体Ａを浸漬し、反応液を５０℃に保ったまま１時間反応させた。その後、反応液から反応後の繊維を取り出し、４０ｍＬのニトロベンゼンに浸漬し洗浄した。続いて繊維をメタノールに浸漬し洗浄を行い、さらに水に浸漬して洗浄を行い、４−イソプロピルベンズアルデヒドにより架橋を行ったタンパク質吸着繊維（以下、「タンパク質吸着繊維Ｃ」）を得た。タンパク質吸着繊維Ｃが有する、芳香環同士が、官能基を介して結合している構造を表１に示す。

（実施例４）タンパク質吸着繊維Ｄの作製：
ニトロベンゼン１８．１ｍＬ、硫酸１１．９ｍＬ、４−ｔｅｒｔ−ブチルベンズアルデヒド０．８ｇを５０℃で混合、撹拌、溶解し、反応液を３０ｍＬ調製した。この反応液に１ｇの繊維状担体Ａを浸漬し、反応液を５０℃に保ったまま１時間反応させた。その後、反応液から反応後の繊維を取り出し、４０ｍＬのニトロベンゼンに浸漬し洗浄した。続いて繊維をメタノールに浸漬し洗浄を行い、さらに水に浸漬して洗浄を行い、４−ｔｅｒｔ−ブチルベンズアルデヒドにより架橋を行ったタンパク質吸着繊維（以下、「タンパク質吸着繊維Ｄ」という。）を得た。タンパク質吸着繊維Ｄが有する、芳香環同士が、官能基を介して結合している構造を表１に示す。

（実施例５）タンパク質吸着繊維Ｅの作製：
ニトロベンゼン１８．１ｍＬ、硫酸１１．９ｍＬ、４−ジエチルアミノベンズアルデヒド１．０ｇを５０℃で混合、撹拌、溶解し、反応液を３０ｍＬ調製した。この反応液に１ｇの繊維状担体Ａを浸漬し、反応液を５０℃に保ったまま５０分間反応させた。その後、反応液から反応後の繊維を取り出し、４０ｍＬのニトロベンゼンに浸漬し洗浄した。続いて繊維をメタノールに浸漬し洗浄を行い、さらに水に浸漬して洗浄を行い、４−ジエチルアミノベンズアルデヒドにより架橋を行ったタンパク質吸着繊維（以下、「タンパク質吸着繊維Ｅ」という。）を得た。タンパク質吸着繊維Ｅが有する、芳香環同士が、官能基を介して結合している構造を表１に示す。

（比較例１）タンパク質吸着繊維Ｆの作製：
ニトロベンゼン１８．１ｍＬ、硫酸１１．９ｍＬ、４−イソプロピルベンズアルデヒド０．１５ｇを５０℃で混合、撹拌、溶解し、反応液を３０ｍＬ調製した。この反応液に１ｇの繊維状担体Ａを浸漬し、反応液を５０℃に保ったまま１時間反応させた。その後、反応液から反応後の繊維を取り出し、４０ｍＬのニトロベンゼンに浸漬し洗浄した。続いて繊維をメタノールに浸漬し洗浄を行い、さらに水に浸漬して洗浄を行い、４−イソプロピルベンズアルデヒドにより架橋を行ったタンパク質吸着繊維（以下、「タンパク質吸着繊維Ｆ」という。）を得た。タンパク質吸着繊維Ｆが有する、芳香環同士が、官能基を介して結合している構造を表１に示す。

（比較例２）タンパク質吸着繊維Ｇの作製：
ニトロベンゼン１８．１ｍＬ、硫酸１１．９ｍＬ、４−イソプロピルベンズアルデヒド
３．０ｇを５０℃で混合、撹拌、溶解し、反応液を３０ｍＬ調製した。この反応液に１ｇの繊維状担体Ａを浸漬し、反応液を５０℃に保ったまま１時間反応させた。その後、反応液から反応後の繊維を取り出し、４０ｍＬのニトロベンゼンに浸漬し洗浄した。続いて繊維をメタノールに浸漬し洗浄を行い、さらに水に浸漬して洗浄を行い、４−イソプロピルベンズアルデヒドにより架橋を行ったタンパク質吸着繊維（以下、「タンパク質吸着繊維Ｇ」という。）を得た。芳香環同士が、官能基を介して結合している構造を表１に示す。

（比較例３）タンパク質吸着繊維Ｈの作製：
ニトロベンゼン１８．１ｍＬ、硫酸１１．９ｍＬ、４−ジメチルアミノベンズアルデヒド１．５ｇを５０℃で混合、撹拌、溶解し、反応液を４０ｍＬ調製した。この反応液に１ｇの不織布Ａを浸漬し、反応液を５０℃に保ったまま１．５時間反応させた。その後、反応液から不織布を取り出し、４０ｍＬのニトロベンゼンに浸漬し洗浄した。続いて不織布を取り出し、メタノールに浸漬し洗浄を行い、さらに水に浸漬して洗浄を行い、４−ジメチルアミノベンズアルデヒドにより架橋を行った不織布（以下、「タンパク質吸着繊維Ｈ」）を得た。タンパク質吸着繊維Ｈが有する、芳香環同士が、官能基を介して結合している構造を表１に示す。

（比較例４）タンパク質吸着繊維Ｉの作製：
５０ｇのＮ−メチロール−α−クロロアセトアミド、４００ｇのニトロベンゼン、４００ｇの９８重量％硫酸及び０．８５ｇのパラホルムアルデヒドからなる混合溶液中に５０ｇの繊維状担体Ｂを浸し、４℃で１時間反応させた。反応後の繊維を０℃の氷水５Ｌ中に浸して反応を停止させた後、水で洗浄し、さらに繊維に付着しているニトロベンゼンをメタノールで抽出除去した。この繊維を５０℃で真空乾燥して、クロロアセトアミドメチル化架橋ポリスチレン編地（以下、「ＡＭＰＳｔ編地」という。）７１ｇを得た。

テトラエチレンペンタミン１．５ｇをジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」）５００ｍＬに溶解し、ここへ２０ｇのＡＭＰＳｔ編地を撹拌しながら加え、２５℃で６時間反応させた。反応後のＡＭＰＳｔ編地は、ガラスフィルター上で５００ｍＬのＤＭＳＯで洗浄した。洗浄後のＡＭＰＳｔ編地３．０ｇを、１．０ｇのパラクロロフェニルイソシアネートを溶解した１５０ｍＬのＤＭＳＯの溶液中に加え、２５℃で１時間反応させてから、ガラスフィルター上でそれぞれ６０ｍＬのＤＭＳＯ及び蒸留水で洗浄し、さらにそれぞれ３Ｌの蒸留水及び生理食塩水で洗浄して、タンパク質吸着繊維（以下、「タンパク質吸着繊維Ｉ」という。）を得た。タンパク質吸着繊維Ｉが有する、芳香環同士が、官能基を介して結合している構造を表１に示す。

（比較例５）タンパク質吸着繊維Ｊの作製：
ニトロベンゼン１８．１ｍＬ、硫酸１１．９ｍＬ、パラホルムアルデヒド０．８ｇを５０℃で混合、撹拌、溶解し、反応液を３０ｍＬ調製した。この反応液に１ｇの繊維状担体Ａを浸漬し、反応液を５０℃に保ったまま１時間反応させた。その後、反応液から反応後の繊維を取り出し、４０ｍＬのニトロベンゼンに浸漬し洗浄した。続いて繊維をメタノールに浸漬し洗浄を行い、さらに水に浸漬して洗浄を行い、タンパク質吸着繊維（以下、「タンパク質吸着繊維Ｊ」）を得た。タンパク質吸着繊維Ｊが有する、芳香環同士が、官能基を介して結合している構造を表１に示す。

（３）タンパク質吸着繊維を吸着担体として備えたカラムの作製：
ポリプロピレン−ポリエチレン共重合体製カラム（直径：４０ｍｍ×長さ：１３３ｍｍ、吸着繊維充填部体積：４０ｃｍ^３）１本当たりに吸着繊維Ａ〜Ｊを各々５４ｇ充填した。その後、カラム内を注射用水（大塚製薬）で満たした後、高圧蒸気滅菌を行い、それぞれタンパク質吸着繊維Ａ〜Ｊを吸着担体として備えたカラム（以下、「カラムＡ〜Ｊ」）を得た。

２．測定方法：
（１）芳香環及び上記一般式（Ｉ）で示される構造の確認：
タンパク質吸着繊維Ａ〜Ｊにおける芳香環及び上記一般式（Ｉ）で示される構造の同定は、^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルで同定した。すなわち、重クロロホルムにタンパク質吸着繊維Ａ〜Ｊを溶解させ、核磁気共鳴装置（ＪＯＥＬＲＥＳＯＮＡＮＣＥ社）を用いて^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＴＭＳ基準）を得た（共鳴周波数：２７０ＭＨｚ）。取得した^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて、プロトンの存在位置とケミカルシフトとの関係にしたがい上記一般式（Ｉ）で示される構造を同定した。
６．０〜８．０ｐｐｍ：芳香環のプロトン
５．０〜６．０：上記一般式（Ｉ）で示される構造の架橋点のプロトン
１．０〜２．５：ポリスチレン主鎖のプロトン
また、^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルデータから、すべての芳香環の数に対する、一般式（Ｉ）で示される構造に含まれる芳香環の数の割合を以下の式１にしたがって算出した。
割合（％）＝（５．０−６．０（ｐｐｍ）におけるピーク積分値）／｛（６．０−８．０（ｐｐｍ）におけるピーク積分値）＋（１．０−２．５（ｐｐｍ）におけるピーク積分値）｝×１／８×１００・・・式１。

（２）吸水率測定：
タンパク質吸着繊維Ａ〜Ｊにおける膨潤性を確認するため、以下に記載の方法にしたがって吸水率を測定した。すなわち、１辺４ｃｍの正方形に切り取った繊維状担体を水に２４時間以上浸漬させた後、２枚のキムタオル（日本製紙クレシア社製）の間に挟んで水分を十分取り除き、乾燥前の重量を測定した。この後、常温真空下で２４時間以上乾燥させ、乾燥後の重量を測定した。吸水率を以下の式２にしたがって算出した。

吸水率（％）＝｛（乾燥前の吸着繊維担体重量）−（乾燥後の吸着繊維担体重量）｝／（乾燥前の吸着繊維担体重量）・・・式２。

（３）ＩＬ−６吸着性能測定：
タンパク質吸着繊維Ａ〜Ｊにおける吸着反応の前後の溶液中のＩＬ−６濃度をＥＬＩＳＡ法で定量し、以下の式にしたがって吸着率を算出した。すなわち、直径６ｍｍの円板状に切り抜いたタンパク質吸着繊維Ａ〜Ｊ４枚を、ポリプロピレン製の容器に入れた。この容器に、ヒト天然型ＩＬ−６（鎌倉テクノサイエンス）の濃度が１００００ｐｇ／ｍＬになるように調整した牛退治血清（以下、ＦＢＳ）を１．１ｍL添加し、３７℃のインキュベータ内で２時間転倒混和した。吸着繊維担体を容器から取り除いた後、市販のヒトＩＬ−６ＥＬＩＳＡキット（鎌倉テクノサイエンス）を用いて溶液中のＩＬ−６の残濃度を測定し、以下の式３にしたがってＩＬ−６吸着率を算出した。
ＩＬ−６吸着率（％）＝｛（インキュベート前のＩＬ−６濃度）―（インキュベート後のＩＬ−６濃度）｝／（インキュベート前のＩＬ−６濃度）×１００・・・式３。

（４）不溶性微粒子数測定：
第十五改正日本薬局方収載(２００６年３月３１日厚生労働省告示第２８５号)の一般試験法６．０７注射剤の不溶性微粒子試験法（第１法：光遮蔽粒子計数法；ｐｐ．１−２）を参考にして実施した。包装貨物及び容器の振動試験方法（ＪＩＳＺ０２３２）を参考にし、カラムを水平及び垂直方向に各１時間振動した。振動後のカラムを市販の人工腎臓用血液回路と接続し、生理食塩液２Ｌを用いて毎分１００ｍＬの流速にて洗浄した。なお、使用する生理食塩液はポアサイズ０．３μｍのフィルターを通したものを用いた。濾過した生理食塩液をポンプを用いて毎分５０ｍＬの流速で１時間本品に送入し、その流出液を２０分毎に１Ｌずつ、計３回採取（計３Ｌ）した。得られた流出液を光遮へい型自動微粒子測定装置にてそれぞれ３００ｍＬずつ供給し、微粒子を測定し、１時間送液した時の総微粒子数（個／ｍＬ）を算出した。１時間送液した時の総微粒子数が、５μｍ以上の微粒子が０．５個／ｍＬ以下かつ２５μｍ以上の微粒子が０．２個／ｍＬ以下であれば微粒子の量が少ないと判断した。

上記の（２）吸水率及び（３）ＩＬ−６吸着性能の測定方法に従い、タンパク質吸着繊維Ａ〜Ｊを評価した。また、上記の（４）不溶性微粒子数の測定試験方法に従い、カラムＡ〜Ｊを評価した。吸水率、ＩＬ−６吸着性能及び不溶性微粒子数測定の結果を表２に示す。

表２の結果より、ポリマーの芳香環同士が、上記一般式（Ｉ）で示される構造を介して共有結合されており、吸水率が１.２％〜４９．７％の範囲であるタンパク質吸着繊維Ａ〜Ｅは、ＩＬ−６吸着率が５３．３％以上を示しサイトカイン除去性能が高いだけでなく、不溶性微粒子の発生を少なくすることができた（実施例１〜５）。

一方、ポリマーの芳香環同士が、上記一般式（Ｉ）で示される構造を介して共有結合されているが、吸水率が５４．３％であるタンパク質吸着繊維Ｆでは、不溶性微粒子の発生は少ないが、ＩＬ−６吸着率は５．０％とサイトカイン除去性能が低かった（比較例１）。ポリマーの芳香環同士が、上記一般式（Ｉ）で示される構造を介して共有結合されているが、吸水率が０．５％であるタンパク質吸着繊維Ｇでは、不溶性微粒子の発生は少ないが、ＩＬ−６吸着率は３．０％とサイトカイン除去性能が低かった（比較例２）。ポリマーの芳香環同士が、上記一般式（Ｉ）で示される構造を介して共有結合されているが、吸水率が０．８％であるタンパク質吸着繊維Ｈでは、不溶性微粒子の発生は少ないが、ＩＬ−６吸着率は７．５％とサイトカイン除去性能は低かった（比較例３）。さらに吸水率が４６．４％であるが、ポリマーの芳香環同士が、上記一般式（Ｉ）で示される構造を介して共有結合されていないタンパク質吸着繊維Ｉでは、ＩＬ−６吸着率は６０．２％となり、サイトカイン除去性能は高いが、不溶性微粒子の発生が多かった（比較例４）。ポリマーの芳香環同士が、上記一般式（Ｉ）で示される構造を介して共有結合されておらず、吸水率も０．６％と低いタンパク質吸着繊維Ｊでは、不溶性微粒子の発生が多く、ＩＬ−６吸着率は７．０％とサイトカイン除去性能も低かった（比較例５）。

なお、各実施例ではポリマーＢに相当するもの以外には芳香族でないポリマーを使用しているので、繊維が含有する全ての芳香族の数は、ポリマーＢの芳香族の数と同じである。

本発明のタンパク質吸着用繊維は、血液、生体の体液及び、生体からの排出液等のタンパク質を含む処理液からβ_２−ＭＧやサイトカイン等のタンパク質を吸着除去する用途に好適に用いることができる。また、特定の被吸着物質を除去しなければならない疾患を治療するためのタンパク質吸着用カラム、例えば、タンパク質であるβ_２−ミクログロブリンや、サイトカイン、自己免疫抗体、脂質・タンパク質複合体である低密度リポタンパク質などを除去するための体外循環カラムに好適に用いられる。

Claims

吸水率が１〜５０％であり、
芳香族炭化水素を繰り返し単位に含み、前記繰り返し単位が有する芳香環の一部が下記一般式（Ｉ）で示される構造を介して架橋されているポリマーを含有し、芳香族炭化水素が、ベンゼンであり、ポリマーが、ポリスチレンである、タンパク質吸着用繊維。

（式中、Ａは以下の一般式（Ａ−１）又は（Ａ−２）から選ばれる。波線は、芳香環との結合位置を表す。）

（式中、Ｒ ^１〜Ｒ ^５は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜１０の炭化水素基を表し、波線は、結合位置を表す。）
前記繊維の単糸径が０．１〜１０００μｍである、請求項１記載のタンパク質吸着用繊維。
前記架橋されているポリマーが有するすべての芳香環の数に対する、一般式（Ｉ）で示される芳香環の数が、４〜７０％である、請求項１又は２記載のタンパク質吸着用繊維。
サイトカイン吸着用である、請求項１〜３のいずれか一項記載のタンパク質吸着用繊維。
請求項１〜４のいずれか一項記載のタンパク質吸着用繊維を吸着担体として含む、タンパク質吸着用カラム。