JP6649263B2 - スタチン系化合物の精製方法 - Google Patents
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Description
例えば、ロスバスタチンは、(E)−7−[4−(4−フルオロフェニル)−6−イソプロピル−2−[メチル(メチルスルホニル)アミノ]ピリミジン−5−イル]−(3R,5S)−3,5−ヒドロキシ−6−ヘプテン酸の一般名であり、そのカルシウム塩は以下の化学式で表される。
例えば、特許文献1に、ロスバスタチン、そのナトリウム塩とカルシウム塩、及びこれらの製造方法が開示されている。特許文献1によれば、ロスバスタチン及びその塩は、(3R)−3−[(tert−ブチルジメチルシリル)オキシ]−5−オキソ−6−トリフェニルホスホラニリデンヘキサン酸メチルと、4−(4−フルオロフェニル)−6−イソプロピル−2−(N−メチル−N−メタンスルホニルアミノ)−5−ピリミジンカルボキシアルデヒドとを縮合させて不斉中心を一個有する側鎖を導入し、次いで3−ヒドロキシ基の脱保護、5−オキソ基の不斉還元、及び加水分解を行なうことによって得られる。
スタチン系化合物は、純度の向上が望まれており、本発明の発明者らは、従来よりも高純度のロスバスタチンカルシウムが得られる方法として、(E)−7−[4−(4−フルオロフェニル)−6−イソプロピル−2−[メチル(メチルスルホニル)アミノ]ピリミジン−5−イル]−3,5−ジオキソ−6−ヘプテン酸n−プロピルエステル(以下、「DOXP」と称する場合がある。)に、カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を有する酵素等を作用させて((3R),(5S),(6E))−7−[4−(4−フルオロフェニル)−6−イソプロピル−2−[メチル(メチルスルホニル)アミノ]ピリミジン−5−イル]−3,5−ジヒドロキシ−6−ヘプテン酸n−プロピルエステル(以下、「DOLP」と称する場合がある。)を得る工程を有するロスバスタチンカルシウムの製造方法について発明し、既に特許出願を行なっている(特許文献2)。
本発明は、スタチン系化合物に含まれる前記一般式(1)で表される化合物を効率よく除去し、高純度のスタチン系化合物を得る方法を提供することを目的とする。
[1]下記一般式(1):
で表される化合物を含むスタチン系化合物の精製方法であって、
(A)該一般式(1)で表される化合物を、下記一般式(2):
で表される化合物に変換する工程
を有することを特徴とする、スタチン系化合物の精製方法;
[2]前記工程(A)の後、(B)前記一般式(2)で表される化合物を除去する工程を有することを特徴とする、[1]に記載のスタチン系化合物の精製方法;
[3]前記工程(A)を、溶媒の存在下、加熱することにより行なうことを特徴とする、[1]又は[2]に記載のスタチン系化合物の精製方法;
[4]前記工程(A)において、前記スタチン系化合物が、前記一般式(1)で表される化合物を0.01面積%以上含有することを特徴とする、[1]〜[3]のいずれか一つに記載のスタチン系化合物の精製方法;
[5]前記工程(B)の後、(C)前記工程(B)で得られた化合物とカルシウム化合物とを反応させる工程を有することを特徴とする、[2]〜[4]のいずれか一つに記載のスタチン系化合物の精製方法;
[6]前記スタチン系化合物が、ロスバスタチン、ピタバスタチン、フルバスタチン、及びその塩からなる群から選ばれる少なくとも一種であり、かつ、前記一般式(1)及び(2)におけるR1が、
[7]前記スタチン系化合物がロスバスタチン又はその塩であり、かつ、下記一般式(3):
で表される化合物をさらに含むことを特徴とする、[1]〜[5]のいずれか一つに記載のスタチン系化合物の精製方法;
[8]下記一般式(2):
[9]下記一般式(2):
[10]下記一般式(2):
[11]下記一般式(2):
[12]スタチン系化合物の製造方法であって、該スタチン系化合物に含まれる下記一般式(2):
さらに、本発明は、以下に関する。
・前記工程(A)を、30℃以上100℃以下の条件下で行なうことを特徴とする、[3]に記載のスタチン系化合物の精製方法;
・前記工程(B)において、塩基性の条件下、有機溶媒により抽出することにより、前記一般式(2)で表される化合物を除去することを特徴とする、[2]〜[4]のいずれか一つに記載のスタチン系化合物の精製方法;
・前記工程(A)に先立ち、前記スタチン系化合物を溶媒に溶解する工程を有することを特徴とする、[1]〜[5]のいずれか一つに記載のスタチン系化合物の精製方法。
本明細書において、「炭素数1〜8の1級アルキル基」とは、メチル基、エチル基、n−プロピル基、n−ブチル基、n−ペンチル基、n−ヘキシル基、n-オクチル基を意味する。
本明細書において、「炭素数1〜4の1級アルキル基」とは、メチル基、エチル基、n−プロピル基、n−ブチル基を意味する。
本明細書において、「炭素数3〜6の2級アルキル基」とは、イソプロピル基、シクロプロピル基、sec−ブチル基、1−メチルブチル基、1−メチルヘプチル基、1−エチルプロピル基、1−エチルブチル基を意味する。
本明細書において、「炭素数3〜4の2級アルキル基」とは、イソプロピル基、シクロプロピル基、sec−ブチル基を意味する。
本明細書において、「炭素数1〜8の直鎖状又は分岐状アルキル基」とは、メチル基、エチル基、n−プロピル基、n−ブチル基、n−ペンチル基、n−ヘキシル基、n−オクチル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、sec−ブチル基、1−メチルブチル基、1−メチルヘプチル基、tert−ブチル基、tert−アミル基を意味する。
本明細書において、「炭素数3〜8の分岐状アルキル基」とは、イソプロピル基、シクロプロピル基、sec−ブチル基、1−メチルブチル基、1−メチルヘプチル基、tert−ブチル基、tert−アミル基を意味する。
本明細書において、「炭素数1〜4のアルキル基」とは、上記「炭素数1〜8の直鎖状又は分岐状アルキル基」のうち、炭素数が1〜4のものを意味する。
本明細書において、「窒素含有複素環を含む基」とは、ピタバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン等のスタチン系化合物に含まれる母骨格に相当する基である。
本明細書において、「アルカリ金属元素」とは、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム、フランシウムを意味する。好ましくは、アルカリ金属元素は、ナトリウム又はカリウムである。
本明細書において、「アルカリ土類金属元素」とは、カルシウム、ストロンチウム、バリウム、ラジウムを意味する。好ましくは、アルカリ土類金属元素は、カルシウム又はバリウムである。
本明細書において、「カルシウム化合物」とは、塩化カルシウム、酢酸カルシウム等の、カルボン酸をカルボン酸のカルシウム塩に変換することのできる化合物を意味する。好ましくは、カルシウム化合物は塩化カルシウムである。
本明細書において、「アミン化合物」とは、n−プロピルアミン、イソプロピルアミン、ジメチルアミン等の、カルボン酸をカルボン酸のアミン塩に変換することのできる化合物を意味する。好ましくは、アミン化合物はn−プロピルアミン又はジメチルアミンである。
なお、本発明に係る化合物には、化合物の塩、無水物、水和物、溶媒和物等も包含される。
「カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性」を有するか否かは、カルボニル基含有化合物中のカルボニル基を不斉還元して光学活性なアルコールに変換する活性を、通常のアッセイ法で測定することにより判定可能である。例えば、一般式(1A)で表される化合物に、測定の対象とする酵素を作用させ、一般式(1A)で表される化合物から変換された一般式(2A)で表される化合物の量を直接的に測定することにより、その酵素活性を確認することができる。また、本明細書における「酵素」には、精製酵素(部分的に精製した酵素を含む。)や、通常の固定化技術を用いて固定化したもの、例えば、ポリアクリルアミド、カラギーナンゲル等の担体に固定化したもの等も含まれる。
なお、「微生物若しくは細胞」の種類としては、後述の宿主生物若しくは宿主細胞に記載のものが挙げられる。また、本明細書において、「前記活性を有する酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞」としては、生きている微生物若しくは細胞に限られず、生体としては死んでいるが酵素活性を有するものも含まれる。
また、本発明の微生物若しくは細胞は、国際公開第2003/078634号に記載の方法で作製することができる。
本明細書において、「宿主細胞」とする細胞の種類は特に限定されず、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等を用いることができる。
本明細書において、「形質転換体」とは、前記発現ベクターが導入され、所望の機能を有するタンパク質に関連する所望の形質を表すことができるようになった生物又は細胞を意味する。
本明細書において、「微生物若しくは細胞を培養して得られた酵素を含む培養液」とは、1)微生物若しくは細胞の培養液、2)微生物若しくは細胞の培養液を有機溶媒等により処理をした培養液、3)微生物若しくは細胞の細胞膜を物理的又は酵素的に破壊してある培養液を意味する。
[スタチン系化合物]
本発明の精製方法では、下記一般式(1)で表される化合物(以下、「3−MOLA」と称することがある。)を含むスタチン系化合物の精製を行なうことができる。本発明において、スタチン系化合物とは、化合物自体であってもよく、カルボン酸、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩等の塩の形態であってもよく、これらの混合物であってもよい。
前記一般式(1)において、R1は、
本発明の精製方法の対象となるスタチン系化合物は、ロスバスタチン、ピタバスタチンフルバスタチン、及びこれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも一種であることが好ましく、ロスバスタチンピタバスタチン、又はこれらの塩であることがより好ましく、ロスバスタチン又はこれらの塩であることが特に好ましい。
また、ここで、本発明の精製方法は、前記一般式(1)で表される化合物を、HPLC(High Performance Liquid Chromatography)で測定して0.01面積%以上含有するスタチン系化合物を、精製の対象とすることが好ましく、0.05面積%以上含有するスタチン系化合物を、精製の対象とすることができる。また、上限値としては、本発明の効果が得られる限り、特に制限はないが、通常99面積%以下、好ましくは50面積%以下、より好ましくは25面積%以下、特に好ましくは5面積%以下、もっとも好ましくは1面積%以下である。本発明の好ましい実施態様では、スタチン系化合物は、前記一般式(1)で表される化合物を0.01面積%以上5面積%以下含有する。
本発明の精製方法は、(A)前記一般式(1)で表される化合物を下記一般式(2):
で表される化合物(以下、「KTNE」と称することがある。)に変換する工程を有することを特徴とする。
前記工程(A)の後、(B)前記一般式(2)で表される化合物を除去する工程を有することが好ましい。
また、さらに、前記工程(B)の後、(C)前記工程(B)で得られた化合物とカルシウム化合物とを反応させる工程を有することが好ましい。
以下、本発明の精製方法が有する工程(A)〜(C)について、工程ごとに説明する。
工程(A)は、前記一般式(1)で表される化合物を、前記一般式(2)で表される化合物に変換する工程である。
前記一般式(1)で表される化合物は、通常、前記スタチン系化合物に含まれているが、工程(A)を開始するにあたって、前記一般式(1)で表される化合物を添加してもよい。
工程(A)では、前記一般式(1)で表される化合物は、脱炭酸化され、前記一般式(2)で表される化合物に変換される。
一方で、工程(A)において、前記スタチン系化合物は、カルボン酸、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩のいずれの形態であってもよく、これらの混合物であってもよい。前記一般式(1)で表される化合物の脱炭酸化に伴い、前記スタチン系化合物は、その形態が変化しても、変化しなくてもよい。具体的には、後述するように工程(A)を酸性又は塩基性条件下で行なう場合は、用いる酸又は塩基の種類に応じて、用いる酸又は塩基に由来する塩の形態に変換されることがある。例えば、スタチン系化合物がロスバスタチンであり、かつ、水酸化ナトリウムの存在下で工程(A)を行なう場合、通常、上記の反応と共に、(E)−7−[4−(4−フルオロフェニル)−6−イソプロピル−2−[メチル(メチルスルホニル)アミノ]ピリミジン−5−イル]−(3R,5S)−3,5−ヒドロキシ−6−ヘプテン酸(以下、「DOLA」と称する場合がある。)が、ロスバスタチンナトリウム(以下、「RSV−Na」と称する場合がある。)に変換される。
工程(A)は、溶媒の存在下で行なうことが好ましい。ここで、溶媒としては、エーテル類(例、メチルt−ブチルエーテル、テトラヒドロフラン(以下、「THF」と称する場合がある。)、シクロペンチルメチルエーテル等)、酢酸エステル類(例、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル等)、アミド類(例、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド等)、炭化水素(例、トルエン、シクロヘキサン等)、アルコール類(例、メタノール、エタノール、イソプロパノール等)、水等が挙げられ、中でも、メチルt−ブチルエーテル、THF、酢酸エチル、トルエン、水が好ましい。
反応温度としては、通常30℃以上、好ましくは40℃以上であり、また、通常130℃以下、好ましくは100℃以下である。反応を効率的に進めるため、必要に応じて加熱することが好ましい。本発明の好ましい実施態様では、工程(A)は、30℃以上100℃以下の条件下で行われる。
工程(A)におけるpHに特に制限はないが、反応を促進するために、酸性条件下又は塩基性条件下とすることが好ましい。
酸性条件下で行なう場合、好ましくはpH0以上pH3以下、より好ましくはpH2以下の範囲で行なうことが好ましい。ここで用いることのできる酸としては、塩酸、硫酸、メタンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸等が挙げられ、中でも、塩酸、硫酸が好ましい。
塩基性条件下で行なう場合、pH10以上pH14以下の範囲で行なうことが好ましい。ここで用いることのできる塩基としては、アルカリ金属水酸化物(例、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等)、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン等が挙げられ、中でも、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが好ましい。
また、反応時間は、その他の条件にもよるが、通常1時間以上、好ましくは2時間以上であり、また、通常48時間以下、好ましくは24時間以下である。
上記の反応時間を短縮するためにも、必要に応じて、工程(A)においては、反応溶液を必要に応じて撹拌することが好ましい。
工程(B)は、工程(A)で得られた混合物(工程(A)に先立ち、前記スタチン系化合物を溶媒に溶解する工程を有する場合、溶液)から、前記一般式(2)で表される化合物を除去する工程である。なお、ここで、除去するとは、必ずしも完全に除去されている必要はなく、その大部分が除去されて、得られる化合物の純度が向上すればよい。また、本工程で、前記一般式(2)で表される化合物が除去されると、前記スタチン系化合物、又はその塩が残る。
前記一般式(2)で表される化合物を除去することができれば、その手段や反応条件に特に制限はない。工程(B)の好ましい例を以下に記載する。
工程(B)は、塩基性の条件下、有機溶媒により抽出することにより、前記一般式(2)で表される化合物を除去することが好ましい。
ここで、用いることのできる有機溶媒としては、エーテル類(例、メチルt−ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル(以下、「CPME」と称する場合がある。)等)、酢酸イソプロピル、酢酸エチル、酢酸メチル等のエステル類、トルエン、メチルエチルケトン等のケトン類等が挙げられ、中でも、上述のエーテル類、エステル類が好ましく、中でも、メチルt−ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、メチルエチルケトン、酢酸エチルが好ましい。
また、塩基性の条件下とは、pH8以上pH14以下の範囲の条件が好ましく、pH10以上pH14以下の範囲の条件で行なうことがより好ましい。
工程(C)は、前記工程(B)で得られた化合物、即ち、前記スタチン系化合物又はその塩とカルシウム化合物とを反応させる工程であり、前記工程(B)で得られた化合物をカルシウム塩に変換する場合に行なう工程である。具体的には、前記スタチン系化合物がロスバスタチン又はピタバスタチンである場合に、ロスバスタチンカルシウム又はピタバスタチンカルシウムを得るために行なう。
工程(C)では、例えばスタチン系化合物がロスバスタチンである場合、通常、前記工程(B)で得られた化合物(例えば、RSV−Na)が、ロスバスタチンカルシウム(以下、「RSV−Ca」と称する場合がある。)に変換される。
カルシウム化合物としては、塩化カルシウム、酢酸カルシウム等を用いることができ、特に、塩化カルシウムが好ましい。カルシウム化合物の使用量は、前記工程(B)で得られた化合物に対して、通常0.5当量〜3当量、好ましくは、0.6当量〜2.8当量である。
反応は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、メチルtert−ブチルエーテル(以下、「MTBE」と称する場合がある。)、THF、CPME等のエーテル系溶媒、N−メチル−2−ピロリドン、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、水等の極性溶媒や、これら極性溶媒と非極性溶媒(トルエン、シクロヘキサン、メシチレン等)との混合物が好ましい。
反応温度は、通常0℃〜200℃、好ましくは、20℃〜110℃である。
反応時間は、通常0.01時間〜200時間、好ましくは、0.5時間〜24時間である。
前記一般式(3)において、R3は、アルカリ金属元素又は水素であることが好ましい。ここで、アルカリ金属元素としてはリチウム、ナトリウム又はカリウムが好ましく、ナトリウム又はカリウムであることが特に好ましい。
上記のように反応温度を高めにすることにより、前記一般式(1)で表される化合物が前記一般式(2)で表される化合物に変換され、さらに、5−MOLAが、(3E,5E)−4−[(4−フルオロフェニル)−2−[メタンスルホニル(メチル)アミノ]−6−イソプロピルピリミジン−5−イル)]−2−オキソ−3,5−ヘキサジエン(以下、「DENK」と称する場合がある。)に変換される。
前記スタチン系化合物がロスバスタチンである場合、本発明の精製方法に用いられるロスバスタチンカルシウムの製造方法に特に制限はないが、以下の方法で製造されたものであることが好ましい。
なお、以下において、w/vは重量/容量を意味する。
本発明の製造方法には、以下に示すように、一般式(1A)で表される化合物を一般式(2A)で表される化合物に変換する工程(i)、及び一般式(2A)で表される化合物を式(6)で示されるロスバスタチンカルシウムに変換する工程(iiia)、(iiib)((iiib−1)〜(iiib−3))又は(iiic)((iiic−1)〜(iiic−2))が含まれる。
−X1及び−X2はそれぞれ独立して、−OH又は=Oを表し、−X1又は−X2の少なくとも一方が=Oである。
R3A及びR4Aはそれぞれ独立して、水素原子又は炭素数1〜8のアルキル基を表し、好ましくは、水素原子又は炭素数1〜4のアルキル基である。
さらに、工程(ii)の好ましい態様として、式(3A)で表される化合物及び一般式(4a)で表される化合物から一般式(5)で表される化合物に変換する工程(iia)、及び一般式(5)で表される化合物を一般式(1A)で表される化合物に変換する工程(iib)が含まれる。
R1Aは炭素数1〜8の直鎖状又は分岐状アルキル基を表す。
R2Aは炭素数3〜8の分岐状アルキル基を表し、上記Rとは異なる基である。R2Aは好ましくは、イソプロピル基、s−ブチル基、tert−ブチル基又はtert−アミル基であり、特に好ましくは、tert−ブチル基である。
工程(i)は、一般式(1A)で表される化合物に、カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を有する酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞(本発明の生物若しくは細胞)、該微生物若しくは細胞の処理物、及び/又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液(以下、これらをまとめて「本発明の酵素等」と称することがある。)を作用させて還元して、一般式(2A)で表される化合物を得る工程である。
(A)特許第4270918号に記載のOgataea minuta var. nonfermentans NBRC1473由来のカルボニル還元酵素(OCR1)(配列番号2)を有するポリペプチド
(B)配列番号2に記載のアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、一般式(1A)で表される化合物を、一般式(2A)で表される化合物に変換する活性を有するポリペプチド
(C)配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ一般式(1A)で表される化合物を、一般式(2A)で表される化合物に変換する活性を有するポリペプチド
また、上記(C)のホモログは、カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を害さない範囲において、配列番号2に記載のアミノ酸配列に1又は数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を有するものである。ここで、「1又は数個のアミノ酸」とは、具体的には20個以下、好ましくは10個以下、より好ましくは5個以下のアミノ酸である。
上記酵素をコードする遺伝子は、下記(D)、(E)又は(F)に示す塩基配列、又はこれらのホモログを含むDNAである。
(D)配列番号1に記載の塩基配列
(E)配列番号1に記載の塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、一般式(1A)で表される化合物に作用して、一般式(2A)で表される化合物に変換する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列
(F)配列番号1に記載の塩基配列において1又は数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列を含み、かつ一般式(1A)で表される化合物に作用して、一般式(2A)で表される化合物に変換する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列
ここで、上記(E)の「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、DNAをプローブとして使用し、ストリンジェントな条件下、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、又はサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるDNAの塩基配列を意味する。ストリンジェントな条件としては、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法及びプラークハイブリダイゼーション法においては、コロニーあるいはプラーク由来のDNA又は該DNAの断片を固定化したフィルターを用いて、0.7mol/L〜1.0mol/Lの塩化ナトリウム水溶液の存在下、65℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2×SSC溶液(1×SSCの組成は、150mmol/L塩化ナトリウム水溶液、15mmol/Lクエン酸ナトリウム水溶液)を用い、65℃の条件下でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。
各ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.等に記載されている方法に準じて行うことができる。
また、上記(F)のホモログは、カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を害さない範囲において、配列番号1に記載の塩基配列に1又は数個の塩基が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を有するものである。「1又は数個の塩基」とは、具体的には60個以下、好ましくは30個以下、より好ましくは15個以下の塩基である。
工程(i)においては、補酵素NAD(P)+もしくはNAD(P)Hの存在下で行なうことが好ましく、この場合、上記補酵素を、通常、0.001mmol/L〜100mmol/L、好ましくは0.01mmol/L〜10mmol/Lの濃度になるように添加するのが好ましい。
上記補酵素を添加する場合には、反応系内で、NAD(P)Hから生成するNAD(P)+をNAD(P)Hへ再生させることが生産効率向上のため好ましい。再生方法としては、1)本発明の生物若しくは細胞自体のNAD(P)+からNAD(P)Hを生成する能力、即ち、NAD(P)+還元能を利用する方法、
2)NAD(P)+からNAD(P)Hを生成する能力を有する微生物やその処理物、あるいは、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素(リンゴ酸脱水素酵素等)等のNAD(P)Hの再生に利用可能な酵素(以下、「再生酵素」という)を一種類以上反応系内に添加する方法、
3)本発明の生物若しくは細胞を作製するに当たり、上記再生酵素の遺伝子を一種類以上、合わせて宿主生物若しくは細胞に導入する方法等が挙げられる。
上記1)の方法においては、反応系にグルコース、エタノール、2−プロパノール又はギ酸等を添加することが好ましい。
また、上記2)の方法においては、上記再生酵素を生産する能力を有する微生物、該微生物をアセトン処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的又は酵素的に破砕したもの等の微生物の処理物、該酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等の担体に固定化したもの等を用いてもよく、また市販の酵素を用いてもよい。
この場合、上記再生酵素の使用量としては、本発明のカルボニル基を立体選択的に還元しうる能力を有する酵素のカルボニル還元活性と比較して、酵素活性で通常0.01倍〜100倍、好ましくは0.5倍〜20倍程度となるよう添加する。
また、上記再生酵素の基質となる化合物、例えば、グルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコース、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、アルコール脱水素酵素を利用する場合のエタノール又はイソプロパノール等の添加も必要となるが、その添加量としては、反応原料である一般式(1A)で表される化合物に対して、通常0.1当量〜20当量、好ましくは1当量〜5当量である。
また、上記3)の方法においては、工程(i)に用いられる酵素をコードするDNAと共に、上記再生酵素類のDNAを染色体に組み込む方法、単一の発現ベクター中に両DNAを導入した後に宿主生物若しくは細胞を形質転換する方法、又は両DNAをそれぞれ別々の発現ベクターに導入した後に、宿主生物若しくは細胞を形質転換する方法等を用いることができる。両DNAをそれぞれ別々の発現ベクターに導入した後に宿主生物若しくは細胞を形質転換する方法の場合は、両発現ベクター同士の不和合性を考慮して発現ベクターを選択する。
単一の発現ベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター及びターミネーター等発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
水性媒体としては、水又は緩衝液(リン酸カリウム緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、トリス塩酸緩衝液等)が挙げられる。
有機溶媒としては、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、n−ヘキサン、n−ヘプタン、ジメチルスルホキシド、メタノール、エタノール、n−プロパノール、2−プロパノール等、一般式(1A)で表される化合物の溶解度が高いものを使用することができる。
工程(i)は、通常4℃〜70℃、好ましくは20℃〜60℃の反応温度で、通常pH3〜11、好ましくはpH4〜8で行われる。反応時間は、通常0.5時間〜48時間、好ましくは0.5時間〜24時間である。また、膜リアクター等を利用して行うことも可能である。
工程(i)で得られる一般式(2A)で表される化合物は、遠心分離やフィルトレーション等により菌体やポリペプチド等を分離した後に、適当なpHに調整し、ヘキサン、酢酸エチル、トルエン等の有機溶媒による抽出、カラムクロマトグラフィーによる精製、結晶化等を適宜組み合わせることにより精製することができる。
工程(ia)は、一般式(1A)において、−X1及び−X2が=Oである一般式(1a)で表される化合物に、カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を有する酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び/又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を作用させて還元し、一般式(1A)において、−X1が−OHで−X2が=Oである一般式(1b)で表される化合物、及び/又は−X1が=Oで−X2が−OHである一般式(1c)で表される化合物を得る工程である。
一般式(1a)で表される化合物の還元は、工程(i)と同様の方法を採用することができる。
工程(ib)は、工程(ia)で得られた一般式(1b)で表される化合物、及び/又は一般式(1c)で表される化合物に、上記カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を有する酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び/又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を作用させて還元し、一般式(2A)で表される化合物を得る工程である。
一般式(1b)で表される化合物、及び/又は一般式(1c)で表される化合物の還元は、工程(i)と同様の方法を採用することができる。
一般式(2A)においてRがn−プロピル基である化合物の結晶は、例えば、以下に示す粉末X線回折パターンを有する。
工程(ii)は、工程(i)で使用する一般式(1A)で表される化合物を製造する工程である。具体的には、式(3A)で表される化合物と一般式(4)で表される化合物を、塩基の存在下、縮合させる工程である。
塩基としては、水素化ナトリウム、水素化カリウム、水素化カルシウム等の金属水素化物、ナトリウムアミド等の金属アミド、ブチルリチウム、リチウムジイソプロピルアミド等の有機リチウム、tert−ブチルマグネシウムクロライド等のグリニャール試薬、ナトリウムエトキシド、ナトリウムtert−ブトキシド、カリウムtert−ブトキシド等のアルコキシドを用いることができ、特に、水素化ナトリウム、ナトリウムアミド、ナトリウムtert−ブトキシドが好ましい。塩基の使用量は、式(3A)で表される化合物に対して、通常1当量〜6当量、好ましくは、1.5当量〜6当量である。
反応は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒としては、反応が進行する限り、特に限定されないが、シクロヘキサン、n−ヘキサン、n−ヘプタン、トルエン等の炭化水素系の非極性溶媒、クロロベンゼン、ジクロロベンゼン等のハロゲン溶媒、メチルtert−ブチルエーテル、テトラヒドロフラン(THF)、シクロペンチルメチルエーテル(CPME)等のエーテル溶媒、N−メチル−2−ピロリドン、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド等の極性溶媒、さらにはこれら極性溶媒と非極性溶媒との混合物が好ましい。溶媒の使用量は、式(3A)で表される化合物1gに対して、通常5mL〜100mL、好ましくは、5mL〜30mLである。
反応温度は、通常−10℃〜200℃、好ましくは、−5℃〜40℃である。
反応時間は、通常0.1時間〜200時間、好ましくは、1時間〜24時間である。
工程(iia)は、式(3A)で表される化合物と一般式(4)においてR1AがR2Aである一般式(4a)で表される化合物を、塩基の存在下、縮合させて、一般式(5)で表される化合物を得る工程である。
塩基としては、水素化ナトリウム、水素化カリウム、水素化カルシウム等の金属水素化物、ナトリウムアミド等の金属アミド、ブチルリチウム、リチウムジイソプロピルアミド等の有機リチウム、tert−ブチルマグネシウムクロライド等のグリニャール試薬、ナトリウムエトキシド、ナトリウムtert−ブトキシド、カリウムtert−ブトキシド等のアルコキシドを用いることができ、特に、ナトリウムアミド、ナトリウムtert−ブトキシド、水素化ナトリウムが好ましい。塩基の使用量は、式(3A)で表される化合物に対して、通常1当量〜6当量、好ましくは、1.5当量〜6当量である。
反応は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、シクロヘキサン、n−ヘキサン、n−ヘプタン、トルエン等の炭化水素系の非極性溶媒、クロロベンゼン、ジクロロベンゼン等のハロゲン溶媒、メチルtert−ブチルエーテル、THF、CPME等のエーテル溶媒、N−メチル−2−ピロリドン、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド等の極性溶媒、さらにはこれら極性溶媒と非極性溶媒との混合物が好ましい。溶媒の使用量は、式(3A)で表される化合物1gに対して、通常5mL〜100mL、好ましくは、5mL〜30mLである。
反応温度は、通常0℃〜200℃、好ましくは、0℃〜40℃である。
反応時間は、通常0.1時間〜200時間、好ましくは、1時間〜24時間である。
一般式(5)で表される化合物と、R−OHで表されるアルコールを反応させて一般式(1a)で表される化合物を得る。
ここで、Rは、炭素数1〜8の1級アルキル基又は炭素数3〜6の2級アルキル基を表し、好ましくは炭素数1〜4の1級アルキル基又は炭素数3〜4の2級アルキル基を表す。Rとしては、メチル基、エチル基、n−プロピル基、イソプロピル基又はn−ブチル基が好ましく、n−プロピル基又はイソプロピル基がより好ましく、n−プロピル基が特に好ましい。
反応は、溶媒を用いて行うこともできる。溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸イソプロピル等のエステル溶媒、シクロヘキサン、n−ヘキサン、n−ヘプタン、トルエン等の非極性溶媒、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン溶媒、MTBE、THF、CPME等のエーテル溶媒、N−メチル−2−ピロリドン、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド等の極性溶媒、さらにはこれら極性溶媒と非極性溶媒との混合物が好ましい。また、R−OHで表されるアルコール自体を溶媒として用いてもよい。溶媒の使用量は、式(5)で表される化合物1gに対して、通常1mL〜100mL、好ましくは、1mL〜10mLである。
反応温度は、通常30℃〜150℃、好ましくは、40℃〜110℃である。
反応時間は、通常1時間〜48時間、好ましくは、2時間〜24時間である。
一般式(1a)においてRがn−プロピル基である化合物の結晶は、例えば、以下に示す粉末X線回折パターンを有する。
工程(iiia)は、一般式(2A)で表される化合物を塩基により加水分解した後、カルシウム化合物と反応させ、得られた生成物を単離することにより、式(6)で示されるロスバスタチンカルシウムを得る工程である。
塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等を用いることができ、特に、水酸化ナトリウムが好ましい。塩基の使用量は、一般式(2A)で表される化合物に対して、通常0.9当量〜2当量、好ましくは、1当量〜1.5当量である。
カルシウム化合物としては、塩化カルシウム、酢酸カルシウム等を用いることができ、特に、塩化カルシウムが好ましい。カルシウム化合物の使用量は、一般式(2A)で表される化合物に対して、通常0.4当量〜1.5当量、好ましくは、0.5当量〜1.2当量である。
反応は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸イソプロピル等のエステル溶媒、シクロヘキサン、n−ヘキサン、n−ヘプタン、トルエン等の非極性溶媒、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン溶媒、MTBE、THF、CPME等のエーテル溶媒、N−メチル−2−ピロリドン、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、水等の極性溶媒、さらにはこれら極性溶媒と非極性溶媒との混合物が好ましい。溶媒の使用量は、一般式(2A)で表される化合物1gに対して、通常1mL〜100mL、好ましくは、5mL〜30mLである。
反応温度は、通常−10℃〜50℃、好ましくは、0℃〜40℃である。
反応時間は、通常1時間〜48時間、好ましくは、2時間〜24時間である。
工程(iiib)は、一般式(2A)で表される化合物を、塩基により加水分解した後、酸で処理し、得られた式(8)で表される化合物をアミン化合物と反応させ、得られた一般式(9)で表される化合物を塩基により加水分解した後、カルシウム化合物と反応させることにより、式(6)で示されるロスバスタチンカルシウムを得る工程である。
具体的には、一般式(2A)で表される化合物を、塩基により加水分解して、一般式(7)で表される化合物とする。
塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等を用いることができ、特に、水酸化ナトリウムが好ましい。塩基の使用量は、一般式(2A)で表される化合物に対して、通常0.9当量〜2当量、好ましくは、1当量〜1.5当量である。
カルシウム化合物としては、塩化カルシウム、酢酸カルシウム等を用いることができ、特に、塩化カルシウムが好ましい。カルシウム化合物の使用量は、一般式(2A)で表される化合物に対して、通常0.4当量〜1.5当量、好ましくは、0.5当量〜1.2当量である。
反応は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、酢酸エチル、酢酸メチル等のエステル溶媒、シクロヘキサン、n−ヘキサン、n−ヘプタン等の非極性溶媒、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン溶媒、MTBE、THF、CPME等のエーテル溶媒、N−メチル−2−ピロリドン、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、水等の極性溶媒、さらにはこれら極性溶媒と非極性溶媒との混合物が好ましい。溶媒の使用量は、一般式(2A)で表される化合物1gに対して、通常1mL〜100mL、好ましくは、5mL〜30mLである。
反応温度は、通常−10℃〜50℃、好ましくは、0℃〜40℃である。
反応時間は、通常1時間〜48時間、好ましくは、2時間〜24時間である。
酸としては、塩酸、硫酸等を用いることができ、特に、塩酸が好ましい。酸の使用量は、酸性化できる量であれば特に限定されないが、加水分解時に使用した塩基に対して、通常1当量〜3当量、好ましくは、1当量〜1.5当量である。
反応温度は、通常−10℃〜50℃、好ましくは、0℃〜30℃である。
反応時間は、通常0.5時間〜5時間である。
アミン化合物としては、n−プロピルアミン、イソプロピルアミン、ジメチルアミン等を用いることができ、特に、n−プロピルアミン、ジメチルアミンが好ましい。アミン化合物の使用量は、式(8)で表される化合物に対して、通常1当量〜3当量、好ましくは、1当量〜2当量である。
反応は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸イソプロピル等のエステル溶媒、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン溶媒、MTBE、THF、CPME等のエーテル溶媒、N−メチル−2−ピロリドン、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル等の極性溶媒、さらにはこれら極性溶媒と非極性溶媒(トルエン、シクロヘキサン、メシチレン等)との混合物が好ましい。
反応温度は、通常−10℃〜50℃、好ましくは、0℃〜30℃である。
反応時間は、0.5時間〜5時間である。
反応は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、MTBE、THF、CPME等のエーテル溶媒、N−メチル−2−ピロリドン、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、水等の極性溶媒、さらにはこれら極性溶媒と非極性溶媒(トルエン、シクロヘキサン、メシチレン等)との混合物が好ましい。
反応温度は、通常−10℃〜50℃、好ましくは、0℃〜30℃である。
反応時間は、通常0.5時間〜10時間である。
カルシウム化合物としては、塩化カルシウム、酢酸カルシウム等を用いることができ、特に、塩化カルシウムが好ましい。カルシウム化合物の使用量は、一般式(7)で表される化合物に対して、通常0.5当量〜3当量、好ましくは、0.6当量〜2.8当量である。
反応は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、MTBE、THF、CPME等のエーテル溶媒、N−メチル−2−ピロリドン、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、水等の極性溶媒、さらにはこれら極性溶媒と非極性溶媒(トルエン、シクロヘキサン、メシチレン等)との混合物が好ましい。
反応温度は、通常0℃〜200℃、好ましくは、20℃〜110℃である。
反応時間は、通常0.01時間〜200時間、好ましくは、0.5時間〜24時間である。
工程(iiic)は、一般式(2A)で表される化合物を塩基により加水分解して一般式(7)で表される化合物とし、次いで一般式(7)で表される化合物を、酸触媒の存在下又は非存在下で分子内脱水縮合させ、得られた式(10)で表される化合物をカルシウム化合物と反応させることにより、式(6)で示されるロスバスタチンカルシウムを得る工程である。
一般式(2A)で表される化合物を塩基により加水分解して一般式(7)で表される化合物を得る工程は、工程(iiib)と同様の方法を採用することができる。
前記分子内脱水縮合は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、酢酸エチル、酢酸メチル等のエステル溶媒、シクロヘキサン、n−ヘキサン、n−ヘプタン、トルエン等の非極性溶媒、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン溶媒、MTBE、THF等のエーテル溶媒、N−メチル−2−ピロリドン、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド等の極性溶媒、さらにはこれら極性溶媒と非極性溶媒との混合物が好ましい。溶媒の使用量は、式(7)で表される化合物1gに対して、通常1mL〜100mL、好ましくは、5mL〜50mLである。
反応温度は、通常0℃〜200℃、好ましくは、20℃〜110℃である。
反応時間は、通常1時間〜72時間、好ましくは、1時間〜24時間である。
前記スタチン系化合物がピタバスタチン又はフルバスタチンである場合、本発明の精製方法に用いられるピタバスタチンカルシウム及びフルバスタチンナトリウムの製造方法に特に制限はないが、ピタバスタチンについては、例えば、特開平1−279866号公報、特開2002−300897号公報(US2004/0030139A1)等に記載の方法で、フルバスタチンについては、例えば、特開平3−47167号公報等に記載の方法で製造することができる。
本発明によれば、下記一般式(2):
上記一般式(2)で表される化合物を1ppm以上1000ppm以下含有するロスバスタチンカルシウムは、安定して保存することができる。
上記一般式(2)で表される化合物を1ppm以上1000ppm以下含有するピタバスタチンカルシウムは、安定して保存することができる。
上記一般式(2)で表される化合物を1ppm以上1000ppm以下含有するフルバスタチンナトリウムは、安定して保存することができる。
カラム:インタクト社製 Cadenza CD−C18(4.6mm×250mm、3μm)
移動相:A:0.1%ギ酸水溶液 B:0.1%ギ酸を含むメタノール
グラジエントプログラム(B濃度):60%(0分)→75%(12分)→100%(20分)
流速:0.8mL/分 カラム温度:40℃
検出波長:UV245nm
<DOXPの化学純度>
カラム:資生堂製 Capcell Pak C18 MG(4.6mm×75mm、3μm)
移動相:A:水/酢酸/酢酸アンモニウム=1000/100/7.7(mL/mL/g)B:THF
グラジエントプログラム(B濃度):38%(0分)→38%(17分)→80%(27分)
流速:1mL/分 カラム温度:40℃
検出波長:UV254nm
<DOLPの化学純度>
カラム:資生堂製 Capcell Pak C18 MGIII−H(2.0mm×100mm、3μm)
移動相:A:0.1mol/L酢酸アンモニウム/エタノール=3/2(mL/mL)B:0.1mol/L酢酸アンモニウム/エタノール=1/4(mL/mL)
グラジエントプログラム(B濃度):0%(0分)→0%(10分)→100%(25分)→100%(30分)
流速:0.3mL/分 カラム温度:40℃
検出波長:UV245nm
<PTV−Caの化学純度>
カラム:インタクト社製 Unison UK−C18(4.6mm×150mm、3μm)
移動相:A:0.1%ギ酸水溶液 B:アセトニトリル
グラジエントプログラム(B濃度):25%(0分)→35%(20分)→90%(30分)→90%(35分)
流速:1.0mL/分 カラム温度:40℃
検出波長:UV331nm
<RSV−Ca中のDENK分析>
カラム:インタクト社製 Cadenza CD−C18(4.6mm×250mm、3μm)
移動相:A:0.1%ギ酸水溶液 B:0.1%ギ酸を含むメタノール
グラジエントプログラム(B濃度):60%(0分)→75%(12分)→100%(20分)
流速:0.8mL/分 カラム温度:40℃
検出器:MS (極性:ポジティブ モード:SIM フラグメンター:200 ドライガス流量:5L/min ネブライザー:40psi ドライガス温度:250℃ ベポライザー温度:150℃)
(DHABの合成)
[工程1]
乾燥終了後、有機層をろ過して次の工程にて使用した。
[工程2]
残渣を薄膜蒸留装置(圧力:50Pa〜80Pa、熱媒温度:110℃)で精製した。得られた3,5−ジオキソ−ヘキサン酸tert−ブチルエステル(以下、「DHAB」と称する場合がある。)は893g(収率:69%)で、HPLC純度は92.1面積%であった。
1H−NMR(400MHz,CDCl3,互変異性体の混合物)δ1.43−1.49(9H,m),2.07(2.5H,s),2.25(0.5H,s),3.24(1.7H,s),3.46(0.3H,s),3.73(0.3H,s),5.61(0.7H,s)
(DOXPの製造)
別の反応釜に、窒素雰囲気下で、水素化ナトリウム8.28kg(純度61.9%,214mol)及びテトラヒドロフラン75Lを仕込み、内温が0℃〜5℃になるまで冷却した。そこに、4−(4−フルオロフェニル)−5−ホルミル−6−イソプロピル−2−[メチル(メチルスルホニル)アミノ]ピリミジン(以下、「ALD」と称する場合がある。)14.9kg(42.4mol)とメチルtert−ブチルエーテル150Lを仕込み、0℃〜5℃まで冷却した。得られたスラリーに、上述の方法で得られた反応液Aを、内温0℃〜5℃となるように制御しながら滴下した。滴下終了後、2時間かけて内温20℃〜25℃まで昇温し、20℃〜25℃で2時間撹拌した。HPLCで分析した結果、ALDからDOXB((E)−7−[4−(4−フルオロフェニル)−6−イソプロピル−2−[メチル(メチルスルホニル)アミノ]ピリミジン−5−イル]−3,5−ジオキソ−6−ヘプテン酸t−ブチルエステル)への転化率は99.3%であった。
反応終了後、内温が20℃以下になるまで冷却し、20℃以下を維持したまま水150Lを滴下した。滴下終了後、分液により水層を抜き出した。続いて2%水酸化ナトリウム水溶液75.0kg(NaOH 1.5kg,水73.5kg)、10%クエン酸水溶液75.0kg(クエン酸7.5kg,水67.5kg)、2%NaCl水溶液75.0kg(NaCl 1.5kg,水73.5kg)の順で有機層を洗浄した。得られた有機層をHPLCで定量分析した結果、収率83%でALDからDOXBが得られていることがわかった。
得られた有機層を、外温35℃で全量が30Lとなるまで減圧濃縮した。得られた残渣にn−プロパノール75Lを添加し、外温40℃で全量が30Lとなるまで減圧濃縮した。
その後、得られた残渣にn−プロパノール38Lを加え、内温97℃で8時間反応させた。得られた溶液を、HPLCにより分析した結果、DOXBからDOXPへの転化率は99%であった。
得られた溶液を、内温60℃で減圧濃縮を行ない、溶液量を45Lまで濃縮した。その後、内温45℃まで冷却し、同温度でDOXPの種晶を投入した。4時間かけて0℃〜5℃まで冷却し、固液分離によりDOXPの結晶を回収した。得られた結晶のHPLC純度は98.1面積%であった。
120L反応器に、得られた結晶及びメタノール50Lを仕込み、昇温して均一な溶液とした。結晶が全て溶解したことを確認した後、45℃に内温を調整し、DOXPの種晶を投入した。その後、4時間かけて0℃〜5℃まで冷却し、固液分離により結晶を回収した。得られた結晶を減圧乾燥してDOXPを得た。得られたDOXPのHPLC純度は99.0面積%であり、回収量は14.0kg(収率63%)であった。
[カルボニル還元酵素(OCR1)、グルコース−1−デヒドロゲナーゼ(以下、GDH)を共発現した組換え大腸菌JM109/pKV32OCR1−GDHの調製例]
オガタエア・ミヌタ 変種ノンファーメンタス(Ogataea minuta var. nonfermentans)NBRC(旧IFO)1473由来のOCR1(特許第4270918号、配列番号2)をコードする遺伝子配列(ocr1)を元に、ocr1遺伝子の全長を増幅させるためのプライマーocr1_F(配列番号3)とocr1_R(配列番号4)を設計、合成した。続いて、オガタエア・ミヌタ 変種ノンファーメンタス(Ogataea minuta var. nonfermentans)の染色体DNAを鋳型とし、常法に従ってPCRを行い、約0.8kbpのDNA断片を得た。
次に、バチルス・サチルス(Bacillus subtilis)由来の遺伝子(GeneBank Accession No. AL009126.3)がコードするグルコース−1−デヒドロゲナーゼにおいて96番目のアミノ酸残基のグルタミン酸をアラニンに置換したGDH(配列番号6)をコードする遺伝子配列(以下、gdh(配列番号5))に対し、gdhの遺伝子の全長を増幅させるためのプライマーgdh_F1(配列番号7)とgdh_R1(配列番号8)を設計、合成した。続いて、常法に従ってPCRを行い約0.8kbpのDNA断片を得た。
上記(1)で得られたocr1のDNA断片を制限酵素EcoRI、及びHindIIIにより消化し、MunI及びHindIIIにより消化した特開2005−34025号公報に記載のプラスミドpKV32にLigation−Convenience Kit(ニッポンジーン社製)を用いてtrcプロモーターの下流に導入し、pKV32OCR1を得た。
次に、上記(1)で得られたgdhのDNA断片を制限酵素EcoRI、及びXbaIにより消化し、MunI及びXbaIにより消化したプラスミドpKV32にLigation−Convenience Kit(ニッポンジーン社製)を用いてtrcプロモーターの下流に導入し、pKV32GDHを得た。
さらに、pKV32GDHを鋳型として、制限酵素サイトHindIIIを付加したプライマーgdh_F2(配列番号9)とgdh_R2(配列番号10)でPCRを行い、得られたフラグメントを制限酵素HindIIIで消化して、あらかじめ制限酵素HindIIIで消化したプラスミドpKV32OCR1の下流に挿入し、pKV32OCR1−GDHを得た。得られたプラスミドにおけるgdh遺伝子の向きはPCRにより確認した。
上記(2)で得られたプラスミドpKV32OCR1−GDHを用いて、大腸菌(Escherichia coli)JM109(タカラバイオ株式会社製)を常法に従い形質転換し、組換え大腸菌JM109/pKV32OCR1−GDHを得た。
1m3の反応槽に、イオン交換水200L、含水グルコース110.94kg、リン酸水素二カリウム2.13kg及びリン酸二水素カリウム4.25kgを仕込み、溶解させた。次に、上記で得られた組換え大腸菌JM109/pKV32OCR1−GDHの凍結菌体52.7kgと、イオン交換水3Lに溶解させたNADP+0.144kgを仕込み、懸濁させた。そこに、DMSO 96.0kgに溶解させたDOXP 10.0kg(19.2mol)を添加し、内温45℃〜52℃で、1mol/L水酸化ナトリウム水溶液を滴下してpHを6.0に保持しながら、6時間撹拌した。反応終了後、98%硫酸を用いてpH5.0に調整し、内温65℃で1時間撹拌した。得られたDOLPのHPLC純度は92.60面積%であった。
得られた反応液を遠心分離し、菌体と反応生成物からなる沈殿物を得た。得られた沈殿物を20%メタノール水溶液502Lに懸濁させ、遠心分離した。
上記で得られた沈殿物を5%硫酸ナトリウム水溶液105.3kgに懸濁した後、酢酸エチルによる抽出を3回繰り返し、得られた抽出液を混合して減圧濃縮した。得られた濃縮液を、4%硫酸ナトリウム水溶液104kgで洗浄後、分液した。得られた有機層を濾過後、再度、減圧濃縮した。得られたDOLP/酢酸エチル溶液は132.8kgであり、DOLPの含有量は7.0kg(回収率70%、HPLC純度は94.13面積%)であった。
上記の方法で得られたDOLPの酢酸エチル溶液(DOLP 6.7kg含有)を減圧濃縮した。得られた残渣に1−プロパノール51.5kgを添加後、再度、減圧濃縮した。その後、水25.6kgを添加し、温度を10℃まで冷却した。DOLP種晶を添加して結晶を析出させた後、水12.8kgを追加し、析出した結晶を固液分離により回収した。得られたDOLPの純度は98.80面積%であり、乾燥することなく次の結晶化を実施した。
上記で得られた湿結晶に、窒素雰囲気下でトルエン48.1kgを添加した。得られた混合物を45℃まで昇温した後、分液して水層を除去した。分液後、減圧濃縮を実施した。温度を40℃に調整した後、DOLP種晶を添加するとDOLPが析出した。温度を0℃まで冷却後、固液分離により結晶を回収した。結晶は予め5℃まで冷却したトルエン2.4kgにて洗浄した。得られたDOLPの純度は98.87面積%であり、乾燥することなく次の結晶化を実施した。
上記で得られた湿結晶に、窒素雰囲気下でトルエン31.7kgを添加した。得られた混合物を62℃まで昇温し、DOLPを溶解させた。溶液を40℃まで冷却したのち、DOLP種晶5.2gを添加し結晶化させた。その後、トルエン9kgを追加した。温度を0℃まで冷却後、固液分離により結晶を回収した。結晶は予め5℃まで冷却したトルエン2.2kgにて洗浄した。得られたDOLPの純度は99.58面積%であり、乾燥することなく次の結晶化を実施した。
上記の方法を2回繰り返し、得られた結晶を減圧乾燥して回収した。乾燥後のDOLPの重量は3.41kg(通算回収率48%)であり、純度は99.86面積%であった。
得られた結晶は2.14kg(収率75%)で、水分を2.9%含んでいた。HPLCで分析した結果、得られたRSV−Caの結晶の化学純度は99.93面積%、光学純度は100%e.e.であった。
得られたRSV−Caの結晶を分析した結果を以下に示す。
1H−NMR(400MHz,DMSO)δ1.12(3H,d,J=8.4Hz),1.23(1H,m),1.45(1H,m),1.93(1H,m),2.07(1H,m),3.37−3.30(4H,m),3.42(3H,s),3.70(1H,brs),4.13(1H,br s),4.99(1H,br s),5.45(1H,dd,J=5.2Hz,16.0Hz),5.75(1H,br s),6.43(1H,d,J=16.0Hz),7.20(2H,m),7.63(2H,m)
得られた結晶の重量は8.93g(収率89%)であり、水分を5.6%含んでいた。HPLCで分析した結果、得られたRSV−Caの結晶の化学純度は99.93面積%であった。
(RSV−Caの空気酸化)
HPLCで分析した結果、得られたRSV−Caの結晶の化学純度は99.47面積%であり、3−MOLAの含量は0.29面積%であった。
(DOLPの酸化)
得られた化合物を分析した結果を以下に示す。
1H−NMR(400MHz,CDCl3)δ0.95(3H,t,J=7.6Hz),1.30(6H,d,J=6.4Hz),1.64(2H,tq,J=6.8Hz,7.6Hz),2.54(2H,d,J=6.4Hz),2.75(2H,d,J=7.2Hz),3.36(1H,q,J=6.4Hz),3.52(3H,s),3.59(3H,s),4.08(2H,t,J=6.8Hz),4.49(1H,m),6.17(1H,d, J=16.4Hz),7.14(2H,m),7.59(2H,m),7.64(1H,d,J=16.4Hz)
(3−MOLAの分解)
得られた化合物を分析した結果を以下に示す。
1H−NMR(400MHz,CDCl3)δ1.30(6H,d,J=6.8),2.25(3H,s),3.38(1H,q,J=6.8Hz),3.52(3H,s),3.59(3H,s),6.16(1H,d, J=16.4Hz),7.14(2H,m),7.55(1H,d,J=16.4Hz),7.60(2H,m)
(KTNEの合成)
本合成例により、合成例4で得られた化合物が、KTNEであることを確認できた。
合成例1で得られたRSV−Caを保管後、後述の実施例1に用いる直前にHPLCで分析した結果、化学純度99.86面積%、3−MOLAの含有量0.04面積%であった。
(RSV−Caの精製)
得られた結晶は8.66g(収率87%)であった。HPLCで分析した結果、得られたRSV−Caの結晶の化学純度は99.92面積%、RSV−Ca中の3−MOLAの含有量は検出限界以下であった。
合成例1で得られたRSV−Caを保管後、後述の実施例2に用いる直前にHPLC分析した結果、化学純度は99.73面積%、3−MOLAの含有量は0.14面積%であった。
(RSV−Caの精製)
得られた結晶は8.40g(収率84%)であった。
また、HPLCで分析した結果、得られたRSV−Caの結晶の化学純度は99.93面積%、RSV−Ca中の3−MOLAの含有量は検出限界未満であった。
(RSV−Caの精製)
得られた結晶は8.93g(収率89%)であった。
また、HPLCで分析した結果、得られたRSV−Caの結晶の化学純度は99.86面積%、RSV−Ca中の3−MOLAの含有量は検出限界以下であった。
(PTV−Caの精製)
得られた結晶は0.77g(収率77%)であった。
また、HPLCで分析した結果、得られたピタバスタチンカルシウム(以下、「PTV−Ca」と称する場合がある。)の結晶の化学純度は99.89面積%、PTV−Ca中のPTV−3−MOLAの含有量は0.01面積%であった。
(RSV−Caの空気酸化)
各々のサンプルに含まれる、((3R),(6E))−7−[4−(4−フルオロフェニル)−6−イソプロピル−2−[メチル(メチルスルホニル)アミノ]ピリミジン−5−イル]−3−ヒドロキシ−5−オキソ−6−ヘプテン酸カルシウム(3−MOLA(カルシウム塩))の含有量と、RSV−Caの含有量をHPLCで分析した。
分析した結果を、図1に示す。81日目におけるRSV−Caの結晶の化学純度は、室温保存で99.63面積%、冷蔵保存で99.90面積%であり、3−MOLA−Caの含有量は、室温保存では0.31面積%、冷蔵保存では0.02面積%であった。
本出願は、日本で出願された特願2014−209481を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。
Claims (10)
- 下記一般式(1):
(式中、R1は、
で表される化合物を含む、ロスバスタチン、ピタバスタチン、フルバスタチン及びこれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも一種であるスタチン系化合物の精製方法であって、
(A)該一般式(1)で表される化合物を、下記一般式(2):
(式中、R1は、前記と同義である。)
で表される化合物に変換する工程
を有することを特徴とする、スタチン系化合物の精製方法。 - 前記工程(A)の後、(B)前記一般式(2)で表される化合物を除去する工程を有することを特徴とする、請求項1に記載のスタチン系化合物の精製方法。
- 前記工程(A)を、溶媒の存在下、加熱することにより行なうことを特徴とする、請求項1又は2に記載のスタチン系化合物の精製方法。
- 前記工程(A)において、前記スタチン系化合物が、前記一般式(1)で表される化合物を0.01面積%以上含有することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載のスタチン系化合物の精製方法。
- 前記工程(B)の後、(C)前記工程(B)で得られた化合物とカルシウム化合物とを反応させる工程を有することを特徴とする、請求項2〜4のいずれか一項に記載のスタチン系化合物の精製方法。
- 前記スタチン系化合物がロスバスタチン又はその塩であり、かつ、下記一般式(3):
(式中、R3は、アルカリ金属元素、アルカリ土類金属元素又は水素である。)
で表される化合物をさらに含むことを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項に記載のスタチン系化合物の精製方法。 - 下記一般式(2):
(式中、R1は、
である。)で表される化合物を1ppm以上1000ppm以下含有することを特徴とする、ロスバスタチンカルシウム含有組成物。 - 下記一般式(2):
(式中、R1は、
である。)で表される化合物を1ppm以上1000ppm以下含有することを特徴とする、ピタバスタチンカルシウム含有組成物。 - 下記一般式(2):
(式中、R1は、
- ロスバスタチン、ピタバスタチン及びこれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも一種であるスタチン系化合物の製造方法であって、該スタチン系化合物に含まれる下記一般式(2):
(式中、R1は、
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