WO2016056658A1 - スタチン系化合物の精製方法 - Google Patents

スタチン系化合物の精製方法 Download PDF

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statin
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鷹士 大谷
正樹 長濱
尚之 渡辺
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株式会社エーピーアイ コーポレーション
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    • C07D239/28—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms
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    • C07D239/42—One nitrogen atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a method for purifying statin compounds.
  • Statin compounds such as rosuvastatin, pitavastatin, fluvastatin and the like are inhibitors of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase (hereinafter sometimes referred to as “HMG-CoA reductase”) in vivo.
  • HMG-CoA reductase 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase
  • rosuvastatin is (E) -7- [4- (4-fluorophenyl) -6-isopropyl-2- [methyl (methylsulfonyl) amino] pyrimidin-5-yl]-(3R, 5S) -3
  • rosuvastatin is administered as its calcium salt, rosuvastatin calcium.
  • Rosuvastatin calcium is sold as CRESTOR®.
  • Patent Document 1 discloses rosuvastatin, its sodium salt and calcium salt, and methods for producing them.
  • rosuvastatin and its salt are (3R) -3-[(tert-butyldimethylsilyl) oxy] -5-oxo-6-triphenylphosphoranylidenehexanoic acid methyl ester and 4- (4 -Fluorophenyl) -6-isopropyl-2- (N-methyl-N-methanesulfonylamino) -5-pyrimidinecarboxaldehyde to introduce a side chain having one asymmetric center and then a 3-hydroxy group It can be obtained by deprotection of, asymmetric reduction of 5-oxo group, and hydrolysis.
  • Statin compounds are desired to be improved in purity, and the inventors of the present invention have proposed (E) -7- [4- (4-fluorophenyl) as a method for obtaining rosuvastatin calcium having higher purity than before.
  • DOXP -6-Isopropyl-2- [methyl (methylsulfonyl) amino] pyrimidin-5-yl] -3,5-dioxo-6-heptenoic acid n-prop
  • Patent Document 2 -2- [Methyl (methylsulfonyl) amino] pyrimidin-5-yl] -3,5-dihydroxy-6-heptenoic acid n-propyl ester
  • the inventors of the present invention examined not only the impurities of statin compounds, but also impurities generated or increased during storage after production, as well as by-products in the production process. However, the presence of a compound represented by the following general formula (1) was specified as one of the impurities generated or increased during storage after production. The inventors of the present invention considered that removal of the compound represented by the general formula (1) is important for recovering the statin compound and increasing its purity.
  • An object of the present invention is to provide a method for efficiently removing the compound represented by the general formula (1) contained in the statin compound to obtain a highly pure statin compound.
  • a method for purifying a statin compound comprising a compound represented by: (A) The compound represented by the general formula (1) is converted into the following general formula (2):
  • a method for purifying a statin compound comprising a step of converting to a compound represented by: [2] The method for purifying a statin compound according to [1], further comprising: (B) a step of removing the compound represented by the general formula (2) after the step (A); [3] The method for purifying a statin compound according to [1] or [2], wherein the step (A) is performed by heating in the presence of a solvent; [4] In the step (A), the statin compound contains 0.01% by area or more of the compound represented by the general formula (1).
  • the statin compound is at least one selected from the group consisting of rosuvastatin, pitavastatin, fluvastatin, and salts thereof, and R 1 in the general formulas (1) and (2) is:
  • statin compound is rosuvastatin or a salt thereof, and the following general formula (3):
  • R 3 is an alkali metal element, an alkaline earth metal element, or hydrogen.
  • Rosuvastatin calcium characterized in that it contains 1 ppm or more and 1000 ppm or less of a compound represented by: [9] The following general formula (2):
  • Fluvastatin sodium characterized by containing a compound represented by 1) to 1000 ppm inclusive; [11] The following general formula (2):
  • a compound represented by: [12] A method for producing a statin compound, the following general formula (2) contained in the statin compound:
  • the method for producing a statin compound comprising a step of measuring the abundance of the compound represented by the formula: Furthermore, the present invention relates to the following. -The method for purifying a statin compound according to [3], wherein the step (A) is performed under conditions of 30 ° C or higher and 100 ° C or lower; -In the step (B), the compound represented by the general formula (2) is removed by extraction with an organic solvent under basic conditions, [2] to [4] A method for purifying the statin compound according to any one of the above; The method for purifying a statin compound according to any one of [1] to [5], wherein the statin compound is dissolved in a solvent prior to the step (A).
  • the purity of the statin compound can be improved efficiently, and a high-purity statin compound can be obtained.
  • the rosuvastatin calcium (RSV-Ca) obtained in Synthesis Example 1 was stored at room temperature or refrigerated (4 ° C.), and the ((3R), ( 6E))-7- [4- (4-Fluorophenyl) -6-isopropyl-2- [methyl (methylsulfonyl) amino] pyrimidin-5-yl] -3-hydroxy-5-oxo-6-heptenoate 3 is a graph showing the results of analyzing the content of (3-MOLA-Ca) and the content of rosuvastatin calcium (RSV-Ca) by HPLC.
  • the “primary alkyl group having 1 to 8 carbon atoms” means methyl group, ethyl group, n-propyl group, n-butyl group, n-pentyl group, n-hexyl group, n-octyl group. Means.
  • the “primary alkyl group having 1 to 4 carbon atoms” means a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, or an n-butyl group.
  • the “secondary alkyl group having 3 to 6 carbon atoms” means isopropyl group, cyclopropyl group, sec-butyl group, 1-methylbutyl group, 1-methylheptyl group, 1-ethylpropyl group, 1 Means an ethylbutyl group;
  • the “secondary alkyl group having 3 to 4 carbon atoms” means an isopropyl group, a cyclopropyl group, or a sec-butyl group.
  • the “linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms” means a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an n-butyl group, an n-pentyl group, an n-hexyl group, It means n-octyl group, isopropyl group, cyclopropyl group, sec-butyl group, 1-methylbutyl group, 1-methylheptyl group, tert-butyl group, tert-amyl group.
  • the “branched alkyl group having 3 to 8 carbon atoms” means isopropyl group, cyclopropyl group, sec-butyl group, 1-methylbutyl group, 1-methylheptyl group, tert-butyl group, tert-butyl group. Means amyl group.
  • an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms means an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms among the above “linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms”.
  • the “group containing a nitrogen-containing heterocycle” is a group corresponding to a mother skeleton contained in a statin compound such as pitavastatin, rosuvastatin, fluvastatin and the like.
  • the “alkali metal element” means lithium, sodium, potassium, rubidium, cesium, or francium.
  • the alkali metal element is sodium or potassium.
  • “alkaline earth metal element” means calcium, strontium, barium, or radium.
  • the alkaline earth metal element is calcium or barium.
  • the “calcium compound” means a compound capable of converting a carboxylic acid into a calcium salt of a carboxylic acid, such as calcium chloride and calcium acetate.
  • the calcium compound is calcium chloride.
  • the “amine compound” means a compound capable of converting a carboxylic acid into an amine salt of a carboxylic acid, such as n-propylamine, isopropylamine, dimethylamine and the like.
  • the amine compound is n-propylamine or dimethylamine.
  • the compounds according to the present invention include compound salts, anhydrides, hydrates, solvates and the like.
  • an enzyme having an activity capable of stereoselectively reducing a carbonyl group means an enzyme having an activity of converting a carbonyl group in a carbonyl group-containing compound into an optically active alcohol by asymmetric reduction. Means. Whether or not it has an activity capable of stereoselectively reducing a carbonyl group is determined by measuring the activity of asymmetric reduction of the carbonyl group in the carbonyl group-containing compound to convert it into an optically active alcohol by a conventional assay method. This can be determined.
  • the enzyme activity can be confirmed.
  • the term “enzyme” in the present specification includes purified enzymes (including partially purified enzymes) and those immobilized using ordinary immobilization techniques, such as polyacrylamide, carrageenan gel and the like. Also included are those fixed in
  • microorganism or cell having the ability to produce an enzyme having an activity capable of stereoselectively reducing a carbonyl group (hereinafter sometimes referred to as “microorganism or cell of the present invention”).
  • an activity capable of stereoselectively reducing a carbonyl group there is no particular limitation, and it may be an organism or cell having the above-mentioned activity, or a microorganism to which the above-mentioned activity is imparted by breeding Or it may be a cell.
  • known methods such as gene recombination treatment (transformation) and mutation treatment can be employed.
  • microorganism or cell examples include those described in the host organism or host cell described below.
  • “microorganisms or cells having the ability to produce an enzyme having the above-mentioned activity” are not limited to living microorganisms or cells, and include those that are dead as living organisms but have enzyme activity. It is.
  • the microorganisms or cells of the present invention can be produced by the method described in International Publication No. 2003/078634.
  • the kind of organism as the “host organism” is not particularly limited, and Escherichia coli, Bacillus subtilis, Coryneform bacterium, Pseudomonas genus bacteria, Bacillus genus bacteria, Rhizobium genus bacteria, Lactobacillus genus bacteria, Succinobacillus genus Examples include prokaryotes such as bacteria, Anaerobiospirillum bacteria and Actinobacillus bacteria, fungi such as yeast and filamentous fungi, eukaryotes such as plants and animals. Among these, E. coli, yeast and coryneform bacteria are preferable, and E. coli is particularly preferable.
  • the type of cell as a “host cell” is not particularly limited, and animal cells, plant cells, insect cells, and the like can be used.
  • an “expression vector” is used to replicate and express a protein having a desired function in the host organism by introducing a polynucleotide encoding the protein having the desired function into the host organism.
  • the genetic factor used examples include, but are not limited to, plasmids, viruses, phages, cosmids and the like.
  • the expression vector is a plasmid.
  • the “transformant” means an organism or cell into which the expression vector has been introduced and can express a desired trait related to a protein having a desired function.
  • processed microorganism or cell refers to a product obtained by culturing a microorganism or cell and treating the microorganism or cell with 1) an organic solvent, 2) a product freeze-dried, 3) a carrier, etc. 4) Physically or enzymatically disrupted and containing a protein having a desired function.
  • a culture solution containing an enzyme obtained by culturing microorganisms or cells means 1) a culture solution of microorganisms or cells, and 2) a culture solution of microorganisms or cells treated with an organic solvent or the like.
  • Culture medium 3) A culture liquid in which the cell membrane of microorganisms or cells is physically or enzymatically destroyed.
  • statin compounds In the purification method of the present invention, a statin compound containing a compound represented by the following general formula (1) (hereinafter sometimes referred to as “3-MOLA”) can be purified.
  • the statin compound may be a compound itself, a salt form such as a carboxylic acid, an alkali metal salt, or an alkaline earth metal salt, or a mixture thereof.
  • R 1 is a group containing a nitrogen-containing heterocycle, and R 2 is an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, an alkali metal element, an alkaline earth metal element, or hydrogen.
  • R 1 is a group containing a nitrogen-containing heterocycle, and R 2 is an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, an alkali metal element, an alkaline earth metal element, or hydrogen.
  • the statin compound subject to the purification method of the present invention is preferably at least one selected from the group consisting of rosuvastatin, pitavastatin fluvastatin, and salts thereof, more preferably rosuvastatin pitavastatin, or salts thereof. Rosuvastatin or a salt thereof is particularly preferable.
  • the purification method of the present invention purifies a statin compound containing 0.01% by area or more of the compound represented by the general formula (1) as measured by HPLC (High Performance Liquid Chromatography).
  • HPLC High Performance Liquid Chromatography
  • the upper limit is not particularly limited as long as the effect of the present invention is obtained, but is usually 99% by area or less, preferably 50% by area or less, more preferably 25% by area or less, and particularly preferably 5% by area or less. Most preferably, it is 1 area% or less.
  • the statin compound contains 0.01 to 5 area% of the compound represented by the general formula (1).
  • R 1 has the same meaning as described above.
  • It has the process of converting into the compound (henceforth "KTNE") represented by these, It is characterized by the above-mentioned.
  • step (A) it is preferable to include a step (B) of removing the compound represented by the general formula (2).
  • step (C) a step of reacting the compound obtained in the step (B) with a calcium compound.
  • steps (A) to (C) of the purification method of the present invention will be described for each step.
  • Step (A) is a step of converting the compound represented by the general formula (1) into the compound represented by the general formula (2).
  • the compound represented by the general formula (1) is usually included in the statin compound, but when starting the step (A), the compound represented by the general formula (1) is added. Also good.
  • the compound represented by the general formula (1) is decarboxylated and converted into a compound represented by the general formula (2).
  • the statin compound may be in any form of a carboxylic acid, an alkali metal salt, an alkaline earth metal salt, or a mixture thereof. With the decarboxylation of the compound represented by the general formula (1), the statin compound may or may not change in form.
  • step (A) when the step (A) is performed under acidic or basic conditions as described later, it is converted into a salt form derived from the acid or base used depending on the type of acid or base used.
  • the statin compound is rosuvastatin and the step (A) is carried out in the presence of sodium hydroxide, usually (E) -7- [4- (4-fluorophenyl)- 6-Isopropyl-2- [methyl (methylsulfonyl) amino] pyrimidin-5-yl]-(3R, 5S) -3,5-hydroxy-6-heptenoic acid (hereinafter sometimes referred to as “DOLA”) Is converted to rosuvastatin sodium (hereinafter sometimes referred to as “RSV-Na”).
  • DOLA rosuvastatin sodium
  • reaction conditions in the step (A) are not particularly limited as long as the compound represented by the general formula (1) can be converted into the compound represented by the general formula (2). Preferred examples of the reaction conditions in the step (A) are described below.
  • the step (A) is preferably performed in the presence of a solvent.
  • ethers eg, methyl t-butyl ether, tetrahydrofuran (hereinafter sometimes referred to as “THF”), cyclopentyl methyl ether, etc.
  • acetates eg, methyl acetate, ethyl acetate, Isopropyl acetate, etc.
  • amides eg, N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, etc.
  • hydrocarbons eg, toluene, cyclohexane, etc.
  • alcohols eg, methanol, ethanol, isopropanol, etc.
  • water examples thereof include water, and among them, methyl t-butyl ether, THF, ethyl acetate, toluene, and water are preferable.
  • the reaction temperature is usually 30 ° C. or higher, preferably 40 ° C. or higher, and is usually 130 ° C. or lower, preferably 100 ° C. or lower. In order to advance reaction efficiently, it is preferable to heat as needed.
  • step (A) is performed under conditions of 30 ° C. or higher and 100 ° C. or lower.
  • limiting in particular in pH in a process (A) In order to accelerate
  • Examples of the acid that can be used here include hydrochloric acid, sulfuric acid, methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, and the like, among which hydrochloric acid and sulfuric acid are preferable.
  • the base When it is carried out under basic conditions, it is preferably carried out in the range of pH 10 to pH 14.
  • Examples of the base that can be used here include alkali metal hydroxides (eg, sodium hydroxide, potassium hydroxide, etc.), calcium hydroxide, calcium carbonate, triethylamine, diisopropylethylamine, and the like. Potassium hydroxide is preferred.
  • the reaction time is usually 1 hour or longer, preferably 2 hours or longer, and usually 48 hours or shorter, preferably 24 hours or shorter. In order to shorten the reaction time, it is preferable to stir the reaction solution as necessary in the step (A) as necessary.
  • Step (B) is represented by the general formula (2) from the mixture obtained in step (A) (in the case of having a step of dissolving the statin compound in a solvent prior to step (A)). This is a step of removing the compound. Here, the removal does not necessarily need to be completely removed, and most of the removal may be performed so that the purity of the obtained compound is improved.
  • the statin compound or a salt thereof remains.
  • the means and reaction conditions are not particularly limited. Preferred examples of the step (B) are described below.
  • the compound represented by the general formula (2) is preferably removed by extraction with an organic solvent under basic conditions.
  • examples of the organic solvent that can be used include ethers (eg, methyl t-butyl ether, cyclopentyl methyl ether (hereinafter sometimes referred to as “CPME”)), isopropyl acetate, ethyl acetate, methyl acetate, and the like.
  • Esters, and ketones such as toluene and methyl ethyl ketone.
  • the above ethers and esters are preferable, and methyl t-butyl ether, cyclopentyl methyl ether, methyl ethyl ketone, and ethyl acetate are particularly preferable.
  • the basic condition is preferably a condition in the range of pH 8 or more and pH 14 or less, and more preferably a condition in the range of pH 10 or more and pH 14 or less.
  • Step (C) is a step of reacting the compound obtained in the step (B), that is, the statin compound or a salt thereof with a calcium compound, and the compound obtained in the step (B) is converted into a calcium salt.
  • This is a process performed when converting to. Specifically, it is carried out to obtain rosuvastatin calcium or pitavastatin calcium when the statin compound is rosuvastatin or pitavastatin.
  • step (C) for example, when the statin compound is rosuvastatin, the compound (eg, RSV-Na) obtained in step (B) is usually referred to as rosuvastatin calcium (hereinafter referred to as “RSV-Ca”). Is converted to
  • the reaction conditions in the step (C) are not particularly limited as long as the compound obtained in the step (B) is reacted with the calcium compound to obtain a calcium salt, but the reaction conditions in the step (C) and the like are not limited. Preferred examples are described below.
  • As the calcium compound calcium chloride, calcium acetate and the like can be used, and calcium chloride is particularly preferable.
  • the amount of calcium compound to be used is generally 0.5 equivalents to 3 equivalents, preferably 0.6 equivalents to 2.8 equivalents, relative to the compound obtained in the step (B).
  • the reaction can be carried out using a solvent.
  • the solvent is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but ether solvents such as methyl tert-butyl ether (hereinafter sometimes referred to as “MTBE”), THF, CPME, N-methyl-2-pyrrolidone, N , N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, dimethyl sulfoxide, acetonitrile, water and the like, and mixtures of these polar solvents and nonpolar solvents (toluene, cyclohexane, mesitylene, etc.) are preferred.
  • the reaction temperature is usually 0 ° C. to 200 ° C., preferably 20 ° C. to 110 ° C.
  • the reaction time is usually 0.01 hours to 200 hours, preferably 0.5 hours to 24 hours.
  • statin compound is rosuvastatin
  • a compound represented by the following general formula (3) ((5S, 6E) -7- [4- (4-Fluorophenyl) -6-isopropyl-2- [methanesulfonyl (methyl) amino] -pyrimidin-5-yl] -5-hydroxy-3-oxohept-6-enoic acid or a salt thereof; hereinafter referred to as “5-MOLA May be referred to as “.”).
  • R 3 is an alkali metal element, an alkaline earth metal element, or hydrogen.
  • R 3 is preferably an alkali metal element or hydrogen.
  • lithium, sodium or potassium is preferable as the alkali metal element, and sodium or potassium is particularly preferable.
  • the reaction temperature in step (A) is usually 30 ° C. or higher, preferably 40 ° C. or higher, and is usually 140 ° C. or lower, preferably 130 ° C. or lower.
  • the compound represented by the general formula (1) is converted into the compound represented by the general formula (2), and 5-MOLA is further converted into (3E, 5E) -4-[(4-Fluorophenyl) -2- [methanesulfonyl (methyl) amino] -6-isopropylpyrimidin-5-yl)]-2-oxo-3,5-hexadiene (hereinafter “DENK”) In some cases.
  • the DENK produced here is 4- (4-fluorophenyl) -6-isopropyl-2- [methyl (methylsulfonyl) amino] -5-[(1E) -3-oxo-1- in step (B).
  • Butenyl)]-pyrimidine in general formula (2), R 1 is
  • KTNE KTNE
  • the method for producing rosuvastatin calcium used in the purification method of the present invention is not particularly limited, but is preferably produced by the following method.
  • w / v means weight / volume.
  • Step (i) of converting the compound represented by the general formula (1A) into the compound represented by the general formula (2A), and the general formula (2A) Step (iiia), (iiib) ((iiib-1) to (iiib-3)) or (iiic) ((iiic-1) to (iii) for converting the compound represented by formula (6) into rosuvastatin calcium iiic-2)).
  • R represents a primary alkyl group having 1 to 8 carbon atoms or a secondary alkyl group having 3 to 6 carbon atoms, preferably a primary alkyl group having 1 to 4 carbon atoms or a secondary alkyl group having 3 to 4 carbon atoms.
  • R is preferably a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group or an n-butyl group.
  • R is more preferably an n-propyl group or an isopropyl group, and particularly preferably an n-propyl group.
  • —X 1 and —X 2 each independently represent —OH or ⁇ O, and at least one of —X 1 or —X 2 is ⁇ O.
  • R 3A and R 4A each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, preferably a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.
  • the compound represented by the general formula (3A) and the general formula (4) The step (ii) of converting the compound represented by) into the compound represented by the general formula (1A) is included. Furthermore, as a preferred embodiment of the step (ii), the step (iia) of converting the compound represented by the formula (3A) and the compound represented by the general formula (4a) into a compound represented by the general formula (5), And a step (iib) of converting a compound represented by the general formula (5) into a compound represented by the general formula (1A).
  • step (i) the step of converting the compound represented by the general formula (1a) into a compound represented by the general formula (1b) and / or a compound represented by the general formula (1c).
  • step (ib) of converting the compound represented by (ia) and the compound represented by the general formula (1b) and / or the compound represented by the general formula (1c) into a compound represented by the general formula (2A) is also included in the present invention. Included in the manufacturing method.
  • R 1A represents a linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms.
  • R 2A represents a branched alkyl group having 3 to 8 carbon atoms, and is a group different from R.
  • R 2A is preferably an isopropyl group, an s-butyl group, a tert-butyl group or a tert-amyl group, and particularly preferably a tert-butyl group.
  • R, —X 1 and —X 2 are as defined above.
  • an enzyme having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 (hereinafter sometimes referred to as “OCR1”) or a homologue of the amino acid sequence can be used.
  • OCR1 an enzyme having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2
  • an enzyme containing any of the polypeptides shown in the following (A), (B) or (C), or a homologue thereof is mentioned.
  • Nonfermentans NBRC1473-derived carbonyl reductase (OCR1) SEQ ID NO: 2
  • polypeptide (B) consisting of an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, and represented by the general formula (1A)
  • Polypeptide (C) having the activity of converting the compound represented by the general formula (2A) into the compound represented by the general formula (2A)
  • amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 one or several amino acids are substituted, deleted or added
  • the homologue (B) is a protein having homology of at least 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more with the entire amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the homolog of (C) above has 1 or several amino acids deleted, added or substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 within the range that does not impair the activity of stereoselectively reducing the carbonyl group. Have an amino acid sequence.
  • “one or several amino acids” are specifically 20 or less, preferably 10 or less, more preferably 5 or less amino acids.
  • the gene encoding the enzyme is a DNA containing the nucleotide sequence shown in (D), (E) or (F) below, or a homologue thereof.
  • (D) a base sequence described in SEQ ID NO: 1
  • (E) a compound that hybridizes with a DNA comprising a complementary sequence of the base sequence described in SEQ ID NO: 1 under stringent conditions and represented by the general formula (1A)
  • 2A the general formula
  • the “base sequence that hybridizes under stringent conditions” in the above (E) means that a colony hybridization method is performed under stringent conditions using DNA as a probe. , DNA base sequence obtained by using plaque hybridization method, Southern blot hybridization method, or the like.
  • stringent conditions for example, in the colony hybridization method and the plaque hybridization method, 0.7 mol / L to 1.0 mol can be obtained using a colony or plaque-derived DNA or a filter on which the DNA fragment is immobilized. After hybridization at 65 ° C.
  • one or several bases are deleted, added or substituted in the base sequence described in SEQ ID NO: 1 within a range that does not impair the activity capable of stereoselectively reducing the carbonyl group.
  • the “one or several bases” are specifically 60 or less, preferably 30 or less, more preferably 15 or less bases.
  • the compound represented by the general formula (1A) serving as a reaction substrate usually has a substrate concentration of 0.01% w / v to 20% w / v, preferably 0.1% w / v. Used in the range of ⁇ 10% w / v.
  • the reaction substrate may be added all at once at the start of the reaction. Further, when there is substrate inhibition of the enzyme, it can be added continuously or intermittently from the viewpoint of reducing the influence and improving the accumulated concentration of the product.
  • the step (i) is preferably performed in the presence of coenzyme NAD (P) + or NAD (P) H.
  • the above coenzyme is usually 0.001 mmol / L to 100 mmol / L, preferably Is preferably added so as to have a concentration of 0.01 mmol / L to 10 mmol / L.
  • the coenzyme it is preferable to regenerate NAD (P) + produced from NAD (P) H to NAD (P) H in the reaction system in order to improve production efficiency.
  • a regeneration method 1) a method of using the ability of NAD (P) + to generate NAD (P) H from the NAD (P) + of the organism or cell itself of the present invention, that is, a method utilizing the NAD (P) + reducing ability 2) Microorganisms capable of producing NAD (P) H from NAD (P) + and their processed products, or glucose dehydrogenase, formate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, amino acid dehydrogenase, organic acid dehydration A method of adding one or more kinds of enzymes (hereinafter referred to as “regenerating enzymes”) that can be used for regeneration of NAD (P) H such as elementary enzymes (malate dehydrogenase, etc.) to the reaction system; 3) In preparing the organism or cell of the present invention, a method of introducing one or more genes of the regenerative enzyme into the host organism or cell in combination.
  • a processed product of a microorganism such as a microorganism capable of producing the regenerated enzyme, an acetone-treated microorganism, a freeze-dried one, or a physically or enzymatically crushed one
  • a product obtained by removing the enzyme fraction as a crude product or a purified product, a product obtained by immobilizing the enzyme fraction on a carrier such as polyacrylamide gel or carrageenan gel, or a commercially available enzyme may be used. Good.
  • the amount of the regenerative enzyme used is usually 0.01 to 100 times the enzyme activity compared to the carbonyl reduction activity of the enzyme having the ability to stereoselectively reduce the carbonyl group of the present invention. Preferably, it is added so as to be about 0.5 to 20 times. Addition of compounds that serve as substrates for the regenerative enzyme, such as glucose when using glucose dehydrogenase, formic acid when using formate dehydrogenase, ethanol or isopropanol when using alcohol dehydrogenase, etc. The amount added is usually 0.1 equivalent to 20 equivalents, preferably 1 equivalent to 5 equivalents, relative to the compound represented by the general formula (1A) as the reaction raw material.
  • compounds that serve as substrates for the regenerative enzyme such as glucose when using glucose dehydrogenase, formic acid when using formate dehydrogenase, ethanol or isopropanol when using alcohol dehydrogenase, etc.
  • the amount added is usually 0.1 equivalent to 20 equivalents, preferably 1 equivalent
  • a method of incorporating the DNA of the above-mentioned regenerative enzymes into the chromosome together with the DNA encoding the enzyme used in step (i), the host after introducing both DNAs into a single expression vector A method of transforming an organism or a cell, or a method of transforming a host organism or a cell after introducing both DNAs into separate expression vectors can be used.
  • the expression vector is selected in consideration of the incompatibility between the two expression vectors.
  • a method involving linking a region related to expression control such as a promoter and terminator to each gene, or an operon containing multiple cistrons such as lactose operon Is also possible.
  • step (i) the compound represented by the general formula (1A), the enzyme, an organism or cell having the ability to produce the enzyme, a processed product of the organism or cell, and / or the organism or cell are cultured.
  • the compound represented by general formula (1A) can be manufactured by the method mentioned later.
  • the aqueous medium include water or a buffer solution (potassium phosphate buffer solution, sodium citrate buffer solution, Tris-HCl buffer solution, etc.).
  • Step (i) is usually carried out at a reaction temperature of 4 ° C. to 70 ° C., preferably 20 ° C. to 60 ° C., usually pH 3 to 11, preferably pH 4 to 8.
  • the reaction time is usually 0.5 to 48 hours, preferably 0.5 to 24 hours.
  • step (i) is adjusted to an appropriate pH after separating cells, polypeptides and the like by centrifugation, filtration, etc., and hexane, ethyl acetate, Purification can be performed by appropriately combining extraction with an organic solvent such as toluene, purification by column chromatography, crystallization, and the like.
  • step (i) can be performed in two steps, ie, the step (ia) and the step (ib) as follows.
  • Step (ia) has an activity capable of stereoselectively reducing a carbonyl group to the compound represented by the general formula (1a) in which —X 1 and —X 2 are ⁇ O in the general formula (1A). Reduced by acting an enzyme, a microorganism or cell capable of producing the enzyme, a processed product of the microorganism or cell, and / or a culture solution containing the enzyme obtained by culturing the microorganism or cell, In the formula (1A), a compound represented by the general formula (1b) in which —X 1 is —OH and —X 2 is ⁇ O, and / or —X 1 is ⁇ O and —X 2 is —OH. In this step, a compound represented by the general formula (1c) is obtained. For the reduction of the compound represented by the general formula (1a), the same method as in step (i) can be employed.
  • R is as defined above.
  • the compound represented by the general formula (1b) and / or (1c) obtained in the step (ia) may be purified by, for example, crystallization before being subjected to the next step (ib).
  • An actionable enzyme, a microorganism or cell having the ability to produce the enzyme, a processed product of the microorganism or cell, and / or a culture solution containing the enzyme obtained by culturing the microorganism or cell This is a step of reducing to obtain a compound represented by the general formula (2A).
  • the same method as in step (i) can be employed.
  • R is as defined above.
  • R is an n-propyl group or an isopropyl group. Since the compound has high crystallinity, it can be obtained with high purity.
  • the crystal of the compound in which R is an n-propyl group in the general formula (2A) has, for example, the following powder X-ray diffraction pattern.
  • Step (ii) is a step of producing a compound represented by the general formula (1A) used in step (i). Specifically, it is a step of condensing the compound represented by the formula (3A) and the compound represented by the general formula (4) in the presence of a base.
  • Bases include metal hydrides such as sodium hydride, potassium hydride and calcium hydride, metal amides such as sodium amide, organolithium such as butyllithium and lithium diisopropylamide, Grignard reagents such as tert-butylmagnesium chloride, sodium Alkoxides such as ethoxide, sodium tert-butoxide and potassium tert-butoxide can be used, and sodium hydride, sodium amide and sodium tert-butoxide are particularly preferred.
  • metal hydrides such as sodium hydride, potassium hydride and calcium hydride
  • metal amides such as sodium amide
  • organolithium such as butyllithium and lithium diisopropylamide
  • Grignard reagents such as tert-butylmagnesium chloride
  • sodium Alkoxides such as ethoxide, sodium tert-butoxide and potassium tert-butoxide can be used, and sodium hydride
  • the amount of the base to be used is generally 1 equivalent to 6 equivalents, preferably 1.5 equivalents to 6 equivalents, relative to the compound represented by the formula (3A).
  • the reaction can be carried out using a solvent.
  • the solvent is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but is not limited to hydrocarbon nonpolar solvents such as cyclohexane, n-hexane, n-heptane, toluene, halogen solvents such as chlorobenzene and dichlorobenzene, methyl tert-butyl ether, Ether solvents such as tetrahydrofuran (THF), cyclopentyl methyl ether (CPME), polar solvents such as N-methyl-2-pyrrolidone, N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, dimethyl sulfoxide, and these polar solvents A mixture of and a nonpolar solvent is preferred.
  • the amount of the solvent to be used is generally 5 mL to 100 mL, preferably 5 mL to 30 mL, per 1 g of the compound represented by formula (3A).
  • the reaction temperature is usually ⁇ 10 ° C. to 200 ° C., preferably ⁇ 5 ° C. to 40 ° C.
  • the reaction time is usually 0.1 hour to 200 hours, preferably 1 hour to 24 hours.
  • the compound represented by Formula (3A) can be produced by the method described in Japanese Patent No. 26488897, and a commercially available product can also be used.
  • a commercially available compound can be used as the compound represented by the general formula (4).
  • R 1A is a group different from R
  • a compound represented by the general formula (1A) is obtained by reacting the compound obtained by the above condensation with an alcohol represented by R—OH.
  • the same method as in step (iib) can be adopted.
  • step (ii) it is particularly preferable to have the following steps (iia) and (iib).
  • Bases include metal hydrides such as sodium hydride, potassium hydride and calcium hydride, metal amides such as sodium amide, organolithium such as butyllithium and lithium diisopropylamide, Grignard reagents such as tert-butylmagnesium chloride, sodium Alkoxides such as ethoxide, sodium tert-butoxide, potassium tert-butoxide and the like can be used, and sodium amide, sodium tert-butoxide and sodium hydride are particularly preferable.
  • the amount of the base to be used is generally 1 equivalent to 6 equivalents, preferably 1.5 equivalents to 6 equivalents, relative to the compound represented by the formula (3A).
  • the reaction can be carried out using a solvent.
  • the solvent is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but non-polar hydrocarbon solvents such as cyclohexane, n-hexane, n-heptane and toluene, halogen solvents such as chlorobenzene and dichlorobenzene, methyl tert-butyl ether, THF Preferred are ether solvents such as CPME, polar solvents such as N-methyl-2-pyrrolidone, N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide and dimethyl sulfoxide, and a mixture of these polar and nonpolar solvents. .
  • the amount of the solvent to be used is generally 5 mL to 100 mL, preferably 5 mL to 30 mL, per 1 g of the compound represented by formula (3A).
  • the reaction temperature is usually 0 ° C. to 200 ° C., preferably 0 ° C. to 40 ° C.
  • the reaction time is usually 0.1 hour to 200 hours, preferably 1 hour to 24 hours.
  • the compound represented by the general formula (5) has high crystallinity, it can be obtained with high purity without complicated purification such as chromatography.
  • R represents a primary alkyl group having 1 to 8 carbon atoms or a secondary alkyl group having 3 to 6 carbon atoms, preferably a primary alkyl group having 1 to 4 carbon atoms or 2 having 3 to 4 carbon atoms. Represents a secondary alkyl group.
  • R is preferably a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group or an n-butyl group, more preferably an n-propyl group or an isopropyl group, and particularly preferably an n-propyl group.
  • R 2A , R, —X 1 and —X 2 are as defined above.
  • a compound represented by the following formula (1a) is particularly preferable.
  • R is as defined above.
  • the reaction can also be performed using a solvent.
  • the solvent is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but ester solvents such as ethyl acetate, methyl acetate, isopropyl acetate, nonpolar solvents such as cyclohexane, n-hexane, n-heptane, toluene, methylene chloride, chloroform, Halogen solvents such as carbon chloride, ether solvents such as MTBE, THF, CPME, polar solvents such as N-methyl-2-pyrrolidone, N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, dimethyl sulfoxide, and these polarities A mixture of a solvent and a nonpolar solvent is preferred.
  • alcohol itself represented by R—OH may be used as a solvent.
  • the amount of the solvent to be used is generally 1 mL to 100 mL, preferably 1 mL to 10 mL, relative to 1 g of the compound represented by formula (5).
  • the reaction temperature is usually 30 ° C. to 150 ° C., preferably 40 ° C. to 110 ° C.
  • the reaction time is usually 1 hour to 48 hours, preferably 2 hours to 24 hours.
  • the crystal of the compound in which R is an n-propyl group in the general formula (1a) has, for example, the following powder X-ray diffraction pattern.
  • R is as defined above.
  • sodium hydroxide, potassium hydroxide and the like can be used, and sodium hydroxide is particularly preferable.
  • the amount of the base to be used is generally 0.9 equivalents to 2 equivalents, preferably 1 equivalents to 1.5 equivalents, relative to the compound represented by the general formula (2A).
  • As the calcium compound calcium chloride, calcium acetate and the like can be used, and calcium chloride is particularly preferable.
  • the amount of the calcium compound to be used is generally 0.4 equivalent to 1.5 equivalents, preferably 0.5 equivalent to 1.2 equivalents, relative to the compound represented by the general formula (2A).
  • the reaction can be carried out using a solvent.
  • the solvent is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but ester solvents such as ethyl acetate, methyl acetate, isopropyl acetate, nonpolar solvents such as cyclohexane, n-hexane, n-heptane, toluene, methylene chloride, chloroform, Halogen solvents such as carbon chloride, ether solvents such as MTBE, THF, CPME, polar solvents such as N-methyl-2-pyrrolidone, N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, dimethyl sulfoxide, water, Mixtures of these polar and nonpolar solvents are preferred.
  • ester solvents such as ethyl acetate, methyl acetate, isopropyl acetate
  • nonpolar solvents such as cyclohexane, n-hexane, n-heptane, toluene, methylene chloride,
  • the amount of the solvent to be used is generally 1 mL to 100 mL, preferably 5 mL to 30 mL, per 1 g of the compound represented by the general formula (2A).
  • the reaction temperature is usually ⁇ 10 ° C. to 50 ° C., preferably 0 ° C. to 40 ° C.
  • the reaction time is usually 1 hour to 48 hours, preferably 2 hours to 24 hours.
  • This is a step of obtaining rosuvastatin calcium represented by the formula (6) by hydrolyzing the compound represented by the general formula (9) with a base and then reacting with a calcium compound.
  • the compound represented by the general formula (2A) is hydrolyzed with a base to obtain a compound represented by the general formula (7).
  • R is as defined above.
  • X represents sodium or potassium.
  • sodium hydroxide, potassium hydroxide and the like can be used, and sodium hydroxide is particularly preferable.
  • the amount of the base to be used is generally 0.9 equivalents to 2 equivalents, preferably 1 equivalents to 1.5 equivalents, relative to the compound represented by the general formula (2A).
  • As the calcium compound calcium chloride, calcium acetate and the like can be used, and calcium chloride is particularly preferable.
  • the amount of the calcium compound to be used is generally 0.4 equivalent to 1.5 equivalents, preferably 0.5 equivalent to 1.2 equivalents, relative to the compound represented by the general formula (2A).
  • the reaction can be carried out using a solvent.
  • the solvent is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but ester solvents such as ethyl acetate and methyl acetate, nonpolar solvents such as cyclohexane, n-hexane and n-heptane, halogens such as methylene chloride, chloroform and carbon tetrachloride. Solvents, ether solvents such as MTBE, THF, CPME, polar solvents such as N-methyl-2-pyrrolidone, N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, dimethyl sulfoxide, water, and non-polar solvents Mixtures with polar solvents are preferred.
  • ester solvents such as ethyl acetate and methyl acetate
  • nonpolar solvents such as cyclohexane, n-hexane and n-heptane
  • halogens such as methylene chloride, chloroform and carbon tetrachloride
  • the amount of the solvent to be used is generally 1 mL to 100 mL, preferably 5 mL to 30 mL, per 1 g of the compound represented by the general formula (2A).
  • the reaction temperature is usually ⁇ 10 ° C. to 50 ° C., preferably 0 ° C. to 40 ° C.
  • the reaction time is usually 1 hour to 48 hours, preferably 2 hours to 24 hours.
  • X is synonymous with the said definition.
  • As the acid hydrochloric acid, sulfuric acid and the like can be used, and hydrochloric acid is particularly preferable.
  • the amount of acid used is not particularly limited as long as it can be acidified, but is usually 1 equivalent to 3 equivalents, preferably 1 equivalent to 1.5 equivalents, relative to the base used during hydrolysis.
  • the reaction temperature is usually ⁇ 10 ° C. to 50 ° C., preferably 0 ° C. to 30 ° C.
  • the reaction time is usually 0.5 hours to 5 hours.
  • an amine compound is added to the compound represented by the formula (8) to obtain an amine salt represented by the formula (9).
  • an amine salt with high crystallinity it is possible to improve the purity of rosuvastatin calcium which is the target product.
  • R 3A and R 4A have the same definitions as above.
  • the amine compound n-propylamine, isopropylamine, dimethylamine and the like can be used, and n-propylamine and dimethylamine are particularly preferable.
  • the amount of the amine compound to be used is generally 1 equivalent to 3 equivalents, preferably 1 equivalent to 2 equivalents, relative to the compound represented by formula (8).
  • the reaction can be carried out using a solvent.
  • the solvent is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but ester solvents such as ethyl acetate, methyl acetate and isopropyl acetate, halogen solvents such as methylene chloride, chloroform and carbon tetrachloride, ether solvents such as MTBE, THF and CPME, Polar solvents such as N-methyl-2-pyrrolidone, N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, dimethyl sulfoxide, acetonitrile, etc., and these polar solvents and nonpolar solvents (toluene, cyclohexane, mesitylene, etc.) Mixtures are preferred.
  • the reaction temperature is usually ⁇ 10 ° C. to 50 ° C., preferably 0 ° C. to 30 ° C.
  • the reaction time is 0.5 to 5 hours.
  • the compound represented by the general formula (9) is an n-propylamine salt or a dimethylamine salt because it has high crystallinity and can be obtained with high purity.
  • the n-propylamine salt of heptenoic acid has, for example, the following powder X-ray diffraction pattern.
  • the dimethylamine salt of -6-heptenoic acid has, for example, the following powder X-ray diffraction pattern.
  • the amine salt represented by the general formula (9) is subjected to salt exchange with a base to obtain a compound represented by the general formula (7).
  • R 3A , R 4A and X are as defined above.
  • sodium hydroxide, potassium hydroxide and the like can be used, and sodium hydroxide is particularly preferable.
  • the amount of the base to be used is generally 1 equivalent to 3 equivalents, preferably 1 equivalent to 2 equivalents, relative to the compound represented by the general formula (9).
  • the reaction can be carried out using a solvent.
  • the solvent is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but ether solvents such as MTBE, THF, CPME, N-methyl-2-pyrrolidone, N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, dimethyl sulfoxide, acetonitrile
  • a polar solvent such as water, and a mixture of these polar solvent and nonpolar solvent (toluene, cyclohexane, mesitylene, etc.) are preferable.
  • the reaction temperature is usually ⁇ 10 ° C. to 50 ° C., preferably 0 ° C. to 30 ° C.
  • the reaction time is usually 0.5 hours to 10 hours.
  • rosuvastatin calcium represented by the formula (6) is obtained by reacting the compound represented by the general formula (7) with a calcium compound.
  • X is synonymous with the said definition.
  • the calcium compound calcium chloride, calcium acetate and the like can be used, and calcium chloride is particularly preferable.
  • the amount of the calcium compound to be used is generally 0.5 equivalents to 3 equivalents, preferably 0.6 equivalents to 2.8 equivalents, relative to the compound represented by the general formula (7).
  • the reaction can be carried out using a solvent.
  • the solvent is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but ether solvents such as MTBE, THF, CPME, N-methyl-2-pyrrolidone, N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, dimethyl sulfoxide, acetonitrile
  • a polar solvent such as water, and a mixture of these polar solvent and nonpolar solvent (toluene, cyclohexane, mesitylene, etc.) are preferable.
  • the reaction temperature is usually 0 ° C. to 200 ° C., preferably 20 ° C. to 110 ° C.
  • the reaction time is usually 0.01 hours to 200 hours, preferably 0.5 hours to 24 hours.
  • R and X are as defined above.
  • the step of hydrolyzing the compound represented by the general formula (2A) with a base to obtain the compound represented by the general formula (7) can employ the same method as in the step (iiib).
  • p-toluene is used as the acid catalyst.
  • Sulfonic acid, pyridinium p-toluenesulfonate, sulfuric acid, hydrochloric acid and the like can be used, and hydrochloric acid and p-toluenesulfonic acid are particularly preferable.
  • the amount of the acid catalyst to be used is generally 0.001 equivalents to 0.5 equivalents, preferably 0.01 equivalents to 0.1 equivalents, relative to the compound represented by the formula (7).
  • the intramolecular dehydration condensation can be performed using a solvent.
  • the solvent is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but ester solvents such as ethyl acetate and methyl acetate, nonpolar solvents such as cyclohexane, n-hexane, n-heptane, and toluene, methylene chloride, chloroform, carbon tetrachloride, etc.
  • Halogen solvents ether solvents such as MTBE, THF, polar solvents such as N-methyl-2-pyrrolidone, N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, dimethyl sulfoxide, and these polar and nonpolar solvents A mixture with is preferred.
  • the amount of the solvent to be used is generally 1 mL to 100 mL, preferably 5 mL to 50 mL, per 1 g of the compound represented by formula (7).
  • the reaction temperature is usually 0 ° C. to 200 ° C., preferably 20 ° C. to 110 ° C.
  • the reaction time is usually 1 hour to 72 hours, preferably 1 hour to 24 hours.
  • the step of obtaining rosuvastatin calcium represented by the formula (6) by reacting the compound represented by the formula (10) with a calcium compound can employ the same method as in the step (iiib).
  • the powder X-ray diffraction spectrum can be measured according to a known method.
  • a sample can be filled on a glass sample plate, and the sample can be measured by irradiating the sample with X-rays having a wavelength of 1.5406 angstroms generated from a ceramic X-ray tube Cu operated at 45 kV and 40 mA. Since the 2 ⁇ value of the powder X-ray diffraction spectrum may vary within an error range of ⁇ 0.2 °, for example, depending on the measuring instrument or sample, the 2 ⁇ value in the present invention should not be interpreted as an absolute value. Absent.
  • the method for producing pitavastatin calcium and fluvastatin sodium used in the purification method of the present invention is not particularly limited, but for pitavastatin, for example, JP-A-1-279866 Fluvastatin can be produced by the method described in JP-A No. 2002-300897 (US2004 / 0030139A1) and the like, for example, by the method described in JP-A-3-47167.
  • the rosuvastatin calcium containing the compound represented by) is preferably 1000 ppm or less, more preferably 500 ppm or less, and even more preferably 100 ppm or less.
  • the content of the compound represented by the general formula (2) is preferably 1 ppm or more. Rosuvastatin calcium containing 1 ppm or more and 1000 ppm or less of the compound represented by the general formula (2) can be stably stored.
  • Pitavastatin calcium containing the compound represented by (1) is preferably 1000 ppm or less, more preferably 500 ppm or less, and even more preferably 100 ppm or less.
  • the content of the compound represented by the general formula (2) is preferably 1 ppm or more.
  • Pitavastatin calcium containing 1 ppm or more and 1000 ppm or less of the compound represented by the general formula (2) can be stably stored.
  • the fluvastatin sodium containing the compound represented by) is preferably 1000 ppm or less, more preferably 500 ppm or less, and even more preferably 100 ppm or less.
  • the content of the compound represented by the general formula (2) is preferably 1 ppm or more. Fluvastatin sodium containing 1 ppm or more and 1000 ppm or less of the compound represented by the general formula (2) can be stably stored.
  • statin compounds When the abundance of these compounds is measured, the quality of statin compounds can be evaluated. According to the present invention, a method for producing a statin compound having a step of measuring the abundance of these compounds can also be provided.
  • the organic layer obtained in the previous step was charged into a 10 L flask, and 555.4 g (7.48 mol) of tert-butanol was added. The mixture was heated to an internal temperature of 60 ° C. After stirring for 7 hours, the reaction solution was cooled to room temperature. After adding 1325.8 g of 7% aqueous sodium hydrogen carbonate solution to the reaction solution, the reaction mixture was filtered. Thereafter, the organic layer was separated, and the obtained organic layer was washed with water. The organic layer was concentrated at 60 ° C. until no organic solvent was distilled off. The residue was purified with a thin film distillation apparatus (pressure: 50 Pa to 80 Pa, heating medium temperature: 110 ° C.).
  • DHAB 3,5-dioxo-hexanoic acid tert-butyl ester
  • reaction solution A A solution was prepared by adding 75 L of tetrahydrofuran to 20.5 kg (103 mol) of DHAB synthesized by the method described in Reference Example 1 in a reaction kettle under a nitrogen atmosphere. The resulting solution was added dropwise to a tetrahydrofuran solution of sodium hydride over 5 hours and stirred at 0 ° C. to 5 ° C. for 1 hour (hereinafter referred to as “reaction solution A”). In a nitrogen atmosphere, another reaction kettle was charged with 8.28 kg of sodium hydride (purity 61.9%, 214 mol) and 75 L of tetrahydrofuran and cooled to an internal temperature of 0 ° C. to 5 ° C.
  • the HPLC purity of the obtained crystal was 98.1 area%.
  • the obtained crystal and 50 L of methanol were charged into a 120 L reactor, and the temperature was raised to obtain a uniform solution. After confirming that all the crystals were dissolved, the internal temperature was adjusted to 45 ° C. and DOXP seed crystals were added. Thereafter, it was cooled to 0 ° C. to 5 ° C. over 4 hours, and the crystals were recovered by solid-liquid separation. The obtained crystal was dried under reduced pressure to obtain DOXP.
  • the HPLC purity of the obtained DOXP was 99.0 area%, and the recovered amount was 14.0 kg (yield 63%).
  • GDH in which glutamic acid at the 96th amino acid residue is substituted with alanine in glucose-1-dehydrogenase encoded by a gene derived from Bacillus subtilis (GeneBank Accession No. AL009126.3) (SEQ ID NO: 6)
  • Primers gdh_F1 (SEQ ID NO: 7) and gdh_R1 (SEQ ID NO: 8) for amplifying the full length of the gdh gene were designed and synthesized with respect to the gene sequence coding for (hereinafter referred to as gdh (SEQ ID NO: 5)).
  • PCR was performed according to a conventional method to obtain a DNA fragment of about 0.8 kbp.
  • pKV32GDH was obtained. Furthermore, using pKV32GDH as a template, PCR was performed with primers gdh_F2 (SEQ ID NO: 9) and gdh_R2 (SEQ ID NO: 10) to which the restriction enzyme site HindIII was added, and the resulting fragment was digested with the restriction enzyme HindIII in advance.
  • gdh_F2 SEQ ID NO: 9
  • gdh_R2 SEQ ID NO: 10
  • HindIII restriction enzyme site HindIII
  • the obtained reaction solution was centrifuged to obtain a precipitate composed of bacterial cells and reaction products.
  • the resulting precipitate was suspended in 502 L of a 20% aqueous methanol solution and centrifuged.
  • DOLP crystallization The ethyl acetate solution (containing 6.7 kg of DOLP) of DOLP obtained by the above method was concentrated under reduced pressure. 11.5-propanol (51.5 kg) was added to the resulting residue, and the mixture was again concentrated under reduced pressure. Thereafter, 25.6 kg of water was added and the temperature was cooled to 10 ° C. After adding DOLP seed crystals to precipitate crystals, 12.8 kg of water was added, and the precipitated crystals were recovered by solid-liquid separation. The purity of the obtained DOLP was 98.80 area%, and the next crystallization was carried out without drying. To the wet crystals obtained above, 48.1 kg of toluene was added under a nitrogen atmosphere.
  • DOLP seed crystals After cooling the solution to 40 ° C., 5.2 g of DOLP seed crystals were added for crystallization. Thereafter, 9 kg of toluene was added. After cooling the temperature to 0 ° C., crystals were recovered by solid-liquid separation. The crystals were washed with 2.2 kg of toluene that had been cooled to 5 ° C. in advance. The purity of the obtained DOLP was 99.58 area%, and the next crystallization was performed without drying. The above method was repeated twice, and the resulting crystals were collected by drying under reduced pressure. The weight of DOLP after drying was 3.41 kg (total recovery rate 48%), and the purity was 99.86 area%.
  • the reaction vessel was charged with 10.0 g (20.0 mmol) of RSV-Ca obtained in Synthesis Example 1, 40.0 g of purified water, and 42.8 g of methyl t-butyl ether. After stirring was started, the internal temperature was 5 ° C to 10 ° C. Prepared. To the obtained mixture, 10.8 g (21.6 mmol) of a 2 mol / L hydrochloric acid aqueous solution was added dropwise over 10 minutes, followed by stirring for 4 hours. 40 g of purified water was added to the organic layer obtained by liquid separation, and 11.0 g (20.4 mmol) of a 2 mol / L aqueous sodium hydroxide solution was added dropwise over 15 minutes. The internal temperature was raised to 45 ° C.
  • the activated carbon was filtered off and the internal temperature was cooled to 25 ° C., and then 23.0 g (21.8 mmol) of a 0.17 mol / L calcium acetate aqueous solution was added dropwise over 30 minutes. Thereafter, the mixture was stirred at 25 ° C. for 1 hour, cooled to 0 ° C. to 5 ° C. at a rate of ⁇ 10 ° C./hour, then aged at 0 ° C. to 5 ° C. for 1 hour, and the precipitated crystals were collected by filtration. The recovered crystals were dried at a temperature of 50 ° C. under reduced pressure. The obtained crystal was 8.40 g (yield 84%). As a result of analysis by HPLC, the chemical purity of the obtained RSV-Ca crystals was 99.93 area%, and the content of 3-MOLA in RSV-Ca was less than the detection limit.
  • the aqueous layer obtained by liquid separation was heated to 49 ° C. and stirred for 6.5 hours.
  • the resulting solution was cooled until the internal temperature reached 25 ° C., 42.8 g of methyl t-butyl ether was added and stirred for 15 minutes, and then the organic layer was separated and removed.
  • 42.8 g of methyl t-butyl ether was added again, and the mixture was stirred for 15 minutes and separated.
  • the obtained aqueous layer was concentrated, and the pH of the aqueous layer was adjusted to 7.5 using 0.2 mol / L acetic acid.
  • the obtained aqueous layer was concentrated, adjusted to a total volume of 15.0 mL using purified water, and 23.0 g (21.8 mmol) of a 0.17 mol / L calcium acetate aqueous solution was added at room temperature over 5 minutes. And dripped. Thereafter, the mixture was stirred at room temperature for 1 hour, cooled to 0 ° C. to 5 ° C. at a rate of ⁇ 10 ° C./hour, then aged at 0 ° C. to 5 ° C. for 1 hour, and the precipitated crystals were collected by filtration. The collected crystals were dried at a temperature of 45 ° C. under reduced pressure. The obtained crystal was 0.77 g (yield 77%).
  • PTV-Ca pitavastatin calcium
  • the analysis results are shown in FIG.
  • the chemical purity of RSV-Ca crystals on the 81st day was 99.63 area% when stored at room temperature and 99.90 area% when stored refrigerated, and the content of 3-MOLA-Ca was 0.31 when stored at room temperature.
  • the area% was 0.02 area% in refrigerated storage.
  • the purity of a statin compound can be improved efficiently, and a high-purity statin compound can be obtained.
  • This application is based on Japanese Patent Application No. 2014-209481 filed in Japan, the contents of which are incorporated in full herein.

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Abstract

　スタチン系化合物の純度を、効率よく向上させることができる精製方法を提供すること。下記一般式（１）：（式中、Ｒ１は、窒素含有複素環を含む基であり、Ｒ２は、炭素数１～４のアルキル基、アルカリ金属元素、アルカリ土類金属元素、または水素である。） で表される化合物を含む、スタチン系化合物の精製方法であって、 （Ａ）該一般式（１）で表される化合物を、下記一般式（２）：（式中、Ｒ１は、前記と同義である。） で表される化合物に変換する工程 を有することを特徴とする、スタチン系化合物の精製方法。

Description

スタチン系化合物の精製方法
　本発明は、スタチン系化合物の精製方法に関する。
　ロスバスタチン、ピタバスタチン、フルバスタチン等のスタチン系化合物は、生体内において、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－コエンザイムＡレダクターゼ（以下、「ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ」と称する場合がある。）の阻害剤として働き、例えば、高脂血症の治療に有用な化合物である。
　例えば、ロスバスタチンは、（Ｅ）－７－［４－（４－フルオロフェニル）－６－イソプロピル－２－［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン－５－イル］－（３Ｒ，５Ｓ）－３，５－ヒドロキシ－６－ヘプテン酸の一般名であり、そのカルシウム塩は以下の化学式で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　治療において、ロスバスタチンは、そのカルシウム塩であるロスバスタチンカルシウムとして投与される。ロスバスタチンカルシウムは、ＣＲＥＳＴＯＲ（登録商標）として販売されている。
　例えば、特許文献１に、ロスバスタチン、そのナトリウム塩とカルシウム塩、及びこれらの製造方法が開示されている。特許文献１によれば、ロスバスタチン及びその塩は、（３Ｒ）－３－［（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ］－５－オキソ－６－トリフェニルホスホラニリデンヘキサン酸メチルと、４－（４－フルオロフェニル）－６－イソプロピル－２－（Ｎ－メチル－Ｎ－メタンスルホニルアミノ）－５－ピリミジンカルボキシアルデヒドとを縮合させて不斉中心を一個有する側鎖を導入し、次いで３－ヒドロキシ基の脱保護、５－オキソ基の不斉還元、及び加水分解を行なうことによって得られる。
　スタチン系化合物は、純度の向上が望まれており、本発明の発明者らは、従来よりも高純度のロスバスタチンカルシウムが得られる方法として、（Ｅ）－７－[４－（４－フルオロフェニル）－６－イソプロピル－２－［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン－５－イル]－３，５－ジオキソ－６－ヘプテン酸ｎ－プロピルエステル（以下、「ＤＯＸＰ」と称する場合がある。）に、カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を有する酵素等を作用させて（（３Ｒ），（５Ｓ），（６Ｅ））－７－[４－（４－フルオロフェニル）－６－イソプロピル－２－［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン－５－イル]－３，５－ジヒドロキシ－６－ヘプテン酸ｎ－プロピルエステル（以下、「ＤＯＬＰ」と称する場合がある。）を得る工程を有するロスバスタチンカルシウムの製造方法について発明し、既に特許出願を行なっている（特許文献２）。
特許第２６４８８９７号公報 国際公開第２０１５／１１９２６１号
　本発明の発明者らは、スタチン系化合物の不純物には、製造工程において副生するものだけではなく、製造後、保管中に生成又は増加する不純物もあるということに着目して検討を行なったところ、製造後、保管中に生成又は増加する不純物の一つとして、下記一般式（１）で表される化合物の存在を特定した。本発明の発明者らは、スタチン系化合物を回収し、かつ、その純度を上げるためには、該一般式（１）で表される化合物の除去が重要であると考えた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　しかしながら、スタチン系化合物から、前記一般式（１）で表される化合物を除去するにあたっては、スタチン系化合物が有機溶媒や水に溶解し難い性質を有するため、再結晶等の通常用いる精製方法では除去することは難しい。
　本発明は、スタチン系化合物に含まれる前記一般式（１）で表される化合物を効率よく除去し、高純度のスタチン系化合物を得る方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、前記一般式（１）で表される化合物を、下記一般式（２）で表される新規化合物に変換するとスタチン系化合物からの除去が容易になることを見出し、本発明を完成させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　即ち、本発明は、以下に関する。
［１］下記一般式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
（式中、Ｒ１は、窒素含有複素環を含む基であり、Ｒ２は、炭素数１～４のアルキル基、アルカリ金属元素、アルカリ土類金属元素又は水素である。）
で表される化合物を含むスタチン系化合物の精製方法であって、
（Ａ）該一般式（１）で表される化合物を、下記一般式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
（式中、Ｒ１は、前記と同義である。）
で表される化合物に変換する工程
を有することを特徴とする、スタチン系化合物の精製方法；
［２］前記工程（Ａ）の後、（Ｂ）前記一般式（２）で表される化合物を除去する工程を有することを特徴とする、［１］に記載のスタチン系化合物の精製方法；
［３］前記工程（Ａ）を、溶媒の存在下、加熱することにより行なうことを特徴とする、［１］又は［２］に記載のスタチン系化合物の精製方法；
［４］前記工程（Ａ）において、前記スタチン系化合物が、前記一般式（１）で表される化合物を０．０１面積％以上含有することを特徴とする、［１］～［３］のいずれか一つに記載のスタチン系化合物の精製方法；
［５］前記工程（Ｂ）の後、（Ｃ）前記工程（Ｂ）で得られた化合物とカルシウム化合物とを反応させる工程を有することを特徴とする、［２］～［４］のいずれか一つに記載のスタチン系化合物の精製方法；
［６］前記スタチン系化合物が、ロスバスタチン、ピタバスタチン、フルバスタチン、及びその塩からなる群から選ばれる少なくとも一種であり、かつ、前記一般式（１）及び（２）におけるＲ１が、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
であることを特徴とする、［１］～［５］のいずれか一つに記載のスタチン系化合物の精製方法；
［７］前記スタチン系化合物がロスバスタチン又はその塩であり、かつ、下記一般式（３）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
（式中、Ｒ３は、アルカリ金属元素、アルカリ土類金属元素又は水素である。）
で表される化合物をさらに含むことを特徴とする、［１］～［５］のいずれか一つに記載のスタチン系化合物の精製方法；
［８］下記一般式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
（式中、Ｒ１は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
である。）で表される化合物を１ｐｐｍ以上１０００ｐｐｍ以下含有することを特徴とする、ロスバスタチンカルシウム；
［９］下記一般式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
（式中、Ｒ１は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
である。）で表される化合物を１ｐｐｍ以上１０００ｐｐｍ以下含有することを特徴とする、ピタバスタチンカルシウム；
［１０］下記一般式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
（式中、Ｒ１は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
である。）で表される化合物を１ｐｐｍ以上１０００ｐｐｍ以下含有することを特徴とする、フルバスタチンナトリウム；
［１１］下記一般式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
（式中、Ｒ１は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
である。）で表される化合物；
［１２］スタチン系化合物の製造方法であって、該スタチン系化合物に含まれる下記一般式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
（式中、Ｒ１は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
である。）で表される化合物の存在量を測定する工程を有することを特徴とする、スタチン系化合物の製造方法。
　さらに、本発明は、以下に関する。
・前記工程（Ａ）を、３０℃以上１００℃以下の条件下で行なうことを特徴とする、［３］に記載のスタチン系化合物の精製方法；
・前記工程（Ｂ）において、塩基性の条件下、有機溶媒により抽出することにより、前記一般式（２）で表される化合物を除去することを特徴とする、［２］～［４］のいずれか一つに記載のスタチン系化合物の精製方法；
・前記工程（Ａ）に先立ち、前記スタチン系化合物を溶媒に溶解する工程を有することを特徴とする、［１］～［５］のいずれか一つに記載のスタチン系化合物の精製方法。
　本発明の方法によれば、スタチン系化合物の純度を効率よく向上させることができ、高純度のスタチン系化合物を得ることができる。
合成例１で得られたロスバスタチンカルシウム（ＲＳＶ－Ｃａ）を、室温又は冷蔵（４℃）で保存し、保存開始から３日目、１９日目、８１日目での、（（３Ｒ），（６Ｅ））－７－[４－（４－フルオロフェニル）－６－イソプロピル－２－［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン－５－イル]－３－ヒドロキシ－５－オキソ－６－ヘプテン酸カルシウム（３－ＭＯＬＡ－Ｃａ）の含有量及びロスバスタチンカルシウム（ＲＳＶ－Ｃａ）の含有量をＨＰＬＣで分析した結果を示すグラフである。
　以下、本明細書において用いられる用語について詳しく説明する。
　本明細書において、「炭素数１～８の１級アルキル基」とは、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基、ｎ-オクチル基を意味する。
　本明細書において、「炭素数１～４の１級アルキル基」とは、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基を意味する。
　本明細書において、「炭素数３～６の２級アルキル基」とは、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｓｅｃ－ブチル基、１－メチルブチル基、１－メチルヘプチル基、１－エチルプロピル基、１－エチルブチル基を意味する。
　本明細書において、「炭素数３～４の２級アルキル基」とは、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｓｅｃ－ブチル基を意味する。
　本明細書において、「炭素数１～８の直鎖状又は分岐状アルキル基」とは、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基、ｎ－オクチル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｓｅｃ－ブチル基、１－メチルブチル基、１－メチルヘプチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｔｅｒｔ－アミル基を意味する。
　本明細書において、「炭素数３～８の分岐状アルキル基」とは、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｓｅｃ－ブチル基、１－メチルブチル基、１－メチルヘプチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｔｅｒｔ－アミル基を意味する。
　本明細書において、「炭素数１～４のアルキル基」とは、上記「炭素数１～８の直鎖状又は分岐状アルキル基」のうち、炭素数が１～４のものを意味する。
　本明細書において、「窒素含有複素環を含む基」とは、ピタバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン等のスタチン系化合物に含まれる母骨格に相当する基である。
　本明細書において、「アルカリ金属元素」とは、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム、フランシウムを意味する。好ましくは、アルカリ金属元素は、ナトリウム又はカリウムである。
　本明細書において、「アルカリ土類金属元素」とは、カルシウム、ストロンチウム、バリウム、ラジウムを意味する。好ましくは、アルカリ土類金属元素は、カルシウム又はバリウムである。
　本明細書において、「カルシウム化合物」とは、塩化カルシウム、酢酸カルシウム等の、カルボン酸をカルボン酸のカルシウム塩に変換することのできる化合物を意味する。好ましくは、カルシウム化合物は塩化カルシウムである。
　本明細書において、「アミン化合物」とは、ｎ－プロピルアミン、イソプロピルアミン、ジメチルアミン等の、カルボン酸をカルボン酸のアミン塩に変換することのできる化合物を意味する。好ましくは、アミン化合物はｎ－プロピルアミン又はジメチルアミンである。
　なお、本発明に係る化合物には、化合物の塩、無水物、水和物、溶媒和物等も包含される。
　本明細書において、「カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を有する酵素」とは、カルボニル基含有化合物中のカルボニル基を不斉還元して光学活性なアルコール類に変換する活性を有する酵素を意味する。
　「カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性」を有するか否かは、カルボニル基含有化合物中のカルボニル基を不斉還元して光学活性なアルコールに変換する活性を、通常のアッセイ法で測定することにより判定可能である。例えば、一般式（１Ａ）で表される化合物に、測定の対象とする酵素を作用させ、一般式（１Ａ）で表される化合物から変換された一般式（２Ａ）で表される化合物の量を直接的に測定することにより、その酵素活性を確認することができる。また、本明細書における「酵素」には、精製酵素（部分的に精製した酵素を含む。）や、通常の固定化技術を用いて固定化したもの、例えば、ポリアクリルアミド、カラギーナンゲル等の担体に固定化したもの等も含まれる。
　本明細書において、「カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を有する酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞」（以下、「本発明の微生物若しくは細胞」と称することがある。）とは、「カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性」を有していれば特に制限はなく、内在的に前記活性を有する生物若しくは細胞であってもよいし、育種により前記活性を付与した微生物若しくは細胞であってもよい。育種により前記活性を付与する手段としては、遺伝子組換え処理（形質転換）や変異処理等、公知の方法を採用することができる。形質転換の方法としては、目的とする遺伝子を導入する、有機化合物の生合成経路における酵素遺伝子の発現を強化する、副生物生合成経路における酵素遺伝子の発現を低減する等の方法を用いることができる。
　なお、「微生物若しくは細胞」の種類としては、後述の宿主生物若しくは宿主細胞に記載のものが挙げられる。また、本明細書において、「前記活性を有する酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞」としては、生きている微生物若しくは細胞に限られず、生体としては死んでいるが酵素活性を有するものも含まれる。
　また、本発明の微生物若しくは細胞は、国際公開第２００３／０７８６３４号に記載の方法で作製することができる。
　本明細書において、「宿主生物」とする生物の種類は特に限定されず、大腸菌、枯草菌、コリネ型細菌、シュードモナス属細菌、バチルス属細菌、リゾビウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、サクシノバチルス属細菌、アナエロビオスピリラム属細菌、アクチノバチルス属細菌等の原核生物、酵母、糸状菌等の菌類、植物、動物等の真核生物が挙げられる。中でも、好ましくは、大腸菌、酵母、コリネ型細菌であり、特に好ましくは大腸菌である。
　本明細書において、「宿主細胞」とする細胞の種類は特に限定されず、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等を用いることができる。
　本明細書において、「発現ベクター」とは、所望の機能を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを組み込み宿主生物へ導入することにより、所望の機能を有するタンパク質を前記宿主生物において複製及び発現させるために用いられる遺伝因子である。例えば、プラスミド、ウイルス、ファージ、コスミド等が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、発現ベクターはプラスミドである。
　本明細書において、「形質転換体」とは、前記発現ベクターが導入され、所望の機能を有するタンパク質に関連する所望の形質を表すことができるようになった生物又は細胞を意味する。
　本明細書において、「微生物若しくは細胞の処理物」とは、微生物若しくは細胞を培養し、当該微生物若しくは細胞を、１）有機溶媒等により処理したもの、２）凍結乾燥したもの、３）担体等に固定化したもの、４）物理的又は酵素的に破壊したものであり、かつ、所望の機能を有するタンパク質を含有するもの等を意味する。
　本明細書において、「微生物若しくは細胞を培養して得られた酵素を含む培養液」とは、１）微生物若しくは細胞の培養液、２）微生物若しくは細胞の培養液を有機溶媒等により処理をした培養液、３）微生物若しくは細胞の細胞膜を物理的又は酵素的に破壊してある培養液を意味する。
　次に、本発明の精製方法について詳しく説明する。
［スタチン系化合物］
　本発明の精製方法では、下記一般式（１）で表される化合物（以下、「３－ＭＯＬＡ」と称することがある。）を含むスタチン系化合物の精製を行なうことができる。本発明において、スタチン系化合物とは、化合物自体であってもよく、カルボン酸、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩等の塩の形態であってもよく、これらの混合物であってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
（式中、Ｒ１は、窒素含有複素環を含む基であり、Ｒ２は、炭素数１～４のアルキル基、アルカリ金属元素、アルカリ土類金属元素又は水素である。）
　前記一般式（１）において、Ｒ１は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
であることが好ましい。
　本発明の精製方法の対象となるスタチン系化合物は、ロスバスタチン、ピタバスタチンフルバスタチン、及びこれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも一種であることが好ましく、ロスバスタチンピタバスタチン、又はこれらの塩であることがより好ましく、ロスバスタチン又はこれらの塩であることが特に好ましい。
　また、ここで、本発明の精製方法は、前記一般式（１）で表される化合物を、ＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で測定して０．０１面積％以上含有するスタチン系化合物を、精製の対象とすることが好ましく、０．０５面積％以上含有するスタチン系化合物を、精製の対象とすることができる。また、上限値としては、本発明の効果が得られる限り、特に制限はないが、通常９９面積％以下、好ましくは５０面積％以下、より好ましくは２５面積％以下、特に好ましくは５面積％以下、もっとも好ましくは１面積％以下である。本発明の好ましい実施態様では、スタチン系化合物は、前記一般式（１）で表される化合物を０．０１面積％以上５面積％以下含有する。
［本発明の精製方法］
　本発明の精製方法は、（Ａ）前記一般式（１）で表される化合物を下記一般式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
（式中、Ｒ１は、前記と同義である。）
で表される化合物（以下、「ＫＴＮＥ」と称することがある。）に変換する工程を有することを特徴とする。
　前記工程（Ａ）の後、（Ｂ）前記一般式（２）で表される化合物を除去する工程を有することが好ましい。
　また、さらに、前記工程（Ｂ）の後、（Ｃ）前記工程（Ｂ）で得られた化合物とカルシウム化合物とを反応させる工程を有することが好ましい。
　以下、本発明の精製方法が有する工程（Ａ）～（Ｃ）について、工程ごとに説明する。
工程（Ａ）：
　工程（Ａ）は、前記一般式（１）で表される化合物を、前記一般式（２）で表される化合物に変換する工程である。
　前記一般式（１）で表される化合物は、通常、前記スタチン系化合物に含まれているが、工程（Ａ）を開始するにあたって、前記一般式（１）で表される化合物を添加してもよい。
　工程（Ａ）では、前記一般式（１）で表される化合物は、脱炭酸化され、前記一般式（２）で表される化合物に変換される。
　一方で、工程（Ａ）において、前記スタチン系化合物は、カルボン酸、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩のいずれの形態であってもよく、これらの混合物であってもよい。前記一般式（１）で表される化合物の脱炭酸化に伴い、前記スタチン系化合物は、その形態が変化しても、変化しなくてもよい。具体的には、後述するように工程（Ａ）を酸性又は塩基性条件下で行なう場合は、用いる酸又は塩基の種類に応じて、用いる酸又は塩基に由来する塩の形態に変換されることがある。例えば、スタチン系化合物がロスバスタチンであり、かつ、水酸化ナトリウムの存在下で工程（Ａ）を行なう場合、通常、上記の反応と共に、（Ｅ）－７－［４－（４－フルオロフェニル）－６－イソプロピル－２－［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン－５－イル］－（３Ｒ，５Ｓ）－３，５－ヒドロキシ－６－ヘプテン酸（以下、「ＤＯＬＡ」と称する場合がある。）が、ロスバスタチンナトリウム（以下、「ＲＳＶ－Ｎａ」と称する場合がある。）に変換される。
　工程（Ａ）の反応条件等は、前記一般式（１）で表される化合物を、前記一般式（２）で表される化合物に変換することができれば、特に制限はない。工程（Ａ）における反応条件の好ましい例を以下に記載する。
　工程（Ａ）は、溶媒の存在下で行なうことが好ましい。ここで、溶媒としては、エーテル類（例、メチルｔ－ブチルエーテル、テトラヒドロフラン（以下、「ＴＨＦ」と称する場合がある。）、シクロペンチルメチルエーテル等）、酢酸エステル類（例、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル等）、アミド類（例、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド等）、炭化水素（例、トルエン、シクロヘキサン等）、アルコール類（例、メタノール、エタノール、イソプロパノール等）、水等が挙げられ、中でも、メチルｔ－ブチルエーテル、ＴＨＦ、酢酸エチル、トルエン、水が好ましい。
　反応温度としては、通常３０℃以上、好ましくは４０℃以上であり、また、通常１３０℃以下、好ましくは１００℃以下である。反応を効率的に進めるため、必要に応じて加熱することが好ましい。本発明の好ましい実施態様では、工程（Ａ）は、３０℃以上１００℃以下の条件下で行われる。
　工程（Ａ）におけるｐＨに特に制限はないが、反応を促進するために、酸性条件下又は塩基性条件下とすることが好ましい。
　酸性条件下で行なう場合、好ましくはｐＨ０以上ｐＨ３以下、より好ましくはｐＨ２以下の範囲で行なうことが好ましい。ここで用いることのできる酸としては、塩酸、硫酸、メタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸等が挙げられ、中でも、塩酸、硫酸が好ましい。
　塩基性条件下で行なう場合、ｐＨ１０以上ｐＨ１４以下の範囲で行なうことが好ましい。ここで用いることのできる塩基としては、アルカリ金属水酸化物（例、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等）、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン等が挙げられ、中でも、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが好ましい。
　また、反応時間は、その他の条件にもよるが、通常１時間以上、好ましくは２時間以上であり、また、通常４８時間以下、好ましくは２４時間以下である。
　上記の反応時間を短縮するためにも、必要に応じて、工程（Ａ）においては、反応溶液を必要に応じて撹拌することが好ましい。
工程（Ｂ）：
　工程（Ｂ）は、工程（Ａ）で得られた混合物（工程（Ａ）に先立ち、前記スタチン系化合物を溶媒に溶解する工程を有する場合、溶液）から、前記一般式（２）で表される化合物を除去する工程である。なお、ここで、除去するとは、必ずしも完全に除去されている必要はなく、その大部分が除去されて、得られる化合物の純度が向上すればよい。また、本工程で、前記一般式（２）で表される化合物が除去されると、前記スタチン系化合物、又はその塩が残る。
　前記一般式（２）で表される化合物を除去することができれば、その手段や反応条件に特に制限はない。工程（Ｂ）の好ましい例を以下に記載する。
　工程（Ｂ）は、塩基性の条件下、有機溶媒により抽出することにより、前記一般式（２）で表される化合物を除去することが好ましい。
　ここで、用いることのできる有機溶媒としては、エーテル類（例、メチルｔ－ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル（以下、「ＣＰＭＥ」と称する場合がある。）等）、酢酸イソプロピル、酢酸エチル、酢酸メチル等のエステル類、トルエン、メチルエチルケトン等のケトン類等が挙げられ、中でも、上述のエーテル類、エステル類が好ましく、中でも、メチルｔ－ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、メチルエチルケトン、酢酸エチルが好ましい。
　また、塩基性の条件下とは、ｐＨ８以上ｐＨ１４以下の範囲の条件が好ましく、ｐＨ１０以上ｐＨ１４以下の範囲の条件で行なうことがより好ましい。
工程（Ｃ）：
　工程（Ｃ）は、前記工程（Ｂ）で得られた化合物、即ち、前記スタチン系化合物又はその塩とカルシウム化合物とを反応させる工程であり、前記工程（Ｂ）で得られた化合物をカルシウム塩に変換する場合に行なう工程である。具体的には、前記スタチン系化合物がロスバスタチン又はピタバスタチンである場合に、ロスバスタチンカルシウム又はピタバスタチンカルシウムを得るために行なう。
　工程（Ｃ）では、例えばスタチン系化合物がロスバスタチンである場合、通常、前記工程（Ｂ）で得られた化合物（例えば、ＲＳＶ－Ｎａ）が、ロスバスタチンカルシウム（以下、「ＲＳＶ－Ｃａ」と称する場合がある。）に変換される。
　工程（Ｃ）における反応条件等は、前記工程（Ｂ）で得られた化合物とカルシウム化合物とを反応させ、カルシウム塩を得ることができれば特に制限はないが、工程（Ｃ）における反応条件等の好ましい例を以下に記載する。
　カルシウム化合物としては、塩化カルシウム、酢酸カルシウム等を用いることができ、特に、塩化カルシウムが好ましい。カルシウム化合物の使用量は、前記工程（Ｂ）で得られた化合物に対して、通常０．５当量～３当量、好ましくは、０．６当量～２．８当量である。
　反応は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（以下、「ＭＴＢＥ」と称する場合がある。）、ＴＨＦ、ＣＰＭＥ等のエーテル系溶媒、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、水等の極性溶媒や、これら極性溶媒と非極性溶媒（トルエン、シクロヘキサン、メシチレン等）との混合物が好ましい。
　反応温度は、通常０℃～２００℃、好ましくは、２０℃～１１０℃である。
　反応時間は、通常０．０１時間～２００時間、好ましくは、０．５時間～２４時間である。
　なお、前記スタチン系化合物がロスバスタチンである場合、前記一般式（１）で表される化合物に加えて、下記一般式（３）で表される化合物（（５Ｓ、６Ｅ）－７－［４－（４－フルオロフェニル）－６－イソプロピル－２－［メタンスルホニル（メチル）アミノ］－ピリミジン－５－イル］－５－ヒドロキシ－３－オキソヘプト－６－エン酸又はその塩；以下「５－ＭＯＬＡ」と称する場合がある。）を含有していてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
（式中、Ｒ３は、アルカリ金属元素、アルカリ土類金属元素又は水素である。）
　前記一般式（３）において、Ｒ３は、アルカリ金属元素又は水素であることが好ましい。ここで、アルカリ金属元素としてはリチウム、ナトリウム又はカリウムが好ましく、ナトリウム又はカリウムであることが特に好ましい。
　この場合、工程（Ａ）の反応温度は、通常３０℃以上、好ましくは４０℃以上であり、また、通常１４０℃以下、好ましくは１３０℃以下である。
　上記のように反応温度を高めにすることにより、前記一般式（１）で表される化合物が前記一般式（２）で表される化合物に変換され、さらに、５－ＭＯＬＡが、（３Ｅ，５Ｅ）－４－［（４－フルオロフェニル）－２－［メタンスルホニル（メチル）アミノ］－６－イソプロピルピリミジン－５－イル）］－２－オキソ－３，５－ヘキサジエン（以下、「ＤＥＮＫ」と称する場合がある。）に変換される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
　ここで生成したＤＥＮＫは、工程（Ｂ）において、４－（４－フルオロフェニル）－６－イソプロピル－２－［メチル（メチルスルホニル）アミノ］－５－［（１Ｅ）－３－オキソ－１－ブテニル）］－ピリミジン（一般式（２）において、Ｒ１が、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
の化合物；以下「ＫＴＮＥ」と称する場合がある。）と共に除去することができる。
［ロスバスタチンカルシウムの製造方法］
　前記スタチン系化合物がロスバスタチンである場合、本発明の精製方法に用いられるロスバスタチンカルシウムの製造方法に特に制限はないが、以下の方法で製造されたものであることが好ましい。
　なお、以下において、ｗ／ｖは重量／容量を意味する。
　本発明の製造方法には、以下に示すように、一般式（１Ａ）で表される化合物を一般式（２Ａ）で表される化合物に変換する工程（ｉ）、及び一般式（２Ａ）で表される化合物を式（６）で示されるロスバスタチンカルシウムに変換する工程（iiiａ）、（iiiｂ）（（iiiｂ－１）～（iiiｂ－３））又は（iiiｃ）（（iiiｃ－１）～（iiiｃ－２））が含まれる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
　式中、Ｒは炭素数１～８の１級アルキル基又は炭素数３～６の２級アルキル基を表し、好ましくは炭素数１～４の１級アルキル基又は炭素数３～４の２級アルキル基を表す。Ｒとしては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基又はｎ－ブチル基が好ましい。中でも、効率よく工程（ｉ）を行うことができる観点から、Ｒとしては、ｎ－プロピル基又はイソプロピル基がより好ましく、ｎ－プロピル基が特に好ましい。
　－Ｘ１及び－Ｘ２はそれぞれ独立して、－ＯＨ又は＝Ｏを表し、－Ｘ１又は－Ｘ２の少なくとも一方が＝Ｏである。
　Ｒ３Ａ及びＲ４Ａはそれぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～８のアルキル基を表し、好ましくは、水素原子又は炭素数１～４のアルキル基である。
　本発明の製造方法には、以下に示すように、工程（ｉ）で使用する一般式（１Ａ）で表される化合物の製造方法として、式（３Ａ）で表される化合物及び一般式（４）で表される化合物から一般式（１Ａ）で表される化合物に変換する工程（ii）が含まれる。
　さらに、工程（ii）の好ましい態様として、式（３Ａ）で表される化合物及び一般式（４ａ）で表される化合物から一般式（５）で表される化合物に変換する工程（iiａ）、及び一般式（５）で表される化合物を一般式（１Ａ）で表される化合物に変換する工程（iiｂ）が含まれる。
　さらに、工程（ｉ）の別の態様として、一般式（１ａ）で表される化合物を一般式（１ｂ）で表される化合物及び／又は一般式（１ｃ）で表される化合物に変換する工程（ｉａ）、及び一般式（１ｂ）で表される化合物及び／又は一般式（１ｃ）で表される化合物を一般式（２Ａ）で表される化合物に変換する工程（ｉｂ）も本発明の製造方法に含まれる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
　式中、Ｒ、－Ｘ１及び－Ｘ２は前記定義と同義である。
　Ｒ１Ａは炭素数１～８の直鎖状又は分岐状アルキル基を表す。
　Ｒ２Ａは炭素数３～８の分岐状アルキル基を表し、上記Ｒとは異なる基である。Ｒ２Ａは好ましくは、イソプロピル基、ｓ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基又はｔｅｒｔ－アミル基であり、特に好ましくは、ｔｅｒｔ－ブチル基である。
　以下に、本発明の製造方法の各工程について詳述する。
工程（ｉ）：
　工程（ｉ）は、一般式（１Ａ）で表される化合物に、カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を有する酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞（本発明の生物若しくは細胞）、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液（以下、これらをまとめて「本発明の酵素等」と称することがある。）を作用させて還元して、一般式（２Ａ）で表される化合物を得る工程である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
　式中、Ｒ、－Ｘ１及び－Ｘ２は前記定義と同義である。
　工程（ｉ）で用いる酵素としては、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するもの（以下「ＯＣＲ１」と称する場合がある）又は該アミノ酸配列のホモログを用いることができる。具体的には、下記（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示すポリペプチドのいずれかを含む酵素、又はこれらのホモログが挙げられる。
（Ａ）特許第４２７０９１８号に記載のＯｇａｔａｅａ　ｍｉｎｕｔａ　ｖａｒ．　ｎｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ　ＮＢＲＣ１４７３由来のカルボニル還元酵素（ＯＣＲ１）（配列番号２）を有するポリペプチド
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、一般式（１Ａ）で表される化合物を、一般式（２Ａ）で表される化合物に変換する活性を有するポリペプチド
（Ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ一般式（１Ａ）で表される化合物を、一般式（２Ａ）で表される化合物に変換する活性を有するポリペプチド
　上記（Ｂ）のホモログは、配列番号２に示されるアミノ酸配列全長と少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するタンパク質である。
　また、上記（Ｃ）のホモログは、カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を害さない範囲において、配列番号２に記載のアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を有するものである。ここで、「１又は数個のアミノ酸」とは、具体的には２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下のアミノ酸である。
　上記酵素をコードする遺伝子は、下記（Ｄ）、（Ｅ）又は（Ｆ）に示す塩基配列、又はこれらのホモログを含むＤＮＡである。
（Ｄ）配列番号１に記載の塩基配列
（Ｅ）配列番号１に記載の塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、一般式（１Ａ）で表される化合物に作用して、一般式（２Ａ）で表される化合物に変換する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列
（Ｆ）配列番号１に記載の塩基配列において１又は数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列を含み、かつ一般式（１Ａ）で表される化合物に作用して、一般式（２Ａ）で表される化合物に変換する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列
　ここで、上記（Ｅ）の「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、ストリンジェントな条件下、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、又はサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味する。ストリンジェントな条件としては、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法及びプラークハイブリダイゼーション法においては、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７ｍｏｌ／Ｌ～１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液の存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１～２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム水溶液）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。
　各ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ，　２ｎｄ　Ｅｄ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　ＮＹ．，１９８９．等に記載されている方法に準じて行うことができる。
　また、上記（Ｆ）のホモログは、カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を害さない範囲において、配列番号１に記載の塩基配列に１又は数個の塩基が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を有するものである。「１又は数個の塩基」とは、具体的には６０個以下、好ましくは３０個以下、より好ましくは１５個以下の塩基である。
　工程（ｉ）において、反応基質となる一般式（１Ａ）で表される化合物は、通常、基質濃度が０．０１％ｗ／ｖ～２０％ｗ／ｖ、好ましくは０．１％ｗ／ｖ～１０％ｗ／ｖの範囲で用いられる。反応基質は反応開始時に一括して添加してもよい。また、酵素の基質阻害があった場合にはその影響を減らし、また生成物の蓄積濃度を向上させるという観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加することもできる。
　工程（ｉ）においては、補酵素ＮＡＤ（Ｐ）＋もしくはＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下で行なうことが好ましく、この場合、上記補酵素を、通常、０．００１ｍｍｏｌ／Ｌ～１００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ～１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度になるように添加するのが好ましい。
　上記補酵素を添加する場合には、反応系内で、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈから生成するＮＡＤ（Ｐ）＋をＮＡＤ（Ｐ）Ｈへ再生させることが生産効率向上のため好ましい。再生方法としては、１）本発明の生物若しくは細胞自体のＮＡＤ（Ｐ）＋からＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成する能力、即ち、ＮＡＤ（Ｐ）＋還元能を利用する方法、
２）ＮＡＤ（Ｐ）＋からＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成する能力を有する微生物やその処理物、あるいは、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素等）等のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生に利用可能な酵素（以下、「再生酵素」という）を一種類以上反応系内に添加する方法、
３）本発明の生物若しくは細胞を作製するに当たり、上記再生酵素の遺伝子を一種類以上、合わせて宿主生物若しくは細胞に導入する方法等が挙げられる。
　上記１）の方法においては、反応系にグルコース、エタノール、２－プロパノール又はギ酸等を添加することが好ましい。
　また、上記２）の方法においては、上記再生酵素を生産する能力を有する微生物、該微生物をアセトン処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的又は酵素的に破砕したもの等の微生物の処理物、該酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等の担体に固定化したもの等を用いてもよく、また市販の酵素を用いてもよい。
　この場合、上記再生酵素の使用量としては、本発明のカルボニル基を立体選択的に還元しうる能力を有する酵素のカルボニル還元活性と比較して、酵素活性で通常０．０１倍～１００倍、好ましくは０．５倍～２０倍程度となるよう添加する。
　また、上記再生酵素の基質となる化合物、例えば、グルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコース、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、アルコール脱水素酵素を利用する場合のエタノール又はイソプロパノール等の添加も必要となるが、その添加量としては、反応原料である一般式（１Ａ）で表される化合物に対して、通常０．１当量～２０当量、好ましくは１当量～５当量である。
　また、上記３）の方法においては、工程（ｉ）に用いられる酵素をコードするＤＮＡと共に、上記再生酵素類のＤＮＡを染色体に組み込む方法、単一の発現ベクター中に両ＤＮＡを導入した後に宿主生物若しくは細胞を形質転換する方法、又は両ＤＮＡをそれぞれ別々の発現ベクターに導入した後に、宿主生物若しくは細胞を形質転換する方法等を用いることができる。両ＤＮＡをそれぞれ別々の発現ベクターに導入した後に宿主生物若しくは細胞を形質転換する方法の場合は、両発現ベクター同士の不和合性を考慮して発現ベクターを選択する。
　単一の発現ベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター及びターミネーター等発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
　工程（ｉ）は、一般式（１Ａ）で表される化合物、及び上記酵素、該酵素を生産する能力を有する生物若しくは細胞、該生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液、並びに、必要に応じて各種補酵素（その再生システム、即ち、補酵素を再生できるようになっていることがより好ましい。）を含有する、水性媒体中もしくは該水性媒体と有機溶媒との混合物中で行われる。なお、一般式（１Ａ）で表される化合物は、後述する方法により製造することができる。
　水性媒体としては、水又は緩衝液（リン酸カリウム緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、トリス塩酸緩衝液等）が挙げられる。
　有機溶媒としては、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ－ヘキサン、ｎ－ヘプタン、ジメチルスルホキシド、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、２－プロパノール等、一般式（１Ａ）で表される化合物の溶解度が高いものを使用することができる。
　工程（ｉ）は、通常４℃～７０℃、好ましくは２０℃～６０℃の反応温度で、通常ｐＨ３～１１、好ましくはｐＨ４～８で行われる。反応時間は、通常０．５時間～４８時間、好ましくは０．５時間～２４時間である。また、膜リアクター等を利用して行うことも可能である。
　工程（ｉ）で得られる一般式（２Ａ）で表される化合物は、遠心分離やフィルトレーション等により菌体やポリペプチド等を分離した後に、適当なｐＨに調整し、ヘキサン、酢酸エチル、トルエン等の有機溶媒による抽出、カラムクロマトグラフィーによる精製、結晶化等を適宜組み合わせることにより精製することができる。
　また、工程（ｉ）は、以下のように、工程（ｉａ）及び工程（ｉｂ）の２段階に分けて行うこともできる。
工程（ｉａ）：
　工程（ｉａ）は、一般式（１Ａ）において、－Ｘ１及び－Ｘ２が＝Ｏである一般式（１ａ）で表される化合物に、カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を有する酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を作用させて還元し、一般式（１Ａ）において、－Ｘ１が－ＯＨで－Ｘ２が＝Ｏである一般式（１ｂ）で表される化合物、及び／又は－Ｘ１が＝Ｏで－Ｘ２が－ＯＨである一般式（１ｃ）で表される化合物を得る工程である。
　一般式（１ａ）で表される化合物の還元は、工程（ｉ）と同様の方法を採用することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
　式中、Ｒは前記定義と同義である。
　工程（ｉａ）で得られた一般式（１ｂ）及び／又は（１ｃ）で表される化合物は、次の工程（ｉｂ）に供する前に、例えば結晶化により精製されてもよい。
工程（ｉｂ）：
　工程（ｉｂ）は、工程（ｉａ）で得られた一般式（１ｂ）で表される化合物、及び／又は一般式（１ｃ）で表される化合物に、上記カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を有する酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を作用させて還元し、一般式（２Ａ）で表される化合物を得る工程である。
　一般式（１ｂ）で表される化合物、及び／又は一般式（１ｃ）で表される化合物の還元は、工程（ｉ）と同様の方法を採用することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
　式中、Ｒは前記定義と同義である。
　また、工程（ｉ）、又は、工程（ｉａ）及び（ｉｂ）で得られる、一般式（２Ａ）で表される化合物、中でも一般式（２Ａ）においてＲがｎ－プロピル基又はイソプロピル基である化合物は、結晶性が高いため高純度で得ることができる。
　一般式（２Ａ）においてＲがｎ－プロピル基である化合物の結晶は、例えば、以下に示す粉末Ｘ線回折パターンを有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000043
　すなわち、一般式（２Ａ）においてＲがｎ－プロピル基である化合物の結晶は、２θ＝８．７°、１６．３°、１９．７°、２１．２°、２１．３°（±０．２°）に特徴的なピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有する。さらには、２θ＝８．７°、１２．９°、１６．３°、１７．１°、１９．７°、２１．２°、２１．３°、２２．４°、２２．７°、２４．９°（±０．２°）に特徴的なピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有することが好ましい。
工程（ii）：
　工程（ii）は、工程（ｉ）で使用する一般式（１Ａ）で表される化合物を製造する工程である。具体的には、式（３Ａ）で表される化合物と一般式（４）で表される化合物を、塩基の存在下、縮合させる工程である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
　式中、Ｒ１Ａ、Ｒ、－Ｘ１及び－Ｘ２は前記定義と同義である。
　塩基としては、水素化ナトリウム、水素化カリウム、水素化カルシウム等の金属水素化物、ナトリウムアミド等の金属アミド、ブチルリチウム、リチウムジイソプロピルアミド等の有機リチウム、ｔｅｒｔ－ブチルマグネシウムクロライド等のグリニャール試薬、ナトリウムエトキシド、ナトリウムｔｅｒｔ－ブトキシド、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド等のアルコキシドを用いることができ、特に、水素化ナトリウム、ナトリウムアミド、ナトリウムｔｅｒｔ－ブトキシドが好ましい。塩基の使用量は、式（３Ａ）で表される化合物に対して、通常１当量～６当量、好ましくは、１．５当量～６当量である。
　反応は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒としては、反応が進行する限り、特に限定されないが、シクロヘキサン、ｎ－ヘキサン、ｎ－ヘプタン、トルエン等の炭化水素系の非極性溶媒、クロロベンゼン、ジクロロベンゼン等のハロゲン溶媒、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、シクロペンチルメチルエーテル（ＣＰＭＥ）等のエーテル溶媒、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド等の極性溶媒、さらにはこれら極性溶媒と非極性溶媒との混合物が好ましい。溶媒の使用量は、式（３Ａ）で表される化合物１ｇに対して、通常５ｍＬ～１００ｍＬ、好ましくは、５ｍＬ～３０ｍＬである。
　反応温度は、通常－１０℃～２００℃、好ましくは、－５℃～４０℃である。
　反応時間は、通常０．１時間～２００時間、好ましくは、１時間～２４時間である。
　式（３Ａ）で表される化合物は、特許第２６４８８９７号公報に記載の方法により製造することができ、また、市販のものを用いることもできる。一般式（４）で表される化合物は、市販のものを用いることができる。
　なお、Ｒ１ＡがＲとは異なる基である場合は、上記縮合で得られた化合物と、Ｒ－ＯＨで表されるアルコールを反応させて一般式（１Ａ）で表される化合物を得る。本工程は、工程（iiｂ）と同様の方法を採用することができる。
　工程（ii）においては、特に以下の（iiａ）及び（iiｂ）の工程を有することが好ましい。
工程（iiａ）：
　工程（iiａ）は、式（３Ａ）で表される化合物と一般式（４）においてＲ１ＡがＲ２Ａである一般式（４ａ）で表される化合物を、塩基の存在下、縮合させて、一般式（５）で表される化合物を得る工程である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
　式中、Ｒ２Ａは前記定義と同義である。
　塩基としては、水素化ナトリウム、水素化カリウム、水素化カルシウム等の金属水素化物、ナトリウムアミド等の金属アミド、ブチルリチウム、リチウムジイソプロピルアミド等の有機リチウム、ｔｅｒｔ－ブチルマグネシウムクロライド等のグリニャール試薬、ナトリウムエトキシド、ナトリウムｔｅｒｔ－ブトキシド、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド等のアルコキシドを用いることができ、特に、ナトリウムアミド、ナトリウムｔｅｒｔ－ブトキシド、水素化ナトリウムが好ましい。塩基の使用量は、式（３Ａ）で表される化合物に対して、通常１当量～６当量、好ましくは、１．５当量～６当量である。
　反応は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、シクロヘキサン、ｎ－ヘキサン、ｎ－ヘプタン、トルエン等の炭化水素系の非極性溶媒、クロロベンゼン、ジクロロベンゼン等のハロゲン溶媒、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル、ＴＨＦ、ＣＰＭＥ等のエーテル溶媒、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド等の極性溶媒、さらにはこれら極性溶媒と非極性溶媒との混合物が好ましい。溶媒の使用量は、式（３Ａ）で表される化合物１ｇに対して、通常５ｍＬ～１００ｍＬ、好ましくは、５ｍＬ～３０ｍＬである。
　反応温度は、通常０℃～２００℃、好ましくは、０℃～４０℃である。
　反応時間は、通常０．１時間～２００時間、好ましくは、１時間～２４時間である。
　一般式（５）で表される化合物は、結晶性が高いため、クロマトグラフィー等の煩雑な精製を行うことなく高純度で得ることができる。
工程（iiｂ）：
　一般式（５）で表される化合物と、Ｒ－ＯＨで表されるアルコールを反応させて一般式（１ａ）で表される化合物を得る。
　ここで、Ｒは、炭素数１～８の１級アルキル基又は炭素数３～６の２級アルキル基を表し、好ましくは炭素数１～４の１級アルキル基又は炭素数３～４の２級アルキル基を表す。Ｒとしては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基又はｎ－ブチル基が好ましく、ｎ－プロピル基又はイソプロピル基がより好ましく、ｎ－プロピル基が特に好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
　式中、Ｒ２Ａ、Ｒ、－Ｘ１及び－Ｘ２は前記定義と同義である。
　一般式（１Ａ）で表される化合物の中でも、特に、下記式（１ａ）で表される化合物が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
　式中、Ｒは前記定義と同義である。
　反応は、溶媒を用いて行うこともできる。溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸イソプロピル等のエステル溶媒、シクロヘキサン、ｎ－ヘキサン、ｎ－ヘプタン、トルエン等の非極性溶媒、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン溶媒、ＭＴＢＥ、ＴＨＦ、ＣＰＭＥ等のエーテル溶媒、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド等の極性溶媒、さらにはこれら極性溶媒と非極性溶媒との混合物が好ましい。また、Ｒ－ＯＨで表されるアルコール自体を溶媒として用いてもよい。溶媒の使用量は、式（５）で表される化合物１ｇに対して、通常１ｍＬ～１００ｍＬ、好ましくは、１ｍＬ～１０ｍＬである。
　反応温度は、通常３０℃～１５０℃、好ましくは、４０℃～１１０℃である。
　反応時間は、通常１時間～４８時間、好ましくは、２時間～２４時間である。
　上記のようにして得られる一般式（１Ａ）で表される化合物、特に一般式（１ａ）で表される化合物、中でも一般式（１ａ）においてＲがｎ－プロピル基又はイソプロピル基である化合物は、結晶性が高いため高純度で得ることができる。
　一般式（１ａ）においてＲがｎ－プロピル基である化合物の結晶は、例えば、以下に示す粉末Ｘ線回折パターンを有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000048
　すなわち、２θ＝１６．７°、２０．８°、２１．３°、２２．１°、２５．１°（±０．２°）に特徴的なピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有する。さらには、２θ＝１６．７°、１７．６°、１９．２°、２０．８°、２１．３°、２２．１°、２４．１°、２４．３°、２５．１°、２６．４°（±０．２°）に特徴的なピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有することが好ましい。
工程（iiiａ）：
　工程（iiiａ）は、一般式（２Ａ）で表される化合物を塩基により加水分解した後、カルシウム化合物と反応させ、得られた生成物を単離することにより、式（６）で示されるロスバスタチンカルシウムを得る工程である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
　式中、Ｒは前記定義と同義である。
　塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等を用いることができ、特に、水酸化ナトリウムが好ましい。塩基の使用量は、一般式（２Ａ）で表される化合物に対して、通常０．９当量～２当量、好ましくは、１当量～１．５当量である。
　カルシウム化合物としては、塩化カルシウム、酢酸カルシウム等を用いることができ、特に、塩化カルシウムが好ましい。カルシウム化合物の使用量は、一般式（２Ａ）で表される化合物に対して、通常０．４当量～１．５当量、好ましくは、０．５当量～１．２当量である。
　反応は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸イソプロピル等のエステル溶媒、シクロヘキサン、ｎ－ヘキサン、ｎ－ヘプタン、トルエン等の非極性溶媒、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン溶媒、ＭＴＢＥ、ＴＨＦ、ＣＰＭＥ等のエーテル溶媒、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、水等の極性溶媒、さらにはこれら極性溶媒と非極性溶媒との混合物が好ましい。溶媒の使用量は、一般式（２Ａ）で表される化合物１ｇに対して、通常１ｍＬ～１００ｍＬ、好ましくは、５ｍＬ～３０ｍＬである。
　反応温度は、通常－１０℃～５０℃、好ましくは、０℃～４０℃である。
　反応時間は、通常１時間～４８時間、好ましくは、２時間～２４時間である。
工程（iiiｂ）：
　工程（iiiｂ）は、一般式（２Ａ）で表される化合物を、塩基により加水分解した後、酸で処理し、得られた式（８）で表される化合物をアミン化合物と反応させ、得られた一般式（９）で表される化合物を塩基により加水分解した後、カルシウム化合物と反応させることにより、式（６）で示されるロスバスタチンカルシウムを得る工程である。
　具体的には、一般式（２Ａ）で表される化合物を、塩基により加水分解して、一般式（７）で表される化合物とする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
　式中、Ｒは前記定義と同義である。Ｘはナトリウム又はカリウム等を表す。
　塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等を用いることができ、特に、水酸化ナトリウムが好ましい。塩基の使用量は、一般式（２Ａ）で表される化合物に対して、通常０．９当量～２当量、好ましくは、１当量～１．５当量である。
　カルシウム化合物としては、塩化カルシウム、酢酸カルシウム等を用いることができ、特に、塩化カルシウムが好ましい。カルシウム化合物の使用量は、一般式（２Ａ）で表される化合物に対して、通常０．４当量～１．５当量、好ましくは、０．５当量～１．２当量である。
　反応は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、酢酸エチル、酢酸メチル等のエステル溶媒、シクロヘキサン、ｎ－ヘキサン、ｎ－ヘプタン等の非極性溶媒、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン溶媒、ＭＴＢＥ、ＴＨＦ、ＣＰＭＥ等のエーテル溶媒、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、水等の極性溶媒、さらにはこれら極性溶媒と非極性溶媒との混合物が好ましい。溶媒の使用量は、一般式（２Ａ）で表される化合物１ｇに対して、通常１ｍＬ～１００ｍＬ、好ましくは、５ｍＬ～３０ｍＬである。
　反応温度は、通常－１０℃～５０℃、好ましくは、０℃～４０℃である。
　反応時間は、通常１時間～４８時間、好ましくは、２時間～２４時間である。
　次いで、一般式（７）で表される化合物を酸で処理して式（８）で表される化合物とする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
　式中、Ｘは前記定義と同義である。
　酸としては、塩酸、硫酸等を用いることができ、特に、塩酸が好ましい。酸の使用量は、酸性化できる量であれば特に限定されないが、加水分解時に使用した塩基に対して、通常１当量～３当量、好ましくは、１当量～１．５当量である。
　反応温度は、通常－１０℃～５０℃、好ましくは、０℃～３０℃である。
　反応時間は、通常０．５時間～５時間である。
　さらに、式（８）で表される化合物にアミン化合物を添加して、式（９）で表されるアミン塩とする。結晶性が高いアミン塩とすることにより、目的物であるロスバスタチンカルシウムの純度を向上させることが可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
　式中、Ｒ３Ａ及びＲ４Ａは前記定義と同義である。
　アミン化合物としては、ｎ－プロピルアミン、イソプロピルアミン、ジメチルアミン等を用いることができ、特に、ｎ－プロピルアミン、ジメチルアミンが好ましい。アミン化合物の使用量は、式（８）で表される化合物に対して、通常１当量～３当量、好ましくは、１当量～２当量である。
　反応は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸イソプロピル等のエステル溶媒、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン溶媒、ＭＴＢＥ、ＴＨＦ、ＣＰＭＥ等のエーテル溶媒、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル等の極性溶媒、さらにはこれら極性溶媒と非極性溶媒（トルエン、シクロヘキサン、メシチレン等）との混合物が好ましい。
　反応温度は、通常－１０℃～５０℃、好ましくは、０℃～３０℃である。
　反応時間は、０．５時間～５時間である。
　特に、一般式（９）で表される化合物がｎ－プロピルアミン塩やジメチルアミン塩である場合は、結晶性が高いため、高純度で得ることができるので好ましい。
　（Ｅ）－７－［４－（４－フルオロフェニル）－６－イソプロピル－２－［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン－５－イル］－（３Ｒ，５Ｓ）－３，５－ヒドロキシ－６－ヘプテン酸のｎ－プロピルアミン塩は、例えば、以下に示す粉末Ｘ線回折パターンを有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000053
　すなわち、２θ＝２６．８°、２９．１°、３０．３°、３８．９°、４５．７°（±０．２°）に特徴的なピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有する。さらには、２θ＝１９．８°、２２．９°、２６．８°、２９．１°、３０．３°、３４．２°、３６．５°、３８．９°、４５．７°、４６．８°（±０．２°）に特徴的なピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有することが好ましい。
　また、（Ｅ）－７－［４－（４－フルオロフェニル）－６－イソプロピル－２－［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン－５－イル］－（３Ｒ，５Ｓ）－３，５－ヒドロキシ－６－ヘプテン酸のジメチルアミン塩は、例えば、以下に示す粉末Ｘ線回折パターンを有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000054
　すなわち、２θ＝６．６°、１０．１°、１３．５°、１７．０°、１８．３°（±０．２°）に特徴的なピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有する。さらには、２θ＝６．６°、１０．１°、１３．５°、１７．０°、１８．３°、１８．９°、１９．４°、１９．６°、２０．５°、２１．２°（±０．２°）に特徴的なピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有することが好ましい。
　次いで、一般式（９）で表されるアミン塩を塩基により塩交換して、一般式（７）で表される化合物とする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
　式中、Ｒ３Ａ、Ｒ４Ａ及びＸは前記定義と同義である。
　塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等を用いることができ、特に、水酸化ナトリウムが好ましい。塩基の使用量は、一般式（９）で表される化合物に対して、通常１当量～３当量、好ましくは、１当量～２当量である。
　反応は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、ＭＴＢＥ、ＴＨＦ、ＣＰＭＥ等のエーテル溶媒、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、水等の極性溶媒、さらにはこれら極性溶媒と非極性溶媒（トルエン、シクロヘキサン、メシチレン等）との混合物が好ましい。
　反応温度は、通常－１０℃～５０℃、好ましくは、０℃～３０℃である。
　反応時間は、通常０．５時間～１０時間である。
　さらに、一般式（７）で表される化合物をカルシウム化合物と反応させることにより、式（６）で示されるロスバスタチンカルシウムを得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
　式中、Ｘは前記定義と同義である。
　カルシウム化合物としては、塩化カルシウム、酢酸カルシウム等を用いることができ、特に、塩化カルシウムが好ましい。カルシウム化合物の使用量は、一般式（７）で表される化合物に対して、通常０．５当量～３当量、好ましくは、０．６当量～２．８当量である。
　反応は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、ＭＴＢＥ、ＴＨＦ、ＣＰＭＥ等のエーテル溶媒、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、水等の極性溶媒、さらにはこれら極性溶媒と非極性溶媒（トルエン、シクロヘキサン、メシチレン等）との混合物が好ましい。
　反応温度は、通常０℃～２００℃、好ましくは、２０℃～１１０℃である。
　反応時間は、通常０．０１時間～２００時間、好ましくは、０．５時間～２４時間である。
工程（iiiｃ）：
　工程（iiiｃ）は、一般式（２Ａ）で表される化合物を塩基により加水分解して一般式（７）で表される化合物とし、次いで一般式（７）で表される化合物を、酸触媒の存在下又は非存在下で分子内脱水縮合させ、得られた式（１０）で表される化合物をカルシウム化合物と反応させることにより、式（６）で示されるロスバスタチンカルシウムを得る工程である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
　式中、Ｒ及びＸは前記定義と同義である。
　一般式（２Ａ）で表される化合物を塩基により加水分解して一般式（７）で表される化合物を得る工程は、工程（iiiｂ）と同様の方法を採用することができる。
　一般式（７）で表される化合物を、酸触媒の存在下又は非存在下で分子内脱水縮合させ、式（１０）で表される化合物を得る工程において、酸触媒としては、ｐ－トルエンスルホン酸、ピリジニウムｐ－トルエンスルホネート、硫酸、塩酸等を用いることができ、特に、塩酸、ｐ－トルエンスルホン酸が好ましい。酸触媒の使用量は、式（７）で表される化合物に対して、通常０．００１当量～０．５当量、好ましくは、０．０１当量～０．１当量である。
　前記分子内脱水縮合は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、酢酸エチル、酢酸メチル等のエステル溶媒、シクロヘキサン、ｎ－ヘキサン、ｎ－ヘプタン、トルエン等の非極性溶媒、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン溶媒、ＭＴＢＥ、ＴＨＦ等のエーテル溶媒、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド等の極性溶媒、さらにはこれら極性溶媒と非極性溶媒との混合物が好ましい。溶媒の使用量は、式（７）で表される化合物１ｇに対して、通常１ｍＬ～１００ｍＬ、好ましくは、５ｍＬ～５０ｍＬである。
　反応温度は、通常０℃～２００℃、好ましくは、２０℃～１１０℃である。
　反応時間は、通常１時間～７２時間、好ましくは、１時間～２４時間である。
　式（１０）で表される化合物をカルシウム化合物と反応させることにより、式（６）で示されるロスバスタチンカルシウムを得る工程は、工程（iiiｂ）と同様の方法を採用することができる。
　なお、本発明において、粉末Ｘ線回折スペクトルは、公知の方法にしたがって測定することができる。例えば、サンプルをガラス試料板上に充填し、４５ｋＶ及び４０ｍＡにて操作されるセラミックスＸ線管球Ｃｕから発生する１．５４０６オングストロームの波長のＸ線をサンプルに照射して測定することができる。粉末Ｘ線回折スペクトルの２θの値は、測定機器やサンプルによって、例えば±０．２°の誤差範囲内で変わることがあるため、本発明における２θの値は絶対的な値と解釈すべきではない。
［ピタバスタチンカルシウム及びフルバスタチンナトリウムの製造方法］
　前記スタチン系化合物がピタバスタチン又はフルバスタチンである場合、本発明の精製方法に用いられるピタバスタチンカルシウム及びフルバスタチンナトリウムの製造方法に特に制限はないが、ピタバスタチンについては、例えば、特開平１－２７９８６６号公報、特開２００２－３００８９７号公報（ＵＳ２００４／００３０１３９Ａ１）等に記載の方法で、フルバスタチンについては、例えば、特開平３－４７１６７号公報等に記載の方法で製造することができる。
［本発明のスタチン系化合物等］
　本発明によれば、下記一般式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
（式中、Ｒ１は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
である。）で表される化合物を好ましくは１０００ｐｐｍ以下、より好ましくは５００ｐｐｍ以下、さらに好ましくは１００ｐｐｍ以下含有するロスバスタチンカルシウムを得ることができる。なお、上記一般式（２）で表される化合物の含有量は、好ましくは１ｐｐｍ以上である。
　上記一般式（２）で表される化合物を１ｐｐｍ以上１０００ｐｐｍ以下含有するロスバスタチンカルシウムは、安定して保存することができる。
　また、本発明によれば、下記一般式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000060
（式中、Ｒ１は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
である。）で表される化合物を好ましくは１０００ｐｐｍ以下、より好ましくは５００ｐｐｍ以下、さらに好ましくは１００ｐｐｍ以下含有するピタバスタチンカルシウムを得ることができる。なお、上記一般式（２）で表される化合物の含有量は、好ましくは１ｐｐｍ以上である。
　上記一般式（２）で表される化合物を１ｐｐｍ以上１０００ｐｐｍ以下含有するピタバスタチンカルシウムは、安定して保存することができる。
　また、本発明によれば、下記一般式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000062
（式中、Ｒ１は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
である。）で表される化合物を好ましくは１０００ｐｐｍ以下、より好ましくは５００ｐｐｍ以下、さらに好ましくは１００ｐｐｍ以下含有するフルバスタチンナトリウムを得ることができる。なお、上記一般式（２）で表される化合物の含有量は、好ましくは１ｐｐｍ以上である。
　上記一般式（２）で表される化合物を１ｐｐｍ以上１０００ｐｐｍ以下含有するフルバスタチンナトリウムは、安定して保存することができる。
　さらに、本発明によれば、下記一般式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000064
（式中、Ｒ１は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000065
である。）で表される新規化合物を提供することができる。これらの化合物の存在量を測定すると、スタチン系化合物の品質評価を行なうことができる。本発明によれば、これらの化合物の存在量を測定する工程を有するスタチン系化合物の製造方法も提供することができる。
　以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。
　本実施例における定量分析は、ＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用い、以下の条件で測定を行った。
＜ＲＳＶ－Ｃａの化学純度＞
　カラム：インタクト社製　Ｃａｄｅｎｚａ　ＣＤ－Ｃ１８（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、３μｍ）
　移動相：Ａ：０．１％ギ酸水溶液　Ｂ：０．１％ギ酸を含むメタノール
　グラジエントプログラム（Ｂ濃度）：６０％（０分）→７５％（１２分）→１００％（２０分）
　流速：０．８ｍＬ／分　　カラム温度：４０℃
　検出波長：ＵＶ２４５ｎｍ
＜ＤＯＸＰの化学純度＞
　カラム：資生堂製　Ｃａｐｃｅｌｌ　Ｐａｋ　Ｃ１８　ＭＧ（４．６ｍｍ×７５ｍｍ、３μｍ）
　移動相：Ａ：水／酢酸／酢酸アンモニウム＝１０００／１００／７．７（ｍＬ／ｍＬ／ｇ）Ｂ：ＴＨＦ
　グラジエントプログラム（Ｂ濃度）：３８％（０分）→３８％（１７分）→８０％（２７分）
　流速：１ｍＬ／分　　カラム温度：４０℃
　検出波長：ＵＶ２５４ｎｍ
＜ＤＯＬＰの化学純度＞
　カラム：資生堂製　Ｃａｐｃｅｌｌ　Ｐａｋ　Ｃ１８　ＭＧＩＩＩ－Ｈ（２．０ｍｍ×１００ｍｍ、３μｍ）
　移動相：Ａ：０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム／エタノール＝３／２（ｍＬ／ｍＬ）Ｂ：０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム／エタノール＝１／４（ｍＬ／ｍＬ）
　グラジエントプログラム（Ｂ濃度）：０％（０分）→０％（１０分）→１００％（２５分）→１００％（３０分）
　流速：０．３ｍＬ／分　　カラム温度：４０℃
　検出波長：ＵＶ２４５ｎｍ
＜ＰＴＶ－Ｃａの化学純度＞
　カラム：インタクト社製　Ｕｎｉｓｏｎ　ＵＫ－Ｃ１８（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、３μｍ）
　移動相：Ａ：０．１％ギ酸水溶液　Ｂ：アセトニトリル
　グラジエントプログラム（Ｂ濃度）：２５％（０分）→３５％（２０分）→９０％（３０分）→９０％（３５分）
　流速：１．０ｍＬ／分　　カラム温度：４０℃
　検出波長：ＵＶ３３１ｎｍ
＜ＲＳＶ－Ｃａ中のＤＥＮＫ分析＞
カラム：インタクト社製　Ｃａｄｅｎｚａ　ＣＤ－Ｃ１８（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、３μｍ）
　移動相：Ａ：０．１％ギ酸水溶液　Ｂ：０．１％ギ酸を含むメタノール
　グラジエントプログラム（Ｂ濃度）：６０％（０分）→７５％（１２分）→１００％（２０分）
　流速：０．８ｍＬ／分　　カラム温度：４０℃
　検出器：ＭＳ　（極性：ポジティブ　モード：ＳＩＭ　フラグメンター：２００　ドライガス流量：５Ｌ／ｍｉｎ　ネブライザー：４０ｐｓｉ　ドライガス温度：２５０℃　ベポライザー温度：１５０℃）
［参考例１］
（ＤＨＡＢの合成）
［工程１］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000066
　窒素雰囲気下、１０Ｌのフラスコにメルドラム酸（Meldrum's acid）９００．１ｇ（６．２４ｍｏｌ）とクロロベンゼン４５３２．１ｇを仕込み、撹拌開始後、内温を２０℃に調整した。混合液にトリエチルアミン６３１．９ｇ（６．２４ｍｏｌ）を２５分かけて滴下した。３０分間撹拌した後、混合液にジケテン（ＤＫ）５５７．８ｇ（６．８６ｍｏｌ）を２時間かけて滴下した。内温２２℃で１．５時間撹拌した後、反応混合物に、３５％塩酸６５１．４ｇと水１７９９．９ｇとの混合液を１時間２０分かけて滴下した。有機層を分離後、有機層を水で洗浄した。得られた有機層を乾燥したＳＫ１Ｂ（Ｈ型イオン交換樹脂、三菱化学社製）で乾燥させた。
　乾燥終了後、有機層をろ過して次の工程にて使用した。
［工程２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000067
　窒素雰囲気下、前工程で得られた有機層を１０Ｌのフラスコに仕込んだ後、ｔｅｒｔ－ブタノール５５５．４ｇ（７．４８ｍｏｌ）を添加した。混合物を内温６０℃まで昇温した。７時間撹拌した後、反応液を室温まで冷却した。反応液に７％炭酸水素ナトリウム水溶液１３２５．８ｇを添加した後、反応混合物をろ過した。その後、有機層を分離し、得られた有機層を水で洗浄した。有機層は６０℃において有機溶媒が留出しなくなるまで濃縮を行った。
　残渣を薄膜蒸留装置（圧力：５０Ｐａ～８０Ｐａ、熱媒温度：１１０℃）で精製した。得られた３，５－ジオキソ－ヘキサン酸ｔｅｒｔ－ブチルエステル（以下、「ＤＨＡＢ」と称する場合がある。）は８９３ｇ（収率：６９％）で、ＨＰＬＣ純度は９２．１面積％であった。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，互変異性体の混合物）δ１．４３－１．４９（９Ｈ，ｍ），２．０７（２．５Ｈ，ｓ），２．２５（０．５Ｈ，ｓ），３．２４（１．７Ｈ，ｓ），３．４６（０．３Ｈ，ｓ），３．７３（０．３Ｈ，ｓ），５．６１（０．７Ｈ，ｓ）
［合成例１］
（ＤＯＸＰの製造）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000068
　反応釜に、窒素雰囲気下、参考例１に記載の方法で合成したＤＨＡＢ２０．５ｋｇ（１０３ｍｏｌ）にテトラヒドロフラン７５Ｌを加えた溶液を調製した。得られた溶液を、５時間かけて水素化ナトリウムのテトラヒドロフラン溶液に滴下し、０℃～５℃で１時間撹拌した（以下、「反応液Ａ」とする）。
　別の反応釜に、窒素雰囲気下で、水素化ナトリウム８．２８ｋｇ（純度６１．９％，２１４ｍｏｌ）及びテトラヒドロフラン７５Ｌを仕込み、内温が０℃～５℃になるまで冷却した。そこに、４－（４－フルオロフェニル）－５－ホルミル－６－イソプロピル－２－［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン（以下、「ＡＬＤ」と称する場合がある。）１４．９ｋｇ（４２．４ｍｏｌ）とメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル１５０Ｌを仕込み、０℃～５℃まで冷却した。得られたスラリーに、上述の方法で得られた反応液Ａを、内温０℃～５℃となるように制御しながら滴下した。滴下終了後、２時間かけて内温２０℃～２５℃まで昇温し、２０℃～２５℃で２時間撹拌した。ＨＰＬＣで分析した結果、ＡＬＤからＤＯＸＢ（（Ｅ）－７－[４－（４－フルオロフェニル）－６－イソプロピル－２－［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン－５－イル]－３，５－ジオキソ－６－ヘプテン酸ｔ－ブチルエステル）への転化率は９９．３％であった。
　反応終了後、内温が２０℃以下になるまで冷却し、２０℃以下を維持したまま水１５０Ｌを滴下した。滴下終了後、分液により水層を抜き出した。続いて２％水酸化ナトリウム水溶液７５．０ｋｇ（ＮａＯＨ　１．５ｋｇ，水７３．５ｋｇ）、１０％クエン酸水溶液７５．０ｋｇ（クエン酸７．５ｋｇ，水６７．５ｋｇ）、２％ＮａＣｌ水溶液７５．０ｋｇ（ＮａＣｌ　１．５ｋｇ，水７３．５ｋｇ）の順で有機層を洗浄した。得られた有機層をＨＰＬＣで定量分析した結果、収率８３％でＡＬＤからＤＯＸＢが得られていることがわかった。
　得られた有機層を、外温３５℃で全量が３０Ｌとなるまで減圧濃縮した。得られた残渣にｎ－プロパノール７５Ｌを添加し、外温４０℃で全量が３０Ｌとなるまで減圧濃縮した。
　その後、得られた残渣にｎ－プロパノール３８Ｌを加え、内温９７℃で８時間反応させた。得られた溶液を、ＨＰＬＣにより分析した結果、ＤＯＸＢからＤＯＸＰへの転化率は９９％であった。
　得られた溶液を、内温６０℃で減圧濃縮を行ない、溶液量を４５Ｌまで濃縮した。その後、内温４５℃まで冷却し、同温度でＤＯＸＰの種晶を投入した。４時間かけて０℃～５℃まで冷却し、固液分離によりＤＯＸＰの結晶を回収した。得られた結晶のＨＰＬＣ純度は９８．１面積％であった。
　１２０Ｌ反応器に、得られた結晶及びメタノール５０Ｌを仕込み、昇温して均一な溶液とした。結晶が全て溶解したことを確認した後、４５℃に内温を調整し、ＤＯＸＰの種晶を投入した。その後、４時間かけて０℃～５℃まで冷却し、固液分離により結晶を回収した。得られた結晶を減圧乾燥してＤＯＸＰを得た。得られたＤＯＸＰのＨＰＬＣ純度は９９．０面積％であり、回収量は１４．０ｋｇ（収率６３％）であった。
（菌体の調製）
［カルボニル還元酵素（ＯＣＲ１）、グルコース－１－デヒドロゲナーゼ（以下、ＧＤＨ）を共発現した組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＶ３２ＯＣＲ１－ＧＤＨの調製例］
（１） 遺伝子のクローニング
　オガタエア・ミヌタ　変種ノンファーメンタス（Ｏｇａｔａｅａ　ｍｉｎｕｔａ　ｖａｒ．　ｎｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）ＮＢＲＣ（旧ＩＦＯ）１４７３由来のＯＣＲ１（特許第４２７０９１８号、配列番号２）をコードする遺伝子配列（ｏｃｒ１）を元に、ｏｃｒ１遺伝子の全長を増幅させるためのプライマーｏｃｒ１＿Ｆ（配列番号３）とｏｃｒ１＿Ｒ（配列番号４）を設計、合成した。続いて、オガタエア・ミヌタ　変種ノンファーメンタス（Ｏｇａｔａｅａ　ｍｉｎｕｔａ　ｖａｒ．　ｎｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）の染色体ＤＮＡを鋳型とし、常法に従ってＰＣＲを行い、約０．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。
　次に、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＬ００９１２６．３）がコードするグルコース－１－デヒドロゲナーゼにおいて９６番目のアミノ酸残基のグルタミン酸をアラニンに置換したＧＤＨ（配列番号６）をコードする遺伝子配列（以下、ｇｄｈ（配列番号５））に対し、ｇｄｈの遺伝子の全長を増幅させるためのプライマーｇｄｈ＿Ｆ１（配列番号７）とｇｄｈ＿Ｒ１（配列番号８）を設計、合成した。続いて、常法に従ってＰＣＲを行い約０．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。
（２）発現用プラスミドの調製
　上記（１）で得られたｏｃｒ１のＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ、及びＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、ＭｕｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより消化した特開２００５－３４０２５号公報に記載のプラスミドｐＫＶ３２にＬｉｇａｔｉｏｎ－Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ　Ｋｉｔ（ニッポンジーン社製）を用いてｔｒｃプロモーターの下流に導入し、ｐＫＶ３２ＯＣＲ１を得た。
　次に、上記（１）で得られたｇｄｈのＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ、及びＸｂａＩにより消化し、ＭｕｎＩ及びＸｂａＩにより消化したプラスミドｐＫＶ３２にＬｉｇａｔｉｏｎ－Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ　Ｋｉｔ（ニッポンジーン社製）を用いてｔｒｃプロモーターの下流に導入し、ｐＫＶ３２ＧＤＨを得た。
　さらに、ｐＫＶ３２ＧＤＨを鋳型として、制限酵素サイトＨｉｎｄＩＩＩを付加したプライマーｇｄｈ＿Ｆ２（配列番号９）とｇｄｈ＿Ｒ２（配列番号１０）でＰＣＲを行い、得られたフラグメントを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化して、あらかじめ制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドｐＫＶ３２ＯＣＲ１の下流に挿入し、ｐＫＶ３２ＯＣＲ１－ＧＤＨを得た。得られたプラスミドにおけるｇｄｈ遺伝子の向きはＰＣＲにより確認した。
（３）発現株の調製
　上記（２）で得られたプラスミドｐＫＶ３２ＯＣＲ１－ＧＤＨを用いて、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（タカラバイオ株式会社製）を常法に従い形質転換し、組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＶ３２ＯＣＲ１－ＧＤＨを得た。
（ＤＯＬＰの合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000069
（１）バイオ反応
　１ｍ３の反応槽に、イオン交換水２００Ｌ、含水グルコース１１０.９４ｋｇ、リン酸水素二カリウム２．１３ｋｇ及びリン酸二水素カリウム４．２５ｋｇを仕込み、溶解させた。次に、上記で得られた組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＶ３２ＯＣＲ１－ＧＤＨの凍結菌体５２．７ｋｇと、イオン交換水３Ｌに溶解させたＮＡＤＰ+０．１４４ｋｇを仕込み、懸濁させた。そこに、ＤＭＳＯ　９６．０ｋｇに溶解させたＤＯＸＰ　１０．０ｋｇ（１９．２ｍｏｌ）を添加し、内温４５℃～５２℃で、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を滴下してｐＨを６．０に保持しながら、６時間撹拌した。反応終了後、９８％硫酸を用いてｐＨ５．０に調整し、内温６５℃で１時間撹拌した。得られたＤＯＬＰのＨＰＬＣ純度は９２．６０面積％であった。
　得られた反応液を遠心分離し、菌体と反応生成物からなる沈殿物を得た。得られた沈殿物を２０％メタノール水溶液５０２Ｌに懸濁させ、遠心分離した。
（２）ＤＯＬＰ抽出
　上記で得られた沈殿物を５％硫酸ナトリウム水溶液１０５．３ｋｇに懸濁した後、酢酸エチルによる抽出を３回繰り返し、得られた抽出液を混合して減圧濃縮した。得られた濃縮液を、４％硫酸ナトリウム水溶液１０４ｋｇで洗浄後、分液した。得られた有機層を濾過後、再度、減圧濃縮した。得られたＤＯＬＰ／酢酸エチル溶液は１３２．８ｋｇであり、ＤＯＬＰの含有量は７．０ｋｇ（回収率７０％、ＨＰＬＣ純度は９４．１３面積％）であった。
（３）ＤＯＬＰ晶析
　上記の方法で得られたＤＯＬＰの酢酸エチル溶液（ＤＯＬＰ　６．７ｋｇ含有）を減圧濃縮した。得られた残渣に１－プロパノール５１．５ｋｇを添加後、再度、減圧濃縮した。その後、水２５．６ｋｇを添加し、温度を１０℃まで冷却した。ＤＯＬＰ種晶を添加して結晶を析出させた後、水１２．８ｋｇを追加し、析出した結晶を固液分離により回収した。得られたＤＯＬＰの純度は９８．８０面積％であり、乾燥することなく次の結晶化を実施した。
　上記で得られた湿結晶に、窒素雰囲気下でトルエン４８．１ｋｇを添加した。得られた混合物を４５℃まで昇温した後、分液して水層を除去した。分液後、減圧濃縮を実施した。温度を４０℃に調整した後、ＤＯＬＰ種晶を添加するとＤＯＬＰが析出した。温度を０℃まで冷却後、固液分離により結晶を回収した。結晶は予め５℃まで冷却したトルエン２．４ｋｇにて洗浄した。得られたＤＯＬＰの純度は９８．８７面積％であり、乾燥することなく次の結晶化を実施した。
　上記で得られた湿結晶に、窒素雰囲気下でトルエン３１．７ｋｇを添加した。得られた混合物を６２℃まで昇温し、ＤＯＬＰを溶解させた。溶液を４０℃まで冷却したのち、ＤＯＬＰ種晶５．２ｇを添加し結晶化させた。その後、トルエン９ｋｇを追加した。温度を０℃まで冷却後、固液分離により結晶を回収した。結晶は予め５℃まで冷却したトルエン２．２ｋｇにて洗浄した。得られたＤＯＬＰの純度は９９．５８面積％であり、乾燥することなく次の結晶化を実施した。
　上記の方法を２回繰り返し、得られた結晶を減圧乾燥して回収した。乾燥後のＤＯＬＰの重量は３．４１ｋｇ（通算回収率４８％）であり、純度は９９．８６面積％であった。
（ＲＳＶ－Ｃａの合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000070
　窒素雰囲気下、上記で得られた（（３Ｒ），（５Ｓ），（６Ｅ））－７－[４－（４－フルオロフェニル）－６－イソプロピル－２－［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン－５－イル]－３，５－ジヒドロキシ－６－ヘプテン酸ｎ－プロピルエステル（ＤＯＬＰ）２．９９ｋｇ（５．７１ｍｏｌ）とメチルｔ－ブチルエーテル１１．１ｋｇを反応容器に仕込み、脱塩水２９．０ｋｇを添加した。得られたスラリーに２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液３．４７ｋｇ（６．４２ｍｏｌ）を内温２５℃～２８℃で１０分間かけて滴下した。３．５時間撹拌した後、分液して得られた水層にメチルｔ－ブチルエーテル１１．１ｋｇを添加した。得られた溶液を３０分間撹拌した後、再度、有機層を分離して除去し、水層を液量２４Ｌとなるまで減圧濃縮した。得られた溶液を内温２５℃～２８℃に調整し、１０％塩化カルシウム水溶液６．９２ｋｇ（６．２２ｍｍｏｌ）を１時間かけて滴下した。得られたスラリーを、内温２５℃～２８℃で１時間撹拌し、－１０℃／時間の速度で０℃～５℃まで冷却した後、同温で１４０分間熟成させ、析出した結晶をろ取した。回収した結晶を温度４０℃、減圧下で乾燥させた。
　得られた結晶は２．１４ｋｇ（収率７５％）で、水分を２．９％含んでいた。ＨＰＬＣで分析した結果、得られたＲＳＶ－Ｃａの結晶の化学純度は９９．９３面積％、光学純度は１００％ｅ．ｅ．であった。
　得られたＲＳＶ－Ｃａの結晶を分析した結果を以下に示す。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１．１２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），１．２３（１Ｈ，ｍ），１．４５（１Ｈ，ｍ），１．９３（１Ｈ，ｍ），２．０７（１Ｈ，ｍ），３．３７－３．３０（４Ｈ，ｍ），３．４２（３Ｈ，ｓ），３．７０（１Ｈ，ｂｒｓ），４．１３（１Ｈ，ｂｒ ｓ），４．９９（１Ｈ，ｂｒ ｓ），５．４５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１６．０Ｈｚ），５．７５（１Ｈ，ｂｒ ｓ），６．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ），７．２０（２Ｈ，ｍ），７．６３（２Ｈ，ｍ）
（ＲＳＶ－Ｃａの精製）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000071
　窒素雰囲気下、得られたＲＳＶ－Ｃａ１０．０ｇ（２０．０ｍｍｏｌ）、精製水３０．０ｇ、メチルｔ－ブチルエーテル３７．３ｇを反応容器に仕込み、撹拌開始後、内温を０℃～５℃に調製した。得られたスラリーに１ｍｏｌ／Ｌ塩酸２２．０ｇ（２１．６ｍｍｏｌ）を１時間かけて滴下し、次いで、１時間撹拌し、得られたＤＯＬＡを有機層に抽出した。その後、分液して得られた有機層に精製水２０．０ｇを加え、２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液１１．０ｇ（２０．４ｍｍｏｌ）を１０分間かけて滴下した。次いで、５分間撹拌した後、分液して有機層を除去した。得られた水層のｐＨを１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を用いて８．７に調整し、減圧濃縮した後、精製水を用いて全量が８０ｍＬとなるように調整した。内温を２３℃～２８℃に調整した後、そこに、０．１７ｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム水溶液２３．２ｇ（２１．８ｍｍｏｌ）を１．５時間かけて滴下した。得られたスラリーを２３～２８℃で１時間撹拌し、－１０℃／時間の速度で０℃～５℃まで冷却した後、０℃～５℃で１時間熟成させ、析出した結晶をろ取した。回収した結晶を温度５０℃、減圧下で乾燥させた。
　得られた結晶の重量は８．９３ｇ（収率８９％）であり、水分を５．６％含んでいた。ＨＰＬＣで分析した結果、得られたＲＳＶ－Ｃａの結晶の化学純度は９９．９３面積％であった。
［合成例２］
（ＲＳＶ－Ｃａの空気酸化）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000072
　合成例１で得られたＲＳＶ－Ｃａ１５．０ｇ（２９．９ｍｍｏｌ）を反応容器に仕込み、空気存在下、外温８０℃で加熱し、２４時間撹拌した。室温まで冷却した後、ＲＳＶ－Ｃａ１４．７ｇを回収した。
　ＨＰＬＣで分析した結果、得られたＲＳＶ－Ｃａの結晶の化学純度は９９．４７面積％であり、３－ＭＯＬＡの含量は０．２９面積％であった。
［合成例３］
（ＤＯＬＰの酸化）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000073
　合成例１と同様の方法で合成した（（３Ｒ），（５Ｓ），（６Ｅ））－７－[４－（４－フルオロフェニル）－６－イソプロピル－２－［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン－５－イル]－３，５－ジヒドロキシ－６－ヘプテン酸ｎ－プロピルエステル（ＤＯＬＰ）７．３０ｇ（１３．９ｍｍｏｌ）と塩化メチレン４６．４ｇを反応容器に仕込み、二酸化マンガン２２．０ｇを加えて内温３５℃で３．５時間撹拌した。次いで、二酸化マンガン７．０ｇを追加して２時間撹拌し、さらに、二酸化マンガン２．９ｇを追加して２時間撹拌した。その後、内温２５℃まで冷却してセライトろ過にて固形分を除去した。得られたろ液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘプタン／酢酸エチル）によって精製した。目的物を含むフラクションを減圧濃縮することにより、（（３Ｒ），（６Ｅ））－７－[４－（４－フルオロフェニル）－６－イソプロピル－２－［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン－５－イル]－３－ヒドロキシ－５－オキソ－６－ヘプテン酸ｎ－プロピルエステル（３－ＭＯＬＰ）を含むシロップ５．１４ｇ（３－ＭＯＬＰ含量４．７６ｇ，収率６６％）を得た。
　得られた化合物を分析した結果を以下に示す。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ０．９５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），１．３０（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），１．６４（２Ｈ，ｔｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，７．６Ｈｚ），２．５４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），２．７５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），３．３６（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），３．５２（３Ｈ，ｓ），３．５９（３Ｈ，ｓ），４．０８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），４．４９（１Ｈ，ｍ），６．１７（１Ｈ，ｄ, Ｊ＝１６．４Ｈｚ），７．１４（２Ｈ，ｍ），７．５９（２Ｈ，ｍ），７．６４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．４Ｈｚ）
［合成例４］
（３－ＭＯＬＡの分解）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000074
　窒素雰囲気下、合成例３で得られた（（３Ｒ），（６Ｅ））－７－[４－（４－フルオロフェニル）－６－イソプロピル－２－［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン－５－イル]－３－ヒドロキシ－５－オキソ－６－ヘプテン酸ｎ－プロピルエステル（３－ＭＯＬＰ）０．１２ｇ（０．２３ｍｍｏｌ）とエタノール２．５１ｇを反応容器に仕込み、そこへ脱塩水１．０４ｇを添加した。得られた溶液に２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液０．１２ｇ（０．２４ｍｍｏｌ）を添加し、外温２５℃にて３時間撹拌した後、外温を５０℃まで昇温してさらに２７時間撹拌した。そこに、さらに、２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液０．１２ｇ（０．２４ｍｍｏｌ）を追加し、１時間撹拌した後、精製水１．０６ｇと、メチルｔ－ブチルエーテル２．０５ｇを仕込み、分液した。得られた水層にメチルｔ－ブチルエーテル２．０５ｇを加え、再度分液した後、得られた２つの有機層を合わせて濃縮することにより、４－（４－フルオロフェニル）－６－イソプロピル－２－［メチル（メチルスルホニル）アミノ］－５－［（１Ｅ）－３－オキソ－１－ブテニル）］－ピリミジン（ＫＴＮＥ）０．０６ｇ（ＨＰＬＣで分析した化学純度９１．３面積％）を得た。
　得られた化合物を分析した結果を以下に示す。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．３０（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８），２．２５（３Ｈ，ｓ），３．３８（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．５２（３Ｈ，ｓ），３．５９（３Ｈ，ｓ），６．１６（１Ｈ，ｄ, Ｊ＝１６．４Ｈｚ），７．１４（２Ｈ，ｍ），７．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．４Ｈｚ），７．６０（２Ｈ，ｍ）
［合成例５］
（ＫＴＮＥの合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000075
　窒素雰囲気下、４－（４－フルオロフェニル）－５－ホルミル－６－イソプロピル－２－［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン（ＡＬＤ（市販品））３．０１ｇ（８．５４ｍｍｏｌ）とアセトン３０．０ｇを反応容器に仕込み、撹拌を開始した後、外温を５℃まで冷却した。１０％水酸化ナトリウム水溶液０．８０ｇ（２．０４ｍｍｏｌ）を４回に分けて添加した後、さらに、テトラブチルアンモニウムブロミド（ＴＢＡＢ）０．２９ｇ（０．８９ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液を外温１０℃まで昇温し、２０時間撹拌した後、酢酸０．１７ｇ（２．８０ｍｍｏｌ）で中和した。そこに、メチルｔ－ブチルエーテル１７６ｇ、精製水１００ｇを加えて生成物を有機層へと抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させた後、有機層を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン＝１：２）によって精製し、目的のフラクションを減圧濃縮して、ＫＴＮＥ　１．６５ｇ（収率４９％）を得た。
　本合成例により、合成例４で得られた化合物が、ＫＴＮＥであることを確認できた。
［比較例１］
　合成例１で得られたＲＳＶ－Ｃａを保管後、後述の実施例１に用いる直前にＨＰＬＣで分析した結果、化学純度９９．８６面積％、３－ＭＯＬＡの含有量０．０４面積％であった。
［実施例１］
（ＲＳＶ－Ｃａの精製）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000076
　合成例１で得られたＲＳＶ－Ｃａ１０．０ｇ（２０．０ｍｍｏｌ）、及び精製水４０．０ｇ、メチルｔ－ブチルエーテル４２．８ｇを反応容器に仕込み、撹拌開始後、内温を５℃～１０℃に調製した。得られた混合液に２ｍｏｌ／Ｌ塩酸水溶液１０．８ｇ（２１．６ｍｍｏｌ）を１０分間かけて滴下し、４時間撹拌した。分液して得られた有機層に精製水４０ｇを加え、２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液１１．０ｇ（２０．４ｍｍｏｌ）を１５分間かけて滴下した。内温を４５℃～５０℃まで昇温して２．５時間撹拌し、室温で分液した。得られた水層にメチルｔ－ブチルエーテル４２．８ｇを添加し、３０分間撹拌した後、分液した。得られた水層を、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸水溶液を用いてｐＨ８．３に調整した。得られた溶液を濃縮後、精製水を用いて全量が８０ｍＬとなるように調整し、内温２５℃にて０．１７ｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム水溶液２３．２ｇ（２１．８ｍｍｏｌ）を３０分間かけて滴下した。得られたスラリーを内温２５℃で１時間撹拌し、－１０℃／時間の速度で０℃～５℃まで冷却した後、同温で１時間熟成させ、析出した結晶をろ取した。回収した結晶を温度５０℃、減圧下で乾燥させた。
　得られた結晶は８．６６ｇ（収率８７％）であった。ＨＰＬＣで分析した結果、得られたＲＳＶ－Ｃａの結晶の化学純度は９９．９２面積％、ＲＳＶ－Ｃａ中の３－ＭＯＬＡの含有量は検出限界以下であった。
［比較例２］
　合成例１で得られたＲＳＶ－Ｃａを保管後、後述の実施例２に用いる直前にＨＰＬＣ分析した結果、化学純度は９９．７３面積％、３－ＭＯＬＡの含有量は０．１４面積％であった。
［実施例２］
（ＲＳＶ－Ｃａの精製）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000077
　窒素雰囲気下、精製水４０．０ｇと、メチルｔ－ブチルエーテル４２．８ｇとの混合液に、２ｍｏｌ／Ｌ塩酸水溶液１０．８ｇ（２１．６ｍｍｏｌ）を加えて、撹拌を開始した後、そこに、合成例１で得られたＲＳＶ－Ｃａ１０．０ｇ（２０．０ｍｍｏｌ）を４回に分けて添加した。その後、３時間撹拌してＲＳＶ－Ｃａを溶解させた後、分液して得られた有機層に精製水４０．０ｇを加えて撹拌した。そこに、２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液１１．０ｇ（２０．４ｍｍｏｌ）を５分間かけて滴下し、得られた溶液を内温５０℃まで昇温し、２．５時間撹拌した。室温まで冷却した後、分液した。得られた水層に再度メチルｔ－ブチルエーテル４２．８ｇを加えて３０分間撹拌した後、再度、有機層を除去した。得られた水層を減圧濃縮した後、精製水を用いて全量が８０ｍＬとなるように調整し、次いで、活性炭０．５ｇを添加して内温５０℃で１．５時間撹拌した。その後、活性炭をろ別し、内温を２５℃まで冷却した後、０．１７ｍｏｌ／Ｌ酢酸カルシウム水溶液２３．０ｇ（２１．８ｍｍｏｌ）を３０分間かけて滴下した。その後、２５℃で１時間撹拌し、－１０℃／時間の速度で０℃～５℃まで冷却した後、０℃～５℃で１時間熟成させ、析出した結晶をろ取した。回収した結晶を温度５０℃、減圧下で乾燥させた。
　得られた結晶は８．４０ｇ（収率８４％）であった。
　また、ＨＰＬＣで分析した結果、得られたＲＳＶ－Ｃａの結晶の化学純度は９９．９３面積％、ＲＳＶ－Ｃａ中の３－ＭＯＬＡの含有量は検出限界未満であった。
［実施例３］
（ＲＳＶ－Ｃａの精製）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000078
　窒素雰囲気下、反応容器に、合成例２で得られたＲＳＶ－Ｃａ１０．０ｇ（２０．０ｍｍｏｌ）と、精製水４０．０ｇと、メチルｔ－ブチルエーテル４２．８ｇを仕込み、撹拌開始後、内温を２５℃に調整した。得られた溶液に２ｍｏｌ／Ｌ塩酸１０．８ｇ（２１．６ｍｍｏｌ）を１０分間かけて滴下した後、４．５時間撹拌した。分液後、得られた有機層に精製水４０ｇを加え、そこに、２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液１１．０ｇ（２０．４ｍｍｏｌ）を５分間かけて滴下し、５分間撹拌した。その後、分液して得られた水層を４９℃まで昇温して６．５時間撹拌した。得られた溶液を内温が２５℃になるまで冷却し、メチルｔ－ブチルエーテル４２．８ｇを加えて１５分間撹拌した後、有機層を分離して除去した。得られた水層に、再度、メチルｔ－ブチルエーテル４２．８ｇを加えて１５分間撹拌し、分液した。得られた水層を濃縮し、０．２ｍｏｌ／Ｌの酢酸を用いて水層のｐＨを７．５に調整した。そこに、内温２５℃にて０．１７ｍｏｌ／Ｌ酢酸カルシウム水溶液２３．０ｇ（２１．８ｍｍｏｌ）を３０分間かけて滴下し、同温で１時間撹拌し、－１０℃／時間の速度で０℃～５℃まで冷却した後、０℃～５℃で１時間熟成させ、析出した結晶をろ取した。回収した結晶を温度５０℃、減圧下で乾燥させた。
　得られた結晶は８．９３ｇ（収率８９％）であった。
　また、ＨＰＬＣで分析した結果、得られたＲＳＶ－Ｃａの結晶の化学純度は９９．８６面積％、ＲＳＶ－Ｃａ中の３－ＭＯＬＡの含有量は検出限界以下であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000079
［実施例４］
（ＰＴＶ－Ｃａの精製）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000080
　窒素雰囲気下、反応容器に、ＰＴＶ－Ｃａ１．００ｇ（２．２７ｍｍｏｌ。本実施例に用いる直前にＨＰＬＣで分析した結果、化学純度９９．６６面積％、ＰＴＶ－３－ＭＯＬＡ－Ｃａの含有量０．２５面積％であった。）と、精製水４．００ｇと、メチルｔ－ブチルエーテル４．４１ｇを仕込み、撹拌開始後、外温を２５℃に調整した。得られた溶液に２ｍｏｌ／Ｌ塩酸１．２１ｇ（２．３８ｍｍｏｌ）を滴下した後、３０分間撹拌した。分液後、得られた有機層に精製水４．００ｇを加え、そこに、２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液１．２９ｇ（２．３８ｍｍｏｌ）を５分間かけて滴下し、５分間撹拌した。その後、分液して得られた水層を外温５０℃まで昇温して３時間撹拌した。得られた溶液を室温まで冷却し、メチルｔ－ブチルエーテル４．４１ｇを加えて１０分間撹拌した後、有機層を分離して除去した。得られた水層に、再度、メチルｔ－ブチルエーテル４．４１ｇを加えて１０分間撹拌し、分液した。得られた水層を濃縮し、精製水を用いて全量が１５．０ｍＬとなるように調整し、室温にて、０．１７ｍｏｌ／Ｌ酢酸カルシウム水溶液２３．０ｇ（２１．８ｍｍｏｌ）を５分間かけて滴下した。その後、室温で１時間撹拌し、－１０℃／時間の速度で０℃～５℃まで冷却した後、０℃～５℃で１時間熟成させ、析出した結晶をろ取した。回収した結晶を、温度４５℃、減圧下で乾燥させた。
　得られた結晶は０．７７ｇ（収率７７％）であった。
　また、ＨＰＬＣで分析した結果、得られたピタバスタチンカルシウム（以下、「ＰＴＶ－Ｃａ」と称する場合がある。）の結晶の化学純度は９９．８９面積％、ＰＴＶ－Ｃａ中のＰＴＶ－３－ＭＯＬＡの含有量は０．０１面積％であった。
［参考例２］
（ＲＳＶ－Ｃａの空気酸化）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000081
　合成例１で得られたＲＳＶ－Ｃａを、２つの褐色瓶（容積９ｍＬ）に０．１５ｇずつ量り取り、蓋をした。その後にそれぞれを室温又は冷蔵（４℃）で８１日間保存した。保存開始から３日目、１９日目、８１日目でサンプリングを行なった。
　各々のサンプルに含まれる、（（３Ｒ），（６Ｅ））－７－[４－（４－フルオロフェニル）－６－イソプロピル－２－［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン－５－イル]－３－ヒドロキシ－５－オキソ－６－ヘプテン酸カルシウム（３－ＭＯＬＡ（カルシウム塩））の含有量と、ＲＳＶ－Ｃａの含有量をＨＰＬＣで分析した。
　分析した結果を、図１に示す。８１日目におけるＲＳＶ－Ｃａの結晶の化学純度は、室温保存で９９．６３面積％、冷蔵保存で９９．９０面積％であり、３－ＭＯＬＡ－Ｃａの含有量は、室温保存では０．３１面積％、冷蔵保存では０．０２面積％であった。
　本発明の方法によれば、スタチン系化合物の純度を効率よく向上させることができ、高純度のスタチン系化合物を得ることができる。
　本出願は、日本で出願された特願２０１４－２０９４８１を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。

Claims (12)

  1. 　下記一般式（１）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    （式中、Ｒ１は、窒素含有複素環を含む基であり、Ｒ２は、炭素数１～４のアルキル基、アルカリ金属元素、アルカリ土類金属元素又は水素である。）
    で表される化合物を含むスタチン系化合物の精製方法であって、
    （Ａ）該一般式（１）で表される化合物を、下記一般式（２）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    （式中、Ｒ１は、前記と同義である。）
    で表される化合物に変換する工程
    を有することを特徴とする、スタチン系化合物の精製方法。
  2. 　前記工程（Ａ）の後、（Ｂ）前記一般式（２）で表される化合物を除去する工程を有することを特徴とする、請求項１に記載のスタチン系化合物の精製方法。
  3. 　前記工程（Ａ）を、溶媒の存在下、加熱することにより行なうことを特徴とする、請求項１又は２に記載のスタチン系化合物の精製方法。
  4. 　前記工程（Ａ）において、前記スタチン系化合物が、前記一般式（１）で表される化合物を０．０１面積％以上含有することを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載のスタチン系化合物の精製方法。
  5. 　前記工程（Ｂ）の後、（Ｃ）前記工程（Ｂ）で得られた化合物とカルシウム化合物とを反応させる工程を有することを特徴とする、請求項２～４のいずれか一項に記載のスタチン系化合物の精製方法。
  6. 　前記スタチン系化合物が、ロスバスタチン、ピタバスタチン、フルバスタチン及びこれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも一種であり、かつ、前記一般式（１）及び（２）におけるＲ１が、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    であることを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載のスタチン系化合物の精製方法。
  7. 　前記スタチン系化合物がロスバスタチン又はその塩であり、かつ、下記一般式（３）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
    （式中、Ｒ３は、アルカリ金属元素、アルカリ土類金属元素又は水素である。）
    で表される化合物をさらに含むことを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載のスタチン系化合物の精製方法。
  8. 　下記一般式（２）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
    （式中、Ｒ１は、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
    である。）で表される化合物を１ｐｐｍ以上１０００ｐｐｍ以下含有することを特徴とする、ロスバスタチンカルシウム。
  9. 　下記一般式（２）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
    （式中、Ｒ１は、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
    である。）で表される化合物を１ｐｐｍ以上１０００ｐｐｍ以下含有することを特徴とする、ピタバスタチンカルシウム。
  10. 　下記一般式（２）：

    （式中、Ｒ１は、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
    である。）で表される化合物を１ｐｐｍ以上１０００ｐｐｍ以下含有することを特徴とする、フルバスタチンナトリウム。
  11. 　下記一般式（２）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
    （式中、Ｒ１は、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
    である。）で表される化合物。
  12. 　スタチン系化合物の製造方法であって、該スタチン系化合物に含まれる下記一般式（２）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
    （式中、Ｒ１は、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
    である。）で表される化合物の存在量を測定する工程を有することを特徴とする、スタチン系化合物の製造方法。
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