JP6608605B2

JP6608605B2 - サーチュイン発現増強剤

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Publication number: JP6608605B2
Application number: JP2015066882A
Authority: JP
Inventors: 晋平川上; 洋輔木下; 裕子内田; 政彦斎
Original assignee: Morinaga and Co Ltd
Current assignee: Morinaga and Co Ltd
Priority date: 2014-04-25
Filing date: 2015-03-27
Publication date: 2019-11-20
Anticipated expiration: 2035-03-27
Also published as: JP2016041680A

Description

本発明は、サーチュイン発現増強剤に関する。

ピセアタンノールは、スチルベン類の化合物であって、例えば、トケイソウ科トケイソウ属（Passiflora）の果物であるパッションフルーツの種子に含まれており、シミ、ソバカス、日焼けなどによる色素沈着の原因となるメラニンの生成を抑制する効果があることが報告されている（特許文献１を参照）。

このピセアタンノールは、サーチュイン１タンパク質の活性を増強するという報告がある。サーチュイン（Sirtuin; SIRT）は、ヒトの場合、サーチュイン１〜７のメンバーを有する脱アセチル化酵素であるが、近年、サーチュインの機能に関する研究が盛んになり、特に、サーチュイン１は、抗老化作用、糖尿病改善作用、心血管保護作用、腎疾患改善作用、炎症性サイトカイン産生の抑制作用、神経保護作用等、様々な機能を有することが明らかになった。これらのサーチュイン１脱アセチル化活性を増強する因子として、レスベラトロールやケルセチンなどの化合物が注目され、抗老化剤（アンチ・エージング剤）、糖尿病治療薬、心血管疾患治療薬、神経系疾患治療薬、抗炎症剤などに利用すべく、活発な研究が行われている（例えば、非特許文献１参照）。

特開２００９−１０２２９８号公報

実験医学２０１０年２８巻１９号３０６８−３０７６頁

本発明は、サーチュイン遺伝子の転写産物レベル及び／又はサーチュインタンパク質レベルでの発現を増強する新規なサーチュイン発現増強剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、ピセアタンノールの機能を解明しようと、鋭意努力した結果、ピセアタンノールや誘導体がサーチュインの発現を増強することを見出し、本発明にいたった。

本発明の一実施態様は、ピセアタンノールまたは以下の構造式を有するピセアタンノールアルキル化誘導体を有効成分として含有する、サーチュイン発現増強剤である。
（式中、Ｒ^１〜Ｒ^６は、それぞれ独立に、−Ｈ、−ＯＨ及び−ＯＲ（Ｒはアルキル基）から選択される基であってＲはＣ１〜Ｃ６のいずれかである。）
前記サーチュインがサーチュイン１であってもサーチュイン２〜７のいずれかであってもよい。Ｒがメチル基であってもよい。前記サーチュイン発現増強剤がパッションフルーツ種子エキス、イソラポンチゲニンまたはラポンチゲニンであってもよい。
本発明の他の一実施態様は、ピセアタンノールまたは以下の構造式を有するピセアタンノールアルキル化誘導体を投与した動物個体から採取された細胞またはピセアタンノールまたは以下の構造式を有するピセアタンノールアルキル化誘導体を投与した細胞におけるサーチュイン遺伝子の転写産物またはサーチュインタンパク質の発現レベルを調べる、発現解析方法である。
（式中、Ｒ^１〜Ｒ^６は、それぞれ独立に、−Ｈ、−ＯＨ及び−ＯＲ（Ｒはアルキル基）から選択される基であってＲはＣ１〜Ｃ６のいずれかである。）前記細胞が白血球であってもよい。前記サーチュインがサーチュイン１であってもサーチュイン２〜７のいずれであってもよい。Ｒがメチル基であってもよい。前記サーチュイン発現増強剤がパッションフルーツ種子エキス、イソラポンチゲニンまたはラポンチゲニンであってもよい。

本発明によって、サーチュイン遺伝子の転写産物レベル及び／又はサーチュインタンパク質レベルでの発現を増強する新規なサーチュイン発現増強剤を提供することができるようになった。

本発明の一実施例において、ヒト末梢血単球細胞株（ＴＨＰ-１）にピセアタンノールまたはレスベラトロールを１−１０μＭの濃度で添加したときの、SIRT1遺伝子のmRNAレベルを示した図である。本発明の一実施例において、ヒト末梢血単球細胞株（ＴＨＰ-１）にピセアタンノールまたはレスベラトロールを６μＭ添加し、２、６、１５時間後のSIRT1 mRNA発現レベルを示した図である。本発明の一実施例において、ヒト末梢血単球細胞株（ＴＨＰ-１）にピセアタンノールまたはレスベラトロールを６μＭ添加し、２４時間後のSIRT1タンパク質発現レベルを示した図である。本発明の一実施例において、SIRT1発現増強能を調べた化合物の構造式を示した図である。

本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。

（１）サーチュイン発現増強剤
本発明の一実施形態は、サーチュイン発現増強剤であって、下記構造式（Ｉ）で示されるピセアタンノールまたはそのアルキル化誘導体を含有することを特徴とする。アルキル化誘導体は、メチル化誘導体であることが好ましい。

なお、本明細書で、限定せずに「ピセアタンノールまたはその誘導体」と表記した場合、本構造式（Ｉ）のトランス体をいうものとする。

（式中、Ｒ^１〜Ｒ^６は、それぞれ独立に、−Ｈ、−ＯＨ及び−ＯＲ（Ｒはアルキル基）から選択される基である。）
なお、置換基Ｒに関して、様々な態様が考えられるが、Ａ）〜Ｃ）が好ましい。

Ａ）ＲはＣ１〜Ｃ１２のいずれかである。

Ｂ）ＲはＣ１〜Ｃ６のいずれかである。

Ｃ）ＲはＣ１のメチル基である。

また、Ｒ^１〜Ｒ^６に関しても、様々な組み合わせが考えられるが、１）〜６）が好ましい。

１）Ｒ^１〜Ｒ^３のいずれも−ＯＲである。

２）Ｒ^１〜Ｒ^３のうち、いずれか一つは−Ｈであって、残りの二つは−ＯＲである。

３）Ｒ^１〜Ｒ^３のうち、Ｒ^３は−Ｈであって、残りの二つは−ＯＲである。

４）Ｒ^４〜Ｒ^６のいずれも−ＯＲである。

５）Ｒ^４〜Ｒ^６のうち、いずれか一つは−Ｈであって、残りの二つは−ＯＲである。

６）Ｒ^４〜Ｒ^６のうち、Ｒ^６は−Ｈであって、残りの二つは−ＯＲである。

ここで、本明細書では、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^６が−ＯＨであって、Ｒ^３が−Ｈであって、Ｒ^４とＲ^５のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである化合物をピセアタンノールと呼ぶ。また、ＲはＣ１のメチル基であって、Ｒ^１〜Ｒ^３のうち、いずれか一つは−Ｈであって、残りの二つは−ＯＲであって、Ｒ^４〜Ｒ^６のうち、いずれか一つは−Ｈであって、残りの二つは−ＯＲである場合（上記選択肢において、Ｃ／２／５の組み合わせ）を、ピセアタンノールのメチル化誘導体と呼ぶ。また、ＲはＣ１〜Ｃ６のアルキル基であって、Ｒ^１〜Ｒ^３のうち、いずれか一つは−Ｈであって、残りの二つは−ＯＲであって、Ｒ^４〜Ｒ^６のうち、いずれか一つは−Ｈであって、残りの二つは−ＯＲである場合（上記選択肢において、Ｂ／２／５の組み合わせ）を、ピセアタンノールのアルキル化誘導体と呼ぶ。

本明細書では、「サーチュイン」という用語が単独で用いられた場合、すべてのサーチュインタンパク質およびそのホモログであるサーチュインタンパク質の総称を表すものとする。サーチュインの由来の動物は特に限定されず、ヒトであっても、ヒト以外の脊椎動物であっても、ヒト以外のほ乳類であってもよい。ヒトの場合、サーチュイン1〜7のいずれであってもよい。本発明で発現増強させる対象としては、サーチュイン1が好ましく、ヒトサーチュイン１が最も好ましい。そして、「サーチュイン遺伝子」とは、サーチュインをコードする遺伝子のことを言う。

本明細書で、「サーチュイン発現」とは、サーチュイン遺伝子の転写産物レベルでの発現とサーチュインタンパク質レベルでの発現を総称するものとする。

本明細書で、「サーチュイン発現増強」とは、サーチュイン遺伝子の転写産物（サーチュイン転写産物とも称する）及び／又はサーチュインタンパク質が増えることであって、例えば、遺伝子の転写及び／又は翻訳の活性化、転写産物及び／又はタンパク質の安定性の向上、転写産物及び／又はタンパク質分解の阻害などのメカニズムは問わないものとする。従って、「サーチュイン発現増強剤」とは、そのメカニズムに関わらず、サーチュイン遺伝子の転写産物レベル及び／又はサーチュインタンパク質レベルを亢進させることができる薬剤をいう。

サーチュイン発現増強剤の剤形は特に限定されないが、ピセアタンノールを含むパッションフルーツ種子エキスなどであっても、精製されたピセアタンノールがバッファーに溶解された溶液であってもよく、その中に、適量の塩やキレート剤を含有してもかまわない。

（２）パッションフルーツ種子エキスの製造方法
パッションフルーツ種子エキスの具体的な製造方法として、公知の方法を用いることができ、例えば、パッションフルーツ種子を、乾燥した後に、破砕、粉砕、または、切断などによって種子分解物を得、溶媒を用いて抽出し、残渣を除去することによって抽出液を得、さらに、抽出液から溶媒を除去することによって、抽出物を得ることができる。この段階のいずれのものも、本発明のパッションフルーツ種子エキスとして使用することができる。

抽出に用いる溶媒の種類は、当業者であれば適切に選択することができるが、例えば、水、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチル、グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、２−プロパノール、１，４−ジオキサン、ヘキサン、クロロホルム、ジクロロメタン、または、これらから選択される２以上の溶媒の混合溶媒であっても良く、水、エタノール、１，３−ブチレングリコール、または、これらから選択される２以上の溶媒の混合溶媒であることが好ましく、水、エタノール、または、水およびエタノールの混合溶媒であることがより好ましい。混合溶媒を用いる場合の、各溶媒の混合比は特に限定されないが、例えば水およびエタノールの混合溶媒を用いる場合には、水とエタノールとの体積比は、１：９９〜９９：１であっても良く、３：９７〜８０：２０であることが好ましく、５：９５〜５０：５０であることがより好ましく、１０：９０〜４０：６０であることが特に好ましい。

溶媒として、水、または、水との混合溶媒を用いる場合には、熱水、または、熱水との混合溶媒であることが好ましい。水、または、水との混合溶媒は塩を含んでいても良く、塩を含む溶媒の例として、バッファー（緩衝液）であっても良い。バッファーのｐＨは、特に限定されず、酸性、中性、または、アルカリ性のいずれであっても良いが、酸性であることが好ましく、ｐＨ６以下の酸性であることがより好ましく、ｐＨ１〜ｐＨ５の酸性であることがさらに好ましい。バッファーに用いる塩の種類は特に限定されず、例として、クエン酸塩、リンゴ酸塩、リン酸塩、酢酸塩および炭酸塩などが挙げられる。

抽出液から溶媒を除去する方法は、特に限定されず公知の方法を用いることができる。例えば、減圧留去、凍結乾燥、または、スプレードライ（噴霧乾燥）であっても良いが、凍結乾燥、または、スプレードライであることが好ましく、スプレードライであることがより好ましい。

抽出物の形状は、特に限定されず、例えば粉体などの固体状、アモルファス状、または、オイル状であっても良い。

（３）サーチュイン発現増強方法
本発明の一実施形態は、サーチュイン発現を増強する方法であって、サーチュイン遺伝子、そのプロモーター、転写産物、及びタンパク質からなる群から選択される少なくとも一つに、ピセアタンノールまたはそのアルキル化誘導体を投与する工程を含む。アルキル化誘導体は、メチル化誘導体であることが好ましい。

この工程が行われるのは、in vitroであっても、in vivoであってもかまわない。また、ピセアタンノールまたはそのアルキル化誘導体が作用する対象であるサーチュイン遺伝子、そのプロモーター、転写産物、及び／又はタンパク質は、細胞内にあっても細胞外にあってもよい。

in vitroで細胞外にある場合、細胞抽出液中にあってもよく、単離された後に再構成されたin vitro転写系の中にあってもよい。

細胞内にある場合、ピセアタンノールまたはそのアルキル化誘導体が作用する対象であるサーチュイン遺伝子、そのプロモーター、転写産物、及び／又はタンパク質は、外来性でも内在性でもよい。in vitroで用いられる細胞は、生体外にあればよく、培養条件下にあることが好ましいが、ライン化されていても、初代培養細胞であってもよく、あるいは培養組織中の細胞であってもかまわない。in vivoで細胞内にある場合は、すなわち生体内にある。ピセアタンノールまたはそのアルキル化誘導体が作用する対象であるサーチュイン遺伝子、そのプロモーター、転写産物、及び／又はタンパク質が由来する動物種と、細胞が由来する動物種は、異なっていてもかまわないが、同じであることが好ましい。細胞は、特に限定されないが、白血球であることが好ましく、単球であることがより好ましい。

これらの系の中にあるサーチュイン遺伝子、そのプロモーター、転写産物、及び／またはタンパク質、に対し、ピセアタンノールまたはそのアルキル化誘導体が投与される。この化合物は、用いる系にあわせて（１）で述べたように剤形化されていてもよい。この化合物の濃度は、用いる系によって、実施者が適宜、容易に決定することができる。投与方法も、用いる系によって、実施者が適宜、容易に決定することができる。例えば、培養細胞の場合、培養細胞を培養している培地に、適量を添加すればよい。生体内の細胞の場合、ピセアタンノールは個体に投与される。投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択することができる。この場合、疾患、症状などに応じた適当な投与経路を選択する。本発明に係る薬剤は、経口経路、非経口経路のいずれによっても投与できる。非経口経路としては、通常の静脈内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内などへの投与を挙げることができる。さらに、経粘膜投与または経皮投与を実施することができる。

ここで述べた方法によって、ピセアタンノールまたはそのアルキル化誘導体を通じて、サーチュイン発現を増強することができる。

（４）サーチュイン発現測定方法
サーチュイン発現を測定する方法は、ピセアタンノールまたはそのアルキル化誘導体を用いてサーチュイン発現を増強する工程と、サーチュイン転写産物及び／又はサーチュインタンパク質を検出する工程と、を含む。

ピセアタンノールまたはそのアルキル化誘導体を用いてサーチュイン発現を増強する工程は、（３）で述べたように行う。

その後、サーチュイン転写産物及び／又はサーチュインタンパク質を検出する。転写産物は、転写後スプライシングが行われる前のｈｎＲＮＡであっても、スプライシングが行われた後のｍＲＮＡであってもかまわない。検出方法は特に限定されないが、ノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＴが好ましい。タンパク質の検出方法も特に限定されないが、ウエスタン・ブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ、ＲＩＡ、ＣＦ、ＣＬＩＡなどが例示できる。

この方法によって、ある特定の条件で、ピセアタンノールまたはそのアルキル化誘導体によって、サーチュイン発現がどのくらいのレベルで増強されるかを知ることができる。

（５）ピセアタンノール誘導体
ピセアタンノールまたはそのアルキル化誘導体は、サーチュイン発現増強能を有する。従って、これらの化合物をリード化合物として作製された誘導体に対し、サーチュイン発現増強能を調べれば、サーチュイン発現増強能を有する化合物を得られる確率が高くなる。そして、複数の誘導体を調べ、サーチュイン発現増強能を有する化合物をサーチュイン発現増強物質として特定することによって、サーチュイン発現増強能を有する化合物をスクリーニングすることができる。

ここで、ピセアタンノールまたはそのメチル化体をリード化合物として作製された誘導体は、特に限定されないが、上記構造式（Ｉ）において、Ａ／１〜３／４〜６、Ｂ／１／４〜５、Ｂ／１〜２／４のいずれかの組み合わせを有する化合物であることが好ましい。なお、水素やアルキル基は、ハロゲン、芳香環、などに任意に置換されてもよい。

（６）サーチュイン発現増強剤を含有する薬品
サーチュインは、老化予防（アンチ・エージング）作用、糖尿病改善作用、心血管保護作用、腎疾患改善作用、炎症性サイトカイン産生の抑制作用、神経保護作用等、様々な機能を有するため、生体内で、サーチュイン発現を増強し、サーチュインの体内濃度を上げることによって、抗老化作用、糖尿病改善作用、心血管保護作用、炎症性サイトカインの抑制作用、神経保護作用等を発揮させることができる。従って、サーチュイン発現増強剤は、アンチ・エージング（老化予防）剤、糖尿病治療剤及び予防剤、心血管疾患治療剤及び予防剤、神経系疾患治療剤及び予防剤、腎疾患治療剤及び予防剤、並びに抗炎症剤などに使用することができる。具体的な対象疾患としては、例えば、２型糖尿病などの糖尿病、動脈硬化、心筋梗塞などの心血管疾患、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、または認知症などの神経系疾患、ネフローゼまたは腎機能障害などの腎疾患、肺炎、肝炎、膵炎、潰瘍性大腸炎などの様々な炎症性疾患などを挙げることができる。特に、これらの対象疾患が、同時に複数生じるような、多臓器（心臓、肝臓、膵臓、腎臓など）の機能低下による全身性の疾患である「老年病」に対して有効に作用し、複数の疾患を一元的に治療または予防できるという点で、極めて有効である。このように、ピセアタンノールまたはその誘導体を有効成分として含有するサーチュイン発現増強剤は、高齢者医療のあり方を根本的に変えることが期待される。

なお、サーチュインは、NF-kappaB抑制作用を有するため、サーチュイン発現増強剤は、NF-kappaB抑制剤としても用いることができる。サーチュイン発現増強剤は、NF-kappaB抑制を通じて、ＮＯシグナルを活性化し、TNF-alfa、ICAM-1、IL-6、IL-1などの炎症性サイトカインや誘導型NOS(i-NOS)を抑制することができるので、心血管保護作用や抗炎症作用の少なくとも一部は、このNF-kappaB抑制作用によるものと考えられる。

（１）ピセアタンノールによるサーチュイン１発現増強（ＴＨＰ-１）
本実施例では、ピセアタンノールによってサーチュイン１発現が増強されることを示す。

ヒト末梢血単球細胞株（ＴＨＰ-１）を、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０で培養した。１ウエル当たり２ｘ１０^５個のＴＨＰ-１を６ウエルのプレートに播種し、一晩培養し、ピセアタンノール（Piceatannol; PIC）またはレスベラトロール（Resveratrol; RES）を１−１０μＭの濃度で添加した。

２、６、１５時間後、細胞からＲＮＡを回収し、ＲＴ−ＰＣＲによってサーチュイン１（SIRT1）遺伝子のmRNA量およびGAPDH遺伝子のmRNA量を測定した。そして、SIRT1mRNA発現レベルを標準化するため、SIRT1/GAPDH比を算出し、ピセアタンノール及びレスベラトロールを添加していない非刺激群（Control; Cont）を１とした場合の、各物質で刺激した場合の値を計算した。

図１に、ピセアタンノール及びレスベラトロールの各濃度に対し、６時間刺激後のSIRT1 mRNA発現レベルを示す。図２には、ピセアタンノールまたはレスベラトロールを６μＭ添加し、２、６、１５時間後のSIRT1 mRNA発現レベルを示す。

また、２４時間後、細胞からタンパク質を回収し、ウエスタン・ブロッティングによってサーチュイン１およびβ-actinタンパク質を検出した。そして、サーチュイン１タンパク質発現レベルを標準化するため、バンドの輝度を数値化してSIRT1/β-actin比を算出し、非添加群を1とした場合の値を計算し、図３にグラフ化した。

図１に示すように、６時間では、レスベラトロールに比べ、ピセアタンノールの方が、SIRT1 mRNA発現増強能が高く、そしてピセアタンノールの増強能は、添加したピセアタンノールの濃度に相関した。そして、図２に示すように、６μＭの濃度では、レスベラトロールに比べ、ピセアタンノールの方が早く、２時間でSIRT1 mRNA発現増強効果が現れた。こうしたSIRT1 mRNA発現増強効果は、図３に示すように、SIRT1タンパク質発現レベルにも反映されている。

このように、ピセアタンノールは、サーチュイン１発現を増強する機能を有する。

（２）ピセアタンノール誘導体によるSIRT1発現増強（ＴＨＰ-１）
ピセアタンノールをリード化合物として作製したピセアタンノール誘導体について、（１）と同様にして、SIRT1発現増強能を調べた。図４に、調べた化合物の構造式を示し、表１に各化合物のSIRT1 mRNA発現レベル(GAPDH mRNA発現レベルで標準化された値)を示す。

なお、各化合物は、以下のようにして合成した。

まず、trans-ピセアタンノール（１３１．９ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１．８ｍＬ）に溶解した後、酢酸ナトリウム（１７７．２ｍｇ、２．１６ｍｍｏｌ、４．０当量）とヨウ化メチル（２６０．６μＬ、４．３２ｍｍｏｌ、８．０当量）を加え、１００℃で５分間撹拌した。その後、ＯＤＳ−ＨＰＬＣにより分離・精製を行い、保持時間２４．７分に未反応のtrans-ピセアタンノール８５．５ｍｇ（回収率：６４．８％）を得、保持時間４２．９分にtrans−３−メトキシ−ピセアタンノール１１．３ｍｇ（収率：８．１％）を得、保持時間４５．１分に図４に示されるtrans−４−メトキシ−ピセアタンノール１８．０ｍｇ（収率：１２．９％）を得、保持時間５１．７分にtrans−３’−メトキシ−ピセアタンノール２．０ｍｇ（収率：１．４％）を、そして、保持時間５４．６分に図４に示されるtrans−３，４−ジメトキシ−ピセアタンノール１．５ｍｇ（収率：１．０％）を得た。また、trans-ピセアタンノール（５４ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５．４ｍＬ）に溶解後、太陽光に８時間露光させた後、ＯＤＳ−ＨＰＬＣにより分離・精製を行い、保持時間４９分にcis-ピセアタンノール１９．５ｍｇ（収率：３６．１％）を得た。trans-ピセアタンノール、trans-レスベラトロール、イソラポンチゲニン、ラポンチゲニン、3,3',4,5'-テトラメトキシ−ピセアタンノールは東京化成工業株式会社より入手した。

＜＜ＯＤＳ−ＨＰＬＣによる分離・精製の条件＞＞
カラム：ＭｉｇｈｔｙｓｉｌＲＰ−１８ＧＰ２０×２５０ｍｍ（粒子径：５μｍ）関東化学株式会社製
検出波長：２１０ｎｍ
流速：５．０ｍＬ／ｍｉｎ
展開溶媒：Ｈ_２Ｏ＋５％ＡｃＯＨ／ＭｅＣＮ＋５％ＡｃＯＨ
グラディエント：表２参照

得られたtrans−３−メトキシ−ピセアタンノール、trans−４−メトキシ−ピセアタンノール、trans−３’−メトキシ−ピセアタンノール、trans−３，４−ジメトキシ−ピセアタンノール、および、cis-ピセアタンノールは、それぞれ、^１Ｈ−ＮＭＲおよび^１３Ｃ−ＮＭＲの測定、並びに、質量分析によって、目的物であると同定した。

trans−３−メトキシ−ピセアタンノール
¹H-NMR (700 MHz, acetone-d₆): 3.88 (3H, s), 6.26 (1H, dd, J = 2.2, 2.2), 6.53 (2H, d, J = 2.2), 6.80 (1H, d, J = 7.9), 6.91 (1H, d, J = 16.4), 7.00 (1H, d, J = 16.4), 7.01 (1H, dd, J = 7.9, 1.9), 7.21 (1H, d, J = 1.9), 7.73 (1H, bs), 8.23 (2H, bs)
¹³C-NMR (175 MHz, acetone-d₆): 55.4, 101.8, 104.8, 104.8, 109.2, 115.1, 120.4, 126.2, 128.6, 129.6, 140.0, 146.7, 147.7, 158.7, 158.7
MS (ESI) m/z : 257.2 (M^-)
trans−４−メトキシ−ピセアタンノール
¹H-NMR (700 MHz, acetone-d₆): 3.83 (3H, s), 6.27 (1H, dd, J = 2.2, 2.2), 6.55 (2H, d, J = 2.2), 6.88 (1H, d, J = 16.1), 6.91 (1H, d, J = 8.5), 6.97 (1H, dd, J = 8.5, 1.9), 6.98 (1H, d, J = 16.1), 7.09 (1H, d, J = 1.9), 7.63 (1H, bs), 8.25 (2H, bs)
¹³C-NMR (175 MHz, acetone-d₆): 55.4, 101.9, 104.9, 104.9, 111.5, 112.4, 118.9, 126.8, 128.2, 130.9, 139.9, 146.7, 147.5, 158.7, 158.7
MS (ESI) m/z : 257.1 (M^-)
trans−３’−メトキシ−ピセアタンノール
¹H-NMR (700 MHz, acetone-d₆): 3.76 (3H, s), 6.29 (1H, dd, J = 1.8, 2.2), 6.61 (2H, bs), 6.80 (1H, d, J = 8.4), 6.86 (1H, d, J = 16.4), 6.90 (1H, dd, J = 8.4, 1.8), 7.01 (1H, d, J = 16.4), 7.08 (1H, d, J = 1.8), 8.18 (3H, bs)
¹³C-NMR (175 MHz, acetone-d₆): 55.6, 100.4, 103.1, 105.8, 113.0, 115.4, 119.2, 125.9, 128.9, 129.8, 140.0 145.3, 145.3, 158.7, 161.3
MS (ESI) m/z : 257.2 (M^-)
trans−３，４−ジメトキシ−ピセアタンノール
¹H-NMR (700 MHz, acetone-d₆): 3.81 (3H, s), 3.85 (3H, s), 6.27 (1H, dd, J = 2.2, 2.2), 6.54 (2H, d, J = 2.2), 6.92 (1H, d, J = 8.4), 6.95 (1H, d, J = 16.4), 7.02 (1H, dd, J = 16.4), 7.06 (1H, dd, J = 8.4, 1.8), 7.22 (1H, bd, J = 1.8), 8.22 (2H, bs)
¹³C-NMR (175 MHz, acetone-d₆): 55.2, 55.2, 101.9, 104.9, 104.9, 109.4, 111.8, 120.0, 126.8, 128.3, 130.6, 139.9, 149.5, 149.7, 158.8, 158.8
MS (ESI) m/z : 271.1 (M^-)
cis-ピセアタンノール
¹H-NMR (500 MHz, acetone-d₆):6.20 (1H, t, J = 1.9, Hz), 6.28 (2H, d, J = 1.9 Hz), 6.28 (1H, d, J = 12.3 Hz), 6.36 (1H, d, J = 12.3 Hz), 6.63 (1H, dd, J = 8.2, 1.9 Hz), 6.68 (1H, d, J = 8.2 Hz), 6.81 (1H, d, 1.9 Hz)
¹³C-NMR (125 MHz, acetone-d₆): 102.3, 107.9 (2C), 115.7, 116.5, 122.0, 128.9, 129.9, 130.7, 140.5, 145.3, 145.4, 159.2 (2C).
MS (ESI) m/z : 243.1 (M^-)
なお、パッションフルーツ種子エキスは、以下のようにして、抽出した。すなわち、パッションフルーツ種子を焙煎して粉砕し、これに８０％含水エタノール（８０ｖ／ｖ％エタノール＋２０ｖ／ｖ％水）を加えて混合、攪拌した後、濾過することで固液分離した。得られた抽出液をエバポレータで濃縮して、スプレードライによって粉末化してパッションフルーツ種子エキスとした。

表１に示すように、構造式（Ｉ）に含まれるピセアタンノールのメチル化誘導体及びパッションフルーツ種子エキスは、ピセアタンノールより強くSIRT1mRNA発現を増強する。

（３）ピセアタンノール及びその誘導体によるサーチュイン２〜７（SIRT2-7）mRNA発現増強
本実施例では、ピセアタンノールまたはその誘導体によってSIRT2-7遺伝子のmRNA発現が増強されることを示す。
ピセアタンノール(PIC)、イソラポンチゲニン(ISO)、ラポンチゲニン(RHA) （各６μＭ）による刺激時間を１５時間としたことと、ＰＣＲプライマーとして遺伝子特異的なものを用いたこと以外は、（１）と同じ条件でSIRT2-7を定量した。表３にコントロール（ＤＭＳＯ）の発現レベルを１．００としたときの、各刺激物質で得られた発現レベルの相対値を示す。
表３に示すように、ピセアタンノール、イソラポンチゲニン、ラポンチゲニンはそれぞれ、単球細胞内でSIRT2-7遺伝子のmRNA発現を増強させた。このように、ピセアタンノールまたはピセアタンノールアルキル化誘導体は、サーチュイン発現増強剤として有用である。

（４）ピセアタンノール及びイソラポンチゲニンによるSIRT1,SIRT2,SIRT7の発現増強（ＰＢＭＣ）
ヒト末梢血を採取し、Ficoll（登録商標） gradientを用いて抹消血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。得られたＰＢＭＣを、５％ＣＯ_２、３７^ｏＣの条件で、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを用いて１ウエル当たり2x10⁵ 個のＰＢＭＣを１２ウエルのプレートに播種し、１時間培養した。ピセアタンノールまたはイソラポンチゲニン２μＭの濃度で添加して１時間培養し、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）＋ＩＦＮγ（１ｎｇ／ｍＬ）を添加して、さらに培養した。陰性対照はピセアタンノール及びイソラポンチゲニンを添加しないものとして、他の条件は同様にして実験を行った。２４時間培養後、（１）（３）と同じ条件で、細胞からＲＮＡを回収しＲＴ−ＰＣＲによってSIRT1,SIRT2,SIRT7を定量した。表４にコントロール（ＤＭＳＯ）の発現レベルを１．００としたときの、各刺激物質で得られた発現レベルの相対値を示す。
表４に示すように、ピセアタンノール及びイソラポンチゲニンはそれぞれ、ヒトから採取された単球細胞内でSIRT1,SIRT2,SIRT7遺伝子のmRNA発現を増強させた。このように、ピセアタンノールまたはピセアタンノールアルキル化誘導体は、ヒトから採取された細胞でもサーチュイン発現増強剤として有用である。

Claims

ピセアタンノール、パッションフルーツ種子エキス、イソラポンチゲニン及びラポンチゲニンからなる群から選択される有効成分を含有する、サーチュイン２〜７のいずれかに対するサーチュイン発現増強剤。
ピセアタンノール、パッションフルーツ種子エキス、イソラポンチゲニンまたはラポンチゲニンを投与した動物個体から採取された白血球、または
ピセアタンノール、パッションフルーツ種子エキス、イソラポンチゲニンまたはラポンチゲニンを投与した白血球もしくはＴＨＰ−１細胞
におけるサーチュイン２又は６をコードする遺伝子の転写産物またはサーチュイン２又は６のタンパク質の発現レベルを調べる、サーチュイン２又は６の発現の増強を確認する方法。