JP6593619B2 - 血管攣縮抑制剤 - Google Patents
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Description
(1)下記の式(I)で表される化合物、その塩又はそれらの配糖体を有効成分とする血管攣縮抑制剤。
オカラを熱水で撹拌して粗抽出液を作製し、血管の異常収縮及び正常収縮の抑制効果を確認した。
電子天秤を用いてオカラ200gを量り取り、オカラの3.5倍量にあたる700mlの純水を加えた。60℃の熱水中で十分に加温した後、40℃インキュベーター内で1時間スターラーにより撹拌した。溶液を珪藻土濾過で濾過し減圧濃縮装置で液量が約40mlになるように濃縮し、粗抽出液を作製した。
北九州市保健福祉局医療部食肉センターより入手した、新鮮なブタ左冠状動脈前下行枝を主幹分岐部の約1cm下から約3cm採取し、あらかじめ混合ガス(95%O2、5%CO2)でバブリングし、氷冷したKrebs液(123mM NaCl、4.7mM KCl、15.5mM NaHCO3、 1.2mM KH2PO4、1.2mM MgCl2、1.25mM CaCl2、11.5mM D−glucose)で動脈内の血液を洗浄した。採取当日に血管周辺の脂肪及び線維を取り除いた後、外膜を剥離し、Krebs液中にて4℃で保存した。実験当日、あらかじめ混合ガスでバブリングしたKrebs液中にて、血管を長軸方向に切り開き、綿棒を用い血管内腔を軽く一方向に擦って血管内皮細胞(内膜)を除去し、剃刀を用いて長軸方向に対してほぼ垂直に、平滑筋細胞の走行方向に合わせて切断し平滑筋条片1mm×4mmを作製した。
血管の収縮を測定し、さらに血管収縮を抑制する作用を測定するための装置を図1に示す。ワイヤーの片側に平滑筋条片を吊るし、反対側をトランスデューサ(FDピックアップ:Panlab社製)に繋ぎ、増幅器(歪圧力用アンプ:Panlab社製)を通して記録計(卓上型ペンレコーダーU−603:パントス社製)で張力を検出した。平滑筋条片は、マグヌス管中の7mlのKrebs液に浸し、Krebs液は常に混合ガス(95%O2、5%CO2)でバブリングした。マグヌス管外は、恒温槽にて37℃に保った水を循環させた。また、交換用のKrebs液についても、37℃で保温し混合ガスをバブリングしたものを用いた。
上記測定装置を用い、Krebs液に10分間平滑筋条片を浸し、Krebs液を排出し、118mMの高カリウム溶液を加えて高カリウム脱分極による収縮を5分間引き起こし、その後高カリウム溶液を排出し、Krebs液に浸して10分間弛緩させる操作を繰り返し、高カリウム脱分極による収縮の安定性と大きさを指標に静止張力を最適化した。次に、高カリウム脱分極による収縮のトレースが安定したところで、40mMのカリウム溶液を加え、その収縮が定常状態に達した後、ブラジキニン(ペプチド研究所社製)を1μMとなるように加えて弛緩が生じなかったことで、血管内皮細胞が除去されていることを確認した。なお、血管内皮細胞が残っている場合、ブラジキニンを加えることで弛緩が生じる。
結果を図2に示す。図2から明らかなとおり、オカラの粗抽出液において、異常収縮の著明な抑制効果が確認された。正常収縮も抑制していたが、30%にすぎなかった。
オカラの粗抽出液のHPLC分析を以下の方法によって行った。HPLC用カラムオーブンは、CO-2060 Plus(日本分光社製)を使用し、検出にはUV-2075 Plus(日本分光社製)を、記録及びデータ解析にはLC-NetII/ADC(日本分光社製)をそれぞれ用いた。カラムはDevelosil ODS-HG-5(NOMURA CHEMICAL社製)を使用した。事前にカラムをカラムオーブンで40℃に加温した状態で測定を行った。開始点から30分間、流速0.3ml/分で超純水を流した。30分地点から60分間、流速0.8ml/分でメタノールが70%になるようにグラジエント溶出した。開始地点から90分間が経過した後同条件のまま30分間溶出させた。開始地点から120分が経過した後流速を0.3ml/分に落として45分間でメタノールが95%になるようにグラジエント溶出した。165分が経過した時点で同条件のまま15分間溶出させた。
結果を図3に示す。図3に示すように、先鋭な高いピークがいくつかみられる以外は比較的小さなピークがみられた。
固相抽出用カラムを用いて粗抽出液を三分画に分離し、それぞれの分画における異常収縮の抑制効果、正常収縮の抑制効果を確認した。
実施例1で作製した粗抽出液中に珪藻土濾過では濾過しきれない微細浮遊物が認められたため、Liposome Auto Extruder(橋本電子工業製)を用い濾過を行った。1.2μm及び0.4μmのメンブレンフィルター(Merck Millipore社製)を一度ずつ通過させた。
上記前処理によって浮遊物を十分に取り除いた粗抽出液を固相抽出にかけた。カラムはBond Elut Certify IIカラム(Agilent Technology社製)用いた。コンディショニングとして100%メタノールを6ml通した後、0.1Mリン酸緩衝液(pH7.0)6mlに通過させた。乾燥しないうちに、オカラ粗抽出液を5ml通過させ十分に吸着させた。10mlの50%メタノールを流した後2mlの酢酸エチルを流し30秒カラムを乾燥させた。さらに、3mlの1%酢酸含有25%酢酸エチル/75%ジエチルエーテルで溶出させた。カラムを通過したオカラ粗抽出液(カラム非吸着)を「Through分画」、その後、カラムを通過した50%メタノールと酢酸エチルを「Wash分画」、さらにその後、カラムを通過した1%酢酸含有25%酢酸エチル/75%ジエチルエーテルを「Trap分画」とした。
オカラの粗抽出液の代わりに上記3つの分画を用いた以外は、実施例1に記載と同様の方法で異常収縮の抑制効果、正常収縮の抑制効果試験を行った。
異常収縮の抑制効果を調べた結果を図4に、正常収縮の抑制効果を調べた結果を図5に示す。図4、5において、(a)はThrough分画、(b)はWash分画、(c)はTrap分画を用いた場合である。図4、5から明らかなとおり、Trap分画は異常収縮を100%抑制し、正常収縮は10%しか抑制しないことが明らかとなった。
Trap分画のHPLC分析を実施例2と同様の方法で行った。結果を図6に示す。図6に示すように、Trap分画の場合はオカラの粗抽出液の場合と比べて高い先鋭なピークが減り、いくつかのピークが増高していることが明らかとなった。
実施例3において異常収縮抑制効果が強く、正常収縮抑制効果が弱かったTrap分画の成分をタンデム型質量分析計によって同定した。
API2000(AB SCIEX社製)を用いて質量分析を行った。実施例3で得られたTrap溶液を0.1%ギ酸含有50%アセトニトリルで1000倍希釈したものを使用した。インフュージョンによる直接分析を行いMS/MSはpositiveモードでCollision Energy30で行った。
質量分析の結果を図7に示す。図7の矢印に示す、バックグラウンドノイズと異なる3つのピークから、Trap分画に含有する成分として、以下の式(IV)で表わされるダイゼイン(Daidzein)、式(II)で表わされるゲニステイン(Genistein)、以下の式(V)で表わされるビオカニンA(BiochaninA)、式(III)で表わされるアカセチン(Acacetin)を同定した。なお、ビオカニンAとアカセチンは構造異性体にあたり、分子量は全く同じである。
(異常収縮及び正常収縮の抑制効果試験)
実施例5によって同定した4つの化合物における異常収縮の抑制効果、正常収縮の抑制効果試験を行った。オカラの粗抽出液の代わりに上記同定した4つの化合物を用いた以外は、実施例1に記載と同様の方法で行った。なお、ダイゼインはDMSOに溶解し、終濃度390μMとなるように調製したもの、ゲニステインはエタノールに溶解し、終濃度37μMとなるように調製したもの、ビオカニンAはエタノールに溶解し、終濃度35μMとなるように調製したもの、アカセチンはDMSOに溶解し、終濃度35μMとなるように調製したものを用いた。
ダイゼイン、ゲニステイン、ビオカニンA、アカセチンを用いた結果をそれぞれ図8〜11に示す。図9、11に示すように、ゲニステインやアカセチンは異常収縮の抑制効果が高く、正常収縮の抑制効果がきわめて低いことが明らかとなった。
Claims (4)
- アカセチン、又はその塩を有効成分とする血管攣縮抑制剤(但し、エイコサペンタエン酸を含有する血管攣縮抑制剤を除く)。
- アカセチンを含有するマメ科植物抽出物を配合したことを特徴とする請求項1記載の血管攣縮抑制剤(但し、エイコサペンタエン酸を含有する血管攣縮抑制剤を除く)。
- マメ科植物が大豆であることを特徴とする請求項2記載の血管攣縮抑制剤。
- スフィンゴシルフォスフォリルコリンによって誘導される血管攣縮を抑制することを特徴とする請求項1〜3のいずれか記載の血管攣縮予防剤。
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