JPS63501797A - ジギタリス様因子の単離及び精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ジギタリス様因子の単離及び精製 本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＨｅ ａｌｔｈ）認可ＩＲＯＩ　ＨＬ　２９９５０、ＩＲＯＩＨＬ　１４９４４、ＩＲ ２Ｂ　ＨＤ　１９０８４−１０号として合衆国政府基金を用い完成されたもので あって、合衆国政府は本発明に関し一定の権利を有する。

発明の分野 本発明は組織及び体液からのジギタリス様因子の単離及び精製に関する。本発明 はかかる因子の同定及び特性にも関する。

発明の背景 動物及びヒトの組織及び体液中に見出される内在性因子又は因子群は、ナトリウ ム尿排泄冗進、即ち尿中のナトリウム異常量排泄と関連がある。ナトリウム尿排 泄冗進作用は、経上皮ナトリウム能動輸送を媒介するＮａ。

Ｋ−ＡＴＰａｓｅ酵素系の阻害に基因すると考えられている。諸研究においても 、この因子は高血圧の病因的役割を果たすことを示唆していた。ニス・グレーブ スら、°腎障害患者における内在性ジゴキシン様物質′、アナルス・オブ・イン ターナル・メデイシン、第９９巻、第６０４−６０８頁、１９８３年（Ｓ、Ｇｒ ａｖｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、　”ＡｎＥｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　Ｄｉｇｏｘｉｎ−Ｌ ｉｋｅ　５ｕｂｓｔａｎｃｅ　ｉｎ　Ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈＲｅｎａｌ　 Ｉａ＋ｐａｉｒｍｅｎｔ″、　Ａｎｎａｌｓ　ｏｒ　Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｍｅｄ ｌｃｌｎｅ、９９　：６０４−８０８（１９８３）　）　；エム・ニー・デビン クら、“血漿中のジギタリス様化合物の測定：本態性高血圧の研究における応用 ”、ブリティッシュ−メディカル・ジャーナル、第２８７巻、第６３１−６３４ 頁、１９８３年（Ｍ、Ａ。

Ｄｅｖｙｎｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、’″ＭｅａｓｕｒｅＩＩｌｅｎｔ　ｏｒ　Ｄｉ ｇｉｔａｌｉｓ−ＬｉｋｅＣｏｍｐｏｕｎｄ　ｉｎ　Ｐｌａｓｍａ：Ａｐｐｌｉ ｃａｔｉｏｎ　１ｎ　５ｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　Ｅｓ５ｅ−ｎｔｉａｌ　Ｈｙｐｅ ｒｔｅｎｓｉｏｎ＝　、　Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ、 ２８７　：６３１−６１４（１９８３）　）　；及び、アール・パルデスら、“ 新生児において偽陽性ジゴキシン測定を引き起こす内在性物質１、ジャーナル・ オブ・ペディアトリクス、第１０２巻、第９４７−９５０頁、１９８３年（Ｒ， Ｖａｌｄｅｓ　ｅｔ　ａｔ。

’Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　５ｕｂｓｔａｎｃｅ　ｉｎ　Ｎｅｗｂｏｒｎ　Ｉｎｆ ’ａｎｔｓ　ＣａｕｓｉｎｇＦａｌｓｅ　Ｐｏ５ｉｔｌｖｅ　Ｄｉｇｏｘｉｎ　 Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ　’　、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＰｅｄｌａｔｒｉｃ ｓ、　１０２　：９４７−９５０（１９８３））参照。この因子の血中レベルと 妊娠時の高血圧との関連性も見出された。ニス・グレーブスら、“内在性ジゴキ シンー−ヒト妊娠時の免疫応答物質”、ジャーナル・オブ・クリニカル・エンド クリノロジー及びメタボリズム、第５８巻、第７４８頁、１９８４年（Ｓ、Ｇｒ ａｖｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、　”ＥｎｄｏｇｅｎｏｕｓＤｉｇｏｘｉｎ−−１ｍａ ＋ｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ　５ｕｂｓｔａｎｃｅ　ｉｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｐｒｅｇ ｎａｎｃｉｅｓ’　、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌ１ｎｉｃａｌ　Ｅｎｄｏｃ ｒｌｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｅｔ−この因子又は因子群は、強心配糖体群に属 する薬物たるジゴキシンに対して生じる抗体と交差反応する。アール・パルデス ら、“ヒト血漿中における内在性ジゴキシン−免疫活性因子のタンパク質結合及 び臨床的条件によるその変形例１、ジャーナル番オブークリニカル・エンドクリ ノロジー及びメタボリズム、第６０巻、第１１３５−１１４３頁、１９８５年（ Ｒ，Ｖａｌｄｅｓ　ｅｔ　ａｌ、。

”Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｂｌｎｄｌｎｇ　ｏｆ　Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　Ｄｉｇｏｘ ｌｎ−１ｍｍｕｎｏａｃｔ−１ｖｅ　Ｆａｃｔｏｒｓ　ｉｎ　ＨｕＩｌａｎ　５ ｅｒｕａ＋　ａｎｄ　Ｉｔｓ　Ｖａｒｌａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈＣｌｌｎｉｃａｌ 　Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ”’　、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌ１ｎｉｃａｌ　Ｅ ｎｄｏｃｒｉ−ｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｅｔａｂｏｌｌｓｍ、６０：１１３５ −１１４３（１９８５））参照。

本発明の目的のために使用されるこの因子は、ジギタリス様因子と称される。他 の用語、例えばジゴキシン様及びウアバイン様という語がこの因子を表現するた めに使用されていたことは、当業者において理解されるであろう。

ジギタツス、ジゴキシン及びウアバインは化学的及び薬理学的に類似した強心配 糖体であって、心不全の患者を治療するために使用される。心筋収縮力を高める ことによって、動悸、細動及び発作性頻脈を伴ううっ血性心不全を治療するには 、薬物が必要である。強心配糖体で治療される腎機能障害のある心臓病患者は膨 大な数である。しかも腎障害又は腎不全の患者は、多くの場合うっ血性心不全又 は機能不全に進行するが、この際強心配糖体で治療される。レミングトン薬科学 （第１６版、１９８０年）、第６５４−６５５頁、第７９４−７９８頁（Ｒｅｍ ｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｌｌａｃｅｕｔｌｃａｌ　５ｃ１ｅｎｃｅｓ＜１ａ ｔｈ　Ｅｄ。

１９８０）ａｔ　６４５−６５５．７９４−７９８　）参照。

血清中におけるこのジギタリス様因子の存在は、現在の技術による強心配糖体の 測定に有害な影響を与える。

諸研究では、この内在性因子が腎障害の無ジゴキシン患者の血清中においてジゴ キシンとして検出されることを示した。ニス・グレーブスら、“腎障害患者にお ける内在性ジゴキシン様物質１、アナルズ・オブ・インターナル・メディシン、 第９９巻、第６０４−６０８頁、１９８３年［Ｓ、Ｇｒａｖｅｓ　ｅｔ　ａｌ、 、“Ａｎ　Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　Ｄｌｇｏｘ−１ｎ−Ｌｌｋｅ　５ｕｂｓｔａ ｎｃｅ　ｉｎ　Ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　Ｒｅｎａｌ　Ｉｍｐａｉｒｍｅ− ｎｔ”　、　Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ’　Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、９ ９：８０４−８０８（１９８３））参照。

この因子の存在は知られているが、しかしまだそれは実質上精製及び確認されて いない。イー・クラークソンら、“正常人の尿中における低分子量ナトリウム尿 排泄冗進物質の観察”、キドニー・インターナショナル、第１６巻、第７１０− ７２１頁、１９７９年（Ｅ、Ｃ１ａｒｋｓｏｎｅｔ　ａｔ、、”Ｆｕｒｔｈｅｒ 　０ｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ　ｏｎ　ａ　Ｌｏｖ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−Ｖｅ１ ｇｔ＋ｔ　Ｎａｔｒｌｕｒｅｔｆｃ　５ｕｂｓｔａｎｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｕｒ ｉｎｅ　ｏｒＮｏｒａ−ａｌ　Ｍａｎ”　、　Ｋｌｄｎｅｙ　Ｉｎｔｅｒｎａｔ ｌｏｎａｌ、ＩＢニア１Ｏ−７２１（１９７９）　）参照。クラークソンの研究 では、正常人の尿からの因子の部分精製について記載しており、その因子は分子 量５００ドルトン以下であり；因子のナトリウム尿排泄光進活性は高もしくは低 ｐＨ時の加熱及び亜硝酸酸化に対して比較的耐性であり；因子は低極性有機溶媒 に不溶性であり；しかも因子はプロリダーゼで破壊されることを示している。因 子はＧ−２５セフアデツクス（５ｅｐｈａｄｅｘ）クロマトグラフィーカラムを 用いて尿がら分離された。

著者は、ナトリウム尿排泄冗進活性かへテロ環式アミノ酸たるプロリンを含有し たペプチドに基因していることを示唆していた。

エッチ・クラマーら、“低分子量ナトリウム尿排泄冗進ホルモンの単離及び精製 に関する研究°、ナトリウム排泄のホルモン調節、１９８０年、第３０３−３２ ３頁（Ｈ，Ｋｒａｍｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、　”Ｆｕｒｔｈｅｒ　５ｔｕｄ１ｅｓ 　ｏｎ　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎａｎｄ　Ｐｕｒｌｒｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｓ ｍａｌｌ　Ｍｏ１ｅｃａｌａｒ　Ｗｅｉｇｈｔ　Ｎａｔｒ−１ｕｒｅｔｌｃ　Ｈ ｏｒｍｏｎｅ　’　、　Ｈｏｒｍｏｎａｌ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｏ ｄ１ｕｍＥｘ＋ｃｒｅｔｆｏｎ（１９８０）、３０３−３２１　）において、著 者はヒト尿がらの因子の単離及び部分精製に関する研究について記載している。

尿は、ゲル濾過、高圧液体クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオ ン交換クロマトグラフィー及び電気泳動のような工程で処理される。第３２０頁 において、著者は因子は酸性小ペプチドであろうと示唆している。

ジエイ会エフークロイクスら、′ナトリウムーカリウムーＡＴＰアーゼの内在性 阻害剤の精製″、エンドクリノロジー、コンブデス・レンダス書ヘブドマデアー ス拳デス・シーンセス・デルアカデミ−・デス・サイエンシス・パリス、第２９ ６巻、第２１３−２１６頁、１９８３年（Ｊ、Ｆ、ＣＩｏｉｘ　ｅｔ　ａｌ、、 ”Ｐｕｒ１ｆ’１ｃａｔ１ｏｎ　ｏｆ’　ａｎＥｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　Ｉｎｈｌ ｂｌｔｏｒ　ｏｆ　Ｓｏｄｉｕｍ−ＰｏｔａｓｓｉａＩＩｌ−ＡＴＰａｓｅ　’ 　。

−２１６（１９８３））は、ゲル濾過次いで陰イオン及び高圧液体逆相クロマト グラフィーを用いたヒト血漿からの因子の部分精製について記載していた。エム ・クラボスら、“高性能液体クロマトグラフィーを用いたヒト血漿及び尿中内在 性Ｎａ”　、Ｋ”−ＡＴＰアーゼ阻害剤の測定”、フエデレーシジン・オブ・ヨ ーロピアン・バイオケミカル・ソサエティーズ・レターズ、第１７６巻、第２２ ３−２２８頁、１９８４年（Ｍ、Ｃｒａｂｏｓ　ｅｔ　ａｌ、、　”Ｍｅａｓｕ ｒｅ−ＩＩｌｅｎｔ　ｏｒ　Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　Ｎａ　、Ｋ　−ＡＴＰａｓ ｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　１ｎＨｕｏ＋ａｎ　Ｐｌａｓｍａ　ａｎｄ　Ｕｒｌ ｎｅ　Ｕｓｉｎｇ　Ｈｌｇｈ−Ｐｅｒｆ’ｏｒａ＋ａｎｃｅ　Ｌｌｑ−ｕｉｄ　 Ｃｈｒｏａａｔｏｇｒａｐｈｙ’　、　Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ’　Ｅｕｒ ｏｐｅａｎ　Ｂｉｏｃ−ヒト血漿及び尿から因子を単離するために、Ｎａ、に− ＡＴＰアーゼ阻害剤及び交差反応抗体と結合せしめられる逆相ＨＰＬＣを利用し ていた。アイ・ダブル・ウニイナー、“逆相゛フラッシュ′クロマトグラフィー を用いた生物活性分子の急速な大規模単離：ヒト尿からの内在性Ｎａ　、Ｋ　− ＡＴＰアーゼ阻害剤の一次精製“、ジャーナル・オブークロマトグラフィー、第 ３３８巻、第４１７−４２１頁、１９８５年（１，Ｗ、Ｗａｌｎｅｒ、“Ｒａｐ ｉｄＬａｒｇｅ−３ｃａｌｅ　ｒｓｏｌａｔｌｏｎ　ｏｆ’　Ｂｉｏｌｏｇｉｃ ａｌｌｙ　Ａｃｔｉｖｅ　Ｍｏ１ｅ−ｃｕｌｅｓ　Ｕｓｉｎｇ　Ｒｅｖｅｒｓｅ ｄ−Ｐｈａｓｅ　’Ｆ１ａ５ｈ’　ＣｈｒｏＩＩａｔｏｇｒｏａｐｈｙ　：Ｉｎ １ｔｉａｌ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　Ｎａ　 、Ｋ　−ＡＴＰａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｆｒｏｍ　Ｈｕｍａｎυｒｉｎ ｅ’　、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＣｈｒｏａ＋ａｔｏｇｒａｐｈｙ、　３３８　 ：４１７−４２１（１９８５））では、°フラッシュ′クロマトグラフィーを用 いたエム・クラボスらの方法を利用していた。ジェイ・エフ・クロイクスら、“ 内在性ナトリウム輸送阻害剤のヒト血漿からの精製”、エクスベリエンティア、 第４０巻、第１３８０−１３８２頁、１９８４年（Ｊ、Ｐ、Ｃ１ｏｉｘ　ｅｔ　 ａｌ、、”Ｐｕｒ１ｆ’−１ｃａｔｉｏｎ　ｆ’ｒｏＩＩＨｕｍａｎ　Ｐｌａｓ ＩＩｌａ　ｏｆ’　Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　５ｏｄｌｕａ＋　Ｔｒ−ａｎｓｐｏ ｒｔ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ｓ）”　、　Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ、４０：１３ ８０−１３８２（１９８４））は、（ａ）ＮａＳＫ−ＡＴＰアーゼ活性の阻害； （ｂ）３Ｈ−ウアバイン結合性の阻害；及び（ｃ）抗ジゴキシン抗体との交差反 応からなるヒト血漿からの因子の精製方法を利用していた。エッチ・デ・□ザら 、″本態性高血圧患者及び高血圧遺伝形質をもつ正常血圧患者における血漿ナト リウムポンプ阻害剤゛、ジャーナル・オブ・カルジオバスキュラー・ファーマコ ロジー、第６巻、第５４９−５５４頁、１９８４年［Ｈ，ｄｅ　Ｔｈｅ　ｅｔ　 ａｌ、。

”Ｐｌａｓｍａ　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｐｕｍｐ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｉｎ　Ｅｓ５ ｅｎｔｉａｌ　）Ｉｙｐｅｒ−ｔｅｎｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｎｏｒｍｏｔｅｎｓｉ ｖｅ　５ｕｂｊｅｃｔｓ　ｗｉｔｈ　Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉ−ｖｅ　Ｉ（ｅｒｅ ｄｉｔｙ　”　、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ　Ｐｈ ａｒｍａｃ−ｏ１ｏｇＬ８　：５４９−５５４（１９８４））は、Ｎａ５Ｋ−Ａ ＴＰアーゼ活性及びウアバイン結合阻害によるヒト血漿からの因子の単離につい て記載していた。エム・ニー・デビンクら、“本態性高血圧における循環性ジギ タリス様化合物”、クリニカル・アンドφエクスベリメンタル・ハイバーテンシ ョンーセオリー・アンド・プラクテイス、第Ａ６巻、第４４１−４５３頁、１９ ８４年（Ｍ、Ａ、Ｄｅｖｙｎｃｋ　ｅｔ　ａｔ、。

”ＣｌｒｃｕｌａｔｌｎｇＤｉｇｉｔａｌｉｓ−Ｌｉｋｅ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ 　ｉｎ　Ｅｓ５ｅｎｔｉ−ａｌ　Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ　’　、　Ｃｌ１ｎ ｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｈｙｐ−ｅｒｔｅｎｓｉｏｎ− Ｔｈｅｏｒｙ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、　Ａ６　：４４１−４５３（１９８ ４））は、ゲルが過、陰イオン交換クロマトグラフィー及び逆相ＨＰＬＣにより 部分精製因子を単離した。

本発明の出願人は、ジギタリス様因子を単離精製するに際しての１つの大問題、 即ちほとんど大部分の因子がタンパク質と結合していることから、精製するため にはそのタンパク質結合部位から分離されねばならないこと番認識していた。こ の分野の研究者らは外見上この問題を認識していなかったため、彼らの成功は上 記のような因子の部分的精製に留まっていた。実質上、本出願人は、本発明に示 された精製度でジギタリス様因子を単離精製した最初の者である。

本出願人の発見に伴う利点の１つは、物理的かつ化学的に因子を同定し得るに十 分な量のジギタリス様因子（ＤＬＦ）の回収方法を提供することができることで ある。因子を単離する上で従来遭遇した大きな困難性は不十分な物質量であった 。因子の十分な収量があれば、その因子は精製及び同定することができる。更に 重要なことは、因子が同定されたならば、本態性高血圧又は妊娠基因性高血圧の 原因物質又は媒体としてのその潜在的役割が容易に評価されることである。この ような高血圧原因因子は臨床的有用性を有しており、受動免疫用抗体を産生させ 、能動免疫用の免疫原型を産生させ、かつ拮抗剤として作用し得る類似体を産生 させるために使用することができる。これらのうちいずれかでの使用によって、 血圧を低下させるための様々な治療様式を開発することができる。

因子は、血管抵抗性を高めることにより、ショック等の低血圧状態の急性的処置 においても治療的役割を有する。しかも、因子はジゴキシン抗体と交差反応し、 ジゴキシンに類似のウアバイン感受性ＮａＳＫ−ＡＴＰａｇｅを阻害することか ら、因子は心臓機能を改善し得る内在性向心臓（ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｉｅ）　 （向イオン（１ｏｎｏｔｒｏｐｉｃ）　）薬剤としての有用性を有しており、現 在強心配糖体で治療されているうっ血性心不全又は心不整脈の処置において治療 剤として使用することができる。

発明の要旨 本発明は内在性ジギタリス様ナトリウム尿排泄冗進因子（Ｄ　Ｌ　Ｆ）を得るた めの新規の単離及び実質的精製方法に関する。

本発明は因子自体の同定及び特性にも関する。

本発明は更に実質的精製因子の用途にも関する。

本発明によれば、内在性ジギタリス様ナトリウム尿排泄冗進因子（ＤＬＦ）は、 因子をそのタンパク質結合部位から除去させるという簡単な方法で因子含有試料 から単離することができるが、この方法によれば迅速かつ簡易な大規模全試料の 処理に適合し得るような態様で因子を除去することができる。

因子を含有するいかなる試料も、本発明記載の方法に従い出発物質として使用す ることができる。好ましい試料は羊水であるが、それは外来成分が最小量だから である。しかしながら、血液血漿、血清及び尿をはじめとする他の試料も使用可 能である。因子含有組織は脳、特に視床下部、胎盤、副腎及び腎臓であって、い ずれも本発明の方法において使用することができる。以下で用いられるように、 因子含有試料は単に“試料°と表現されるが、この語は何らかの哺乳動物因子の 含有試料であることを意味する。

本発明によれば、ジギタリス様因子は、試料及び試料タンパク質結合部位から因 子を除去し得るように選択された条件下において、試料を極性溶媒と接触させる ことにより、因子含有試料から除去される。溶媒中に存在する因子は、かくして 単離かつ実質上精製することができる。例えば、１．０ｍｊ！の血清は相対的質 量単位０．０１以下の因子を含有する。しかしながら、本発明による溶媒処理後 、血清１．０ｍＢから回収される標準的因子量はほぼ３．０相対的質量単位、即 ち３００倍多い因子である。

更に詳しくは、好ましい態様の場合、試料は因子−タンパク質複合体を単離する ために前処理される。典型的前処理法は、格別限定されないが、凍結乾燥、煮沸 による加熱処理又は有機溶媒によるタンパク質沈降である。

単離された因子含有タンパク質は次いで誘電率約６以上の極性溶媒と接触せしめ られかつ完全に分散せしめられる。本発明で使用される好ましい極洩４媒は、約 １０以上の高誘電率を有する。本発明で使用可能な各種化合物の誘電率は、ゴー トン及びフォード、ザ・ケミスツ・コンパニオン、ジョン・ウィリー・アンド・ サンズ、１９７２年、第４−１８頁（Ｇｏｒｄｏｎ　ａｎｄ　Ｐｏｒｄ、Ｔｂｅ 　Ｃｈｅ−ｍｉｓｔ’ｓ　Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ ｏｎｓ、１９７２）ｏｎ　ｐａｇｅｓ　４−１８３に掲載されている。例えば、 本発明で使用可能な極性溶媒としては、格別限定されないが、メタノール、エタ ノール、アセトン、酢酸エチル、イソブタノール、酢酸及びインプロパツールが ある。

因子は次いで血清試料から分離される。好ましい態様の場合では遠心分離が適用 されるが、当業者にとっては濾過、沈降分離等の別の手段も適用可能であると解 される。かくして、好ましい態様においては、溶媒及び因子含有タンパク質は遠 心分離され、遠心分離工程からの上澄は因子が有機相中に存在するようにデカン トされかつ貯蔵される。好ましい態様の場合、上澄のデカンテーラジン後に残留 するベレットはなおタンパク質と結合している因子を抽出するために再度極性溶 媒と接触せしめられる。当業者であれば理解できるように、この工程は試料から の因子の回収量を高めるために繰返すことができる。因子−溶媒上澄は次いで溶 媒を除去しかつ因子を単離するために処理される。蒸発等のいかなる適当な除去 技術も適用可能である。溶媒除去後の残留残渣は単離された因子を含有する。

因子を不純物含有形態で含むこの残渣は、各種溶媒を用いる選択的抽出の利用に よって精製され、かつ高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及びアフィニテ ィークロマトグラフィーの併用によって最終精製される。好ましい態様の場合で は、因子は下記工程により精製される： （１）　因子を含有する単離された残渣は蒸留水に分散され、ヘキサンで抽出さ れる。因子を含有する水相は分離され、真空乾燥されて、粘稠な残留溶液を残す 。

（２）　工程（１）の残留液はメタノールで連続的に洗浄される。各々の洗浄後 、液体がデカントされ、小型微細フィルターでｉ濾過される。炉液は次いでプー ルされ、真空乾燥される。この工程は、工程（１）の残留液がら因子を抽出させ るために、複数回繰返されることが好ましい。

（３）　（２）の残渣はメタノールに溶解される。メタノールが加えられ、沈降 物が生成する。混合物は次いで遠心分離される。遠心分離後、因子含有上澄はデ カントされ、真空乾燥される。

（４）　（３）の残渣は蒸留水で洗浄され、溶液は遠心分離される。得られる因 子含有水相は限外枦遇される。

限外か液は真空乾燥され、次いで蒸留水に懸濁される。

最終精製は、蒸留水に懸濁された限外炉液を高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰ ＬＣ）に供し、次いでタンパク質Ａ−セファロース４Ｂに結合したジゴキシンに 対する抗体を用いてアフィニティークロマトグラフィーに供することにより行な われる。

ＨＰＬＣ工程は当該技術分野で公知の手段により行なうことができる。例えば、 生化学者のための高性能液体クロマトグラフ（−（ＬＫ８１９８２年）　［Ｈｌ ｇｈ　Ｐｅｒｒ−ｏｒａ＋ａｎｃｅ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐ ｈｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｎ＋１ｓｔｓ（ＬＫＢ　１９８２））参照 。好ましい態様の場合、蒸留水に懸濁された限外か液は逆相クロマトグラフィー によるＨＰＬＣカラムに供され、溶出液が２２５ｎｍで継続的にモニターされる 。カラムを流速１．０ｍＮ／分のＣＨＣＮ／Ｈ２０液の勾配で溶出させた場合、 画分は溶出後１７〜１８分で溶出する。この両分は集められて、真空乾燥される 。

１７．１８ｍＮ溶出時のＨＰＬＣ画分の残渣は蒸留水に溶解され、アフィニティ ーカラムに供される。精製用アフィニティークロマトグラフィーの使用法は当該 技術分野において周知である。例えば、アフィニティー・クロマトグラフィー（ ファルマシア１９７３年）　ＣＡｒｆｌｎ−１ｔｙ　Ｃｈｒｏａ＋ａｔｏｇｒａ ｐｈｙ（Ｐｈａｒｍａｃｌａ　１９７３））参照。アフィニティーカラム樹脂は 、セファロース４Ｂ（シグマ・ケミカル（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）　） に結合せしめられたプロティンＡと共有結合している一部ジゴキシン抗血清〔ケ ンブリッチ・メディカル・ダイアグノスティクス（ＣａＩＩｂｒｉｄｇｅ　Ｍｅ ｄｉｃａｌ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ロット番号Ｒ８８２２３Ｆ号〕を用い た。活性物質はメタノール、０．５Ｍ酢酸次いでメタノールを用いてカラムから 洗浄される。メタノール及び酢酸洗液はプールされ、次いで乾燥される。

アフィニティークロマトグラフィーによる乾燥溶出物は蒸留水に溶解され、次い で分析用サイズのフェニルエチルシリルカラムを用いてＨＰＬＣで再度クロマト グラフィーに供され、流速１．０ｍＮ／分のＣＨ３ＣＮ／Ｈ２０勾配で溶出され る。両分は溶出後２６〜２８分で溶出する。この画分は実質上精製されたジギタ リス様因子である。

本明細書で用いられる“実質的（上）純粋な”又は“実質的（上）精製（された ）１という語は、普通の状態で通常因子と結合するようないかなる化合物をも実 質上含有していない因子、即ちタンパク質及び炭水化物成分を含有しない因子を 表現するために用いられる。この用語は更に、当業者で使用される１以上の純度 及び均一度の特性に関して均一である因子を表現するために用いられる。例えば 、実質上純粋な因子は、分子量、クロマトグラフィー技術、その他のパラメータ ーに関し標準的実験偏差の範囲内で一定のかつ再現可能な特性を示す。

しかしながら、この用語は因子と他の化合物との人工的又は合成混合物を除外す ることを意味しない。この用語は更に、因子の生物活性を妨げずかつ例えば不完 全精製に基づき存在し得る微量不純物の存在を除外することも意味しない。

１０．０００の分子量排除フィルターを自由に通過する。

分離パターンの試験を行ない、その結果評価された分子量は約１５０〜約２５０ ドルトンである。

ｍ薇几：　Ｄ　Ｌ　Ｆは水溶性でありかつ高極性である。

ＤＬＦは１００％メタノール、１００％エタノール及び９５％エタノールに１０ ０％可溶である。塩化メチレン又は酢酸エチルを用いたＤＬＦ水溶液の等容量抽 出では、約３０％のＤＬＦが除去された。クロロホルム又はヘキサンを用いた同 様の抽出では活性物質く５％が除去された。

’１ｉｔｔ　：水溶液中でＤＬＦを１００’Ｃで２時間加熱させた場合、活性の 検知し得る低下は生じながった。６ＮＨＣ１中でＤＬＦを２時間加熱した場合、 活性の検出可能な低下は生じなかった。しかしながら、インキュベート時間を２ ４時間に延長した場合、７５％の活性低下が結合せず、又はｐＨ５〜９で強陰イ オン交換樹脂と結合されたＤＬＦはケイ光を発せず、しかも活性の低下を示いこ とに加え、その活性がトリプシン及び非特異的タンことは、因子がペプチドでは ないことを示している。

非脂肪酸又は非脂質：溶解性及び抽出パターンの他に、因子が検知可能な程度に までアルブミンに特異的に吸着又は結合されない、即ち１０％未満であるという 試験結果が組合わさって、ＤＬＦが脂肪酸、脂質、リン脂質その他の非極性化合 物ではないことを示している。しがち、ＤＬＦ水溶液はクロロホルム／メタノー ル（Ｈ２Ｃ：ＣＨ３０Ｈ：ＣＨＣｌ３；１：１：２）で抽出された。

脂質又は脂肪酸除去のだめのこの標準的方法を適用した場合、３０％未満の活性 が低下した。

アルコール類：塩化ベンゾイルとの反応後においてＤＬＦは有意の活性低下を示 す。塩化アセチルは明確には活性を低下させないが、これらのことは、塩化ベン ゾイルのフェニル環の余分な嵩張りが活性低下に十分な立体障害を生じさせるか 又はＤＬＦ溶解性を変化′させることを示唆している。アミン類が存在しないた め、これはアルコールであることを示している。過ヨウ素酸酸化は活性に影響を 与えないことから、ビシナル（ｖｉｅｉｎａｌ）非芳香族アルコール類、アミノ アルコール類又はカルボニル類、例えば糖類が除外される。

ケトン類又はアルデヒド類：重亜硫酸塩及び水素化ホウ素ナトリウムはアルデヒ ド類又はケトン類と特異的に反応る。両方の試薬ともＤＬＦ活性の経時的低下を 生じさせる。重亜硫酸塩は非立体障害ケトン類又はアルデヒド類とのみ反応する 。ＤＬＦは少なくとも１個の非立体障害ケトン又はアルデヒドを含有する。

カテコール：　ＤＬＦはカテコール−０−メチルトランスフェラーゼの基質又は 偽基質として作用する。この酵素は（標識）アデノシルメチオニンのメチオニン からＤＬＦに末端メチル基を移す。ＤＬＦは、フェニルエチルシリルカラム及び 前記アセトニトル／Ｈ２ｏ勾配（最初の２０分間は１０〜３０％ＣＨ３ＣＮ１次 の２０〜５０分間は３０〜９０％ＣＨ３ＣＮ１最後の１ｏ分間の溶出は１００％ ＣＨ３ＣＮ）を用いた場合に、最初の２６〜２８ｍｇ溶出分ではなく３４〜３６ ｍ１溶出分で溶出する放射能単一ピークとして回収される。

ジギタリス様因子のインビトロ活性： 抗ジゴキシン抗体との交差反応剤：ＤＬＦは、二ニー・イングランド・ヌクレア （Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）ジゴキシンアッセイで用いられる 抗ジゴキシン抗体と交差反応する。それらは一部の他の抗ジギトキシン抗体〔ベ ックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ））と交差反応せず、コーニング・メディカル（Ｃｏ ｒｎｉｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ）ジゴキシンアッセイでは交差反応性を低下させた 。

ウアバイン感受性［Ｎａ、Ｋ］ＡＴＰアーゼの阻害剤＝ＤＬＦはイヌ腎ウアバイ ン感受性（Ｎａ、Ｋ）ＡＴＰアーゼの可溶製剤を阻害する。

ＤＬＦはしかも赤血球中へのＲｂ流入を阻害するが、これは［Ｎａ、Ｋ）ＡＴＰ アーゼ阻害による反射的作用実質上精製されたジギタリス様因子は、いくつかの 分野において臨床的有用性を有する。作用剤としては、この因子は薬学上許容さ れる担体とともに有効量の因子を含有する医薬組成物において使用することがで きる。因子は、患者に治療有効量の因子を投与することにより、心機能不全の患 者を治療するために使用することもできる。しかも、因子は、患者に治療有効量 の因子を投与することにより、低血圧患者において低血圧を治療するためにも使 用される。

拮抗剤としては、この因子は、高血圧を治療しかつ血圧を低下させるために、受 動免疫用の抗体を産生させるための治療剤としての有用性を有する。因子は更に 高血圧症及び高血圧に対する能動免疫用の免疫原を産生させるために使用するこ ともできる。更には、因子は高血圧症及び血圧を緩和させる様々な治療様式を産 み出し得る類似体を製造するためにも使用される。

下記例は、羊水からのジギタリス様因子（ＤＬＦ）の単離及び精製方法について 記載している。羊水の選択は、不純物（血清からの外来性成分）を最小化し、し かも、ＤＬＦが高濃度で存在し多量に入手し得る供給源であるように行なわれた 。ジゴキシンラジオイムノアッセイ（二ニー・イングラ、ンド・ヌクレア）を精 製モニター用として実施した。

羊水的１００〜１５０ｒＪ）の試料を一夜凍結乾燥させて、乾燥粉末状固体残渣 を得た。

残渣を無水メタノール２０ｒｒｌで洗浄した。固体物をメタノール中で完全に分 散させ（スパチュラで物質を摩砕し粉砕する）、シかる後混合物全体を遠心分離 した（１５，０００ｘｇ、５℃、１０分間）。上澄をデカントし、保存した。ベ レットを無水メタノール１５ｍｊ）に溶解し、上記のように遠心分離した。上澄 を保存した。

ベレットを再度メタノール１５ｒｒＪで洗浄し、上記のように遠心分離した。透 明暗黄色の３つの上澄をプールし、真空乾燥した。ベレットを廃棄した。

高粘稠な混濁黄色の液体残渣を蒸留水１０ｍｇに分散し、ヘキサン１０ｍ、Ｑで 抽出した。有機相を除去し、廃棄し、活性物質含有水相を真空乾燥した。減圧下 、水相は乾燥時において泡立ち現象を起こす傾向があった。

混濁粘稠性黄褐色液体たる残渣を無水メタノール４．０ｍｌで完全に洗浄した。

液体を移行する固体量を最小化し得るような方法で除去し、小型微細フィルター で濾過した。容器中の固体物をメタノール２．０ｍＮで２回以上洗浄し、液体を 除去し、濾過し、３つの洗液をプールし、真空乾燥した。

残渣は黄褐色の混濁した結晶乃至油状物であった。これをメタノール２．０．１ ．０及び０．５ｍｊｌｌで連続的に洗浄した。各洗浄後、液体を除去し、ン濾過 した。洗液をプールし、真空乾燥した。

黄色油状物たる残渣をメタノール１；　Ｏｍｇに溶解し、９５％エタノールを沈 降物が更に検出されなくなるまで加えた（１０〜１５ｍ、Ｑ）。エタノール添加 により黄白色綿状沈降物が生じた。混合物を２，５００ｘｇ、４℃で１０分間遠 心分離した。液体を除去し、真空乾燥した。

ベレットを廃棄した。

残渣を蒸留水１．０ｍｇに懸濁し、更に水０．　５ｍＮで洗浄し、溶液を９５， ０００ｘｇ、４℃で４５分間超遠心分離した。緑褐色物質が水相の上部に層をな した。

水相を慎重に除去し、緑褐色物質を廃棄した。

限外か液を真空乾燥し、蒸留水０．３〜０．　５ｍ、ｌ！に懸濁した。これを高 性能液体クロマトグラフィーカラムに供した〔Ｃ１８逆相カラム、ウォーターズ ・ボンダパック（Ｗａｔｅｒｓ　Ｂｏｎｄａｐａｋ））　ｏ流速１．０ｍｊｌ／ 分でアセトニトリル／Ｈ２０勾配を用い、室温でカラムを溶出させた。カラムを ２０％ＣＨＣＮ／８０％Ｈ２０で洗浄平衡化し、次の２０分間は２０％ＣＨ３Ｃ Ｎから１００％ＣＨ３ＣＮまで直線的に増加させ、更に１０分間は１００％ＣＨ ３ＣＮで溶出させた。液出液をＵＶ分光測定法により２２５ｎｍで継続的にモニ ターした。目的とする画分は１７〜１８ｍｇ溶出時に溶出した。この画分を集め 、真空乾燥した。

１７．１８ｍＮ溶出時のＨＰＬＣ画分の残渣（すべて目視不可）を水１〜３ｍＤ に溶解し、アフィニティカラム１．０ｍｇに供した。カラム樹脂は、セファ０− ス４Ｂ（シグマ中ケミカル）に結合したタンパク質Ａと共有結合している一部ジ ゴキシン抗血清（ケンブリッチ・メディカル・ダイアグノスティクス、ロット番 号Ｒ８８２２３Ｆ号）を用いた。抗血清をタンパク質Ａに共有結合せしめる方法 は、シュナイダー、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２５ ０巻、第１０７６６頁、１９８０年（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏ ｆＢｉｏｌｏｇｌｃａｌ　ＣｈｅＩｌｌｉｓｔｒｙ、　２５０　：１０７６Ｂ（ １９８０））の方法にほぼ従った。カラムを活性物質含有溶液とともに室温で１ ６時間回転させた。カラムを排水し、１．０Ｍ酢酸アンモニウム５．０ｍｇ次い で蒸留水１０．０ｍｊ）で洗浄した。活性物質を無水メタノール５．０ｍＤ、０ ．５Ｍ酢酸５．０ｍ１ｔ次いでメタノール５．　０ｍＪ７でカラムから溶出させ た。メタノール及び酢酸溶液をプールし、真空乾燥した。すべての酢酸を除去し た。

溶出液を非常に純粋な水０．４〜０．　５ｍ１）に溶解し、分析用サイズのフェ ニルエチルシリルカラム〔コーニング、ゾルパックス・フェニル（Ｚｏｒｂａｘ 　Ｐｈｅｎｙｌ）、内径４．６ｍｍｘ２５ｃｍ）を用いて再度ＨＰＬＣクロマト グラフィーニ供し、流速１．０ｍｊ？／分のＣＨ３ＣＮ／Ｈ２０勾配で溶出させ た。勾配は１０％ＣＨ３ＣＮ／９０％Ｈ２０から開始した（カラムは十分に洗浄 かつ平衡化されていた）。勾配は最初の溶出２０分間にわたり３０％ＣＨ３ＣＮ ／７０％Ｈ２０まで増加せしめられた。

次いで、ＣＨ３ＣＮは溶出２０〜５０分間の間９０％ＣＨ３ＣＮは最後の溶出１ ０分間の間１００％まで高められた。再度、溶出液を２２５ｎｍ、現寸吸光度単 位０．０２でＵＶ分光測定法により溶出と同時にモニターした。活性単一ピーク の溶出は（ジゴキシンＲＩＡでモニターした場合と同様に）溶出２６〜２８分時 に確認された。この両分ではＵＶ吸収がなかった。この画分は高精製ジギタリス 様因子である。

例　２ 因子の物理的及び化学的特性 下記例は、因子の物理的及び化学的特性を調べるために適用された方法について 記載する。

分子量：１０，０００及び５，０００ドルトンの名目分子量及び分離機能をもつ ＹＭ−１０及びＹ　Ｍ　−５ｔｐ過膜装備限外濾過装置〔アミコン（Ａ■１ｃｏ ａ）　）を使用した。

濾過はＮ２ガス７０ｐｓｉ（約５Ｋｇ／ａｍ　）下４℃で一定に撹拌しながら行 なった。フィルターを各々３ｍＤの９５％エタノール及び水で事前に洗浄してお いた。

ゲル濾過実験は、事前にｐＨ６，８の１０ｍＭ酢酸アンモニウムで膨潤せしめら れたＧ−２５セフアデツクスの１７５ｍｇ　（２，５Ｘ３５ｃｍ）カラムを用い て行なった。このカラムにＤＬＦ含有溶液（約２ｍｇ以下、タンパク質非結合） を供し、流速１００ｍＮ／時間で４℃にて同一緩衝液で溶出させた。ツバ（ＮＯ ＶＡ）１アナライザーを用いて、様々な２．０ｍＯ因子中のＮａ及びに濃度を測 定した。サイズ測定試験は、パルデス及びグレーブス、ジャーナル・オブ・クリ ニカル・エンドクリノロジー・アンド・メタボリズム、第６０巻、第１１３５− １１４３頁、１９８５年（Ｖａｌｄｅｓ　ａｎｄ　Ｇｒａｖｅｓ、Ｊｏｕｒｎ− ａｌ　ｏｒ　Ｃ１１ｎ１ｃａｌ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｅｔ ａｂｏｌｉｓｍ、６０：１１３５−１１４３（１９８５）　］の論文に記載され た方法に従い、３、ＯｒＪアミコン限界ン濾過セル及び５００〜１０．０００分 子量排除枦遇膜を用いて行なった。

貫トユ：正常ヒト血清中で通常測定されるよりも１００倍以上の及びヒト羊水中 で通常測定されるよりも１０倍以上のＤＬＦ濃縮物をＮ２０．メタノール、エタ ノール又は９５％エタノールに溶解し、定量的に移行させ、溶媒を除去し、ＤＬ ＦをＮ２０で再生し、ＲＩＡで分析した。Ｈ２Ｏｓ　ｍ　Ｏ中のＤＬＦ含有抽出 液を様々な非水混和性有機溶媒５ｍ、Ｑと一緒に振盪し、２相を分離し、真空乾 燥し、初期容量の水で再生し、ＲＩＡで分酸加水分解液、Ｎ２０での再生及びＲ ＩＡによる分析の前にＨＣＩを除去するため凍結乾燥工程を実施した。

中　性：適用された方法は、パルデス及びグレーブス、ジャーナル・オブ・エン ドクリノロジー・アンド・メタボリズム、第６０巻、第１１３４−１１４３頁、 １９８５年で概要が記載されており、イオン交換クロマトグラフィー　（Ｊｏｎ 　Ｅｘｃｈａｎｇｅ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、ファルマシア・ファイ ン・ケミカルズＡ　Ｂ　（ＰｈａｒＩＩｌａｃｉａ　ＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌ ｓ　ＡＢ）　、ウプサラ、スウェーデンに概説された方法のわずかな改良法であ る。

非−級アミン＝ＤＬＦ活性存在及び非存布ＨＰＬＣ画分の一部（１００μｆりを ０．２Ｍホウ酸緩衝液１．４ｍｌ？　（ｐＨ９，０）に加えた。激しく混合しな がら、フルオレサミン（３０ｍｇ／１００ｍＮアセトン）０．５ｍｆｌを加えた 。フルオレサミンは、３９０ｎｍの励起波を用い４２５〜５２５ｎｍの放射光を スキャンしながら追跡した。溶液を乾燥し、Ｎ２０　０．５ｒｎＤで再生し、ｐ Ｈ７，，４に調整し、ＲＩＡ用に１００μｇを分液した。

ＤＬＦ活性含有ＨＰＬＣ画分の第二の１００°μｇ部分を０．２Ｍホウ酸緩衝液 １．５ｍ１で希釈し、アセトン０．５ｍＲを加えた。溶液を乾燥し、Ｈ２Ｏ０， ５ｍｊｌで再生し、ｐＨ７，４に調整した。これをコントロールとして用いた。

フルオレサミン処理後、ＲＩＡでは活性の低下が検知されなかった。フルオレサ ミン自体はアッセイ時に認識し得る程の影響を与えなかった。

非ペプチド：　ＤＬＦ活性含有ＨＰＬＣ画分の２つの分液をプロナーゼ（タンパ ク質１ｍｇ又は１５酵素活性単位）存在及び非存在下で３０分間緩衝液（１０ｍ ＭＮ　ａ　ＨＰ　Ｏ４、ｐＨ７，４）に加えた。ペプチドが存在する場合、これ は速度１５μｍｏ　１／分又は２０．５ｍｍｏｌ／インキュベートで基質に変換 するはずである。

処理及び非処理ＤＬＦの活性間に差異はみられなかった。

同一特異的活性でかつ同一量のトリプシンもまた影響を与えなかった。

非脂肪酸又は脂質：溶解性及び抽出試験は前記のとおりである。ＤＬＦ溶液１０ ０μｇに加えられたウシ又はヒト血清アルブミン（１０％溶液中１０μｇ）は１ ０％未満の活性低下を示した。分液１００μｇをＨ２０１ｍｆｌで希釈し、次い でクロロホルム−メタノール（ＨＯ，ＣＨＯＨ，ＣＨＣｌ３．１　：　１　：　 ３）で抽出し、他の抽出が実施された場合と同様に後処理した。

おりであった：管内にＤＬＦ溶液５０μｇを加え、ＤＬＦ溶液を真空乾燥した。

これに塩化アセチル２０μｇを加え、管に栓をし、１時間放置した。過剰の塩化 アセチルはＮ２０５００μｇの添加により分解した。

溶液を乾燥し、塩化アセチル、酢酸及びＨＣＩを除去した。水（１００μｇ）を 加えて再生した。第二の管内に塩化アセチル２０μｇを加え、次いでＮ２０５０ ０μｇを加えた。この溶液に同一溶液５０μｇを加え、溶液を乾燥し、Ｎ２０１ ００μｇで再生した。この溶液に塩化アセチル２０μρ次いでＮ２０１００μｇ を加えた。第一の管では、ＤＬＦが活性試薬に接触せしめられている。第三の管 は陰性コントロールである。第二の管はＤＬＦ含有コントロールである。管１及 び２は、ヒドロキシル又はアミンが存在しないか（本明細書に記載された他の実 験でも存在しないことが示された）、あるいは変換体が活性を低下させないこと を示唆する、同等の活性を示した。塩化ベンゾイルによる試験は下記のように実 施された：第一の管にＤＬＦ溶液５０μｇ、塩化ベンゾイル２０μｇ及びピリジ ン１０μｇを加え、１時間インキュベートした。次いで、Ｈ２００−５ｍ　Ｄを 加え、この溶液をヘキサン２．０ｍ（ｌで抽出した。ヘキサンを除去した。水相 を真空乾燥し、Ｎ２０１００μｇで再生した。第二の管に塩化ベンゾイル２０μ ｇ１ピリジン１０μｇ及びＨ２０４５０Ｈｇを加えた。１時間後、ＤＬＦ溶液５ ０μｇを加え、溶液をヘキサン２．０ｍｇで抽出し、上記のように後処理した。

第三の管では、塩化ベンゾイル２０μｇ、ピリジン１０μｇ及びＨ２Ｏ５００μ ρを混合した。１時間後、溶液をヘキサン２．０ｍｆｌで抽出し、上記のように 後処理した。

第三の管の読取り値はほぼＯとなるべきである。活性低下はＤＬＦのベンゾイル 化が行なわれた管１の場合に観察されたことから、活性低下は立体障害、極性低 下又はその両方に基因している。このことはヒドロキシル基の場合に妥当する。

更に、塩化アセチル処理ＤＬＦを同一条件下で再度ＨＰＬＣクロマトグラフィー に供したところ、活性物質がより遅い保持時間で溶出したことがら、ヒドロキシ ル基が存在するか又はアセチル化により変化せしめられていることを再度強く示 唆している。別の実験において、一部のＤＬＦを真空乾燥させた。これに２％過 ヨウ素酸ナトリウム溶液５０μｇを加えた。５０’Ｃで３０分間インキュベート 後、過剰の過ヨウ素酸塩を１０％重亜硫酸ナトリウム５０μｇで分解した。第二 の管ではまず過ヨウ素酸塩５０μｇ及び重亜硫酸塩５０μｇ１次いでＤＬＦを加 えた。糖類で見出されるような非芳香族ビシナルジオール類を含有しない化合物 が一致する２つの管の間において、差がみられなかった。

性が過ヨウ素酸の存在とは関係なく重亜硫酸に対して影響をうけることを示した 。重亜硫酸による実験は下記のとおりであった。一部のＤＬＦ溶液２５μｇをＨ ２Ｏ２５μｇ及び１０％重亜硫酸塩５０μｇ又はＨ２０７５Ｈｇと混合した。重 亜硫酸はそれ自体でアッセイに無視しうる程の影響を与えた：無電亜硫酸ＤＬＦ 管は１時間後に１．６２単位の活性値を示した。重亜硫酸塩と３０分間インキュ ベートした場合０．７２単位まで活性を低下させ、６０分間のインキュベートで は０．５５単位まで活性を低下させた。重亜硫酸塩はアルデヒド及び／又は非立 体障害ケトンに対して選択性を有する。それらの存在を確認するために、実験を 水素化ホウ素ナトリウムで行なったが、この還元剤はアルデヒド及びケトンに対 して非常に選択的である。一部のＤＬＦ４０μｇをＨ２Ｏ２００Ｈｇ及び水素化 ホウ素ナトリウム１ｍｇに加えた。５０℃で２時間後、反応を濃酢酸５μｇで停 止させた。第二の管（コントａ−ル）にＨ２Ｏ２４０Ｈｇ１水素化ホウ素ナトリ ウム１ｍｇ及び濃酢酸５μｇを加え、次いでＤＬＦ溶戒４０μｇを加えた。ＤＬ Ｆ活性は水素化ホウ素との接触により０．９単位から０．５単位まで低下した。

カテコール：カテコールの存在を評価するために利用された方法はカテコールア ミンの場合に適用される方法と同一である。この方法は、ピューラー及びジョン ソン、“血漿ノルエピネフリン、エピネフリン及びドーパミンの同時−目的アイ ソトープラジオエンザイムアッセイ”、ライフ・サイエンシス、第２１巻、第６ ２５頁、１９７７年（Ｐｅｕｌｅｒ　ａｎｄ　Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｓｉｍｕｌｔａ ｎｅｏｕｓ　Ｓｉ−ｎｇｌｅ　ｌ５ｏｔｏｐｅ　Ｒａｄｉｏｅｎｚｙｍａｔｉｃ 　Ａｓ５ａｙ　ｏｆ’　Ｐｌａｓｍａ　Ｎｏｒｅｐ−１ｎｅｐｈｒ１ｎｅ、Ｅｐ ｉｎｅｐｈｒｉｎｅ　ａｎｄ　Ｄｏｐａｍｌｎｅ”　、　Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎ ｃ−ｅｓ、幻、：６２５（１９７７））の方法の改良法であるラジオエンザイム アッセイである。メチル標識３Ｈ−Ｓ−アデノシルメチオニン（３Ｈ−３ＡＭ） を用いて、血漿５０μｇ及び尿５０μｇ中のカテコールアミン類を３−０３−メ チル化するが、得られる生成物は３Ｈ−ノルメタネフリン、３Ｈ−メタネフリン 及び３Ｈ−３−メトキシチラミンである。これらは薄層クロマトグラフィー及び 過ヨウ素酸反応により分離される。

カテコール−〇−メチルトランスフェラーゼＣＯＭＴは、反応を触媒するために 使用され、キュエロ（Ｃｕｅｌｌｏ）ヒリー（Ｈｌｌｅｙ）及びアイバーセン（ Ｉｖｅｒｓｅｎ）の方法に従いラット肝から単離される。ベンジルヒドロキシル アミン塩酸塩は、ＣＯＭＴ製剤中に存在するドーパデカルボキシラーゼ活性に基 因する血漿ドーパからのドーパミンの生成を阻害させるために使用される。ＥＧ ＴＡは、血漿カルシウムの阻害作用を抑制するために、直接血漿試料に加えられ る。

ス及びウィリアムス、“ジャーナル・オブ・クリニカル・エンドクリノロジー・ アンド・メタボリズム、第５９巻、第１０７０−１０７４頁、１９８４年［Ｇｒ ａｖｅｓ　ａｎｄＷｉｌｌｉａｍｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌ１ｎＩｃａｌ 　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｅ−ｔａｂｏｌｉｓｍ、　５９：Ｌ ０７０（０７４（１９８４）］の論文に記載されている。

ジゴキシンラジオイムノアッセイ：方法は、グレーブス及びウィリアムス；同上 の論文に記載された方法と同行なわれた：ヒト赤血球をナイスクチン処理に付し 、飽和量のＮａ　（７５ｍＭ　Ｎａ＋７５ｍＭ　Ｋ）を含有させた。次いで、ウ アバイン非存在下及び各挿置のウアバイン存在下（１０’　〜１０−４Ｍ）にお いてＮａ　１４０ｍＭ及びＫ　２ｍＭ含有媒体からのＲｂ流入量を測定した。Ｒ ｂ流入量の滴定曲線をウアバイン濃度の関数としてめた。ＨＰＬＣ又は他の精製 手段により分離された血漿又は組織の抽出物及び画分の阻害活性を試験するため に、Ｎａ補充赤血球を流入媒体（アイソトープ非存在）中で１時間予めインキュ ベートし、次いで８６Ｒｂを加え、３つの同一試料を流入量測定のために３０分 後に採取する。このアッセイでは、１０−９〜１０−６Ｍのウアバイン濃度に正 確に対応した阻害レベルを検出することができ、このアッセイの条件下において はＲｂ流入量はＮａボンブが飽和していることから細胞内Ｎａとは無関係である 。

本開示は本発明に関連するすべての必要な情報を掲載しているが、本明細書で引 用された多数の文献が発明の背景及び技術の説明を理解する上で参考になるであ ろう。

したがって、引用された文献のすべてが参考のために本発明の開示の中に組込ま れる。しかも、上記発明は、理解の明確化を図る目的で実例及び具体例によりや や詳細に説明されてきたが、添付された請求の範囲によってのみ限定される本発 明の範囲内においである種の変更及び改良が行なわれてもよいことは明らかであ ろう。

暴ＡＩＩｌｆｉｍｌｌａＭａｌ＾”””””Ｎ０ＰＣＴ／ＵＳ８６１０２３１４ 国際調査報告 Ｉｎ１ｏｎ＋Ｍ、ｗｌＡｏｏ＋：ｅａ１１ａ＊　Ｎ。ＰＣＴ／ＵＳ　８６１０２ ３１４１°＋＊＋ｍ＋１ａｎａｌ　Ａ°９°°ｃｓｌ゛ａ＊　Ｎ。ＰＣＴ／ＩＪ Ｓ　８６１０２３１４

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．ナトリウム尿排泄亢進活性を有する実質上精製されたジギタリス様因子であ って、 （ｉ）約１５０〜２５０ドルトンの分子量を有する；（ｉｉ）高極性である； （ｉｉｉ）非タンパク質である； （ｉｖ）塩化ベンゾイルと接触した場合に活性を低下させる； （Ｖ）重亜硫酸塩及び水素化ホウ素ナトリウムと反応ずる； （ｖｉ）カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼの基質又は偽基質として作 用する；及び（ｖｉｉ）赤血球中へのＲｂ流入を阻害する；ことを特徴とする因 子。
2. ２．請求の範囲第１項記載の因子の有効量及び薬学上許容される担体を含んでな る心機能不全患者治療用医薬組成物。
3. ３．ジギタリス様因子を該因子含有試料から除去するための方法であって、 上記因子を上記試料から除去し得るよう選択された条件下で、ジギタリス様因子 含有試料を少なくとも約６の誘電率を有する極性溶媒と接触せしめることを特徴 とする方法。
4. ４．極性溶媒が、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチル、イソブタノ ール、酢酸及びイソプロパノールからなる溶媒群より選択される、請求の範囲第 ３項記載の方法。
5. ５．極性有機溶媒がメタノールである、請求の範囲第４項記載の方法。
6. ６．試料が血清、血液、組織、尿及び羊水からなる群より選択される、請求の範 囲第１項記載の方法。
7. ７．試料が溶媒と接触する前に沈降物を生成させるために凍結乾燥され、上記沈 降物が回収され、次いで上記溶媒と接触せしめられる、請求の範囲第３項記載の 方法。
8. ８．試料が溶媒と接触する前に沈降物を生成させるために加熱処理され、上記生 成物が回収され、次いで上記溶媒と接触せしめられる、請求の範囲第３項記載の 方法。
9. ９．因子が遠心分離、濾過又は沈降分離により試料から回収される、請求の範囲 第３項記載の方法。
10. １０．溶媒との接触後、因子が回収される、請求の範囲第３項記載の方法。
11. １１．ジギタリス様因子含有試料からジギタリス様因子を回収するための方法で あって、 （ａ）ジギタリス様因子含有試料を少なくとも約６の誘電率を有する極性溶媒と 接触させる；（ｂ）上記因子を上記試料から除去する；及び（ｃ）上記ジギタリ ス様因子を回収する；ことからなることを特徴とする方法。
12. １２．ジギタリス様因子の回収が、該ジギタリス様因子含有残渣を生成させるよ うに溶媒を蒸発することによって行なわれる、請求の範囲第１１項の方法。
13. １３．更にジギタリス様因子を精製することを含んでなる、請求の範囲第１２項 記載の方法。
14. １４．（ａ）ジギタリス様因子含有試料から該因子を除去し得るよう選択された 条件下で、上記試料を少なくとも６の誘電率を有する極性溶媒と接触せしめるこ とにより、上記試料から上記因子を除去する； （ｂ）上記因子を回収する；及び （ｃ）上記因子を精製する； ことを含んでなる方法により得ることができるジギタリス様因子。
15. １５．請求の範囲第１項記載の因子の治療有効量を患者に投与することによる低 血圧患者における低血圧治療方法。
16. １６．請求の範囲第１項記載の因子の治療有効量を患者に投与することによる心 機能不全患者における心機能不全治療方法。