JP6571523B2 - マイコプラズマ・ハイオニューモニエを形質転換するためのベクター、形質転換されたマイコプラズマ・ハイオニューモニエの株、及びそれらの使用 - Google Patents

Description

本発明は、ブタの疾患に対するワクチンとして使用することができ、前記細菌種の形質転換された変異株を調製する目的のための、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの遺伝子操作のための方法及びツールの開発の分野に含まれる。

獣医学の分野では、細菌、ウイルス又は寄生虫のような微生物によって引き起こされる疾患は、動物の死に起因する、又は成長過程や肥育過程における低能力に起因する深刻な経済的損失を引き起こす。

将来の感染に対して動物を保護する方法の一つは、免疫応答を生成するためのワクチンの投与からなる。

弱毒化した微生物又は生きて不活性化された微生物に基づくワクチンは、現在までほとんどの感染症の制御と根絶のための主要な免疫学的基礎を有している。

しかし、これらのタイプのワクチンを用いて得られた良好な結果にもかかわらず、それらは弱毒化ワクチンの病原性の復帰の可能性、感染した動物からワクチン接種した動物を区別できない、又は全ての疾患に有効であるワクチンを達成することが困難であるなどの問題を提示している。

微生物の遺伝子操作のためのツールの開発は、上記のものよりも効果的であるワクチン、例として、サブユニットワクチン、遺伝的に改変された不活化又は生ワクチン、マーカーワクチン（ＤＩＶＡ）又はＤＮＡワクチンなどを調製することを一般的に可能としている。

にもかかわらず、獣医の分野での疾患の原因となる全ての微生物が、容易に遺伝的に操作することができるわけではない。

マイコプラズマは、遺伝子レベルで操作することが困難である微生物の一員である。

マイコプラズマは、グラム陽性菌に密接に関連する微生物の広範なグループである、モリクテス綱（Mollicutes）のクラスに属している。

マイコプラズマは、５００〜１０００の範囲の遺伝子数を持つ、１０００ｋｂよりも一般的に小さいサイズの小さな環状ゲノムを有する。

細菌のこのグループは、おそらくは寄生虫のライフスタイルへの適応の結果として、通常は全ての生物において見出される代謝経路の多くを欠いている。その結果、マイコプラズマは、液体及び固体培地の両方で培養するのが非常に困難である偏好性微生物である。

マイコプラズマは、ブタの産業に大きな経済的損失の責任を負う細菌であるマイコプラズマ・ハイオニューモニエ（以下、「Ｍｈｙｏ」）を含む。ほとんどのＭｈｙｏ感染は深刻ではないが、Ｍｈｙｏに感染した動物は、日々の体重増加率を減少させるか又は死さえも引き起こす可能性がある呼吸器系の二次感染にかかりやすい。

Ｍｈｙｏは、非常に広範囲に及ぶ世界的な慢性呼吸器疾患であるブタの流行性肺炎（以下、「ＰＥＰ」）の原因物質である。この疾患は、高い罹患率と低い死亡率によって特徴づけされている。ＰＥＰの罹患率は、肥育ブタで特に高く、そして臨床徴候の重症度は、感染症を引き起こすＭｈｙｏの株、環境条件、動物の健康状態、そして他の病原体による二次感染の発症に依存する。幾つかの場合において、ＰＥＰは、明らかな臨床徴候を持たない無症状の状態で存在する。合併症がない場合において、動物は、毎日の体重増加率をの減少とその後飼料転換効率の低下を伴う慢性的な乾性の咳を示す。二次感染が発生した場合、臨床徴候はより明らかとなり、動物の死を引き起こす可能性さえある、急性呼吸器症状や発熱を提示する。それにもかかわらず、二次感染に起因する合併症がない場合に、ＰＥＰは、低い飼料転換率及び薬物療法から派生する費用に起因する深刻な経済的損失の原因となる。疾患が農場で確立されると、それは咳が生成したエアロゾルにより他の動物に対して水平に伝染され、及び生殖雌から子ブタへ垂直に伝染される。

問題のある培養に加えて、マイコプラズマの遺伝子操作は、利用可能なツールがほとんどないため、妨げられる。

マイコプラズマ、特にＭｈｙｏの遺伝子操作における困難さは、当該技術分野において説明されている。

Ｍｈｙｏ株２３２のゲノム配列は、Minion et al., The Genome Sequence of Mycoplasma hyopneumoniae Strain 232, the Agent of Swine Mycoplasmosis, J. Bacteriol., 2004, 186(21), 7123-7133による論文に記載されている。著者は、Ｍｈｙｏは偏好性微生物であり、それを形質転換するためのツールとプロトコルが欠如していると述べている。

温度変化にさらされたときにＭｈｙｏで生じる修飾の試験との関連で、Madsen et al., Transcriptional Profiling of Mycoplasma hyopneumoniae during Heat Shock Using Microarrays, Infect. Immun., 2006, 74(1), 160-166による論文において、著者らは、ブタの生産におけるＭｈｙｏの大きな重要性にもかかわらず、環境の変化に応答した、その病原性の潜在的な分子メカニズムに関する研究はほとんどなされておらず、これは、その増殖の困難さによるものであり、かつそれが遺伝子操作に不応性であるという事実によると述べている。

Pich et al., Comparative analysis of antibiotic resistance marker genes in Mycoplasma genitalium: application to studies of the minimal gene complement, Microbiology, 2006, 152, 519-527による論文では、電気穿孔による、異なるプラスミドを用いたＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの遺伝子改変が記載されているが、Ｍｈｙｏへの言及を見いだすことはできない。

B. Machado, Construcao de vetor oriC de Mycoplasma hyopneumoniae - uma ferramenta para estudos geneticos do agente da Pneumonia Enzootica Suina, Porto Alegre, 2007による論文は、電気穿孔による複製プラスミドｐＯＳＴＭを用いたＭｈｙｏ株７４４８の形質転換を説明している。このプラスミドを構築するために、ＭｈｙｏのｏｒｉＣ領域及びテトラサイクリン耐性遺伝子（ｔｅｔＭ）を含む発現カセットを、Spiroplasma citri プロモーター遺伝子の制御下で、ｐＵＣ１８ベクターに導入した。実験部分は、ＰＣＲによって、プラスミドの取り込みと前記ベクターによって付与された抗生物質耐性を示しているが、テトラサイクリン耐性形質転換株からのプラスミドの単離は説明されていないので、プラスミドｐＯＳＴＭが実際に安定的にＭｈｙｏに取り込まれたことを示す決定的な結果は、この研究では提供されていない。さらに、形質転換株は、選択培地中で二回の継代の後に増殖が困難であったとも記載されている。結果として、これらの結果は、この文献に開示された形質転換を使用して、Ｍｈｙｏの株においては、形質転換された細菌の複数世代の後に回復することはできないので、外来性ＤＮＡ配列を安定的に導入することが可能でなかったことを示している。

２００７年の開示にもかかわらず、Ｍｈｙｏの遺伝子改変の問題は、その後の研究で解決されたとは示されていない。

２００９年１月１０日から２０１０年９月３０日の期間に対応するM. Calcutt on the project entitled Development of genetic manipulation protocols for Mycoplasma hyopneumoniae clade of animal pathogens, ミズーリ大学による報告（２０１２年２月１６日に取得したｗｅｂページ http://www.reeis.usda.gov/web/ crisprojectpages/220630.htmlからダウンロードされる）では、このプロジェクトの目的はＭｈｙｏの遺伝子操作のための方法論を開発することであると説明されている。また、テトラサイクリン耐性遺伝子を含むプラスミドを用いて、Ｍｈｙｏから電気的形質転換することが意図されることが説明されている。しかし、形質転換細菌に対して実施されたＤＮＡ分析の結果は、陽性ではく、著者らは、形質転換は発生していなかったと考えるに至った。この耐性遺伝子の発現に対する結果も記載されていなかった。

Browning et al., Developing attenuated vaccines to control mycoplasmoses, Microbiology Australia, 2011, 121-122による論文は、その宿主の体温では増殖しないマイコプラズマの温度感受性株を含むワクチンの開発を記載している。前記株は野生型株からの化学的変異がにより得られた。著者らは、ＭｈｙｏとM. synoviaeにおいて指向性遺伝子操作は課題であり続けており、前記の種において達成されていないと述べている。同じ研究グループからの国際特許出願ＷＯ−Ａ−１３２９３２／２０１０はまたＭｈｙｏの温度感受性株に関するものである。

Maboni et al., Mycoplasma hyopneumoniae Transcription Unit Organization: Genome Survey and Prediction, DNA Research, 2011, 18, 413-422による論文では、Ｍｈｙｏの３つの株（７４４８、Ｊ及び２３２）のゲノムの比較検討が、オープンリーディングフレームを同定する目的で行われた。著者らは、マイコプラズマの幾つかの種のための人工的な形質転換及び他の遺伝的ツールの開発にもかかわらず、これらの方法論はＭｈｙｏのためにまだ開発されなければならないと述べている。

従って、Ｍｈｙｏの形質転換のための方法は、そのような形質転換を実行するための幾つかの失敗した試みはあるものの、当技術分野で説明はされていない。

よって、遺伝子工学ツールによってＭｈｙｏの変異株を調製するための方法を提供し、それゆえ、ブタ流行性肺炎に対するワクチン組成物を、他のブタ疾患の予防及び／又は治療のために最終的に他の抗原成分との組み合わせて、調製するために適切な変異株を提供する必要性が依然として存在する。

本発明の目的は、Ｍｈｙｏの変異株を調製するための方法である。
本発明の別の態様は、前記方法で使用される複製プラスミドベクターである。
本発明の別の態様は、前記方法で使用されるトランスポゾンベクターである。
本発明の別の態様は、Ｍｈｙｏの変異株を調製するための前記ベクターの使用である。
本発明の別の態様は、前記方法により得ることができるＭｈｙｏの変異株である。
本発明の別の態様は、外来性ＤＮＡ配列を含むＭｈｙｏの変異株である。
本発明の別の態様は、本発明のベクターを含むＭｈｙｏの変異株である。
本発明の別の態様は、本発明のベクターで形質転換されたＭｈｙｏの変異株である。
本発明の別の態様は、発現宿主としての前記変異株の使用である。
本発明の別の態様は、前記変異株を含むワクチンである。
本発明の別の態様は、ワクチンを調製するための本発明のＭｈｙｏの変異株の使用である。
本発明の別の態様は、前記変異株を含むワクチン接種キットである。

著者らは、Ｍｈｙｏの変異株を調製するための方法を開発し、それによって外来性ＤＮＡ配列は、驚くべきことに、安定的に細胞質内に、又はＭｈｙｏ株のゲノムへ導入することができ、そしてそれらの配列の内容物が発現される。

「細胞質内又はＭｈｙｏの株のゲノムに安定的に導入される外来性ＤＮＡ配列」という表現によって、そのような配列は、前記外因性配列で形質転換された細菌の継続的世代に沿って失われることはないことが理解される。この安定性は、外来性ＤＮＡ配列は、形質転換された細菌の内部で、及びその子孫において複製することができ、そして形質転換された細菌の複数の世代後に回復することができることを意味する。

開発された方法を用いて、遺伝子工学ツールによって初めてＭｈｙｏ株を改変することへの扉を開けている。

外来性ＤＮＡ配列を含むＭｈｙｏの変異株は、前記方法を用いて調製することができる。前記変異体株は、例えば、特定のタンパク質を発現する、又は野生型親株に対する病原性の程度が低いなどの異なる特性を持つことができる。

前記変異体株は、ワクチンとして、例えば、弱毒化した生ワクチン、不活化ワクチン、感染した動物からワクチン接種した動物を区別することを可能にするマーカーワクチン、又はブタ流行性肺炎や 例えば、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）によって引き起こされる感染症などブタに影響を及ぼす可能性のある別の付加的疾患に対する多価ワクチンとして使用することができる。

本発明の方法は、安定した形態で、遺伝的にＭｈｙｏを改変することを初めて可能にし、それをもって、とりわけ、外来性ＤＮＡ配列など、例えば、とりわけＰＣＶ２カプシドの配列などの治療又は予防目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現ベクターとしてのこれらの形質転換株の使用が実現されている。本発明に開示された技術を用いて、新しいワクチンの候補が設計され製造されており、それらはまた多価でもあり、その理由はそれらが本発明の方法によって改変された単一株を投与することによって種々の疾患を予防することができるからである。

本明細書及び特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈で他に明確に示されない限り、複数の言及を含む。

同様に、本発明の文脈において、用語「配列」は、それが明示的にアミノ酸配列を指すことが示される場合を除いて、ＤＮＡ配列を指す。

図１は、遺伝的にＭｈｙｏを改変して、組換えタンパク質又はアンチセンス転写物の生成を実現するために使用される複製プラスミドの図を示す。クローニング操作に使用される、プロモーター、遺伝子及び制限酵素部位は矢印で示されている。プラスミドｐＯＧは、前記プラスミドのキャリア細胞の選択を可能にするのと同時に、このベクターがＭｈｙｏ内で複製できるように、必要な要素が含まれる。このプラスミドは、Ｍｈｙｏ Ｐ９７タンパク質（ｐｐ９７、塩基１８２３から２０８７）の遺伝子のプロモーターの制御下で、ＭｈｙｏのｏｒｉＣ領域（塩基２０９６から４０４３）及びゲンタマイシン耐性マーカー遺伝子（ａａｃ、塩基１から１８１６）を有する。プラスミドｐＯＧＣＲＥはプラスミドｐＯＧから直接由来し、更に、プロモーターｐｐ９７（塩基１０３９から１３０３）の制御下にあるファージＰ１のｃｒｅ遺伝子（塩基１から１０３２）を含む。前のプラスミドとは異なり、プラスミドｐＯＧＡ１５９は、プロモーターｐｐ９７（塩基６７４から９３８）の制御下にあるテトラサイクリン耐性遺伝子（ｔｅｔＭ、塩基９４５から２８８３）を含む。ＭｈｙｏのｏｒｉＣ領域は塩基２９０１から４８４８の間に位置している。最後に、それは、逆向きで、プロモーターｐｐ９７（塩基４９９６から５２６０）の制御下にあるｔｌｙＡ遺伝子（ａ１５９、塩基４８５５から４９８０）の５’末端に対応するＭｈｙｏゲノムのセグメントを含む。 図２は、遺伝的にＭｈｙｏを改変して、ＰＣＶ２ウイルスキャプシドのタンパク質の異なる組換えバージョンの生成を実現するために使用される複製プラスミドの図を示す。クローニング操作に使用される、プロモーター、遺伝子及び制限酵素部位は矢印で示されている。プラスミドＰＯＧＣは、プラスミドｐＯＧとまったく同じ要素を含み（図１）、更にＰＣＶ２ウイルスキャプシドのＯＲＦ２Ｖ２（塩基６９４６から７６４７）に含まれるサーコウイルスキャプシドをコードする合成遺伝子の発現を制御する、プロモーターｐｐ９７（塩基７６５４から７９１８）の更なるコピーを含む。このプラスミドは、キャリア細胞の細胞質におけるＰＣＶ２カプシドタンパク質の発現を可能にする。プラスミドｐＯＧＬはプラスミドｐＯＧと全く同じ要素を含み（図１）、更に、Ｐ４６ Ｍｈｙｏ膜タンパク質（塩基８６４２から８９１７及び６９４６から７９３０）をコードする遺伝子の内部に、ＰＣＶ２ウイルスキャプシドのタンパク質（ＯＲＦ２）の遺伝子の融合体の発現を制御するＭｈｙｏ Ｐ４６タンパク質の遺伝子（ｐｐ４６：塩基８９１８から９１８１）のプロモーター配列を含む。このプラスミドは、アミノ酸１から９２は、Ｐ４６タンパク質のＮ末端からのものであり、アミノ酸９５から３２７は、ＰＣＶ２ウイルスキャプシドのタンパク質に対応し、及びアミノ酸３３０から６５６はＭｈｙｏ Ｐ４６タンパク質のＣ末端からのものであることを特徴とするハイブリッドタンパク質を生成する。プラスミドｐＯＧＬはプラスミドｐＯＧと全く同じ要素を含み（図１）、更に、Ｐ４６ Ｍｈｙｏ膜タンパク質（塩基７６４８から８９０４）をコードする遺伝子の３’末端に、ＰＣＶ２ウイルスキャプシドのタンパク質（ＯＲＦ２）の遺伝子の融合体の発現を制御するプロモーター配列ｐｐ４６（塩基８９０５から９１６９）を含む。このプラスミドは、アミノ酸１から４１９はＰ４６タンパク質からのものであり、及びアミノ酸４２０から６５２は、ＰＣＶ２ウイルスキャプシドタンパク質、ＯＲＦ２バージョン（塩基６９４６から７６４７）に対応することを特徴とするハイブリッドタンパク質を生成する。 図３は、Ｍｈｙｏ染色体における挿入を得るために使用されるミニトランスポゾンを運ぶするプラスミドの図を示す。プラスミドの構築のために使用されるプロモーター、遺伝子、及び制限酵素の標的、及びその他の重要なＤＮＡ配列は矢印で示されている。プラスミドｐＴＣ３は、トランスポゾンの挿入を有するＭｈｙｏの株を得るために必要な要素が含まれる。このプラスミドは、プラスミドｐＭＴｎ４００１のバックボーン上に構築されている。このプラスミドの最初の要素は、プラスミドｐＭＴｎ４００１（塩基２８４から１２６１）のトランスポザーゼの発現を制御するプロモーターｐｐ９７（塩基７から２７１）である。塩基１４６１から１４８６と３７７４から３７９９は逆方向反復に対応し、図にそれぞれＩＲＩとＩＲＯとして示されている。このプラスミドの最後の要素は、Ｍｈｙｏ Ｐ９７タンパク質（１５０２から１７６６）のプロモーターの制御下にもある、テトラサイクリン耐性マーカー遺伝子（塩基１７６１から３６９２）に対応する。プラスミドｐＴＣ３６６は、プラスミドｐＴＣ３から直接由来し、かつ、テトラサイクリン耐性マーカー遺伝子ＴｅｔＭ（塩基１７９１から３７２２）に隣接するｌｏｘ６６配列（Ｃｒｅリコンビナーゼの基質、塩基１４８５から１５１８及び３７６２から３７９５）を含む。プラスミドｐＴＣ３Ｃは、プラスミドｐＴＣ３６６から直接由来し、かつ、プロモーターｐｐ９７（塩基３８０８から４０７１）の制御下にある、ＰＣＶ２ウイルスのＰＣＶ２ウイルスキャプシドＯＲＦ２Ｖ２（塩基４０７８から４７７９）のタンパク質をコードする遺伝子を含む。このプラスミドは、前記プラスミドによって形質転換されたＭｈｙｏの株の細胞質中でＰＣＶ２カプシドタンパク質に対応する組換えタンパク質の合成を促進する。プラスミドｐＴＣ３Ｌは、プラスミドｐＴＣ３６６から直接由来し、かつ、プロモーターｐｐ４６（塩基３８０１から４０６５）の制御下にある、Ｐ４６ Ｍｈｙｏ膜タンパク質をコードする遺伝子の内部に、ＰＣＶ２ウイルスキャプシドのタンパク質（ＯＲＦ２）の遺伝子（それぞれ塩基４３４７から５０４５及び４０６６から４３４０及び５０５２から６０３６）の融合体を含んでいる。このプラスミドは、アミノ酸１から９２は、Ｐ４６タンパク質のＮ末端からのものであり、アミノ酸９５から３２７は、ＰＣＶ２ウイルスキャプシドのタンパク質に対応し、及びアミノ酸３３０から６５６はＭｈｙｏ Ｐ４６タンパク質のＣ末端からのものであることを特徴とするハイブリッドタンパク質の合成を促進する。プラスミドｐＴＣ３Ｔは、プラスミドｐＴＣ３６６から直接由来し、かつ、Ｍｈｙｏ Ｐ４６タンパク質をコードする遺伝子（塩基３８０１から４０６５）のプロモーターの制御下にある、Ｐ４６ Ｍｈｙｏ膜タンパク質をコードする遺伝子とＰＣＶ２ウイルスキャプシドのタンパク質（ＯＲＦ２）の遺伝子（それぞれ塩基５３２２から６０３１及び４０６５から５３２１）の間に融合体を含んでいる。このプラスミドは、アミノ酸１から４１９はＰ４６タンパク質からのものであり、及びアミノ酸４２０から６５２は、ＰＣＶ２ウイルスキャプシドに対応することを特徴とするハイブリッドタンパク質の合成を促進する。 図４は、組換えタンパク質の産生における複製プラスミドの安定性及びそれらの使用に関する。この図は、３つのパネルに分割される。パネルＡは、６Ｖ／ｃｍでの電圧で２時間実行された、０．７％アガロースゲル電気泳動を示す。１ｋｂとラダー分子量マーカー（Invitrogen）はレーンＭである。大腸菌ＸＬ１ブルーから単離され、制限酵素ＳｃａＩで消化されたプラスミドｐＯＧは、レーン１である。制限酵素ＳｃａＩで消化されたＭｈｙｏ株２３２ＰＯＧｃ９の総ＤＮＡ抽出は、レーン２である。制限酵素ＳｃａＩで消化されるプラスミドｐＯＧの期待されるバンドは、３５６４ ｂｐ、２２２５ ｂｐ及び１１４３ ｂｐである（図４、パネルＡ）。分子量マーカーと大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅから単離されたプラスミドのバンドの比較により、プラスミドｐＯＧは株２３２ＰＯＧｃ９で安定的に伝播していることが確認されている。別の関連するＤＮＡマーカー断片の長さは、図の左側に示されている。パネルＢは、バクテリオファージＰ１のＣｒｅリコンビナーゼの特異的ポリクローナル抗体を用いて検出されたＭｈｙｏの異なる株のタンパク質サンプルによる変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動のウェスタンブロットを示す。レーン１は、３９ｋＤａの予想されるバンドが観察される株２３２ＰＯＧＣＲＥｃ１のタンパク質抽出物を示す。レーン２は、全くバンドが観察されず、プレシジョンプラスプロテインデュアルエクストラ（バイオラッド）分子量マーカーがレーンＭにある株２３２の抽出物を示している。関連する分子量は図の右側にｋＤａで示されている。これらの結果は、プラスミドｐＯＧＣＲＥはＭｈｙｏ株２３２に形質転換されると、Ｃｒｅタンパク質を生成することができることを示している。パネルＣは、Ｍｈｙｏ親株６３１４（レーン１）、及びプラスミドｐＯＧＡ１５９による株６３１４の形質転換の生成物である株６３１４ｐＯＧＡｃ４（レーン２）のＤＮＡサンプルが分析されるアガロースゲル電気泳動を示す。矢印はＭｈｙｏの形質転換された変異株においてプラスミドｐＯＧＡ１５９によって採用された２つのコンフォメーションの位置を示している。 図５はトランスポゾン挿入を持つＭｈｙｏ株、及び組換えタンパク質の生成におけるそれらの有用性の回復を示している。この図は、３つのパネルに分割される。パネルＡ（レーンＭ及び１から４）は、６Ｖ／ｃｍでの電圧で２時間実行された、０．７％アガロースゲル電気泳動を示し、一方パネルＡの右側（レーン５から８）は、ナイロン膜上でのこのゲルのサザンブロットを示す。サザンブロットで観察されたバンドは、Ｍｈｙｏ Ｐ９７タンパク質のプロモーターの制御下にあるＴｅｔＭ配列に対して設計したプローブによって認識されるバンドに対応する。１ｋｂとラダー（Invitrogen）分子量マーカーはレーンＭである。レーン１及び５は、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した株２３２ＴＣ３ｈｌｙＣからの全ＤＮＡの抽出に対応する。レーン２及び６は、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した株２３２からの全ＤＮＡの抽出に対応する。レーン３及び７は、制限酵素ＥｃｏＲＶで消化した株２３２ＴＣ３ｈｌｙＣからの全ＤＮＡの抽出に対応する。レーン４及び８は、ＥｃｏＲＶで消化した株２３２からの全ＤＮＡの抽出に対応する。レーン５の６．３ｋｂのバンドとレーン７の２ｋｂのバンドは、ＭｈｙｏゲノムにおけるＰ９７タンパク質のプロモーターの下でのＴｅｔＭ耐性を含むトランスポゾンの存在を実証し、一方、レーン６及び８におけるこれらのバンドの欠損はこれらの結果を裏付ける。パネルＢは、Ｍｈｙｏからの異なるタンパク質サンプルによるＩＮＧＥＺＩＭ ＰＣＶ ＤＡＳキット（Ingenasa, Spain）を用いて行ったＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。各アッセイで使用される希釈は、表の左欄に示され、一方分析した株は上段に示される。数値結果は、各ウェルに導入されたタンパク質の量により正規化された、４５０ｎｍの波長での吸光度読み取りからの値である。ｐＴＣ３Ｃ、ｐＴＣ３Ｌ及びｐＴＣ３Ｔベクターで形質転換Ｍｈｙｏの全ての株は、陰性コントロールのそれよりも明らかに高い吸光度を示し、このことは組換えＰＣＶ２カプシドタンパク質の発現は、これらの株のそれぞれで起こることを示している。パネルＣは、ＰＣＶ２カプシドタンパク質の特異的なモノクローナル抗体を用いて検出されたＭｈｙｏの異なる株のタンパク質サンプルによる変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動のウェスタンブロットを示す。レーン１は、２８ｋＤａの予想されるバンドが観察される株２３２Ｃｃ６のタンパク質抽出物を含む。レーン２は、全くバンドが観察されない株２３２のタンパク質抽出物を含む。レーン３は、２８ｋＤａで予想されるバンドが観察される、ＩＮＧＥＺＩＭ ＰＣＶ ＤＡＳキット（Ingenasa, Spain）で陽性コントロールとして供給されるＰＣＶ２カプシドのタンパク質サンプルを含む。レーン４は、全くバンドが観察されない株６３１４のタンパク質抽出物を含み、一方、株６３１４Ｃｃ１のタンパク質抽出物はレーン５であり、そこではレーン１及び３よりも弱い強度を有するが、２８ｋＤａで予想されるバンドが観察される。これらの結果は、６３１４株と２３２株の両方において、プラスミドｐＴＣ３Ｃに存在するトランスポゾンのＭｈｙｏゲノムにおける挿入は、ＯＲＦ２ｖ２によりコードされたＰＣＶ２カプシドタンパク質の発現を誘導することを示している。 図６は、実験的なワクチン、実施例７．１の群１から４で得られたＭｈｙｏに対する血清学的応答を示している。群５及び６は、非ワクチン接種であるが感染対照グループ、及び非ワクチン接種であって非感染対照グループにそれぞれ対応する。分析が実施された試験の日はｘ軸上であり、及びＥＬＩＳＡによって測定し％として表されるＳ／Ｐ比（サンプル／ポジティブ）が、Ｍｈｙｏに対するＩｇＧ抗体応答の指標としてｙ軸上に表される。アスタリスクは、非ワクチン接種であるが感染対照グループに関する差が統計的に有意である（マン・ホイットニーのＵ検定によってｐ＜０．０５）ことを示している。 図７は、実験的なワクチン、実施例７．１の群１から４で得られたブタサーコウイルス（ＰＣＶ２）に対する血清学的応答を示している。群５及び６は、非ワクチン接種であるが感染対照グループ、及び非ワクチン接種であって非感染対照グループにそれぞれ対応する。分析が実施された試験の日はｘ軸上であり、及びＥＬＩＳＡによって測定し％として表されるＳ／Ｐ比（サンプル／ポジティブ）が、ＰＣＶ２に対するＩｇＧ抗体応答の指標としてｙ軸上に表される。アスタリスクは、非ワクチン接種であるが感染対照グループに関する差が統計的に有意である（一方向ＡＮＯＶＡ検定によってｐ＜０．０５）ことを示している。 図８は、実施例７．１における治療群１から４及び対照グループ５及び６における血清ウイルス負荷を示す。分析が実施された試験の日はｘ軸上であり、コピー／ｍｌで表されたブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）の血清ウイルス負荷のｌｏｇ_１０は、ｙ軸上に表される。アスタリスクは、対照グループ（非ワクチン接種で感染）に関する差が統計的に有意である（マン・ホイットニーのＵ検定によってｐ＜０．０５）ことを示している。 図９は、実施例８．２によるＭｈｙｏによる感染に対する血清学的応答を示す。群１は実施例４．８の変異株に感染した動物に対応し、群２は野生型親株に感染した動物に対応し、群３は非感染対照グループである。分析が実施された試験の日はｘ軸上であり、及びＥＬＩＳＡによって測定し％として表されるＳ／Ｐ比（サンプル／ポジティブ）が、Ｍｈｙｏに対するＩｇＧ抗体応答の指標としてｙ軸上に表される。アスタリスクは、野生型親株で感染した群に関する差が統計的に有意である（一方向ＡＮＯＶＡ検定によってｐ＜０．０５）ことを示している。 図１０は、実施例８．２のＭｈｙｏ ＰＣＲ陽性動物の割合を示している。群１は実施例４．８の変異株に感染した動物に対応し、群２は野生型親株に感染した動物に対応し、群３は非感染対照グループである。分析が実施された試験の日は、分析される試料のタイプ（経鼻又ｈは気管支）と同様にｘ軸上であり、ＰＣＲ陽性動物の割合はｙ軸上に表される。アスタリスクは、野生型親株で感染した群に関する差が統計的に有意である（フィッシャーの直接確率検定によってｐ＜０．０５）ことを示している。 図１１は、実施例８．２のアッセイに従ったＭｈｙｏによる感染に起因し得る病変により罹患した肺の平均表面を示している。群１は実施例４．８の変異株に感染した動物に対応し、群２は野生型親株に感染した動物に対応し、群３は非感染対照グループである。罹患した肺表面の平均値はｙ軸上に表される。アスタリスクは、野生型親株で感染した群に関する差が統計的に有意である（マン・ホイットニーのＵ検定によってｐ＜０．０５）ことを示している。 図１２は、実施例７．２における治療群１及び対照グループ２及び３において測定された血清ウイルス負荷を示す。分析が実施された試験の日はｘ軸上であり、定量的ＰＣＲにより測定されたコピー／ｍｌで表されたブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）の血清ウイルス負荷のｌｏｇ_１０は、ｙ軸上に表される。 図１３は、実施例７．２における治療群１及び対照グループ２及び３におけるＰＣＶ２によるウイルス血症を示す動物の割合を示す。感染後に分析が実施された日は、ｘ軸上であり、陽性動物の割合はｙ軸上に表される。 図１４は、感染後２８日目において実施例７．２の治療群１と対照グループ２及び３の、パーセンテージで表されたＭｈｙｏ様病変により罹患した肺の表面の中央値を示している。群はｘ軸上であり、Ｍｈｙｏ様病変により罹患した表面の中央値はｙ軸上である。

発明の詳細な説明
本発明の目的は、Ｍ．ハイオニューモニエのプロモーター領域と少なくとも８０％の同一性の程度を有するＤＮＡ配列の制御下にある配列である、少なくとも一の外来性ＤＮＡ配列を含むキャリアベクターを用いることによってＭ．ハイオニューモニエの株を形質転換する工程を含む、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの変異株を調製するための方法である。

細胞質ゾルにおいて外来性ＤＮＡ配列又はそのゲノムを安定的に取り込み、前記配列の内容を発現する、Ｍｈｙｏの変異株が、本発明の方法によって得ることができる。
本発明の方法は更に、当業者によって周知であり前記方法に必須ではない細菌の変異株を調製するための方法の典型的な工程を含む。
従って、本発明の方法は更に以下の工程：
ａ）形質転換工程で細菌にベクターを導入する前に、ベクターを構築し、及び
ｂ）形質転換工程の後、外来性ＤＮＡ配列で形質転換された変異細菌を選択する
工程を含む。

本発明の方法の有効性は、実施例において後述するように、形質転換株中に存在するＤＮＡ配列を単離し特徴付ける手段によって、並びに例えば、変異株の遺伝子型又は表現型の特徴を確認する手段によって、又は同じものによる組換えタンパク質の生成を確認する手段によって決定される。

細胞質ゾルにおいて外来性ＤＮＡ配列又はそのゲノムを安定的に取り込み、前記配列の内容を発現する、Ｍｈｙｏの変異株が、本発明の方法で使用されるキャリアベクターの手段により得ることができる。

好ましい実施態様では、キャリアベクターは、複製プラスミドベクター及びトランスポゾンベクターからなる群から選択される。

好ましい実施態様において、キャリアベクターは、複製プラスミドベクターである。

本発明の文脈では、「複製プラスミドベクター」又は「複製プラスミド」は、エピソームエレメントが自己複製染色体外ユニットである、宿主細菌におけるエピソームエレメントのように複製するＤＮＡ配列を運ぶベクターとしてとして理解されている。

本発明の文脈において、複製プラスミドベクターは、Ｍｈｙｏ細菌の細胞質ゾルに外来性ＤＮＡ配列を安定した方法で取り込み、任意で、細菌の細胞質ゾルの中で前記配列によりコードされたＲＮＡ又はタンパク質を発現することを可能にするものである。

好ましい実施態様では、キャリアベクターはベクター、好ましくはプラスミドであり、そこに包含される少なくとも一の外来性ＤＮＡ配列は、Ｍｈｙｏの株のゲノム中に転位により組み込まれる。このことは、ＩＲＩ及びＩＲＯと呼ばれる反転した反復配列の間に含まれる部分であり、かつ少なくとも一の外来性ＤＮＡ配列を含む、ベクターの実質的な部分を、転位によってそのゲノムに取り入れるＭｈｙｏの変異株を得るように、その株は、転位によりキャリアベクターで形質転換されることを意味する。前記反転した反復がトランスポザーゼ標的配列である。

本発明の文脈において、「トランスポゾンベクター」は、ＤＮＡ配列を運ぶベクターとして理解され、それらのうちの少なくとも一が転位によって宿主のゲノムに取り込まれる。

本発明の方法では、トランスポゾンベクターは、Ｍｈｙｏの細菌のゲノムにおいて外来性ＤＮＡ配列を安定的に取り込むことができるものである。

前記取り込みは細菌のゲノム中にランダムに起きる。従って、前記挿入が発生する特定の部位に応じて、細菌の遺伝子配列がトランスポゾンの挿入によって中断されているので、細菌の遺伝子のいずれかを不活性化することができる。不活性化された遺伝子がＭｈｙｏの病原性因子に関与している場合は、得られた株は、ＰＥＰに対する弱毒化ワクチンを調製するために用いることができ、更にＰＥＰに対するマーカーワクチンを得ることを可能にする。加えて、及び複製ベクターの場合のように、異なる機能を有する組換えタンパク質を発現させるために、トランスポゾンはＭｈｙｏのプロモーター領域の制御下に他の遺伝子を含むことができる。

本発明の方法によって行われた遺伝子改変がゲノムに組み込まれているので、形質転換株は次の世代に対して安定している。

外来性ＤＮＡ配列
本発明の文脈では、「外来性ＤＮＡ配列は、Ｍｈｙｏの株の細胞質ゾル又はゲノムに安定的に導入されたＤＮＡ断片として理解される。
しかしながら、本発明の方法によって、外来性ＤＮＡ配列は、該外因性配列で形質転換されている細菌の後に続く世代にわたって失われることはないので、外来性ＤＮＡ配列はＭｈｙｏの株に安定的に導入することができることが見出されている。この安定性は、外来性ＤＮＡ配列は、形質転換された細菌の内部で、及びその子孫において複製することができ、そして形質転換された細菌の複数の世代後に回復することができることを意味する。

外来性ＤＮＡ配列は非常に多様であることができ、以下に説明するように、広い定義を有する。

本発明の文脈では、前記配列は、例えば、マーカー遺伝子であることができる。外来性ＤＮＡ配列を含むベクターは、通常、形質転換された変異株を容易に選択できる前記マーカーを含む。前記遺伝子マーカーは、例えば、抗生物質耐性遺伝子であることができる。これらは、例えば、Dybvig et al., J. Bacteriol, 2000, 182, 4343-4347に記載される、プラスミドｐＩＶＴ−１からのテトラサイクリンに対する耐性を付与する、ＴｅｔＭ遺伝子、又は、例えばChow et al., Antimicrob. Agents Chemother., 2001, 45/10), 2691-2694に記載される、ゲンタマイシン等のアミノグリコシド系抗生物質に対する耐性を付与するａａｃ（６’）−ａｐｈ（２”）遺伝子を含み得る。表現型選択のための遺伝子は、好ましくは、ＴｅｔＭ遺伝子である。

外来性ＤＮＡ配列は、例えば、バクテリオファージＰ１のＣｒｅリコンビナーゼ、又はトランスポゾンＴｎ４００１のトランスポザーゼ、又はトランスポザーゼ標的配列、例えばＩＲＩ又はＩＲＯなど、組換えタンパク質をコードする遺伝子であることができる。

外来性ＤＮＡ配列はまた、治療又は予防目的の組換えタンパク質をコードする遺伝子であることができる。前記タンパク質はブタに疾患を引き起こす微生物の病原性因子又は抗原決定基と関連することができ、ブタが罹患し得る疾患又は病的状態に対する防御応答を誘導し又はその誘導に貢献することができる。外来性ＤＮＡ配列は、アクチノバチルス属（Actinobacillus sp.）、ブラキスピラ属（Brachyspira sp.）、パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）、サルモネラ属（Salmonella sp.）、連鎖球菌属（Streptococcus sp.）、イソスポラ属（Isospora sp.）、ブタ丹毒菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）、レプトスピラ属（Leptospira sp.）、ブドウ球菌属（Staphylococcus sp.）、ヘモフィルス・パラスイス（Haemophilus parasuis）、気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica）、クロストリジウム属（Clostridium sp.）、マイコプラズマ属（Mycoplasma sp.）、ローソニア・イントラセルラリス（Lawsonia intracellularis）、大腸菌、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタパルボウイルス、脳心筋炎ウイルス、コロナウイルス、ロタウイルス、ブタ離乳後成長不全症候群薬剤、ブタコレラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、カリシウイルス、トルクテノウイルス（ＴＴＶ）及びブタサーコウイルスによって形成された群からの微生物によって引き起こされる、ブタに影響を及ぼす疾患又は病理学的状態に対する防御応答を誘導する組換えタンパク質を好ましくはコードする。これらの中でも、例えば、ブタ繁殖呼吸器系ウイルス（ＰＲＲＳ）の糖タンパク質５（ｇｐ５）をコードする遺伝子、ブタサーコウイルス２型のカプシドタンパク質（ＰＣＶ２）をコードする遺伝子、ブタコレラウイルスの糖タンパク質Ｅ（ｇｐＥ）をコードする遺伝子、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）のＳＰ１のタンパク質をコードする遺伝子、パスツレラ・マルトシダの毒素をコードする遺伝子、気管支敗血症菌のｄｅｒｍｏｎｅｃｒｏｔｏｘｉｎをコードする遺伝子、クロストリジウム属（Clostridium spp）、大腸菌、又はアクチノバチルス・プルロニューモニアの毒素をコードする遺伝子が挙げられる。好ましい実施態様において、前記タンパク質は、上記の疾患に対する防御応答を誘導した。

ＭｈｙｏからのＤＮＡ断片は、任意で他のＤＮＡ断片と並べ替えられ又は再結合され、外来性ＤＮＡ配列であると考えられる。この外来性ＤＮＡ配列の例は、前記遺伝子の転写及び翻訳の速度を増加させる、例えば、Ｍｈｙｏの複製起点ｏｒｉＣ、アンチセンスＲＮＡ配列、又はＭｈｙｏ Ｐ９７又はＰ４６タンパク質をコードする遺伝子である。

外来性ＤＮＡ配列は、好ましくは、抗生物質耐性遺伝子、リコンビナーゼをコードする遺伝子、トランスポザーゼをコードする遺伝子、トランスポザーゼ標的配列、ＭｈｙｏからのＤＮＡ断片、好ましくは、一又は幾つかのＤＮＡ断片と並べ替えられ或いは再結合された断片、ブタの疾患を引き起こす微生物の抗原成分をコードする遺伝子、及びそれらの組み合わせ；より好ましくは、抗生物質に対する耐性を付与するマーカー遺伝子、ブタの疾患を引き起こす微生物の抗原成分をコードする遺伝子、又はそれらの組み合わせ；更により好ましくはブタ疾患を引き起こす微生物の抗原成分をコードする遺伝子と組み合わせた抗生物質耐性遺伝子、好ましくは、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）のカプシドタンパク質をコードする遺伝子であって、任意で、Ｍｈｙｏ膜タンパク質、好ましくはＭｈｙｏ Ｐ４６タンパク質をコードする遺伝子と組み合わせたものからなる群から選択される。

Ｍｈｙｏのプロモーター領域
本発明の文脈において、「Ｍｈｙｏのプロモーター領域」は、Ｍｈｙｏ ＤＮＡ配列の転写を開始又は促進するＭｈｙｏの特徴的なＤＮＡ配列として理解されている。

外来性ＤＮＡ配列の転写を開始又は促進するＤＮＡ配列は、Ｍｈｙｏのプロモーター領域と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％、更に好ましくは１００％の同一性の程度を有している。

特に好ましい実施態様において、外来性ＤＮＡ配列の転写を開始又は促進するＤＮＡ配列は、Ｍｈｙｏのプロモーター領域と、１００％の同一性の程度を有している。

いったんＲＮＡポリメラーゼホロ酵素によって、その３’末端に向かって、メッセンジャーＲＮＡ（転写産物）の合成を誘導する配列はプロモーター領域として理解される。この転写産物は、正常に翻訳され、特定の機能を有するタンパク質を生成し、又は、タンパク質合成又は前記転写活性の調節に干渉するＲＮＡをもたらす。

当業者には「プロモーター領域」なる表現の意味は周知であり、標準的な手段によって同定することができる。

Ｍｈｙｏのプロモーター領域は、十分に確立されたＭｈｙｏコード配列の５’側に位置する好ましくは、少なくとも５０塩基対、好ましくは、少なくとも１００塩基対、より好ましくは少なくとも２００塩基対、更により好ましくは２００から３００塩基対を含むＤＮＡセグメントに対応する。

特に好ましい実施態様において、本方法及び本発明のキャリアベクターでプロモーターとして使用したＤＮＡ配列は、少なくとも５０塩基対を含む、Ｍｈｙｏのプロモーター領域と１００％の同一性の程度を有する。

更により好ましい実施態様において、本方法及び本発明のキャリアベクターでプロモーターとして使用したＤＮＡ配列は、２００から３００塩基対を含む、Ｍｈｙｏのプロモーター領域と１００％の同一性の程度を有する。

本発明の文脈において、「十分に確立されたコード配列」とは、Ｍｈｙｏタンパク質、又はタンパク質合成又は転写活性の調節に干渉するＲＮＡをもたらすＭｈｙｏゲノムの転写活性領域をコードするＤＮＡ配列として理解されている。これらの配列は、例えば、Minion et al., J. Bacteriol., 2004, 186(21), 7123-7133に記載される、Ｐ４６、Ｐ６５、Ｐ９７、及びＰ１０２表面タンパク質；Vasconcelos et al., J. Bacteriol., 2005, 187(16), 5568-5577に記載されるＰ７６、Ｐ１４６、Ｐ２１６アドヘシン又はＰ９５膜タンパク質；又はCaron et al., J. Clin. Microbiol., 2000, 38(4), 1390-1396に記載されるＰ３６細胞質タンパク質又はリボソームＲＮＡが含まれる。

好ましい実施態様において、Ｍｈｙｏのプロモーター領域は、Ｐ３６、Ｐ４６、Ｐ６５、Ｐ７６、Ｐ９７、Ｐ１０２、Ｐ１４６、及びＰ２１６タンパク質、より好ましくは、Ｐ４６及びＰ９７タンパク質により形成される群から選択されるＭｈｙｏタンパク質の遺伝子のプロモーター領域を含み、更により好ましくは、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに番号ＡＥ０１７２４３で寄託され、上述のVasconcelosらに記載される、Ｐ９７タンパク質をコードし、Ｍｈｙｏ株Ｊの塩基２１４２９３と２１４５５７の間に含まれるＤＮＡ配列に対応するＭｈｙｏ株Ｊのｍｈｊ＿０１９４遺伝子のプロモーター領域（配列番号１）、及びＰ４６タンパク質をコードし、Ｍｈｙｏ株Ｊの塩基６５６４５１と６５６７１３の間に含まれるＤＮＡ配列に対応するＭｈｙｏ株Ｊの遺伝子ｍｈｊ＿０５１１のプロモーター領域（配列番号２）を含む群から選択される。

外因性配列を制御するＭｈｙｏのプロモーター領域は、全ての配列に対して同一であり得るか、又は異なっていてもよい。好ましくは、それは同じである。

ＤＮＡのプロモーター配列は、好ましくは、十分に確立されＭｈｙｏコード配列の５’側に位置し、本発明の方法を実施する、少なくとも５０塩基対、好ましくは、少なくとも１００塩基対、より好ましくは、少なくとも２００塩基対、更により好ましくは２００から３００塩基対を含む、Ｍｈｙｏのプロモーター領域と、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９９％、更により好ましくは１００％の同一性の程度を有するＤＮＡ配列を選択することにより、当業者によって容易に同定することができる。ＤＮＡのプロモーター配列を同定するための方法は、例えば、the Sambrook and Russell manual, Molecular Cloning 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York (2001)に記載されている。

複製プラスミドベクター
本発明の対象は、
１）マイコプラズマ属の株のｏｒｉＣ領域を含むＤＮＡ配列、及び
２）Ｍｈｙｏのプロモーター領域と少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％の同一性の程度を有するＤＮＡ配列の制御下にある、マーカー遺伝子、及び任意で付加的な外来性ＤＮＡ配列を含む外来性ＤＮＡ配列
を含む複製プラスミドベクターである。

特に好ましい実施態様において、外来性ＤＮＡ配列の転写を開始又は促進するＤＮＡ配列は、２００から３００塩基対を含み、Ｍｈｙｏのプロモーター領域と１００％の同一性の程度を有している。

本発明の複製プラスミドには、Ｍｈｙｏ Ｐ９７タンパク質の遺伝子のプロモーター領域、及びＭｈｙｏ Ｐ４６タンパク質の遺伝子のプロモーター領域からなる群から選択されるＭｈｙｏのプロモーター領域が好ましくは使用され、Ｍｈｙｏのプロモーター領域は、好ましくは、Ｍｈｙｏ Ｐ９７タンパク質の遺伝子のプロモーター領域又は代替的に、上述したＭｈｙｏ Ｐ４６タンパク質の遺伝子のプロモーター領域を含む。

複製プラスミドに含まれる配列を制御するＭｈｙｏのプロモーター領域は、全ての配列に対して同一であり得るか、又は異なっていてもよい。それは、好ましくは、同じ配列である。

ｏｒｉＣ領域は、エピソーム要素のように、導入されたＤＮＡ断片の複製、そして形質転換された細胞の子孫でこのＤＮＡ断片を安定的に維持し、好ましくは、表現型選択のための条件を維持することを可能にする。

本発明の複製プラスミドベクターにおいて、ｏｒｉＣ領域は、マイコプラズマ属の株のｏｒｉＣ領域である。

本発明の文脈において、マイコプラズマ属は、例えば、とりわけ、肺炎マイコプラズマ、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ、マイコプラズマ・ホミニス、マイコプラズマ・ゲニタリウム、マイコプラズマ・プルモニス、マイコプラズマ・カプリーコム、マイコプラズマ・ミコイデス（M. mycoides）、マイコプラズマ・オビニューモニエ、M. haemofelis、マイコプラズマ・ガリセプティカム、マイコプラズマ・ラボラトリウム、又はマイコプラズマ・ボビスなどのマイコプラズマ属の何れかの細菌として理解される。

好ましい実施態様において、ｏｒｉＣ領域はＭｈｙｏの株に属し、より好ましくは株Ｊに属し、より好ましくは、それはＭｈｙｏ株Ｊの塩基８９７２６２と１８０２年の間に含まれるＤＮＡ配列を含む。

表現型の選択のための遺伝子とも呼ばれるマーカー遺伝子は、上述したように、プラスミドに外来性ＤＮＡ配列を組み込んだクローンの選択を可能にする。

好ましい実施態様において、ベクターは付加的な外来性ＤＮＡ配列を含む。一価又は多価のワクチン、場合によってはマーカーワクチンを調製するために使用することができるＭｈｙｏの変異株は、前記変異体のその後の修飾のために有用な遺伝子ツール、例えばファージＰ１のＣｒｅリコンビナーゼ、サッカロマイセス・セレビシエのＦＬＰリコンビナーゼ、テトラサイクリンリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）を発現することもでき、或いは特定のＭｈｙｏ遺伝子の翻訳を完全に又は部分的にブロックすることができるものであり、前記付加的な外来性ＤＮＡ配列を用いて得ることができる。

複製プラスミドに組み込むことができる付加的な外来性ＤＮＡ配列は、例えば、ファージＰ１のＣｒｅリコンビナーゼをコードするＯＲＦ ｃｒｅ遺伝子を含む。

Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ配列型配列に挟まれたＤＮＡ領域を分割する能力を有する。これにより、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼが発現されるときに、複製プラスミドがｃｒｅＯＲＦ遺伝子及びｌｏｘＰ型配列に挟まれた抗生物質に対する耐性遺伝子、例えば、ｌｏｘ６６を含む場合、抗生物質耐性は形質転換細菌によって排除される。言い換えれば、後の工程で、マーカー遺伝子を除去することができる。これは弱毒化した病原性を持つＭｈｙｏの形質転換された変異株を調製する場合に重要であり、抗生物質に対する耐性遺伝子の存在は所望されない特徴である生ワクチンを調製するために使用される。

好ましい実施態様において、複製プラスミドは、治療又は予防目的の組換えタンパク質をコードする付加的な外来性ＤＮＡ配列を含む。前記タンパク質は、ブタに疾患を引き起こす微生物の病原性因子又は抗原決定基と関連することができ、そして、上記の微生物によって引き起こされ、ブタが罹患し得る疾患又は病的状態に対する防御応答を誘導し又はその誘導に貢献することができる。

好ましい実施態様において、複製プラスミドは、治療又は予防目的の組換えタンパク質をコードする付加的な外来性ＤＮＡ配列を少なくとも２回、好ましくは、２回、より好ましくは２又は３回含む。このようにして、付加的な外来性ＤＮＡ配列のいくつかのコピーが導入され、そのタンパク質の発現量が増加する。複製プラスミドに含まれる配列を制御するＭｈｙｏのプロモーター領域は、全ての配列に対して同一であり得るか、又は異なっていてもよい。

更により好ましい実施態様において、付加的な外来性ＤＮＡ配列は、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）のカプシドタンパク質をコードする配列、及び前記タンパク質のＮ末端にＭｅｔＳｅｒＧｌｙＳｅｒアミノ酸を付加的に有するブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）のカプシドタンパク質を含むタンパク質をコードする外来性ＤＮＡ配列からなる群から選択され、ここで、前記カプシドタンパク質は、受託番号ＡＡＣ６１８６４でＧｅｎＢａｎｋデータベースに記載されている（配列番号６）。

更により好ましい実施態様において、付加的な外因性ＤＮＡ配列は、配列番号３、配列番号４及び配列番号５により形成される群から選択される前記タンパク質に対応するアミノ酸の各々について、Ｍｈｙｏゲノムにおいて最も一般的なコドンを用いて、ＰＣＶ２カプシドタンパク質をコードする。

配列番号３は６９９塩基対を有し、配列番号４は７０２塩基対を有し、そして配列番号５は、Ｍｈｙｏ株Ｊの塩基２１４２９３及び２１４５５７の間に含まれるＤＮＡ配列に対応する、Ｐ９７タンパク質の遺伝子のプロモーター領域をも組み込んでいるため、他の二つより実質的に大きい長さを有するＤＮＡ配列である９９２塩基対を有し、こうしてクローニング工程を簡素化する。本説明では、配列番号５はまたＯＲＦ２ｖ２とも呼ばれる。

好ましい実施態様において、付加的な外来性ＤＮＡ配列は、Ｍｈｙｏ膜タンパク質の遺伝子をコードする最後の塩基に融合したＰＣＶ２ウイルスカプシド（ＯＲＦ２）タンパク質の遺伝子を含み、好ましくは、Ｍｈｙｏ膜タンパク質は、Ｐ４６タンパク質及びＰ９７タンパク質からなる群から選択され、より好ましくは、それはＰ４６タンパク質であり、より好ましくはＭｈｙｏ Ｐ４６又はＰ９７タンパク質の遺伝子のプロモーターの制御下にあり、更により好ましくはＭｈｙｏ Ｐ４６タンパク質遺伝子のプロモーターの制御下にある。

Ｐ４６タンパク質の場合において、融合は、前記膜タンパク質をコードする遺伝子の３’末端で起こる（塩基７６４８から８９０４）。このプラスミドは、アミノ酸１から４１９はＰ４６タンパク質からのものであり、及びアミノ酸４２０から６５２は、ＰＣＶ２ウイルスキャプシドタンパク質、ＯＲＦ２バージョン（塩基６９４６から７６４７）に対応することを特徴とするハイブリッドタンパク質の合成を導く。

好ましい実施態様において、付加的な外来性ＤＮＡ配列は、Ｍｈｙｏ膜タンパク質のループをコードするＤＮＡ配列に挿入されたＰＣＶ２カプシドタンパク質をコードする遺伝子を含み、好ましくは、Ｍｈｙｏ膜タンパク質は、Ｐ４６タンパク質及びＰ９７タンパク質からなる群から選択され、より好ましくは、それはＰ４６タンパク質であり、より好ましくはＭｈｙｏ Ｐ４６又はＰ９７タンパク質の遺伝子のプロモーターの制御下にあり、更により好ましくはＭｈｙｏ Ｐ４６タンパク質遺伝子のプロモーターの制御下にある。

Ｐ４６タンパク質による好ましい実施態様の場合、本プラスミドは、アミノ酸１から９２は、Ｐ４６タンパク質のＮ末端からのものであり、アミノ酸９５から３２７は、ＰＣＶ２ウイルスキャプシドのタンパク質に対応し、及びアミノ酸３３０から６５６はＭｈｙｏ Ｐ４６タンパク質のＣ末端からのものであることを特徴とするハイブリッドタンパク質の合成を導く。

ループは、当業者に周知の方法によって、アミノ酸配列において同定され、それにより合理的な有効性でそれらの位置を予測することが可能である。

前記ループは、一般に高い柔軟性を提示し、他のタンパク質からのアミノ酸配列の挿入において良好な許容度を有している。更に、それらは、細菌の表面に露出しているので、それらは、良好な免疫原性応答の発生を可能にする。

好ましい実施態様において、複製プラスミドは、Ｍｈｙｏのプロモーター領域に対して逆向きであるＭｈｙｏ遺伝子である付加的な外来性ＤＮＡ配列を含み、好ましくはＭｈｙｏ遺伝子は、好ましくはＭｈｙｏ Ｐ４６又はＰ９７タンパク質のプロモーターの制御下で、更により好ましくはＭｈｙｏのＰ４６タンパク質のプロモーターの制御下で、Ｍｈｙｏの病原性因子をコードする。

前記ＤＮＡ配列は、前記Ｍｈｙｏ遺伝子の翻訳をブロックすることができるアンチセンスＲＮＡを生成することができる。それがＭｈｙｏの病原性因子をコードする遺伝子であれば、形質転換は微生物の病原性の程度を減少させることができる。

より好ましい実施態様において、複製プラスミドは、Ｍｈｙｏのプロモーター領域に対して逆向きである、Ｍｈｙｏ株Ｊのゲノムの塩基１９４５３５との１９４６５４の間に含まれる配列を含む。

前記配列はＭｈｙｏ溶血素に対応した、前記株のｔｌｙＡ遺伝子の翻訳を阻止することができるアンチセンスＲＮＡを生成する。

実施例は、プラスミドＰＯＧ、ｐＯＧＣＲＥ、ｐＯＧＡ１５９、ＰＯＧＣ、ｐＯＧＬ及びｐＯＧＴの調製を記載している。最初は、ゲンタマイシン耐性を付与するａａｃ（６’）−ａｐｈ（２”）遺伝子を組み込む。更に、プラスミドｐＯＧＣＲＥは、ファージＰ１のＣｒｅリコンビナーゼをコードするＯＲＦ ｃｒｅ遺伝子を組み込み；プラスミドｐＯＧＡ１５９はＭｈｙｏの溶血素ａ１５９遺伝子の翻訳の抑制配列を組み込み；一方、プラスミドｐＯＧＣ、ｐＯＧＬ及びｐＯＧＴはさらに、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）のキャプシドタンパク質の異なるタンパク質のバージョンをコードする遺伝子を組み込む。

トランスポゾンベクター
本発明の別の目的は、トランスポゾンベクターであり、好ましくは、
１）トランスポザーゼをコードするＤＮＡ配列、
２）マーカー遺伝子を含む外来性ＤＮＡ配列、
３）任意で、付加的な外来性ＤＮＡ配列
を含むプラスミドであり、
トランスポザーゼ及び外来性ＤＮＡ配列の少なくとも一をコードするＤＮＡは、Ｍｈｙｏのプロモーター領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の同一性の程度を有するＤＮＡ配列の制御下にある。

特に好ましい実施態様において、ＤＮＡ配列の転写を開始又は促進するＤＮＡ配列は、２００から３００塩基対を含み、Ｍｈｙｏのプロモーター領域と１００％の同一性の程度を有している。

トランスポザーゼをコードする遺伝子は、トランスポゾンに特異的な配列に結合し、前記トランスポゾンのゲノムの別の部分への移動を触媒する酵素をコードするＤＮＡ配列を含む。トランスポザーゼをコードする遺伝子の選択は重要ではない。トランスポザーゼをコードする遺伝子は、上述のプラスミドｐＩＶＴ−１に組み込まれたトランスポゾンＴＮ４００１Ｔ、又は、Cao et al., J. Bacteriol., 1994, 176(14), 4459-4462に記載のプラスミドｐＡＭ１２０に組み込まれたトランスポゾンＴｎ９１６を含む。

マーカー遺伝子又は表現型選択のための遺伝子は、例えば、上述されたＴｅｔＭ遺伝子、又はａａｃ（６’）−ａｐｈ（２”）遺伝子など抗生物質に対する耐性遺伝子であることができる。表現型選択のための遺伝子は、好ましくは、ＴｅｔＭ遺伝子である。

マーカー遺伝子は、例えば、上記のプラスミドｐＩＶＴ−１に存在するトランスポゾンのものなど、２つの逆方向反復によって隣接される。前記配列は、トランスポザーゼにより認識され、それらが無ければ、表現型選択のための遺伝子は、細菌染色体へ移動することはなく、遺伝子改変は行われないであろう。遺伝子改変はゲノムに組み込まれるので、形質転換された細胞の後続世代にわたって維持されるであろう。

逆方向反復は好ましくは、ＩＲＯでは配列番号７、ＩＲＩでは配列番号８の配列に存在する。

上述したように、Ｍｈｙｏ Ｐ９７タンパク質の遺伝子のプロモーター領域、及びＭｈｙｏ Ｐ４６タンパク質の遺伝子のプロモーター領域を含む群から選択されるＭｈｙｏのプロモーター領域は、好ましくは、本発明のトランスポゾンベクターに使用される。Ｍｈｙｏのプロモーター領域は、好ましくは、Ｍｈｙｏ Ｐ９７タンパク質の遺伝子のプロモーター領域、又は代わりにＭｈｙｏ Ｐ４６タンパク質の遺伝子のプロモーター領域を含む。

トランスポゾンベクターに含まれる配列を制御するＭｈｙｏのプロモーター領域は、全ての配列に対して同一であり得るか、又は異なっていてもよい。好ましくは、それは同じである。

複製プラスミドの場合に説明したのと同様に、所望の実施態様において、トランスポゾンベクターは、目的の組換えタンパク質をコードする付加的な外来性ＤＮＡ配列を更に含む。前記タンパク質は、ブタが罹患し得る疾患又は病的状態に対する防御応答を誘導し又はその誘導に貢献することができる。

好ましい実施態様において、トランスポゾンベクターは、治療又は予防目的の組換えタンパク質をコードする付加的な外来性ＤＮＡ配列を少なくとも２回、好ましくは、２回、より好ましくは２又は３回含む。このようにして、付加的な外来性ＤＮＡ配列のいくつかのコピーが導入され、そのタンパク質の発現量が増加する。トランスポゾンベクターに含まれる配列を制御するＭｈｙｏのプロモーター領域は、全ての配列に対して同一であり得るか、又は異なっていてもよい。

更により好ましい実施態様において、付加的な外来性ＤＮＡ配列は、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）のカプシドタンパク質をコードする配列、及び前記タンパク質のＮ末端にＭｅｔＳｅｒＧｌｙＳｅｒアミノ酸を付加的に有するブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）のカプシドタンパク質を含むタンパク質をコードする外来性ＤＮＡ配列から選択され、ここで、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）のカプシドタンパク質は、受託番号ＡＡＣ６１８６４でＧｅｎＢａｎｋデータベースに記載されている（配列番号６）。

更により好ましい実施態様において、付加的な外因性ＤＮＡ配列は、配列番号３、配列番号４及び配列番号５により形成される群から選択される前記タンパク質に対応するアミノ酸の各々について、Ｍｈｙｏゲノムにおいて最も一般的なコドンを用いて、ＰＣＶ２カプシドタンパク質をコードし、ここでＤＮＡ配列の各々はＭｈｙｏのプロモーター領域の制御下にある。Ｍｈｙｏ Ｐ９７タンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域を既に含む配列番号５は、より好ましく用いられる。

好ましい実施態様において、付加的な外来性ＤＮＡ配列は、Ｍｈｙｏ膜タンパク質の遺伝子をコードする最後の塩基に融合されたＰＣＶ２カプシドタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含み、好ましくは、膜タンパク質は、Ｐ４６タンパク質及びＰ９７タンパク質からなる群から選択され、より好ましくは、それはＰ４６タンパク質である。このプラスミドで形質転換された株は、ＰＣＶ２カプシドタンパク質に対応するアミノ酸が、その最後のアミノ酸の直後に位置するＭｈｙｏタンパク質を発現し、すなわち、それはＭｈｙｏ Ｐ４６又はＰ９７タンパク質及びＰＣＶ２カプシドタンパク質によって形成されたハイブリッドタンパク質を発現する。それが膜タンパク質であることを考慮すると、前記プラスミドで形質転換されたＭｈｙｏの株は、細菌膜中で両タンパク質の融合体を発現する。ＰＣＶ２カプシドタンパク質は、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５により形成される群から選択され、より好ましくはそれは配列番号４である。Ｍｈｙｏのプロモーター領域は、好ましくは、Ｍｈｙｏ Ｐ９７又はＰ４６タンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域であり、更により好ましくはＭｈｙｏ Ｐ４６タンパク質のプロモーターである。

別の好ましい実施態様において、付加的ＤＮＡ配列は、Ｍｈｙｏ膜タンパク質のループをコードするＤＮＡ配列に挿入されたＰＣＶ２カプシドタンパク質をコードする遺伝子を含み、膜タンパク質は、Ｐ４６タンパク質及びＰ９７タンパク質からなる群から好ましくは選択され、より好ましくは、それはＰ４６タンパク質である。このプラスミドで形質転換された株は、Ｍｈｙｏ Ｐ４６又はＰ９７蛋白質の間に挿入された、ＰＣＶ２カプシドタンパク質を発現し、即ち、それはＭｈｙｏ Ｐ４６又はＰ９７タンパク質及びＰＣＶ２カプシドタンパク質によって形成されたハイブリッドタンパク質を発現する。ＰＣＶ２カプシドタンパク質は、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５により形成される群から選択され、より好ましくはそれは配列番号３である。

好ましい実施態様において、ＰＣＶ２カプシドタンパク質は、Ｐ４６タンパク質のアミノ酸９２と９３との間に挿入される。

以下のトランスポゾンベクター、好ましくはプラスミドが、特に好ましい。
１）トランスポザーゼ、好ましくはトランスポゾンＴＮ４００１ＴをコードするＤＮＡ配列、マーカー遺伝子、好ましくはｔｅｔＭ遺伝子をコードし、任意でｌｏｘＰ型配列に隣接されたＤＮＡ配列、好ましくは、配列番号５によって定義されるＰＣＶ２カプシドタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むベクターであって、ここでＤＮＡ配列の各々は、Ｍｈｙｏ Ｐ９７タンパク質又はＰ４６タンパク質のプロモーター領域から選択され、好ましくは、Ｐ９７タンパク質のプロモーター領域である、Ｍｈｙｏのプロモーター領域の制御下にある。プラスミドのこのタイプの例は、ｐＴＣ３Ｃと呼ばれ、実施例の項に記載されている。
２）トランスポザーゼ、好ましくはトランスポゾンＴＮ４００１ＴをコードするＤＮＡ配列、マーカー遺伝子、好ましくはｔｅｔＭ遺伝子をコードし、任意でｌｏｘＰ配列に隣接されたＤＮＡ配列、及び、好ましくは配列番号４によって定義されるＰＣＶ２カプシドタンパク質をコードし、Ｍｈｙｏ膜タンパク質の遺伝子をコードする最後の塩基に融合されるＤＮＡ配列であって、好ましくは、該膜タンパク質は、Ｐ４６タンパク質及びＰ９７タンパク質からなる群から選択され、より好ましくは、それはＰ４６タンパク質である、ＤＮＡ配列含むベクターであって、ここでＤＮＡ配列の各々は、Ｍｈｙｏ Ｐ９７又はＰ４６タンパク質のプロモーター領域から選択され、好ましくはＰ４６タンパク質のプロモーター領域である、Ｍｈｙｏのプロモーター領域の制御下にある。プラスミドのこのタイプの例は、ｐＴＣ３Ｔと呼ばれ、実施例の項に記載されている。
３）トランスポザーゼ、好ましくはトランスポゾンＴＮ４００１ＴをコードするＤＮＡ配列、任意でｌｏｘＰ型配列に隣接された、マーカー遺伝子、好ましくはｔｅｔＭ遺伝子をコードするＤＮＡ配列、及び、好ましくは配列番号３によって定義されるＰＣＶ２カプシドタンパク質をコードし、Ｍｈｙｏ膜タンパク質のループに融合されるＤＮＡ配列であって、好ましくは、該膜タンパク質は、Ｐ４６タンパク質及びＰ９７タンパク質からなる群から選択され、より好ましくは、それはＰ４６タンパク質であり、好ましくはＰ４６タンパク質のアミノ酸９２と９３の間に挿入される、ＤＮＡ配列含むベクターであって、ここでＤＮＡ配列の各々は、Ｐ９７タンパク質又はＭｈｙｏ Ｐ４６タンパク質のプロモーター領域から選択され、好ましくはＰ４６タンパク質のプロモーター領域である、Ｍｈｙｏのプロモーター領域の制御下にある。プラスミドのこのタイプの例は、ｐＴＣ３Ｌと呼ばれ、実施例の項に記載されている。

これらの３つの好ましいベクターにおいて、外来性ＤＮＡ配列の群は、トランスポゼースをコードする配列を除いて、形質転換されるべきＭｈｙｏ細菌のゲノムへの前記群の組み込みを可能とする２つの逆方向反復に隣接している。逆方向反復は好ましくは、ＩＲＯでは配列番号７、ＩＲＩでは配列番号８の配列に存在する。

本発明の別の目的は、Ｍｈｙｏの変異株を調製するための、複製プラスミドベクター及びトランスポゾンベクターの使用である。

Ｍｈｙｏの株
Ｍｈｙｏの任意の株は、本発明の方法において使用することができ、すなわち、株は、とりわけ、野外株、コレクション株（例えば、株Ｊ又は株２３２）又は遺伝的に改変された株から選択することができる。

本発明の方法を適用するのに適したＭｈｙｏの株は、当業者によって使用される通常の方法に従って臨床的症例又は無症状症例から単離することができ、あるいは、タイプ・カルチャー・コレクションに寄託された株から選択することができる。臨床例では、株は、ＰＥＰの典型的な病理を提示するが、一方、無症状の場合、株は動物の粘膜膜にコロニー形成するがいかなる病理をも提示しない。本発明の方法を適用するために使用することができるＭｈｙｏの株は、様々な程度の病原性を示すことができる。Ｍｈｙｏの主な免疫原決定基を発現する病原性株又は株が、好ましくは、本発明の方法に使用される。本発明の方法において使用することができる株は、株２３２、そのゲノムはMinion et al., J. Bacteriol., 2004, 186(21), 7123-7133による論文に記載され、番号ＡＥ０１７３３２でＧｅｎＢａｎｋデータベースに収集される；株Ｊ、そのゲノムはVasconcelos et al., J. Bacteriol., 2005, 187(16), 5568-5577による論文に記載され、番号ＡＥ０１７２４３でＧｅｎＢａｎｋデータベースに収集される；又は６３１４などの野生型株、これはLaboratorios Hipra, S.A. に属するＭｈｙｏの病原性分離株に対応する（Amer-Girona-Spain）、を含む。

株の形質転換
本発明の文脈において、「Ｍｈｙｏの株を形質転換する」とは、分子生物学の当業者によって理解される通常の意味を持ち、細菌、この場合Ｍｈｙｏ細菌が外来性ＤＮＡ配列を組み込み、前記配列が特定の機能を遂行する方法を言う。

Ｍｈｙｏ細菌に組み込まれた外来性ＤＮＡ配列が遂行できる機能には、例えば、ＲＮＡ転写、タンパク質発現、他のＤＮＡ配列との組換え、又は宿主生物のゲノム中の遺伝子をコードする配列の中断が含まれる。

形質転換の方法は、外来性ＤＮＡ配列を細菌中に導入することができる３つの方法の一つである。他の２つは、直接接触した２つの細菌間で遺伝物質を移動させるコンジュゲーション、及びバクテリオファージウイルスを用いて細菌へ外来性ＤＮＡ配列を注入する形質導入である。

細菌の形質転換は、例えば、二価イオン例えば、塩化カルシウム又はリン酸カルシウムを含む塩の存在下での細菌のインキュベーション、ポリエチレングリコールの混合物への曝露、ポリビニルアルコールの存在下でのインキュベーション、外来性ＤＮＡ配列が脂質でコーティングされたリポソームの使用、ジエチルアミノエチルデキストラン媒介型トランスフェクション、又は電気穿孔又は電気的形質転換とも称される物理的処理による、又は遺伝子銃によるなど、当業者に周知の生化学的処置を用いて本発明の方法で行うことができる。

本発明の方法において、細菌は、好ましくは、二価イオンを含む塩の存在下で細菌をインキュベートし、ポリエチレングリコールの混合物に曝露し、又は電気穿孔に供することによって形質転換され；そしてより好ましくは電気穿孔によって実施される。

電気穿孔は当業者に周知の方法であり、その実験プロトコルは、例えば、上述したSambrookとRussellのマニュアルに記載されている。

電気穿孔法において、外来性ＤＮＡ配列を運ぶキャリアベクターを含む電気穿孔緩衝液中の細菌の懸濁液を、前記配列の細胞の進入を容易にするために、細菌膜の構造の変化を引き起こす電気パルスに供する。

電気穿孔の緩衝液は、例えば、上記のSambrookとRussellのマニュアルに記載されているものなど当業者に周知の電気穿孔に適した任意の緩衝液を用いることができるが、例えば、スクロース及び４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）により形成されたｐＨが７．２の緩衝液とすることができる。

外来性ＤＮＡ配列を運ぶキャリアベクターは、一般的に、０．１から５μｇ／ｍｌの間、好ましくは０．５から２μｇ／ｍｌの間に含まれる濃度で使用される。エレクトロポレーション緩衝液は、典型的には前記キャリアベクターのビヒクルとして使用される。

細菌の懸濁液は、一般的に１０^６と１０^１２ｃｆｕ／ｍｌの間で構成される。

電気穿孔は、１と３ｋＶの間に含まれる電圧、７５と３００Ωの間に含まれる抵抗値、そして１０と４０μＦの間に含まれるキャパシタンスで一般的に行うことができる。本発明の方法において、電気穿孔は、２と３ｋＶの間に含まれる電圧、１００と１７５Ωの間に含まれる抵抗値、そして２０と３０μＦの間に含まれるキャパシタンスで好ましくは行うことができる。

好ましい実施態様において、電気穿孔を行う前に、Ｍｈｙｏ細菌の懸濁液は、二価イオンキレート剤を含む電気穿孔緩衝液中でのインキュベーションに供される。前記工程は、本発明の方法の基本的なものではないが、それは著しく形質転換効率を高めることが観察された。

前記インキュベーションに使用することができるキレート化剤は、例えば、アミノカルボン酸、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、又はそれらのアルカリ塩；ヒドロキシカルボン酸、例えば、クエン酸、グルコン酸など、又はそれらのアルカリ塩；ホスホン酸、例えば、２−アミノエチルホスホン酸、１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジホスホン酸（ＨＥＤＰ）、アミノトリス（メチレンホスホン酸）（ＡＴＭＰ）、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン）酸（ＥＤＴＭＰ）、又はそれらのアルカリ塩が含まれる。キレート剤は、好ましくはＥＤＴＡである。

電気穿孔が実行されると、すなわち、電気パルスが放出されると、細菌の懸濁液は、好ましくは、外来性ＤＮＡ配列を含むキャリアベクターの追加量と共にインキュベートされる。

電気パルスを放出する前に追加される、同量のキャリアベクターが通常使用される。

前記インキュベーションは、細菌及びキャリアベクターの懸濁液を氷とともに約１時間未満の時間インキュベートし、その後５％の二酸化炭素環境下、３７℃の温度で２〜５時間の間に含まれる時間それを維持することによって実行することができる。

より好ましい実施態様において、電気穿孔を行う前に、Ｍｈｙｏ細菌の懸濁液は、二価イオンキレート剤を含む電気穿孔緩衝液中でのインキュベーションに供され、電気穿孔後、細菌の懸濁液は、外来性ＤＮＡ配列を含むキャリアベクターの追加量と共にインキュベートされる。

本発明の方法では、形質転換は、その少なくとも一部分は転位により組み込まれる、複製プラスミドベクターを用いて、又はベクター、好ましくはプラスミドを用いて行うことができる。

従って、本発明の方法によりＭｈｙｏの株の形質転換は、形質転換が転位によって行われている場合、そのゲノムに挿入された少なくとも一の外来性ＤＮＡ配列を含むＭｈｙｏの株を得ることを可能にし、又は、形質転換が複製プラスミドベクターを用いて行われている場合、Ｍｈｙｏで安定して自主的に複製する、染色体外ベクター（又はエピソームエレメント）中に前記ＤＮＡ断片を含む。

変異株を取得する
本発明の目的は、本発明の方法により得ることができるＭｈｙｏの変異株である。

本発明の別の目的は、ゲノム又はそれらの細胞質ゾル中に安定的に組み込まれる少なくとも一の外来性ＤＮＡ配列を含むＭｈｙｏの変異株である。好ましくは、外来性ＤＮＡ配列は、Ｍｈｙｏのプロモーター領域と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％、更に好ましくは１００％の同一性の程度を有しているＤＮＡ配列によって制御される。好ましい実施態様では、外来性ＤＮＡ配列は、本発明の複製プラスミドベクターに含まれる。

別の好ましい実施態様では、外来性ＤＮＡ配列は、本発明のトランスポゾンベクターのＩＲＩとＩＲＯ逆方向配列反復の間に含まれる。

本発明のＭｈｙｏの変異株は、本発明の複製プラスミドベクター又は本発明のトランスポゾンベクターの実質的な部分を含む。複製プラスミドベクターが使用される場合、Ｍｈｙｏの変異株は、その細胞質ゾル中の前記ベクターを含む。トランスポゾンベクターを用いる場合には、Ｍｈｙｏの変異株は、ＩＲＩとＩＲＯ逆方向配列反復の間に含まれる部分であり、少なくとも一の外来性ＤＮＡ配列を含むベクターの実質的な部分を組み込む。

本発明の別の目的は、本発明のキャリアベクターで形質転換されたＭｈｙｏの変異株である。

本発明の文脈において、「マイコプラズマ・ハイオニューモニエの変異株は、遺伝子工学的ツールを用いることによって遺伝的に改変されているＭｈｙｏの株として理解される。

前記変異株で機能的である、外来性ＤＮＡ配列安定してを組み込んだＭｈｙｏの変異株は、本発明の方法によって得ることができる。

本発明の文脈において、外来性ＤＮＡ配列は、例えば、それが前記配列によってコードされるタンパク質を発現し、ＲＮＡを転写し又は前記株を遺伝的に改変する際に、Ｍｈｙｏの変異株において機能的であることが理解される。

Ｍｈｙｏの形質転換株を得るための本発明の方法において、出発材料は、好ましくはＭｈｙｏの対数増殖期培養物である。

前記培養物は、好ましくは、ＦｒｉｉｓＨＳ培地（ウマ血清、酵母エキス、ハートインフュージョンブイヨン、ハンクス平衡塩溶液とＰＰＬＯ（牛肺疫菌様微生物）ブロス）を含む培養培地を使用することによって得られる。

培養物は、好ましくは、対数増殖期に達するまで１００から２００ｒｐｍの間で振とうしながら、約３７℃の温度で、４８から１４４時間の間、維持される。

次いで、細菌は好ましくは、遠心分離によって分離され、そして形質転換の方法に供される。

形質転換後、細菌の懸濁液は、好ましくは、寒天培地と所望の選択的抗生物質を補充したＦｒｉｉｓＨＳ培地のプレート上に広げられる。

培地の抗生物質に耐性を示す形質転換コロニーは、３７℃の温度で、５％二酸化炭素環境下でのインキュベーションの２又は３週間後に回収することができる。形質転換されたコロニーは、好ましくは、選択的抗生物質を補充したＦｒｉｉｓＨＳ培地に植菌され、約１０日又は２０日の後、当業者に周知である方法によってそれらのゲノムＤＮＡ又はタンパク質抽出物を得ることによって得られた変異体の遺伝子型及び／又は表現型が検討される。

組換えタンパク質を発現するＭｈｙｏの形質転換された変異株は、本発明の方法によって得ることができる。

好ましい実施態様では、本発明のＭｈｙｏの変異株は、外来性ＤＮＡ配列によりコードされた内容、例えば、タンパク質を発現する。外来性ＤＮＡ配列は、例えば、その過剰発現を実現する、サーコウイルス（ＰＣＶ２）キャプシドタンパク質、又はＭｈｙｏタンパク質、例えば、Ｐ４６タンパク質とすることができる。それらの例としては、細菌のゲノム中に外来性ＤＮＡ配列を組み込んだ株２３２Ｃｃ６、６３１４Ｃｃ１、２３２Ｌｃ２及び２３２Ｔｃ２である。

本発明の目的は、ライプニッツ・インスティテュートＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraβe 7 B, 38124 Braunschweig, Germany）のLaboratorios Hipra, S.A. (Amer, Girona, Spain)によって、２０１２年５月２９日に受託番号ＤＳＭ２６０２７で寄託されたＭｈｙｏの変異株である。２３２Ｃｃ６と呼ばれる前記株は、Ｍｈｙｏ株２３２においてプラスミドｐＴＣ３Ｃに存在するトランスポゾンを組み込む。この株は、ウェスタンブロット及びＥＬＩＳＡアッセイによって検出することができる量で、細胞質内にＰＣＶ２カプシドタンパク質を発現する。

本発明の目的は、ライプニッツ・インスティテュートＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraβe 7 B, 38124 Braunschweig, Germany）のLaboratorios Hipra, S.A. (Amer, Girona, Spain）によって、２０１２年５月２９日に受託番号ＤＳＭ２６０２０で寄託されたＭｈｙｏの変異株である。６３１４Ｃｃ１と呼ばれる前記株は、野生型Ｍｈｙｏ株６３１４においてプラスミドｐＴＣ３Ｃに存在するトランスポゾンを組み込む。この株は、ウェスタンブロット及びＥＬＩＳＡアッセイによって検出することができる量で、細胞質内にＰＣＶ２カプシドタンパク質を発現する。

本発明の目的は、ライプニッツ・インスティテュートＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraβe 7 B, 38124 Braunschweig, Germany）のLaboratorios Hipra, S.A. (Amer, Girona, Spain)によって、２０１２年５月２９日に受託番号ＤＳＭ２６０３３で寄託されたＭｈｙｏの変異株である。２３２Ｌｃ２と呼ばれる前記株は、野生型Ｍｈｙｏ株２３２においてプラスミドｐＴＣ３Ｌに存在するトランスポゾンを組み込む。この株は、ＥＬＩＳＡアッセイによって検出することができる量でＰＣＶ２カプシドタンパク質を発現する。

本発明の目的は、ライプニッツ・インスティテュートＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraβe 7 B, 38124 Braunschweig, Germany）のLaboratorios Hipra, S.A. (Amer, Girona, Spain）によって、２０１２年５月２９日に受託番号ＤＳＭ２６０３４で寄託されたＭｈｙｏの変異株である。２３２Ｔｃ２と呼ばれる前記株は、野生型Ｍｈｙｏ株２３２においてプラスミドｐＴＣ３Ｔに存在するトランスポゾンを組み込む。この株は、ＥＬＩＳＡアッセイによって検出することができる量でＰＣＶ２カプシドタンパク質を発現する。

以下の株はまた、外来性ＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質を発現し、その場合エピソーム要素として細菌の細胞質ゾル中に組み込まれる：
− 野生型Ｍｈｙｏ株２３２において複製プラスミドｐＯＧを組み込んだ形質転換されたＭｈｙｏ株２３２ＰＯＧｃ９。前記組み込みは、制限酵素によるこのＭｈｙｏの株の全ＤＮＡを消化し、アガロースゲル電気泳動により得られた断片を分析することによって検出された。
− 野生型Ｍｈｙｏ株２３２において複製プラスミドｐＯＧＣＲＥを組み込んだ形質転換されたＭｈｙｏ株２３２ＰＯＧＣＲＥｃ１。Ｃｒｅリコンビナーゼの発現は、ウェスタンブロット及び免疫検出によって検出される。

転位により組み込まれた外来性ＤＮＡ配列が、前記株の病原性の原因となる遺伝子、例えば、Ｍｈｙｏ溶血素に対応している遺伝子の翻訳をブロックすることができるアンチセンスＲＮＡを産生する、Ｍｈｙｏの変異株を、本発明の方法によって得ることができる。

好ましい実施態様において、Ｍｈｙｏの変異株は、前記株が前記株の病原性の原因となる遺伝子に対するアンチセンスＲＮＡを生成するように、ゲノム中又は細胞質ゾル内に外来性ＤＮＡ配列を組み込む。

株のゲノムに転位により組み込まれた外来性ＤＮＡ配列が、Ｍｈｙｏの毒性因子をコードする遺伝子を中断するＭｈｙｏの変異株が本発明の方法によって得ることができ、それらは、弱毒化された病原性を示す。

好ましい実施態様では、Ｍｈｙｏの変異株は、Ｍｈｙｏの毒性因子、例えば、溶血素をコードする遺伝子を中断する外来性ＤＮＡ配列を組み込んでいる。一例では、株は、２３２ＴＣ３ｈｌｙＣと称する。

Ｍｈｙｏの病原性因子をコードする遮断された遺伝子を有する変異株は、前記変異体のゲノムの配列決定など当業者に周知の方法によって選択することができる。

本発明の目的は、ライプニッツ・インスティテュートＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraβe 7 B, 38124 Braunschweig, Germany）のLaboratorios Hipra, S.A. (Amer, Girona, Spain)によって、２０１２年５月２９日に受託番号ＤＳＭ２６０４９で寄託されたＭｈｙｏの変異株である。２３２ＴＣ３ｈｌｙＣと呼ばれる前記株は、野生型Ｍｈｙｏ株２３２においてプラスミドＴＣ３に存在するトランスポゾンを組み込む。この株はＭｈｙｏ ｈｌｙＣ病原性因子をコードするＯＲＦの中断を有するので、弱毒化ワクチン株として使用するのに良い候補である。ゲノム中の挿入は、サザンブロットによって、及び直接配列決定によって検出される。

この説明に含まれる情報から、当業者はＭｈｙｏの他の形質転換株を、本発明の方法を使用する手段により、及び具体的に説明される以外の外来性ＤＮＡ配列を選択することにより調製することができる。

本発明の目的は、その発現のための宿主として、細胞質ゾル中又はそのゲノム中に外来性ＤＮＡ配列を含むＭｈｙｏの変異株の使用である。本明細書で説明したように外来性ＤＮＡ配列は、組換えタンパク質又は目的の他の配列をコードすることができる。

非常に多様な特性を持つＭｈｙｏの変異株は、本発明の方法によって得ることができ、当業者は、彼／彼女の意のままに、Ｍｈｙｏの株を遺伝的に改変し、様々な機能を有する株を得るための方法を有することに留意すべきである。

実施例５及び６は、本発明の方法によって得られたＭｈｙｏの変異株は、驚くべきことに、キャリアベクターに含まれる外来性ＤＮＡ配列を安定的に組み込み、そして、その内容を、例えば組換えタンパク質の生成によって発現することを示している。

本発明の方法により得られた株は、当業者に周知の標準的な手順を用いて弱毒化又は不活性化することができる。このようにして、ワクチンの調製に使用することができる。好ましくは、不活性化型で使用される。

本発明の方法により、これまで非開示であるＭｈｙｏの新しい株が得られる。それらの特徴はＭｈｙｏに対すると同時に他のブタの病原体に対する新しいワクチンを調製することを可能にする。すなわち、本発明の変異体株は、本発明の方法に従って形質転換された単一の株を用いて多価ワクチンを調製可能にする。

ワクチン
本発明の目的は、本発明の変異体Ｍｈｙｏ株の免疫学的に有効な量を含む、Ｍｈｙｏによって引き起こされるブタ流行性肺炎に対して、及び任意でブタに影響を及ぼす別の疾患又は微生物によって引き起こされる病理学的状態に対して、ブタを保護するためのワクチンである。

好ましい実施態様において、ワクチンは、薬学的に許容されるビヒクル、及び任意で、アジュバント剤を含む。

本発明のワクチン中の株は、不活性化又は弱毒化され、好ましくは不活性化される。

不活化ワクチンは、病原体、その場合には細菌を、通常、熱；例えば、ホルムアルデヒド、ＢＥＩ（バイナリーエチレンイミン）、又は界面活性剤などの化学物質；ホモジナイザーを用いた機械的な力等を利用して不活性化することによって得ることができる。病原体の不活性化は、複製することができないがその構造の維持又は構造の破壊又は崩壊をもたらし得る。本発明の文脈において、用語「不活化ワクチン」は、不活化されているがその構造を保持している細菌を含む組成物、並びに、細菌の構造が破壊又は崩壊された組成物を含む。

本発明の別の目的は、Ｍｈｙｏによって引き起こされるブタ流行性肺炎に対して、及び任意でブタに影響を及ぼす別の疾患又は更なる病理学的状態に対してのワクチンを調製するための本発明の変異体Ｍｈｙｏ株の使用である。

表現「免疫学的に有効な」とは、ワクチン接種の過程で投与される細菌の量は、Ｍｈｙｏの病原性形態による感染に対して宿主における有効な免疫応答を誘導するのに十分であることを意味し、そして、Ｍｈｙｏの形質転換株がブタに影響を及ぼす疾患又は病的状態に対する防御応答の誘導に寄与することが可能である組換えタンパク質を発現する場合には、前記微生物によって引き起こされる感染に対して宿主における有効な免疫応答を誘導するのにも十分である。

ワクチンは、好ましくは、疾患又は病的状態、例えば、アクチノバチルス属(Actinobacillus sp.)、ブラキスピラ属(Brachyspira sp.)、パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）、サルモネラ属（Salmonella sp.）、連鎖球菌属（Streptococcus sp.）、イソスポラ属（Isospora sp.）、ブタ丹毒菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）、レプトスピラ属（Leptospira sp.）、ブドウ球菌属（Staphylococcus sp.）、ヘモフィルス・パラスイス（Haemophilus parasuis）、気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica）、クロストリジウム属（Clostridium sp.）、マイコプラズマ属（Mycoplasma sp.）、ローソニア・イントラセルラリス（Lawsonia intracellularis）、大腸菌の微生物、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタパルボウイルス、脳心筋炎ウイルス、コロナウイルス、ロタウイルス、ブタサーコウイルス、ブタ離乳後成長不全症候群薬剤、ブタコレラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、カリシウイルス、及びトルクテノウイルス（ＴＴＶ）によって引き起こされるものなどに対して、ブタへ保護を与えることを目的としている。

より好ましい実施態様において、付加的疾患は、単一の病原体として又はその他の関連する病原体又は微生物の存在とともに存在するかによらず、ブタサーコウイルス（ＰＣＶ２）によって引き起こされるＰＣＶＡＤ（ブタサーコウイルス関連疾患）として知られているものである。

本発明のワクチンはまた、単一又は複数のレシピエントで、付加的ワクチン又は抗原組成物と組み合わせることができる。付加的ワクチン又は抗原組成物のワクチンは、好ましくは、疾患又は病的状態、例えば、アクチノバチルス属(Actinobacillus sp.)、ブラキスピラ属(Brachyspira sp.)、パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）、サルモネラ属（Salmonella sp.）、連鎖球菌属（Streptococcus sp.）、イソスポラ属（Isospora sp.）、ブタ丹毒菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）、レプトスピラ属（Leptospira sp.）、ブドウ球菌属（Staphylococcus sp.）、ヘモフィルス・パラスイス（Haemophilus parasuis）、気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica）、クロストリジウム属（Clostridium sp.）、マイコプラズマ属（Mycoplasma sp.）、ローソニア・イントラセルラリス（Lawsonia intracellularis）、大腸菌の微生物、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタパルボウイルス、脳心筋炎ウイルス、コロナウイルス、ロタウイルス、ブタサーコウイルス、ブタ離乳後成長不全症候群薬剤、ブタコレラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、カリシウイルス、及びトルクテノウイルス（ＴＴＶ）によって引き起こされるものなどに対して、ブタへ保護を与えることを目的としている。

本発明のワクチンは、本発明に記載の方法に従って得ることができるＭｈｙｏの不活化又は生株の細菌の免疫学的有効量を含む。

使用される投与量は、ワクチン接種される動物の年齢及び体重、及び投与経路に依存することが知られている。

適切な用量は、一般に、１０^３と１０^１０色変化単位（ｃｃｕ）との間、好ましくは、１０^６と１０^１０ｃｃｕの間、より好ましくは１０^８と１０^９ｃｃｕの間の範囲に含まれる。

動物は、任意の適切な時点でワクチン接種することができる。本発明のワクチンの用量は、好ましくは１から１２週齢の間に投与され、より好ましくは、ワクチンは、３週齢から開始して投与される。特定の場合には、相補的な用量の投与は、満足のいく保護を達成するために必要であり得る。これらの状況下で、第二の用量は、好ましくは、初回投与後１から５週間の間に投与され、より好ましくは、初回投与から３週間後に投与される。好ましくは、ワクチンは、単回投与ワクチンである。

本発明のワクチンは、とりわけ、ブタ、イノシシ、雌ブタ、そして任意の年齢及び生産循環のあらゆる段階の子ブタを含むブタの種のために意図されており；それは、好ましくは、肥育段階でのブタ、より好ましくは生命の１から１２週間のブタを対象とする。

ワクチンは、鼻腔内、皮内、経粘膜又は粘膜下、皮下に、エアロゾルにより、筋肉内、又は経口的に投与することができる。好ましくは、皮内又は筋肉内に投与される。

前記ワクチンは、例えば、Remington The Science and Practice of Pharmacy, 20^th edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 2000 [ISBN: 0-683-306472]のマニュアルに説明したように、異なる投与形態に適した薬学的製剤を調製するために当業者によって使用される典型的な方法に従って調製することができる。

ワクチンは、典型的には、溶液の形態で注射ワクチン、エマルジョン又は液体懸濁液として調製される。それらはまた、注射前に液体ビヒクルに溶解又は懸濁するのに適した固体形態で調製することができる。

注射ワクチンの１回投与の典型的な容積は、０．１ｍｌから５ｍｌであり、好ましくは０．１５と３ｍｌの間、より好ましくは０．２ｍｌと２ｍｌの間である。通常は皮内投与では、好ましくは、０．１ｍｌと０．５ｍｌの間で、好ましくは０．１５ｍｌと０．４ｍｌの間で、より好ましくは０．２ｍｌで使用される。筋肉内投与では、一般的に、０．５ｍｌと５ｍｌの間で、好ましくは１ｍｌと３ｍｌの間で、より好ましくは１ｍｌと２ｍｌで使用される。

本発明のワクチンを用いて動物を免疫するために、Ｍｈｙｏの変異株は、一般に、薬学的に許容されるビヒクルと混合される。

ワクチンを調製するために使用することができる液体ビヒクルは、例えば、水、生理的塩濃度の食塩水、又は細菌が培養される培養液を含む。

さらに、所望であれば、ビヒクルは、例えば、湿潤剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝液）、糖質安定剤（例えば、グルコース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、デンプン又はデキストラン）、又はタンパク質（例えば、アルブミン、カゼイン、ウシ血清又はスキムミルクなど）のような薬学的に許容される賦形剤又は補助物質を含有することができる。

賦形剤の物理化学的特性並びにそれらが販売されている市販製品の名前は、R.C. Rowe et al., による書籍Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4^th edition, Pharmaceutical Press, London, 2003 [ISBN: 0-85369-472-9]において見つけることができる。

アジュバントはまた、任意で、その有効性を高めるためにワクチンに組み込むことができる。好ましくは、本発明のワクチンはアジュバントを更に含む。

アジュバントは、侵入病原体に対する宿主の免疫応答を増加させる非特異的な免疫系刺激である。アジュバントの例は以下のとおりである：水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、酸化アルミニウム、ビタミンＥ、スクアレン、植物油、サポニン、人参、ザイモサン、グルカン、ジメチルアミノエチルデキストラン、デキストラン、非イオン性ブロックポリマー、ポリアクリレート（カルボマー）、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、ムラミルジペプチド、Ｗ／Ｏ、Ｏ／Ｗ、Ｗ／ＯＷ型エマルジョン、及びこれらの混合物が挙げられる。

好ましい実施態様において、ワクチンは、注射ワクチンであり、非イオン性界面活性剤によって不活性化された本発明の変異体株を含む。好ましくは、アルキルフェノールエトキシレート、エトキシル化ソルビタンエステル、エトキシル化脂肪族アルコール、エトキシル化脂肪酸、脂肪酸アルカノールアミド、エトキシル化脂肪酸アルカノールアミド、エトキシル化脂肪族アミン、脂肪族アミンオキシド、脂肪族アミドアミンオキサイド、脂肪酸グリセリド、スクロースエステル、アルキルポリグリコシド、エチレンオキシド及びプロピレンオキシドのコポリマー、及びエトキシル化及びプロポキシル化脂肪族アルコールによって形成される群から選択される非イオン性界面活性剤が使用される；より好ましくは、アルキルフェノールエトキシレート及びエトキシル化ソルビタンエステルから選択され；更により好ましくは、それは例えば、ダウにより市販されるＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００などのアルキルフェノールエトキシレートである。

より好ましい実施態様において、ワクチンは、注射ワクチンであり、非イオン性界面活性剤によって不活性化された本発明の変異体株、及びアジュバントとして、例えば、ＳＥＰＰＩＣ社（フランス）により市販される製品Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）ＩＳＡ２０１などのＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを含む。

好ましい実施態様において、ワクチンは凍結乾燥形態で、本発明の株を含むことができる。凍結乾燥プロセスは、当業者に周知の方法によって行われる。

ワクチン接種キット
本発明の目的はまた、Ｍｈｙｏによって引き起こされる感染又は疾患に対して、及び任意でブタに影響を及ぼす微生物によって引き起こされる別の疾患又は病的状態に対して、ブタにワクチン接種するためのワクチン接種キットを含む。

前記ワクチン接種キットは、本発明の変異株又は本発明のワクチンの免疫学的に有効な量を含有する容器を含む。

別の実施態様において、ワクチン接種キットは、単一のレシピエント又は別のレシピエントにおいて含まれる、本発明のワクチンと付加的抗原性組成物との組み合わせを含む。そのような付加的抗原性組成物は、ワクチンの項で述べたような疾患又は病理学的状態に対して、ブタへ保護を与えることを目的としている。

本発明の産業上の利用は本記述から明確に推論される。ＰＥＰは、養豚業界において大きな経済的損失の原因となる広範囲に及ぶ世界的な慢性呼吸器疾患であり、ターゲットを絞って安定した方法でＭｈｙｏの株を遺伝子改変する可能性は、従来のバクテリンのものよりも優れた特性を有するワクチンの製造を可能にすることは指摘されるべきである。Ｍｈｙｏの弱毒化変異株、特定の病原性因子を過剰発現する変異株、特定の病原性因子を阻害する株、又はブタに影響を及ぼす疾患の原因となる微生物の抗原成分を更に発現する株、例えば、ＰＥＰに対して及び他のブタの病態に対して有効なワクチンを調製するのに適しているものが、本発明の方法によって調製することができる。

安定した形態でのＭｈｙｏの標的化された遺伝子改変は、初めて、とりわけ、外来性ＤＮＡ配列など、例えば、とりわけＰＣＶ２カプシドのタンパク質などの治療又は予防目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現ベクターとしてのこれらの形質転換株の使用を、本発明者らに可能にした。本発明に開示された技術を用いて、単一の株を投与することにより、同時に異なる疾患を予防するために使用することができる新しいワクチンの多価候補が設計・製造されてきた。

本発明の方法によるＭｈｙｏの形質転換株による組換えタンパク質の生成のためのアッセイ
ＥＬＩＳＡ法は、本発明のＭｈｙｏの変異株における外因性ＤＮＡ配列により発現されるタンパク質の存在を同定するために使用され得る。

特に、ＰＣＶ２カプシドタンパク質の存在を検出するため及び得られたＭｈｙｏの株でそれを定量化するために、プレート免疫検出（ＥＬＩＳＡ）により前記抗原の量を近似的に検出推定できる市販のキットが使用された。

各株の対数期培養物でそれらを濃縮し得られた細胞を溶解した後にタンパク質抽出物を得た。

結果は、ＯＲＦ２又はＯＲＦ２ｖ２でコードされたタンパク質は、全てのアッセイされた株とプラスミドで大なり小なりの量で発現されることを示す陽性であった（図５Ｂ）。

プラスミドｐＴＣ３Ｃから生じるバージョンによる株もまた変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウェスタンブロットによって分析した（図５Ｃ）。ＰＣＶ２カプシドタンパク質と同じ分子量のバンドが検出された。

組換えタンパク質の発現に共通の問題であるタンパク質分解性バンドは、電気泳動ゲルに出現しなかったことを観察することができる。

その目的のために、Ｍｈｙｏにおいて組換え的に発現されるＰＣＶ２カプシドタンパク質は、多価ワクチンを製剤化するための優れた抗原であることができる。同様に、Ｍｈｙｏはタンパク質の組換えによる生成用の良好な宿主である。

ワクチン接種アッセイ
本発明の方法に従って得られたＭｈｙｏの変異株を含有するワクチンの有効性が試験され、そこでは前記株は、細菌のゲノム中のＰＣＶ２カプシドタンパク質をコードする外因性ＤＮＡ配列を含んでおり、そしてそれらは、細菌の細胞質ゾル中で前記タンパク質を発現した。

そのために、株６３１４Ｃｃ１又は株２３２Ｃｃ６を含有するワクチンが試験され、実施例の項に記載されているように、動物は単回投与量でワクチン接種され、又は２回目の投与量で再ワクチン接種された。

更に、２つのグループの動物が試験に組み込まれた：非ワクチン接種であるが感染したグループ（グループ５）、非ワクチン接種であって非感染グループ（グループ６）。

以下の応答が評価された：Ｍｈｙｏに対する免疫応答、ＰＣＶ２に対する免疫応答、及び動物の血清中のＰＣＶ２ウイルスＤＮＡの量。

図６、図７及び図８に示す本発明の方法に従って得られたＭｈｙｏの変異株を含むワクチンを用いて行われたワクチン接種アッセイの結果を観察することにより、ＰＣＶ２カプシドタンパク質を発現するＭｈｙｏの形質転換株はＭｈｙｏに対して及び驚くべきことにＰＣＶ２に対しても有意な免疫応答を生成し、それらがＭｈｙｏ及び同時にＰＣＶ２によって引き起こされる感染症に対するワクチンによって使用することができるように、ＰＣＶ２ウイルス量を著しく減少させると結論付けることができる。

本発明の方法に従って得られたＭｈｙｏの変異株を含有するワクチンはまた、ＰＣＶ２及びＭｈｙｏによる感染に対して試験され、ここで、その株は、細菌のゲノムにおけるＰＣＶ２カプシドタンパク質をコードする外来性ＤＮＡ配列を含んでおり、細菌の細胞質ゾル中にこのようなタンパク質を発現していた。

６３１４Ｃｃ１株を含むワクチンが試験され、動物は、単回用量でワクチン接種され、実施例に記載されるように、ＰＣＶ２分離物で及びＭｈｙｏの病原性株で曝露された。

更に、２つのグループの動物がアッセイに組み込まれた：非ワクチン接種であるが感染（グループ２）、非ワクチン接種であって非感染（グループ３）。

評価された応答は以下の通りであった：Ｍｈｙｏに対する免疫応答、ＰＣＶ２に対する免疫応答、動物の血清中のＰＣＶ２ウイルスＤＮＡ量及び動物の肺におけるＭｈｙｏ様病変。

本発明の方法に従って遺伝子改変され、ＰＣＶ２のカプシドタンパク質を発現するＭｈｙｏの株は、非ワクチン接種動物と比較して、ＰＣＶ２ウイルスＤＮＡの量及び動物の肺におけるＭｈｙｏ様病変の有意な減少を生じることが観察された。

本発明の方法に従って得られたＭｈｙｏの変異株を含有するワクチンもまた試験され、ここで、その株は、ＰＣＶ２カプシドタンパク質をコードする外来性ＤＮＡ配列を含む複製プラスミドを含み、細菌の細胞質ゾル中にそのタンパク質を発現していた。以前の試験にあるように、ＰＣＶ２カプシドタンパク質を発現する、本発明の方法に従って複製プラスミドを用いて遺伝子改変されたＭｈｙｏの株は、ＰＣＶ２ウイルス量の有意な減少を生じることが観察された。

変異株の弱毒化の程度を試験する
Ｍｈｙｏ株の形質転換のために、本発明の方法を実践して得られた変異体は、Ｍｈｙｏの毒性因子：ｈｌｙＣ遺伝子によってコードされた溶血素Ｃをコードするゲノムの領域中に転位によって組み込まプラスミドｐＴＣ３を含有する株２３２ＴＣ３ｈｌｙＣを含む。

前記株の弱毒化の程度を評価するために、８週齢のブタを選択し、グループあたり８匹の２つのグループに分けた。第一グループは、株２３２ＴＣ３ｈｌｙＣの一用量で気管内に感染させられ、第二グループは、改変される前のＭｈｙｏ株２３２であるＭｈｙｏの野生型株の一用量で感染させた。

動物は、感染後２８日で安楽死させ、コロニー形成は、２つの動物グループの何れにおいても鼻の領域に全く発生していないことが観察されたが、一方、野生型株に感染したグループの動物の２５％は気管支コロニー形成を示していた。

Ｍｈｙｏの形質転換株に感染した動物の何れも、気管支コロニー形成を示さなかった。

そのため、形質転換されたＭｈｙｏ株２３２ＴＣ３ｈｌｙＣは、野生型親株との関係で弱毒化され、そしてそれ自体弱毒化生ワクチンのワクチン候補として使用することができる。

Ｍｈｙｏ変異株６３１４ＰＯＧＡｃ４は、本発明の方法によって得られた。前記変異株は、複製プラスミド（ｐＯＧＡ１５９）により組み込まれた外来性ＤＮＡ配列がＭｈｙｏ溶血素をコードする遺伝子に対応するアンチセンスＲＮＡを生成したため、Ｍｈｙｏ溶血素１５９遺伝子の発現をを阻害する。動物をこの株に感染させた場合には、その株は野生型親株に関して弱毒化を示したことが観察された。前記変異株は、上下気道にコロニーを形成する能力の低下によって、並びにＰＥＰの典型的な病変を生じさせる能力の低下によって特徴づけられる。

以下の実施例は、当業者に本発明の十分に明確かつ完全な説明を提供するために記載されるが、それらは本明細書の前のセクションに記載された目的の本質的な側面を限定するものと見なされてはならない。

以下に適用される組換えＤＮＡ技術及び方法は、Sambrook and Russell, Molecular Cloning 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York 5 (2001) 及びAusubel et al., Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1998)によるマニュアルに詳細に記載されている。

大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ株（Stratagene）が、プラスミドｐＭＴｎ４００１又はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫに基づくベクターのための宿主として使用されている。

特に断りのない限り、このセクションで記載されるプラスミドコンストラクトに記載された全てのＤＮＡ配列は、でＧｅｎＢａｎｋデータベースに番号ＡＥ０１７２４３寄託された配列からのものである。このゲノム配列は、Vasconcelos et al., J. Bacteriol., 2005, 187(16), 5568-5577によって記載されたＭｈｙｏ株Ｊのそれに対応する。

特に明記しない限り、以下に記載される全てのオリゴヌクレオチド配列は、５’から３’の方向に書かれている。プルーフリーディング活性を有するＰｈｕｓｉｏｎ ｔｈｅｒｍｏｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ(Finnzymes)を全てのＰＣＲ反応に使用した。

下線を引いたオリゴヌクレオチド配列は、その配列の各々の名前で明記されている制限酵素部位の存在を示す。

実施例１．− Ｍｈｙｏの株を選択する
使用したＭｈｙｏの野生型株はLaboratorios Hipra S.A. (Amer-Girona-Spain)からの病原性Ｍｈｙｏ単離物に相当する６３１４株、及びアイオワ州立大学（エイムスアイオワ州−ＵＳＡ）からの２３２株であった。

実施例２−複製プラスミドの構築
実施例２．１−複製プラスミドｐＯＧの構築
Ｍｈｙｏにおける複製プラスミドを得るためには、ＰＣＲによって増幅されたＭｈｙｏのｏｒｉＣ領域がプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫに導入された。オリゴヌクレオチド５ＯｒｉＣＮｏｔＩ（ＡＴＧ ＣＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＴＴＡ ＴＴＴ ＡＴＣ ＡＧＡ ＡＡＣ ＡＧＴ ＴＡＧ）（配列番号９）及び３ＯｒｉＣＸｂａＩ（ＡＧＴ ＣＧＧ ＧＣＣ ＣＡＧ ＣＴＴ ＧＣＧ ＣＡＴ ＣＡＴ ＴＧＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＧＡＴ ＴＣ）（配列番号１０）がこの増幅のために使用され、ＭｈｙｏのゲノムＤＮＡが鋳型として使用された。得られた１．９６ｂｐ断片は次いで制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｂａＩで消化された。一方、ゲンタマイシン耐性遺伝子（ａａｃ（６’）−ａｐｈ（２”）が、オリゴクヌレオチド５ＧｍＯＲＦ（ＡＣＴ ＧＧＧ ＡＴＣ ＣＡＴ ＧＡＡ ＴＡＴ ＡＧＴ ＴＧＡ ＡＡ ＡＴＧ）（配列番号１１）及び３ＧｍＡｐａ（ＧＧＡ ＴＧＧ ＧＣＣ ＣＡＧ ＣＴＴ ＧＣＧ ＣＡＴ ＣＡＴ ＴＧＧ） （配列番号１２）により、及びプラスミドｐＩＶ−Ｔを鋳型として用いてＰＣＲで増幅された。１．８ｋｂのＰＣＲ生成物は、対応する制限酵素で消化した。Ｐ９７タンパク質の遺伝子のプロモーター領域は、鋳型としてＭｈｙｏ株ＪのＤＮＡを使用して、オリゴヌクレオチド５’ｐ９７ＸｂａＩ（Ｇ ＡＴＣ ＴＣＴ ＡＧＡ ＴＣＧ ＡＧＧ ＡＡＧ ＡＣＴ ＧＡＴ ＴＡＧ ＡＡＡ ＴＴＴ ＡＧＡ ＡＣＴ）（配列番号１３）及び３’ｐ９７ＢａｍＨＩ（ＧＡＴ ＣＧＧ ＡＴＣ ＣＡＣ ＴＣＡ ＴＡＴ ＴＴＴ ＡＡＡ ＣＣＴ ＣＡＡ ＴＴＡ Ｔ）（配列番号１４）によりＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ生成物（２６６ｂｐ）は、対応する制限酵素で消化した。最後に、得られた３つの断片は、先に制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化されたプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫに連結され、そのライゲーション混合物は大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞に形質転換された。所望のコンストラクトを有するコロニーを、制限パターン解析及び配列決定によって形質転換から得られたコロニーから同定された。陽性クローンの一つは、ｐＯＧと命名され、次のステップのために選択された（図１）。

実施例２．２−複製プラスミドｐＯＧＣＲＥの構築
複製プラスミドｐＯＧＣＲＥは、プラスミドｐＯＧを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＡｐａＩで消化し５．１ｋｂ断片を回収することにより得られた。一方、ゲンタマイシン耐性遺伝子（ａａｃ（６’）−ａｐｈ（２”）は、オリゴヌクレオチド５ＧｍＯＲＦ及び３ＧｍＯＲＦＳｐｅＩ（ＡＣＴ ＧＡＣ ＴＡＧ ＴＡＧ ＣＴＴ ＧＣＧ ＣＡＴ ＣＡＴ ＴＧＧ）（配列番号１５）を使用してプラスミドｐＩＶ−ＴからＰＣＲによって増幅され、次いで制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳｐｅＩで消化された１．８ｋｂ断片が得られた。Ｃｒｅリコンビナーゼに対応する遺伝子は、プラスミドｐＳＨ６２（Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ）及び鋳型としてオリゴヌクレオチドの５ＣｒｅＢｇｌＩＩ（ＡＴＧ ＣＡＧ ＡＴＣ ＴＡＴ ＧＴＣ ＣＡＡ ＴＴＴ ＡＣＴ ＧＡＣ ＣＧＴ ＡＣＡ ＣＣＡ ＡＡＡ ＴＴＴ Ｇ）（配列番号１６）及び３ＣｒｅＡｐａＩ（ＡＴＧ ＣＧＧ ＧＣＣ ＣＴＴＡ ＡＴＣ ＧＣＣ ＡＴＣ ＴＴＣ ＣＡＧ ＣＡＧ ＧＣＧ ＣＡＣ）（配列番号１７）を用いて、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ生成物（１．０ｋｂ）は、酵素ＢｇｌＩＩ及びＡｐａＩで切断した。最後に、プラスミドｐＯＧは今度は制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで再び消化され、Ｐ９７タンパク質の遺伝子のプロモーターに対応する２６６ｂｐのバンドとして回収された。得られた４つの断片は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結され、このライゲーション反応物は、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞に形質転換された。得られた形質転換コロニーから、所望のコンストラクトを有するものを、制限パターン解析により同定した。陽性クローンの一つは、ｐＯＧＣＲＥと命名され、次のステップのために選択された（図１）。

実施例２．３−複製プラスミドｐＯＧＣの構築
プラスミドｐＯＧＣを得るには、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫを酵素ＮｏｔＩで消化し、一度精製されると、アルカリホスファターゼ酵素で脱リン酸化された。同時に、９９２ｂｐの断片が合成遺伝子ＯＲＦ２ｖ２（配列番号５）を制限酵素ＳｐｅＩ及びＮｏｔＩで消化することにより得られた。鋳型としてプラスミドｐＯＧＣＲＥを用いて、ＤＮＡセグメントは、オリゴヌクレオチド３ｇｍＯＲＦＳｐｅＩと５ＯｒｉＣＮｏｔＩを用いてＰＣＲにより増幅され、一度精製されると、そのＰＣＲ生成物は、酵素ＳｐｅＩ及びＮｏｔＩで消化された。得られた３つの断片は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結され、このライゲーション反応物は、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞に形質転換された。陽性クローンは制限マッピング及び配列決定により同定された（図２）。

実施例２．４−複製プラスミドｐＯＧＣの構築
プラスミドｐＯＧＬを得るために、プラスミドｐＯＧＣは酵素ＮｏｔＩ及びＳｐｅＩで消化され、２．８ｋｂと４ｋｂのバンドが回収された。２．８ｋｂのバンドに対応するＤＮＡ断片を、アルカリホスファターゼで脱リン酸化した。同時に、２．２５ｂｐの断片が、プラスミドｐＴＣ３Ｌ（実施例３、４を参照）を制限酵素ＳｐｅＩ及びＮｏｔＩで消化することにより得られた。得られた３つの断片は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結され、このライゲーション反応物は、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞に形質転換された。陽性クローンは制限マッピング及び配列決定により同定された（図２）。

実施例２．５−複製プラスミドｐＯＧＴの構築
プラスミドｐＯＧＴを得るために、プラスミドｐＯＧＣは酵素ＮｏｔＩ及びＳｐｅＩで消化され、２．８ｋｂと４ｋｂのバンドが回収された。２．８ｋｂのバンドに対応するＤＮＡ断片を、アルカリホスファターゼで脱リン酸化した。同時に、２．２３ｂｐの断片が、制限酵素ＳｐｅＩ及びＮｏｔＩによるプラスミドｐＴＣ３Ｔ（実施例３、５を参照）の消化から得られた。得られた３つの断片は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結され、このライゲーション反応物は、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞に形質転換された。陽性クローンは制限マッピング及び配列決定により同定された（図２）。

実施例２．６−複製プラスミドｐＯＧＡ１５９の構築
複製プラスミドｐＯＧＡ１５９が、２つの連続したクローニング工程で構築された。プラスミドｐＭＴｎ４００１を鋳型として用い、オリゴヌクレオチド５’ｐ９７ＡｐａＩ及び３ＴｅｔＭＣｌａＩ（ＴＧＴ ＴＡＴ ＣＧＡ ＴＡＣＣ ＧＴＣ ＧＡＴ ＧＣＡ ＣＣＴ ＣＧＡ ＧＣＴ ＡＡＧ ＴＴＡ ＴＴＴ ＴＡＴ ＴＧ）（配列番号１８）を用いたＰＣＲ反応によって、Ｐ９７タンパク質の遺伝子のプロモーターに対応する２．２ｋｂの断片が増幅された。このＰＣＲ生成物を制限酵素ＣｌａＩ及びＡｐａＩで消化した。一方で、鋳型としプラスミドｐＯＧを使用して、１．９ｋｂの断片は、Ｍｈｙｏ ｏｒｉＣに対応するオリゴヌクレオチド５ＯｒｉＣＣｌａＩ（ＡＧＡ ＣＡＴ ＣＧＡ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＡＴ ＴＡＴ ＧＣＴ ＧＡＴ ＴＧＣ ＡＴＴ ＣＴＴ ＴＣＡ ＡＴＴ ＴＧ）（配列番号１９）及び５ＯｒｉＣＥｃｏＲＩ（ＡＧＡ ＧＧＡ ＡＴ ＣＣ ＧＡＴ ＴＴＡ ＴＴＴ ＡＴＣ ＡＧＡ ＡＡＣ ＡＧＴ ＴＡＧ ＴＣＴ ＴＴＴ ＣＣ）（配列番号２０）を用いて増幅した。このＰＣＲ生成物を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＣｌａＩで消化した。続いて、ＰＣＲによって、Ｐ９７タンパク質遺伝子のプロモーターに対応する３１６ｂｐの断片を、オリゴヌクレオチド５ＸｂａＩｐｐ９７（ＡＧＡ ＣＴＣ ＴＡＧ ＡＡＣ ＴＡＧ ＴＧＧ ＡＴＣ ＣＣＣ ＣＧＧ ＧＣＣ ＣＣＴ ＣＧＡ ＧＧＡ ＡＧＡ ＣＴＧ ＡＴＴ ＡＧＡ ＡＡＴ ＴＴＡ Ｇ）（配列番号２１）と３ＥｃｏＲＩｐｐ９７（ＡＧＡ ＣＧＡ ＡＴＴ ＣＧＡ ＡＴＴ ＣＣＴ ＧＣＡ ＧＧＧ ＡＴＣ ＣＡＣ ＴＣＡ ＴＡＴ ＴＴＴ ＡＡＡ ＣＣＴ Ｃ）（配列番号２２）を用いて増幅した。一度精製されると、この断片は、酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化された。この最初のクローニング・プロセスの最後の工程は、制限酵素ＸｂａＩ及びＡｐａＩを用いたプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫの消化であった。これらの４つのＤＮＡ断片は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結され、そのライゲーション反応物は、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞に形質転換された。所望のコンストラクトを有するコロニーを、制限パターン解析によって形質転換から得られたコロニーから同定された。こうして得られた新しいプラスミドは、制限酵素ＥｃｏＲＩにより消化された。最後に、サイレンシングのために設計されたＤＮＡは、オリゴヌクレオチド５ａｈｌｙｃＥｃｏＲＩ（ＣＡＴ ＣＧＡ ＡＴＴ ＣＡＣ ＧＡＡ ＴＴＡ ＧＴＧ ＡＴＴ ＣＴＧ ＣＣＴ ＴＴＴ Ｃ）（配列番号２３）及び３ａｈｌｙｃＥｃｏＲＩ（ＣＡＴ ＣＧＡ ＡＴＴ ＣＡＴ ＴＡＡ ＡＧＴ ＴＧＡ ＴＴＣ ＧＧＴ ＧＴＴ ＴＡＡ ＴＣ）（配列番号２４）を用いたＰＣＲによって増幅した。一度制限酵素ＥｃｏＲＩで消化され、アルカリホスファターゼによって脱リン酸化されると、得られたＤＮＡ断片はＴ４ ＤＮＡリガーゼａを用いてライゲーションされ、そのライゲーション反応物は大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞に形質転換された。所望のコンストラクトを有するコロニーを、配列解析によって形質転換から得られたコロニーから同定された。

実施例３−転位による形質転換のためのプラスミドの構築
実施例３．１ 転位による形質転換のためのプラスミドｐＴＣ３の構築
プラスミドｐＭＴｎ４００１（Pich et al., Microbiology 152:519-527 (2006)）は、オリゴヌクレオチド５ｐＭＴｎ４００１ＰｓｔＩ（ＣＡＴ ＧＣＴ ＧＣＡ ＧＣＣ ＣＧＧ ＧＧＧ ＡＴＣ ＣＡＣ ＴＡＧ ＴＴＣ ＴＡＧ ＡＧ）（配列番号２５）及び３ｐＭＴｎ４００１（ＧＴＡ ＣＣＣ ＡＡＴ ＴＣＧ ＣＣＣ ＴＡＴ ＡＧＴ ＧＡＧ ＴＣＧ）（配列番号２６）を用いてＰＣＲによって増幅された。オリゴ３ｐＭＴｎ４００１は、その５’末端でリン酸化された。このＰＣＲ反応物（２．９８ｋｂ）の生成物は制限酵素ＰｓｔＩで消化された。一方、Ｐ９７タンパク質の遺伝子のプロモーターは、鋳型としてＭｈｙｏ株ＪのＤＮＡを使用して、オリゴヌクレオチド５’ｐ９７（ＴＣＧ ＡＧＧ ＡＡＧ ＡＣＴ ＧＡＴ ＴＡＧ ＡＡＡ ＴＴＴ ＡＧＡ ＡＣＴ）（配列番号２７）及び３’ｐ９７ＢａｍＨＩを用いてＰＣＲによって増幅された。ＰＣＲ生成物（２８０ｂｐ）は制限酵素ＢａｍＨＩで消化され、アルカリホスファターゼで脱リン酸化された。同じプロモーターはオリゴヌクレオチド：５’ｐ９７ＡｐａＩ（ＧＡＴ ＣＧＧ ＧＣＣ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＡＡ ＧＡＣ ＴＧＡ ＴＴＡ ＧＡＡ ＡＴＴ ＴＡＧ ＡＡＣ Ｔ）（配列番号２８）及び３’ｐ９７ＢａｍＨＩの第二のペアによって増幅され、制限酵素ＡｐａＩ及びＢａｍＨＩ．で消化された。トランスポゼース遺伝子は、鋳型としてプラスミドｐＭＴｎ４００１及びオリゴヌクレオチド５’ＴｎｐＢａｍＨＩ（ＧＡＴ ＣＧＧ ＡＴＣ ＣＡＴ ＧＡＣ ＣＣＡ ＡＧＴ ＡＣＡ ＴＴＴ ＴＡＣ ＡＣＴ ＧＡＡ ＡＡＧ）（配列番号２９）及び３’ＴｎｐＡｐａＩ（ＧＡＴ ＣＣＴ ＣＧＡ ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＣＣ ＣＴＴ ＴＴＡ ＣＡＣ ＡＡＴ ＴＡＴ ＡＣＧ ＧＡＣ）（配列番号３０）を用いてＰＣＲにより増幅された。９７８ｂｐのバンドが得られた後、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＡｐａＩで消化した。最後に、テトラサイクリン耐性ｔｅｔＭに対応する断片を、オリゴヌクレオチド５’ＴｅｔＭＢａｍＨＩ（ＧＡＴ ＣＧＧ ＡＴＣ ＣＡＴ ＧＡＡ ＡＡＴ ＴＡＴ ＴＡＡ ＴＡＴ ＴＧＧ ＡＧＴ Ｔ）（配列番号３１）及び３’ＴｅｔＭＰｓｔＩ（ＧＡＴ ＣＧＣ ＴＧＣ ＡＧＧ ＡＡＴ ＴＣＧ ＡＴＡ ＴＣＡ ＡＧＣ ＴＴＡ ＴＣＧ ＡＴＡ ＣＣＧ ＴＣＧ ＡＴＧ ＣＡＣ ＣＴ） （配列番号３２）を用いてプラスミドｐＭＴｎＴｅｔＭ４３８（Pich et al., Microbiology 152:519-527 (2006)）から増幅した。得られた１．９ｋｂ断片を、制限酵素ＳａｌＩ及びＢａｍＨＩで消化し、アルカリホスファターゼで脱リン酸化した。５得られた断片を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結したライゲーション反応は、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。得られた形質転換コロニーから、所望のコンストラクトを有するものを、制限パターン解析及び配列決定により同定した。陽性クローンの一つは、ｐＴＣ３と命名され、次のステップのために選択された（図３）。

実施例３．２ 転位による形質転換のためのプラスミドｐＴＣ３６６の構築
このプラスミドは、テトラサイクリン耐性遺伝子に隣接する２つの３４ｂｐのｌｏｘ６６配列（ＡＴＡ ＡＣＴ ＴＣＧ ＴＡＴ ＡＧＣ ＡＴＡ ＣＡＴ ＴＡＴ ＡＣＧ ＡＡＣ ＧＧＴ Ａ）（配列番号３３）によってｐＴＣ３から直接由来する。そのために、プラスミドＴＣ３のテトラサイクリン耐性遺伝子配列ＴｅｔＭｐ９７（ＧＡＴ ＴＡＡ ＧＧＧ ＣＣＣ ＡＴＡ ＡＣＴ ＴＣＧ ＴＡＴ ＡＧＧ ＡＴＡ ＣＴＴ ＴＡＴ ＡＣＧ ＡＡＧ ＴＴＡ ＴＧＴ ＣＧＡ ＣＣＣ ＣＣＴ ＣＧＡ ＧＧＡ ＡＧＡ ＣＴＧ）（配列番号３４）が、オリゴヌクレオチド５ｌｏｘｐ６６Ｔｅｔｐ９７及び３ｌｏｘｐ６６Ｔｅｔｐ９７（ＧＧＧ ＡＣＴ ＡＧＴ ＴＡＣ ＧＧＴ ＴＣＧ ＴＡＴ ＡＡＴ ＧＴＡ ＴＧＣ ＴＡＴ ＡＣＧ ＡＡＧ ＴＴＡ ＴＣＴ ＧＣＡ ＧＧＡ ＴＡＴ ＣＡＡ ＧＣＴ ＴＡＴ ＣＧＡ ＴＡＣ ＣＧＴ ＣＧ）（配列番号３５）を用いてＰＣＲによって増幅され、制限酵素ＡｐａＩ及びＳｐｅＩで消化されて２．２キロバイトＰＣＲ断片を得た。同時に、プラスミドＴＣ３は同じ制限酵素で消化され、４．４ｋｂでのバンドが回収された。２つの断片は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結され、そのライゲーション混合物は、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞に形質転換された。ｌｏｘ６６配列を正しく組み込み、ｐＴＣ３６６（図３）と呼ばれた陽性クローンは、形質転換から得られたコロニーからの配列決定により同定された。

実施例３．３ 転位による形質転換のためのプラスミドｐＴＣ３Ｃの構築
プラスミドｐＴＣ３Ｃを得るために、プラスミドｐＴＣ３６６は酵素ＳｐｅＩ及びＮｏｔＩで消化された。同じ制限酵素を用いて、合成遺伝子ＯＲＦ２ｖ２（配列番号５）の消化から派生した９９２ｂｐ断片がこのプラスミド上にクローニングされた。陽性クローンは制限マッピングにより同定された（図３）。

実施例３．４ 転位による形質転換のためのプラスミドｐＴＣ３Ｌの構築
オリゴヌクレオチドＰ４６ＣｔＦｄＨｉｎｄＩＩＩ（ＧＴＧ ＴＡＡ ＧＣＴ ＴＡＡ ＡＡＡ ＣＣＡ ＧＧＡ ＴＧＣ ＡＣＡ ＡＡＡ ＴＡＡ Ｃ）（配列番号３６）及びＰ４６ＣｔＲｖ−ＮｏｔＩ（ＴＧＴ ＴＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＴＴＴ ＡＧＧ ＣＡＴ ＣＡＧ ＧＡＴ ＴＡＴ ＣＡＡ Ｃ）（配列番号３７）を用い、鋳型として株２３２のゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ反応によって、Ｐ４６タンパク質の遺伝子の３’末端に対応する１．０ｋｂの断片が増幅された。このＰＣＲ生成物を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩで消化した。他方、鋳型として同じゲノムＤＮＡを用いることによって、２７６ｂｐ断片がオリゴＰ４６ＮｔＦｄＳｐｅＩ（ＡＧＡ ＣＡＣ ＴＡＧ ＴＴＴ ＧＡＡ ＴＴＴ ＧＴＡ ＴＴＴ ＴＣＣ ＡＴＡ ＡＴＣ）（配列番号３８）及びＰ４６ＮｔＲｖＢａｍＨＩ（ＡＧＡ ＧＧＧ ＡＴＣ ＣＴＧ ＴＡＡ ＴＴＧ ＴＴＧ ＡＡＧ ＴＴＧ ＣＴＧ ＣＣＴ）（配列番号３９）を用いて増幅された。Ｐ４６タンパク質の遺伝子の５’末端に対応するこの断片は、次いで制限酵素ＳｐｅＩ及びＢａｍＨＩで消化された。最後に、オリゴヌクレオチドＣｉｒｃＲｖ−ＮｏｔＩ（ＴＧＴ ＴＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＴＴＡ ＴＧＧ ＴＴＣ ＴＡＡ ５５ ＴＧＧ ＴＧＧ ＡＴＣ）（配列番号４０）及びＣｉｒｃ２Ｆｄ−ＢａｍＨＩ（ＧＴＧ ＴＧＧ ＡＴＣ ＣＡＴ ＧＡＣ ＡＴＡ ＴＣＣ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＴ）（配列番号４１）とともに鋳型としてプラスミドｐＴＣ３Ｃを用いて、ＰＣＶ２カプシドタンパク質が増幅された。７１２ｂｐのＤＮＡ断片は次いで制限酵素ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩで消化された。得られた全ての断片は、酵素ＳｐｅＩ及びＮｏｔＩで先に消化されたプラスミドｐＴＣ３６６中にクローニングされた。陽性クローンは制限マッピングにより同定された（図３）。

実施例３．５ 転位による形質転換のためのプラスミドｐＴＣ３Ｔの構築
この実施例では、オリゴヌクレオチドＰ４６ＮｔＦｄＳｐｅＩ及びＰ４６ＣＩＲＣＲｖ（ＡＴＣ ＴＴＣ ＴＴＣ ＴＴＧ ＧＡＴ ＡＴＧ ＴＣＡ ＴＧＧ ＣＡＴ ＣＡＧ ＧＡＴ ＴＡＴ ＣＡＡ ＣＡＴ ＴＡ）（配列番号４２）が、株２３２のゲノムＤＮＡから開始するＰ４６タンパク質の遺伝子のコード化領域の５’末端及びプロモーター領域のＰＣＲ増幅のために使用された。得られた１．２５ｋｂのバンドを制限酵素ＳｐｅＩで切断した。同時に、第二のＰＣＲ反応が、ｐＴＣ３Ｃ上で、オリゴヌクレオチドＰ４６ＣＩＲＣＦｄ（ＴＡＡ ＴＧＴ ＴＧＡ ＴＡＡ ＴＣＣ ＴＧＡ ＴＧＣ ＣＡＴ ＧＡＣ ＡＴＡ ＴＣＣ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＴ）（配列番号４３）及びＣｉｒｃＲｖ−ＮｏｔＩを用いて行われ、７３２ｂｐのＤＮＡ断片を得た。前述の断片が鋳型として用いられた組換えＰＣＲ反応により、オリゴヌクレオチドＰ４６ＮｔＦｄＳｐｅＩとＣｉｒｃＲｖ−ＮｏｔＩを使用して、２．２ｋｂの断片を得た。この断片を制限酵素ＳｐｅＩ及びＮｏｔＩで消化し、先に酵素ＳｐｅＩ及びＮｏｔＩで消化したプラスミドｐＴＣ３６６と連結させた。陽性クローンは制限マッピング及び配列決定により同定された（図３）。

実施例４−形質転換細菌を得る
この方法で使用される全ての製品及び試薬は、オートクレーブ処理、濾過又は照射により滅菌した。出発物質は、対数増殖期にあるＭｈｙｏ培養物であった。この増殖期は、好ましくは、接種菌液の１／１００希釈を用い、培養物をＦｒｉｉｓＨＳ培地（２０％（ｖ／ｖ）の放射線照ウマ血清、２．４％（ｖ／ｖ）の酵母エキス、０．１％（ｖ／ｖ）のフェノールレッド、０．４％の「ハンクス平衡塩溶液」、０．０５８（ｗ／ｖ）の％「ハートブロインフュージョンス」、０．０５４％（ｗ／ｖ）のＰＰＬＯ、最終濃度１００μｇ／ｍｌのアンピシリン）中で約４８から１４４時間増殖させることによって得られる。静止期においてＭｈｙｏ培養物約４０ｍｌを得た後、培養フラスコの内容物は、細胞を分離するために１０回ピペッティングされ、次いで培養物を０．４５μｍのフィルターで濾過して細胞の分離を終了する。次いで、細胞を、２０，０００×ｇで２０分間遠心分離し、１ｍＭのＥＤＴＡを補充した電気穿孔緩衝液（２７２ｍＭのスクロース、２００ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．２）に再懸濁し、１０分間氷上でインキュベートした。ＥＤＴＡとの１０分間のインキュベーションの後、遠心分離を２０分間２０，０００×ｇで繰り返し、細胞は、電気穿孔緩衝液の１００から３００μｌの間の体積中に再懸濁した。以前に０．５から２μｇ・ｍｌ^−１の間の濃度で電気穿孔緩衝液に溶解された２０μｇのプラスミドと１００μｌの最終容量の細胞懸濁液が、０．２ｃｍの電気穿孔キュベットに添加された。電気穿孔を行う際には、電気穿孔機の変数は、電圧が２．５ｋＶ、抵抗は１００から１７５Ωの間、及び容量は２５μＦに設定した。得られた典型的な「時定数」の値は２．３と３ｍｓの間であった。電気パルスが放出された後、９００μｌのＦｒｉｉｓＦＢＳ培地（ＦｒｉｉｓＨＳ培地と全く同じ処方であるが、ウマ血清をウシ胎児血清と置換している）及び追加の２０μｇのプラスミドが添加された。得られた懸濁液を氷上で２０分間インキュベートし、次いで３７℃で５％のＣＯ_２下で３時間インキュベートした。３時間後、得られた懸濁液は、０．７％（ｗ／ｖ）の低融点寒天と所望の選択的抗生物質（０．５／ｍｌのテトラサイクリン及び／又は１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン）を補充したＦｒｉｉｓＨＳプレート上に分配された（プレートあたり約２００μｌ）。

３７℃で５％ＣＯ２での２又は３週間のインキュベーションの後、ＦｒｉｉｓＨＳプレート中で形質転換体コロニーを回収し、そして選択的な抗生物質を先に示した濃度で補充したＦｒｉｉｓＨＳ培地１０ｍｌを含む５０ｍｌのフラスコに植菌した。培地はその色が変わったら、（３７℃で１５０ｒｐｍでインキュベートした後に１０日から２０日の間）、得られた変異体の遺伝子型及び／又は表現型の試験は、当業者によって知られているように、ゲノムＤＮＡ又はタンパク質抽出物を得ることによって行われた。

実施例４．１から４．８．−Ｍｈｙｏの形質転換された変異株を得る
実施例４に記載した方法に実質的に従うことにより、表１に示すＭｈｙｏの形質転換された変異株が、同じ表に一覧されているプラスミドを使用して調製された。
表に示された変異株は、本発明の方法に従って行われた形質転換で得られた異なる変異体から選択された。これらの株は、異なるワクチン接種のアッセイ及び弱毒化の程度のアッセイに用いた。

実施例５．− 複製プラスミドによる形質転換によって得られた変異株の解析
実施例５．１．− 複製プラスミドｐＯＧによる形質転換によって得られた変異株の解析
実施例４．６の形質転換株、２３２ＰＯＧｃ９が、Ｆｒｉｉｓ寒天プレートの形質転換から回収され１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含むＦｒｉｉｓＨＳ培地中で増殖させた細胞中のプラスミドの存在を確認するために使用された。

そのために、総ＤＮＡを細胞から精製した。得られたＤＮＡは制限酵素ＳｃａＩで消化され、この場合、これは容易にアガロースゲルで同定することができるバンドの出現をもたらした（図４Ａ）。

ゲノムＤＮＡのバックグランドの上で明らかに目立つプラスミドに対応するバンドの出現は、分析したクローンはプラスミドを含み、このプラスミドは安定的に複製して細胞あたり２５〜３０コピーのプラスミドを生じさせることを示唆している。

この結果の分析は、本発明の複製プラスミドは、形質転換された細菌の子孫に安定的に伝播することを示している。

実施例５．２．− 複製プラスミドｐＯＧＣＲＥによる形質転換によって得られた変異株の解析
実施例４．７の形質転換株、２３２ＰＯＧＣＲＥｃ１は、Ｃｒｅタンパク質をコードする遺伝子を含む。

複製プラスミドによる異種遺伝子の導入はＭｈｙｏに検出可能な方法で、対応するタンパク質の発現を生じたかどうかを確認するために、プラスミドｐＯＧＣＲＥによる形質転換アッセイで回収されたクローンからの全タンパク質抽出物を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析し、その後、免疫学的方法によりＣｒｅリコンビナーゼの存在を検出するためにウエスタンブロットを行った（図４Ｂ）。

この場合、Ｃｒｅタンパク質は、プラスミドｐＯＧＣＲＥにより形質転換された株でのみ検出され、従ってＭｈｙｏにおけるタンパク質の異種発現のための複製プラスミドの有用性を示している。

実施例５．３．− 複製プラスミドｐＯＧＡ１５９による形質転換によって得られた変異株の解析
実施例４．８の形質転換株、６３１４ｐＯＧＡｃ４が、Ｆｒｉｉｓ寒天プレートの形質転換から回収され０．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＦｒｉｉｓＨＳ培地中で増殖させた細胞中のプラスミドの存在を確認するために使用された。

そのために、総ＤＮＡを細胞から精製した。得られたＤＮＡは、この場合、親株６３１４から得られたＤＮＡ調製と比較する際に容易に同定できるバンドの出現をもたらすアガロースゲルで分析した（図４Ｃ）。

実施例６．− 転位による形質転換によって得られた変異株の解析
実施例６．１．−プラスミドｐＴＣ３の転位による形質転換によって得られた変異株の解析
プラスミドＴＣ３を用いた電気穿孔によって得られた別の形質転換体クローンを、テトラサイクリン耐性変異体が細菌染色体におけるトランスポゾン挿入の存在の結果であったことを示すために、サザンブロット及びゲノムＤＮＡの直接配列決定の両方によって分析した。

得られた全てのクローンは単一トランスポゾンの挿入を有し、数世代後にこれらの挿入は再移動されないことを確実にするために、２３２ＴＣ３ｈｌｙＣという名のプラスミドｐＴＣ３によって得られたクローンのゲノムＤＮＡのサザンブロットを行った。このクローンは、配列決定の結果が、トランスポゾンはｈｌｙＣ遺伝子のコード配列内に挿入されていたことを示したためそのように呼ばれていた（株２３２のゲノムの塩基８４３４４８、ＧｅｎＢａｎｋのＡＥ０１７３３２．１）。そのために、株２３２のゲノムＤＮＡ及び株２３２ＴＣ３ｈｌｙＣのそれの両方とも、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＶで消化した。得られた断片を０．７％アガロースゲルで分離し、ナイロン膜に移した。プローブは、鋳型としてプラスミドｐＴＣ３を用いてジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰを用いたＰＣＲ反応によって、オリゴヌクレオチドＳｏｎｄａＴｅｔ−５（ＡＴＧ ＡＧＴ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＡＡ ＡＴＴ ＡＴＴ ＡＡＴ ＡＴＴ Ｇ）（配列番号４４）及びＳｏｎｄａＴｅｔ−３（ＣＴＡ ＡＧＴ ＴＡＴ ＴＴＴ ＡＴＴ ＧＡＡ ＣＡＴ ＡＴＡ ＴＣＧ ＴＡＣ ＴＴＴ ＡＴＣ）（配列番号４５）で生成された。プローブは、トランスポゾンの挿入が起こったゲノムの領域（図５Ａ）がサザンブロットで検出されるように、テトラサイクリン耐性遺伝子配列ＴｅｔＭを認識する。バンドの数と大きさは、理論的に予測されるものと一致し、この方法により得られた変異体及びそのようなベクターは、トランスポゾン挿入の単一コピーを有し、前記挿入は数世代後に安定に保たれていることを示唆している。

実施例６．２．−プラスミドｐＴＣ３Ｃ、ｐＴＣ３Ｌ及びｐＴＣ３Ｔの転位による形質転換によって得られた変異株の解析
各トランスポゾン由来の幾つかの変異体が選択され、６３１４Ｃｃ１、２３２Ｃｃ６、２３２Ｌｃ２、２３２Ｔｃ２と呼ばれる。前述したように、細胞質ゾルでの発現のために設計されたプラスミドによる２つの変異体（一つは株６３１４のための６３１４Ｃｃ１及び他方は株２３２のための２３２Ｃｃ６）が選択されたが、膜に局在するように設計されたバージョンは、プラスミドｐＴＣ３Ｌからの変異体２３２Ｌｃ２とｐＴＣ３Ｔからの変異体２３２Ｔｃ２など、株２３２で例証されただけである。

細菌染色体における細胞質ゾルバージョントランスポゾン（ｐＴＣ３Ｃ）の挿入点は、直接ゲノムＤＮＡ配列決定により決定した。株２３２のゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＥ０１７３３２．１）を参照すると、クローン６３１４Ｃｃ１におけるトランスポゾンは塩基２２４５４７に挿入されが、一方、クローン２３２Ｃｃ６におけるトランスポゾンは塩基５６９２５３に挿入された。

ＰＣＶ２カプシドタンパク質の存在を同定し、そして、それを得られたＭｈｙｏの株（２３２Ｌｃ２、２３２Ｃｃ６、２３２Ｔｃ２と６３１４Ｃｃ１）で定量するために、オンプレート免疫検出（ＥＬＩＳＡ）による前記抗原の検出及び定量を可能にする市販のキット（Ingenasa）が使用された。タンパク質抽出物は、各株１００倍（１００ｘ）の対数増殖期にある培養物を濃縮し、ＰＢＳ及び０．１％（ｖ／ｖ）の最終濃度でのトリトン（登録商標）Ｘ−１００中で得られた細胞を溶解後に得られた。結果は、試験した全ての株及びプラスミドはＯＲＦ２又はＯＲＦ２ｖ２によってコードされるタンパク質を大なり小なりの量で発現されることを示す陽性であった（図５Ｂ）。

プラスミドｐＴＣ３Ｃからのバージョンによる株もまた変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウェスタンブロットによって分析した（図５Ｃ）。ＰＣＶ２カプシドタンパク質と同じ分子量のバンドが検出された。興味深いことに、組換えタンパク質の発現に共通の問題であるタンパク質分解バンドは存在しなかった。組換え的にＭｈｙｏにおいて発現されるＰＣＶ２カプシドタンパク質は、多価ワクチンを製剤化するための優れた抗原であることができる。同様に、Ｍｈｙｏは、組換えタンパク質を発現させるための優れた宿主であることが確認された。

実施例７．− ワクチン接種アッセイ
実施例７．１．− ＰＣＶ２によるワクチン接種及び曝露
これは、本発明の方法に従って調製されたＭｈｙｏの形質転換株を含有するワクチンの有効性が試験され、ここで、前記株はそれらの細胞質ゾル中にＰＣＶ２サーコウイルスカプシドタンパク質を発現し、動物はＰＣＶ２の病原性株で曝露された。

評価された応答は、ＥＬＩＳＡにより決定されたＰＣＶ２に対する及びＭｈｙｏに対する免疫応答及び動物の血清中のＰＣＶ２ウイルスＤＮＡの量であった。

試験のために、年齢２８日の７２匹のブタが選択され、それらは各々が１２匹の６グループに無作為に分けられた。

前記有効性は、動物の４グループによる２^２要因計画に従って試験され、そこで評価される要因はＭｈｙｏの形質転換株とワクチン接種レジメンであった。そのために、株６３１４Ｃｃ１又は株２３２Ｃｃ６を含有するワクチンが試験され、動物は単回投与レジメン又は付加的投与を含む再ワクチン接種レジメンに従ってワクチン接種された。

実施したアッセイのグループを表ＩＩに示す。

更に、２つのグループの動物が試験に組み込まれた：非ワクチン接種であるが感染したグループ（グループ５）、非ワクチン接種であって非感染グループ（グループ６）。

ワクチンは、非イオン性界面活性剤を用いて不活性化されたＭｈｙｏの変異株、及びアジュバントとしてＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを含み、動物の首に筋肉内投与された。

ワクチン接種レジメンは、対照グループの一部ではない全ての動物に試験の第０日目に２ｍｌの用量のワクチンを投与することから成り、その動物の半分は最初の投与後１４日に再ワクチン接種された。

グループ５と６の動物はプラセボとして初日と第１４日目に２ｍｌのＰＢＳを受けた。

ワクチンのため抗原を調製するために、Ｍｈｙｏの形質転換株は、３７℃の温度で、１００から２００ｒｐｍの間で振盪下、０．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＦｒｉｉｓ培地中で、培地のｐＨの変化に起因する色の変化が観察されるまで増殖させた。

培養物を遠心分離し、ＰＢＳで２回洗浄し、３０倍に濃縮された培養物を得た。形質転換されたＭｈｙｏ株６３１４Ｃｃ１に対応する抗原は、９．２色変化単位／ｍｌ（ＣＣＵ／ｍｌ ｌｏｇ_１０）の力価を有し、形質転換されたＭｈｙｏ株２３２Ｃｃ６に対応する抗原は、９．４５ＣＣＵ／ｍｌ ｌｏｇ_１０の力価を有していた。ＰＣＶ２カプシドタンパク質の生成はＥＬＩＳＡにより確認した（Ingezim PCV DAS, Ingenasa, Spain）。各抗原の全タンパク質は、クーマシーブルー法により測定してそれぞれ、３７３ｍｇ／ｌ及び３５０．２ｍｇ／ｌであった。

抗原は、非イオン性界面活性剤で不活性化され、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルション、例えば、５０：５０重量／重量の割合でのＭｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）ＩＳＡ２０１製品（SEPPIC、France）などがアジュバントとして使用された。

血液サンプルをワクチン接種の前日（−１日目）、１３日目（ワクチン再接種の前日）、２７日目（感染前）、そして、試験の３５日目、４２日目及び４９日目にそれぞれ対応する感染後７日目、１４日目、及び２１日目に動物から採取した。

血清は、ＰＣＶ２抗体のＥＬＩＳＡ試験キット（Biocheck, The Netherlands）を用いてＰＣＶ２に対する免疫応答を決定するため、及びＣＩＶＴＥＳＴ ＳＵＩＳ Ｍｙｏ（Hipra, Girona-Amer, Spain）を用いてＭｈｙｏに対する免疫応答を決定するため；そしてまたＰＣＶ２ウイルス血症の分析のために得た。

血清サンプルを−１日目、１３日目及び２７日目に得たが、それらは陰性であると予想されたので、それらは、例えば、Quintana et al., Veterinary Record, 2001, 149, 357-361によって説明したように標準的なＰＣＲによって分析され、一方、感染後７日目及び１４日目に採取したサンプルは、例えば、Olvera et al., J. Virol. Meth., 2004, 10 117, 75-80によって説明したように定量的ＰＣＲによって分析された。

１から５グループの動物は、２ｍｌ（５．６６ ＣＣＩＤ_５０／ｍｌ ｌｏｇ_１０）のＰＣＶ２の病原性野生型株（Ｓｐ−１０７−５４−１３ ＰＣＶ２、Fort et al., Vet. Immunol. Immunopathol., 2010, 137, 226-234）で、ワクチンの最初の用量の投与後２８日目に鼻腔内感染させた。グループ６からの動物は鼻腔内にプラセボとして２ｍｌのＰＢＳを受けた。動物は、試験の４９日目、即ち、感染後２１日目に安楽死させた。

完全盲検、無作為感染ワクチン接種の試験中に、動物はバイオセーフティーレベル３による部屋で飼育した。グループ６は、交差感染を防止するために別の部屋に配置され、従ってこれは、動物の世話をすることに責任を負う職員には非盲検である唯一のグループであった。

動物は抗ＰＣＶ２移行抗体を持っていたことを考慮して、グループは、グループ間の初期の差異を防ぐために、このパラメータに関連してブロック単位で処置した。

ＰＣＶ２感染の有効性を評価するための主要なパラメータは、定量的ＰＣＲにより決定されるＰＣＶ２ウイルス血症の減少であった。

Ｍｈｙｏに関して有効性を判定するための主要なパラメータは、ＥＬＩＳＡにより分析されるセロコンバージョンであった。

Ｍｈｙｏに対する血清学的応答は、図６に示されている。４つの試験ワクチンは、試験の１３日目以降から非ワクチン接種グループと比べて有意な血清転換を促進した（グループ５及び６）。

ＰＣＶ２感染後、ワクチン接種グループは、感染後１４日目に、またグループ４を除いて感染後２１日目に、非ワクチン接種であるが感染のグループに関してより大きな免疫応答を示した。

非ワクチン接種であって非感染グループは、感染後２１日目において、非ワクチン接種であって感染グループとは有意に相違して、抗ＰＣＶ２移行抗体の正常な低下を示した。

ＰＣＶ２感染に関連した臨床徴候は観察されなかった。ＰＣＶ２の試験モデルは、通常、無症状モデルであり、ワクチンの有効性を決定するための重要なパラメータは、ウイルス血症の減少である。

全ての動物は、感染の前に、標準的なＰＣＲによって実行された分析によって、ＰＣＶ２に関して陰性であった。図８は、感染後７日目及び１４日目に、ＰＣＲによりリアルタイムで定量したＰＣＶ２のゲノムコピーを示す。ＰＣＶ２のいかなるゲノムコピーも、非ワクチン接種であって非感染グループの血清サンプルにおいて検出されなかった。

ＰＣＶ２ウイルス血症は、感染後１４日目に、非ワクチン接種であるが感染したグループと比較して、ワクチン接種グループで有意に低かった。

この試験の結果は、本発明の方法によって形質転換されてＰＣＶ２カプシドタンパク質を発現するＭｈｙｏの株は、Ｍｈｙｏ及びブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）に対する有意な免疫応答を同時に生み出すことを示している。

非ワクチン接種であって感染グループ（グループ５）で観察されたＰＣＶ２ウイルス血症から推測されるように、一度ＰＣＶ２感染が確立されると、ワクチン接種した動物におけるＰＣＶ２に対する差次的免疫応答は、感染後１４日目には明らかであった。

Ｍｈｙｏで起こったこととは逆に、抗ＰＣＶ２移行抗体の存在は、実験的感染の非存在下で、ワクチンの免疫原性評価を妨げた。

ＰＣＶ２感染に起因する巨視的な病変に対応する臨床徴候は実験モデルで再現することができないので、ＰＣＶ２感染の結果は、定量的ＰＣＲによるウイルス血症の観点から評価し、ワクチンの有効性は、ウイルス血症の減少によって示された。ウイルス血症がその最高レベルに達すると、この減少は、感染後１４日目に４つの試験ワクチンで観察された。

従って、ＰＣＶ２タンパク質カプシドを発現するＭｈｙｏの形質転換株は、Ｍｈｙｏによって、同時にブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）によって引き起こされる感染症に対するワクチンで使用することができる。

実施例７．２．− ＰＣＶ２及びＭｈｙｏによるワクチン接種及び感染
本発明の方法に従って調製されたＭｈｙｏの形質転換株を含有するワクチンの有効性が試験され、ここで、前記株はその細胞質ゾル中にＰＣＶ２サーコウイルスカプシドタンパク質を発現した。動物はＰＣＶ２とＭｈｙｏの病原性株で曝露した。

評価される応答は、動物の血清中のＰＣＶ２ウイルスＤＮＡの量、ＰＣＶ２ウイルス血症を有する動物の数、及び動物の肺におけるとＭｈｙｏ様病変であった。

試験のために、年齢２８日の３６匹のブタが選択され、それらは各々が１２匹の３グループに無作為に分けられた。

前記有効性は、株６３１４Ｃｃ１を含むワクチンを用いて試験したグループ１の動物は、単回投与レジメンに従ってワクチン接種した。更に、２つのグループの動物が試験に組み込まれた：非ワクチン接種であるが感染したグループ（グループ２）、非ワクチン接種であって非感染グループ（グループ３）。

ワクチンは、非イオン性界面活性剤を用いて不活性化されたＭｈｙｏの変異株、及びアジュバントとしてＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを含み、動物の首に筋肉内投与された。

ワクチン接種レジメンは、対照グループの一部ではない全ての動物に試験の第０日目に２ｍｌの用量のワクチンを投与することからなる。

グループ２及び３からの動物はプラセボとして２ｍｌのＰＢＳを受けた。

ワクチンのため抗原を調製するために、Ｍｈｙｏの形質転換株は、３７℃の温度で、１００から２００ｒｐｍの間で振盪下、０．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＦｒｉｉｓ培地中で、培地のｐＨの変化に起因する色の変化が観察されるまで増殖させた。

培養物を遠心分離し、ＰＢＳに再懸濁し、２５倍に濃縮された培養物を得た。形質転換されたＭｈｙｏ株６３１４Ｃｃ１に対応する抗原は、９，３２５色変化単位／ｍｌ（ＣＣＵ／ｍｌ ｌｏｇ_１０）の力価を有していた。ＰＣＶ２カプシドタンパク質の生成はＥＬＩＳＡにより確認した（Ingezim PCV DAS, Ingenasa, Spain）。

抗原は、非イオン性界面活性剤で不活性化され、アジュバントとして、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルション、例えば、５０：５０重量／重量の割合でのＭｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）ＩＳＡ２０１製品（ＳＥＰＰＩＣ、フランス）が使用された。

血液サンプルをワクチン接種の前日（−１日目）、ワクチン接種後の１３日目、２１日目及び２７日目、そして、試験の３５日目、４２日目、４９日目及び５６日目にそれぞれ対応する感染後７日目、１４日目、２１日目及び２８日目に動物から採取した。

血清を、例えば、既に引用されたＯｌｖｅｒａらに説明されるように、定量的ＰＣＲを用いて、ＰＣＶ２ウイルス血症を測定するために得た。

グループ１及び２からの動物は、ＰＣＶ２の病原性野生型株（Ｓｐ−１０７−５４−１３ ＰＣＶ２、Fort et al., Vet. Immunol. Immunopathol., 2010, 137, 226-234）の２ｍｌ／動物（５．３３ ＣＣＩＤ_５０／ｍｌ ｌｏｇ_１０）により鼻腔内感染させ、ワクチンの投与後２８日目に、病原性株Ｍｈｙｏ ３３７１の１０ｍｌ／動物（７．３２５ ＣＣＵ／ｍｌ ｌｏｇ_１０）により気管内感染させた。グループ３からの動物は、プラセボとして２ｍｌのＰＢＳを鼻腔内に、１０ｍｌのＰＢＳ／動物を気管内に受けた。動物は、試験の５６日目、即ち、感染後２８日目に安楽死させ、その時点で、動物の肺におけるＭｈｙｏ様病変の存在を評価した。

完全盲検、無作為感染ワクチン接種の試験中に、動物はバイオセーフティーレベル３による部屋で飼育した。グループ３は、交差感染を防止するために別の部屋に配置され、従ってこれは、動物の世話をすることに責任を負う職員には非盲検である唯一のグループであった。

動物は抗ＰＣＶ２移行抗体を持っていたことを考慮して、グループは、グループ間の初期の差異を防ぐために、このパラメータに関連してブロック単位で処置した。

ＰＣＶ２感染の有効性を評価するための主要なパラメータは、定量的ＰＣＲにより決定されるＰＣＶ２ウイルス血症の減少であった。Ｍｈｙｏに関して有効性を判定するための主要なパラメータは、Ｍｈｙｏ様病変により罹患した肺の表面であった。

全ての動物は、実験的な感染の前に、標準的なＰＣＲによって実行された分析によって、ＰＣＶ２に関して陰性であった。図１２は、感染後７日目、１４日目、２１日目及び２８日目に、ＰＣＲによりリアルタイムで定量したＰＣＶ２のゲノムコピーを示す。ＰＣＶ２のいかなるゲノムコピーも、非ワクチン接種であって非感染グループの血清サンプルにおいて検出されなかった。ＰＣＶ２ウイルス血症は、感染後１４日目及び２１日目に、非ワクチン接種であるが感染したグループと比較して、ワクチン接種グループで有意に低かった。

図１３は、ウイルス血症を有する（定量的ＰＣＲで陽性）動物の割合として表される、同じ結果を示している。

図１４は、Ｍｈｙｏ様病変により罹患した肺表面の百分率の中央値を示している。ワクチン接種した動物において罹患した肺表面は、非ワクチン接種であるが感染した動物よりも有意に低かったことが観察された（グループ２）。

この試験の結果は、本発明の方法に従って遺伝的に形質転換され及びＰＣＶ２カプシドタンパク質を発現するＭｈｙｏの株は、非ワクチン接種した動物と比較して、ＰＣＶ２ウイルス血症及びＭｈｙｏ様病変の有意な減少を同時に起こすとする結論に導いた。

その結果として、ＰＣＶ２タンパク質カプシドを発現するＭｈｙｏの形質転換株は、Ｍｈｙｏによって、同時にブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）によって引き起こされる感染症に対するワクチンで使用することができる。

実施例８．−形質転換された変異株の弱毒化の程度の試験
実施例８．１．− Ｍｈｙｏ溶血素Ｃ遺伝子においてトランスポゾン挿入を有する形質転換された変異株の弱毒化の程度を試験する
転位により得られたＭｈｙｏの変異株の弱毒化の程度を、この試験で、ブタの上部及び下部気道にコロニーを形成する前記株の能力を評価することによって測定した。

例４．５で得られた試験された変異株、２３２ＴＣ３ｈｌｙＣは、Ｍｈｙｏ溶血素Ｃ遺伝子（ｈｌｙＣ）におけるトランスポゾン挿入を示している。

８週齢のブタが選択され、それらはランダムに各々８匹ずつ２グループに分けられ、各グループは、相互感染を防止するために、別々の部屋において維持された。

動物は感染される前に鎮静された。動物のグループは、変異株２３２ＴＣ３ｈｌｙＣを１０ｍｌで０日目に気管内感染させ、他のグループはＭｈｙｏの親株２３２を１０ｍｌで気管内感染させた。接種は、７ＣＣＵ／ｍｌ ｌｏｇ_１０の力価を有していた。動物は、試験の２８日目に安楽死させた。

鼻サンプルは、ネステッドＰＣＲによりＭｈｙｏ解析を実施するために、−１日（感染の前日）、８日目、１５日目、２１日目、及び２８日目に採取した。

気管支のサンプルは、またネステッドＰＣＲによりＭｈｙｏ解析を実施するために、安楽死させた動物から２８日目に採取した。

ＭｈｙｏのゲノムＤＮＡを保有する動物は、試験の過程を通じて収集した鼻の試料では検出されなかった。しかしながら、Ｍｈｙｏ野生型株２３２は、動物の気管支のサンプルの２５％で検出されたものの、形質転換変異株においては検出率は０％であった。

この結果は、変異株２３２ＴＣ３ｈｌｙＣは、下気道のコロニー形成に関して、それが由来する親株と比較して弱毒化した挙動を示しており；従って、それをＭｈｙｏに対するワクチンにおいて弱毒化された候補として使用することができることを示唆している。

実施例８．２．− Ｍｈｙｏ溶血素１５９遺伝子の発現の阻害を示す形質転換された変異株の弱毒化の程度を試験する
Ｍｈｙｏ溶血素１５９遺伝子の発現の抑制を示す実施例４．８で得られた株６３１４ＰＯＧＡｃ４の減衰の程度は別の試験で決定された。

８週齢のブタが選択され、それらはランダムに各々８匹ずつ３グループに分けられ、相互感染を防止するために、別々の部屋において維持された。

試験の０日目に、グループ１からの動物は、８ＣＣＵ／ｍｌ ｌｏｇ_１０の濃度で１０ｍｌの株６３１４ＰＯＧＡｃ４を気管内に接種され、そして同量の野生型親菌株６３１４がグループ２からの動物に投与された。動物は感染される前に鎮静された。グループ３は非感染対照グループであった。動物は、試験の２８日目に安楽死させた。

血液試料は、感染の前日（−１日目）、１５日目及び２８日目に採取した。Ｍｈｙｏの血清は、ＣＩＶＴＥＳＴ ＳＵＩＳ Ｍｈｙｏ（Hipra-Amer-Girona-Spain）によって解析された。鼻サンプルは、ネステッドＰＣＲによりＭｈｙｏ解析を実施するために、−１日、８日目、１５日目、２１日目、及び２８日目に採取した。

気管支のサンプルは、またネステッドＰＣＲによりＭｈｙｏ解析を実施するために、安楽死させた動物から２８日目に採取した。

Ｍｈｙｏ感染と一致する巨視的カタル性気管支肺炎肺病変が評価された。各肺葉は、Ｍｈｙｏによって引き起こされる病変を有する組織の割合に応じて０から５で評価された。

罹患した全肺表面への各肺葉の寄与は、Christensen et al., Diseases of the respiratory system. In: Diseases of Swine. 8^th Edition. Straw B.E., D'Allaire S., Mengeling W.L. and Taylor D.J. Iowa State University Press, Ames (IA) 1999の914頁に記載される方法を適用して算出した。

図９はＭｈｙｏ感染に対する血清学的応答を示す。野生型親株（グループ２）のみが、感染後２８日目で血清転換を示し、形質転換された変異株６３１４ＰＯＧＡｃ４に感染したグループ１、及び対照グループに関して有意な違いであったことが観察できる。

図１０は、Ｍｈｙｏは、グループ２の鼻の試料のみで感染後２１日目と２８日目で検出されたことを示している。グループ２の８匹の動物において、Ｍｈｙｏは、２８日目に収集した気管支のサンプルで検出されたが、一方、その数は本発明の形質転換された変異株を投与したグループで有意に少なかった。

Ｍｈｙｏによって引き起こされる巨視的な肺病変は、野生型親株に感染したグループ２において有意に高かったが、一方本発明の変異株に感染した動物は、非感染グループで観察されたものに匹敵する小さな病変を示したことが図１１で観察することができる。

従って、この実施例で試験した本発明の形質転換された変異株は、上気道及び下気道にコロニーを形成する能力の低下及びＰＥＰ−関連肺病変を引き起こす能力の低下をも示していると結論付けることができる。

この全ては、形質転換された変異株は、ＰＥＰとＭｈｙｏ関連病態に対する弱毒化ワクチンを調製するために使用することができることを示唆している。

Claims (6)

1. ライプニッツ・インスティテュートＤＳＭＺに寄託されたＭｈｙｏの変異株であり、
   受託番号ＤＳＭ２６０２０を有するＭｈｙｏの変異株、
   受託番号ＤＳＭ２６０２７を有するＭｈｙｏの変異株、
   受託番号ＤＳＭ２６０３３を有するＭｈｙｏの変異株、
   受託番号ＤＳＭ２６０３４を有するＭｈｙｏの変異株、及び
   受託番号ＤＳＭ２６０４９を有するＭｈｙｏの変異株から選択される、変異株であって、
   マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｈｙｏ）の変異株を調製するための方法により得ることができる、変異体であり、
   方法が、Ｍ．ハイオニューモニエのプロモーター領域のＤＮＡ配列の制御下にある配列である、少なくとも一の外来性ＤＮＡ配列を含むキャリアベクターを用いることによってＭ．ハイオニューモニエの菌株を形質転換する工程を含むことを特徴とし、
   キャリアベクターが、複製プラスミドベクター及びトランスポゾンベクターからなる群から選択され、
   複製プラスミドベクターが、
   １）マイコプラズマ・ハイオニューモニエであるマイコプラズマ属の種の菌株のｏｒｉＣ領域を含むＤＮＡ配列、及び
   ２）Ｍｈｙｏのプロモーター領域のＤＮＡ配列の制御下にある、マーカー遺伝子、及び任意選択的に付加的な外来性ＤＮＡ配列を含む外来性ＤＮＡ配列、を含み、
   トランスポゾンベクターが、
   １）トランスポザーゼをコードするＤＮＡ配列、
   ２）マーカー遺伝子を含む外来性ＤＮＡ配列、及び
   ３）任意選択的に付加的な外来性ＤＮＡ配列、を含み、
   トランスポザーゼをコードするＤＮＡ配列及び少なくとも１の外来性ＤＮＡ配列が、Ｍｈｙｏのプロモーター領域のＤＮＡ配列の制御下にあり、
   Ｍｈｙｏのプロモーター領域は、Ｐ３６、Ｐ４６、Ｐ６５、Ｐ７６、Ｐ９７、Ｐ１０２、Ｐ１４６、及びＰ２１６タンパク質からなる群から選択されるＭｈｙｏタンパク質をコードする遺伝子の５’側に位置する少なくとも５０塩基対を含むＤＮＡ断片に対応し、かつ
   Ｍｈｙｏのプロモーター領域はＭｈｙｏＤＮＡ配列の転写を開始又は促進する、方法である、変異株。
2. 請求項１に記載される、Ｍｈｙｏの変異株の免疫学的に有効な量を含む、Ｍｈｙｏによって引き起こされるブタ流行性肺炎に対して、ブタを保護するためのワクチン。
3. ブタに影響を及ぼす別の疾患又は付加的病理学的状態に対して、ブタを保護するための、請求項２に記載のワクチン。
4. 付加的ワクチン又は抗原性組成物と組み合わされることを特徴とする、請求項２又は３に記載のワクチン。
5. 請求項１に記載される、変異株の免疫学的に有効な量を含む容器を含む、Ｍｈｙｏによって引き起こされるブタ感染症又は疾患に対して、ブタにワクチン接種するためのワクチン接種キット。
6. ブタに影響を与える微生物によって引き起こされる別の疾患又は病理学的状態に対して、ブタにワクチン接種するための、請求項５に記載のワクチン接種キット。