PT1957103E - Vacina bacteriana contra agentes infecciosos bacterianos para aplicar em animais - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"VACINA BACTERIANA CONTRA AGENTES INFECCIOSOS BACTERIANOS PARA APLICAR EM ANIMAIS" A invenção refere-se a uma vacina bacteriana segundo o conceito geral da reivindicação 1 e a um processo para a sua preparação de acordo com a reivindicação 3. A invenção refere-se, para além disso, a uma bactéria de acordo com a reivindicação 4, a uma proteína imunogénica de acordo com a reivindicação 7, à sua utilização de acordo com a reivindicação 10 e a um processo de diagnóstico de acordo com a reivindicação 11.

Na criação animal agrícola, em particular na criação de porcos, as doenças das vias respiratórias e as infecções do tracto gastrointestinal são responsáveis por prejuízos económicos substanciais. As doenças não só provocam uma elevada mortalidade, uma redução das taxas de crescimento e uma pior qualidade da carne, como são também responsáveis por mais de metade de todos os tratamentos antibióticos no domínio da criação de porcos de engorda (Elbers et ai., 1990,

Sero-epidemiological screening of pig sera collected at the slaughterhouse to detect herds infected with Aujeszky's disease virus, porcine influenza virus and Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae in the framework of an integrated quality control System. Vet.Q. 12, 221-230).

Na criação animal agrícola, as vacinações, em particular contra infecções bacterianas, são empregues praticamente 1 exclusivamente metafiláctica e não profilacticamente. Neste caso, não é o animal individual que está no centro das medidas, mas sim o efectivo. Assim sendo, em particular nos efectivos para os quais há um agente patogénico endémico, estes são vacinados contra este agente patogénico independentemente do facto de um animal individual estar já infectado ou não.

As vacinas contra agentes infecciosos bacterianos utilizadas actualmente na medicina veterinária são predominantemente bacterinas formuladas simplesmente com adjuvantes, p. ex. bactérias inteiras inactivadas com formalina. Por adjuvante deve entender-se, neste caso, uma substância que é aplicada como mistura com uma substância (antigénio) que desencadeia uma resposta imunitária, e que induz anticorpos, ou separada desta e que, de modo inespecifico, intensifica ou altera a resposta imunitária a este antigénio. Estes conseguem frequentemente uma protecção frequentemente serotipica face a doenças clinicas sem impedir, contudo, uma colonização latente das mucosas. Por esta razão, o agente infeccioso também pode ser propagado através de animais vacinados.

Os agentes patogénicos mais relevantes de doenças infecciosas respiratórias, tais como Actinobacillus pleuropneumoniae, Mycoplasma hyopneumoniae ou Mycobacterium bovis são altamente contagiosos e ocorrem frequentemente como colonizadores latentes de mucosas do tracto respiratório. 0 A. pleuropneumoniae e o M. hyopneumoniae têm em comum o facto de animais reconvalescentes permanecerem frequentemente portadores do agente patogénico durante meses. Isto, suportado pelo comércio de gado e pelo transporte de animais, levou a uma disseminação generalizada dos agentes patogénicos. As vacinas que se encontram no mercado até à data são quase exclusivamente 2 bacterinas. Nenhuma das vacinas impede uma infecçao latente ou permite uma distinção entre animais vacinados e infectados.

As infecções com Salmonella Typhimurium representam, do ponto de vista da defesa sanitária do consumidor, a doença do tracto gastrointestinal mais importante nos porcos. No mercado, até à data, existem vacinas contra a salmonelose dos novilhos e contra a colonização de salmonelas de suínos e das poedeiras. Em todos os casos podem ser também obtidas, ou exclusivamente, vacinas vivas atenuadas. Nos novilhos impede-se eficazmente o surgimento de sintomas clínicos através da vacina. Em poedeiras reduz-se nitidamente a transmissão intraovariana, bem como a excreção do agente patogénico, em suínos reduz-se a excreção do agente patogénico.

As vacinas vivas de salmonelas aprovadas contêm agentes patogénicos atenuados preparados por mutações químicas, que podem ser distinguidas genotípica e fenotipicamente da estirpe selvagem. Na aplicação destas vacinas não é contudo possível uma distinção serológica entre animais vacinados e animais infectados.

As vacinas de bacterina actuais não permitem assim qualquer distinção serológica entre animais de criação vacinados e infectados, p. ex., pela aplicação de um teste de ELISA. Deste modo, com auxílio destas vacinas não é possível construir efectivos livres de agentes patogénicos específicos (SPF) e mantê-los de forma controlada sob protecção por vacinação. A criação de efectivos SPF é contudo o objectivo ideal no sentido da defesa preventiva do consumidor e em termos de eficiência económica. 3

Para além disso, a vacinação de porcos em explorações com controlo de salmonelas é problemática (BMVEL 1996; Leitlinie zur Reduzierung des Eintrags von Salmonellen durch Schlachtschweine in die Fleischgewinnung; eine entsprechende Verordnung ist in Vorbereitung) , dado que a classificação e monitorização destas explorações é efectuada com base na serologia e dado que os animais vacinados reagem positivamente em termos serológicos. 0 objectivo da criação de efectivos SPF foi alcançado para a doença de Aujeszky em suínos (causada pelo vírus Herpes I porcino) e em infecções de bovinos com o vírus Herpes 1 bovino (BHV1) através da introdução de vacinas marcadas. As vacinas marcadas baseiam-se em estirpes de vacinas alteradas estruturalmente que, em regra, possibilitam uma distinção serológica entre animais vacinados e animais naturalmente infectados. Distingue-se entre vacinas marcadas positivas e vacinas marcadas negativas.

Para preparar vacinas marcadas positivas introduz-se, em regra, um marcador antigénio por tecnologia genética na estirpe de vacina, que, em regra, induz a formação de anticorpos adicionais ou é, pelo menos, detectável genotípica ou fenotipicamente. A desvantagem é o facto de as infecções posteriores com um agente infeccioso nativo, após uma vacinação, isto é, vacinado mais infectado, deixarem de poder ser detectadas. A vacina marcada positiva permite assim, apenas a distinção entre animais não vacinados, não vacinados mais infectados e vacinados.

As vacinas marcadas negativas são caracterizadas por faltar uma zona definida do genoma ao genoma do agente patogénico.

Estas mutações poder ser originadas por vias naturais ou por via 4 da tecnologia genética. A ausência de um segmento definido de um gene gue codifique para uma proteína imunogénica conduz à alteração da resposta imunitária humoral que permite uma distinção entre animais apenas infectados, apenas vacinados e vacinados mais infectados. Uma demarcação entre animais vacinados mais infectados e animais apenas infectados não é possível, sendo que esta delimitação é contudo irrelevante do ponto de vista médico e económico. A vantagem de vacinas marcadas negativas sem ADN estranho é, além disso, o facto de, embora sendo organismos geneticamente modificados, não são abrangidos pela legislação alemã relativa à tecnologia genética.

Até à data, não foram contudo desenvolvidas quaisquer vacinas especificamente marcadas para a prevenção e combate de doenças infecciosas bacterianas em animais de criação, ao contrário do que é o caso no domínio das doenças infecciosas virais. KOTLOFF K L ET AL: "Shigella flexneri 2a strain CVD 1207, with specific deletions in virG, sen, set, and guaBA, is highly attenuated in humans." INFECTION AND IMMUNITY MAR 2000, vol. 68, n2 3, Março 2000 (2000-03), páginas 1034-1039, XP002454965 ISSN: 0019-9567 descreve uma vacina de Shigella flexneri 2a estirpe CVD 1207 (Enterobacteriaceae) com mutações específicas por deleção nos genes virG, sen, set e guaBA. O artigo de revisão MASTROENI P ET AL: "Salmonella: immune responses and vaccines." VETERINARY JOURNAL (LONDON, ENGLAND : 1997) MAR 2001, vol. 161, n2 2, Março 2001 (200103), páginas 132-164, XP002454966 ISSN: 1090-0233 descreve a preparação de vacinas contra infecções por salmonela. São descritos mono a 5 trimutantes diferentes como vacinas adequadas. Numa tabela estão expostos diversos alvos génicos. MEYER P N ET AL: "Virulence of a Salmonella typhimurium OmpD mutant." INFECTION AND IMMUNITY JAN 1998, vol. 66, η2 1, Janeiro 1998 (1998-01), páginas 387-390, XP002455109 ISSN: 0019- 9567 descreve mutantes de Salmonella Typhimurium OmpD. Estes mutantes não são contudo adequados como vacina bacteriana, dado que a virulência destes não se distingue da do tipo selvagem. DORMAN C J ET AL: "CHARACTERIZATION OF PORIN AND OMP-R MUTANTS OF A VIRULENT STRAIN OF SALMONELLA -TYPHIMURIUM OMP-R MUTANTS ARE ATTENUATE IN-VIVO" INFECTION AND IMMUNITY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY. WASHINGTON, US, vol. 57, n2 7, Julho 1989 (1989-07), páginas 2136-2140, XP002112175 ISSN: 0019-9567 refere-se a mutantes de Salmonella Typhimirium com deleções nas porinas ompC, ompD, ompF e no regulador ompR, em que a mutação em ompR conduz a uma estirpe avirulenta, enquanto as outras mutações não afectam de todo a virulência ou afectam-na apenas diminutamente. A presente invenção tem, por conseguinte, por base o objectivo de desenvolver vacinas marcadas para o combate de doenças infecciosas bacterianas, que possibilitem uma distinção serológica simples entre animais de exploração vacinados e animais naturalmente infectados, em particular, na criação de porcos.

Este objectivo é solucionado através de uma vacina bacteriana com as características da reivindicação 1. 6 A vacina bacteriana de acordo com a invenção destinada à aplicação em animais, em particular em animais de criação, compreende, pelo menos, um serotipo do organismo Salmonella enterica com, pelo menos, respectivamente uma mutação knock-out em, pelo menos, três genes cromossómicos diferentes, em que o serotipo Salmonella Thypimurium compreende, pelo menos, uma mutação knock-out num gene que codifica a proteína OmpD. A mutação knock-out na zona que codifica a proteína imunogénica faz com que deixe de ser formada a proteína imunogénica correspondente e, com isso, também os correspondentes anticorpos, num animal vacinado. Dado que a proteína imunogénica que deixa de ser expressa devido à manipulação génica não é essencial para uma imunidade protectora, a vacina de acordo com a invenção continua a oferecer uma protecção imunitária efectiva.

As proteínas essenciais para a resposta imunitária protectora não são, pelo contrário, manipuladas, de modo que a vacina oferece uma protecção activa do animal vacinado contra os respectivos agentes infecciosos. Torna-se assim possível, distinguir entre animais vacinados e animais naturalmente infectados através de testes serológicos simples, tais como o ELISA, dado que o agente patogénico natural, não manipulado, produz todas as proteínas imunogénicas, mas ao agente patogénico utilizado como vacina faltam contudo algumas proteínas imunogénicas desnecessárias para a protecção. A manipulação do agente infeccioso baseia-se assim, no essencial, em proteínas imunogénicas não essenciais para a protecção e seus genes correspondentes, numa estirpe alvo 7 geneticamente manipulável e num sistema para a contrasselecção destinado à identificação da estirpe alvo manipulada.

De um modo preferido, estão ainda introduzidas mutações knock-out adicionais em genes cromossómicos, que não codificam proteínas imunogénicas, mas que servem para atenuar o agente patogénico bacteriano. A vacina compreende, pelo menos, um agente infeccioso do grupo das bactérias gram-negativas, em particular da família das enterobactérias, Pasteurellaceae ou micoplasmas, que são responsáveis por diferentes doenças infecciosas em animais de criação. 0 agente infeccioso contido na vacina também pode ser, pelo menos, um serotipo de Actinobacillus pleuropneumoniae ou Mycoplasma hyopneumoniae. A vacina apresenta também, vantajosamente, pelo menos, um agente infeccioso do grupo das bactérias gram-positivas, de um modo preferido, da família das micobactérias que causam doenças das vias respiratórias, tal como a Mycobacterium bovis.

As mutações knock-out introduzidas nos agentes infecciosos representam vantajosamente deleções não marcadas, sendo que por uma deleção não marcada se entende uma deleção de um segmento de genoma sem introdução de um marcador de selecção específico, tal como uma cassete de resistência a antibióticos, neste segmento de genoma.

Pelo menos um serotipo do organismo Actinobacillus pleuropneumoniae apresenta, com vantagem, mutações knock-out em, 8 pelo menos, três dos genes, que codificam as proteínas ApxIIA (n2 de acesso AAU847009), UreC (n2 de acesso AAC00060), DmsA (n2 de acesso AAN28298), AspA (n2 de acesso NC_003998) HypB (n2 de acesso ZP_00134397) e/ou FurA (NC_004130). A proteína ApxIIA é uma toxina secretada, fortemente imunogénica, que ocorre em todos os serotipos de A. pleuropneumoniae com excepção do serotipo 10. O UreC é um componente do complexo enzimático da urease, que hidrolisa ureia a amoníaco e dióxido de carbono e facilita, com isso, a persistência do agente patogénico no meio ácido do "epithelial lining fluid" do pulmão. O gene dmsA codifica uma DMSO redutase, associada a virulência, expressa sob condições anaeróbias, (Baltes et ai., 2003, Identification of dimethyl sulfoxide reductase in Actinobacillus pleuropneumoniae and its role in infection. Infect. Immun. 71, 6784-6792). Uma correspondente mutante individual do serotipo 7 de A. pleuropneumoniae demonstrou ser ligeiramente atenuada num ensaio de infecção. 0 gene aspA codifica uma subunidade da aspartato-amónio liase (Jacobsen et ai. 2005, Enzymes involved in anaerobic respiration appear to play a role in Actinobacillus pleuropneumoniae virulence. Infect Immun 73, 226-234) e o gene hybB codifica a enzima [Ni,Fe]-desidrogenase 2 (Baltes, Kyaw et ai., 2004, Lack of influence of the anaerobic [NiFe] hydrogenase and L-1,2 propanediol oxidoreductase an the outcome of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 7 infection. Vet.Microbiol 102, 67-72). Ambas as enzimas são significativas no metabolismo anaeróbio de A. pleuropneumoniae e possibilitam a 9 sobrevivência do agente patogénico no meio anaeróbio das lesões pulmonares. 0 gene furA (ferric uptake regulation, fur) codifica um regulador global dependente de ferro. É um repressor transcricional de promotores regulados por ferro, que se liga ao ADN quando o ferro está presente. Foi já construído um mutante fur do serotipo 7 de A. pleuropneumoniae e testado em animais (Jacobsen et al. 2005, Enzymes involved in anaerobic respiration appear to play a role in Actinobacillus pleuropneumoniae virulence. Infect Immun 73, 226-234). Verificou-se, nesse caso, que o mutante já só causa sintomas muito diminutos da doença, mas que induz ainda uma forte resposta imunitária. O objectivo da invenção é igualmente solucionado por um processo para a preparação da vacina de acordo com a reivindicação 3. O processo de acordo com a invenção para a preparação da vacina é caracterizado por, para a mutagénese de OmpD no serotipo Salmonella Thypimurium, utilizar-se um vector pROKBl com um replicão R6K o qual contém o gene OmpD com uma mutação knock-out. O plasmídeo de transconjugação contém um gene do agente infeccioso com, pelo menos, uma mutação kock-out. De um modo preferido, o gene contém uma deleção interna e codifica uma proteína imunogénica, que não gera anticorpos essenciais para a protecção imunitária efectiva. 0 plasmídeo de transconjugação descrito no documento DE 19928073 compreende a região mobilizadora mobRP4, um poliligante, um replicão do tipo ColEl, um determinante de resistência e uma fusão transcricional do gene sacB de Bacillus 10 subtilis com o promotor omIA de Actinobacillus pleuropneumoniae. 0 gene que codifica uma proteína imunogénica com uma deleção não marcada é inserido, neste caso, como ADN exógeno no poliligante. A introdução das mutações knock-out nos, pelo menos, três genes cromossómicos efectua-se, vantajosamente, de modo sucessivo. A vacina de acordo com a invenção é utilizada vantajosamente como vacina bacteriana viva negativa e vacina bacteriana inactivada negativa. A vacina viva compreende, neste caso, uma estirpe atenuada, infecciosa mas enfraquecida, com capacidade de replicação, mas avirulenta. A vacina inactivada, pelo contrário, não tem capacidade de replicação. A inactivação é efectuada com álcoois ou aldeídos. A indução de uma resposta imunitária é desencadeada por adjuvantes tais como A1(0H)3. No caso das vacinas subunitárias não é necessária qualquer inactivação. 0 objectivo de acordo com a invenção é também solucionado através de uma bactéria de acordo com a reivindicação 4 utilizada na vacina bacteriana de acordo com a invenção, assim como de um processo de diagnóstico de acordo com a reivindicação 11. 0 processo de diagnóstico para a distinção entre animais infectados e animais vacinados com a vacina bacteriana de acordo com a invenção é caracterizado pela determinação serológica de proteínas imunogénicas não essenciais para a protecção imunitária, em particular, por meio de um teste ELISA. 11 0 objectivo colocado é também solucionado por uma proteína imunogénica de acordo com a reivindicação 7 e pela sua utilização de acordo com a reivindicação 10.

De acordo com isto, a proteína imunogénica de acordo com a invenção de, pelo menos, um agente infeccioso bacteriano de um animal, utilizada numa vacina, é caracterizada por gerar anticorpos que, de um modo preferido, não são essenciais para uma resposta protectora imunitária, em que esta interage com anticorpos de, pelo menos, um soro de porcos infectados com

Salmonella Typhimurium e com anticorpos de, pelo menos, um soro de porcos vacinados contra Salmonella Typhimurium. A proteína de acordo com a invenção é, de um modo preferido, detectável pelo facto de a proteína interagir com anticorpos de, pelo menos, um soro de um animal naturalmente infectado ou de um animal naturalmente infectado e vacinado, mas não, ou apenas parcialmente, com anticorpos de, pelo menos, um soro de animais da mesma espécie vacinados apenas com vacinas marcadas. A interacção específica da proteína de acordo com a invenção com os soros de um animal naturalmente infectado ou naturalmente infectado mais vacinado baseia-se na ligação de um anticorpo presente no soro ao seu antigénio específico.

Perante a infecção de um animal com um agente infeccioso natural são expressas normalmente um grande número de proteínas imunogénicas do agente infeccioso, tanto proteínas essenciais para a protecção imunitária, como também proteínas não essenciais. Os agentes infecciosos utilizados como vacinas vivas, pelo contrário, são bactérias cuja virulência está 12 enfraquecida, que são construídas de modo a que não expressem, pelo menos, uma proteína imunogénica que não seja essencial para a imunização. Os soros de animais vacinados contêm portanto um outro espectro de anticorpos e distinguem-se assim dos soros dos animais naturalmente infectados.

As proteínas de acordo com a invenção são assim, de um modo preferido, detectáveis em animais naturalmente infectados ou em animais naturalmente infectados mais vacinados e formam, por conseguinte, a base para os processos serológicos de teste para a distinção de animais vacinados com a vacina de acordo com a invenção e animais naturalmente infectados, bem como animais naturalmente infectados mais vacinados. A proteína imunogénica revela, com vantagem, uma interacção com anticorpos de soros de porcos infectados com Mycoplasma hyopneumoniae, mas não mostra qualquer interacção, ou uma interacção fraca, com anticorpos de soros de porcos vacinados contra Mycoplasma hyopneumoniae. A vacina utilizada nesta vacinação baseia-se vantajosamente em agentes patogénicos mortos de Mycoplasma hyopneumoniae. As proteínas imunogénicas preferidas são as lipoproteínas hipotéticas, proteína MHP 378 (n2 de acesso YP_115889) e MHP 651 (n2 de acesso YP_116159) de

Mycoplasma hyopneumoniae. A proteína imunogénica de acordo com a invenção é também contudo detectável pelo facto de esta reagir, de um modo preferido, com anticorpos de, pelo menos, um soro de porcos infectados com Salmonella Typhimurium e com anticorpos de, pelo menos, um soro de porcos vacinados contra Salmonella

Typhimurium. Uma proteína imunogénica preferida identificada em

Salmonella Typhimurium é a proteína OmpD. 13

Para dotar uma vacina viva contra Salmonella Typhimurium, já existente, com um marcador é necessário que o gene a ser mutado codifique uma proteína imunogénica, que seja reconhecida por anticorpos que tanto sejam gerados por animais naturalmente infectados como também em animais vacinados. Os soros de animais que sejam vacinados com a vacina viva dotada com o correspondente marcador na forma de um gene deletado já não reagem mais tarde com esta proteína. A proteína de acordo com a invenção e o ácido nucleico que lhe corresponde formam a base para a mutagénese do respectivo agente infeccioso destinado ao desenvolvimento de uma vacina marcada. A proteína de acordo com a invenção é utilizada, de um modo preferido, para a detecção de animais naturalmente infectados e/ou animais naturalmente infectados e vacinados, em particular de porcos, e/ou como vacina.

Para além disso, o objectivo colocado é solucionado através de um ácido nucleico e sua utilização. 0 ácido nucleico codifica, pelo menos, uma proteína imunogénica, que induz, de um modo preferido, anticorpos não essenciais para uma resposta imunitária protectora, e é caracterizado por, pelo menos, uma mutação destinada à adaptação ao uso específico do codão de, pelo menos, um hospedeiro de expressão. 0 ácido nucleico codifica, com vantagem, a proteína MHP 378 de Mycoplasma hyopneumoniae e contém as mutações A629G, A761G e 14 A1757G. 0 ácido nucleico codifica, em particular, a extremidade carboxilo terminal da MHP 378 com inicio na posição de aminoácido 286 (posição de ácido nucleico 856, Seq. ID n2 1) . 0 ácido nucleico codifica também vantajosamente a proteína MHP 651 de Mycoplasma hyopneumoniae e apresenta as mutações A731G, A931G, A1055G, A1424G e A1811G, em que o ácido nucleico codifica, de um modo preferido, a extremidade carboxilo terminal da MHP 651 com inicio na posição de aminoácido 351 (posição de ácido nucleico 1051, Seq.ID n2 2). 0 ácido nucleico é utilizado, de um modo preferido, para a preparação de proteínas recombinantes, em particular, em E. coli e/ou Actinobaclllus pleuropneumoniae.

Um vector de ADN recombinante compreende, com vantagem, pelo menos, um ácido nucleico, em que o vector está presente, em particular, numa célula hospedeira. Para a preparação de uma proteína recombinante cultiva-se, com vantagem, a célula hospedeira que contém o vector de ADN sob condições para a expressão da respectiva proteína imunogénica e obtém-se a enzima a partir da célula hospedeira. A proteína recombinante é utilizada, com vantagem, para a detecção de animais naturalmente infectados e/ou vacinados, e como vacina. A invenção é em seguida explicada mais detalhadamente fazendo referência a vários exemplos de realização e a figuras. Mostram:

Figura 1 Delecção em apxIIA compreendendo 1518 pares de bases 15

Figura 2

Análise com PCR de estirpes mutantes AapxIIA criadas com iniciadores internos, com banda 1, A. pleuropneumoniae serotipo 1 tipo selvagem; banda 2, serotipo 1 AapxIIA; banda 3, A. pleuropneumoniae serotipo 2 tipo selvagem; banda 4, serotipo 2 AapxIIA·, banda 5, A. pleuropneumoniae serotipo 5 tipo selvagem; banda 6, serotipo 5 AapxIIA; banda 7, A. pleuropneumoniae serotipo 9 tipo selvagem; banda 8, serotipo 9 AapxIIA e banda M marcador

Figura 3

Análise com PCR dos tri, tetra e penta mutantes construídos, em que as deleções em aspA (A) e em hybB (B) foram detectadas com iniciadores que se situam fora da região deletada do gene. A banda 1 mostra respectivamente serotipo 2 de A. pleuropneumoniae tipo selvagem; a banda 2, serotipo 2 triplo mutante; banda 3, serotipo 2 tetra mutante (AhybB); banda 4, serotipo 2 tetra mutante (AaspA); banda 5, serotipo 2 penta mutante e banda Μ, o marcador.

Figura 4

Avaliação da lesão do pulmão de porcos infectados experimentalmente, representado como caixas com entalhes, neste caso, a constrição central em cada caixa representa o média geométrica, a limitação superior e inferior desta caixa mostram respectivamente a média dos valores em cada metade dos dados e os pontos superiores e inferiores os valores mínimos e máximos, respectivamente.

Figura 5

Análise com PCR do gene fur nos tri a hexa mutantes construídos com iniciadores internos, em 16 que para a hexa mutante com uma deleção no gene fur foram utilizados iniciadores que se situam fora da região detetada do gene fur; com a banda 1, A. pleuropneumoniae serotipo 2 tipo selvagem; banda 2, triplo mutante serotipo 2; banda 3, tetra mutante serotipo 2 (AhybB); banda 4, penta mutante serotipo 2; banda 5, hexa mutante serotipo 2 com deleção no gene fur e banda M, marcador.

Figura 6 Resultados patológicos e serológicos após contaminação heteróloga. A) Mostra para todos os porcos a proporção pulmonar lesionada na forma de caixas com entalhes. Sacrificaram-se quatro porcos do grupo vacinado com a hexa mutante no dia 7 após a infecção, todos os outros porcos sobreviventes no dia 21 após a infecção. 0 asterisco mostra uma diferença estatisticamente significativa (p < 0,05) no teste de Wilcoxon. B) Resposta imunitária humoral dos porcos controlo e dos porcos vacinados um dia antes e 21 dias após a infecção averiguada utilizando-se um extracto de detergente (de-ELISA) ou a proteína ApxIIA recombinante (ApxII-ELISA) como antigénio de fase sólida. A resposta imunitária para a ELISA ApxIIA está representada em unidades de ELISA baseadas num padrão externo. Actividades com valores iguais ou superiores a 25 unidades ELISA num ApxII-ELISA padronizado foram encaradas como sendo positivas. Para o de-ELISA a resposta imunitária foi indicada como título sérico em comparação com um controlo interno. 17

Figura 7

Figura 8

Figura 9

Figura 10

Representação esquemática da construção do vector de expressão mhp378

Reactividade das proteínas de fusão GST-Mhp378-C e GST-Mhp651-C com soros hiperimunes produzidos em coelhos dirigidos contra M. hyopneumoniae, M. hyorhinis, M. hyosynoviae and M. flocculare. A) Placas comerciais de ELISA (IDEXX HerdChek Mycoplasma hyopneumoniae, IDEXX Laboratories) revestidas com o antogénio celular completo de M. hyopneumoniae. B) Placas de microtitulação 96 Polysorb® (Nunc, Roskilde, Denmark) revestidas com GST-Mhp651-C proteína de fusão e C) com GST-Mhp378 proteína de fusão.

Representação esquemática da estrutura calculada da proteína OmpD em relação ao genótipo. Epítopo antigénico (azul)/zonas expostas à superfície (verde).

Verificação da mutação ompD via PCR (A) , Transferência de Southern após digestão por Pstl e BspDI (B) e eletroforese em campo pulsado (PFGE) após digestão por Xbal (C) com banda 1 tipo selvagem e banda 2 mutante ΔompD 18

Exemplo de realização 1 1.1. Construção de mutantes negativos para a toxina ApxII de A. pleuropneumoniae serotipo 1, 2, 5 e 9 para utilizar como vacina morta negativa 0 gene apxIIA codifica a toxina ApxIIA, uma toxina secretada fortemente imunogénica, que ocorre em todos os serotipos de A. pleuropneumoniae com excepção do serotipo 10. A deleção pretende permitir a distinção serológica entre animais que tenham sido vacinados com a vacina marcada e animais que tenham sido infectados com o tipo selvagem. Já se emprega um ELISA com o qual é possível detectar anticorpos contra a toxina ApxIIA.

Efectuou-se a deleção utilizando-se o sistema estabelecido e patenteado "single-step-transconjugation" (Oswald, Tonpitak et al., 1999, A single-step transconjugation system for the introduction of unmarked deletions into Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 7 using a sucrose sensitivity marker. FEMS Microbiol. Lett. 179, 153-160). Para o efeito, introduziu- se o gene apxIIA encurtado (Dapx2A) do serotipo 2 no vector de conjugação pEMOC2 (Baltes et al., 2003, Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 7 siderophore receptor FhuA is not required for virulence. Fems Microbiology Letters 220, 41-48).

Este vector contém um gene de resistência a cloroanfenicol e não tem capacidade de replicação em A. pleuropneumoniae. Com o objectivo de simplificar os trabalhos de clonagem com os vectores de conjugação disponíveis, sequenciaram-se completamente o vector pEMOC2, bem como o vector de conjugação patenteado, pBMKl, que comporta um gene de resistência à canamicina no início dos trabalhos. Os dados da sequência foram 19 publicados com os números de acesso AJ868289 (pBMKl) e AJ868288 (pEM0C2) no banco de genes.

Designou-se o derivado de pEM0C2, que contém o gene apxIIA encurtado (AapxIIA), de pAPX700 e transferiu-se por meio de conjugação a partir de E. coli - estirpe β2155 (dapA) para as estirpes correspondentes de A. pleuropneumoniae. Pretendeu-se que esta construção fosse integrada por recombinação homóloga no ADN genómico ("recombinação cruzada simples") . No segundo passo, o da contrasselecção, cultivaram-se as colónias resistentes ao cloroanfenicol, num meio com sacarose. Sobre o vector de conjugação encontra-se adicionalmente o gene sacB. Este codifica a enzima levanasacarase, que medeia uma sensibilidade de bactérias gram-negativas face a sacarose. A cultura no meio contendo sacarose favorece assim as bactérias que perderam o vector através de uma segunda recombinação homóloga. Nesta contrasselecção ou é o gene mutado que é alvo de deleção ou é o gene do tipo selvagem que é alvo de deleção, de modo que no caso da deleção do gene do tipo selvagem se originam mutantes isogénicos que não contêm qualquer ADN estranho.

No caso da estirpe serotipo 2 de A. pleuropneumoniae foi possível realizar imediatamente, com sucesso, a deleção do gene apxIIA. No caso dos serotipos 5 e 9 não foi logo possível gerar "recombinações cruzadas simples". As causas para tal foram provavelmente diminutas diferenças de sequência entre os genes apxIIA dos serotipos. Por conseguinte, para os serotipos 5 e 9 de A. pleuropneumoniae construíram-se vectores de conjugação específicos para o serotipo, que contêm o gene apxIIA do respectivo serotipo de A. pleuropneumoniae (figura 1) . Os plasmídeos foram designados de pAPX705 (serotipo 5) e pAPX709 (serotipo 9). 20

Com o vector de conjugação específico para o serotipo 5 de A. pleuropneumoniae foi possível criar um mutante ApxIIA isogénico para este serotipo. No caso do serotipo 9 de A. pleuropneumoniae foi possível de facto gerar colónias resistentes a cloroanfenicol. Contudo, na contrasselecção estas reverteram sempre novamente para o tipo selvagem.

Uma vez que eram necessários trabalhos mais exaustivos para solucionar os problemas na mutagenização do serotipo 9 de A. pleuropneumoniae seleccionou-se em primeiro lugar uma estirpe de serotipo 1 de A. pleuropneumoniae como componente alternativo para a vacina morta negativa. Este serotipo é o serotipo que ocorre mais frequentemente na América do Norte, enquanto o serotipo 9 está predominantemente descrito na Alemanha e, mesmo aqui, é apenas responsável por uma parte relativamente pequena das doenças.

Dado que, segundo as investigações do banco de genes, os genes apxIIA do serotipo 1 e 5 de A. pleuropneumniae são idênticos nas zonas nas quais tem lugar uma recombinação homóloga no decurso do processo, utilizou-se o vector de conjugação específico para o serotipo 5 de A. pleuropneumoniae para a construção de um mutante por deleção, isogénico, do serotipo 1 de A. pleuropneumoniae. Foi deste modo possível criar, com sucesso, um "double- -crossing-over", isto é, um mutante isogénico para o serotipo 1 de A. pleuropneumoniae. Os mutantes dos serotipos 1, 2 e 5 de A. pleuropneumoniae assim construídos foram depois empregues para a preparação de uma vacina subunitária. Paralelamente a isto, concluiu-se igualmente com sucesso, ao longo do último ano, a mutagenização do serotipo 9 de A. pleuropneumoniae. Os mutantes apxIIA de todos os quatro 21 serotipos foram caracterizados como sendo mutantes isogénicos livres de ADN estranho por análise de PCR (figura 2), análise de Transferência de Southern, após digestão de ADN cromossómico por enzimas de restrição, electroforese em gel de campo pulsado e sequenciação de ADN. Além disso, a eliminação da toxina ApxIIA foi comprovada em todos os serotipos por análise de Transferência de Western, após electroforese em gel de SDS-poliacrilamida, de sobrenadantes de cultura. 1.2. Teste quanto a eficácia de uma vacina subunitária à base dos preparados de mutantes no porco e desenvolvimento de iima vacina morta negativa de A. pleuropneumoniae

Formulou-se uma vacina inactivada a partir dos mutantes dos serotipos 1, 2 e 5 de A. pleuropneumoniae gerados segundo o método descrito e patenteado (patente DE 19753176) por Goethe et al. (2000; A novel strategy for protective Actinobacillus pleuropneumoniae subunit vaccines: detergent extraction of cultures induced by iron restriction. Vaccine 19: 966-975). Esta foi verificada por meio de análise de Transferência de Western relativamente a duas das suas proteínas antigénicas e testada subsequentemente numa experiência animal. Recorreu-se, nesse caso, a 24 porcos com uma idade de 4 semanas. As imunizações efectuaram-se na idade de 4 e 7 semanas, em que se imunizaram 14 porcos com a vacina inactivada marcada criada e em que 10 porcos serviram de animais controlo e foram vacinados com um placebo, ao qual faltavam os componentes antigénicos. Subsequentemente, todos os animais (com excepção de quatro porcos vacinados com a vacina inactivada marcada) foram infectados na câmara de aerossol, na idade de 10 semanas, com uma estirpe heteróloga do serotipo 2 de A. pleuropneumoniae (isto é, uma estirpe do 22 serotipo 2 diferente daquela que serviu para a preparação da vacina). Os quatro animais não infectados serviram como grupo controlo para garantir que também não se formavam quaisquer anticorpos contra a proteína ApxII durante o decurso adicional da criação. Uma metade do grupo dos animais foi sujeita a eutanásia após 7 dias e o restante grupo após 21 dias e analisadas patológica e bacteriologicamente.

No decurso deste ensaio foi possível comprovar uma protecção muito boa tanto face a sintomas clínicos como também face a sintomas patológicos nos animais que tinham sido imunizados com a vacina inactivada marcada. Oito dos dez animais vacinados não tiveram quaisquer alterações patológicas, enquanto todos os animais de controlo apresentavam lesões, em parte muito severas, nos pulmões. Além disso, com auxílio do ELISA, foi possível detectar anticorpos contra a toxina ApxIIA. 0 serotipo 2 de A. pleuropneumoniae utilizado para a contaminação foi significativamente menos frequentemente detectável em porcos vacinados do que em porcos não vacinados do grupo de controlo (teste de Wilcoxon, p < 0,05) .

Dado que se pretendia que uma vacina para A. pleuropneumoniae protegesse ainda também contra outros serotipos, para além dos serotipos contidos na vacina, realizou-se uma experiência animal adicional. Neste caso, dividiram-se os 15 porcos em 2 grupos; um grupo de 10 animais foi imunizado com a vacina inactivada marcada, constituída pelos serotipos 1, 2 e 5, o outro grupo com 5 animais com um placebo. As imunizações efectuaram-se na idade de 4 e 7 semanas. Na 10a semana de vida, os animais foram depois infectados com uma estirpe de serotipo 9 de A. pleuropneumoniae. A eutanásia e as dissecações efectuaram- se 7 dias e 21 dias, respectivamente, após a contaminação. Os 23 resultados após a contaminação mostram uma protecção da vacina muito boa e transversal aos serotipos. Assim sendo, todos os animais do grupo de controlo desenvolveram dispneia, anorexia e depressões e morreram num intervalo de 48 horas após a contaminação. Os animais imunizados não revelaram quaisquer sintomas clínicos e a temperatura corporal não ultrapassou os 40,1 °C. A análise patológica ao grupo de controlo não vacinado revelou uma severa pleurite fibrinogénica associada a uma pneumonia, que afectava uma grande parte do pulmão. Os animais vacinados, pelo contrário, não revelavam quaisquer alterações da pleura ou do pulmão. Foi possível voltar a isolar a estirpe contaminante administrada em grande número do grupo de controlo não vacinado, o que foi apenas possível num número reduzido no caso de dois dos porcos vacinados.

Recolheram-se amostras de soros três semanas após a imunização e três semanas após a infecção e analisaram-se em termos serológicos em dois testes ELISA diferentes. No ELISA_ApXII recorre-se à toxina ApxII como antigénio da fase sólida. A reacção é quantificada na forma de unidades ELISA (UE) que se baseiam num padrão externo, sendo que as actividades de inferiores/iguais a 10 UE no soro foram consideradas negativas, as de 11 a 25 UE como questionáveis, e as actividades superiores a 25 UE como positivas. O segundo teste ELISA, o denominado de-ELISA, utiliza um extracto detergente de proteínas, que estão presentes associadas à membrana exterior de A. pleuropneumoniae, como antigénio da fase sólida. No de-ELISA a resposta imunitária é quantificada como o título sérico em comparação com um controlo interno negativo. O controlo negativo é constituído por uma mistura de volumes iguais de todos as amostras de soro, que foram colhidas à chegada dos porcos não infectados. O controlo positivo é constituído por uma mistura de volumes iguais de 24 todas as amostras de soro que foram colhidas de porcos infectados no dia 21 após a infecção. 0 titulo do de-ELISA, neste caso, é a diluição de soro mais elevada que origina uma densidade óptica que é o dobro da densidade óptica do soro do controlo negativo numa diluição de 1 para 100.

No momento da infecção, os porcos do grupo controlo não apresentavam qualquer titulo quer no de-ELISA quer no Elisa APXIIa. Os animais vacinados, pelo contrário, apresentavam um elevado titulo no caso do de-ELISA no momento da infecção e três semanas após a infecção, mas, em ambos os momentos, eram negativos no caso do ELISA ApxIIA.

Exemplo de realização 2 2.1. Desenvolvimento de uma vacina viva negativa de A. pleuropneumoniae O objectivo é a atenuação de uma estirpe de serotipo 2 de A. pleuropneumoniae por deleções em diferentes factores associados à virulência. Pretende-se com isto que a estirpe deixe de desencadear sintomas clínicos, mas que continue a induzir uma resposta imunitária após a aplicação de aerossol. Esta estirpe é depois empregue como vacina viva.

Um protótipo existente de uma vacina viva negativa de um serotipo 2 de A. pleuropneumoniae (Tonpitak et ai., 2002, Construction of an Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 2 prototype live negative-marker vaccine. Infect Immun 70, 7120- 7125) constituiu a base para estes trabalhos. Este contém duas deleções atenuantes: uma no gene apxIIA, que serve aqui também 25 como marcação negativa e uma no gene ureC, que codifica para um componente do complexo enzimático da urease. Com base neste duplo mutante e com auxilio do sistema da "single-step-transconjugation" construiu-se um triplo mutante que contém uma deleção adicional no gene dmsA. 0 triplo mutante criado foi confirmado como sendo um mutante genotipica e fenotipicamente isogénico, livre de ADN estranho e foi testado quanto à sua virulência numa experiência animal com contaminação aerogénica. Para o efeito, infectaram-se porcos na câmara de aerossol com uma dose de 1,2 x 105 UFC (unidades formadoras de colónias) do triplo mutante. Todos os porcos desenvolveram sinais típicos de uma infecção. Um porco morreu num intervalo de 2 dias e um outro porco num intervalo de 9 dias após a infecção. Os porcos sobreviventes foram submetidos a eutanásia após 21 dias e analisados em termos patológicos. Neste caso, 4 de 5 porcos revelavam lesões pulmonares (figura 4), o que é completamente inaceitável na utilização como vacina.

Para criar uma estirpe de vacina tiveram portanto de ser inseridas deleções adicionais. Como genes alvo seleccionaram-se, para o efeito, o gene aspA e o gene hybB. Partindo do triplo mutante criaram-se dois tetra mutantes, com uma deleção adicional do gene aspA e do gene hybB, respectivamente. Além disso, construiu-se um penta mutante, no qual tanto o gene aspA como também o gene hybB estão presentes na forma inactivada. Estes mutantes foram caracterizados fenotípica e genotipicamente. Com isso, os mutantes criados puderam ser identificados como mutantes isogénicos livres de ADN estranho, através de análise de PCR (figura 3) , análises de Transferência de Southern, após digestão por enzimas de restrição, e electroforese em gel de campo pulsado. 26

Subsequentemente testou-se o penta mutante numa experiência animal quanto às suas propriedades virulentas. Segundo o esquema explicado acima, contaminaram-se 9 animais na câmara de aerossol com o agente patogénico numa dose de 9,1 x 104 UFC por cada cinco porcos e com o penta mutante numa dose de 1,5 x 105 UFC por cada cinco porcos. No grupo com o penta mutante, 6 de 9 animais apresentaram uma temperatura corporal aumentada de mais de 40,5 °C um dia após a infecção e 3 de 9 animais recusaram a ingestão de alimentos. Três dias após a infecção a temperatura corporal de todos os animais vacinados com o penta mutante situava-se abaixo dos 40,5 °C e no dia 7 após a infecção apenas um animal vacinado tinha desenvolvido tosse. Os porcos no grupo controlo, pelo contrário, desenvolveram sintomas severos de doença tais como anorexia, letargia, falta de ar (dispneia) ou vómitos no primeiro dia após a infecção. Os animais foram sujeitos a eutanásia e dissecados após 7 e 21 dias, respectivamente. Os animais, que tinham sido infectados com o penta mutante tinham, neste caso, significativamente menos lesões pulmonares (figura 4), que um grupo controlo infectado com a estirpe do tipo selvagem (teste de Wilcoxon, p < 0,05) . Todos os animais mostravam títulos de anticorpos evidentes 21 dias após a infecção. As lesões pulmonares causadas ainda são contudo tão severas que não permitem que este penta mutante possa ser utilizado como estirpe de vacina. O objectivo continuou por ser, por conseguinte, o de atenuar adicionalmente o mutante penta criado. Para o efeito o gene fur (ferric uptake regulation, fur) foi alvo de deleção. Foi necessário construir um vector de conjugação específico para o tipo de soro para a mutagenização, dado que as diferenças de sequência entre os serotipos 2 e 7 eram tão grandes que o plasmídeo de conjugação ao qual Jacobsen recorreu não conduziu a 27 qualquer "Single-Crossinq-Over" no serotipo 2. Com auxílio do sistema "single-step-transconjugation" foi então possível criar um hexa mutante que, na caracterização genotípica e fenotípica, confirmou ser um mutante isogénico, livre de ADN estranho (figura 5).

Para examinar as propriedades virulentas do hexa mutante contaminou-se um grupo de 5 porcos com o hexa mutante numa dose de 1,1 x 105 UFC por cada cinco porcos numa câmara de aerossol. Quatro dos cinco porcos contaminados com o hexa mutante revelaram uma temperatura corporal aumentada acima de 40,5 °C um dia após a infecção. Não foram detectáveis quaisquer sintomas adicionais. Os animais infectados foram sujeitos a eutanásia três semanas após a infecção e examinados em termos patológicos. Todos os porcos tinham apenas alterações patológicas mínimas na dissecação (fracção média da lesão pulmonar de 0,3).

No dia 21 após a infecção foi somente possível detectar os penta e hexa mutantes numa amostra de tecido de pulmão intacto, enquanto a estirpe do tipo selvagem pode ser de novo isolada de 4 das 5 amostras.

Os porcos infectados com o penta mutante ou o hexa mutante, respectivamente, não revelaram em qualquer momento após a infecção qualquer título de anticorpos no caso do de-ELISA ApxII, mas revelaram uma reacção medível no caso do de-ELISA 21 dias após a infecção.

Uma vacina viva para A. pleuropneumoniae constituída por um serotipo só tem futuro comercial quando adicionalmente a uma protecção contra o próprio serotipo esta possa mediar também uma conseguinte

Por protecção transversal aos serotipos. 28 prescindiu-se de um teste quanto a uma protecção homóloga perante a utilização do hexa mutante como vacina viva. Em vez disso, realizou-se uma experiência animal com contaminação heteróloga após imunização.

Neste caso, 10 porcos na idade de 7 semanas foram imunizados com o hexa mutante por aplicação de aerossol, enquanto 5 animais de controlo foram tratados apenas com solução de cloreto de sódio (150 mM) . Ambos os grupos foram subsequentemente infectados com um serotipo 9 de A. pleuropneumoniae. Os grupos foram novamente sujeitos a eutanásia e dissecados 7 dias e 21 dias após a contaminação. Os resultados revelam um efeito evidente das vacinas vivas transversal aos serotipos. Assim sendo, morreram 3 dos 5 animais do grupo controlo enquanto todos os animais do grupo vacinado não desenvolveram quaisquer sintomas clínicos ou tiveram sintomas clínicos reduzidos. Os porcos vacinados apresentaram uma taxa de lesão pulmonar claramente mais reduzida que os animais de controlo (figura 6) . Só foi possível isolar esporadicamente a estirpe de vacina, enquanto no caso do reisolamento da estirpe selvagem não houve distinção entre o grupo vacinado e o de controlo (Tabela 1) . Três semanas após a imunização testaram-se todos os porcos com o de-ELISA e o Elisa ApxII. Os animais de controlo revelaram um título negativo em ambos os testes, enquanto os animais vacinados apresentaram um título de anticorpos detectável no teste de-ELISA, mas não no caso do ELISA ApxII (Tabela 1) . Três semanas após a infecção, os dois animais do grupo controlo sobreviventes revelaram um título de anticorpos no caso do de-ELISA e um animal apresentou-se positivo no caso do ELISA ApxII. 29

Os ELISA e animais vacinados revelaram títulos intensos no caso do dois apresentavam-se positivos no caso do ELISA ApxII. 30

Tabela

+1 0 IflJ <1 Φ 0 +J (ΰ ϋ Η V Ό 3 φ •Η +J CU (ΰ X | 'Φ (ΰ Η ε Q •Η +J 0 W •Η •Η (ΰ U 0) Φ V V Φ (ΰ U Ο iflj Ο

Ή 3 οII U3 (D

Ο> Ο3 <ΰ Q ο a. <ΰ W •Η

(ΰ υ (ΰ Ό 0 U . •Η 0 )(ΰ (ΰ +J •Η (ΰ W 3 Η V 1 1 +1 > W nd X (0 Φ Η 0 6 +J •Η Φ Ό V +J Φ Η 3 U <ΰ cu V CU 0) Φ W ίο •Η W (ΰ Φ Η (ΰ ε 0 υ

0) (1) U <ΰ 3 Οε Η 3 CU Μ Φ-Ρ U •ΗΟ»'0 ΗΟΜ (1) •Η CUΟυWοuυο)3

(ΰ m 0) ιβ 0 (ΰ Ν φ •Η 3 Ό W 0) U (Η <ΰ 0 0 U U υ 0 Ω Φ — U (Η Μ 0 3 0 CU •Η CU -μ 3 φσ>

hP Ρ Ο ο -Η Ό ΝΦ ,_| ε φ ι-Ρ Ρ Ό ε Ρ Ο ΓΊ -Ρ íp I—1 3 θ' Φ -Η ε Φ Ρ φ Φ Γ—1 μ -Η m α Ό Ρ φ -Η ρ Ρ 3 ε Ό η Ρ s de col indicad< ro para Ρ ο μ 0 φ ο μ Ό φ ο Ρ ε Ό ε 'Ρ μ 3 ο ο > μ-ι ο -Η -μ m Ρ φ σ> Ό ο φ Ρ ο 3 Ό ο -Η CN] ο 3 ι-1 Ρ ο *“ Ρ são Μ Ρ -μ 3 Ο Φ ο U Ό Φ 0 Ρ Ό φ Φ -Η Α Ο Ό V Ρ 3 Φ η -Η 0 0 ϋ Ό Ο μ ο φ ε 'Ρ ο -μ -Η 'φ 3 ρ φ φ Ρ Ο Φ Ο"1 ι—1 Φ Ό Ρ φ Ο 'Ρ -Η m -μ m -Γ~ι α ο Ό μ Ο Φ ε φ Ρ Ο Ό Φ Ρ φ Ό Ό ι-1 -Η Ρ Φ Ρ -μ 3 μ Φ ção na cama preparados gina numa d Ρ -Η Ή ε Ρ Ο Ρ Ο m Ρ ο Φ Ρ Φ-Ι Ρ -μ Ο"1 φ Ρ Φ Ό Ό -Η Ρ ι—1 Ό ι-Ρ Ό Ρ ε Φ > Φ ΓΊ Φ ι—1 <—1 Φ Φ Ρ Φ 4-ι φ Φ -Η 1 ε Ρ de Ρ ε μ Ο Ρ φ Ρ Ν ο Ο -Η -Η φ μ 3 φ ΝΦ φ > σ> Ό Γ—I -Η Ρ -μ Ο Ρ-ι 3 Íp Ρ θ' -Η ι—1 [/] Ρ Ο Ο Γ—I Ρ -Η 2 _Ω Ό Ό -Η> Xαc !ΡΟ Ρ

3 ΦV 'Φ-Ρ Ό Ρ> Ό 3 Ρσ> φ ο Ρ 3 α ο μ ρ φ Φ-μ 3 X φ Λ c ο 31

Exemplo de realização 3 3.1. Identificação, clonagem e expressão de proteínas imunogénicas de M. hyopneumoniae

Para a identificação de novas proteínas imunogénicas de M. hyopneumoniae prepararam-se fundamentalmente fracções membranares de células, que haviam crescido sob condições padrão laboratoriais, dado que a maior parte das proteínas imunogénicas estão contidas na fracção membranar. Obtiveram-se as proteínas membranares e proteínas associadas à membrana por meio de extracção com Triton X114 (Regula et al., Towards a two-dimensional proteome map of Mycoplasma pneumoniae, Electrophoresis, 2000, 21, 3765-3780).

Subsequentemente separaram-se os extractos membranares na electroforese bidimensional em gel e analisou-se com subsequente Transferência de Western, em que se testaram diferentes condições de focagem, tal como o gradiente de pH e concentrações do gel. Utilizou-se um soro de reconvalescentes para detectar possíveis proteínas candidatas. Trata-se, neste caso, de uma pool de cinco soros individuais de porcos não vacinados, nos quais existia uma infecção com M. hyopneumoniae. Para a comparação fez-se também uma transferência das amostras com um soro hiperimune, que foi preparado utilizando-se a vacina "Respiporc M.hyo 1 Shot" da produtora de vacinas Dessau-Thornau (IDT, Alemanha) . Com isto encontraram-se os pontos que reagem apenas com o soro de reconvalescentes, ou que, pelo menos, reagem mais intensamente com o mesmo.

Removeram-se vários pontos de proteínas de um gel corado com azul de Coomassie, das quais se identificaram os pontos n2 32 43 e η2 48. Para a identificação digeriram-se os pontos com tripsina e analisaram-se, os péptidos, neste caso, originados com auxílio de um Q-Tof MS. 0 ponto 43 foi identificado como a lipoproteína hipotética Mhp378. A proteína mostra as maiores homologias face a lipoproteínas hipotéticas de outras espécies de micoplasmas. Não existem até à data quaisquer indicações quanto a possíveis funções destas proteínas. Para os trabalhos adicionais, tal como o estabelecimento de um teste ELISA para a detecção de animais infectados naturalmente, são necessárias grandes quantidades de proteína recombinante. Para o efeito construíram-se vectores de expressão para a preparação de proteínas de fusão com GST. 0 gene mhp378 correspondente à lipoproteína Mhp378 codifica uma proteína com uma dimensão de 708 aminoácidos e contém três codões TGA nas posições de aminoácidos 209, 253 e 585. Em virtude do uso específico do codão nos micoplasmas, estes tripletos não funcionam como codão stop, pelo contrário, codificam triptofano. Para a expressão heteróloga do gene mhp378 em E. coli, o codão TGA 585 foi alvo de mutação para TGG por mutagénese com PCR segundo o método de Shigaki e Hirschi (2001, Use of class IS restriction enzymes for site-directed mutagenesis: Variations on Phoenix mutagenesis; Analytical

Biochemistry 298:118-120). Para o efeito, amplificou-se a região entre as posições de aminoácidos 253 e 585 com auxílio dos iniciadores da PCR OMHP378E e OMHP378F e amplificou-se a região entre as posições de aminoácidos 585 e a extremidade do quadro de leitura com os iniciadores OMHP378G e OMHP378H. Na região de sobreposição cortaram-se os dois fragmentos com a enzima de restrição BsmBI e uniu-se. O fragmento resultante codifica a extremidade carboxilo terminal da proteína (aminoácido 286 a 33 708) e foi clonado no vector de expressão pGEX5-3 (figura 7) . O vector de expressão pMhp378-500 assim construído possibilita a síntese induzível de uma proteína de fusão GST-Mhp378(AS286_708) em E. coli DH5a. A proteína expressa estava presente na E. coli DH5a como agregado insolúvel. A proteína de fusão agregada foi extensamente purificada através do tratamento com um tampão de ureia 5 M. O gene mhp651 que codifica a lipoproteína Mhp651 contém 5 codões TGA nas posições de aminoácidos 243, 309, 351, 474 e 603. Para a análise adicional construíram-se dois vectores de expressão analogamente ao processo descrito para mhp378.

Para a expressão da extremidade amino terminal com os aminoácidos 19 a 210, amplificou-se a região do mhp651 gene entre os dois locais de corte da EcoRI em posições nucleotídicas 53 e 623, cortou-se e clonou-se no vector de expressão pGEX5-2. O vector de expressão pMhp651-N(AS 19 a 210) assim construído possibilita a síntese induzível de uma proteína de fusão com GST com a região aminoterminal da proteína Mhp651 em E. coli DH5a.

Para a expressão da extremidade carboxi terminal (aminoácidos 351 a 714) os codões TGA foram alvos de mutação para TGG nas posições 47 e 603 segundo o processo descrito acima. Para o efeito foi necessário amplificar os fragmentos da PCR e cortar com a BsmBI, uni-los e cloná-los no vector de expressão. O vector de expressão pMhp651-C(AS351_714) construído contém a região carboxilo terminal da proteína.

Para a obtenção das proteínas de fusão GST cultivaram-se as correspondentes estirpes E. coli DH5ct em volumes de até 200 mL. A indução da expressão e a purificação das proteínas de fusão 34 por cromatografia de afinidade efectuaram-se de acordo com as indicações do fabricante (Amersham Biosciences). As duas proteínas de fusão GST-Mhp651-N(AS19~210) e GST-Mhp651-501-C(AS351~714) foram expressas como proteínas solúveis em E. coli DH5a e purificadas.

As proteínas de fusão purificadas GST-Mhp37 8 (AS286~708), GST-Mhp651-N(AS19”210) e GST-Mhp651-C(AS351_714) foram subsequentemente testadas em experiências de Transferência de Western relativamente à sua reacção ao soro de reconvalescentes e ao soro hiperimune. Todas as três proteínas revelam uma reacção positiva a ambos os soros, em que a intensidade da interacção com o soro de reconvalescentes foi nitidamente mais forte. A proteína GST usada como controlo não reagiu com nenhum dos dois soros. Os dois genes mhp378 e mhp651 de M. hyopneumoniae, previstos em virtude da sequência genómica, são assim expressos in vivo e as proteínas correspondentes são imunogénicas.

Para a caracterização adicional aplicaram-se as proteínas de fusão recombinantes GST-Mhp37 8 (AS286_708) e GSTMhp651- C(AS351 714) como antigénio da fase sólida sobre placas de ELISA Polysorb®. Em primeiro lugar testaram-se possíveis reacções cruzadas com as outras espécies de micoplasma que ocorrem no porco. Para o efeito incubaram-se placas de ELISA com soros policlonais de coelho que são dirigidos contra preparações de células totais de M. hyorhinis, M. hyosynoviae e M. flocculare.

Dissolveram-se para isso as proteínas de fusão, em primeiro lugar, num tampão de carbonato (50 mM, pH 9,6) e averiguou-se a concentração óptima de revestimento por meio de titulação em bloco utilizando-se o soro de reconvalescentes do porco, que ocasionou uma concentração óptima de 2,5 mg/mL. 35

Subsequentemente revestiram-se placas de microtitulação 96 Polysorb® (Nunc, Roskilde, Dinamarca) com 100 pL da solução de proteína diluída por cada poço, a 4 °C de um dia para o outro, sem subsequente bloqueio. Como controlo utilizou-se uma placa de ELISA (IDEXX HerdCheck M. hyopneumoniae) , que está revestida com o antigénio celular completo de M. hyopneumoniae. Incubaram-se os soros diluídos e os conjugados cabra-anti-porco peroxidase ou cabra-anti-coelho peroxidase (Dianova, Hamburg, DE) , respectivamente durante uma hora à temperatura ambiente. Desenvolveu-se subsequentemente o ELISA utilizando-se ABTS (2,2'-azino-di-[3-etilbenzitiazolinossulfonato]) e mediu-se o acréscimo da intensidade de cor para uma DO de 405 nm.

Os resultados experimentais mostram uma forte reacção cruzada dos soros hiperimunes de coelho dirigidos contra M. flocculare e M. hyorhinis sobre a placa de ELISA disponível comercialmente (figura 8A) . Das duas proteínas de fusão testadas, somente a proteína de fusão GST-Mhp651-C(AS352_714) mostrou uma reacção cruzada com o soro hiperimune específico para M. flocculare (figura 8B) , enquanto a proteína de fusão GST-Mhp37 8 (AS254~708) foi somente reconhecida pelo imunossoro específico para M. hyopneumoniae (figura 8C). Estas experiências mostram que as proteínas imunogénicas Mhp378 e Mhp651 isoladas de M. hyopneumoniae podem ser utilizadas como marcadores específicos para a detecção de animais de criação infectados com M. hopyneumoniae ou animais de criação vacinados e naturalmente infectados sem que ocorram reacções falso-positivas devido a uma colonização/infecção dos porcos com outros micoplasmas. 36

Exemplo de realização 4 4.1. Identificação, clonagem e expressão de proteínas imunogénicas de S. Typhimurium

Para identificar proteinas imunogénicas de S. Typhimurium isolaram-se proteinas associadas à superfície por via de um método de "lavagem com detergente" estabelecido no laboratório do requerente e detectaram-se por meio de electroforese em gel bidimensional em combinação com Transferência de Western. Neste caso, separam-se as proteinas, em primeiro lugar, segundo o seu ponto isoeléctrico e, em seguida, segundo a sua mobilidade electroforética num gel de SDS-PAGE e transferiu-se subsequentemente por meio de um equipamento semi-seco sobre uma membrana de nitrocelulose. As proteinas são testadas quanto à sua imunogenicidade por meio de três soros. 0 soro 1 é um soro porcino gerado por vacina que foi obtido após múltipla imunização de porcos com a vacina viva atenuada SALMOPORC® (Fabricante: Impfstoffwerk Dessau, Alemanha). 0 soro 2 é uma pool de soros de animais que não foram vacinados contra S. Typhimurium, mas que deram resultados positivos de anticorpos de salmonela na serologia do suco da carne. 0 soro 3 é uma pool de soros de um total de 120 animais que haviam sido infectados com S. Derby no âmbito de um ensaio de alimentação. A par da observação de proteinas diferenciadamente expressas após a cultura sob condições laboratoriais padrão e sob condições de carência de ferro, procurou-se, em primeiro lugar, as proteinas que foram reconhecidas como imunogénicas tanto pelo soro gerado por vacina, como também pelos dois soros de reconvalescentes. 37 A proteína DWST-5 (outer membrane porin NmpC/OmpD precursor) foi identificada deste modo como sendo expressa de forma diferenciada. A proteína DWST-5 foi verificada por meio de pesquisa no banco de dados quanto à sua aptidão para o desenvolvimento de uma vacina viva negativa. Uma proteína adequada tem de apresentar uma elevada especificidade para Salmonella, de modo a evitar, tanto quanto possível, reacções cruzadas com anticorpos contra outras enterobactérias, quando esta é empregue como antigénio da fase sólida num sistema ELISA. A proteína DWST-5 identificada como porina D da membrana externa (OmpD) revela uma elevada especificidade para Salmonella spp. e dispõe, para além disso, de 14 epitopos antigénios previstos e oito regiões expostas à superfície na sua sequência (figura 9).

0 gene ompD foi amplificado por meio de PCR de ADN cromossómico da estirpe SALMOPORC® e clonado "no quadro de leitura" no vector de expressão pGEX5x-3. Com o plasmídeo pSOM500 assim construído foi possível preparar uma proteína de fusão recombinante glutationa S-transferase-OmpD (GST-OmpD) em E. coli. 0 desenvolvimento da vacina viva negativa está acoplado ao desenvolvimento de um sistema de diagnóstico baseado no ELISA, o qual, na prática, possibilita a distinção entre animais vacinados e doentes. Para o efeito aplicou-se a proteína recombinante GST-OmpD como antigénio da fase sólida sobre placas de ELISA Polysorb® e testou-se com diversos soros, já empregues com um sistema comercial de ELISA para o diagnóstico de S. Typhimurium.

Um soro nulo de um ensaio de vacinação com a vacina SALMOPORC utilizada serviu como controlo negativo, um soro 38 hiperimune, após uma quarta imunização, serviu como controlo positivo. Os ensaios mostraram que todos os soros positivos no ELISA comercial apresentaram uma absorção, que, no mínimo, era o dobro da do controlo negativo no ELISA OmpD.

Num rastreio em massa com soros suínos no qual se analisou paralelamente com o Salmotype Pigscreen® ELISA comercial, empregaram-se placas com 0,5 pg/mL de preparação de agregado de GST-OmpD e placas com 0,5 pg/mL de proteína de fusão purificadas por cromatografia em coluna. As duas reagiram de forma muito diferente, em que se deve partir do princípio que no caso da preparação de agregado não purificado ocorreram múltiplas reacções cruzadas com proteínas de E. coli. No ELISA com a proteína de fusão purificada, há mais varas que reagem positivamente do que no caso do ELISA Salmotype Pigscreen, o que aponta para uma sensibilidade mais elevada ou então para uma menor especificidade. 4.2. Construção de uma vacina viva isogénica negativa com a deleção do gene ompD em S. Typhimurium

Para a mutagénese do gene ompD em S. Typhimurium seleccionou-se um vector com pROKBl que dispõe de um replicão R6K. Dado que, para a replicação na bactéria, este replicão necessita obrigatoriamente do produto do gene lambda-fago pir, o vector pode ser empregue na Salmonella como vector suicida.

Preparou-se um gene ompD encurtado a partir de dois fragmentos de PCR, que foram amplificados de regiões na extremidade 5' e 3' do gene. Os iniciadores localizados na direcção do centro do gene comportam sempre uma local de 39 restrição enzimática BsmBI (McCaffery et al., 1996, A novel system for the rapid generation of precise ADN deletions. Nucleic Acids Res. 24, 5048-5050) . Ambos os pedaços são em seguida cortados com a BsmBI e unidos. Isto originou uma mutação no quadro de leitura no gene, que não contém qualquer ADN estranho. Os fragmentos individuais ligados foram depois clonados, em primeiro lugar, no vector pTOPO 2.1 (pSOM800) e depois transformados no vector pROKBl (pSOM14666).

Pretendeu-se transferir, por conjugação, o plasmideo de mutagenização pSOM14666 da estirpe β2155 auxotrófica DAPI de E.coli, como dador portador de plasmideo, para a estirpe de vacina de S. Typhimurium Salmoporc®, como recipiente. Após a selecção (sobre placas contendo canamicina) e contrasselecção (em meio que contém sacarose) pretendeu-se isolar, por rastreio com PCR, os clones nos quais tenha tido lugar uma recombinação homóloga. O protocolo para a conjugação foi estabelecido de antemão para a Actinobacillus pleuropneumoniae e teve de ser adaptado para a S. Typhimurium, dado que, nas primeiras experiências com o método padrão não foi possível criar quaisquer mutantes por deleção estáveis. Com isto, optimizou-se o meio de cultura (agar azul) , bem como o tempo de cultura dos recipientes de salmonelas.

Após a optimização do método de conjugação (cultura do recipiente sobre agar azul ao longo de cerca de 40 horas a 37 °C) foi possível isolar transconjugados de salmonelas com o plasmideo de mutagenização integrado ("single crossing-overs") . Realizou-se uma contrasselecção destes isolados com sacarose. Com isto seleccionam-se quanto agentes patogénicos que removeram o plasmideo do seu genoma através de um segundo passo de recombinação (estes agentes patogénicos já não comportam o gene 40 para a levanasacarase e não são assim sensíveis à sacarose) . As condições de cultura tiveram também de ser aqui adaptadas em comparação com o protocolo estabelecido; assim sendo, foi necessário manter os agentes patogénicos, após a cultura, no meio de contrasselecção durante 72 horas a 4 °C, de modo a obter um bom rendimento de "double-crossing-overs". Os clones desta contrasselecção foram testados em seguida numa PCR quanto ao seu genótipo ompD, de modo a garantir que estes comportam o gene ompD encurtado.

Foi deste modo possível construir um mutante isogénico knockout para ompD, que foi testado por via de PCR e Transferência de Southern. Tal como mostra a figura 10, seleccionou-se uma enzima (PstI) que corta antes e depois do gene alvo, no tipo selvagem e no mutante, e que origina um fragmento com uma dimensão de cerca de 3900 bp no tipo selvagem, no caso do mutante, um fragmento com uma dimensão de cerca de 2900 bp. Além disso, seleccionou-se uma enzima (BspHI) que corta no interior do gene do tipo selvagem, mas não no gene encurtado do mutante, em que para o tipo selvagem originam-se fragmentos da dimensão de 6000 bp e 5000 bp e para o mutante um fragmento de cerca de 9300bp.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Gerlach, Prof. Gerald F <120> Vacina bacteriana <130> GRL104 <160> 2 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 41

<211> 1272 <212> ADN <213> Mycoplasma hyopneumoniae <220> <221> Mhp378 C_region <222> (1) .. (1272) <223> Extremidade carboxi terminal de Mhp378 com inicio na posição de ácido nucleico 856 a 2127 <400> 1 <400> 1 attcttcgtt cttttccaga ggccctttca ggaggatcca ctgattcggc aaaatcagtt 60 ttaggaattg ataatcaagc aacgctagtt tttgctcttg ccagatcagt ttctgaaggt 120 aatcgatccc aggaagttac cgttcttgat aggcaaaaga atttaattga ttatatatct 180 tttatagata aacctgattc aattaggtat aaaaatttag aaaaaatttt taatttatta 240 agccaaggga taaaagatcg ctcaatttat tatacatctg caggggagta taattcaact 300 tttttccgga atcateagca ggttttctca attggttcaa cttcaggcta tttccataat 360 tttgttaaac caacagcgac aaattatcaa atcggcttta agaaaaatga tggtcttaag 420 tcagtttata gcgttagcta ccccaaattt agcgcaattg tatcacttga agatctcaag 480 gatataacca aagatctaga aataacagca accgatggta gctctaaatt aaaaattgat 540 gctaaatttt taggaaaact taaagaatat gcacagcaaa atccagttaa aaaagtgttt 600 tattttactg atcgatcaga aaaaccttca ggtatcttcg aaaaagatta tattgtttta 660 GRLl04-SeqlD.txt ggcaaataca aaaatgacaa aaacgaagaa tttaatggcc ttgtaattcç aacttataca 720 gaactctata aaaattctgg atcaaatgcc cttaatgatg atgaacttgc acttgaagcc 780 ccaccgcata aattcgatgc aaatagtaaa atcaccccca ttgtcgccca aggtcctgat 840 ctaattttta ttcattcaac tgaaaaagaa gataaagccg caaaagcttt tgttaaatgg 900 cttttgacag aaaaaatagt ctttgaggaa aatagtcagg aaaaaatgac tccgcttgag 960 tattttgcca gagcaacttc atatttatta ccaataaaat caacacttga taaaacccat 1020 tttagtccaa aaaatagatc acagaaattt atacttgacc aatttagtaa atttcttaat 1080 gctgattcaa aaggaaaata ttcgcttgtc tatgataatg ccgatgcaaa cgcttcatcc 1140 ttccgtgaat cactagattc ttcagttgcc cagatgcaat cattaaaagc çagcgatgga 1200 aaagtgcgta gttttaaaga gtttttagaa aaactagagg gaaatttagg tcctgctttt 1260 aaatcaaaat aa 1272 42

<210> 2 <211> 1095 <212> ADN <213> Mycoplasma hyopneumoniae <22 0> <221> Mhp651 C_region <222> (1) .. (1095) <223> Extremidade carboxi terminal de Mhp651 com inicio na posição de ácido nucleico 1051 a 2142 <400> 2 <400> 2 tggacttcag attatcttgc agaagaaacc ggaaatggcc ttgatttagt catcgatggg 60 cattcgcata caaaaatcga aattcaçaaa cccaaagaag ataaaaaagt ttgggtaacc 120 caaactgagg cctatgcaaa atggctcggg gacattgatt tagtttttga tactgaaact 180 ggcgagatag taaaaattgt acaatcttta agagatatta accaaatcaa tattgtaacc 240 agagatttat cagaacatta tatcaaaaaa cttcataaag tttatgatgt agaaaatgat 300 gtaaaagtat ttaattcgcc tggtgttttt gaacatgttc aatcaattga gatcaacaaa 360 actccttact ggattggacg ggtaaaacca acttcattag gggtaatgac agcagatgcc 420 attgcttggg aatatgcaaa aagttcaaaa gaacaagtac aaagtacgaa aaatgaaatt 480 gcaacacttg ataattcctt aggacttata aacggtggta gtcttagaac agatctaaaa 540 agtggtgaaa tcaaaagagg agatgtttta ggggttagtc cttttgggaa taggattgta 600 actattaaac taaaaggaga tacacttaaa aaaactctcg aatacggact ttctatgggg 660 aaacaaggcg catttgccca actatcttca aatatttcct ataaagtcaa agttgaaaaa 720 gggactgatc cgaaaaccaa aatagaatcc tgggtttgga aaccagatac aacatccttt 780 aaaattaata acaagccgat tgatgataac aaattttact atttaagcac aaatgattat 840 ctttcagcgg gcggggacgg ctatcaaatg ttaaatctag gtaaaaacag ggatattgaa 900 aaagtttatg agggagttca atatattgat tctttaatta aatatggtca atatttggac 960 aaattaacta aagattcaag tcaaaaagat ctatttgccc acacattcca agaatattta 1020 agttctgatt ttacaaaaaa tcaacaagtt gagattcctc aagaagctct aacgaaaagc 1080 caaagtcaat cttaa 1095 Lisboa, 19 de Novembro de 2014 43

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Vacina bacteriana destinada à aplicação num animal, em particular um animal de criação, compreendendo, pelo menos, um serotipo do organismo Salmonella enterica com, pelo menos, respectivamente uma mutação knock-out em, pelo menos, três genes cromossómicos diferentes, em que, o pelo menos um, serotipo compreende Salmonella Typhimurium com, pelo menos, uma mutação knock-out num gene que codifica para a proteína OmpD.
2. 2. Vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a, pelo menos uma, mutação knock-out ser respectivamente uma deleção não marcada.
3. 3. Processo para a preparação de uma vacina de acordo com qualquer umas das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por, para a mutagénese de OmpD no serotipo de Salmonella Typhimurium, ser utilizado um vector pROKBl com um replicão R6K, que contém o gene OmpD com uma mutação knock-out.
4. 4. Bactéria utilizada numa vacina bacteriana de acordo com, pelo menos, uma das reivindicações 1 a 2.
5. 5. Vacina viva negativa compreendendo, pelo menos, uma vacina bacteriana de acordo com, pelo menos, uma das revindicações 1 a 2.
6. 6. Vacina inactivada negativa compreendendo, pelo menos, uma vacina bacteriana de acordo com, pelo menos, uma das reivindicações 1 a 2. 1
7. 7. Proteína imunogénica sintetizada a partir de, pelo menos, um agente infeccioso bacteriano de um animal, numa vacina de acordo com, pelo menos, uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada por esta gerar anticorpos que, de um modo preferido, não são essenciais para uma resposta imunitária protectora e em que esta interage com anticorpos de, pelo menos, um soro de porcos infectados com Salmonella Typhimurium e com anticorpos de, pelo menos, um soro de porcos vacinados com uma vacina contra Salmonella Typhimurium, em que a proteína imunogénica compreende a proteína OmpD de Salmonella Typhimurium.
8. 8. Proteína imunogénica de acordo com a reivindicação 7 caracterizada por esta estar presente na forma de uma proteína de fusão glutationa-S-transferase OmpD.
9. 9. Utilização de uma proteína imunogénica de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 ou 8 para a detecção de animais naturalmente infectados, de animais vacinados com uma vacina bacteriana de acordo com, pelo menos, uma das reivindicações 1 a 2 e/ou de animais naturalmente infectados e vacinados com uma vacina bacteriana de acordo com, pelo menos, uma das reivindicações 1 a 2, em particular porcos.
10. 10. Processo de diagnóstico para a distinção de animais infectados, de animais vacinados com uma vacina bacteriana de acordo com, pelo menos, uma das reivindicações 1 a 2 e/ou de animais naturalmente infectados e vacinados com uma vacina bacteriana de acordo com, pelo menos, uma das reivindicações 1 a 2 compreendendo a determinação 2 serológica de proteínas imunogénicas não essenciais para a resposta protectora imunitária, em particular, OmpD, em animais naturalmente infectados e/ou em animais vacinados com uma vacina bacteriana de acordo com, pelo menos, uma das reivindicações 1 a 2.
11. 11. Processo de diagnóstico de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por este ser realizado na forma de um teste ELISA.
12. 12. Placas de rastreio, em particular placas de ELISA, com uma proteína imunogénica de acordo com uma das reivindicações 7 ou 8 . Lisboa, 19 de Novembro de 2014 3