ES2209954T3 - Cepas de e.coli enteropatogena mutantes atenuadas (epec), procedimiento para su produccion y sus utilizaciones. - Google Patents

Abstract

Cepa de Escherichia coli enteropatógena (EPEC) de mamífero, no humana, atenuada, que comprende una supresión de una secuencia de un gen que codifica la intimina, en donde dicha supresión comprende la secuencia codificante completa o parte de la secuencia codificante, que resulta en una mutación por desplazamiento de la pauta, o resulta en una señal de detención transcripcional o de traducción, caracterizada porque además dicha supresión elimina completamente la expresión de una proteína intimina funcional.

Description

Cepas de E. coli enteropatógena mutantes atenuadas (EPEC), procedimiento para su producción y sus utilizaciones.

La presente invención concierne a un proceso para obtener cepas mutantes atenuadas de Escherichia coli enteropatógenas (EPEC), derivadas de cepas portadoras de parte o la totalidad del locus del esfacelamiento enterocítico (enterocyte effacement), que les proporciona ciertas características patógenas. Estas características son, entre otras, la desaparición del villi intestinal o borde ciliado, la reordenación de la estructura del citoesqueleto, y la diarrea resultante. La invención concierne igualmente a las cepas atenuadas que son el resultado de este proceso y a su uso en una vacuna.

Se sabe que las cepas de EPEC son un agente etiológico importante de la diarrea infantil en humanos y en animales, mediante la adhesión a la mucosa intestinal y la producción de la lesión de adhesión y esfacelamiento característica en la membrana del borde ciliado del microvilli (26). Son también el prototipo de una familia de patógenos que presentan este mecanismo de virulencia único (27). Este grupo de Escherichia coli de adhesión y esfacelamiento (AE) incluye la Escherichia coli enterohemorrágica, la Hafnia alvei, y el patógeno del ratón Citrobacter rodentium (6, 22). Las cepas de EPEC se consideran como la única clase importante de Escherichia coli AE en conejos (34). Se demostró además que la cepa RDEC-1 del tipo EPEC del conejo posee los mismos atributos descritos para las cepas EPEC humanas (6, 17). Las cepas de EPEC del conejo se adhieren al tejido y células intestinales y destruyen el microvilli. Hasta la fecha, no se han descrito enterotoxinas termoestables o termolábiles conocidas, y la gran mayoría de estas cepas no son enteroinvasoras (33a).

Junto con las características genéticas, las cuales pueden detectarse ahora más fácilmente que antes, y a los efectos AE característicos, los cuales se describen con mayor detalle más adelante, hay ciertas características adicionales que pueden detectarse usando procedimientos más tradicionales. A continuación de la caracterización serológica de Salmonelas, se desarrollo el esquema de serotipado para cepas de Escherichia coli, basado originalmente en tres tipos de antígenos: el antígeno somático (O), el antígeno capsular (K), y el antígeno flagelar (H). Los antígenos somáticos son complejos de lipopolisacáridos y parte de la estructura de la pared celular de Escherichia coli. La unidades repetidas de polisacárido proporcionan a los antígenos O su inmunogenicidad específica. Un cierto número de los antígenos O reaccionan serológicamente de forma cruzada con, o incluso son química y serológicamente idénticos a antígenos somáticos de otros organismos, como los miembros de los grupos Shigella y Salmonella. Algunas cepas, llamadas cepas rugosas y denominadas OR, carecen de estas cadenas laterales repetidas y devienen auto-aglutinables. Los antígenos K capsulares son principalmente polisacáridos ácidos. Actualmente, el tipado del antígeno K no se realiza regularmente, excepto en ciertos casos. La diversidad de los antígenos H flagelares se basa en los diferentes tipos de flagelina presentes como parte de la estructura flagelar. Muchas Escherichia coli son o bien sólo ligeramente móviles o no móviles a partir de su aislamiento primario. Sin embargo, muchas cepas obtienen una movilidad completa al pasar a través de agar semisólido. Aquellas cepas que no desarrollan motilidad se denominan no-móviles (NM) o H-. Por tanto, el tipo de O:K:H describe las características serológicas de Escherichia coli al completo. En general, el antígeno K se deja fuera, y una cepa se considerará serotipada detectando solamente el tipo de O:H. En algunos casos, también se detectan los antígenos F fimbriales, y en ese caso el tipado completo de una cepa resulta en una denominación O:K:H:F.

Hay indicaciones de que algunos serotipos están más probablemente asociados con ciertos microentornos. No obstante, el serotipado tan sólo etiqueta los organismos sin mostrar su patogenicidad específica o sus factores de virulencia. Ciertos serotipos parecen están asociados con ciertos rasgos de virulencia (42). Mucho antes de que se conocieran sus características de virulencia, las EPEC se demostraban primero en base a su serotipo. En el conejo, hay un cierto número de serotipos descritos como más (O15, O26, y O103) o menos (O128, O132) patogénicos. Hay también un serotipo, O109, que parece ser más patogénico en conejos amamantados y menos patogénicos en conejos destetados. Por tanto, el serotipado nos proporciona, en combinación con un esquema de biotipado, una primera indicación sobre las propiedades de virulencia de cepas de EPEC de conejo aisladas.

Se mostró que un esquema de biotipado basado en la capacidad de las cepas de fermentar dulcitol, rafinosa, ramnosa y sorbosa, y en la capacidad de descarboxilar la ornitina, proporcionaba una discriminación óptima entre las cepas de EPEC de conejo. Aplicando este esquema, se pudieron establecer 21 biotipos. Con estos biotipos, en combinación con el serotipo y la movilidad de la cepa, se pueden distinguir ciertos patotipos. En general, las cepas denominadas O15:H-/3 (positiva para O14, no móvil, y pertenecientes al biotipo 3), O26:H+/4 y O103:H+/8 es consideran como altamente patógenas para conejos destetados. Otros tipos como el O132:H+/2 y el O128:H+/2 incluyen cepas que tienen características de patogenicidad muy diferentes, desde no patógenas hasta altamente patógenas, pero generalmente sólo modestamente patógenas. Al contrario que las cepas antes mencionadas, el tipo O109:H+/1 está más a menudo asociado con diarrea en conejos amamantados, y puede ser altamente patogénico para estos conejos inmaduros. Aunque pueden aislarse más tipos a partir de las diarreas de conejos, los patotipos antes mencionados son los más importantes y los más frecuentemente aislados en el caso de diarrea en conejos asociada con EPEC.

Aparte de estas técnicas más clásicas, se ha realizado mucho trabajo para relevar las propiedades genéticas subyacentes de las EPEC, especialmente a partir de aislados de humanos. Todos los genes necesarios para la AE están codificados en una isla de patogenicidad cromosómica de 35 k.b. denominada "locus del esfacelamiento enterocítico" (LEE) (22). Entre otros, se caracterizaron los genes que codifican un sistema de secreción del tipo III, proteínas secretadas (Esp), y la intimina de la adhesina, y se situaron en esta isla (1, 2, 11, 15, 16). Los experimentos confirmaron que un LEE de EPEC clonado es capaz de introducir el fenotipo AE en un huésped K12 de Escherichia coli. Se hallaron islas de patogenicidad similares en todos los otros patógenos de AE, incluyendo aquellas cepas aisladas de conejos diarreicos (22, 41).

El mecanismos de virulencia de AE está precedido por una pérdida inicial de adherencia. Esta unión microbiana a las células huésped o superficies de tejidos mediada por la interacción de una molécula de adhesión (es decir, adhesina) y una molécula receptora se caracteriza por un elevado grado de especificidad. Las adhesinas toman varias formas, más a menudo como estructuras morfológicas distintas, denominadas fimbrias (también conocidas como pili) y fibrilas, pero también como proteínas de superficie afimbrial (7a). En el caso de las EPEC, algunas adhesinas están bien caracterizadas, pero probablemente muchas más permanecen aún desconocidas. Aunque la mayoría de las adhesinas no son necesarias para la AE, ciertamente pueden incrementar la virulencia de una cepa. Por ejemplo, el factor de la virulencia (Per) y el conjunto formador de pili codificados en el plásmido EAF, los cuales se cree hacen posible una colonización rápida de la posible región de los alrededores, tienen un efecto positivo intenso sobre la virulencia de las cepas de EPEC humanas (14, 19). En ciertas cepas, la intimina es la única adhesina conocida (13a, 17a, 21a), por tanto, la detección hará imposible la adherencia. Después de una pérdida inicial de adherencia, se secretan el receptor de intimina translocado (Tir) recientemente descrito y ciertas proteínas Esp mediante el sistema de secreción del tipo III (49). Como resultado, algunas proteínas, incluyendo el Tir, se transfieren al citoplasma de la célula huésped (18, 32). La transferencia del Tir y su ubicación en la membrana de la célula huésped permite a las EPEC unirse íntimamente mediante la unión de la intimina a este receptor.

Por debajo de la EPEC unida, las reordenaciones citoesqueléticas, inducidas por la célula que se une, resultan en la degeneración localizada del borde epitelial rugoso y en la lesión AE, también descrita como formación de pedestal (9, 27, 28, 43). La lesión del tejido resultante conduce a pérdidas de nutrientes directas y a una captación de alimentos disminuida.

La proteína intimina de la membrana externa se transcribe a partir del gen eae, y se considera que es un proteína importante para el mecanismo de virulencia. Los mutantes defectuosos en eae forman lesiones de AE inmaduras, y no inducen la reorganización de la estructura del citoesqueleto por debajo del lugar de infección (8). La respuesta inmune contra la proteína intimina se considera que es un factor inmunoprotector principal contra la infección por EPEC (8, 47). La mutagénesis de supresión de eae en una cepa EPEC humana resultó en una cepa que causó diarrea en 4 de 11 de los voluntarios que recibieron esta cepa. Más aún, una infección experimental, posterior en el tiempo, con una cepa de EPEC completamente virulenta en individuos que habían sido vacunados experimentalmente con la cepa mutante, demostró que la aplicación de una vacuna tal no conseguía inducir una protección a largo plazo (8, 10).

Los inventores actuales han estudiado extensamente la EPEC como un agente causante de diarrea en conejos destetados y amamantados. Las cepas de EPEC se identificaron como un factor importante en la enteropatía del conejo (39). Se describieron las propiedades patógenas y la ausencia de enterotoxinas termoestables o termolábiles (33a). Se realizaron infecciones experimentales con cepas aisladas, procedentes de conejos recién nacidos, amamantados y procedentes de conejos destetados, y los estudios clínicos mostraron hallazgos que eran similares a los descritos en infecciones por EPEC humanas (33, 35).

Actualmente, sólo hay una solución para un criador de conejos cuando aparece la coliobacilosis: tratar los animales con antibióticos y, eventualmente, eliminar los animales y repoblar la granja. Sin embargo, la resistencia a los antibióticos está creciendo, y no hay garantía de que los animales nuevos estén completamente libres EPEC. Actualmente no hay disponibles vacunas que sean a la vez seguras y efectivas. Se han realizado algunos experimentos sobre el uso de cepas matadas con formalina como posibles vacunas contra la infección por cepas O103 (5, 23), sin resultados directamente útiles. También se han ensayado como una vacuna cepas aisladas naturalmente portadoras tan sólo de algunos antígenos del serogrupo patogénico O103, todavía sin una protección segura contra la infección directa con una cepa del tipo salvaje (25). Más recientemente, se ha descrito el uso de una cepa mutada en la región sep (responsable del sistema de secreción del tipo III) (4a). Se obtuvieron buenos resultados, pero la cepa se atenuó usando mutagénesis de trasposón, y porta un gen de resistencia a la kanamicina, el cual la hace inapropiada para un uso práctico. La cepa, su procedimiento de obtención, y su uso eventual han sido descritos en una solicitud de patente francesa publicada bajo el número 2.758.568 (24). En una publicación más reciente, los mismos investigadores informaron de la construcción de cepas similares, mutadas respectivamente en espA, espD y eae (29). Tal como se ha descrito anteriormente, las cepas mutadas de esta forman no inducen adhesión y esfacelamiento (1, 2, 8, 10, 20, 45). En la cepa O103 mutante en eae, todavía se apreció un lento efecto citopático (CPE). Este efecto se suprimió en los mutantes de esp y en mutantes de AF/R2 descritos anteriormente. La AF/R2 es una adhesina que ha sido descrito antes, y para la cual no hay un homólogo presente en las cepas O15:H- (3, 12). Todas éstas se construyen todavía haciendo uso de un gen marcador de la resistencia a antibiótico, lo que las hace inapropiadas para un uso apropiado en la práctica. Por tanto, los resultados de ensayar un mutante de supresión de eae en humano (8, 10) y un mutante de secreción (sep) en conejo (4a) como posibles cepas de vacunas indicaron que es necesario mantener intacto el gen eae, puesto que la intimina está considerada como un antígeno importante para inducir una respuesta inmune protectora,

Por tanto, es un objetivo de la presente invención proporcionar cepas de Escherichia coli enteropatógenas atenuadas, las cuales puedan usarse efectivamente como una vacuna en mamíferos.

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Es otro objetivo de la presente invención proporcionar un procedimiento para producir una cepa de Escherichia coli enteropatógena mutante atenuada que pueda usarse efectivamente como una vacuna en mamíferos.

Es otro objetivo de la presente invención proporcionar un vector recombinante útil para producir una cepa de Escherichia coli enteropatógena mutante atenuada que pueda usarse efectivamente como una vacuna en mamíferos.

Es otro objetivo de la presente invención proporcionar una composición de vacuna contra infecciones por Escherichia coli enteropatógena en mamíferos.

Es otro objetivo de la presente invención proporcionar un procedimiento para diferenciar in vitro entre mamíferos infectados por Escherichia coli enteropatógena y mamíferos vacunados.

Los presentes inventores han demostrado que las supresiones en la secuencia codificante de al menos uno de los genes en el locus LEE de las cepas de EPEC resulta en un atenuación de la virulencia de dichas cepas.

La presente invención se refiere a una cepa de Escherichia coli enteropatógena (EPEC) de mamíferos, no humana, atenuada, que comprende una supresión de una secuencia de un gen que codifica una intimina, en donde dicha supresión comprende la secuencia codificante completa, o parte de la secuencia codificante que resulta de la mutación por desplazamiento en pauta, o que resulta en una señal de detención transcripcional o de traducción, caracterizada además porque dicha supresión elimina completamente (la expresión de) una proteína intimina funcional.

Aunque la mutagénesis de supresión de las secuencias eae en cepas de EPEC humanas resultó en una cepa que proporcionaba sólo una ligera protección contra la infección experimental, los presentes inventores han hallado sorprendentemente que la supresión de una secuencia del gen eae, cadena abajo respecto la región de anclaje transmembrana sospechada de la intimina, en cepas de EPEC de mamífero, resultaba en una protección efectiva frente a la infección experimental.

La expresión "cepas atenuadas" se refiere a una cepa que es menos virulenta que la cepa progenitora.

La expresión "cepa de Escherichia coli enteropatógena (EPEC)" se refiere a un grupo de cepas de Escherichia coli de adhesión y esfacelamiento (AE), las cuales son conocidas como un agente etiológico importante de la diarrea de infantes humanos y animales. Otro grupo importante de cepas de AE son las cepas enterohemorrágicas de Escherichia coli (EHEC), las cuales presentan el mismo mecanismo de virulencia particular (27).

Debería entenderse que la expresión "dicha supresión elimina completamente la expresión de una proteína intimina funcional" se refiere a supresiones de las secuencias codificantes, las cuales pueden comprender toda la secuencia codificante del gen de la intimina, pero que también comprenden sólo parte de la secuencia codificante, lo que resulta en una mutación por desplazamiento de pauta, o resulta en una señal de detención transcripcional o de traducción. Como consecuencia, la proteína intimina no se expresa en una forma funcionalmente activa sobre la superficie de la célula.

Por tanto, la presente invención también se refiere a una cepa de Escherichia coli enteropatógena (EPEC) de conejo que comprende una supresión de una secuencia que codifica el gen de la intimina, caracterizándose además dicha cepa en que induce una respuesta inmune cuando se administra a un conejo.

De acuerdo con la invención, la cepa de Escherichia coli enteropatógena (EPEC) atenuada, de mamífero, no humana, se caracteriza además en que dicha cepa contiene fimbrias sobre su superficie.

Las fimbrias podrían ser necesarias para adherirse y colonizar el vello intestinal, y, como consecuencia, inducir una respuesta inmune protectora. Por otra parte, una respuesta inmune contra las principales adhesinas podría ser protectora debida a prevenir esta colonización.

La invención se refiere a cepas de Escherichia coli enteropatógenas (EPEC) atenuadas, de mamífero, no humanas. Las cepas no humanas preferidas proceden de conejo, perro, gato, caballo, cabra, bovino, cerdos, o aves de corral.

De acuerdo con todavía otra realización preferida, la presente invención se refiere a una cepa de Escherichia coli enteropatógena (EPEC) de conejo atenuada que comprende una supresión de una secuencia del gen que codifica la intimina, en donde dicha supresión elimina completamente una proteína intimina funcional, y/o con dicha cepa caracterizada además porque induce una respuesta inmune cuando se administra a un mamífero.

De acuerdo con una realización también preferida, la presente invención proporciona una cepa de Escherichia coli enteropatógena (EPEC) de conejo atenuada, en donde dicha supresión consiste en una supresión de una región interna de 248 pares de bases del gen eae. Dicha supresión debería ser tal que elimina completamente una proteína intimina funcional.

La presente invención también proporciona Escherichia coli enteropatógena (EPEC) de conejo atenuada, tal como se depositó, el 22 de abril de 1999, bajo el número LMG P-18935, en la colección "Belgian Coordinates Collections of Microorganisms LMG". El 22 de mayo de 200, se depositó en la colección "Belgian Coordinates Collections of Microorganisms LMG" una variante de esta cepa sensible a tetraciclina con el número LMG P-19461.

De acuerdo con otra realización, la presente invención se refiere a un vector recombinante que comprende secuencias de genes que codifican intimina en las que hay una supresión, en donde dicha supresión elimina completamente la expresión de proteína intimina funcional, y en donde dicha supresión es una de las siguientes: (i) una supresión cadena abajo de la región de anclaje transmembrana de la intimina; o (ii) una supresión que comprende parte de la secuencia codificante, que resulta en una mutación por desplazamiento en fase, o que resulta en una señal de detención transcripcional o de traducción, caracterizada además porque dicha secuencia del gen codificante de la intimina procede de una cepa de Escherichia coli enteropatógena (EPEC) de mamífero que no es humano.

Más particularmente, la presente invención se refiere a un vector, tal como se ha definido más arriba, en donde dicho gen que codifica la intimina es el gen eae procedente de una cepa de EPEC de conejo.

Incluso más particularmente, la presente invención se refiere a un vector, tal como se ha definido más arriba, denominado pKO3\Deltaeae y caracterizado por un mapa de restricción como se muestra en la Figura 1.

De acuerdo con otra realización, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir una cepa de Escherichia coli enteropatógena (EPEC) de mamífero, atenuada, no humana, tal como se ha definido más arriba, que comprende el paso de introducir una supresión del gen eae en una cepa EPEC del tipo salvaje mediante recombinación homóloga, usando un vector que comprende una supresión de una secuencia del gen que codifica la intimina, tal como se a definido más arriba.

De acuerdo con otra realización, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir una cepa de Escherichia coli enteropatógena (EPEC) de conejo, atenuada, tal como se define más arriba, que comprende el paso de introducir una supresión en el gen eae de una cepa de EPEC del tipo salvaje mediante recombinación homóloga, usando un vector que comprende una supresión de una secuencia del gen que codifica la intimina, tal como se a definido más arriba.

Los procedimientos de la invención no se limitan a la producción de cepas de Escherichia coli enteropatógenas (EPEC) de conejo, atenuadas, sino que pueden aplicarse a la producción de cepas de Escherichia coli enteropatógenas (EPEC) no humanas, atenuadas, que proceden de otros huéspedes, tales como perros, gatos, caballos, cabras, terneras, cerdos o aves de corral.

De acuerdo todavía con otra realización, la presente invención se refiere a una composición inmunogénica que comprende una cepa de Escherichia coli enteropatógena (EPEC) de conejo, atenuada, que comprende una supresión de una secuencia de gen que codifica una intimina, tal como se ha definido más arriba.

De acuerdo con todavía otra realización, la presente invención se refiere a una composición de vacuna viva que proporciona inmunidad protectora frente a una infección por EPEC en un conejo, la cual comprende una cepa de Escherichia coli enteropatógena (EPEC) de mamífero, atenuada, de conejo, que comprende una supresión de una secuencia del gen codificante de intimina, en donde dicha supresión comprende la secuencia codificante completa, o parte de la secuencia codificante, lo que resulta en una mutación por desplazamiento de pauta, o resulta en una señal de detención transcripcional o de traducción, caracterizada además porque dicha supresión elimina completamente la expresión de una proteína intimina funcional.

De acuerdo con una realización preferida, dicha cepa de mamífero es una cepa de mamífero no humana. Como tal, la presente invención se refiere a una composición de vacuna viva que proporciona inmunidad protectora contra una infección por EPEC en un conejo, que comprende una cepa de Escherichia coli enteropatógena (EPEC) de conejo atenuada, la cual comprende una supresión de una secuencia de gen codificante de intimina, tal como se ha definido más arriba.

No obstante, si es necesario, la cepa de Escherichia coli enteropatógena (EPEC) de mamífero, no humana, podría administrarse también mediante cualquier ruta conocida en la técnica para ayudar al tratamiento de infección por Escherichia coli enteropatógena (EPEC).

De acuerdo con una realización preferida, dicha composición de vacuna es una vacuna oral.

La administración de las cepas de Escherichia coli enteropatógena (EPEC) atenuadas de la invención podrían realizarse mediante la adición de cualquier adyuvante o cualquier otro agente potenciador de la respuestas inmune conocido en la técnica.

De acuerdo con otra realización, la presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para diferenciar entre individuos infectados o vacunados, en donde dichos individuos infectados se diagnostican in vitro en base a la presencia de anticuerpos contra la intimina.

De acuerdo con una realización preferida, la presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para diferencia entre individuos infectados y vacunados, en donde la diferenciación entre la cepa del tipo salvaje y la mutante se consigue usando moléculas de ácido nucleico (cebadores), representados por las SEC. Nº ID.: 3 y 4, en una reacción de amplificación.

De acuerdo con otra realización, la presente invención se refiere al uso de una cepa de Escherichia coli enteropatógena (EPEC) de conejo, atenuada, que comprende una supresión de una secuencia del gen codificante de la intimina, tal como se ha definido más arriba para la preparación de una vacuna, en donde dicha supresión comprende la secuencia codificante completa o parte de la secuencia codificante, lo que resulta en una mutación por desplazamiento de pauta, o resulta en una señal de detención transcripcional o de traducción, caracterizada además porque dicha supresión elimina completamente la expresión de una proteína intimina funcional.

La invención, ahora descrita de forma general, será entendida más fácilmente por referencia a los ejemplos siguientes, los cuales se incluyen meramente con propósitos de ilustración de ciertos aspectos y realizaciones de la presente invención, y no se pretende que limiten la invención.

Leyendas de las figuras

Figura 1: el pKO3eae (8798 p.b.) resulta de la clonación de la secuencia del eae, procedente de RDEC-1, en el sitio de restricción BamHI de PKO3. Aparte de los sitios de restricción SmaI, NotI, BamHI, EcoRI, PstI y SalI, se muestran las siguientes características: cat (acetiltransferasa del cloramfenicol), ori de M13 (origen filamentoso f1 (+)), sacB (gen sacB de Bacillus subtilis), oriC, Rep (sensible a la temperatura de pSC101). El corte de este vector con PstI y su religación resultó en el plásmido pKO3\Deltaeae, que tiene una supresión del gen eae.

Figura 2: Los productos de la PCR de la REPEC O15: H-\Deltaeae (carril 1), 97/241.6 del tipo salvaje (carril 2), un control negativo (agua, carril 3), y un marcador de tamaño del ADN (gel ADN de \lambda cortado con PstI), se separaron en un gel (0,8% de agarosa en un tampón de tris-borato de etiléndiamina tetra-acetato (TBE)). Los cebadores usados (SEC. Nº ID.: 3 y SEC. Nº ID.: 4) se alinean cadena arriba y cadena abajo de la región suprimida de 248 p.b. en \Deltaeae, resultando un producto de 350 p.b. para un eae sin cortar (carril 2) y en un producto de 102 p.b. para el gen recombinante \Deltaeae (carril 1).

Figura 3: Se muestra el resultado de una transferencia Western a partir de proteínas de membrana aisladas, detectado aplicando suero policlonal disponible contra EPEC de conejo (47). La técnica usada se describe en otros lugares (40, 47). El carril 1 muestra los Biotinylated Broad Standard (Bio-Rad), el carril 2 muestra proteínas procedentes de la REPEC O15:H-\Deltaeae, y el carril muestra proteínas procedentes de la cepa salvaje 97/241.6. La REPEC O15:H-\Deltaeae parece haber perdido la banda de intimina (94 kDa, flecha), mientras que la 97/241.6 todavía produce esta banda.

Figura 4: El panel A muestra la íntima y la desaparición del microvilli por parte de la cepa 97/233.10 del tipo salvaje (3500\times, microscopio electrónico de barrido, SEM). El panel B muestra efectos idénticos observados después de infección con la cepa 97/241.6 del tipo salvaje (3500\times). El panel C muestra una visión de conjunto (900\times) con una clara diferencia entre regiones no infectadas e infectadas.

Figura 5: Fotografía de microscopio electrónico de barrido tomada después de la infección de un conejo con una cepa REPEC O15:H-\Deltaeae atenuada (900\times, SEM). No se observa unión o esfacelamiento por parte de esta cepa.

Figura 6: Presentación gráfica que muestra la captación de alimento diaria, tal como se calculó tres veces por semana. Se halló una diferencia significativa entre el grupo no vacunado y el vacunado/control (intervalo de confianza del 95%).

Ejemplos Ejemplo 1 Selección de la cepa diana

El biotipado se realizó sobre una colección de cepas EPEC de conejo putativas disponibles en el laboratorio de los investigadores, usando procedimientos rutinarios (30, 38). La motilidad, la reacción al indol, y la actividad descarboxilasa de ornitina se ensayaron en tubos MIO (GIBCO, Paisley, Escocia) siguiendo las especificaciones del fabricante. El serotipado se realizó mediante aglutinación sobre portaobjetos con antisueros específicos (31). El tipado se repitió después de almacenar las cepas de forma segura en un congelador a -70ºC. La presencia del locus de esfacelamiento enterocítico se detectó mediante hibridación de colonias rutinaria con sondas no radiactivas A, B, C y D (22, 44). Estas sondas cubren la totalidad del locus genético dle LEE. La hibridación se realizó a 65ºC y como tampón de hibridación se escogió el tampón estándar (46). En base a estos hallazgos, se escogieron dos cepas O15:H- como cepas de referencia para el grupo de EPEC de conejo O15:H-, a saber, la 97/223.10 y la 97/241.6. Estas cepas están disponibles, previa solicitud, en el Centrum voor Onderzoek in Diergeneeskunde en Agrochemie, Groeselenberg 99, B-1180, Bruselas (Ukkel), Bélgica.

Ejemplo 2 Construcción y análisis de unas cepas mutantes de EPEC 1. Cepa REPEC O15:H- \Deltaeae

Los genes eae de 97/241.6 y 97/223.10 y RDEC-1 se clonaron usando técnicas estándares descritas en (44). En base a la secuencia publicada del eae de RDEC-1 (4), se escogieron cebadores y se realizó la PCR del ADN cromosómico de las respectivas cepas (cebador hacia arriba: 5' AAAAAAGGATCCAAAAATTACGCCGGAAGAT 3' (SEC. Nº ID.: 1); cebador hacia abajo: 5' AAAAAATCTAGAAAAAGGTAAACLAGGTCTC 3' (SEC. Nº ID.: 2); 10 ciclos de 15'' a 94ºC, 30'' a 55,4ºC, 2' a 68ºC, seguidos por 20 ciclos de 15'' a 94ºC, 30'' a 55,4ºC, 2' a 68ºC + 20'' cada ciclo). Se usó la polimerasa Expand™ (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Alemania), y las reacciones se realizaron en un GeneAmp 9600 Thermal Cycler de Perkin Elmer. Los productos de la PCR se clonaron usando el sistema de clonación del vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Groningen, Países Bajos). El gen eae de RDEC-1 se recortó del plásmido pCR2.1-TOPO con BamHI y se ligó en pKO3 cortado de igual modo (21), resultando en el plásmido pKO3eae (Figura 1). La ligación correcta se comprobó mediante digestión de restricción y electroforesis en gel, y mediante PCR (siguiendo el procedimiento descrito más arriba, con plásmido recombinante como ADN de plantilla). Se suprimió una región interna de 248 pares de bases (p.b.) del eae mediante digestión del pKO3eae con PstI y religando el plásmido, lo que resultó en el pKO3\Deltaeae. Se diseño una reacción de PCR con cebadores que flanqueaban la región de 248 p.b. suprimida (cebador hacia arriba: 5' CCACTCAAAAAACTGTCTGTTG 3' (SEC. Nº ID.: 3); cebador hacia abajo 5' TCCAGTGAACTACCGTCAAAG 3' (SEC. Nº ID.: 4); 25 ciclos de 15'' a 94ºC, 58, 1ºC, 72ºC), haciendo más fácil la detección del pKO3\Deltaeae correctamente ligado. En caso de no eliminarse mediante corte el área de 248 p.b., el producto resultante debería ser de 350 p.b., y en caso de una supresión correcta, de
102 p.b.

El plásmido pKO3 es un plásmido suicida con un origen de replicación sensible a la temperatura (ori), y un gen de sensibilidad a la sacarosa (sacB) procedente de Bacillus subtilis como sus características principales (21). Esta combinación permitió usarlo como una herramienta para la mutagénesis específica de un sitio promoviendo dos recombinaciones homólogas sucesivas. El vector se diseñó originalmente como una herramienta auxiliar para analizar pautas de lectura abierta no identificadas de Escherichia coli, también conocida como investigación genómica (21). Los siguientes cepas, aisladas a partir de varios mamíferos, se hicieron electrocompetentes siguiendo técnicas rutinarias (44). y se electroporaron (condiciones usadas: 200 \Omega, 25 F, 1,80 kV, usando una cubeta de 0,1 cm en un Gene Pulser de Bio-Rad): 97/96, 91/387, 95/148.2, 97/251, 97/44, 997/46.5, 98/33.1, 97/226, 97/224, 97/241.6, 97/223.10, 148KH96, 390KH97, 408KH97, 410KH97, 415KH97, 7KH98, 10KH98, 11KH98, 104KH99, 105KH99, 106KH99, 144KH99, 88KH00, y 155KH00. Las cepas electroporadas se cultivaron en medio SOC durante 30 minutos en un incubador con agitación, y se sembraron sobre placas de agar tal como se describe en (21). Las recombinaciones homólogas dobles no tuvieron éxito, pero el procedimiento siguiente, descrito en (21), en el cual el vector pKO3\Deltaeae se
co-integra primero con eae en el cromosoma, y a continuación experimenta una segunda recombinación, sí que resultó en numerosas colonias. El segundo suceso de recombinación resultó en el gen eae intacto o en \Deltaeae. Puesto que la región suprimida estaba situada cerca del extremo N-terminal del eae (405 p.b. respecto el codón de inicio), y lejos de la región C-terminal (2166 p.b. desde el codón de detención), una recombinación que dejara el \Deltaeae era menos favorable. Las posibles colonias mutantes se recolectaron y se ensayaron mediante el procedimiento de ensayo de PCR (ver Figura 2) descrito más arriba, o mediante hibridación de colonias usando las mismas condiciones descritas más arriba, pero con la región de 248 p.b. como sonda (construida realizando una PCR con los cebadores flanqueantes sobre los cromosomas de las cepas del tipo salvaje, y cortando el producto resultante con PstI, que resultó en la sonda de la región de 248 p.b. suprimida). Se aisló una Escherichia coli que había perdido la región de 248 p.b., lo que resultó en la cepa mutante de REPEC O15:H^{-} \Deltaeae depositada bajo el número LMG P-18935, el 22 de abril de 1999, en la colección Belgian Coordinated Collections of Microorganisms.

2. Análisis de proteínas de la cepa mutante

El suero hiperinmune con una cepa O109:H+, obtenido en experimentos descritos previamente (47), se usó para visualizar proteínas antigénicas de las cepas REPEC O15:H^{-} \Deltaeae y 97/241.6 mediante inmunotransferencia realizada como se había describió previamente (40). LA banda de 94 kilodaltones (kDa) de tamaño, que había sido identificada como intimina, ya no era visible en el carril en el que se habían cargado las proteínas de REPEC O15:H^{-} \Deltaeae (ver Figura 3). Esto permitió a los inventores concluir que la intimina estaba ausente en la cepa mutante, tal como se esperaba.

3. Construcción de la cepa de REPEC O15:H+ \Deltaeae Tc^{s} sensible a la tetraciclina

Se obtuvo una cepa REPEC O15:H^{-} \Deltaeae sensible a la tetraciclina usando placas de selección Bochner (4b). Se usó ácido fusárico (2 mg/ml) como agente quelante. Se sembraron aproximadamente 10^{6} células sobre una placa Bochner y subsiguientemente se incubaron a 37ºC durante 24-36 horas. Se recolectaron las colonias, se dispersaron para obtener colonias individuales, y se sembraron sobre una placa de medio Bochner. Se repitió este procedimiento hasta que se obtuvo una cepa claramente sensible a la tetraciclina. La cepa resultante sensible a la tetraciclina REPEC O15:H^{-} \Deltaeae Tc^{s} se depositó bajo el número LMG P-19461, el 12 de mayo de 2000, en la colección Belgian Coordinated Collections of Microorganisms LMG.

Ejemplo 3 Propiedades patógenas de las cepas mutantes y no mutantes

Las propiedades patógenas de la cepa 97/241.6, 97/223.10 y REPEC O15:H^{-} \Deltaeae se ensayaron realizando un experimento de infección in vivo. Se ensayaron dos conejos New Zealand White MDL (nivel de enfermedad mínimo) por cepa, dos animales control se albergaron por separado y nunca se infectaron. Estos conejos se compraron a N.V. Verlabreed (Nevele, Bélgica), un criador con un reputación higiénica bien conocido. Su comida no contenía coccidioestáticos ni antibióticos. Su control en el momento de su llegado mostró que estaban libres de EPEC, Clostridium spiroforme, rotavirus y Eimeria (37, 48). Las habitaciones de experimentación se desinfectaron antes de su uso, así como las jaulas individuales. Los conejos se alimentaron con comida comercial libre de anticoccidiostáticos, y la ingestión de comida y el incremento de peso diario se siguieron regularmente. La infección experimental re realizó administrando per os 1 ml de una suspensión de células, cultivada durante la noche, y diluida en solución salina tamponada con fosfato (PBS) hasta 1,6 \times 10^{4} CFU por ml. Uno de los dos conejos se sacrificó 7 días después de la infección, el segundo 10 día después de la infección. Se tomaron muestras de duodeno, yeyuno, íleon y ciego, para su estudio mediante microscopía óptica y microscopía electrónica (36).

Las observaciones clínicas mostraron una diarrea suave (97/223.10), ligera (97/241.6) y ninguna diarrea (control y REPEC O15:H^{-} \Deltaeae). Las dosis de infección fueron bastante bajas, puesto que la muerte causada por colibacilosis interferiría con las observaciones histológicas claras usando el microscopio. A partir de la infección con 97/241.6 y 97/223.10, la proporción de conversión de comida disminuyó claramente, especialmente para los conejos infectados con 97/223.10. La velocidad de conversión de comida de los conejos infectados con REPEC O15:H^{-} \Deltaeae no fue influenciada negativamente en comparación con los conejos control. Los estudios histológicos mostraron que la 97/223.10 se unía íntimamente, se observaron pedestales y el microvilli estaba suprimido, resultando en células claramente destruidas en las regiones de los alrededores. Estos efectos eran más intensamente visibles en el ciego, pero también eran detectables en el íleon (ver Figura 4). La infección con 97/241.6 condujo a observaciones idénticas. La infección con REPEC O15:H^{-} \Deltaeae mostró, sin embargo, que la cepa no estaba íntimamente unida, sino que aparecía concentrada en microcolonias en el lumen (ver Figura 5). El tejido procedente de los conejos control no mostró organismos unidos. Los hallazgos histológicos se observaron siguiendo los procedimientos descritos en (36).

Ejemplo 4 Adhesión de la cepa mutante al borde ciliado del vello intestinal

Asumiendo que es necesaria una cierta persistencia de la cepa de EPEC para que se desarrolle una respuesta inmune protectora, y, por tanto, para proteger el huésped frente a una nueva infección, los presentes inventores se han asegurado que, después de la supresión del gen eae, el mutante es todavía capaz de unirse a los enterocitos.

Se realizó un ensayo in vitro. Se aisló el vello intestinal de un conejo New-Zealand de 6 semanas de edad usando una técnica descrita anteriormente (12a, 15a). Las cepas mutantes se marcaron con FITC incubando 10^{8} microorganismos durante 30 minutos con una solución de 0,5 mg de FITC/1 ml de Na_{2}CO_{3} 0,1 M. Después de lavar las bacterias varias veces con PBS, se incubaron durante 1 hora con el vello intestinal separado. Unas pocas, pero cierta cantidad de bacterias se adhirieron a los bordes ciliados. De nuevo, B10 y DH5\alpha se usaron como cepas control positiva y negativa.

Además, la prueba de la persistencia del mutante in vivo se obtuvo sembrando muestras fecales diarias de los conejos, a los que se les administró oralmente la cepa mutante, sobre un agar SCS (agar citrato de Simon, incluyendo un 4% p/v de sorbosa y 250 ppm de novobiocine) y G_{2}S (agar de Gassner, extracto de levadura, Na_{2}S_{2}O_{3}.5H_{2}O, Fe^{2+}-citrato, y 25% de novobiocine). Las cepas mutantes pudieron aislarse durante un período de más de 20 días.

Ejemplo 5 1. Inmunoprotección usando la cepa mutante en una vacuna

Se realizó un experimento de vacunación para observar las características inmunoprotectoras de la REPEC O15:H^{-} \Deltaeae frente a una infección con 97/223.10. Se compraron 42 conejos, se controlaron y se albergaron como se ha descrito más arriba. Se dividieron en tres grupos con 14 conejos cada uno, de forma que el peso promedio de los tres grupos era altamente similar. El primer grupo se vacunó experimentalmente per os con 1 ml de una solución de PBS con 2,5 \times 10^{5} CFU/ml de REPEC O15:H^{-} \Deltaeae. Una semana más tarde, el mismo grupo junto con el segundo grupo se infectaron experimentalmente con 97/223.10 (5,4 \times 10^{4} CFU/ml). El tercer grupo sirvió como grupo control y nunca se infectó con una cepa EPEC.

El grupo de animales no vacunados sufrió más de diarrea que el grupo vacunado. Incluso, aunque la dosis infección bastante baja, uno de los animales no vacunados murió de colibacilosis, puesto que esta fue la única posibilidad después de su autopsia. Los animales no vacunados mostraron un retraso en su ganancia de peso en comparación con los animales vacunados y los animales control. También el consumo de comida diaria difirió entre los animales vacunados y los no vacunados, puesto que el consumo de comida de los animales no vacunados se redujo hasta un nivel significativamente diferente (alfa = 0,05) en comparación con los conejos control y vacunados (ver la Figura 6). Cuando se calculan las conversiones de comida, no se hallan diferencias significativas, usando el test de la t de Student, entre los tres grupos antes de la infección con 97/223.10 (vacunado respecto control: p = 0,52; vacunado respecto no vacunado: p = 0,35; control respecto no vacunados: p = 0,73). A continuación de la infección de los grupos 1 y 2, las conversiones de comida difieren claramente para los conejos no vacunados y vacunados (vacunado respecto control: p = 0,68; vacunado respecto no vacunado: p = 0,02; control respecto no vacunados: p = 0,02). La proporción de conversión de comida de los conejos no vacunados era significativamente inferior en comparación con las proporciones de los grupos vacunado y control. No se halló diferencia significativa alguna entre los grupos vacunado y control.

2. Las cepas obtenidas como una base para ulterior investigación de vacunas

El estudio ulterior de las cepas nos enseño más sobre la señalización entre el organismo patógeno y su huésped. Las características de adhesión se estudiaron in vitro sobre diferentes líneas celulares. Esto, junto con la secuenciación de las región que rodea la región de 248 p.b. suprimida, proporciona más claridad sobre las características precisas de la REPEC O15:H^{-} \Deltaeae y de la REPEC O15:H^{-} \Deltaeae Tc^{s}. Las cepas se ensayaron por su preciso papel inmunogénico y protector siguiendo las respuestas humorales y de células T. Se ensayaron modificaciones adicionales para su efecto inmunogénico.

Ejemplo 6 Presencia de fimbrias

En base a resultados publicados anteriormente, se realizó una PCR de ADN cromosómico de las respectivas cepas para detectar las adhesinas predominantes en el conejo, a saber, la AF/R2 y la RalE (3, 7, 7b, 40a). El ensayo fue positivo tanto para AF/R2 como para RalE (cebador hacia arriba AF/R2: 5' GAAACTAATTGCTATTGCTG 3' (SEC. Nº ID.: 5); cebador hacia abajo AF/R2: 5' ATGCGATTGAAATAGTTAGC 3' (SEC. Nº ID.: 6); cebador hacia arriba RalE: 5' TTTGCCAAAATGAAACGCTT 3' (SEC. Nº ID.: 7); cebador hacia abajo RalE: 5' AGCGCTTTTTGTT
TACTTCC 3' (SEC. Nº ID.: 8); 25 ciclos de 15'' a 94ºC, 30'' a 53,1ºC para AF/R2 y 30'' a 52,7ºC para RalE, 2' 72ºC. Para la mayoría de las cepas, también se ensayó la presencia de EAF (factor de enteroadherencia). Los resultados se listan más abajo (TABLA 1).

TABLA 1 Presencia de fimbrias en algunas Escherichia coli patógenas LEE-positivas

Nombre	Fenotipo	Fimbrias
		AF/R2	RalE	EAF
97/223.10	3-/O15	+	+	+
97/241.6	3-/O15	+	+	+
RDEC-1	3-/O15	-	-	+
DH5\alpha	3-/O15	-	-	NA
E2348/69	3-/O15	-	-	NA
97/204	3-/O15	-	+	NA
97/193.1	3-/O15	+	+	+
97/190.1	3-/O15	+	+	+
97/185.1	3-/O15	+	+	+
97/17.2	3-/O15	+	+	+
97/146	3-/O15	+	+	+
97/127	3-/O15	+	+	+
97/119.1	3-/O15	+	+	NA
97/101.1	3-/O15	+	+	+
96/261	3-/O15	+	+	+
95/148.2	3-/O15	+	+	NA
97/226	8+/O103	+	-	+
97/110.6	8+/O103	+	+	+
B10	8+/O103	+	+	+
91/184	4+/O26	-	-	+
B13 RDZ 113	4+/O26	+	+	NA
B13 RDZ 112	4+/O26	+	+	NA
B13 RDZ 112	4+/O26	+	+	NA
B13 RDZ 116	4+/O26	+	+	NA
NA = No disponible

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<110> CENTRUM VOOR ONDERZOEK IN DIERGENEESKUNDE EN AGROG

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<120> CEPAS DE E. COLI enteropatógena (EPEC) ATENUADAS, PROCESO PARA SU PRODUCCIÓN, Y SU USO

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<130> CODA-001-PCT

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<140>

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<141>

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<160> 8

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

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<400> 1

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aaaaaaggat ccaaaaatta cgccggaaga t

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<210> 2

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<212> ADN

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

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aaaaaatcta gaaaaaggta aaclaggtct c

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<210> 3

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

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<400> 3

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ccactcaaaa aactgtctgt tg

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

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tccagtgaac taccgtcaaa g

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<210> 5

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<212> ADN

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gaaactaatt gctattgctg

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<212> ADN

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atgcgattga aatagttagc

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<212> ADN

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tttgccaaaa tgaaacgctt

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<212> ADN

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

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agcgcttttt gtttacttcc

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Claims (13)

1. Cepa de Escherichia coli enteropatógena (EPEC) de mamífero, no humana, atenuada, que comprende una supresión de una secuencia de un gen que codifica la intimina, en donde dicha supresión comprende la secuencia codificante completa o parte de la secuencia codificante, que resulta en una mutación por desplazamiento de la pauta, o resulta en una señal de detención transcripcional o de traducción, caracterizada porque además dicha supresión elimina completamente la expresión de una proteína intimina funcional.

2. Cepa de Escherichia coli enteropatógena de conejo atenuada que comprende una supresión de una secuencia de un gen que codifica la intimina de acuerdo con la reivindicación 1, con dicha cepa que está caracterizada porque además induce una respuesta inmune cuando se administra a un conejo.

3. Cepa de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque además dicha cepa contiene fimbrias sobre su superficie.

4. Cepa de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3, escogida de entre las cepas depositadas bajo el nº de LGM P-18935, el 22 de abril de 1999, y el nº de LGM P19461, el 22 de mayo de 2000, en la colección LGM Belgian Coordinated Collections of Microorganisms.

5. Vector recombinante que comprende secuencias de genes que codifican la intimina en las que hay una supresión presente, en donde dicha supresión elimina completamente la expresión de una proteína intimina funcional, y en donde dicha supresión es una de las siguientes: (i) una supresión cadena abajo de la región de anclaje transmembrana de la intimina, o (ii) una supresión que comprende parte de la secuencia codificante, que resulta en una mutación por desplazamiento de la pauta, o resulta en una señal de detención transcripcional o de traducción, caracterizada porque además dicha secuencia de gen que codifica la intimina procede de una cepa de Escherichia coli enteropatógena (EPEC) de un mamífero, no humana.

6. Vector de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicho gen que codifica la intimina es el gen eae procedente de una cepa de EPEC de conejo.

7. Procedimiento para producir una cepa de Escherichia coli enteropatógena (EPEC) de mamífero, no humana, tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende la etapa de introducir una supresión del gen eae en una cepa EPEC de tipo salvaje, mediante recombinación homóloga usando un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7.

8. Composición inmunogénica que comprende una cepa de EPEC de conejo atenuada de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.

9. Composición de vacuna que proporciona inmunidad protectora frente a una infección por EPEC en un conejo, que comprende un cepa de Escherichia coli enteropatógena (EPEC) de conejo, la cual comprende una supresión de una secuencia del gen que codifica la intimina, en donde dicha supresión comprende la secuencia codificante completa o parte de la secuencia codificante, lo que resulta en una mutación por desplazamiento de pauta o resulta en una señal de detención transcripcional o de traducción, caracterizada porque además dicha supresión elimina completamente la expresión de una proteína intimina funcional.

10. Composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 9, la cual es una vacuna oral.

11. Procedimiento in vitro para diferenciar entre individuos infectados y vacunados, en donde dichos individuos infectados se diagnostican in vitro en base a la presencia de anticuerpos contra la intimina.

12. Procedimiento in vitro para diferenciar entre individuos infectados y vacunados, en donde la diferenciación entre la cepa del tipo salvaje y mutante se realiza usando cebadores representados por las SEC. Nº ID.: 3 y 4 en una reacción de amplificación.

13. Utilización de una cepa de Escherichia coli enteropatógena (EPEC) de conejo atenuada, que comprende una supresión de una secuencia de un gen que codifica la intimina, para la preparación de una vacuna, en donde dicha supresión comprende la secuencia codificante completa o parte de la secuencia codificante, lo que resulta en una mutación por desplazamiento de pauta o resulta en una señal de detención transcripcional o de traducción, caracterizada porque además dicha supresión elimina completamente la expresión de un proteína intimina funcional.