JP6506291B2 - 短縮型大腸腺腫性ポリポーシス（ａｐｃ）タンパク質を標的にする治療剤 - Google Patents

短縮型大腸腺腫性ポリポーシス（ａｐｃ）タンパク質を標的にする治療剤 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
(0001)本出願は、米国仮出願第61/875,933号(出願日2013年9月10日)及び米国仮出願第61/930,754号(出願日2014年1月23日)に優先権の恩典を主張する。これらの出願の各々の内容は、本願明細書に全体として援用されている。
発明の分野
(0002)記載されている発明は、大腸がん、APCがん抑制遺伝子、遺伝子の変異によって生じた短縮型(truncated)APC遺伝子産物、及び結腸がん細胞系及び短縮型APC遺伝子産物を有する他のヒトがん細胞系を標的にする治療剤に関する。
発明の背景
(0003)大腸がん(CRC)は、米国において多く診断されるがんの第3位で且つがん関連死亡率の原因の第3位であり、2011年にはおよそ141,000の症例の結腸がんと直腸がんが診断されている。従って、アメリカ人の19人に1人が、生涯に全リスクの5.4%としてCRCと診断される。幸いにも、初期の非侵襲性腺腫の外科的切除は本質的に治癒的である。しかしながら、進行型のCRCに罹患している患者にはほとんど効果的な治療選択肢がなく、予後がしばしば悪い。潜伏期が長期にわたるにもかかわらず、外科的に切除され得る段階で確認される病巣はかなり少ない(Phelps et al. Cell Cycle, 2009; 8:16, 2549-2556を参照のこと)。
(0004)ヒトAPCがん抑制遺伝子の変異は、家族性腺腫性ポリポーシス(FAP)、多数のポリープが大腸の上皮に形成されている遺伝性のがん傾向状態に関係がある(Kinzler et al., Science, 1991; 253:661-665; Kinzler and Vogelstein, Cell, 1996; 87:159-170; Half et al., Orphanet Journal of Rare Diseases, 2009; 4:22を参照のこと)。CRCの発症は、結腸上皮から腺腫性ポリープの異常な生成によって開始され、最終的に侵襲性の強いがんになる(Kinzler and Vogelstein, Cell, 1996; 87: 159-170を参照のこと)。散発性大腸がんの約85%がAPC切断変異をもっていることが報告された(Kinzler and Vogelstein, Cell, 1996; 87:159-170を参照のこと)。ポリープの成長は、ほとんどの症例において大腸線腫性ポリポーシス(Adenomatous Polyposis Coli; APC)遺伝子の両対立遺伝子の変化と関連している。変異性ファーストヒットはほぼオープンリーディングフレームの中央で起こり、C末の半分がない短縮型APC分子を生成する。このようなトランケーション変異は、いわゆる突然変異クラスター領域(MCR)にある(Schneikert et al., Human Molecular Genetics, 2006; 16: 199-209を参照のこと)。変異性セカンドヒットは第二の対立遺伝子の欠失又は切断産物の合成につながる突然変異を含み、MCR後にはほとんど起こらない(Schneikert et al., Human Molecular Genetics, 2006; 16: 199-209を参照のこと)。従って、結腸がん細胞は、少なくとも短縮型APC分子を発現し、その長さはMCRの位置及び時には追加のより短い断片によって区切られている。
(0005)CRC治療は、主に、疾患の原因となる遺伝学的根拠の最小限の特異性と作用する化学療法剤に依存している。これらの化学療法剤は、化学標的に対する依存を共有するためがん細胞を破壊しつつ正常細胞の機能をしばしば破壊する。CRCと診断された患者の治療を改善するためにより良好なより正確な治療薬が求められている。
大腸腺腫性ポリポーシス(APC)遺伝子
(0006)APCは、古典的がん抑制因子として作用せず、Wntシグナル伝達に影響し、このことにより遺伝子転写が調節される。Wntは、幹細胞維持、増殖、及び胚発生の間の分化の調節が含まれている分泌されたシステインの豊富な糖タンパク質のファミリーである。古典的Wntシグナル伝達は、GSK-3キナーゼ活性の受容体仲介不活性化によって細胞質のβ-カテニンの安定性を増加させるとともにβ-カテニンの核内への転座を促進する。古典的Wntシグナル経路は、また、細胞内β-カテニンの安定化及びβ-カテニン/TCF/LEF転写複合体の活性化を介して幹細胞マイトジェンとして働き、結果として細胞周期調節遺伝子、例えばMyc、サイクリンD1、EPhrinB(EPhB)、Msx1の発現が活性化され、細胞増殖を促進する(Cayuso and Marti, Journal of Neurobiology, 2005; 64:376-387を参照のこと)。
(0007)APCは、Wntシグナル伝達の負の調節因子である。この負の調節のないWnt経路は、より活性であり、がんにおいて重要である。(Polakis, Current Opinion in Genetics & Development, 2007; 17: 45-51を参照のこと)。ヒト及びマウス双方において疾患のWntシグナル伝達と重症度のレベルを相関させるために両方のAPC対立遺伝子における変異による腫瘍細胞を比較する研究によって、遺伝子量効果がWntシグナル伝達増強の所定のウィンドウを生成しているモデルを確立するのに援助され、腸におけるポリープ形成につながった。より弱いWntシグナル伝達増強と関連した『より軽度の』APC変異の組み合わせは、腸外組織の腫瘍を引き起こしている。このモデルによれば、APCにおける生殖細胞変異の種類は、第二の対立遺伝子で生じるタイプの体細胞変異を決定する。(Minde et al.Molecular Cancer, 2011; 10:101を参照のこと)。
APCタンパク質
(0008)APC遺伝子産物は、複数のドメインからなる312kDaのタンパク質であり、ベータカテニン、アキシン、C末端結合タンパク質(CtBP)、APC刺激グアニンヌクレオチド交換因子(Asef)、RasGTPアーゼ活性化関連タンパク質(IQGAP1)、末端結合-1(EB1)及び微小管が含まれる、種々のタンパク質に結合する。変異体マウス及び培養細胞を用いた研究によって、APCが古典的Wntシグナル伝達を抑制し、上皮細胞及びリンパ系細胞が含まれる、種々の細胞型の腫瘍形成、発症及びホメオスタシスにとって重要であることが証明された。更なる研究によって、APCタンパク質が他のいくつかの基本的な細胞過程で機能することが提唱されている。これらの細胞過程には、細胞接着と移動、アクチンや微小管ネットワークの組織化、紡錘糸の形成及び染色体分離が含まれる。APCにおける変異によって生じるこれらの過程の調節解除は、大腸がんの開始と拡張に関係している(Aoki and Taketo, Journal of Cell Science, 2007; 120:3327-3335を参照のこと)。
(0009)APCタンパク質はシグナル伝達ハブ又は足場として働くので、発がんに関連する多くのタンパクと物理的に相互作用する。APCの減少は、細胞接着、細胞移動、細胞骨格、及び染色体分離に影響する(Aoki and Taketo, Journal of Cell Science, 2007; 120:3327-3335を参照のこと)。
(0010)ほとんどの研究者は、APC変異によって大腸がんにおける機能変化の減少が生じると思っている。ミスセンス変異はAPCにおいて点変異を生じ、トランケーション変異によって所定の調節ドメインが含まれるAPCタンパクの大部分の減少が生じる。かなりの数のAPCミスセンス変異は、種々の組織に由来する腫瘍において報告されており、浸潤性尿路上皮がんにおいてはより悪い疾患結果に関連しており(Kastritis et al., International Journal of Cancer, 2009; 124:103-108を参照のこと)、腸管外腫瘍の発症に点変異したAPCタンパク質の機能的関連性が提唱されている。これらの変異がAPC機能を妨げる分子的機序は未解決のままである。
(0011)機能転換を引き起こすAPC変異は、少なくとも3つの方法で: 動原体-微小管相互作用を減弱させることによって、有糸分裂チェックポイント機能低下によって及び倍数体細胞を生成することによって、染色体不安定性に影響し得る。例えば、研究によって、微小管に結合したAPCが生体内で及び生体外で微小管安定性を増加させたことが示され、微小管安定性におけるAPCの役割が提唱されている(Zumbrunn et al., Current Biology, 2001; 11:44-49を参照のこと)。短縮型APCにより、マウス胚幹細胞においては染色体不安定性につながり(Fodde et al., Nature Cell Biology, 2001; 3:433-438を参照のこと)、微小管プラス端結合が妨げられ、有糸分裂異常の劇的な増加が引き起こされた(Green and Kaplan, Journal of Cell Biology, 2003; 163:949-961を参照のこと)。研究によって、APC変異を有するがん細胞が誤った動原体-微小管結合を修正する能力が減弱することが示されており、腫瘍における染色体不安定性の広範な発生を説明している(Bakhoum et al., Current Biology, 2009; 19:1937-1942を参照のこと)。更に、紡錘体チェックポイント機能の排除は、APC機能低下によって報告された。siRNAによるAPCのノックダウンは、APCの減少によって動原体とチェックポイントタンパク質Bub1及びBubR1の間の関連を弱めることによって有糸分裂紡錘体チェックポイント機能の低下が生じることを示した。従って、APCの減少は、アポトーシスを減少させるとともに倍数性を誘導する(Kaplan et al., Nature Cell Biology, 2001; 3:429-432; Dikovskaya et al., Journal of Cell Biology, 2007; 176:183-195; Rusan and Peifer, Journal of Cell Biology, 2008; 181:719-726を参照のこと)。倍数性は、多極分裂につながり得るので、異数性の主な原因である(Shi and King, Nature, 2005; 437:1038-1042を参照のこと)。
(0012)APCによる機能低下は部分的には正しいものであるが、大部分の大腸がん患者は端を切り取っている少なくとも1つのAPC遺伝子産物を有すること、及びこれが機能を増強することを示している報告がある。従って、短縮型APCタンパク質は、劣性であるのと対照的に大腸がん開始と進行において積極的な役割を果たすことになり; 例えば、短縮型APC、全長APC以外は、Asefを活性化するとともに細胞移動を促進する場合がある。
(0013)APCの欠損が大部分の大腸がん症例に存在するにもかかわらず、これらの欠損から生じる脆弱性を標的にする治療法が現在のところない。記載されている発明は、大腸がんを治療するための不死化ヒト結腸上皮細胞(HCEC)における短縮型APCを選択的に標的にする低分子阻害化合物を提供する。
(0014)一態様によれば、記載されている発明は、短縮型大腸腺種性ポリポーシス(APC)タンパク質を含有するヒトがん細胞の成長を選択的に阻害する一連の低分子化合物を提供する。
(0015)一実施態様によれば、低分子抗がん化合物は、式Iの化合物である。他の実施態様によれば、低分子抗がん化合物は、式I-aの化合物である。他の実施態様によれば、低分子抗がん化合物は、式I-bの化合物である。他の実施態様によれば、低分子抗がん化合物は、式I-cの化合物である。他の実施態様によれば、低分子抗がん化合物は、式I-dの化合物である。他の実施態様によれば、低分子抗がん化合物は、請求項3に記載の43構造からなる群より選ばれる化合物である。他の実施態様によれば、低分子抗がん化合物は、請求項5に記載の構造式の化合物である。他の実施態様によれば、低分子抗がん化合物は、請求項7に記載の5構造からなる群より選ばれる化合物である。他の実施態様によれば、低分子抗がん化合物は、請求項9に記載の構造式の化合物である。他の実施態様によれば、低分子抗がん化合物のIC50は、0.01nMから5μMまでである。他の実施態様によれば、低分子抗がん化合物は、治療量の化合物及び医薬的に許容され得る担体を含む医薬組成物の形である。他の実施態様によれば、治療量の低分子抗がん化合物は、腫瘍成長を阻止するか、腫瘍増殖を阻害するか、細胞死を誘導するか又はこれらの組み合わせに効果的である。
(0016)他の態様によれば、記載されている発明は、結腸上皮細胞が少なくとも1つの短縮型APCタンパク質を発現する被検者において大腸がんを治療する方法であって、治療量の請求項1〜19のいずれか1項に記載の少なくとも1つの低分子抗がん化合物及び医薬的に許容され得る担体を含む医薬組成物を被検者に投与することを含み、その治療量が、腫瘍成長を阻止するか、腫瘍増殖を阻害するか、細胞死を誘導するか、又はこれらの組み合わせに効果的な量である、前記方法を提供する。
(0017)他の態様によれば、記載されている発明は、全長野生型APC遺伝子を含む不死化ヒト結腸上皮細胞(HCEC)であって、細胞が以下の少なくとも1つ: Kirstenラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ(Krasv12)を含有する異所的発現ベクター、腫瘍タンパクp53に対する小ヘアピンRNA(shp53)、及びAPCに対する小ヘアピンRNA(shAPC)を含んでいる、前記細胞を提供する。一実施態様によれば、APC遺伝子は、コドン1450に体細胞変異を有する。他の実施態様によれば、APC遺伝子は、コドン1309に体細胞変異を有する。他の実施態様によれば、細胞は、LacZタンパク質を発現している。他の実施態様によれば、細胞は、Kirstenラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ(Krasv12)及びAPCに対する小ヘアピンRNA(shAPC)を発現している。他の実施態様によれば、細胞は、レトロウイルスサイクリン依存性キナーゼ4(Cdk4)、及び、ヒトテロメラーゼ(hTERT)の触媒コンポーネントによって導入される。
(0018)図1は、結腸陰窩の図である。結腸陰窩は、細胞分裂を受ける幹細胞が含まれる細胞の上皮層、円柱吸収細胞、ムチン産生杯細胞、及び腸内分泌細胞から構成される。細胞は、分化し、陰窩の管腔表面に移動し、ここでプログラム細胞死によって腸管腔に押出される。APCは腸上皮細胞内で転写プロファイルをモジュレートすることによって直接又は間接にこれらの過程の全てに関与すると考えられる(Goss et al., Journal of Clinical Oncology, 2000; 18:1967-1979を参照のこと)。APCは、ベータカテニン/TCFによってWntシグナル伝達に影響する。全長APCは、網膜芽細胞腫(Rb)経路を通ってG1/Sで細胞を静止するとともにM期の間に有糸分裂紡錘体及び中心体に局在することによって細胞周期制御に影響する。APCは、微小管を安定化するとともに細胞分裂制御タンパク質42(cdc42)を活性化することによって細胞移動に影響する。最後に、全長APCは、細胞分化及びアポトーシスに影響する。 (0019)図2は、正常結腸上皮から大腸がんまでの進行に関係する可能な遺伝子を示す図である。APC変異は、APC変異が80%を超える大腸腫瘍に検出され、90%を超えるAPC変異が結果として短縮型遺伝子産物になる未成熟終止コドンを生成するので、大腸がんにおいてしばしば起こる初期のイベントであると考えられている。 (0020)図3は、全長及び短縮型APCの構造を示す図である。短縮型APCは、ベータカテニン及び微小管のための結合ドメインを欠いているが、Asefのための結合ドメインを保持しているので、増殖の活性化、染色体不安定性の誘発及び細胞移動の刺激につながる。(Fodde et al., Nat Rev Cancer, 1:55-67を参照のこと) 変異A1309及びA1450は、最も大きく表されている。 (0021)図4は、不死化ヒト結腸上皮細胞(HCEC)が正常2倍体であり、分化することができることを示す図である。(A) 小さな自己組織化多細胞構造は、極性化ビリン及び一般核染色の兆候を示している。(B) 小さな自己組織化多細胞構造(11日目)は、閉鎖帯-1(ZO-1)及び一般核染色の兆候を示している。(C) 小さな自己組織化多細胞構造(11日目)は、ムチン[MUC]2、閉鎖帯-1(ZO-1)及び一般核染色の兆候を示している。(D) hTERT CDK4不死化ヒト結腸上皮細胞が原発性マウス腸細胞と同様に分化したことを示している。hTERT CDK細胞は、100% LGR-5陽性である。LGR-5は、結腸幹細胞の認められた生物マーカーである。(Roig et al.Gastro, 2010; 138:1012-1021を参照のこと)。 (0022)図5は、APCトランケーションが腫瘍形成能を与えることを示す図である。用いられる同質遺伝子的ヒト結腸上皮細胞(HCEC)は、サイクリン依存性キナーゼ4(CDK4)及びヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)(1CT)で不死化されたHCEC; 遺伝子変化CDK4、hTERT、Kirstenラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ(Krasv12)、APCに対する小ヘアピンRNA(shAPC)、(1CTRA)によるHCEC; 遺伝子変化CDK4、hTERT、Krasv12、腫瘍タンパク質p53(shp53)に対する小ヘアピンRNA、shAPC(1CTRPA)によるHCEC; LacZを発現する1CTRPA(1CTRPA LacZ); コドン1450に体細胞変異を有する1CTRPA(1CTRPA 1450); 及びコドン1309に体細胞変異を有する1CTRPA(1CTRPA 1309)。APC機能の90%減少は腫瘍形成能を増加させないが、短縮型APCを含有する同質遺伝子的細胞系誘導体は形質転換の特徴を示している。このことは、短縮型APCががん進行の増大を表す機能の獲得を与え且つCRCを有する大部分の患者が短縮型APCタンパク質を保持する理由を説明することができることを示している。 (0023)図6は、高いスループットスクリーニングによるTASIN-1(短縮型APC選択的阻害薬)の識別の段階を示している流れ図である。 (0024)図7は、TASIN-1がAPCトランケーションを有する大腸がん(CRC)ラインに対して選択的に毒性があることを示している図である。(b)APCトランケーションの異所性発現、WT APCのノックダウン、及びp53及びウェスタンブロット又は制限消化物アッセイによる発がん性Krasv12の妥当性確認。プライマリスクリーニングで用いられる細胞系は、赤いボックスで強調されている。(e)HCT116及びDLD1の細胞におけるTASIN-1の用量応答曲線。表(e)は、双方の細胞系のIC50値を示している。DLD1は短縮型APCを発現し、HCT116は野生型APCを発現する。従って、TASIN-1は、生存コロニーと形成コロニーから短縮型APCを発現するDLD1細胞を阻害するが、HCT116細胞にはほとんど又はまったく影響しない。(f)TASIN-1の有無で7日間軟寒天中に成長したHCT116細胞とDLD1細胞の代表的写真及び定量化。データは、平均±s.d.、n=3を表す。スチューデントのt検定、***P<0.001。 (0025)図8は、APCトランケーションの異所性発現が腫瘍形成能を与えることを示す図である。(a)APCトランケーションの異所性発現によって、1CTRPAと比較して1CTRPA A1309細胞の成長速度が増加した。1CTRPA A1309細胞における軟寒天コロニー形成効率の比(b)又はMatrigel(登録商標)による浸潤(c)は1CTRPAと比較した。データは、平均±s.d.、n=3を表す。スチューデントのt検定、*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。 (0026)図9は、短縮型APCのノックダウンがTASIN-1に対してDLD1細胞を除感作し、APCがTASIN-1の標的であることを証明することを示す図である。 (0027)図10は、APCトランケーションがTASIN-1の細胞毒性に必要とされていることを示す図である。(a)APCに対して非サイレンシング(Nsi) shRNA又はshRNAsを発現するDLD1細胞の用量応答曲線。表(a)は、細胞系ごとのIC50値を示すものである。(b)HCT116及びHCT116 p53-/-細胞の用量応答曲線、短縮型APC A1309を発現するレンチウイルスのベクターに感染した、腫瘍タンパク53(既知の腫瘍抑制遺伝子)のためのヌル変異体を用いて、ベータ-ガラクトシドトランスアセチラーゼ(LacA)又はAPCトランケーション変異体A1309を発現させた。LacAは、負の対照として細胞系において異所的に発現させた。データは、平均±s.d.、n=3を表す。ノックダウン及び異所性発現は、ウェスタンブロットによって示した。(c)左の棒グラフは、DMSO、2.5M又は5uMのTASIN-1で72時間処理した各細胞株に対する生存率を示すものである。右表(c)は、生物学的3回反復実験から各細胞系に対する平均IC50値を示すものである。統計的有意性は、WT APCを有する細胞系と短縮型APCを有する細胞系のIC50値の平均の間で定量された。スチューデントのt検定、****P<0.0001。各細胞系におけるAPCの状態は、発表されたデータ(Chandra, S.H., Wacker, I.Appelt, U.K., Behrens, J.& Schneikert, J.A common role for various human truncated adenomatous polyposis coli isoforms in the control of beta-catenin activity and cell proliferation.PloS one 7, e34479 (2012))及びがんゲノムプロジェクトデータベース(www.sanger.ac.uk/genetics/CGP)に基づくものである。 (0028)図11は、TASIN-1が短縮型APCを有する細胞に対して選択的に毒性であることを示す図である。TASIN-1は、正常細胞系(a)及びWT APCを有する他のがん型細胞(b)の生存度に影響を及ぼさず、短縮型APCを有するDU4457細胞を死滅させる。データは、平均±s.d.、n=3を表す。スチューデントのt検定、***P<0.001。 (0029)図12は、TASIN-1に対する様々なAPC状態を有する大腸がん細胞系の応答を示す図である。短縮型APCを発現するヒト結腸上皮細胞系HT-29、DLD1、SW620、SW480、HCT15、Lovo及びCaco-2、及び野生型APCを発現する細胞、HCT116、HCT116 p53-/-、HCEC、C26Ci、HBEC及びBJをTASIN-1で処理し、細胞生存率を評価した。HCT116、HCT116 p53-/-、HCEC及びC26Ciは結腸細胞系であるが、HBEC及びBJ細胞系はそれぞれ気管支上皮細胞系及び包皮線維芽細胞である。2μM及び5μM双方のTASIN-1状態において、短縮型APCを発現するすべての細胞系はTASIN-1に対して感受性を示したが、野生型APCを発現する細胞系はTASIN-1に対して感受性を示さなかった。これは、APCの野生型レベルを含有する正常細胞がTASIN-1に影響を受けないにちがいないないことを意味する。 (0030)図13は、低用量のTASIN-1による持続性の処理がDLD1細胞において足場非依存性成長を抑制したことを示す図である。 (0031)図14は、TASIN-1がDLD1細胞においてアポトーシスを誘導することを示す図である。HCT116細胞又はDLD1細胞をDMSO、2.5μM TASIN-1又はBARDと72時間インキュベートした後、切断されたPARPのレベルをウェスタンブロットによって分析した。DMSOは負の対照として使用し、細胞系において切断されたPARPの量に影響しなかった。しかしながら、BARDは正の対照として使用し、HCT116及びDLD1の細胞系における切断されたPARPの増大を容易にした。TASIN-1で処理したDLD1細胞は切断されたPARPの増大を示したが、同じ条件下でHCT116細胞は示さなかった。HCT116は野生型APCを発現し、DLD1は短縮型APCを発現する。更に、2.5μM TASIN-1で処理したDLD1細胞においてカスパーゼ活性が増大した。 (0032)図15は、TASIN-1がDLD1細胞においてc-Jun N末端キナーゼ(JNK)-依存性アポトーシスを誘導するがHCT116細胞では誘導しないことを示す図である。TASIN-1とインキュベートすると、DLD1細胞(c)においてPARP(a)の切断、ミトコンドリア(b)からのシトクロムc放出及びカスパーゼ3活性化を誘導する。アポトーシスに対する正の対照としてドキソルビシン(DOX)を用いた。負荷対照としてβ-アクチンを用いた。(c)における値は、標準化したカスパーゼ3/7活性とDMSO処理細胞との誘導倍率を表す。RLU: 相対ルシフェラーゼ単位。(d) TASIN-1処理は、DLD1細胞においてJNKのリン酸化を誘導する。(e)〜(g) TASIN-1とSP600125を共処理すると、TASIN-1の死滅効果を逆転させ(e)、JNKのリン酸化を阻害し、TASIN-1処理によって誘導されるPARPの切断を消失させ(f)、カスパーゼ3/7活性を低下させる(g)。データは、平均±s.d.、n=3を表す。スチューデントのt検定、**P<0.01、***P<0.001。 (0033)図16は、TASIN-1がDLD1細胞におけるシトクロムC放出を誘導したことを示す図である。Cyto: 細胞質; mito: ミトコンドリア。電位依存正アニオンチャネル(VDAC)、ミトコンドリア外膜に見られる。 (0034)図17は、マウスS9におけるTASIN-1の代謝安定性及び肝細胞分析を示す図である。 (0035)図18は、TASIN-1が腹膜腔から吸収された後に大腸に保持されることを示す図である。LIC:大腸含有量。 (0036)図19は、リード化合物の効力及び選択性が生体内で確認された方法を示す図である。 (0037)図20は、TASIN-1がDLD1異種移植片において腫瘍成長を阻害することを示す図である。投与スケジュールは40mg/kgで18日間かけて1日2回腹腔内投与した。(a)TASIN-1処理DLD1異種移植片(下)の腫瘍サイズは、対照マウス(上)より小さい。スケールバー、10mm. TASIN-1は、DLD1(b)の腫瘍成長速度を著しく低下させる。 (0038)図21は、TASIN-1が選択的にAPCトランケーションを有する異種移植片の腫瘍増殖を阻害し(c〜d)且つCRCマウス遺伝子モデルの腫瘍形成能を低下させる(e〜g)ことを示す図である。TASIN-1は、HT29の腫瘍成長速度を著しく低下させる(c)が、HCT116異種移植片を低下させない(d)。(c)〜(d)、データは8個の腫瘍の平均±s.d.を表している。TASIN-1処理は、良性(ポリープ)腫瘍の数を著しく減少させ(e)、CPC;Apcマウスにおけるポリープサイズを縮小させる(f)。(e)において、各点は、1匹のマウスを表している。平均は、黒い線によって示されている。(g) TASIN-1は、マウスの成長を阻止しなかった。(f)及び(g)において、データは、8〜10匹のマウスの平均±s.d.を表している。スチューデントのt検定(c)〜(e)、(g)及び多重t検定((f)、FDR=1%)を用いた。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。 (0039)図22は、TASIN-1がHT29異種移植片における腫瘍成長を阻止したことを示している。投与スケジュールは40mg/kgで18日間にわたって1日2回腹腔内投与した。 (0040)図23は、TASIN-1がHCT116異種移植片において腫瘍成長を阻止しないことを示す図である。投与スケジュールは40mg/kgで18日間にわたって1日2回腹腔内投与した。HCT116は、野生型APCを有する。従って、TASIN-1は、生体内で短縮型APCに選択性を維持する。 (0041)図24は、TASIN-1が遺伝子工学によるCRCマウスモデルにおいて腫瘍形成を低減させることを示す図である。(a)TASIN-1は、腹腔内注射後の大腸組織に主に保持される。(b)対照及びTASIN-1処理グループからの結腸の代表的写真。(c)TASIN-1は、生体内にはめ込まれた炎症性遺伝子の発現を抑制する。対照及びTASIN-1処理グループの腫瘍溶解物からRNAを抽出し、cDNAを合成し、qPCR分析にかけた。データは、5匹のマウスの平均±s.d.を表している。スチューデントのt検定、*P<0.05、**P<0.01。 (0042)図25は、TASIN-1が目立った毒性を含まずにアポトーシスの誘発によって異種移植片マウスモデルにおいて腫瘍を阻害することを示す図である。(a)対照又はTASIN-1処理マウスにおける処理前後の体重。(b)TASIN-1又は溶媒処理DLD1異種移植片における代表的H&E染色画像及び切断されたカスパーゼに対する免疫組織化学。スケールバー(左)、50μM; (右)、200μM。TASIN-1処理腫瘍は、アポトーシス腫瘍細胞の領域を示し(ボックスでマークした、下の左)、切断されたカスパーゼ3に対して陽性染色であった(下の右)。(c)ウェスタンブロットによって対照又はTASIN-1処理腫瘍標品の抽出物において切断されたPARPが検出された。 (0043)図26は、TASIN-1の類縁体を同定するために構造活性相関(SAR)分析を示す図である。異なる化学型を有する類縁体を試験した。101個の類縁体を試験し、これらの類縁体の40個はDLD1細胞においてはTASIN-1よ大きな効力を示している。 (0044)図27は、低分子抗がん化合物PDSA-010、PDSA-011、PDSA-013及びPDSA-014が強力に及び選択的にDLD1細胞及び1CTRPA A1309細胞を死滅させることを示す図である。 (0045)図28は、1日2回10mg/kgの腹腔内注射によって投与された低分子抗がん化合物PDSA-014がDLD1異種移植片において腫瘍成長を阻止することを示す図である。 (0046)図29は、1日2回10mg/kgの腹腔内注射によって投与された低分子抗がん化合物PDSA-014がHCT116異種移植片において腫瘍成長を阻止することを示す図である。 (0047)図30は、2.5μM TASIN-1が緩慢で可逆的な細胞死を誘導することを示す図である。 (0048)図31は、TASIN-1が分裂指数を対照細胞より4倍増加させることを示す図である。 (0049)図32は、TASIN-1が正の対照PITSTOP2と同様に染色体集合を分裂させることを示す図である。 (0050)図33は、TASIN-1がDLD1細胞において細胞分裂の間に紡錘体、染色体整列及びK-繊維組織を分裂させることを示す図である。(a)中期プレートの幅。(b)紡錘体の幅/中期細胞の合計セル幅の比。Pitstop2は、紡錘体の破壊に対する正の対照である。各点は、細胞を表している。平均は、黒い線によって示されている。(c)中期同調細胞の代表的な画像は、α-チューブリン(赤色)、HURP(緑色)、及びDNA(DAPI、青色)に染色した。グラフは、異常URP局在を有するTASIN-1処理細胞のパーセントを示している。データは、3回の生物学的3回反復実験から記録した50個の細胞の平均±s.e.m.を表している。スチューデントのt検定、**P<0.001。(d)TASIN-1処理は、赤色矢印によって示されているようにラギングミクロソーム及び後期ブリッジを誘導する。すべてのスケールバー: 10μM。 (0051)図34は、TASIN-1がDLD1細胞においてWnt経路活性に影響しないことを示す図である。TASIN-1で24時間処理したDLD1細胞における合計β-カテニン(b)に対する活性β-カテニン(a)の免疫染色及びウェスタンブロット。(c)TASIN-1は、STFリポーターを用いたWnt経路活性に影響しなかった。IWRを正の対照として用いた(Chen, C. et al. Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nature chemical biology 5, 100-107 (2009))。データは、平均±s.d.、n=3を表している。スチューデントのt検定、**P<0.01、***P<0.001。すべてのスケールバー: 10μM。 (0052)図35は、TASIN-1がノコダゾール同調からの放出後にDLD-1細胞においてG1期への侵入を遅延させることを示す図である。 (0053)図36(a〜z)及び(aa)は、例示化合物のNMRスペクトルを示す図である。
詳細な説明
(0054)記載されている発明は、添付の図面と共に用いられる、例示的実施態様の下記の説明からよりよく理解され得る。本明細書に示された記載されている発明の記載されている実施態様が単に例示的及び説明的なものであり限定するものでないことは、当業者に明らかでなければならない。
定義:
(0055)本明細書の全体にわたって用いられる種々の用語は、本明細書に述べられている定義を有する。
(0056)本明細書に用いられる用語「大腸腺腫性ポリポーシス遺伝子」又は「APC遺伝子」又は「APC」は、APCタンパク質をコードしている哺乳類DNA配列を意味する。ヒトAPC遺伝子の一例は、第5番染色体上の5q21-q22に位置する、GenBank: M74088.1。ヒトAPC遺伝子に対する同義語には、BTPS2、DP2、DP2.5、DP3、PPP1R46及び「タンパク質ホスファターゼ1、調節サブユニット46」が含まれる。マウスAPC遺伝子の一例は、第18番染色体B1に位置する、MGI:88039。マウスAPC遺伝子に対する同義語には、CC2、Min、mAPC、AI0147805、AU020952及びAW124434が含まれる。
(0057)本明細書に用いられる用語「抗がん化合物」は、短縮型APCの生物活性を選択的に標的にし且つ阻害する低分子化合物を意味する。
(0058)本明細書に用いられる用語「大腸腺腫性ポリポーシスタンパク質」又は「APCタンパク質」又は「APC」は、2843個のアミノ酸の哺乳類タンパク質配列を意味する。ヒトAPC配列の一例は、GenBank: AAA03586である。マウスAPC配列の一例は、GenBank: AAB59632である。
(0059)用語「APCトランケーション」又は「APCトランケーション変異体」又は「APCトランケーション変異」は、APC遺伝子内に存在する突然変異から得られる短縮型タンパク質産物を意味する。APCトランケーションは、例えば、1309個のアミノ酸産物又は1450個のアミノ酸産物であり得るがこれに限定されない。
(0060)本明細書に用いられる用語「投与する」には、生体内投与だけでなく、生体外で直接組織に投与も含まれる。一般に、組成物は、所望される慣用の非毒性の医薬的に許容され得る担体、補助剤及び賦形剤を含有する投薬単位製剤で経口的に、口腔内に、非経口的に、局所的に、吸入又はガス注入で(すなわち、口を通して又は鼻を通して)、又は直腸に全身投与されてもよく、又は、非経口的に、注射、埋め込み、移植、局所適用のようなこれらに限定されない手段によって、又は非経口的に局所投与されてもよい。
(0061)用語「類縁体」及び「誘導体」は、同じ意味に用いられて、1つ以上の工程で同様の構造の他の化合物から生成される化合物を意味する。化合物の「誘導体」又は「類縁体」は、少なくとも参照化合物の望ましい機能の程度を保持している。従って、「誘導体」の別の用語は、「機能誘導体」であってもよい。誘導体には、化学変性、例えばアルキル化、アシル化、カルバミル化、ヨウ素化又は化合物を誘導体化する任意の変性が含まれ得る。このような誘導体化分子としては、例えば、遊離アミノ基がアミン塩酸塩を形成するために誘導体化された分子、p-トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、t-ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基又はホルミル基が挙げられる。遊離カルボキシル基は、塩、エステル、アミド、又はヒドラジドを形成するために誘導体化され得る。遊離ヒドロキシル基は、O-アシル誘導体又はO-アルキル誘導体を形成するために誘導体化され得る。本明細書に用いられる用語「状態」は、種々の健康状態を意味し、基礎にある任意の機序又は損傷によって引き起こされる障害又は疾患が含まれることを意味する。APCと関連した疾患としては、大腸がんが挙げられるがこれに限定されない。
(0062)本明細書に用いられる用語「疾患」又は「障害」は、健康障害又は異常機能の状態を意味する。
(0063)本明細書に用いられる用語「薬剤」は、治療薬又は疾患の予防、診断、緩和、治療、又は治癒に用いられる任意の物質を意味する。
(0064)本明細書に用いられる用語「酵素活性」は、所定の条件下に所定の時間で消費される基質(又は形成される生成物)を意味する。酵素活性は、また、「代謝回転数」と呼ばれてもよい。
(0065)本明細書に用いられる用語「阻害する」は、物質又は化合物の化学活性又は生物活性を低下させるか又はモジュレートすることを意味する。
(0066)本明細書に用いられる用語「損傷」は、物理的であっても化学的であってもよい、外部の物質又は力によって生じる身体の構造又は機能に対する損傷又は傷害を意味する。
(0067)本明細書に用いられる用語「症候群」は、ある疾患又は状態を表す症状のパターンを意味する。
(0068)本明細書に用いられる用語「治療薬」は、治療効果を与える薬剤、分子、核酸、タンパク質、代謝産物、組成物又は他の物質を意味する。本明細書に用いられる用語「活性」は、意図された治療効果に関与する記載されている発明の組成物の成分、構成要素又は構成成分を意味する。用語「治療薬」及び「活性薬剤」は、本明細書において同じ意味で用いられている。活性薬剤は、例えば、式Iの化合物の少なくとも1つ、又はその医薬的に許容され得る塩であってもよいがこれに限定されない。
(0069)本明細書に用いられる用語「変性する」は、1つ以上の事項がある種の基準又は割合に変化する、変動する、調整する、加減する、改質する、影響する又は調節することを意味する。
(0070)本明細書に用いられる用語「変性剤」は、病気、状態、障害、疾患、症状又は症候群の形態、症状、兆候、特質、性質又は特性を低減させるか、程度又は範囲において減少させるか、又は緩和させる物質、組成物、抽出物、植物成分、植物抽出物、植物構成成分、治療成分、活性成分、治療薬、薬剤、代謝産物、活性薬剤、タンパク質、非治療成分、又は非活性剤を意味する。
(0071)本明細書に用いられる用語「モジュレートする」は、ある種の基準又は割合に調節するか、変化させるか、適応させることを意味する。
(0072)本明細書に用いられる用語「非経口」は、注射によって身体に導入すること(すなわち、注射による投与)を意味し、例えば、皮下に(すなわち、皮膚の下に注射)、筋肉内に(すなわち、筋肉に注射); 静脈内に(すなわち、静脈に注射)、くも膜下腔内に(すなわち、脊髄のまわりの空間に又は脳のくも膜下に注射)、胸骨内に注射、又は注入技術が挙げられる。非経口的に投与された組成物は、ニードル、例えば、外科用ニードルを用いて送達される。本明細書に用いられる用語「外科用ニードル」は、選ばれた解剖学的構造への流体(すなわち、流動可能な)組成物の送達に適応した任意のニードルを意味する。注射用製剤、例えば滅菌注射用水性又は油性懸濁液剤は、例示的分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて既知の技術に従って製剤化させることができる。
(0073)本明細書に用いられる用語「低減させる」又は「低減する」は、障害を発症するリスクがある個体の障害の限界発生を意味する。
(0074)本明細書に用いられる用語「被検者」又は「個体」又は「患者」は、同じ意味で用いられ、ヒトを含める、哺乳類由来の動物種の一員を意味する。
(0075)本明細書に用いられる用語「症状」は、特定の疾患又は障害から生じ且つそれの徴候として役立つ現象を意味する。
(0076)本明細書に用いられる用語「治療成分」は、集団のパーセントにおいて特定の疾患症状の進行を取り除くか、遅らせるか又は予防する治療的に有効な用量(すなわち、投与の用量及び回数)を意味する。一般に用いられる治療成分の例はED50であり、集団の50%において特定の疾患症状に治療的に有効である特定の投薬における用量を記載している。
(0077)本明細書に用いられる用語「治療効果」は、結果が望ましく有益であると判断されている治療の結果を意味する。治療効果には、直接又は間接に、疾患症状の停止、軽減、又は排除が含まれ得る。治療効果には、また、直接又は間接に、疾患症状の進行の停止、軽減又は排除が含まれ得る。
(0078)本明細書に用いられる用語「局所」は、適用点で、又は直下で組成物の投与を意味する。語句「局所適用する」は、上皮表面が含まれる1つ以上の表面上への適用を記載している。経皮投与とは対照的に、局所投与は、一般的には、全身効果よりもむしろ局所効果を与えるが、特に明記又は暗示されない限り、本明細書に用いられる用語「局所投与」及び「経皮投与」は同じ意味で用いられる。
(0079)本明細書に用いられる用語「変異」は、親のタイプに見られない新たな性質又は素質の作成をもたらす生物体の遺伝子又は染色体の中のDNA配列の変化、又はこのような変化が染色体で生じるプロセス(遺伝子をコードしているDNAのヌクレオチド配列の変化によって又は染色体の物理的配列の変化によって染色体に存在するプロセスを意味する。変異の3つの機序には、置換(位置塩基対を他の塩基対に交換)、付加(1つ以上の塩基を配列へ挿入)、及び欠失(1つ以上の塩基対の欠損)が含まれる。
(0080)用語「突然変異体」及び「変異体」は、基準ヌクレオチド配列に実質的に同一のヌクレオチド配列を意味するように本明細書において同じ意味で用いられている。配列の相違は、自然に又は意図的に、配列又は構造の変化の結果によるものであり得る。自然の変化は、特定の核酸配列の正常な複製又は重複過程で天然に起こり得る。設計された変化は、特定の目的のための配列に特に設計され且つ導入され得る。このような特定の変化は、種々の技術を用いて生体外でなされ得る。
(0081)本明細書に用いられる用語「医薬組成物」は、医薬生成物、薬剤、代謝産物、又は有効成分を含む製剤を意味する。
(0082)本明細書に用いられる用語「治療する」には、病気の進行を抑止し、実質的に阻止し、遅らせるか又は逆転させるか、又は病気の臨床症状を実質的に回復させるか、又は病気の臨床症状の出現を実質的に予防することが含まれる。治療するは、更に、下記の1つ以上を達成することを意味する: (a)障害の重症度を軽減させること; (b)治療している障害(1つ以上)に特有の症状の発症を制限すること; (c)治療している障害(1つ以上)に特有の症状の悪化を制限すること; (d)障害(1つ以上)を以前にもっていた患者において障害(1つ以上)の再発を制限すること; 及び(e)障害(1つ以上)が以前には無症候性であった患者において症状の再発を制限すること。本明細書で用いられる用語「状態」は、種々の健康状態を表し、短縮型APCタンパクが発現されている基礎にある任意の機序又は障害によって引き起こされる障害又は疾患が含まれることを意味する。それを必要としている被検者は、APC変異に関連した障害をもつ、又はAPC変異に関連した障害をもつリスクがある患者である。
化合物
(0083)一態様によれば、記載されている発明は、式Ｉの低分子抗がん化合物を提供する:
(式Ｉ)
(式中:
(0084)Y1及びY2は、各々独立して、CH又はNであり;
(0085)Lは、SO2、CO、CH2、又はCHMeであり;
(0086)X2は、CH2、CHR2、NR3、O、Sからなる群より選ばれ;
(0087)X1は、CH2、CHR4、NR5、O、Sからなる群より選ばれ;
(0088)n = 0、1、2
(0089)R1及びR2は、各々独立して、H、C1-4アルキル、C1-4アルケニル、C1-4アルキニル、CH2アリール、CH2ヘテロアリールからなる群より選ばれ
(0090)R3、R4及びR5は、各々独立して、C1-6アルキル; C1-6シクロアルキル、C1-6アルケニル、C1-6アルキニル、アリール、ヘテロアリール、CH2アリール、CH2ヘテロアリールからなる群より選ばれ;
(0091)R3はその他の環原子の1つにメチレン橋又はエチレン橋を形成することができるので、二環式環構造を与え;
(0092)Lに接続しているRingは、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、縮合シクロアルキルアリール、縮合ヘテロシクリルアリール、縮合アリールヘテロシクリル、縮合シクロアルキルヘテロアリール、縮合ヘテロシクリルヘテロアリール、縮合ヘテロアリールヘテロシクリルであることができ;
(0093)ここで、立体中心が存在するときは、光学活性異性体を含めてすべての可能な立体異性体が含まれる)。
(0094)式Iの例示的な低分子抗がん化合物は、表A(SAR)に見られる。立体中心が存在するときは、光学活性異性体を含めてすべての可能な立体異性体が含まれる。
(0095)一実施態様によれば、記載されている発明は式I-aの低分子抗がん化合物を提供する:
(式I-a)
(式中:
(0096)Y1及びY2は、各々独立して、CH又はNであり;
(0097)Lは、SO2、CO、CH2、又はCHMeであり;
(0098)X1は、CH2、CHR4、NR5、O、Sからなる群より選ばれ;
(0099)R1及びR2は、各々独立して、H又はMeであり;
(0100)R4及びR5は、各々独立して、C1-6アルキル; C1-6シクロアルキル、C1-6アルケニル、C1-6アルキニル、アリール、ヘテロアリール、CH2アリール、CH2ヘテロアリールからなる群より選ばれ;
(0101)Lに接続しているRingは、アリール、ヘテロアリール、縮合ヘテロシクリルアリールであることができ;
(0102)ここで、立体中心が存在するときは、光学活性異性体を含めてすべての可能な立体異性体が含まれる)。
(0103)他の実施態様によれば、記載されている発明は、式I-bの低分子抗がん化合物を提供する:
(式I-b)
(式中:
(0104)Lは、SO2、CO、CH2、又はCHMeであり
(0105)R1及びR2は、各々独立して、H又はMeであり;
(0106)R4は、C1-6アルキル; C1-6アルキニル、アリール、CH2アリールからなる群より選ばれ;
(0107)Lに接続しているRingは、アリール、ヘテロアリール、縮合ヘテロシクリルアリールであることができ;
(0108)ここで、立体中心が存在するときは、光学活性異性体を含めてすべての可能な立体異性体が含まれる)。
(0109)他の実施態様によれば、記載されている発明の低分子抗がん化合物は、式I-cによって表される:
(式I-c)
(式中:
(0110)Lは、SO2、CH2、又はCHMeであり;
(0111)Lに接続しているRingは、アリール、ヘテロアリール、縮合ヘテロシクリルアリールであることができ;
(0112)ここで、立体中心が存在するときは、光学活性異性体を含めてすべての可能な立体異性体が含まれる)。
(0113)他の実施態様によれば、記載されている発明の低分子抗がん化合物は、式I-dによって表される:
(式I-d)
(式中:
(0114)Lは、SO2、CH2、又はCHMeであり;
(0115)R4は、C1-6アルキル; C1-6アルキニル、アリール、CH2アリールからなる群より選ばれ;
(0116)Lに接続しているRingは、アリール、ヘテロアリール、縮合ヘテロシクリルアリールであることができ;
(0117)ここで、立体中心が存在するときは、光学活性異性体を含めてすべての可能な立体異性体が含まれる)。
(0118)他の実施態様によれば、記載されている発明の低分子抗がん化合物は、式I-eによって表される:
(式I-e)
(式中:
(0119)R1及びR2は、各々独立して、H又はMeであり;
(0120)R4は、H、Me、プロパルギル、イソプロピル、シクロプロピル、CH2アリールからなる群より選ばれ;
(0121)R6-10は、各々独立して、H、F、Cl、Br、Me、Et、CF3、シクロプロピル、イソプロピル、tert-ブチル、アリール、OMe、OCF3、OCHF2、Oアリール、CN、N3、COアリール、CO2H、CO2R、CHO、CONH2、CONR2、CONHRからなる群より選ばれる。この項に関連して、Rは、独立して、H、C1-4アルキル、C1-4シクロアルキル、アリール、CH2アリール、CH2ヘテロアリールからなる群より選ばれ;
(0122)ここで、立体中心が存在するときは、光学活性異性体を含めてすべての可能な立体異性体が含まれる)。
(0123)式I-eによって表される低分子抗がん化合物の一実施態様によれば、R1及びR2は、各々独立して、H又はMeであり; R4は、H、Me、プロパルギル、イソプロピル、シクロプロピル、CH2アリールより選ばれ; R6-10は、各々独立して、H、F、Cl、Br、Me、Et、CF3、シクロプロピル、イソプロピル、アリール、OMe、OCF3、OCHF2、Oアリールより選ばれる;
(0124)式I-eによって表される低分子抗がん化合物の他の実施例によれば、R1及びR2は、各々独立して、H又はMeであり; R4は、H、Me、プロパルギル、イソプロピル、シクロプロピル、CH2アリールより選ばれ; R6はアリールであり、R7-10は、各々独立して、H、F、Cl、CF3、Me、シクロプロピル、イソプロピル、OMe、OCF3、OCHF2より選ばれる;
(0125)式I-eによって表される低分子抗がん化合物の他の実施態様によれば、R1及びR2は、各々独立して、H又はMeであり; R4は、H、Me、プロパルギル、イソプロピル、シクロプロピル、CH2アリールより選ばれ; R7はアリールであり、R6、R8、R9及びR10は、各々独立して、H、F、Cl、CF3、Me、シクロプロピル、イソプロピル、OMe、OCF3、OCHF2より選ばれる;
(0126)式I-eによって表される低分子抗がん化合物の他の実施態様によれば、R1及びR2は、各々独立して、H又はMeであり; R4は、H、Me、プロパルギル、イソプロピル、シクロプロピル、CH2アリールより選ばれ; R8は、アリールであり、 R6、R7、R9及びR10は、各々独立して、H、F、Cl、CF3、Me、シクロプロピル、イソプロピル、OMe、OCF3、OCHF2より選ばれる;
(0127)式I-eによって表される低分子抗がん化合物の他の実施態様によれば、R1及びR2は、各々独立して、H又はMeであり; R4は、H、Me、プロパルギル、イソプロピル、シクロプロピル、CH2アリールより選ばれ; R7は、COアリールであり、R6、R8、R9及びR10は、各々独立して、H、F、Cl、CF3、Me、シクロプロピル、イソプロピル、OMe、OCF3、OCHF2より選ばれる;
(0128)他の実施態様によれば、記載されている発明の低分子抗がん化合物は、式I-fによって表される:
(式I-f)
(式中:
(0129)Y1及びY2は、各々独立して、CH又はNであり;
(0130)R1及びR2は、各々独立して、H又はMeであり;
(0131)R4は、C1-6アルキル; C1-6シクロアルキル、C1-6アルケニル、C1-6アルキニル、CH2アリールからなる群より選ばれ;
(0132)R11及びR12は、各々独立して、H、F、Cl、Br、Me、CF3、シクロプロピル、アリール、ヘテロアリールより選ばれ;
(0133)ここで、立体中心が存在するときは、光学活性異性体を含めてすべての可能な立体異性体が含まれる)。
(0134)式I-fによって表される低分子抗がん化合物の実施態様によれば、Y1は、CHであり; Y2は、Nであり; R1及びR2は、各々独立して、H又はMeであり; R4は、H、Me、プロパルギル、イソプロピル、シクロプロピル、CH2アリールより選ばれ; R11は、H、Me、CF3、シクロプロピル、アリールであり; R12は、H、F、Cl、CF3、アリールより選ばれる;
化学置換基及び立体化学
(0135)本明細書に用いられる用語「脂肪族」は、成分炭素原子の直鎖-又は分枝鎖-配置を示し、飽和であるパラフィン(アルカン)、不飽和であるオレフィン(アルケン又はアルカジエン)、及び三重結合を含有するアセチレン(アルキン)が含まれるがこれらに限定されない。複雑な構造において、鎖は、分枝であっても架橋であってもよい。
(0136)本明細書に用いられる用語「低級」は、1と6個の間の炭素を有する基を意味する。
(0137)本明細書に用いられる用語「アルキル」は、1から25個までの炭素原子を有するか、又は指定された炭素原子の数(例えばC1-6アルキル)又はこれの範囲内の任意の数の直鎖又は分枝鎖炭化水素を意味する。このようなアルキル基がハロゲン、ペルフルオロアルキル、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、低級シクロアルキル、低級アルコキシ、低級シクロアルコキシ、低級アルキルスルファニル、オキソ、ヒドロキシルに限定されない置換基で置換されてもよいことが本出願の関連の範囲内で暗黙に意味する。本明細書に用いられる「アルキル」の例としては、メチル、トリフルオロメチル、エチル、プロピル、n-ブチル、t-ブチル、n-ペンチル、イソブチル、及びイソプロピル、メトキシメチル、メトキシエチル、イソプロポキシブチル、プロピニルオキシエチル等が挙げられるがこれらに限定されない。
(0138)本明細書に用いられる用語「アルケニル」は、その中に1つ以上の二重結合を有する一価の直鎖(非分枝鎖)又は分枝鎖炭化水素を意味し、二重結合が他の不飽和基(例えば、ポリ不飽和アルケニル)に非共役又は共役であることができ、置換されていないか又は置換されていることができ、多置換度が許容されている。アルケニルは、ハロゲン、ペルフルオロアルキル、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、低級シクロアルキル、低級アルコキシ、低級シクロアルコキシ、低級アルキルスルファニル、オキソ、ヒドロキシルのようなこれらに限定されない置換基で置換されていてもよい。例えば、限定されるものではないがアルケニルは、ビニル、アリル、ブテニル、ペンテニル、ヘキシニル、ブタジエニル、ペンタジエニル、ヘキサジエニル、2-エチルヘキセニル、2-プロピル-2-ブテニル、4-(2-メチル-3-ブテン)-ペンテニル、6-メトキシヘキシニル、2-トリフルオロメチル-3-ブテニル等であり得る。
(0139)本明細書に用いられる用語「アルキニル」は、ハロゲン、ペルフルオロアルキル、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、低級シクロアルキル、低級アルコキシ、低級シクロアルコキシ、低級アルキルスルファニル、オキソ、ヒドロキシルのようなこれらに限定されない置換基で置換されていてもよい、少なくとも1つの炭素-炭素三重結合を有する炭化水素基を意味する。
(0140)本明細書に用いられる用語「アリール」は、ベンゼン環又は多置換度が許容される、置換されていてもよい1つ以上のベンゼン環に縮合された置換されていてもよいベンゼン環系を意味する。置換基としては、シアノ、ハロゲン、ペルフルオロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルキルスルファニル、オキソ、ヒドロキシ、アルキル又はアリール又はヘテロアリール又はヘテロシクリル又はシクロアルキルによって置換されていてもよいアミノ、アルキル又はアリール又はヘテロアリール又はヘテロシクリル又はシクロアルキルによって置換されていてもよいアミノカルボニル(-NRC(O)R)、カルボキシ、アシル、アシルオキシ、アルコキシカルボニル、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリルオキシ、アロイルオキシ、ヘテロアロイルオキシ、ヘテロシクロイルオキシ、アルキル又はシクロアルキル又はアリール又はヘテロアリール又はヘテロシクリルによって置換されていてもよいカルバモイル、アルキル又はシクロアルキル又はアリール又はヘテロアリール又はヘテロシクリルによって置換されていてもよいアミノスルホニルが挙げられるがこれらに限定されない。アリールの例としては、フェニル、2-ナフチル、1-ナフチル、1-アントラセニル等が挙げられるがこれらに限定されない。
(0141)用語「アルキル」又は「アリール」又はこれらの接頭語語根のいずれもが置換基の名称で記載されている場合は、アルキル及びアリールに対して上で示した制限が含まれると解釈されることは理解すべきである。指定された炭素原子数(例えばC1-10)は、独立して、アルキル、アルケニル又はアルキニル又は環状アルキル部分における炭素原子数又は用語「アルキル」がその接頭語語根として記載されているより大きい置換基のアルキル部分を意味する。
(0142)本明細書に用いられる「シクロアルキル」(本明細書に「脂肪族環状」と同じ意味で用いられる)は、ハロゲン、ペルフルオロアルキル、シクロアルキル、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルキルスルファニル、オキソ、ヒドロキシルのようなこれらに限定されない置換基で置換されていてもよい、合計3から10個までの炭素環原子を有する(ヘテロ原子がない)1つ以上の不飽和度を有してもよい一価の非芳香族の単環式又は多環式環構造を意味する。「シクロアルキル」としては、一例としてシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、アダマンタニル、ノルボルニル、ノルボルネニル、シクロヘプチル、又はシクロオクチル等が挙げられる。
(0143)本明細書に用いられる用語「複素環」及び「複素環式」は、多置換度が許容される、ニトロ、シアノ、ハロゲン、ペルフルオロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルキルスルファニル、低級アルキルスルフェニル、低級アルキルスルホニル、オキソ、ヒドロキシ、メルカプト、アルキル又はアリール又はヘテロアリール又はヘテロシクリル又はシクロアルキルによって置換されていてもよいアミノ、アルキル又はアリール又はヘテロアリール又はヘテロシクリル又はシクロアルキルによって置換されていてもよいアミノカルボニル(-NRC(O)R)、カルボキシ、アシル、アシルオキシ、アルコキシカルボニル、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリルオキシ、アロイルオキシ、ヘテロアロイルオキシ、ヘテロシクロイルオキシ、アルキル又はシクロアルキル又はアリール又はヘテロアリール又はヘテロシクリルによって置換されていてもよいカルバモイル、アルキル又はシクロアルキル又はアリール又はヘテロアリール又はヘテロシクリルによって置換されていてもよいアミノスルホニル、アルキル又はアリールによって置換されていてもよいシリルオキシ、アルコキシ又はアルキル又はアリールによって置換されていてもよいシリルが含まれるがこれらに限定されない置換基で置換されていてもよく、-S-、-SO-、-SO2-、-O-、又は-N-より選ばれる1つ以上のヘテロ原子置換を含有する、1つ以上の不飽和度を有してもよい3員〜12員複素環式環を意味するために同じ意味で用いられる。このような環は、他の「複素環式」環(1つ以上)の1つ以上に縮合されていてもよい。「複素環式」の例としては、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、3-ピロリン、ピロリジン、ピリジン、ピリミジン、プリン、キノリン、イソキノリン、カルバゾール、テトラヒドロフラン、1,4-ジオキサン、1,3-ジオキサン、ピペリジン、ピロリジン、モルホリン、ピペラジン等が挙げられるがこれらに限定されない。
(0144)複素環の例としては、ピリジル、チアゾリル、テトラヒドロチオフェニル、硫黄酸化テトラヒドロチオフェニル、ピリミジニル、フラニル、チエニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、テトラゾリル、ベンゾフラニル、チアナフタレニル、インドリル、インドレニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンズイミダゾリル、ピペリジニル、4-ピペリドニル、ピロリジニル、2-ピロリドニル、ピロリニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オクタヒドロイソキノリニル、アゾシニル、トリアジニル、6H-1,2,5-チアジアジニル、2H,6H-1,5,2-ジチアジニル、チエニル、チアントレニル、ピラニル、イソベンゾフラニル、クロメニル、キサンテニル、フェノキサチイニル、2H-ピロリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、インドリジニル、イソインドリル、3H-インドリル、1H-インダゾリル、プリニル、4H-キノリジニル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、プテリジニル、4aH-カルバゾリル、カルバゾリル、ベータ-カルボリニル、フェナントリジニル、アクリジニル、ピリミジニル、フェナントロリニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フラザニル、フェノキサジニル、イソクロマニル、クロマニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペラジニル、インドリニル、イソインドリニル、キヌクリジニル、モルホリニル、オキサゾリジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンズイソキサゾリル、オキシインドリル、ベンゾキサゾリニル及びイサチノイルが挙げられるがこれらに限定されない。
(0145)本明細書に用いられる用語「ヘテロアリール」は、多置換度が許容される、ニトロ、シアノ、ハロゲン、ペルフルオロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルキルスルファニル、低級アルキルスルフェニル、低級アルキルスルホニル、オキソ、ヒドロキシ、メルカプト、アルキル又はアリール又はヘテロアリール又はヘテロシクリル又はシクロアルキルによって置換されていてもよいアミノ、アルキル又はアリール又はヘテロアリール又はヘテロシクリル又はシクロアルキルによって置換されていてもよいアミノカルボニル(-NRC(O)R)、カルボキシ、アシル、アシルオキシ、アルコキシカルボニル、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリルオキシ、アロイルオキシ、ヘテロアロイルオキシ、ヘテロシクロイルオキシ、アルキル又はシクロアルキル又はアリール又はヘテロアリール又はヘテロシクリルによって置換されていてもよいカルバモイル、アルキル又はシクロアルキル又はアリール又はヘテロアリール又はヘテロシクリルによって置換されていてもよいアミノスルホニル、アルキル又はアリールによって置換されていてもよいシリルオキシ、アルコキシ又はアルキル又はアリールによって置換されていてもよいシリルが含まれるがこれらに限定されない置換基で置換されてもよく、N-オキシド及び一酸化硫黄及び二酸化硫黄が許容できるヘテロ芳香族置換である場合、1つ以上の窒素、酸素又は硫黄ヘテロ原子を含有する、5員〜7員芳香環、又は多環複素環式芳香環を意味する。多環芳香環系に対しては、環の1つ以上が1つ以上のヘテロ原子を含有することができる。本明細書に用いられる「ヘテロアリール」の例は、フラン、チオフェン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、トリアゾール、テトラゾール、チアゾール、オキサゾール、イソキサゾール、オキサジアゾール、チアジアゾール、イソチアゾール、ピリジン、ピリダジン、ピラジン、ピリミジン、キノリン、イソキノリン、キナゾリン、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、インドール、及びインダゾール等である。
(0146)本明細書に用いられる用語「縮合シクロアルキルアリール」は、アリール基に縮合されたシクロアルキル基を意味し、これらの2つは共通の2つの原子を有し、アリール基が置換点である。本明細書に用いられる「縮合シクロアルキルアリール」の例としては、5-インダニル、5,6,7,8-テトラヒドロ-2-ナフチル、
等が挙げられるがこれらに限定されない。
(0147)本明細書に用いられる用語「縮合アリールシクロアルキル」は、シクロアルキル基に縮合されたアリール基を意味し、これらの2つは共通の2つの原子を有し、シクロアルキル基が置換点である。本明細書に用いられる「縮合アリールシクロアルキル」の例としては、1-インダニル、2-インダニル、1-(1,2,3,4-テトラヒドロナフチル)、
等が挙げられるがこれらに限定されない。
(0148)本明細書に用いられる用語「縮合ヘテロシクリルアリール」は、アリール基に縮合されたヘテロシクリル基を意味し、これらの2つは共通の2つの原子を有し、アリール基が置換点である。本明細書に用いられる「縮合ヘテロシクリルアリール」の例としては、3,4-メチレンジオキシ-1-フェニル、
等が挙げられるがこれらに限定されない。
(0149)本明細書に用いられる用語「縮合アリールヘテロシクリル」は、ヘテロシクリル基に縮合されたアリール基を意味し、これらの2つは共通の2つの原子を有し、ヘテロシクリル基が置換点である。本明細書に用いられる「縮合アリールヘテロシクリル」の例としては、2-(1,3-ベンゾジオキソリル)、
等が挙げられるがこれらに限定されない。
(0150)本明細書に用いられる用語「縮合シクロアルキルヘテロアリール」は、ヘテロアリール基に縮合されたシクロアルキル基を意味し、これらの2つは共通の2つの原子を有し、ヘテロアリール基が置換点である。本明細書に用いられる「縮合シクロアルキルヘテロアリール」の例としては、5-アザ-6-インダニル、
等が挙げられるがこれらに限定されない。
(0151)本明細書に用いられる用語「縮合ヘテロアリールシクロアルキル」は、シクロアルキル基に縮合されたヘテロアリール基を意味し、これらの2つは共通の2つの原子を有し、シクロアルキル基が置換点である。本明細書に用いられる「縮合ヘテロアリールシクロアルキル」の例としては、5-アザ-1-インダニル、
等が挙げられるがこれらに限定されない。
(0152)本明細書に用いられる用語「縮合ヘテロシクリルヘテロアリール」は、ヘテロアリール基に縮合されたヘテロシクリル基を意味し、これらの2つは共通の2つの原子を有し、ヘテロアリール基が置換点である。本明細書に用いられる「縮合ヘテロシクリルヘテロアリール」の例としては、1,2,3,4-テトラヒドロ-β-カルボリン-8-イル、
等が挙げられるがこれらに限定されない。
(0153)本明細書に用いられる用語「縮合ヘテロアリールヘテロシクリル」は、ヘテロシクリル基に縮合されたヘテロアリール基を意味し、これらの2つは共通の2つの原子を有し、ヘテロシクリル基が置換点である。本明細書に用いられる「縮合ヘテロアリールヘテロシクリル」の例としては、-5-アザ-2,3-ジヒドロベンゾフラン-2-イル、
等が挙げられるがこれらに限定されない。
(0154)本明細書に用いられる用語「直接結合」は、構造可変部分指定の一部の場合、「直接結合」として用いられた可変部分に隣接する(前と後の)置換基の直接結合を意味する。
(0155)本明細書に用いられる用語「O-結合部分」は、酸素原子によって結合される部分を意味する。従って、R基がO-結合部分である場合、そのRは酸素によって結合されるので、エーテル、エステル(例えば、--O--C(O)-置換されていてもよいアルキル)、カーボネート又はカルバメート(例えば、--O--C(O)--NH2又は---O--C(O)--NH-置換されていてもよいアルキル)であり得る。同様に、用語「S-結合部分」は、硫黄原子によって結合される部分を意味する。従って、R基がS-結合部分である場合、そのRは硫黄によって結合されるので、チオエーテル(例えば、--S-置換されていてもよいアルキル)、チオエステル(--S--C(O)-置換されていてもよいアルキル)又はジスルフィド(例えば、--S--S-置換されていてもよいアルキル)であり得る。用語「N-結合部分」は、窒素原子によって結合される部分を意味する。従って、R基がN-結合部分である場合、R基は窒素によって結合されるので、これらの1つ以上は--NH--CH2--COOHのようなN-結合アミノ酸、--NH--C(O)--O-置換されていてもよいアルキルのようなカルバメート、--NH-置換されていてもよいアルキルのようなアミン、--NH--C(O)-置換されていてもよいアルキル又は--N3のようなアミドであり得る。用語「C-結合部分」は、炭素原子によって結合される部分を意味する。1つ以上のR基が炭素によって結合される場合には、これらの1つ以上は--CH2--CH2--O--CH3のような-置換されていてもよいアルキル、--C(O)-置換されていてもよいアルキルヒドロキシアルキル、メルカプトアルキル、アミノアルキル又は=CH-置換されていてもよいアルキルであり得る。
(0156)本明細書に用いられる用語「アルコキシ」は、基RaO-(ここで、Raはアルキルである)を意味する。
(0157)本明細書に用いられる用語「アルケニルオキシ」は、基RaO-(ここで、Raはアルケニルである)を意味する。
(0158)本明細書に用いられる用語「アルキニルオキシ」は、基RaO-(ここで、Raはアルキニルである)を意味する。
(0159)本明細書に用いられる用語「アルキルスルファニル」は、基RaS-(ここで、Raはアルキルである)を意味する。
(0160)本明細書に用いられる用語「アルケニルスルファニル」は基RaS-(ここで、Raはアルケニルである)を意味する。
(0161)本明細書に用いられる用語「アルキニルスルファニル」は、基RaS-(ここで、Raはアルキニルである)を意味する。
(0162)本明細書に用いられる用語「アルキルスルフェニル」は、基RaS(O)-(ここで、Raはアルキルである)を意味する。
(0163)本明細書に用いられる用語「アルケニルスルフェニル」は、基RaS(O)-(ここで、Raはアルケニルである)を意味する。
(0164)本明細書に用いられる用語「アルキニルスルフェニル」は、基RaS(O)-(ここで、Raはアルキニルである)を意味する。
(0165)本明細書に用いられる用語「アルキルスルホニル」は、基RaSO2-(ここで、Raはアルキルである)を意味する。
(0166)本明細書に用いられる用語「アルケニルスルホニル」は、基RaSO2-(ここで、Raはアルケニルである)を意味する。
(0167)本明細書に用いられる用語「アルキニルスルホニル」は、基RaSO2-(ここで、Raはアルキニルである)を意味する。
(0168)本明細書に用いられる用語「アシル」は、基RaC(O)-(ここで、Raはアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、又はヘテロシクリルである)を意味する。
(0169)本明細書に用いられる用語「アロイル」は、基RaC(O)-(ここで、Raはアリールである)を意味する。
(0170)本明細書で用いられる用語「ヘテロアロイル」は、基RaC(O)-(ここで、Raはヘテロアリールである)を意味する。
(0171)本明細書に用いられる用語「ヘテロシクロイル」は、基RaC(O)-(ここで、Raはヘテロシクリルである)を意味する。
(0172)本明細書に用いられる用語「アルコキシカルボニル」は、基RaOC(O)-(ここで、Raはアルキルである)を意味する。
(0173)本明細書に用いられる用語「アシルオキシ」は、基RaC(O)O-(ここで、Raはアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、又はヘテロシクリルである)を意味する。
(0174)本明細書に用いられる用語「アロイルオキシ」は、基RaC(O)O-(ここで、Raはアリールである)を意味する。
(0175)本明細書に用いられる用語「ヘテロアロイルオキシ」は、基RaC(O)O-(ここで、Raはヘテロアリールである)を意味する。
(0176)本明細書に用いられる用語「ヘテロシクロイルオキシ」は、基RaC(O)O-(ここで、Raはヘテロシクリルである)を意味する。
(0177)本明細書に用いられる用語「置換された」は、命名された置換基又は置換基群による置換を意味し、特に明記されない限り多置換度が許容される。
(0178)本明細書に用いられる用語「含有する」又は「含有している」は、例えば、-CH2-O-CH2、-CH2-SO2-CH2、-CH2-NH-CH3等が含まれる、O、S、SO、SO2、N、又はN-アルキルのいずれかの1つ以上による上で定義されたアルキル、アルケニル、アルキニル又はシクロアルキル置換基に沿って任意の位置でインライン置換を意味する。
(0179)本明細書に用いられる用語「オキソ」は、置換基=Oを意味する。
(0180)本明細書に用いられる用語「ハロゲン」又は「ハロ」には、ヨウ素、臭素、塩素及びフッ素が含まれる。
(0181)本明細書に用いられる用語「メルカプト」は、置換基-SHを意味する。
(0182)本明細書に用いられる用語「カルボキシ」は、置換基-COOHを意味する。
(0183)本明細書に用いられる用語「シアノ」は、置換基-CNを意味する。
(0184)本明細書に用いられる用語「アミノスルホニル」は、置換基-SO2NH2を意味する。
(0185)本明細書に用いられる用語「カルバモイル」は、置換基-C(O)NH2を意味する。
(0186)本明細書に用いられる用語「スルファニル」は、置換基-S-を意味する。
(0187)本明細書に用いられる用語「スルフェニル」は、置換基-S(O)-を意味する。
(0188)本明細書に用いられる用語「スルホニル」は、置換基-S(O)2-を意味する。
(0189)本明細書に用いられる用語「エトキシ」は、置換基-O-CH2CH3を意味する。
(0190)本明細書に用いられる用語「メトキシ」は、置換基-O-CH3を意味する。
(0191)本明細書に用いられる用語「してもよい」は、引き続き記載されている事象(1つ以上)が起こっても起こらなくてもよいことを意味し、起こる事象(1つ以上)と起こらない事象双方が含まれる。
(0192)構造式I及び構造式Ia〜fの化合物は、1つ以上の不斉中心を含有してもよいので、ラセミ化合物及びラセミ混合物、単一エナンチオマー、ジアステレオマー混合物及び個々のジアステレオマーとして存在し得る。本発明は、構造式I及び構造式Ia〜fの化合物のこのようなすべての異性体を包含することを意味する。
(0193)構造式I及び構造式Ia〜fの化合物は、これらの個々のジアステレオ異性体に、例えば、適切な溶媒、例えばメタノール又は酢酸エチル又はこれらの混合物から分別結晶によって、又は光学活性固定相を用いたキラルクロマトグラフィによって分離することができる。無水立体化学は、誘導体化される結晶性生成物又は結晶性中間体のX線結晶学によって、必要ならば、既知の絶対配置の不斉中心を含有する試薬によって定量され得る。
(0194)或いは、一般構造式I及び一般構造式Ia〜fの化合物の任意の立体異性体は、既知の絶対配置の光学的に純粋な出発材料又は試薬を用いた立体特異的合成によって得られてもよい。
(0195)所望により、個々のエナンチオマーが分離されるように化合物のラセミ混合物が分離されてもよい。分離は、当該技術において周知の方法、例えば化合物のラセミ混合物を鏡像異性的に純粋な化合物にカップリングして、ジアステレオマー混合物を形成し、続いて個々のジアステレオマーを標準法、例えば分別結晶又はクロマトグラフィによって分離することによって行われ得る。カップリングは、鏡像異性的に純粋な酸又は塩基を用いて塩をしばしば形成する。次に、ジアステレオマー誘導体は、添加したキラル残留物の切断によって純粋なエナンチオマーに変換され得る。化合物のラセミ混合物は、また、キラル固定相を用いてクロマトグラフィ方法によって直接分離することができ、この方法は当該技術において周知である。
(0196)本明細書に記載されている化合物の一部は、オレフィン二重結合を含有し、特に断わらない限り、EとZ双方の幾何異性体を含むものとする。
(0197)本明細書に記載されている化合物の一部は、互変異性体として存在することができ、これは1つ以上の二重結合シフトを伴う水素の異なる結合点を有する。例えば、ケトンとそのエノール形は、ケト-エノール互変異性体である。個々の互変異性体だけでなくその混合物は、本発明の化合物に包含されている。
(0198)一般式I及び一般式Ia〜fの化合物において、原子はその天然同位体存在度を示すことができるか、又は原子の1つ以上は同じ原子番号を有する特定の同位体が人工的に強化されるが、原子質量又は質量数と異なる原子質量又は質量数が主に天然に見られる。本発明は、一般的式Ｉ及び一般式Ia〜gの化合物のすべての適切な同位体変化が含まれることを意味する。例えば、水素(H)の異なる同位体形には、プロチウム(1H)及びジュウテリウム(2H)が含まれる。プロチウムは、天然に見られる主な水素同位体である。ジュウテリウムに対する強化は、ある種の治療利点、例えば生体内半減期の増加又は用量要求の低減をもたらすことができ、生体試料の確認のための基準として有用な化合物を与えることもできる。一般式I及び一般式Ia〜fの範囲内の同位体的に強化した化合物は、当業者に周知の慣用の技術によって又は適切な同位体的に強化した試薬及び/又は中間体を用いてスキームと実施例に記載されているものと同様のプロセスによって過度の実験を含めずに調製することができる。
(0199)本明細書に用いられる構造式I及び構造式Ia〜fの化合物の参照には、また、医薬的に許容され得る塩、更に遊離化合物又はその医薬的に許容され得る塩の前駆体として又は他の合成操作において用いられる場合に医薬的に許容され得ない塩が含まれるものであることが理解される。
組成物
(0200)他の態様によれば、記載されている発明は、低分子抗がん化合物及び医薬的に許容され得る担体の少なくとも1つを含む医薬組成物を提供する。
(0201)本明細書に用いられる用語「活性」は、薬理学的又は生物学的な活性又は働きかけを有することを意味する。用語「有効成分」(「AI」、「医薬有効成分」、又は「バルク活性」)は、医薬的に活性である薬剤中の物質である。
(0202)用語「製剤」及び「組成物」は、本明細書において同じ意味で用いられて、すべての活性成分及び不活性成分を含む記載されている発明の生成物を意味する。本明細書に用いられる用語「医薬製剤」又は「医薬組成物」は標的状態又は疾患を、予防するか、強さを低減させるか、治癒させるか、或いは治療するために使われる製剤又は組成物を意味する。
(0203)本明細書に用いられる用語「結合剤」は、粉末を一緒に結合するか又は「接着する」物質、また、顆粒を形成することによって粉末を粘着性にする物質を意味するので、製剤において「接着剤」として役に立っている。結合剤は、希釈液又は増量剤においてすでに利用可能な凝集力を加える。例示的な結合剤としては、糖、例えばスクロース; コムギ、トウモロコシ、イネ及びジャガイモから誘導されるデンプン; 天然ガム、例えばアラビアゴム、ゼラチン、トラガカント; 海藻の誘導体、例えばアルギン酸、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カルシウムアンモニウム; セルロース系材料、例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース; ポリビニルピロリドン; 及び無機物、例えばケイ酸アルミウニムマグネシウム) が挙げられる。組成物中の結合剤の量は、組成物の約2から約20質量%、より好ましくは約3から約10質量%、更により好ましくは約3から約6質量%までの範囲にあり得る。
(0204)本明細書に用いられる用語「バイオアベイラビリティ」は、活性薬剤成分又は治療部分が標準又は対照と比較して投与された剤形から体循環に吸収される速度と程度を意味する。
(0205)本明細書に用いられる用語「カプセル」は、有効成分を含む組成物を保持するか又は含有するためのメチルセルロース、ポリビニルアルコール、又は変性したゼラチン又はデンプンでできている特別な容器又はエンクロージャを意味する。硬シェルカプセルは、典型的には、比較的高いゲル強度骨と豚皮ゼラチンのブレンドでできている。カプセル自体は、少量の染料、不透明物質、可塑剤及び防腐剤を含有してもよい。
(0206)本明細書に用いられる用語「着色剤」は、組成物又は剤形を着色する賦形剤を意味する。このような賦形剤には、食品用染料及び粘土又は酸化アルミニウムのような例示的吸着剤上に吸着させた食品用染料が含まれ得る。着色剤の量は、組成物の約0.1から約5質量%まで、好ましくは約0.1から約1%まで異なり得る。
(0207)本明細書に用いられる用語「希釈剤」は、通常、組成物又は剤形の大部分を構成する物質を意味する。例示的な希釈剤としては、糖、例えばラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール; コムギ、トウモロコシ、イネ及びジャガイモから誘導されるデンプン; 及びセルロース、例えばミクロクリスタリンセルロースが挙げられる。組成物中の希釈剤の量は、合計組成物の約10から約90質量%、好ましくは約25から約75%まで、より好ましくは約30から約60質量%、更により好ましくは約12から約60%までの範囲にあり得る。
(0208)本明細書に用いられる用語「崩壊剤」は、それが離れて破壊する(崩壊する)とともに薬剤を放出するのを助けるために組成物に添加される材料を意味する。例示的な崩壊剤としては、デンプン;「冷水可溶性」の加工デンプン、例えばカルボキシメチルデンプンナトリウム; 天然及び合成のガム、例えばイナゴマメ、カラヤ、グアー、トラガカント、寒天; セルロース誘導体、例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム; ミクロクリスタリンセルロース及び架橋ミクロクリスタリンセルロース、例えばクロスカルメロースナトリウム; アルギン酸塩、例えばアルギン酸、アルギン酸ナトリウム; 粘土、例えばベントナイト; 及び発泡性混合物が挙げられる。組成物中の崩壊剤の量は、組成物の約2から約15質量%まで、より好ましくは約4から約10質量%までの範囲にあり得る。
(0209)本明細書に用いられる用語「流動促進剤」は、ケークとなることを防止し且つ造粒の流れ特性を改善するので、流れが平滑で一様である材料を意味する。例示的な流動促進剤としては、二酸化ケイ素及びタルクが挙げられる。組成物中の流動促進剤の量は、合計組成物の約0.1%から約5質量%、好ましくは約0.5から約2質量%までの範囲にあり得る。
(0210)本明細書に用いられる用語「滑沢剤」は、圧縮した後の錠剤、顆粒を摩擦又は摩耗を低減させることによってモールド又はダイから放出することを可能にする剤形に添加された物質を意味する。例示的な滑沢剤としては、金属ステアリン酸塩、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム又はステアリン酸カリウム; ステアリン酸; 高融点ワックス; 及び水溶性滑沢剤、例えば塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール及びd'l-ロイシンが挙げられる。滑沢剤は、通常、顆粒の表面上に及び顆粒の表面と錠剤成形機の部分との間に存在しなければならないので、圧縮の前のまさに最後の工程で添加される。組成物中の滑沢剤の量は、組成物の約0.2から約5質量%、好ましくは約0.5から約2%まで、より好ましくは約0.3から約1.5質量%までの範囲にあり得る。
(0211)本明細書に用いられる用語「経口ゲル」は、親水性半固体マトリックスに分散又は可溶化された有効成分を意味する。
(0212)本明細書に用いられる用語「錠剤」は、有効成分と適切な希釈剤とを含有する圧縮又は成形された固体剤形を意味する。錠剤は、湿性造粒、乾燥造粒又は圧密によって得られた混合物又は造粒の圧縮によって調製され得る。
(0213)本明細書に用いられる用語「治療量」は、望ましい生物学的効果を実現するのに必要な又は充分な低分子抗がん化合物の量を意味する。本明細書に示された教示と共に、種々の活性化合物の中で選択し且つ要因、例えば効力、相対的バイオアベイラビリティ、患者の体重、悪い副作用の程度及び好ましい投与方法を検討することによって、実質的な毒性を引き起こさず、特定の被検者を治療するのに効果的である有効な予防的又は治療的治療を計画することができる。いかなる特定の適用にも効果的な量は、治療されている疾患又は状態、具体的な記載されている化合物、被検者のサイズ、又は疾患又は状態の重症度のような要因によって異なってもよい。当業者は、具体的な記載されている化合物及び/又は他の治療薬の治療的に有効な量を過度の実験を必要とすることなく経験的に求めることができる。一般的には、最大投与量、すなわち、いくつかの医学的な判断に従って最も高い安全な投与量が用いられることが好ましい。「投与量」及び「用量」は、本明細書において同じ意味で用いられる。
(0214)本明細書に記載されている任意の化合物に対して、治療的に有効な量は予備的生体外実験及び/又は動物モデルから最初に求めることができる。治療的に有効な投与量は、一般構造I及び一般構造Ia〜fの化合物についてのヒトデータから求めることもできる。投与量は、投与された化合物の相対的バイオアベイラビリティ及び効力に基づいて調整され得る。上記の方法及び当該技術において周知である他の方法に基づく最大有効性を達成するように投与量を調整することは、当業者の能力の範囲内である。
(0215)阻害剤の製剤は、医薬的に許容され得る濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、適合する担体、補助剤を日常的に含有することができ、更に他の治療薬を含有してもよい、医薬的に許容され得る溶液で投与され得る。
(0216)他の実施態様によれば、記載されている発明の組成物には、更に、1つ以上の追加の適用できる有効成分が含まれ得る。本明細書に用いられる「適合する」は、このような組成物の成分が通常の使用条件下で組成物の有効性を実質的に低下させる相互作用がないような方法で相互に組み合わせることができることを意味する。本明細書に用いられる語句「追加の有効成分」は、薬理学的、又は他の任意の有益な活性を示す、記載されている組成物の抗がん化合物以外の薬剤を意味する。このような追加の治療薬の限定されない例としては、5-フルオロウラシル、ロイコボリン、オキサリプラチンカペシタビン、ロイコボリン、イリノテカン、カペシタビン、オキサリプラチン、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、又はこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。
医薬的に許容され得る担体
(0217)本明細書に用いられる用語「医薬的に許容され得る担体」は、ヒト又は他の脊椎動物に投与するのに例示的である1つ以上の適合する固体又は液体の充填剤、希釈剤又は封入物質を意味する。本明細書に用いられる用語「担体」は、有効成分が適用を容易にするために組み合わせられている天然又は合成の有機又は無機の成分を意味する。いくつかの実施態様によれば、担体は不活性であることもでき、薬効を有することもできる。
(0218)医薬組成物の成分もまた、望ましい医薬効率を実質的には損なう相互作用がないような方法で混ぜ合わせることができる。
(0219)所定の組成物の活性物質及びその他の成分と組み合わせる場合、担体は液体又は固体であることができ、望ましいバルク、コンシステンシー等を備えることを考慮して計画された投与方法で選ばれる。
投与
(0220)治療に用いるために、低分子抗がん化合物の治療量は、任意の方法によって被検者に投与され得る。医薬組成物を投与することは、当業者に既知の任意の手段によって達成され得る。投与経路としては、非経口経口、口腔、局所、吸入又はガス注入で(すなわち、口を通して又は鼻を通して)、又は直腸が挙げられるがこれらに限定されない。
(0221)本明細書に用いられる用語「非経口」は、注射によって体内に導入すること(すなわち、注射による投与)を意味し、例えば、皮下(すなわち、皮膚の下に注射)、筋肉内(すなわち、筋肉への注射); 静脈内(すなわち、静脈への注射剤)、くも膜下腔内(すなわち、脊髄のまわりの空間への注射剤)、胸骨内注射、又は注入技術が挙げられる。本発明の非経口投与組成物は、ニードル、例えば、外科用ニードルを用いて送達される。本明細書に用いられる用語「外科用ニードル」は、選ばれた解剖学的構造への本発明の流体(すなわち、流動可能な)組成物の送達のために適応された任意のニードルを意味する。注射用製剤、例えば滅菌注射用水性又は油性懸濁液は、例示的な分散剤又は湿潤剤及び沈殿防止剤を用いた既知の技術に従って製剤化され得る。
(0222)本発明の組成物は、滅菌注射用水性溶液又は油性懸濁液の形であり得る。溶液は、一般的には、2個以上の物質の均質混合物とみなされ; 溶液は、しばしば、しかし必ずではなく、液体である。溶液において、溶質(又は溶解した物質)の分子は、溶媒の分子の中で一様に分配される。懸濁液は、細かく分けられた化学種が他の化学種と組み合わせられている分散液であり、懸濁液は急速に沈降しないほど細かく分けられ且つ混合されている。本明細書に用いられる用語「分散液」は、2相系を意味し、1つの相が第2又は連続相の粒子又は液滴として分配されている。これらの系において、分散相はしばしば不連続相又は内相と呼ばれ、連続相は外相又は分散媒体と呼ばれている。例えば、粗大分散液における粒子サイズは0.5mmである。コロイド分散液において、分散した粒子のサイズは、約1nmから0.5mmまでの範囲にある。分子分散液は、分散した相が個々の分子からなる分散であり; 分子がコロイドサイズ未満である場合には、結果は真溶液である。
(0223)記載されている発明の組成物は、また、エマルジョンの形であり得る。エマルジョンは、2つの不混和性液体担体を併用することによって調製される二相系であり、一方がもう一方全体にわたって一様に分散され且つ最大のコロイド粒子に等しいか又は大きい直径を有する小球からなっている。小球サイズは重要であり、系が最大安定性を達成するようなものでなければならない。通常、第3の物質、乳化剤が組み込まれない限り2相の分離は発生しない。従って、基本的なエマルジョンは、少なくとも3つの成分、その2つが不混和性液体担体及び乳化剤、並びに有効成分を含有する。ほとんどのエマルジョンは、水相を非水相に組み込んでいる(又はその逆)。しかしながら、基本的に非水性であるエマルジョン、例えば、非水性不混和系グリセリンやオリーブ油のアニオン界面活性剤やカチオン界面活性剤を調製することが可能である。従って、本発明の組成物は、水中油エマルジョンの形であってもよい。油相は、植物性油、例えば、オリーブ油又はラッカセイ油、又は鉱油、例えば流動パラフィン、又はこれらの混合物であり得る。例示的な乳化剤は、天然に存在するガム、例えば、アラビアゴム又はトラガカントゴム、天然に存在するリン脂質、例えば大豆、レシチン、及び脂肪酸とヘキシトール無水物から誘導されるエステル又は部分エステル、例えばソルビタンモノオレエート、及び部分エステルとエチレンオキシドの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであり得る。
(0224)いくつかの実施態様によれば、組成物は、ボーラス注射又は連続注入によって非経口投与用に製剤化され得る。注射用製剤は、防腐剤を添加した単位剤形、例えば、アンプル又は多回容器で存在してもよい。組成物は、油性又は水性中の懸濁液、溶液又はエマルジョンのような形態を取ることができ、沈殿防止剤、安定化剤及び/又は分散剤のような配合剤を含有することができる。非経口投与用医薬製剤には、水溶性形態の活性化合物の水溶液が含まれる。更に、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製されてもよい。例示的な親油性溶媒又は賦形剤としては、脂肪油、例えばゴマ油、又は合成脂肪酸エステル、例えばエチルオレエート又はトリグリセリド、又はリポソームが挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加する物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデキストランを含有してもよい。懸濁液は、また、高濃度溶液の調製を可能にする化合物の溶解性を上げる例示的な安定剤又は物質を含有してもよい。或いは、活性化合物は、使用前に例示的な賦形剤、例えば、発熱物質を含まない滅菌水と構成するために粉末形態であってもよい。
(0225)医薬組成物は、また、例示的な固相又はゲル相担体又は賦形剤を含むことができる。このような担体又は賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、及びポリエチレングリコールのようなポリマーが挙げられるがこれらに限定されない。
(0226)例示的な液体又は固体医薬製剤は、例えば、適切な場合には1つ以上の賦形剤と、マイクロカプセル化されるか、蝸牛状にされる(encochleate)か、顕微鏡的金粒子上に被覆されるか、組織に植え込むためのリポソーム、ペレットに含有されるか、又は組織にすりこむ対象物上に乾燥させる。このような医薬組成物は、また、顆粒剤、ビーズ剤、散剤、錠剤、コーティング錠、(マイクロ)カプセル剤、坐剤、シロップ剤、乳剤、懸濁液剤、クリーム剤、滴剤又は活性化合物の放出を遅延させた製剤の形であってもよく、その製剤には賦形剤及び添加剤及び/又は助剤、例えば崩壊剤、結合剤、被覆剤、膨潤剤、滑沢剤、又は可溶化剤が、上記のように慣用的に用いられる。医薬組成物は、種々のドラッグデリバリーシステムに用いるための例示である。ドラッグデリバリーのための方法の短い概説としては、Langer 1990 Science 249, 1527-1533を参照のこと、この開示内容は本願明細書に援用されている。
(0227)構造によっては、記載されている発明の少なくとも1つの低分子抗がん化合物が、更に少なくとも1つの活性剤が追加されてもよく、それ自体(正味)で又は、阻害剤の構造によっては、医薬的に許容され得る塩の形で投与され得る。記載されている発明の阻害剤は、有機又は無機の酸、又は有機又は無機の塩基による医薬的に許容され得る塩を形成してもよい。医薬において用いられる場合、塩は医薬的に許容され得る塩でなければならないが、その医薬的に許容され得る塩を調製するために非医薬的に許容され得る塩が都合よく用いられてもよい。このような塩としては、下記の酸: 塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、p-トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン-2-スルホン酸、ベンゼンスルホン酸から調製されるものが挙げられるがこれらに限定されない。また、このような塩は、カルボン酸基のナトリウム塩、カリウム塩又はカルシウム塩のようなアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩として製造されてもよい。
(0228)「医薬的に許容され得る塩」は、堅実な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答等のないヒト及び下等動物の組織と接触させて用いるための例示であり且つ相当な利点/リスク比に相応している塩を意味する。医薬的に許容され得る塩は、当該技術において周知である。例えば、P.H.Stahlらは、医薬的に許容され得る塩を「Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use」(Wiley VCH, Zurich, Switzerland: 2002)に詳細に記載している。
(0229)塩は、記載されている発明の範囲内に記載されている化合物の最終の単離及び精製の間にその場で又は遊離塩基官能と例示的な有機酸とを反応させることによって個別に調製され得る。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、ブチル酸塩、樟脳酸塩、カンファスルホン酸塩、ジグルコン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素塩、2-ヒドロキシエタンスルホン酸塩(イセチオン酸塩)、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、2-ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、3-フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、リン酸塩、グルタミン酸塩、重炭酸塩、p-トルエンスルホン酸塩及びウンデカン酸塩が挙げられるがこれらに限定されない。また、塩基性窒素含有基は、低級アルキルハライド、例えば塩化、臭化、ヨウ化メチル、エチル、プロピル、ブチル; ジアルキル硫酸塩、例えば硫酸ジメチル、ジエチル、ジブチル、ジアミル; 長鎖ハライド、例えば塩化、臭化、ヨウ化デシル、ラウリル、ミリスチル、ステアリル; アリールアルキルハライド、例えば臭化ベンジル、フェネチル等のような物質で四級化され得る。それにより水溶性又は油溶性又は分散性生成物が得られる。医薬的に許容され得る酸付加塩を形成するために使われ得る酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸のような無機酸及びシュウ酸、マレイン酸、コハク酸、クエン酸のような有機酸が挙げられる。塩基性付加塩は、カルボン酸含有部分と例示的な塩基、例えば医薬的に許容され得る金属カチオンの水酸化物、炭酸塩又は重炭酸塩又はアンモニア又は有機の第一級、第二級又は第三級の有機アミンとを反応させることによって本発明の範囲内で記載されている化合物の最終の単離及び精製の間にその場で調製され得る。医薬的に許容され得る塩としては、アルカリ金属又はアルカリ土類金属、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム及びアルミニウムの塩等に基づくカチオン及びアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジエチルアミン、エチルアミン等が含まれる非毒性第四級アンモニア及びアミンのカチオンが挙げられるがこれらに限定されない。塩基付加塩の形成に有用な他の代表的な有機アミンとしては、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペリジン、ピペラジン等が挙げられるがこれらに限定されない。医薬的に許容され得る塩は、また、当該技術において周知の標準手順を用いて、例えば充分に塩基性の化合物、例えばアミンと生理的に許容され得るアニオンを得る例示的な酸とを反応させることによって、得ることができる。カルボン酸のアルカリ金属(例えば、ナトリウム、カリウム又はリチウム)又はアルカリ土類金属(例えばカルシウム又はマグネシウム)塩もまた生成することができる。
(0230)製剤は、都合よく単位剤形で存在することができ、薬剤技術において周知方法のいずれによっても調製することができる。すべての方法には、組成物、又は医薬的に許容され得る塩又はその溶媒和物(「活性化合物」)と1つ以上の付属物質を構成する担体を関連させる工程が含まれる。一般に、製剤は、活性物質と液体担体又は細かく分けられた固体担体又は双方を一様に及び密接に関連させ、次に、必要ならば、生成物を望ましい製剤に成形することによって調製される。
(0231)医薬剤又は医薬的に許容され得るエステル、塩、溶媒和物又はそのプロドラッグは、望ましい作用を損なわない他の活性材料と、又は望ましい作用を補充する材料と混合してもよい。非経口、皮内、皮下、くも膜下、又は局所適用に用いられる溶液又は懸濁液には、例えば、下記の成分: 滅菌希釈剤、例えば注射用水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒; 抗菌物質、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベン; 抗酸化剤、例えばアスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム; キレート化剤、例えばエチレンジアミン四酢酸; 緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩及び張性を調整するための物質、例えば塩化ナトリウム又はデキストロースが含まれてもよいがこれらに限定されない。非経口製剤は、アンプル、使い捨て注射器又はガラス又はプラスチック製の多回投与バイアルに封入されてもよい。静脈内に投与される具体的な担体は、生理的食塩水又は、リン酸緩衝食塩水(PBS)である。
(0232)非経口注射用の医薬組成物は、医薬的に許容され得る滅菌水溶液又は非水溶液、分散液、懸濁液又はエマルジョン及び滅菌注射用溶液又は分散液に再構成するための滅菌粉末を含んでいる。例示的な水性及び非水性の担体、希釈剤、溶媒又は賦形剤の例としては、水、エタノール、ポリオール(プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール等)、その例示的な混合物、植物性油(例えばオリーブ油)及び注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散液の場合に要求される粒径の維持によって、界面活性剤の使用によって維持され得る。
(0233)これらの組成物は、また、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤が含まれる補助剤を含有してもよい。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等によって確実にされ得る。また、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムらが含まれることが望ましい場合がある。注射用医薬形態の持続的吸収は、吸収を遅らせる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムやゼラチンの使用によってもたらされ得る。
(0234)懸濁液は、活性化合物に加えて、沈殿防止剤、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、ソルビタンエステル、ミクロクリスタリンセルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天、トラガカント、これらの混合物を含有してもよい。
(0235)記載されている発明の組成物が含まれる治療薬(1つ以上)は、粒子で与えることができる。本明細書に用いられる用語「粒子」は、本明細書に記載されているように組成物又は他の治療薬(1つ以上)を全体に又は部分的に含有してもよいナノ又はマイクロ粒子(又は場合によってはより大きい)を意味する。粒子は、コーティングによって取り囲まれたコア内に治療薬(1つ以上)を含有してもよい。治療薬(1つ以上)は、また、粒子全体にわたって分散されてもよい。治療薬(1つ以上)は、また、粒子に吸着されてもよい。粒子は、0次放出、1次放出、2次放出、遅延放出、持続放出、即時放出等、及び任意の組み合わせが含まれる任意次放出速度論を有してもよい。粒子には、治療薬(1つ以上)に加えて、浸食されやすい材料、浸食されない材料、生分解性材料、又は生分解性でない材料又はこれらの組み合わせが含まれるがこれらに限定されない、薬局医薬品の当該技術において日常的に用いられる材料のいずれが含まれてもよい。粒子は、溶液又は半固体状態の組成物を含有するマイクロカプセルであってもよい。粒子は、実質的に任意の形状を有してもよい。
(0236)治療薬(1つ以上)を送達するための粒子の製造において生分解性でない及び生物分解性のポリマー材料が用いられてもよい。このようなポリマーは、天然又は合成のポリマーであってもよい。ポリマーは、放出が望まれる期間に基づいて選ばれる。例えば、生体接着ポリマーには、SawhneyらがMacromolecules (1993) 26, 581-587に記載されている生体内分解性ヒドロゲルが含まれ、その教示は本明細書に援用されている。これには、ポリヒアルロン酸酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン、ポリ無水物、ポリアクリル酸、アルギン酸塩、キトサン、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(エチルメタクリレート)、ポリ(ブチルメタクリレート)、ポリ(イソブチルメタクリレート)、ポリ(ヘキシルメタクリレート)、ポリ(イソデシルメタクリレート)、ポリ(ラウリルメタクリレート)、ポリ(フェニルメタクリレート)、ポリ(メチルアクリレート)、ポリ(イソプロピルアクリレート)、ポリ(イソブチルアクリレート)、及びポリ(オクタデシルアクリレート)が挙げられている。
(0237)治療薬(1つ以上)は、放出制御システムに含有されてもよい。薬剤の効果を延長するために、皮下、くも膜下、又は筋肉内注射から薬剤の吸収を遅延させることがしばしば望ましい。これは、水溶性が悪い結晶性又はアモルファスの材料の液体懸濁液の使用によって達成され得る。その場合、薬剤の吸収速度は薬剤の溶解速度に左右され、溶解速度は結晶サイズ及び結晶形に左右される。用語「放出制御」は、製剤から薬剤放出の方法とプロファイルが制御されている任意の薬剤含有製剤を意味するものとする。これは即時放出製剤だけでなく非即時放出製剤を意味し、非即時放出製剤には持続放出製剤及び遅延放出製剤が含まれるがこれらに限定されない。用語「持続放出」(「徐放」とも言われる)は、長期間にわたって薬剤の漸進的な放出を与え、且つ長期間にわたって薬剤の血中濃度が実質的に一定になり得る薬剤の製剤を表すために慣用の意味で本明細書に用いられている。或いは、非経口投与薬剤形態の遅延された吸収は、薬剤を油性賦形剤に溶解するか又は懸濁することによって達成される。用語「遅延放出」は、製剤の投与とそこからの薬剤の放出との間に時間の遅れがあるという薬剤の製剤を表すために慣用の意味で本明細書に用いられている。「遅延放出」は、長期間にわたって薬剤の漸進的な放出を必要としてもしなくてもよいので、「持続放出」であってもなくてもよい。
(0238)いくつかの実施態様によれば、長期持続放出移植片の使用は、慢性状態の治療に望ましい場合がある。本明細書に用いられる用語「長期」放出は、移植片が構築され配置されて、治療レベルの有効成分を少なくとも7日間、好ましくは約30〜約60日間送達することをを意味する。長期持続放出移植片は、当業者に周知であり、上記放出系の一部が含まれる。
(0239)注射用デポ形態は、生分解性ポリマー、例えばポリ乳酸-ポリグリコリド中の記載されている阻害剤のマイクロカプセル化マトリックスを形成することによって行われる。阻害剤とポリマーとの比率及び使われた具体的なポリマーの種類によって、薬剤放出速度が調節され得る。このような長時間作用する製剤は、適切なポリマー材料又は疎水性材料(例えば許容され得る油中のエマルジョンとして)又はイオン交換樹脂によって、又はやや溶けにくい誘導体として、例えば、やや溶けにくい塩として製剤化され得る。他の生分解性高分子の例としては、ポリ(オルトエステル)及びポリ(無水物)が挙げられる。デポ注射用製剤もまた、体組織と適合するリポソーム又はマイクロエマルジョンに記載されている発明の阻害剤を混入させることによって調製される。
(0240)注射用製剤は、例えば細菌保持フィルターでろ過することによって又は使用直前に滅菌水又は他の滅菌注射用媒体に溶解又は分散され得る滅菌固体組成物の形に滅菌剤を組み込むことによって滅菌され得る。注射用製剤、例えば、滅菌注射用水性又は油性懸濁液は、適切な分散剤又は湿潤剤及び沈殿防止剤を用いて既知の技術に従って製剤化され得る。滅菌注射用製剤もまた、非毒性、非経口的に許容され得る希釈剤又は溶媒、例えば1,3-ブタンジオールの溶液中の滅菌注射用溶液、懸濁液又はエマルジョンであり得る。使うことができる許容され得る賦形剤及び溶媒の中には水、リンゲル液、U.S.P.及び塩化ナトリウム等張液がある。更に、滅菌固定油が溶媒又は懸濁媒体として慣用的に使われる。このためには、合成モノグリセリド又はジグリセリドが含まれる刺激の少ない固定油が使われてもよい。更に、オレイン酸のような脂肪酸も注射剤の製造に用いられる。
(0241)非経口(皮下、内皮、筋肉内、静脈内、くも膜下及び関節内が含まれるがこれらに限定されない)投与用の製剤には、製剤を所定の受容者の血液と等張にする、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬及び溶質を含有し得る水性及び非水性の滅菌注射溶液; 及び沈殿防止剤及び増粘剤が含まれてもよい水性及び非水性の滅菌懸濁液が含まれる。これらの製剤は、単位用量又は多回投与容器、例えば密封アンプルやバイアルで存在することができ、更に使用直前に滅菌液体担体、例えば食塩水、注射用水の添加のみを必要とするフリーズ-ドライ(凍結乾燥)状態で貯蔵することができる。前記の種類の滅菌粉末、顆粒及び錠剤から即時注射溶液及び懸濁液を調製してもよい。
(0242)例示的な緩衝剤としては、酢酸及び塩(1〜2質量/容積%); クエン酸及び塩(1〜3質量/容積%); ホウ酸及び塩(0.5〜2.5質量/容積%); 及びリン酸及び塩(0.8〜2質量/容積%)が挙げられる。例示的な防腐剤としては、塩化ベンザルコニウム(0.003〜0.03質量/容積%); クロロブタノール(0.3〜0.9質量/容積%); パラベン(0.01〜0.25質量/容積%)及びチメロサール(0.004〜0.02質量/容積%)が挙げられる。
(0243)錠剤又はカプセル剤の形の経口投与としては、活性薬剤成分が任意の経口非毒性の医薬的に許容され得る不活性担体、例えばラクトース、デンプン、スクロース、セルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、タルク、マンニトール、エチルアルコール(液体形態)等と組み合わせられてもよい。更に、望まれるか又は必要とされる場合、適切な結合剤、滑沢剤、崩壊剤及び着色剤が混合物に組み込まれてもよい。粉末及び錠剤は、約5から約95パーセントまでの記載されている組成物から構成されてもよい。例示的な結合剤としては、デンプン、ゼラチン、天然糖、コーン甘味剤、合成ガム、例えばアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコールワックスが挙げられる。滑沢剤の中で、ホウ酸、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等がこれらの剤形に用いることができる。崩壊剤としては、デンプン、メチルセルロース、グアーゴム等が挙げられる。甘味剤及び芳香剤及び防腐剤を必要に応じて含めてもよい。
(0244)本発明の組成物は、また、シロップ剤及びエリキシル剤として製剤化され得る。シロップ剤及びエリキシル剤は、甘味剤、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール又はスクロースと共に製剤化され得る。このような製剤は、また、粘滑剤、防腐剤、及び香味剤や着色剤を含有してもよい。粘滑剤は、刺激、特に粘膜又は擦過組織を緩和するために主に使われる保護剤である。多くの化学物質が粘滑特性をもっている。これらの物質には、アルギン酸塩、粘液、ガム、デキストリン、デンプン、特定の糖、及びポリマーの多価グリコールが含まれる。他には、アラビアゴム、寒天、ベンゾイン、カルボマー、ゼラチン、グリセリン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、プロピレングリコール、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、ヒドロゲル等が含まれる。
(0245)口腔投与としては、本発明の組成物は、この経路に対して慣用の方法で製剤化される錠剤又はロゼンジ剤の形をとることができる。
(0246)液状製剤には、溶液、懸濁液及びエマルションが含まれる。
(0247)液状製剤には、鼻内投与用の溶液も含まれ得る。
(0248)本発明の組成物は、吸入又はガス注入によって(口を通して又は鼻を通して)送達するための分散性乾燥粉末の形であってもよい。乾燥粉末組成物は、国際公開第91/16038号パンフレットに開示されているように及び米国特許第6,921,527号明細書に開示されているように、当該技術において既知のプロセス、例えば凍結乾燥やジェットミリングによって調製されてもよく、これらの開示内容は援用されている。本発明の組成物は、被検者に単位用量治療を与えるのに充分な量で例示的な投薬レセプタクル内に配置される。投薬レセプタクルは、乾燥粉末組成物をガス流内に分散することによりエアロゾル化して、エアロゾルを形成し、次にそのようにして生成したエアロゾルを、治療を必要としている患者によって続いての吸入のためにマウスピースが取り付けられたチャンバ内に取り込むことを可能にする例示的な吸入装置内に適合するものである。このような投薬レセプタクルには、ガス(例えば、空気)の流れを容器内に送って、乾燥粉末組成物を分散させることを可能にする着脱可能な部分を有するゼラチン又はプラスチックカプセルのような当該技術において既知の組成物を封入する任意の容器が含まれる。このような容器は、米国特許第4,227,522号明細書; 同第4,192,309号明細書; 及び同第4,105,027号明細書に示されるものによって例示されている。例示的な容器には、また、GlaxoのVentolin(登録商標)Rotohaler粉末吸入器又はFisonのSpinhaler(登録商標)粉末吸入器と連結して用いられるものが含まれる。優れた防湿層を与える他の例示的な単位投与容器は、アルミニウムホイルプラスチックラミネートから形成される。医薬ベースの粉末は、形成可能な箔のくぼみに質量又は容積で充填され、カバリングホイル-プラスチックラミネートによって密封されている。粉末吸入装置と用いるためのこのような容器は、米国特許第4,778,054号明細書に記載されておりGlaxoのDiskhaler(登録商標)と用いられている(米国特許第4,627,432号明細書; 同第4,811,731号明細書; 及び同第5,035,237号明細書)。これらの文献の各々は、本明細書に援用されている。
(0249)本発明の組成物は、組成物の直腸投与用の坐剤の形であってもよい。本明細書に用いられる「直腸」又は「直腸に」は、吸収が直腸の壁を通して生じる場合に直腸を通して体内に導入することを意味する。これらの組成物は、薬剤と例示的な非刺激性賦形剤、例えば常温で固体であるが直腸温で液体であるので直腸で融解するとともに薬剤を放出するカカオ脂やポリエチレングリコールとを混合することによって調製され得る。坐剤として製剤化される場合、本発明の組成物は従来の結合剤や担体、例えばトリグリセリドによって製剤化され得る。
(0250)用語「局所的」は、適用点で、又は適用点の直下での発明組成物の投与を意味する。語句「局所適用する」は、上皮表面が含まれる1つ以上の表面上に適用することを記載している。局所投与は、経皮投与とは対照的に、一般的には全身作用よりもむしろ局所作用を与えるが、特に明記されるか又は暗示されない限り、本明細書に用いられる用語局所投与と経皮投与は同じ意味で用いられている。本出願のための局所適用には、洗口剤及び含嗽薬が含まれる。
(0251)局所投与は、また、経皮投与、例えば当該技術において周知の手法及び手順に従って調製される経皮貼付剤又はイオントフォレーシス装置の使用を必要とし得る。用語「経皮送達システム」、「経皮貼付剤」又は「貼付剤」は、剤形から皮膚を通して体循環を経て分配に利用できる通路によって薬剤(1つ以上)の1回の放出量を送達するために皮膚に配置された接着剤系を意味する。経皮貼付剤は、多種多様な医薬品を送達するために用いられる広く受け入れられている技術であり、運動病のためのスコポラミン、狭心症の治療のためのニトログリセリン、高血圧のためのクロニジン、閉経後適応症のためのエストラジオール、及び禁煙のためのニコチンが挙げられるがこれらに限定されない。
(0252)本発明に用いるための例示的な貼付剤には、下記が挙げられるがこれらに限定されない、(1)マトリックスパッチ; (2)リザーバパッチ; (3)接着剤中薬剤マルチラミネートパッチ; 及び(4)接着剤中薬剤モノリシックパッチ; TRANSDERMAL AND TOPICAL DRUG DELIVERY SYSTEMS, pp.249-297 (Tapash K.Ghosh et al.eds., 1997)、これにより本明細書に援用されている。これらの貼付剤は、当該技術において周知であり、一般に市販されている。
(0253)特に定義されない限り、本明細書に用いられるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属している当業者が一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様の又は等価な方法及び材料もまた記載されている発明の実施又は試験において使用し得るが、好ましい方法及び材料をここで記載している。本明細書に挙げられたすべての出版物は、出版物が引用しているものと関連して方法及び/又は材料を開示し記載するために本明細書に援用されている。
(0254)数値の範囲が示されている場合、各々介在する数値が、文脈上特に明確な指示がない限り下限の単位の10分の1まで、その範囲の上限と下限及びその所定の範囲における他の所定の又は介在している数値の間で本発明の範囲内に包含されることが理解される。より小さい範囲に独立して含まれてもよいこれらのより小さい範囲の上限と下限もまた、所定の範囲において特に除外された限界に従って、本発明の範囲内に包含される。所定の範囲が一方又は双方の限度を含める場合、その含まれた限度の双方を除く範囲が本発明に含まれる。
(0255)本明細書に及び添付の特許請求の範囲に用いられる単数形には、文脈上特に明確な指示がない限り複数形の語が含まれる。本明細書に用いられるすべての技術用語及び科学用語は同じ意味を有する。
(0256)本明細書に述べられる出版物は、本出願の出願日の前にその開示のみが示されている。本明細書において記載されている発明が先行発明によってこのような出版物に先だつ権利がないという承認として解釈されてはならない。更に、示された出版物の日付は、独立して確認されることを必要とすることになる実際の出版日と異なってもよい。
(0257)下記の実施例は、記載されている発明をどのように製造し使用するかの完全な開示と説明によって当業者に与えるように示され、且つ発明者らがそれらの発明とみなすものの範囲を制限するものでなく、下記の実験が行われる全ての実験か又は唯一の実験であることを表すものでもない。用いられる数字(例えば、量、温度等)に関して正確度を確実にするために努力がなされてきたが、いくつかの実験誤差及び偏差は明らかにされなければならない。特に明記しない限り、部は質量であり、分子量は質量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧又はほぼ大気圧である。
実施例1
(0258)不死化されたヒト結腸上皮細胞(HCEC)系は、外因的に導入されたテロメラーゼ及びcdk4を用いて生成した(Fearon, E.R.& Vogelstein, B.A genetic model for colorectal tumorigenesis.Cell 61, 759-767 (1990).)。これらの細胞は、形質転換されていない核型二倍体であり、多分化能の特性を有する。間葉支持細胞層の存在しないmatrigel(登録商標)に配置された場合、個々の細胞が分裂し、成熟した上皮と関連したマーカーを示す細胞のサブセットを有する自己組織化陰窩様構造を形成する。
結腸組織
(0259)この実験は、ダラス VA メディカルセンターの施設内審査委員会に承認された。インフォームドコンセントを得た後に日常的なスクリーニング結腸鏡検査を受けている患者から内視鏡的可視腺腫と関係していない組織から結腸生検(20〜30の試料、〜0.5cm3)を得た。
増殖培地及び組織培養基質
(0260)EGF(25ng/mL)(Peprotech、ロッキーヒル、ニュージャージー州)、ヒドロコルチゾン(1μg/mL)、インスリン(10μg/mL)、トランスフェリン(2μg/mL)、亜セレン酸ナトリウム(5ナノモル)(すべてSigma製、セントルイス、ミズーリ州)、2% cosmic仔ウシ血清(Hyclone)及び硫酸ゲンタマイシン(50μg/ml)(Gemini Bio-Products、ウエストサクラメント、カリフォルニア州)で補足したDMEM、MEM又はRPMI基礎培地(Gibco(登録商標)、Hyclone、ローガン、ユタ州)上で細胞を増殖した。細胞をprimariaフラスコ(BD Biosciences、サンノゼ、カリフォルニア州)中で培養し、2%〜5%酸素及び7%二酸化炭素中で増殖した。HCT 116、BJヒト皮膚線維芽細胞、HeLa細胞、及び不死化されたヒト結腸線維芽細胞(C26Ci、集団倍加150)を10% cosmic仔ウシ血清(Hyclone)で補足したDMEM、MEM又はRPMI培地(Gibco(登録商標)、Hyclone、ローガン、ユタ州)中で維持した。C26Ci細胞を10μg/mLマイトマイシンc(Sigma)で2時間処理し、初期陰窩付着点から第一継代まで支持細胞層として用いた。
(0261)PARP切断の検出及びカスパーゼ3活性分析のために、細胞を2.5uMのTASIN-1で12.5uMのSP600125(Millipore)の有無で72時間又は正の対照として5uMのドキソルビシン(Sigma)のみで6時間処理した。有糸分裂同調のために、細胞を選択的cdk1低分子阻害剤、RO-3306(9uM)で18時間処理することによってG2/M境界で同調させた(Kim, Hyun S.et al. Systematic Identification of Molecular Subtype-Selective Vulnerabilities in Non-Small-Cell Lung cancer. Cell 155, 552-566 (2013)。
プラスミド
(0262)CDK4、hTERT、pSRZ-shTP53及びpBABE-hyg-KRASV12がVassilev, L.T.に記載されており、本願明細書に援用されている(Vassilev, L.T. Cell cycle synchronization at the G2/M phase border by reversible inhibition of CDK1. Cell cycle 5, 2555-2556 (2006))。
細胞単離及び不死化
(0263)結腸生検を冷DMEM、MEM又はRPMI培地(Gibco(登録商標)、Hyclone、ローガン、ユタ州)に浸漬し、結腸鏡検査後の40〜60分以内に研究室に運び、抗菌/抗真菌溶液(Gemini Bio-Products)を含有するリン酸緩衝食塩水でおびただしく洗浄し、複数の小片(サイズが〜1 mm)に切断した。コラゲナーゼ150u/mL(Worthington Biochemical、レークウッド、ニュージャージー州)及びディスパーゼ40μg/ml(Roche、ドイツ)で酵素消化させた後、陰窩を2%血清を含める増殖補足物を有するDMEM、MEM又はRPMI培地(Gibco(登録商標)、Hyclone、ローガン、ユタ州)に再浮遊させ、50%融合性結腸線維芽細胞支持細胞層を48時間前に播種したprimaria培養皿で平板培養した。付着した後の最初の10日間の間に、細胞を3日毎に入れ、線維芽細胞のような望ましくない細胞の成長を防止するために0%まで各々1%の変化だけ血清を減少させた。上皮細胞を拡大するスモールネストが容易に見られると、以前に記載されているように細胞をレトロウイルスCDK4及びhTERTで導入した。多数の立方体様に見える細胞巣が見られる場合(最初の陰窩播種の3〜4週間後)、細胞をprimariaフラスコ上に再播種した。第一継代後日常的な組織培養のために支持細胞層を必要とせず用いなかった。
APCノックダウン実験
(0264)通常の結腸生検から分離されたHCECを、CDK4及びhTERTの連続感染、続いてそれぞれ抗生物質-G418(250μg/mL)及びブラストシジン(2.5μg/mL)による選択によって不死化した。p53に対するshRNAsをレトロウイルスで導入し、p53ノックダウン効率をウエスタン分析によって検査した。ヒト結腸がん細胞系(HCT116、DLD-1、RKO)及びウイルス産生細胞系(293FT、Phoenix A)を10%血清で補足した基礎培地中で培養した。すべての細胞系の同一性をDNA鑑定によって検査した。1μgのshRNAを1μgのヘルパープラスミド(0.4μg pMD2G及び0.6μg psPAX2)と一緒にPolyjet試薬(SignaGen)を有する293FT細胞にトタンスフェクトした。ウイルス上清を、トランスフェクトした48時間後に収集し、0.45μmフィルターで取り除いた。細胞に4μg/mLポリブレン(Sigma)を含有するウイルス上清を約1の感染多重度(MOI)で感染させた。うまく感染させた細胞を以下に記載されているように1ug/mLピューロマイシンにより3日間選択した: Eskiocak U, Kim SB, Ly P, Roig AI, Biglione S, Komurov K, Cornelius C, Wright WE, White MA, Shay JW. Functional parsing of driver mutations in the colorectal cancer genome reveals numerous suppressors of anchorage-independent growth. Cancer Res 2011;71:4359-65、これは本願明細書に援用されている。
ウェスタンブロット分析
(0265)10% SDS-PAGEによる電気泳動後、分離されたタンパク質をニトロセルロース(NC)膜(Pierce、ロックフォード、米国)上に移動した。膜を、ポリ(ADPリボース)ポリメラーゼ(PARP)(Millipore、Cell Signaling Technology、Santa Cruz等)に対する一次抗体、シトクロムC(Abcam、Cell Signaling Technology、Santa Cruz等)、電位依存性アニオン選択的チャネルタンパク質1(VDAC)(Cell Signaling Technology、Abcam、Santa Cruz等)、ホスホJNK(Cell Signaling)、JNK(Cell Signaling)、又はアクチン(Abcam、Santa Cruz、Cell Signaling等)に対する第一級抗体と4℃で一晩インキュベートした。洗浄後、膜を各対応する二次抗体とインキュベートした後、化学ルミネセンスによって視覚化した。マウスモノクローナルGAPDH(Promab、米国、1:1000)を対照のための一次抗体として用いた。
カスパーゼ3/7活性
(0266)細胞を賦形剤対照又は2.5uMのTASin-1で72時間処理し、96ウェルプレート(Promega)におけるカスパーゼ-Glo3/7分析に供した。特に、細胞を含有する96ウェル位置をインキュベータから取り出し、室温に平衡化した。再構成されたカスパーゼ-Glo試薬も室温に平衡化した。細胞培養液の容積に等しいカスパーゼ-Glo試薬の容積を各ウェルに添加した。プレートシェカーを用いて300〜500rpmで30秒間混合物を穏やかに混合し、次に室温で30分〜3時間インキュベートした。プレートをVeritasに挿入して、分析を開始した。RLU値をVeritasTMによって測定した。(Promega; A Veritas Microplate Luminometer Method for Prometa's caspase-GloTM 3/7 assay)。
免疫細胞化学
(0267)3.7%パラホルムアルデヒドを用いて細胞を10分間固定し、PBS中の0.5%トリトンX-100で5分間透過化処理し、ブロッキング溶液(0.1%トリトンX-100を含有するPBS中の10%ヤギ血清及び3% BSA)と60分間インキュベートした。次に、細胞をブロッキング溶液に希釈した一次抗体と1時間インキュベートした。下記の抗体を用いた: 抗HURP(Santa Cruz Biotechnology)、抗α-チューブリン(Cell Signaling)、抗活性β-カテニン(EMD Millipore)。Alexa-568又はAlexa-488(Invitrogen)で標識した二次抗体を用いてインキュベートした後、スライドにMowiol 4-88(Calbiochem)溶液を載せた(Eskiocak, U.et al. Functional parsing of driver mutations in the colorectal cancer genome reveals numerous suppressors of anchorage-independent growth. Cancer Res 71, 4359-4365 (2011))。細胞を蛍光顕微鏡、Axiovert 200M(Carl Zeiss)下で観察した。核をDAPI(Vectashield、Vector Laboratories)による対比染色剤で着色した。中期プレート幅、スピンドル幅及びセル幅をImageJソフトウェアにおけるライン測定ツールを用いて定量した。
SuperTopFlash分析
(0268)DLD1細胞にCMVプロモーターによって駆動されたホタルルシフェラーゼ(FL)及びGaussiaルシフェラーゼ(GL)タンパク質をコードするDNA構築物を一時的にトランスフェクトし、DMSO又はTASIN-1と18時間インキュベートし、次に、24時間後にGL活性及びFL活性をそれぞれ分析した。(Longin, A., Souchier, C., Ffrench, M. & Bryon, P. A. Comparison of anti-fading agents used in fluorescence microscopy: image analysis and laser confocal microscopy study. J Histochem Cytochem 41, 1833-1840 (1993).)
定量的逆転写-PCR(qRT-PCR)
(0269)製造業者のプロトコールに従いRNeasy Plus Universal Miniキット(Qiagen)を用いて全RNAをマウス組織から分離した。次に、First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche)を用いて1μgをcDNAに変換した。リアルタイムの定量的PCR反応をSsofast Master Mix(Biorad)で3回反復に設定し、LightCycler(登録商標)480(Roche)を続けた。変異体Krasの検出のための制限酵素断片長多形(RFLP)分析をSatoらによって行い、これにより援用されるものとする(Sato, M.et al. Multiple oncogenic changes (K-RAS(V12), p53 knockdown, mutant EGFRs, p16 bypass, telomerase) are not sufficient to confer a full malignant phenotype on human bronchial epithelial cells. Cancer Res 66, 2116-2128 (2006))。この実験に用いたすべてのプライマー(Sigma)をデータ表3に示す。
データ表3. 炎症性遺伝子のためのqPCRプライマーセット
データ表2. APCに対するshRNA配列.
生体内薬物動態分析
(0270)雌CD-1マウスに10mg/kgのTASIN-1、5% DMSO、5%クレモホルEL及び90% D5W pH 7.4として配合された0.2mL/マウスを注入された腹腔内に(IP)注射した。全血を収集した。全血からACD処理血液を標準遠心分離機において10,000rpmで10分間遠心することによって血漿を処理した。内容物を有する大腸を収集し、更なる分析のために大腸内容物を取り出した。収集したすべての組織を計量し、液体窒素で急速凍結した。腸の内容物を細かく切り刻み且つ4倍容積のPBSでホモジナイズすることにより大腸内容物(LIC)ホモジネートを調製した。100マイクロリットルのLICを0.15%ギ酸及び37.5ng/mLのIS(IS最終濃度= 25ng/ml)を含有する200マイクロリットルのアセトニトリルと混合した。試料を15秒間撹拌し、室温で10分間インキュベートし、標準微量遠心分離機において2×13,200rpmに回転させた。次に、上清をLC/MS/MSによって分析した。標準及びQCをつくるために処理されていないマウスを用いてブランクホモジネートのための組織を集めた。
組織染色
パラフィン切片のためのヘマトキシリン及びエオシン染色プロトコール
(0271)染色前に、スライドを70℃の最低温度で少なくとも20分間焼いて、染色手順の間の切片の剥離を阻害した。切片をWeigertのヘマトキシリン、ワーキング溶液で6分間染色し、流した。スライドを各々70%酸-エタノール、pH 2.5で、2回取り替え、各々3回急速浸漬を用いて脱水した。スライドを各々70% Acid-DI、pH 2.5、2回取り替え、各々3回急速浸漬を用いて脱水した。スライドを水道水で15分間洗浄し、過剰の水をスライドから流し、次にエオジン-フロキシンワーキング溶液で2分間染色し、流した。スライドを95%エタノール中で2回取り替え、各々30秒を用いて脱水し、100%エタノール中で3回取り換え、各々3回急速浸漬を用いて完全に脱水し、Histoclear(National Diagnosics; AGTC Bioproducts等)で2回取り替えを用いて各々1分で取り除いた。新鮮なHistoclearを用い、スライドを封入剤でカバースリップした。
凍結組織切片のためのヘマトキシリン及びエオシン染色プロトコール
(0272)切片をスライドに載せ、風乾して、水分を除去し、濾過した0.1%マイヤーヘマトキシリン(Sigma; MHS-16)で10分間染色し、冷たい流水のddH2Oで5分間すすいだ。スライドを0.5%エオジン(1.5gを300mLの95% EtOHに溶解した)に12回、次に蒸留水にもはやエオジンが混じらなくなるまで浸漬し、50% EtOHに10回浸漬し、70% EtOHに10回浸漬し、95% EtOHで30秒間平衡化し、100% EtOHで1分間の平衡化し、キシレンに数回浸漬し、次にキムワイプで拭きとり、Cytoseal XYL(Stephens Scientific; cat#8312-4)を用いてカバーガラスを載せた。
標準免疫組織化学染色法: アビジンビオチン複合体(ABC)法
(0273)脱パラフィン又は凍結切片を含有するスライドをPBS-トゥイーン20で2×2分間すすいだ。切片を二次抗体と同じ種の正常血清中でインキュベートした。切片を一次抗体、抗カスパーゼ3(Millipore No.AB3623; Sigma-Aldrich No.C8487等)、IHC-TekTM抗体希釈剤(Cat# IW-1000又はIW-1001)中1:100で又は抗切断カスパーゼ3(Cell signaling)中室温で1時間又は一晩インキュベートし、及びPBS-トゥイーン20で3×2分間すすいだ。切片をペルオキシダーゼブロッキング溶液中室温で10分間インキュベートし、PBS-トゥイーン20で3×2分間すすぎ、次にPBS中のビオチニル化二次抗体中室温で30分間インキュベートした。切片をPBS-トゥイーン20で3×2分間すすぎ、次にABC-ペロキシダーゼ溶液中室温で30分間インキュベートした。切片をPBS-トゥイーン20で3×2分間すすぎ、次にペルオキシダーゼ基質溶液中でインキュベートした。切片をPBS-トゥイーン20で3×2分間すすぎ、対比染色溶液で対比染色し、水道水で2〜5分間すすぎ、95%エタノールで1分間、100%エタノールで2×3分間脱水し、キシレンで2×5分間取り除き、封入剤でカバースリップした。負の対照スライドを一次抗体の非存在下で処理した。(Ren, Y.et al. Small molecule Wnt inhibitors enhance the efficiency of BMP-4-directed cardiac differentiation of human pluripotent stem cells. Journal of molecular and cellular cardiology 51, 280-287 (2011); Scholl, F.A.et al.Mek 1/2 MAPK kinases are essential for Mammalian development, homeostasis, and Raf-induced hyperplasia.Developmental cell 12, 615-629 (2007)).
軟寒天コロニー形成分析
(0274)DLD1又はHCT116細胞を35mm皿において二層寒天培養内で平板培養した。ウシ胎児血清(Sigma-Aldrich、Invitrogen等)で補足した20%イーグル最小必須培地(Flow Laboratories、Invitrogen、Sigma-Aldrich等)のアルファ変性をすべての培養に用いた。成長因子及び/又は順化培地を1皿につき1.5mLの合計培養容積の最高13.2%でアンダーレイに組み入れた。培養物を5% 02-10% C02-85% N2混合物でガス処理し、10〜14日間インキュベートした。50以上の細胞を含有しているコロニーだけを記録した。
浸潤分析
(0275)105個の細胞を一晩血清飢餓培養し、基礎培地に懸濁し、8.0μm孔Matrigel(登録商標)トランスウェル(BD Biosciences)上へ平板培養した。2%血清及び増殖サプリメントを含有する500マイクロリットルの培地を底部ウェルに添加した。非遊走細胞を24時間後にこすり取り、遊走細胞を4',6-ジアミノ-2-フェニルインドール(DAPI)で染色した。実験を生物学的3回反復に対して3回反復のトランスウェルで行い、チャンバ当たり5視野を計数する4×視野当たり染色細胞の数を平均することによって数量化した。
フローサイトメトリー
(0276)HCT116、DLD1、1CTRPA及び1CTRPA A1309細胞を低分子抗がん類縁体PDSA-010、PDSA-011、PDSA-013又はPDSA-014にさらし、ベックマンコールター(Hialeah、FL) EPICS XLフローサイトメトリーを用いたフローサイトメトリーによって分析した。
シトクロムC放出アポトーシス分析
(0277)用語「アポトーシス」又は「プログラム細胞死」は、生物体に損傷を与えずに、小疱形成、細胞膜に対する変化、例えば膜非対称や付着の消失、細胞収縮、核断片化、染色質凝縮、及び染色体のDNA断片化が含まれる、種々の形態学的変化につながる一連の生化学的事象から構成される生物学的ホメオスタシスに関与する高度に調節された活性プロセスを意味する。
(0278)アポトーシス細胞死は、多くの異なる要因によって誘導され、多数のシグナル伝達経路を必要とし、いくつかはカスパーゼプロテアーゼ(システインプロテアーゼの一種)に依存的であり、他のものはカスパーゼ非依存的である。アポトーシス細胞死は、アポトーシスシグナル伝達経路の活性化がもたらされる、細胞表面受容体、ストレスに対するミトコンドリア反応、及び細胞障害性T細胞が含まれる、多くの異なる細胞刺激が引き金となり得る。
(0279)アポトーシスに関係するカスパーゼは、タンパク質分解カスケードのアポトーシスシグナルを伝達し、カスパーゼが他のカスパーゼを切断し活性化し、そのときに細胞死につながる他の細胞標的を分解する。カスケードの上端部のカスパーゼには、カスパーゼ-8及びカスパーゼ-9が含まれる。カスパーゼ-8は、Fasのような死ドメイン(DD)を有する受容体に対する応答に関係する最初のカスパーゼである。
(0280)TNF受容体ファミリーの受容体は、アポトーシスの誘発だけでなく、炎症性シグナル伝達と関連している。Fas受容体(CD95)は、他の細胞の表面上に発現したFas-リガンドによってアポトーシスシグナル伝達を仲介する。Fas-FasL相互作用は免疫系において重要な役割を果たし、この系の欠如によって自己免疫につながり、Fas仲介アポトーシスが自己反応性リンパ球を取り除くことを示している。Fasシグナル伝達は、また、免疫学的監視に関与して、形質転換細胞及びウイルス感染細胞を取り除く。Fasが他の細胞上のオリゴマー化されたFasLに結合すると、FAF、FADD及びDAXが含まれるシグナル伝達アダプターと相互作用して、カスパーゼタンパク質分解カスケードを活性化する死ドメイン(DD)と呼ばれる細胞質ドメインを通してアポトーシスシグナル伝達が活性化される。カスパーゼ-8及びカスパーゼ-10を最初に活性化して、次に、細胞死につながる下流カスパーゼ及び種々の細胞基質を切断し活性化する。
(0281)ミトコンドリアは、ミトコンドリアタンパク質の細胞質への放出によってアポトーシスシグナル伝達経路に関与する。シトクロムc、電子伝達の主要タンパク質はアポトーシスシグナルに応答してミトコンドリアから放出され、Apaf-1、ミトコンドリアから放出されるプロテアーゼを活性化する。活性化されたApaf-1は、カスパーゼ-9及び残りのカスパーゼ経路を活性化する。Smac/DIABLOは、ミトコンドリアから放出され、通常はカスパーゼ-9と相互作用してアポトーシスを阻害するIAPタンパク質を阻害する。Bcl-2ファミリータンパク質によるアポトーシスレギュレーションは、ファミリーメンバーがミトコンドリア膜に入る複合体を形成するにつれて起こり、シトクロムc及び他のタンパク質の放出が調節される。アポトーシスを引き起こすTNFファミリー受容体は、カスパーゼカスケードを直接活性化するが、ミトコンドリア仲介アポトーシスを活性化するBid、Bcl-2ファミリーメンバーも活性化することができる。Bax、他のBcl-2ファミリーメンバーがこの経路によって活性化されて、ミトコンドリア膜に局在するとともにその透過性を増加し、シトクロムc及び他のミトコンドリアタンパク質を放出する。Bcl-2及びBcl-xLは孔形成を防止し、アポトーシスを阻止する。シトクロムcのように、AIF(アポトーシス誘発因子)は、アポトーシス刺激によってミトコンドリアから放出されるミトコンドリアに見られるタンパク質である。シトクロムCはカスパーゼ依存的アポトーシスシグナル伝達に関連するが、AIF放出はカスパーゼ非依存的アポトーシスを刺激して、DNAを結合する核へ移動する。AIFによるDNA結合は、おそらくヌクレアーゼの漸増によって、染色質凝縮、及びDNA断片化を刺激する。
(0282)ミトコンドリアストレス経路はミトコンドリアからシトクロムcの放出から始まり、次にApaf-1と相互作用して、カスパーゼ-9の自動切断及び活性化を引き起こす。カスパーゼ-3、-6及び-7は、上流プロテアーゼによって活性化される下流カスパーゼであり、それら自体細胞標的を切断するために作用する。
(0283)細胞障害性T細胞によって放出されるグランザイムB及びパーフォリンタンパク質がアポトーシスを誘発して、膜貫通孔を形成し且つ、おそらくカスパーゼの切断によって、アポトーシスの引き金となるが、グランザイムBのカスパーゼ非依存的機序が示されている。
(0284)ヌクレオソームラダーを作成するためにアポトーシスシグナル伝達経路によって活性化される複数のヌクレアーゼによる核ゲノムの断片化は、アポトーシスに特有の細胞応答である。アポトーシスに関係する1つのヌクレアーゼは、DNA断片化因子(DFF)、カスパーゼ活性化DNAse(CAD)である。DFF/CADは、アポトーシスの間にカスパーゼプロテアーゼによるその関連する阻害剤ICADの切断によって活性化される。DFF/CADは、クロマチン成分、例えばトポイソメラーゼIIやヒストンH1と相互作用して、クロマチン構造を凝結させ、おそらくCADをクロマチンに漸加させる。他のアポトーシス活性化プロテアーゼは、エンドヌクレアーゼG(EndoG)である。EndoGは、核ゲノムにコードされているが、正常細胞におけるミトコンドリアに局在している。EndoGは、ミトコンドリアゲノムの複製だけでなく、アポトーシスに役割を果たし得る。アポトーシスシグナル伝達によって、ミトコンドリアからEndoGの放出が生じる。EndoG経路がDFFのない細胞中に存在するので、EndoG及びDFF/CADの経路は非依存的である。
(0285)低酸素だけでなく、低酸素に続く再酸素化もシトクロムc放出及びアポトーシスの引き金となり得る。グリコーゲンシンターゼキナーゼ(GSK-3)ほとんどの細胞型に偏在して発現されるセリントレオニンキナーゼは、ミトコンドリア細胞死経路を活性化する多くの刺激のためアポトーシスを仲介するか又は増強すると思われる。Loberg, RD, et al., J.Biol.Chem.277 (44): 41667-673 (2002). カスパーゼ3活性化を誘導し且つプロアポトーシスがん抑制遺伝子p53を活性化することが示された。また、GSK-3がプロアポトーシスBcl-2ファミリーメンバー、Baxの活性化及び転座を促進し、凝集及びミトコンドリア局在の際に、シトクロムc放出を誘導することが示された。AktはGSK-3の重要な調節剤であり、GSK-3のリン酸化及び不活性化はAktの抗アポトーシス作用の一部を仲介することができる。
(0286)以下の通り細胞においてアポトーシスを誘導した。細胞を4℃で5分間600×gの遠心分離によって集め(5×107)、10mlの氷冷PBSで洗浄し、4℃で5分間600×gで遠心分離し、上清を取り出した。細胞をDTT及びプロテアーゼ阻害剤を含有する1.0mlの1×サイトゾル抽出バッファミックスで再浮遊させ、氷上で10分間インキュベートした。細胞を氷上の氷冷ダウンス組織グラインダー中でホモジナイズした。ホモジネートを1.5mlの微小遠心管に移し、4℃で10分間700×gで遠心分離した。上清を新鮮な1.5ml管に集め、4℃で30分間10,000×gで遠心分離した。上清を細胞画分として集めた。ペレットをDTT及びプロテアーゼ阻害剤を含有する0.1mLのミトコンドリア抽出バッファミックスに再浮遊させ、10秒間撹拌し、ミトコンドリア画分として保存した。細胞画分とミトコンドリア画分の各々10μgを誘導されていない細胞及び誘導された細胞から分離し、12% SDS-PAGEに装填し、電気泳動にかけた。標準ウェスタンブロット手順を行い、ブロットをシトクロムc抗体(1μg/mL)でプローブした。(BioVision; Cytochrome C Releasing Apoptosis Assay Kit; Catalog #K257-100)
TASIN-1の吸収を定量する分析
(0287)大腸の内容物、血漿及び大腸からの試料を分析して、TASIN-1の保持を定量した。試料を下記の時点で用いた: 200、400、600、800、1000、1200、1400、及び1600分。高性能液体クロマトグラフィ(HPLC)を用いて、試料の各々におけるTASIN-1の存在を評価した。
(0288)エトキシクマリン(DMSO中2mM)を雄ICR/CD-1マウス肝細胞(ロットHIC)及びHI培地と0〜240分間インキュベートした。反応物を0.2%ギ酸及び100ng/nl IS(IS最終濃度= 25ng/ml)を含有する0.2mL(1:2)のメタノールで急冷した。試料を15秒間撹拌し、室温で10分間インキュベートし、次に卓上用冷却遠心分離機において13.2Krpmで5分間回転させた。上清(185μL)をHPLAバイアル(挿入物のある)へ移した。結果をQtrap 4000質量分析計によって分析した。Qtrap 4000を用いられるためのパラメータは、エトキシクマリン + IS 050412.damであった。イオン源/ガスパラメータは、CUR = 45、CAD = 低い、IS = 5500、TEM = 600、GS1 = 60及びGS2 = 60であった。バッファAは、水 + 0.1%ギ酸であり; バッファBは、MeOH + 0.1%ギ酸であり、流量は、1.5mL/分であった。用いられたカラムは、Agilent C18XDBカラム、5ミクロン充填50×4.6mmサイズ、0〜1.5分97% A、1.5〜2.0分 100%までの勾配 B、2.0〜3.0分100% B、3.0〜3.3分97%までの勾配 A、3.3〜4.5分97%までの勾配A; IS: n-ベンジルベンズアミド(sigma-alderich (ロット#02914LH、MeOH中11/07/11作製、トランジション212.1〜91.1); 化合物トランジション191.0〜163.1。化合物(DMSO中2mM)の各々をネズミS9(ロットKWB)画分及び相I(NADPH Regenerating System)コファクターと0〜240分間インキュベートした。反応物を0.2%ギ酸及び100ng/mLのIS(IS最終濃度 = 50ng/mL)を含有する1mL(1:1)のメタノールで急冷した。試料を15秒間撹拌し、室温で10分間インキュベートし、2400rpmで5分間回転させた。次に上清(1mL)をeppendorfチューブへ移し、卓上用冷却遠心分離機において13.2K rpmで5分間回転させた。上清(800μL)をHPLCバイアル(挿入物なし)へ移した。結果をQtrap 4000質量分析計によって分析した。Qtrap 4000を用いるためのパラメータは、SW142282+IS053112.damであった。 イオン源/ガスパラメータは、以下の通りであった: CUR = 45、CAD = 低い、IS = 5500、TEM = 600、GS1 = 60、GS2 = 60。バッファAは水 + 0.1%ギ酸であり; バッファBはMeOH + 0.1%ギ酸であり、流量は1.5mL/分であった。用いられたカラムは、Agilent C18XDBカラム、5ミクロン充填50×4.6mmサイズ、0〜1.5分97% A、1.5〜2.0分100%までの勾配 B、2.0〜3.0分100% B、3.0〜3.3分97%までの勾配A、3.3〜4.5分97%までの勾配A; IS: n-ベンジルベンズアミド(sigma-alderich、ロット#02914LH、MeOH中11/07/11作製、トランジション212.1〜91.1); 化合物トランジション、例えば、400.1〜146.0、又は例えば354.2〜171.0。
動物実験
(0289)生後5〜6週の雌ヌードマウス(NCI)において各マウスの背側両脇腹に2×106 CRC細胞を接種することによって皮下(s.c.)異種移植片を与えた。腫瘍が直径2〜3mmに増大したときに、マウスにTASIN-1を(10% DMSO、10%クレモホルを含有する0.2mL溶媒に溶解した)40mg/kgの投与量で又は溶媒のみを1日2回対照グループにおいて腫瘍が直径15mmに増大するまで腹腔内注射した。カリパスを用いて腫瘍容積を測定し、式l×w2×0.5(式中、l及びwはそれぞれ腫瘍の長さと幅を表した)を用いて計算した。結腸直腸遺伝子組み換えがんマウスモデル、CDX2P-NLS Cre;APC+/loxP(CPC;Apc)マウスを用いた(Kaplan, K.B.et al.A role for the Adenomatous Polyposis Coli protein in chromosome segregation.Nature cell biology 3, 429-432 (2001)。雄CPC;Apcマウス生後〜110日に溶媒か又は20mg/kg/注射のTASIN-1を週2回90日間腹腔内に注射した。処理期間にわたって15日毎に体重を測定した。
(0290)概要としては、異種移植片を与えた雌ヌードマウス(NCI)に1日2回、40mg/kg(10% DMSO、10%クレモホルを含有する0.2mLの溶媒に溶解した)の投与量のTASIN-1又は溶媒のみを1日2回腹腔内注射した。CPC; Apcマウス実験としては、マウスに溶媒か又は20mg/kg/注射のTASIN-1を週2回90日間注射した。
マウスにおける腫瘍発生
(0291)マウスにHCT116細胞、DLD1細胞又はHT-29細胞を0日目及び8日目注射し、次に賦形剤又は10〜40mg/kgの投与量の化合物で1日2回処理した。腫瘍のサイズを切除し物理的に測定することによって腫瘍成長を評価した。HCT116細胞、DLD1又はHT-29を接種した後下記の時点後に腫瘍サイズを分析することによって腫瘍成長速度を評価した: 12、15、19、22及び24日間。
(0292)類縁体についてマウスにおける腫瘍阻害を試験した。DLD1細胞又はHCT116細胞をマウスに注射して、腫瘍を成長させた。6日目に、腫瘍容積が約50mm3であるときに、マウスに対照又はPDSA-014を接種した。PDSA-014をマウスに10mg/kgで1日2回腹腔内注射によって投与した。腫瘍を9、12、15、18及び21日間で取り出した。腫瘍を測定して、腫瘍成長を定量した。
分裂指数
(0293)分裂指数を求めるために、DLD1細胞を2.5μL又は10μLの濃度のTASIN-1又は10□□Lの濃度のPitstop2(abcam、ab120687)で処理した24時間後にタノール固定し、DNAをヘキスト33342染色によって視覚化し、細胞をLD 40×/NA 0.75/Ph2 Plan-Neofluor対物レンズを用いた顕微鏡(Axiovert 200M; Carl Zeiss)により画像化した。有糸分裂細胞をその凝結されたDNA含有量によってUVチャネルにおいて確認した。
(0294)TP53、APCノックダウン、変異(1CTRPA)をもつHCECはAPCトランケーション1309(以下「1CTRPA A1309」)(表1)の異所性発現と共に開発されている(Eskiocak U, Kim SB, Ly P, Roig AI, Biglione S, Komurov K, Cornelius C, Wright WE, White MA, Shay JW. Functional parsing of driver mutations in the colorectal cancer genome reveals numerous suppressors of anchorage-independent growth. Cancer Res 2011;71:4359-65; Ly, P.Eskiocak, U., Parker, C.R., Harris, K.J., Wright, W.E.and Shay, J.W. RNAi screening of the human colorectal cancer genome identifies multifunctional tumor suppressors regulating epithelial cell invasion. Cell Res.22:1605-1608, 2012, PubMed PMID: 23044803; Zhang, L., Komurov, K., Wright, W.E.and Shay, J.W. Identification of novel driver tumor suppressors through functional interrogation of putative passenger mutations in colorectal cancer. Int J Cancer.132(3):732-7, 2013.doi: 10.1002/ijc.27705.Epub 2012 Jul 21.PMID: 22753261を参照のこと、これらの各々は本願明細書に援用されている)。このAPC変異は大腸がんにおいて強く選ばれる、APCの他の切断型よりカスパーゼ切断に耐性であることが示されている。APC短縮型HCEC細胞系1CTRPA A1309は、適合した親HCEC(1CTRPA)と比較して、成長速度の増大、軟寒天成長の増進及びmatrigel(登録商標)による浸潤を示す。しかしながら、野生型APC(1CTRPA)のみのノックダウンは、HCECに腫瘍形成特性を獲得させなかった(未発表のデータ)。
(0295)これらの所見は、APCトランケーションが細胞に腫瘍形成特性、例えば、過剰な又は誤制御した細胞増殖を獲得させることができるという考えに支持を与えた。
(0296)短縮型APCタンパク質を標的にする低分子の確認の細胞モデルとして、規定の遺伝子変化を有するこれらの同質遺伝子的細胞系が用いられている。
(0297)同質遺伝子的細胞系を用いて、APC短縮型HCECの細胞成長を選択的に阻止し得るテキサス大学 サウスウェスタン(UTSW)化合物ファイルの中から低分子及び/又は天然産物画分を確認するように設計された細胞ベースの高スループットスクリーンを行った(図6)。この化合物ライブラリは、Prestwick Chemical Library(登録商標)から1200の市販薬剤及びNIHライブラリから前臨床試験へ行った600の化合物が含まれる、いくつかの商用ベンダーから大きい化学的環境を表す〜200,000の合成化合物を包含する。スクリーニングにおいて用いられる同質遺伝子的細胞系を表1に挙げる。
(0298)一次スクリーニングを1CTRPA A1309において行った。スクリーニングとしては、細胞を市販されている(Invitrogen; BioRad; Corning等)[結腸上皮細胞培地(CoEpiCM(ScienCell Research Laboratories; Innoprot等)における]384のウェルプレートに400の細胞/ウェルの密度で単層として播種した。24時間後の候補化合物を1ウェルにつき2.5μMの濃度で添加し、細胞を生理的酸素状態(≦3〜5%のO2)で4日間インキュベートした。読み取りとしてATPレベルを用いて細胞生存度を測定するためにルミネッセンスベースのCelltiter-Glo(登録商標)分析を行った。概要としては、培地中哺乳類細胞による不透明壁のマルチウェルプレート(1ウェルにつき25μl、384-ウェルプレート)を調製した。細胞のない培地を含有する対照ウェルを調製して、バックグラウンドルミネッセンスの値を得た。試験化合物を実験ウェルに添加し、培養プロトコールに従ってインキュベートした。プレート及びその内容物を室温で約30分間インキュベートした。CellTiter-Glo(登録商標)試薬を添加する直前にATP標準曲線を作成した。各ウェル中に存在する細胞培養液の容積に等しいCellTiter-Glo(登録商標)試薬の容積(384ウェルプレートに対して25μlの細胞を含有する培地に対して25μlの試薬)を添加した。内容物をオービタルシェーカーにより2分間混合して、細胞溶解を誘導した。プレートを室温で10分間インキュベートして、ルミネッセンスシグナルを安定化し、ルミネッセンスを記録した。(例えばGloMax(登録商標)、Lumistar、SPECTROstar、PHERAstar FS). 一次スクリーニングにより、6704の正のヒットを得た(z-スコア<-3に基づき、z-スコア-3が平均より小さい標準偏差3であることを意味する)。
(0299)正常なヒト上皮細胞の増殖の>40%を阻害した化合物をスクリーニング機能データベース及び以前の経験に基づいて除外した。残りの5381の化合物を1CTRPA A1309(一次スクリーニング結果を確認するために)及び1CTRPA(APCトランケーションに特定でない化合物を除外するために)に対して再スクリーニングした。これらの化合物の可能な一般毒性を排除するために、化合物を正常二倍体HCEC(1CT)に対してもカウンタースクリーニングした。このカウンタースクリーニングは、1CTRPA及び1CTを超える＞50% CTRPA A1309の細胞成長を阻害する126の化合物を確認した。これらの選択的毒性化合物の追加のスクリーニングを、2.5umから30nmまでの範囲にある、1:3倍希釈系列の濃度のHCECの同じパネルに対して行った。この二次カウンタースクリーニングにより、14の候補化合物が得られ、30nm又は90nmの濃度で1CTRPA A1309細胞の選択的阻害を示したが、1CTRPA又は1CT細胞には注目すべき影響がなかった。全体のスクリーニング戦略を流れ図に示す(図6)。
(0300)次にこれらの14の化合物をその商業的入手し、そのIC50を2種の標準CRC系: HCT116(野生型APC)及びDLD1(短縮型APC)において12濃度ポイントの3.2倍(half log)希釈系列による用量反応実験を行うことによって求めた。抗がん化合物A及びBは、図7に示されるように、DLD1に対してそれぞれIC50 63nm及び131nmで選択毒性を示した。これらの2種の化合物は、類縁体開発のための及び追加実験のための最初のリード化合物として役立った。
これらの置換から得られる例示的な化合物を表Aに示す。
I. 一般情報
(0301)1H及び13C NMRスペクトルをVarian Inova-400MHz又は500MHzのスペクトロメータを用して得た。シグナルカップリングの略号は以下の通りである: s、一重線; br、幅広い; d 、二重線; t、三重線、q、四重線及びm、多重線。固体試料の融点はFisher-Johns融点装置を用いて行った。分析用薄層クロマトグラフィー(TLC)は、E. Merckから購入したプレコートされたプレート(TLCシリカ60 PF254、25Glassプレート20×20cm)上で行った。クロマトグラムをUV光下で又はヨウ化物又はKMnO4で染色することによって視覚化した。フラッシュクロマトグラフィは、E. Merckシリカゲル60(230〜400メッシュ)を用いてStill et al (Still, W.C.et al. J. Org. Chem. 1978, 43, 2923-2925の説明に基づくか、又はサイズが4グラムから80グラムまでの範囲にあるRedisep(登録商標)Rfフラッシュカラムを用いたIsco Combiflash装置により行った。すべての空気感受性反応をアルゴン環境下で実施した。特に明記しない限り、商業的な供給源から購入したすべての一般試薬及び溶媒を精製せずに用いた。水分感受性反応のために用いられるすべてのガラス製品は、一晩炉乾燥するか又は火炎乾燥した。
II. スルホニルクロリド及びアミンからスルホンアミドの調製のための一般手順
(0302)アミン(1.0mmol)、スルホニルクロリド(1.1mmol)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(1.5mmol)及びCH2Cl2(5mL)の混合物を一晩室温で撹拌した。次に反応溶液をNaHCO3飽和溶液(20ml)に注入し、CH2Cl2(3×20mL)によって抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物を溶離剤としてMeOH : CH2Cl2(又はMeOH : EtOAc)混合物とのシリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィによって又はCH2Cl2とヘキサンの混合物から再結晶によって精製して、スルホンアミドを得た。
(0303)
4-メチル-1'-(フェニルスルホニル)-1,4'-ビピペリジン: 4-メチル-1,4'-ビピペリジンとベンゼンスルホニルクロリド間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:9のMeOH : EtOAc)によってこの化合物を淡黄色固形物(92%)として得た。mp 154 - 156℃; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.77 (dd, J = 8.3, 1.4 Hz, 2 H), 7.65 - 7.58 (m, 1 H), 7.54 (dd, J = 8.4, 7.0 Hz, 2H), 3.87 (d, J = 11.9 Hz, 2 H), 2.80 (d, J = 11.8 Hz, 2 H), 2.26 (m, 3 H), 2.14 (t, J = 11.4 Hz, 2 H), 1.86 (d, J = 11.7 Hz, 2 H), 1.72 - 1.59 (m, 4 H), 1.40 - 1.28 (m, 1 H), 1.23 (m, 2 H), 0.91 (d, J = 6.4 Hz, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 136.0, 132.7, 129.0, 127.6, 61.3, 49.1, 46.1, 33.9, 30.8, 26.9, 21.7; MS (ESI) m/z 323.2 (100 %, [M+H]+).
(0304)
1'-((4-(ジフルオロメトキシ)フェニル)スルホニル)-4-メチル-1,4'-ビピペリジン: 4-メチル-1,4'-ビピペリジンと4-(ジフルオロメトキシ)ベンゼン-1-スルホニルクロリド間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:19のMeOH : CH2Cl2)によってこの化合物を薄橙色固形物(69%)として得た。mp 132 - 135℃; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.76 (d, J = 8.8 Hz, 2 H), 7.24 (d, J = 8.8 Hz, 2 H), 6.61 (t, J = 72.6 Hz, 1 H), 3.83 (d, J = 12.1 Hz, 2 H), 2.77 (d, J = 11.7 Hz, 2 H), 2.33 - 2.16 (m, 3 H), 2.11 (td, J = 11.6, 2.5 Hz, 2 H), 1.84 (d, J = 13.2 Hz, 2 H), 1.64 (m, 4 H), 1.30 (dddt, J = 13.3, 9.7, 6.5, 3.5 Hz, 1 H), 1.16 (qd, J = 12.0, 3.8 Hz, 2 H), 0.89 (d, J = 6.5 Hz, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 154.1 (t, J = 2.9 Hz), 132.9, 129.8, 119.3, 115.2 (t, J = 262.5 Hz), 61.4, 49.5, 46.1, 34.6, 31.0, 27.3, 21.8; MS (ESI) m/z 389.2 (100 %, [M+H]+).
(0305)
4-メチル-1'-((2,2,4,6,7-ペンタメチル-2,3-ジヒドロベンゾフラン-5-イル)スルホニル)-1,4'-ビピペリジン: 4-メチル-1,4'-ビピペリジンと2,2,4,6,7-ペンタメチル-2,3-ジヒドロベンゾフラン-5-スルホニルクロリド間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:9のMeOH : EtOAc)によってこの化合物を淡黄色油状物(95%)として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.63 (d, J = 12.0 Hz, 2 H), 2.97 (s, 2 H), 2.89 (s, br, 2 H), 2.75 (dt, J = 12.0, 4.0 Hz, 2 H), 2.50 (s, 3 H), 2.46 (s, 3 H), 2.41 (s, br, 1 H), 2.14 (s, br, 2 H), 2.10 (s, 3 H), 1.90 (d, J = 12.0 Hz, 2 H), 1.64 (d, J = 12.0 Hz, 2 H), 1.51 (m, 2 H), 1.48 (s, 6 H), 1.40 - 1.08 (m, 3 H), 0.87 (d, J = 4.0 Hz, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 159.9, 140.8, 135.3, 125.8, 125.0, 117.9, 86.8, 61.9, 49.6, 43.9, 43.1, 34.5, 31.0, 28.6, 27.7, 21.8, 19.2, 17.6, 12.5; MS (ESI) m/z 435.3 (100 %, [M+H]+).
(0306)
1-((4-メトキシフェニル)スルホニル)-4-(ピロリジン-1-イル)ピペリジン: 4-(ピロリジン-1-イル)ピペリジンと4-メトキシベンゼン-1-スルホニルクロリド間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:9のMeOH : EtOAc、次に1:9のMeOH : CH2Cl2)によってこの化合物を淡黄色の油状物(70%)として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.68 (d, J =8.0 Hz, 2 H), 6.97 (d, J = 8.0 Hz, 2 H), 3.86 (s, 3 H), 3.68 (d, J = 12.0 Hz, 2 H), 2.51 (s, 4 H), 2.36 (dt, J = 12.0, 4.0 Hz, 2 H), 1.90 (m, 3 H), 1.75 (s, 4 H), 1.61 (q, J = 12.0 Hz, 1H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 162.9, 129.8, 127.8, 114.1, 60.8, 55.6, 51.3, 45.0, 30.4, 23.2; MS (ESI) m/z 325.2 (100 %, [M+H]+).
(0307)
1-(メシチルスルホニル)-4-(ピロリジン-1-イル)ピペリジン: 4-(ピロリジン-1-イル)ピペリジンと2,4,6-トリメチルベンゼン-1-スルホニルクロリド間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:9のMeOH : EtOAc)によってこの化合物を黄色油状物(59%)として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.92 (s, 2 H), 3.53 (d, J = 12.0 Hz, 2 H), 2.80 (td, J = 12.0, 2.6 Hz, 2 H), 2.59 (s, 6 H), 2.56 (s, 4 H), 2.28 (s, 3 H), 2.11 (s, br, 1 H), 1.93 (d, J = 12.0 Hz, 2 H), 1.77 (s, 4 H), 1.50 (m, 2 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 142.5, 140.6, 131.9, 131.6, 61.2, 51.4, 42.9, 30.7, 23.2, 22.7, 21.0; MS (ESI) m/z 337.2 (100 %, [M+H]+).
(0308)
4-(ピロリジン-1-イル)-1-((2,4,6-トリイソプロピルフェニル)スルホニル)ピペリジン: 4-(ピロリジン-1-イル)ピペリジンと2,4,6-トリイソプロピルベンゼン-1-スルホニルクロリド間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:9のMeOH : EtOAc)によってこの化合物を黄色固形物(>95%)として得た。mp 118 - 122℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.15 (s, 2 H), 4.16 (m, 2 H), 3.58 (d, J = 12.0 Hz, 2 H), 2.85 (m, 3 H), 2.62 (s, 4 H), 2.16 (s, br, 1 H), 1.98 (d, J = 12.0 Hz, 2 H), 1.81 (s, 4 H)m 1.55 (d, J = 12.0 Hz, 2 H), 1.24 (m, 18 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 153.2, 151.8, 129.7, 123.9, 61.5, 51.4, 42.9, 34.2, 29.3, 24.9, 23.6, 23.2; MS (ESI) m/z 421.2 (100 %, [M+H]+).
(0309)
1-(ナフタレン-1-イルスルホニル)-4-(ピロリジン-1-イル)ピペリジン: 4-(ピロリジン-1-イル)ピペリジンとナフタレン-1-スルホニルクロリド間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:9のMeOH : EtOAc)によってこの化合物を白色固形物(67%)として得た。mp 151 - 154℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.70 (d, J = 12.0 Hz, 1 H), 8.20 (dd, J = 7.3, 1.4 Hz, 1 H), 8.05 (d, J = 12.0 Hz, 1 H), 7.90 (dd, J = 7.3, 1.4 Hz, 1 H), 7.58 (m, 3H), 3.81 (d, J = 12.0 Hz, 2 H), 2.65 (m, 6 H), 2.19 (s, br, 1 H), 1.92 (m, 2 H), 1.79 (s, 4 H), 1.59 (m, 2 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 134.5, 134.3, 132.8, 130.5, 128.9, 128.8, 128.1, 126.9, 125.2, 124.1, 60.8, 51.1, 44.2, 30.0, 23.2; MS (ESI) m/z 345.2 (100 %, [M+H]+).
(0310)
1'-((3-(tert-ブチル)フェニル)スルホニル)-4-メチル-1,4'-ビピペリジン: 4-(ピロリジン-1-イル)ピペリジンと3-(tert-ブチル)ベンゼン-1-スルホニルクロリド間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:9のMeOH : EtOAc)によってこの化合物を黄色固形物(90%)として得た。mp 100-102℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.73 (s, 1 H), 7.57 (m, 2 H), 7.43 (m, 1 H), 3.84 (d, J = 12.0 Hz, 2 H), 2.78 (d, J = 12.0 Hz, 2 H), 2.22 (td, J = 12.0, 2.5 Hz, 3 H), 2.12 (t, J = 12.0 Hz, 2 H), 1.82 (d, J = 12.0 Hz, 2 H), 1.63 (m, 4 H), 1.33 (s, 9 H), 1.28 (m, 1 H), 1.19 (m, 2 H), 0.88 (d, J = 8.0 Hz, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 152.5, 135.9, 129.7, 128.7, 124.7, 124.4, 61.5, 49.4, 46.0, 35.0, 34.4, 31.1, 31.0, 27.2, 21.8; MS (ESI) m/z 379.2 (100 %, [M+H]+).
(0311)
3-(4-(メシチルスルホニル)ピペラジン-1-イル)キヌクリジン: N,N-ジイソプロピルエチルアミン(1.5mmol)の存在下にCH2Cl2中で3-ピペラジン-1-イルキヌクリジン三塩酸塩半水化物(1.0mmol)と2,4,6-トリメチルベンゼンスルホニルクロリド(1.1mmol)間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:9のMeOH : EtOAc)によってこの化合物を白色固形物(42%)として得た。mp 300℃より高い; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.96 (s, 2 H), 3.34-3.12 (m, 9 H), 3.04 (dd, J = 12.0, 4.0 Hz, 1 H), 2.60 (s, 6 H), 2.45 (s, 5 H), 2.30 (s, 4 H), 2.05 (m, 2 H), 1.79 (m, 1 H), 1.68 (m, 1 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 142.8, 140.5, 132.0, 131.0, 59.1, 52.8, 50.3, 46.6, 45.6, 44.1, 23.0, 22.9, 22.1, 20.9, 17.7; MS (ESI) m/z 378.2 (100 %, [M+H]+).
(0312)
1'-((4-クロロナフタレン-1-イル)スルホニル)-4-メチル-1,4'-ビピペリジン: 4-メチル-1,4'-ビピペリジンと4-クロロナフタレン-1-スルホニルクロリド間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:9のMeOH : EtOAc)によってこの化合物を白色固形物(71%)として得た。mp 129-132℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.76 (m, 1H), 8.39 (ddd, J = 6.5, 3.4, 0.7 Hz, 1 H), 8.11 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 7.69 (dd, J = 6.6, 3.3 Hz, 2 H), 7.64 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 3.87 (d, J = 12.4 Hz, 2 H), 2.75 (d, J = 11.0 Hz, 2 H), 2.55 (td, J = 12.2, 2.4 Hz, 2 H), 2.23 (t, J = 12.0 Hz, 1 H), 2.06 (t, J = 11.3 Hz, 2 H), 1.81 (d, J = 13.1 Hz, 2 H), 1.55 (m, 4 H), 1.27 (dd, J = 17.6, 9.0 Hz, 1 H), 1.15 (dd, J = 13.4, 9.6 Hz, 2 H), 0.87 (d, J = 6.4 Hz, 3 H).; 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 138.4, 132.3, 131.5, 130.1, 130.0, 128.7, 127.9, 125.7, 125.4, 124.6, 61.5, 49.5, 45.5, 34.5, 31.0, 27.7, 21.8; MS (ESI) m/z 407.1(100 %, [M+H]+).
(0313)
1'-((2,4-ジクロロ-5-メチルフェニル)スルホニル)-4-メチル-1,4'-ビピペリジン: 4-メチル-1,4'-ビピペリジンと2,4-ジクロロ-5-トルエン-1-スルホニルクロリド間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:9のMeOH : EtOAc)によってこの化合物を白色固形物(83%)として得た。mp 120-123℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.89 (s, 1H), 7.49 (s, 1H), 3.87 (d, J = 12.9 Hz, 2 H), 2.82 (d, J = 11.2 Hz, 2H), 2.71 (td, J = 12.4, 2.4 Hz, 2H), 2.38 (s, 3 H), 2.34 (m, 1 H), 2.15 (t, J = 11.2 Hz, 2H), 1.83 (d, J = 11.6 Hz, 2H), 1.59 (m, 4H), 1.31 (m, 1H), 1.06 (t, J = 12.0 Hz, 2H), 0.89 (d, J = 6.0 Hz, 3H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 139.3, 135.5, 134.6, 133.6, 132.0, 129.9, 61.7, 49.5, 45.6, 34.5, 31.0, 27.7, 21.8, 19.6; MS (ESI) m/z 405.1(100 %, [M+H]+).
(0314)
1'-([1,1'-ビフェニル]-2-イルスルホニル)-4-メチル-1,4'-ビピペリジン: 4-メチル-1,4'-ビピペリジンと[1,1'-ビフェニル]-2-スルホニルクロリド間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:9のMeOH : EtOAc)によってこの化合物を黄色固形物(>95%)として得た。mp 106-109℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.12 (dd, J = 8.0, 1.6 Hz, 1H), 7.56 (td, J = 7.6, 1.6 Hz, 1H), 7.46 (td, J = 7.6, 1.6 Hz, 1 H), 7.39 (m, 5 H), 7.30 (dd, J = 7.6, 1.6 Hz, 1 H), 3.29 (d, J = 12.8, 2 H), 2.71 (d, J = 10.8 Hz, 2 H), 2.22 (td, J = 12.6, 2.5 Hz, 3 H), 2.09 (t, J = 10.4 Hz, 2 H), 1.90 -1 49 (m, 4 H), 1.21 (m, 5 H), 0.88 (d, J = 6.0 Hz, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 141.6, 139.7, 137.1, 133.0, 132.2, 130.3, 129.6, 127.7, 127.5, 61.7, 49.3, 44.4, 34.4, 31.0, 27.2, 21.8; MS (ESI) m/z 399.2(100 %, [M+H]+).
(0315)
N-(4-((4-メチル-[1,4'-ビピペリジン]-1'-イル)スルホニル)ナフタレン-1-イル)アセトアミド: 4-メチル-1,4'-ビピペリジンと4-アセトアミドナフタレン-1-スルホニルクロリド間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:9のMeOH : CH2Cl2)によってこの化合物を黄色固形物(64%)として得た。mp 113-117℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.51 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.09 (m, 2H), 7.87 (s, 1 H), 7.66 (d, J = 7.6 Hz, 1 H), 7.48 (m, 2 H), 3.86 (d, J = 9.6 Hz, 2 H), 2.80 (d, J = 11.6 Hz, 2 H), 2.52 (t, J = 12.4 Hz, 2 H), 2.36 (t, J = 12.8 Hz, 1 H), 2.31 (s, 3 H), 2.15 ( t, J = 11.6 Hz, 3 H), 1.83 (d, J =13.6 Hz, 2 H), 1.56 (m, 4 H), 1.24 (m, 3 H), 0.88 (d, J = 6.0 Hz, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 169.5, 133.3, 133.2, 130.6, 129.5, 129.4, 128.1, 127.7, 124.3, 123.9,123.4, 61.6, 49.3, 45.3, 33.7, 30.7, 27.2, 24.0, 21.6; MS (ESI) m/z 430.2 (100 %, [M+H]+).
(0316)
5-((4-メチル-[1,4'-ビピペリジン]-1'-イル)スルホニル)イソキノリン: 4-メチル-1,4'-ビピペリジンとイソキノリン-5-スルホニルクロリド間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:9のMeOH : EtOAc)によってこの化合物を白色固形物(51%)として得た。mp 123 - 126℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.33 (s, 1 H), 8.66 (d, J = 6.0 Hz, 1 H), 8.48 (d, J = 6.0 hz, 1 H), 8.36 (dd, J = 7.6, 1.6 Hz, 1 H), 8.19 (d, J = 6.0 Hz, 1 H), 7.69 (dd, J = 8.2, 7.4 Hz, 1H), 3.90 (d, J = 12.4 Hz, 2 H), 2.74 (d, J = 10.8 Hz, 2 H), 2.51 (td, J = 12.0, 2.4 Hz, 2 H), 2.21 (m, 1 H), 2.06 (m, 2 H), 1.81 (d, J = 11.6 Hz, 2 H), 1.56 (m, 4 H), 1.27 (m, 1 H), 1.15 (m, 2 H), 0.86 (d, J = 6.4 Hz, 3 H) ; 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 153.2, 145.1, 134.0, 133.7, 132.6, 131.9, 129.1, 125.8, 117.7, 61.4, 49.9, 45.6, 34.5, 31.0, 27.7, 21.6; MS (ESI) m/z 374.2(100 %, [M+H]+).
(0317)
1'-((4-ブロモ-2-エチルフェニル)スルホニル)-4-メチル-1,4'-ビピペリジン: 4-メチル-1,4'-ビピペリジンと4-ブロモ-2-エチルベンゼン-1-スルホニルクロリド間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:9のMeOH : EtOAc)によってこの化合物を白色固形物(92%)として得た。mp 87 - 91℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.73 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.50 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 7.42 (dd, J = 8.4, 2.0 Hz, 1 H), 3.75 (d, J = 12.4 Hz, 2 H), 2.96 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 2.83 (d, J = 7.6 Hz, 2 H), 2.60 (td, J = 12.4, 2.4 Hz, 2 H), 2.34 (m, 1 H), 2.13 (m, 2 H), 1.84 (d, J = 7.6 Hz, 2 H), 1.57 (m, 4 H), 1.25 (m, 6 H), 0.89 (d, J =6.4 Hz, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 145.2, 134.8, 133.9, 131.7, 129.0, 127.8, 61.6, 49.5, 45.1, 34.4, 30.9,27.7, 25.9, 21.8, 15.4; MS (ESI) m/z 429.1 (100 %, [M+]+), 431.1 (100 %, [M+2]+).
(0318)
1'-((2,4-ジクロロである-6-メチルフェニル)スルホニル)-4-メチル-1,4'-ビピペリジン: 4-メチル-1,4'-ビピペリジンと2,4-ジクロロ-6-トルエン-1-スルホニルクロリド間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:9のMeOH : EtOAc)によってこの化合物を白色固形物(93%)として得た。mp 89 - 91℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.37 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.19 (dd, J = 2.3, 0.9 Hz, 1H), 3.79 (d, J = 12.7 Hz, 2H), 2.93 - 2.73 (m, 4H), 2.67 (s, 3H), 2.45 - 2.27 (m, 1H), 2.14 (td, J = 11.3, 2.5 Hz, 2H), 1.83 (dd, J = 12.3, 3.4 Hz, 2H), 1.57 (dtd, J = 24.4, 11.6, 4.0 Hz, 4H), 1.30 (ddt, J = 12.8, 6.4, 3.7 Hz, 1H), 1.18 (qd, J = 12.0, 3.9 Hz, 2H), 0.89 (d, J = 6.9 Hz, 3H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 143.7, 137.7, 135.3, 134.2, 131.6, 130.2, 61.7, 49.5, 45.0, 34.6, 31.0, 27.9, 24.0, 21.8; MS (ESI) m/z 405.1(100 %, [M+H]+).
(0319)
1'-((5-ブロモ-2,3-ジヒドロベンゾフラン-7-イル)スルホニル)-4-メチル-1,4'-ビピペリジン: 4-メチル-1,4'-ビピペリジンと5-ブロモ-2,3-ジヒドロベンゾフラン-7-スルホニルクロリド間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:9のMeOH : EtOAc)によってこの化合物を白色固形物(86%)として得た。mp 128 - 132℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.62 (s, 1 H), 7.43 (s, 1 H), 4.70 (t, J = 8.9 H z, 2 H), 3.89 (d, J = 12.3Hz, 2 H), 3.24 (t, J = 9.0 Hz, 2 H), 2.79 (d, J = 11.9 Hz, 2 H), 2.50 (t, J = 12.4 Hz, 2 H), 2.27 (tt, J = 11.7, 3.7 Hz, 1 H), 2.12 (t, J = 11.5 Hz, 2H), 1.82 (d, J = 11.2 Hz, 2H), 1.60 (m, 4H), 1.30 (m, 1H), 1.17 (qd, J = 11.9, 3.7 Hz, 2 H), 0.88 (d, J = 6.3 Hz, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 156.4, 132.3, 132.2, 130.7, 121.0, 111.8, 73.0, 61.7, 49.5, 46.0, 34.6, 31.0, 29.0, 27.6, 21.9; MS (ESI) m/z 443.1 (90 %, [M+]+), 445.1 (100 %, [M+2]+).
(0320)
3-メチル-1'-(フェニルスルホニル)-1,4'-ビピペリジン: 3-メチル-1,4'-ビピペリジンとベンゼンスルホニルクロリド間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:9のMeOH : EtOAc)によってこの化合物を黄色固形物(63%)として得た。mp 132 - 135℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.79 - 7.69 (m, 2 H), 7.62 - 7.55 (m, 1 H), 7.55 - 7.44 (m, 2 H), 3.84 (d, J = 11.9 Hz, 2H), 2.89 - 2.51 (m, 2 H), 2.36 - 2.09 (m, 3 H), 2.02 (td, J = 11.2, 2.7 Hz, 1 H), 1.88 - 1.76 (m, 2 H), 1.75 - 1.44 (m, 7 H), 0.85 - 0.73 (m, 1 H), 0.81 (d, J = 6.4 Hz, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 136.3, 132.6, 129.0, 127.6, 61.5, 57.6, 49.5, 46.2, 33.29, 31.5, 27.2, 27.1, 25.9, 19.8; MS (ESI) m/z 323.2 (100 %, [M+H]+).
(0321)
1'-((4-メトキシフェニル)スルホニル)-3-メチル-1,4'-ビピペリジン: 3-メチル-1,4'-ビピペリジンと4-メトキシベンゼン-1-スルホニルクロリド間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:19のMeOH : CH2Cl2)によってこの化合物を黄色固形物(74%)として得た。mp 114 - 117℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.69 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.98 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 3.87 (s, 3H), 3.82 (d, J = 12.0 Hz, 2H), 2.87 - 2.62 (m, 2H), 2.22 (td, J = 12.0, 2.5 Hz, 3H), 2.06 (td, J = 11.8, 10.7, 2.9 Hz, 1H), 1.90 - 1.79 (d, J = 12.4 Hz, 2H), 1.79 - 1.46 (m, 7H), 0.88 - 0.75 (m, 1H), 0.83 (d, J = 6.4 Hz, 3H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 162.9, 129.8, 127.7, 114.1, 61.6, 57.3, 55.6, 49.4, 46.1, 33.1, 31.2, 27.0, 25.6, 19.8.; MS (ESI) m/z 353.2 (100 %, [M+H]+).
(0322)
1'-((5-ブロモ-2-メトキシフェニル)スルホニル)-4-メチル-1,4'-ビピペリジン: 4-メチル-1,4'-ビピペリジンと5-ブロモ-2-メトキシベンゼン-1-スルホニルクロリド間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:19のMeOH : CH2Cl2)によってこの化合物を黄色固形物(92%)として得た。mp 98 - 102℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ8.01 (d, J = 2.6, Hz, 1 H), 7.59 (dd, J = 8.8, 2.6 Hz, 1 H), 6.88 (d, J = 8.8 Hz, 1 H), 3.96 - 3.88 (d, J = 13.6 Hz, 2 H), 3.90 (s, 3 H), 2.84 (d, J = 10.9 Hz, 2 H), 2.64 (td, J = 12.5, 2.5 Hz, 2 H), 2.38 (d, J = 12.2 Hz, 1 H), 2.17 (t, J = 11.7 Hz, 2 H), 1.85 (d, J = 12.7 Hz, 2 H), 1.60 (m, 4 H), 1.40 - 1.14 (m, 3 H), 0.91 (d, J = 6.2 Hz, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 155.9, 136.8, 133.8, 128.7, 114.1, 112.3, 61.8, 56.3, 49.5, 45.9, 34.6, 31.0, 28.0, 21.9; MS (ESI) m/z 431.1 (100 %, [M+]+), 433.1 (100 %, [M+2]+).
(0323)
4-メチル-1'-((1-メチル-1H-イミダゾール-2-イル)スルホニル)-1,4'-ビピペリジン: 4-メチル-1,4'-ビピペリジンと1-メチル-1H-イミダゾール-2-スルホニルクロリド間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:19のMeOH : CH2Cl2)によってこの化合物を白色固形物(51%)として得た。mp 153 - 156℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.03 (d, J = 1.1 Hz, 1H), 6.92 (d, J = 1.1 Hz, 1H), 3.96 (d, J = 12.2 Hz, 2H), 3.89 (s, 3H), 3.05 (t, J = 12.5 Hz, 2H), 2.89 (d, J = 10.8 Hz, 2H), 2.54 (s, 1H), 2.24 (s, 2H), 1.94 (d, J = 12.5 Hz, 2H), 1.81 - 1.58 (m, 4H), 1.31 (s, 3H), 1.06 - 0.79 (d, , J = 8.0 Hz, 3H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 142.8, 128.2, 124.4, 61.8, 49.4, 46.6, 34.8, 34.1, 30.9, 27.3, 21.7; MS (ESI) m/z 327.2 (100 %, [M+H]+).
(0324)
1'-((2-クロロピリジン-3-イル)スルホニル)-4-メチル-1,4'-ビピペリジン: 4-メチル-1,4'-ビピペリジンと2-クロロピリジン-3-スルホニルクロリド間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:19のMeOH : CH2Cl2)によってこの化合物を白色固形物(71%)として得た。mp 122 - 124℃; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.55 (d, J = 4.9 Hz, 1 H), 8.38 (d, J = 7.8 Hz, 1 H), 7.40 (dd, J = 7.8, 4.8 Hz, 1 H), 3.92 (d, J = 13.0 Hz, 2 H), 2.83 (t, J = 12.5 Hz, 4 H), 2.38 (t, J = 11.5 Hz, 1H), 2.15 (t, J = 11.0 Hz, 2H), 1.86 (d, J = 12.5 Hz, 2H)., 1.72 - 1.53 (m, 4 H), 1.32 (m, 1 H), 1.18 (m, 2 H), 0.90 (d, J = 6.5 Hz, 3 H).; 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 148.4, 144.5, 136.9, 130.5, 118.5, 57.6, 45.6, 41.9, 30.7, 27.1, 24.0, 17.9; MS (ESI) m/z 358.1 (100 %, [M+H]+).
(0325)
1'-((2-フルオロピリジン-3-イル)スルホニル)-4-メチル-1,4'-ビピペリジン: 4-メチル-1,4'-ビピペリジンと2-フルオロピリジン-3-スルホニルクロリド間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:19のMeOH : CH2Cl2)によってこの化合物を白色固形物(>95%)として得た。mp 120 - 123℃; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.41 (d, J = 4.9 Hz, 1 H), 8.29 (dd, J = 9.2, 7.6 Hz, 1 H), 7.37 (dd, J = 7.6, 4.9 Hz, 1 H), 3.96 (d, J = 12.6 Hz, 2 H), 2.81 (d, J = 11.5 Hz, 2 H),, 2.67 (t, J = 12.4 Hz, 2 H), 2.34 (ddd, J = 11.5, 8.0, 3.5 Hz, 1 H), 2.15 (t, J = 10.4 Hz, 2 H), 1.87 (d, J = 12.1 Hz, 2 H), 1.74 - 1.55 (m, 4 H), 1.32 (ddt, J = 10.3, 6.9, 4.1 Hz, 1 H), 1.27 - 1.11 (m, 2 H), 0.91 (d, J = 6.4 Hz, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 154.75 (d, J = 244.0 Hz), 147.68 (d, J = 14.3 Hz), 138.2, 118.2, 117.9, 57.5, 45.6, 41.9, 30.7, 27.1, 23.8, 17.9; MS (ESI) m/z 342.2 (100 %, [M+H]+).
(0326)
3,5-ジメチル-4-((4-メチル-[1,4'-ビピペリジン]-1'-イル)スルホニル)イソオキサゾール: 4-メチル-1,4'-ビピペリジンと3,5-ジメチルイソオキサゾール-4-スルホニルクロリド間の反応後にCH2Cl2とヘキサンの混合物中の再結晶によってこの化合物を白色固形物(28%)として得た。mp 158 - 161℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.78 (d, J = 11.9 Hz, 2H), 2.80 (d, J = 11.5 Hz, 2H), 2.61 (s, 3H), 2.50 (t, J = 12.0 Hz, 2H), 2.38 (s, 3H), 2.27 (tt, J = 11.4, 3.5 Hz, 1H), 2.14 - 2.06 (m, 2H), 1.87 (d, J = 11.6 Hz, 2H), 1.72 - 1.50 (m, 4H), 1.30 (m, 1H), 1.25 - 1.09 (m, 2H), 0.89 (d, J = 6.4 Hz, 3H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 173.5, 158.0, 113.7, 61.3, 49.6, 45.4, 34.6, 31.0, 27.5, 21.9, 13.0, 11.4; MS (ESI) m/z 342.2 (100 %, [M+H]+).
(0327)
4-メチル-1'-((1-メチル-1H-イミダゾール-4-イル)スルホニル)-1,4'-ビピペリジン: 4-メチル-1,4'-ビピペリジンと1-メチル-1H-イミダゾール-4-スルホニルクロリド間の反応後にCH2Cl2とヘキサンの混合物中の再結晶によってこの化合物を黄色固形物(61%)として得た。mp 139 - 142℃; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.48 (s, 1H), 7.42 (s, 1H), 3.90 (d, J = 13.0 Hz, 2H), 3.75 (s, 3H), 2.80 (d, J = 9.9 Hz, 2H), 2.57 (t, J = 12.1 Hz, 2H), 2.26 (t, J = 11.5 Hz, 1H), 2.13 (t, J = 10.5 Hz, 2H), 1.83 (d, J = 12.1 Hz, 2H), 1.64 (m, 4H), 1.31 (s, br, 1H), 1.26 - 1.12 (m, 2H), 0.90 (d, J = 6.4 Hz, 3H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 139.0, 138.3, 124.4, 61.7, 49.5, 46.3, 34.6, 34.0, 31.1, 27.4, 21.9; MS (ESI) m/z 327.2 (100 %, [M+H]+).
(0328)
1-(メシチルスルホニル)-4-(1-メチルピペリジン-4-イル)ピペラジン: N,N-ジイソプロピルエチルアミン(1.5mmol)の存在下にCH2Cl2中で1-(1-メチルピペリジン-4-イル)ピペラジン(1.0mmol)と2,4,6-トリメチルベンゼンスルホニルクロリド(1.1mmol)間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:9のMeOH : CH2Cl2)によってこの化合物を無色のゲル(>95%)として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.91 (s, 2 H), 3.23 - 3.04 (m, 4 H), 2.85 (d, J = 12.2 Hz, 2 H), 2.59 (s, 6 H), 2.57 - 2.48 (m, 4 H), 2.26 (s, 3 H), 2.22 (s, 3 H), 2.19 (m, 1 H), 1.89 (t, J = 12.0 Hz, 2 H), 1.69 (d, J = 11.0 Hz, 2 H), 1.51 (qd, J = 12.3, 3.9 Hz, 2 H).; 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 142.5, 140.4, 131.9, 131.3, 61.4, 55.3, 48.4, 46.1, 44.7, 28.0, 23.0, 21.0.; MS (ESI) m/z 366.2 (60 %, [M+H]+), 414.2 (100 %, [M+K]+).
(0329)
1'-((6-クロロピリジン-3-イル)スルホニル)-4-メチル-1,4'-ビピペリジン: 4-メチル-1,4'-ビピペリジンと6-クロロピリジン-3-スルホニルクロリド間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:9のMeOH : CH2Cl2)によってこの化合物を白色固形物(80%)として得た。mp 178 - 182℃ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.75 (s, 1H), 7.99 (dd, J = 8.4, 2.3 Hz, 1H), 7.51 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 3.87 (d, J = 12.0 Hz, 2H), 2.81 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 2.35 (t, J = 12.0 Hz, 2H), 2.25 (t, J = 11.4 Hz, 1H), 2.14 (t, J = 11.3 Hz, 2H), 1.89 (d, J = 11.3 Hz, 2H), 1.75 - 1.58 (m, 4H), 1.33 (s, br, 1H), 1.21 (m, 2H), 0.91 (d, J = 6.6 Hz, 3H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 155.6, 148.6, 137.7, 132.1, 124.7, 61.3, 49.5, 46.0, 34.4, 30.9, 27.3, 21.8; MS (ESI) m/z 358.1(100 %, [M+H]+).
(0330)
1'-((5-ブロモピリジン-3-イル)スルホニル)-4-メチル-1,4'-ビピペリジン: 4-メチル-1,4'-ビピペリジンと5-ブロモピリジン-3-スルホニルクロリド間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:9のMeOH : CH2Cl2)によってこの化合物を白色固形物(79%)として得た。mp 171 - 173℃; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.81 (s, 2 H), 8.18 (t, J = 2.0 Hz, 1 H), 3.89 (d, J = 11.6 Hz, 2 H), 2.81 (d, J = 11.0 Hz, 2 H), 2.39 (td, J = 12.0, 2.5 Hz, 2 H), 2.25 (d, J = 11.9 Hz, 1 H), 2.14 (t, J = 11.6 Hz, 2 H), 1.90 (d, J = 12.8 Hz, 2 H), 1.78 - 1.57 (m, 4 H), 1.43 - 1.29 (m, 1 H), 1.20 (m, 2 H), 0.91 (d, J = 6.4 Hz, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 154.4, 146.2, 137.4, 134.5, 121.0, 61.2, 49.5, 46.0, 34.5, 31.0, 27.3, 21.8; MS (ESI) m/z 402.1 (100 %, [M+]+), 404.1 (100 %, [M+2]+).
(0331)
1,3-ジメチル-5-((4-メチル-[1,4'-ビピペリジン]-1'-イル)スルホニル)ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオン: 4-メチル-1,4'-ビピペリジンと1,3-ジメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-5-スルホニルクロリド間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:9のMeOH : CH2Cl2)によってこの化合物を白色固形物(78%)として得た。mp 212 - 215℃; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.07 (s, 1H), 3.94 (d, J = 12.8 Hz, 2 H), 3.50 (s, 3 H), 3.35 (s, 3 H), 2.93 (d, J = 11.6 Hz, 2 H), 2.85 (t, J = 12.7 Hz, 2 H), 2.56 (t, J = 11.7 Hz, 1 H), 2.26 (t, J = 11.9 Hz, 2 H), 1.92 (d, J = 11.9 Hz, 2 H), 1.75 - 1.58 (m, 4H), 1.48 - 1.20 (m, 3H), 0.93 (d, J = 6.0 Hz, 3H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 158.2, 150.8, 148.1, 112.6, 61.6, 49.2, 46.0, 37.9, 33.8, 30.7, 28.3, 27.5, 21.7; MS (ESI) m/z 385.2 (100 %, [M+H]+).
(0332)
1'-(メシチルスルホニル)-4-メチル-1,4'-ビピペリジン: 4-メチル-1,4'-ビピペリジンと2,4,6-トリメチルベンゼン-1-スルホニルクロリド間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:19のMeOH : CH2Cl2)によってこの化合物を黄色固形物(>95%)として得た。mp 62 - 65℃; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.94 (s, 2 H), 3.62 (d, J = 12.5 Hz, 2 H), 2.85 (d, J = 12.4 Hz, 2 H), 2.75 (t, J = 12.4 Hz, 2 H), 2.61 (s, 6 H), 2.34 (t, J = 11.5 Hz, 1 H), 2.29 (s, 3 H), 2.12 (t, J = 11.4 Hz, 2 H), 1.86 (d, J = 11.1 Hz, 2H), 1.63 (d, J = 13.4 Hz, 2 H), 1.50 (qd, J = 12.3, 4.0 Hz, 2H), 1.39 - 1.27 (s, br, 1 H), 1.27 - 1.13 (m, 2 H), 0.90 (d, J = 6.6 Hz, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 142.4, 140.4, 131.8, 131.7, 61.8, 49.6, 44.0, 34.6, 31.0, 27.7, 22.8, 21.9, 20.9; MS (ESI) m/z 365.2 (100 %, [M+H]+).
(0333)
2-クロロ-4-メチル-5-((4-メチル-[1,4'-ビピペリジン]-1'-イル)スルホニル)チアゾール: 4-メチル-1,4'-ビピペリジンと2-クロロ-4-メチルチアゾール-5-スルホニルクロリド間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:19のMeOH : CH2Cl2)によるこの化合物を白色固形物(64%)として得た。mp 117-119℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.85 (d, J = 13.5 Hz, 2 H), 2.82 (d, J = 11.0 Hz, 2 H), 2.60 (s, 3 H), 2.53 (t, J = 12.0 Hz, 2 H), 2.34 (t, J = 11.9 Hz, 1 H), 2.15 (t, J = 11.4 Hz, 2 H), 1.91 (d, J = 12.7 Hz, 2 H), 1.65 (m, 4 H), 1.45 - 1.29 (m, 1 H), 1.22 (m, 2 H), 0.89 (d, J = 6.2 Hz, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 155.4, 154.4, 128.9, 61.3, 49.5, 46.0, 34.3, 30.9, 27.3, 21.8, 16.8; MS (ESI) m/z 378.1 (100 %, [M+H]+).
(0334)
4-((4-メチル-[1,4'-ビピペリジン]-1'-イル)スルホニル)ベンゾニトリル: 4-メチル-1,4'-ビピペリジンと4-シアノベンゼン-1-スルホニルクロリド間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:19のMeOH : CH2Cl2)によってこの化合物を白色固形物(86%)として得た。mp 184 - 186℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.84 (q, J = 8.5 Hz, 4 H), 3.85 (d, J = 12.1 Hz, 2 H), 2.77 (d, J = 11.6 Hz, 2 H), 2.31 (t, J = 12.0 Hz, 2 H), 2.22 (tt, J = 11.6, 3.6 Hz, 1 H), 2.11 (t, J = 12.2 Hz, 2 H), 1.85 (d, J = 11.6 Hz, 2 H), 1.71 - 1.55 (m, 4 H), 1.31 (m, 1 H), 1.25 - 1.10 (m, 2 H), 0.89 (d, J = 6.4 Hz, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 140.9, 132.8, 128.1, 117.3, 116.4, 61.2, 49.5, 46.1, 34.6, 31.0, 27.4, 21.8; MS (ESI) m/z 348.2 (100 %, [M+H]+).
(0335)
4-メチル-1'-(ピリジン-3-イルスルホニル)-1,4'-ビピペリジン: 4-メチル-1,4'-ビピペリジンとピリジン-3-スルホニルクロリド間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:9のMeOH : CH2Cl2)によってこの化合物を黄色固形物(86%)として得た。mp 144 - 147℃; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.98 (s, 1 H), 8.82 (d, J = 4.9 Hz, 1 H), 8.04 (d, J = 8.1 Hz, 1 H), 7.49 (dd, J = 8.0, 4.9 Hz, 1 H), 3.88 (d, J = 12.3 Hz, 2 H), 2.78 (d, J = 11.9 Hz, 2 H), 2.32 (td, J = 12.0, 2.4 Hz, 2 H), 2.22 (tt, J = 11.6, 3.6 Hz, 1H), 2.12 (t, J = 11.6 Hz, 2 H), 1.86 (d, J = 11.9 Hz, 2 H), 1.75 - 1.55 (m, 4 H), 1.31 (m, 1 H), 1.17 (qd, J = 12.0, 3.7 Hz, 2 H), 0.89 (d, J = 6.5 Hz, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 153.3, 148.4, 135.2, 133.1, 123.7, 61.3, 49.5, 46.0, 34.5, 31.0, 27.3, 21.8; MS (ESI) m/z 324.2 (100 %, [M+H]+).
(0336)
6-((4-メチル-[1,4'-ビピペリジン]-1'-イル)スルホニル)ベンゾ[d]チアゾール: 4-メチル-1,4'-ビピペリジンとベンゾ[d]チアゾール-6-スルホニルクロリド間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:19のMeOH : CH2Cl2)によってこの化合物を黄色固形物(93%)として得た。mp 197 - 199℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.19 (s, 1 H), 8.41 (d, J = 1.8 Hz, 1 H), 8.24 (d, J = 8.6 Hz, 1 H), 7.86 (dd, J = 8.5, 1.8 Hz, 1 H), 3.89 (d, J = 12.3, 2 H), 2.75 (d, J = 10.7 Hz, 2 H), 2.45 - 2.02 (m, 5 H), 1.84 (d, J = 12.4 Hz, 2 H), 1.76 - 1.51 (m, 4 H), 1.44 - 1.05 (m, 3 H), 0.87 (d, J = 6.3 Hz, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 157.8, 155.5, 134.3, 133.5, 125.2, 124.1, 122.4, 61.4, 49.4, 46.2, 34.4, 30.9, 27.3, 21.8; MS (ESI) m/z 380.1 (100 %, [M+H]+).
(0337)
1'-((4-メトキシフェニル)スルホニル)-4-メチル-1,4'-ビピペリジン: 4-メチル-1,4'-ビピペリジンと4-メトキシベンゼン-1-スルホニルクロリド間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:19のMeOH : CH2Cl2)によってこの化合物を白色固形物(94%)として得た。mp 109 - 112℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.67 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.97 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 3.85 (s, 3H), 3.83 - 3.74 (d, J = 12.0 Hz, 2H), 2.76 (d, J = 11.7 Hz, 2H), 2.28 - 2.04 (m, 5H), 1.88 - 1.75 (d, J = 12.9 Hz, 2H), 1.72 - 1.54 (m, 4H), 1.28 (m, 1H), 1.23 - 1.08 (m, 2H), 0.87 (d, J = 6.3 Hz, 3H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 162.9, 129.8, 127.6, 114.1, 61.5, 55.6, 49.5, 46.2, 34.6, 31.0, 27.3, 21.9; MS (ESI) m/z 353.2 (100 %, [M+H]+).
(0338)
1'-((4'-クロロ-[1,1'-ビフェニル]-4-イル)スルホニル)-4-メチル-1,4'-ビピペリジン: 4-メチル-1,4'-ビピペリジンと4'-クロロ-[1,1'-ビフェニル]-4-スルホニルクロリド間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:9のMeOH : CH2Cl2)によってこの化合物を白色固形物(87%)として得た。mp 205 - 207℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.88 - 7.75 (m, 2 H), 7.67 (d, J = 8.4 Hz, 2 H), 7.51 (d, J = 8.5 Hz, 2 H), 7.43 (d, J = 8.5 Hz, 2 H), 3.87 (d, J = 12.0 Hz, 2 H), 2.76 (d, J = 10.9 Hz, 2 H), 2.41 - 2.02 (m, 5 H), 1.83 (dd, J = 12.3, 3.6 Hz, 2 H), 1.70 - 1.46 (m, 4 H), 1.37 - 1.05 (m, 3 H), 0.87 (d, J = 6.3 Hz, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 144.2, 137.7, 135.1, 134.7, 129.2, 128.5, 128.3, 127.4, 61.4, 49.5, 46.2, 34.6, 31.0, 27.3, 21.8; MS (ESI) m/z 433.2 (100 %, [M+H]+).
(0339)
1'-((4'-メトキシである-[1,1'-ビフェニル]-4-イル)スルホニル)-4-メチル-1,4'-ビピペリジン: 4-メチル-1,4'-ビピペリジンと4'-メトキシ-[1,1'-ビフェニル]-4-スルホニルクロリド間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:9のMeOH : CH2Cl2)によってこの化合物を白色固形物(92%)として得た。mp 195 - 198℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.85 - 7.72 (m, 2 H), 7.66 (d, J = 8.5 Hz, 2 H), 7.53 (d, J = 8.7 Hz, 2 H), 7.04 - 6.88 (m, 2 H), 3.88 (d, J = 12.0 Hz, 2 H), 3.84 (s, 3 H), 2.76 (d, J = 11.6 Hz, 2 H), 2.40 - 1.95 (m, 5 H), 1.83 (d, J = 10.7 Hz, 2 H), 1.71 - 1.48 (m, 4 H), 1.29 (m, 1 H), 1.23 - 1.04 (m, 2 H), 0.87 (d, J = 6.3 Hz, 3 H).; 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 160.0, 145.1, 133.9, 131.6, 128.4, 128.2, 126.9, 114.5, 61.5, 55.4, 49.5, 46.2, 34.6, 31.0, 27.4, 21.9; MS (ESI) m/z 429.2 (100 %, [M+H]+).
(0340)
2,7-ビス((4-メチル-[1,4'-ビピペリジン]-1'-イル)スルホニル)ナフタレン: N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.52mmol)の存在下にCH2Cl2(2.5mL)中で4-メチル-1,4'-ビピペリジン(0.39mmol)とナフタレン-2,7-ジスルホニルジクロリド(0.15mmol)との反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:19のMeOH : CH2Cl2)によってこの化合物を白色固形物(92%)として得た。mp 265 - 268℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.42 (s, 2 H), 8.04 (d, J = 8.7 Hz, 2 H), 7.89 (dd, J = 8.6, 1.7 Hz, 2 H), 3.92 (d, J = 12.3 Hz, 4 H), 2.75 (d, J = 11.7 Hz, 4 H), 2.32 (td, J = 12.1, 2.4 Hz, 4 H), 2.25 - 1.99 (m, 6 H), 1.84 (d, J = 11.5 Hz, 4 H), 1.72 - 1.51 (m, 8 H), 1.37 - 1.21 (m, 2 H), 1.21 - 1.07 (m, 4 H), 0.86 (d, J = 6.3 Hz, 6 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 136.0, 135.5, 131.3, 129.7, 129.2, 125.8, 61.4, 49.5, 46.2, 34.5, 31.0, 27.4, 21.8; MS (ESI) m/z 617.3 (100 %, [M+H]+)
(0341)
4-メチル-1,4'-ビピペリジンと4-ブロモ-2-(トリフルオロメトキシ)ベンゼン-1-スルホニルクロリド間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:19のMeOH : CH2Cl2)によって1'-((4-ブロモ-2-(トリフルオロメトキシ)フェニル)スルホニル)-4-メチル-1,4'-ビピペリジンを黄色固形物(67%)として得た。mp 108 - 110℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.83 (d, J = 8.9 Hz, 1 H), 7.58 - 7.45 (m, 2 H), 3.85 (d, J = 12.7 Hz, 2 H), 2.78 (dt, J = 11.9, 3.3 Hz, 2 H), 2.59 (td, J = 12.5, 2.5 Hz, 2 H), 2.29 (tt, J = 11.5, 3.6 Hz, 1 H), 2.11 (td, J = 11.5, 2.4 Hz, 2 H), 1.82 (dt, J = 12.7, 2.7 Hz, 2 H), 1.69 - 1.45 (m, 4 H), 1.40 - 1.24 (m, 1 H), 1.23 - 1.05 (m, 2 H), 0.88 (d, J = 6.3 Hz, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 146.2, 132.7, 130.1, 129.8, 127.9, 123.90, 121.3, 61.5, 49.5, 45.7, 34.59, 31.0, 27.8, 21.8; MS (ESI) m/z 485.1 (100 %, [M+H]+)
(0342)
4-メチル-1,4'-ビピペリジンと3-ブロモベンゼン-1-スルホニルクロリド間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:19のMeOH : CH2Cl2)によって1'-((3-ブロモフェニル)スルホニル)-4-メチル-1,4'-ビピペリジンを白色固形物(65%)として得た。mp 125 - 126℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.85 (s, 1 H), 7.66 (dd, J = 13.3, 7.9 Hz, 2 H), 7.37 (t, J = 7.9 Hz, 1 H), 3.80 (d, J = 11.7 Hz, 2 H), 2.74 (d, J = 11.0 Hz, 2 H), 2.16 (dt, J = 73.4, 11.4 Hz, 5 H), 1.81 (d, J = 12.7 Hz, 2 H), 1.60 (td, J = 12.4, 8.1 Hz, 4 H), 1.27 (dt, J = 11.0, 5.9 Hz, 1 H), 1.20 - 1.02 (m, 2 H), 0.85 (d, J = 6.2 Hz, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 138.2, 135.7, 130.5, 130.3, 126.1, 123.1, 61.3, 49.5, 46.1, 34.6, 31.0, 27.4, 21.9; MS (ESI) m/z 401.1 (100 %, [M+]+), 403.1 (100 %, [M+2]+).
(0343)
4-メチル-1,4'-ビピペリジンと4-クロロベンゼン-1-スルホニルクロリド間の反応後にCH2Cl2とヘキサンの混合物中の再結晶によって1'-((4-クロロフェニル)スルホニル)-4-メチル-1,4'-ビピペリジンを白色固形物(67%)として得た。mp 152 - 155℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.66 (d, J = 8.5 Hz, 2 H), 7.47 (d, J = 8.5 Hz, 2 H), 3.93 - 3.69 (m, 2 H), 2.80 (dt, J = 11.6, 3.4 Hz, 2 H), 2.23 (td, J = 12.0, 2.5 Hz, 3 H), 2.15 (t, J = 11.3 Hz, 2 H), 1.84 (d, J = 12.6 Hz, 2 H), 1.71 - 1.54 (m, 4 H), 1.42 - 1.26 (m, 1 H), 1.25 - 1.12 (m, 2 H), 0.87 (d, J = 6.2 Hz, 3H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 139.3, 134.6, 129.3, 129.0, 61.4, 49.4, 46.0, 34.2, 30.8, 27.2, 21.7; MS (ESI) m/z 357.2 (100 %, [M+H]+).
(0344)
4-メチル-1,4'-ビピペリジンと4-トルエン-1-スルホニルクロリド間の反応後にCH2Cl2とヘキサンの混合物中の再結晶によって4-メチル-1'-トシル-1,4'-ビピペリジンを白色固形物(67%)として得た。mp 139 - 142℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.59 (d, J = 8.2 Hz, 2 H), 7.28 (d, J = 8.2 Hz, 2 H), 3.80 (d, J = 11.9 Hz, 2 H), 2.79 (d, J = 11.1 Hz, 2 H), 2.39 (s, 3 H), 2.30 - 2.07 (m, 5 H), 1.84 (d, J = 10.9 Hz, 2 H), 1.69 - 1.53 (m, 4 H), 1.40 - 1.09 (m, 3 H), 0.86 (d, J = 6.2 Hz, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 143.5, 132.9, 129.6, 127.7, 61.6, 49.4, 46.0, 34.1, 30.8, 27.1, 21.7, 21.5; MS (ESI) m/z 337.2 (100 %, [M+H]+).
(0345)
4-メチル-1,4'-ビピペリジンと3,4-ジクロロベンゼン-1-スルホニルクロリド間の反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:19のMeOH : CH2Cl2)によって1'-((3,4-ジクロロフェニル)スルホニル)-4-メチル-1,4'-ビピペリジンを淡褐色固形物(86%)として得た。mp 160 - 162℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.81 (d, J = 1.9 Hz, 1 H), 7.66 - 7.44 (m, 2 H), 3.81 (d, J = 12.1 Hz, 2 H), 2.76 (d, J = 11.2 Hz, 2 H), 2.29 (td, J = 11.9, 2.5 Hz, 2 H), 2.20 (tt, J = 11.5, 3.5 Hz, 1 H), 2.10 (td, J = 11.5, 2.4 Hz, 2 H), 1.84 (d, J = 11.5 Hz, 2 H), 1.62 (ddt, J = 16.3, 12.5, 5.6 Hz, 4 H), 1.28 (tdd, J = 12.8, 10.3, 5.5 Hz, 1 H), 1.15 (qd, J = 11.8, 11.2, 3.7 Hz, 2 H), 0.87 (d, J = 6.5 Hz, 3H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 137.5, 136.2, 133.8, 131.1, 129.4, 126.6, 61.3, 49.5, 46.1, 34.6, 31.0, 27.4, 21.8; MS (ESI) m/z 391.1 (100 %, [M+H]+).
III. スルホニルクロリド及びアミン塩酸塩からスルホンアミドの調製のための一般手順
(0346)スルホニルクロリド(1.2mmol)、アミン塩酸塩(1.0mmol)、CHCl3(2mL)、水(2mL)及びK2CO3(2.5mmol)を順次15mlのフラスコに添加した。反応溶液を分液ロートへ移し、25mLのNaHCO3飽和溶液を添加した後、二相反応溶液を室温で20時間激しく撹拌した。得られた二相溶液をCH2Cl2(3×20mL)によって抽出し、合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物を溶離剤としてヘキサン : EtOAc(又はMeOH : CH2Cl2)混合物とのシリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィによって精製して、スルホンアミド生成物を形成した。
(0347)
1-(フェニルスルホニル)ピペリジン-4-オン: フラッシュクロマトグラフィ(1:1のヘキサン : EtOAc)によってこの化合物を白色固形物(93%)として得た。mp 105 - 108℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.85 - 7.73 (m, 2 H), 7.66 - 7.58 (m, 1 H), 7.58 - 7.48 (m, 2 H), 3.39 (t, J = 6.2 Hz, 4 H), 2.52 (t, J = 6.2 Hz, 4 H); 13C NMR (126MHz, CDCl3) δ 205.6, 136.3, 133.2, 129.3, 127.5, 45.9, 40.7. 分析データは、文献報告と一致した(Ellis, G.L.et al. J. Med. Chem. 2008, 51, 2170-2177)。
(0348)
1-(1-(メシチルスルホニル)ピペリジン-4-イル)アゼパン:フラッシュクロマトグラフィ(1:19のMeOH : CH2Cl2)によってこの化合物を橙色ゲル(90%)として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.94 (s, 2 H), 3.71 (d, J = 11.8 Hz, 2 H), 3.62 (s, br, 1 H), 3.18 - 2.89 (s, 4 H), 2.77 (t, J = 12.7 Hz, 2 H), 2.58 (s, 6 H), 2.29 (s, 3 H), 2.10 (d, J = 12.5 Hz, 2 H), 1.82 (s, 4 H), 1.76 - 1.54 (m, 6 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 142.8, 140.3, 132.0, 132.0, 132.0, 131.5, 63.3, 51.2, 43.8, 26.9, 26.6, 26.4, 22.8, 21.0.MS (ESI) m/z 365.2 (100 %, [M+H]+).
(0349)
1-(メシチルスルホニル)ピペリジン-4-オン: フラッシュクロマトグラフィ((1:19のMeOH : CH2Cl2)によってこの化合物を白色固形物(95%)として得た。mp 102 - 105℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.95 (s, 2 H), 3.50 (t, J = 6.2 Hz, 4 H), 2.61 (s, 6 H), 2.52 (t, J = 6.2 Hz, 4 H), 2.29 (s, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 201.6, 138.3, 135.6, 127.4, 126.8, 39.6, 36.3, 18.1, 16.2; MS (ESI) m/z 282.1 (100 %, [M+H]+).
(0350)
1-((2-ニトロフェニル)スルホニル)ピペリジン-4-オン: フラッシュクロマトグラフィ((1:19のMeOH : CH2Cl2)によってこの化合物を白色固形物(88%)として得た。mp 107 - 109℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.13 - 7.96 (m, 1 H), 7.81 - 7.58 (m, 3 H), 3.64 (t, J = 6.3 Hz, 4 H), 2.63 - 2.45 (t, J = 6.3 Hz, 4 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 205.4, 134.1, 131.9, 131.9, 130.9, 124.4, 45.5, 41.2; MS (ESI) m/z 285.0 (100 %, [M+H]+).
(0351)
1-((4-ニトロフェニル)スルホニル)ピペリジン-4-オン: フラッシュクロマトグラフィ((1:19のMeOH : CH2Cl2)によってこの化合物を白色固形物(82%)として得た。mp 192 - 195℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.47 - 8.33 (m, 2 H), 7.98 (d, J = 8.8 Hz, 2 H), 3.46 (t, J = 6.2 Hz, 4 H), 2.56 (t, J = 6.2 Hz, 4 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 204.5, 150.4, 142.7, 128.6, 124.6, 45.8, 40.7; MS (ESI) m/z 285.1 (100 %, [M+H]+).
(0352)
1-((3-ニトロフェニル)スルホニル)ピペリジン-4-オン: フラッシュクロマトグラフィ((1:19のMeOH : CH2Cl2)によってこの化合物を白色固形物(90%)として得た。mp 141 - 143℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.60 (s, 1 H), 8.48 - 8.43 (m, 1 H), 8.14 - 8.07 (m, 1 H), 7.78 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 3.46 (t, J = 6.2 Hz, 4 H), 2.56 (t, J = 6.2 Hz, 4 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 204.6, 148.5, 139.1, 132.8, 130.8, 127.6, 122.5, 45.8, 40.7; MS (ESI) m/z 285.1 (100 %, [M+H]+).
IV. 第三級アミンのメチル化のための一般手順
(0353)第三級アミン(0.1mmol)をアセトニトリル(3mL)に溶解し、CH3I(0.3mmol)を滴下した。得られた混合物を4時間撹拌還流した。真空中で有機溶媒の蒸発時に、対応する第四級アンモニウム塩を特に明記しない限り精製せずに得た。
(0354)
1,4-ジメチル-1-(1-(フェニルスルホニル)ピペリジン-4-イル)ピペリジン-1-イウムヨーダイド(N-メチル及びC-メチルはトランスである): 4-メチル-1'-(フェニルスルホニル)-1,4'-ビピペリジンのメチル化後にフラッシュクロマトグラフィ(1:9のEtOH : CH2Cl2)によってこのトランス異性体を黄色固形物(58%)として得た。mp 201-204℃; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.73 (m, 3 H), 7.65 (m, 2 H), 3.78 (d, J = 12.0 Hz, 2 H), 3.36 (d, J = 12.0 Hz, 3 H), 3.07 (t, J = 12.0 Hz, 2 H), 2.84 (s, 3 H), 2.18 (t, J = 12.4 Hz, 4 H), 1.78 (qd, J = 12.0, 3.9 Hz, 2 H), 1.67 (d, J = 12.0 Hz, 2 H), 1.54 (m, 3H), 0.91 (d, J = 4.0 Hz, 3 H); 13C NMR (100MHz, DMSO-d6) δ 135.1, 133.9, 130.0, 128.0, 72.0, 58.5, 45.6, 41.1, 27.9, 27.6, 24.6, 20.7; MS (ESI) m/z 337.2 (100 %, [M-I]+).
(0355)
1,4-ジメチル-1-(1-(フェニルスルホニル)ピペリジン-4-イル)ピペリジン-1-イウムヨーダイド(N-メチル及びC-メチルはシスである): 4-メチル-1'-(フェニルスルホニル)-1,4'-ビピペリジンのメチル化後にフラッシュクロマトグラフィ(1:9のEtOH : CH2Cl2)によってこのシス異性体を白色固形物(28%)として得た。mp 264 - 266℃; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.74 (m, 3 H), 7.65 (m, 2 H), 3.75 (m, 3 H), 3.53 (d, J = 16.0 Hz, 2 H), 3.16 (t, J = 12.0 Hz, 2 H), 2.81 (s, 3 H), 2.40 (t, J = 12.0 Hz, 2 H), 1.99 (d, J = 12.0, 2 H), 1.75 (m, 2 H), 1.51 (m, 5 H), 0.87 (d, J = 4.0 Hz, 3 H); 13C NMR (100MHz, DMSO-d6) δ 135.8, 133.8, 130.1, 128.0, 59.8, 58.3, 47.2, 45.0, 28.0, 26.9, 24.0, 20.5; MS (ESI) m/z 337.2 (100 %, [M-I]+).
(0356)
1-(1-((4-メトキシフェニル)スルホニル)ピペリジン-4-イル)-1-メチルピロリジン-1-イウムヨーダイド:この化合物を黄色固形物(>95%)として得た。mp 82 - 85℃; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.67 (d, J = 8.0 Hz, 2 H), 7.15 (d, J = 8.0 Hz, 2 H), 3.82 (s, 3 H), 3.72 (d, J = 12.0 Hz, 2 H), 3.49 (dd, J = 12.0, 8.0 Hz, 2 H), 3.30 (s, br, 3 H), 2.79 (s, 3 H), 2.17 (t, J = 12.0 Hz, 2 H), 2.02 (m, 6 H), 1.84 (m, 2 H); 13C NMR (100MHz, DMSO-d6) δ 163.4, 130.3, 126.6, 115.1, 70.1, 63.5, 56.3, 45.4, 43.3, 26.2, 21.3; MS (ESI) m/z 339.2 (100 %, [M-I]+).
(0357)
1-(1-(メシチルスルホニル)ピペリジン-4-イル)-1-メチルピロリジン-1-イウムヨーダイド: この化合物を黄色固形物(83%)として得た。mp 263 - 266℃; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.07 (s, 2 H), 3.60-3.43 (m, 5 H), 3.34 (dd, J = 19.2, 8.0 Hz, 2 H), 2.80 (s, 3 H), 2.73 (td, J = 12.6, 2.1 Hz, 2 H), 2.56 (s, 6 H), 2.25 (s, 3 H), 2.05 (m, 6 H), 1.71 (m, 2 H); 13C NMR (100MHz, DMSO-d6) δ 143.1, 140.1, 132.4, 131.6, 70.6, 63.4, 43.4, 43.2, 26.5, 22.8, 21.2, 20.9; MS (ESI) m/z 351.2 (100 %, [M-I]+).
(0358)
1-メチル-1-(1-(ナフタレン-1-イルスルホニル)ピペリジン-4-イル)ピロリジン-1-イウムヨーダイド: この化合物を黄色固形物(91%)として得た。mp 285 - 288℃; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.67 (dd, J = 8.4, 1.2 Hz, 1 H), 8.29 (dd, J = 8.4, 1.2 Hz, 1 H), 8.12 (m, 2 H), 7.69 (m, 3 H), 3.90 (d, J = 12.8 Hz, 2 H), 3.46 (dd, J = 9.6, 4.8 Hz, 2 H), 3.26 (m, 3 H), 2.75 (s, 3 H), 2.42 (s, 1 H), 2.02 (m, 7 H), 1.78 (m, 2 H); 13C NMR (100MHz, DMSO-d6) δ 135.2, 134.5, 132.1, 130.8, 129.6, 128.8, 128.6, 127.5, 125.2, 125.0, 70.1, 63.4, 45.0, 43.2, 26.6, 21.2; MS (ESI) m/z 359.2 (100 %, [M-I]+).
V. 第三級アミン塩酸塩の調製のための一般手順
(0359)第三級アミド(0.5mmol)を最小量のDCMに溶解し、得られた溶液を激しく撹拌し、その間に1,4-ジオキサン中のHCl(4M、2mL)を滴下した。溶媒の除去時に、表題アミン塩酸塩を白色固形物として得、精製しなかった。
(0360)
1-(1-((4-(ジフルオロメトキシ)フェニル)スルホニル)ピペリジン-4-イル)-4-メチルピペリジン-1-イウムクロリド: この化合物を白色固形物(>95%)として得た。mp 251 - 254℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 12.08 (s, 1 H), 7.73 (d, J = 8.0 Hz, 2 H), 7.25 (d, J = 7.9 Hz, 2 H), 6.63 (t, J = 72.4 Hz, 1 H), 3.93 (d, J = 9.9 Hz, 2 H), 3.33 (d, J = 9.8 Hz, 2 H), 3.03 (s, 1 H), 2.70 (s, 2 H), 2.35 (d, J = 11.7 Hz, 4 H), 2.20 - 1.90 (m, 2 H), 1.81 (t, J = 15.8 Hz, 4 H), 1.55 (s, 1 H), 0.99 (d, J = 6.0 Hz, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 154.5, 132.4, 129.7, 119.7, 115.2 (triplet), 62.8, 49.5, 45.1, 30.7, 29.7, 25.3, 20.9; MS (ESI) m/z 389.2 (100 %, [M-Cl]+).
(0361)
1-(1-((4-メトキシフェニル)スルホニル)ピペリジン-4-イル)-4-メチルピペリジン-1-イウムクロリド: この化合物を白色固形物(>95%)として得た。mp 247 - 250℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 12.03 (s, 1 H), 7.63 (d, J = 8.8 Hz, 2 H), 6.98 (d, J = 8.1 Hz, 2 H), 3.98 - 3.87 (s, 2 H), 3.85 (s, 3 H), 3.30 (s, 2 H), 2.99 (s, 1 H), 2.72 (s, 2 H), 2.30 (s, 4 H), 2.10 - 1.92 (s, 2 H), 1.78 (m, 4 H), 1.55 (s, 1 H), 1.13 - 0.89 (s, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 163.4, 129.8, 126.8, 114.5, 63.0, 55.8, 49.4, 45.2, 30.8, 29.8, 25.3, 20.9; MS (ESI) m/z 353.2 (100 %, [M-Cl]+).
(0362)
1-(1-((2,5-ジメトキシフェニル)スルホニル)ピペリジン-4-イル)-4-メチルピペリジン-1-イウムクロリド: この化合物を白色固形物(73%)として得た。mp 207 - 210℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 11.90 (s, 1 H), 7.31 (s, 1 H), 6.96 (d, J = 32.2 Hz, 2 H), 4.16 - 3.90 (s, 2 H), 3.83 (s, 3 H), 3.73 (s, 3 H), 3.24 (d, br, J = 75.5 Hz, 3H), 2.70 (s, 4 H), 2.46 - 2.18 (s, 2 H), 2.16 - 1.90 (s, 2 H), 1.88 - 1.68 (s, 4 H), 1.69 - 1.41 (s, 1 H), 0.96 (s, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 152.98, 150.81, 126.50, 120.42, 115.98, 114.02, 63.41, 57.05, 56.07, 49.66, 45.11, 30.79, 29.68, 26.09, 20.93; MS (ESI) m/z 383.2 (100 %, [M-Cl]+).
(0363)1-(1-(メシチルスルホニル)ピペリジン-4-イル)-4-メチルピペリジン-1-イウムクロリド: この化合物を白色固形物(69%)として得た。mp 259 - 262℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 11.73 (s, 1 H), 6.85 (s, 2 H), 3.93 - 3.46 (s, br, 2 H), 3.33 (s, br, 3 H), 2.74 (s, 3 H), 2.46 (s, 6 H), 2.18 (d, J = 4.3 Hz, 5 H), 2.06 - 1.07 (m, 8 H), 0.89 (s, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 142.99, 140.20, 132.08, 131.01, 63.44, 49.91, 43.52, 30.77, 29.54, 25.70, 22.85, 20.96; MS (ESI) m/z 365.2 (100 %, [M-Cl]+).
(0364)図30は、例示された化合物のNMRスペクトルを示す図である。
VI. 還元的アミノ化のための一般手順
(0365)ケトン(又はアセトン)(1.0mmol)、アミン(1.0mmol)、AcOH(1.0mmol)、及びCH2Cl2(又はDCE)(5ml)の混合物を室温で15分間撹拌した後にNaBH(OAc)3(1.5mmol)を添加した。得られた懸濁液を室温で反応時間が20時間から89時間までの範囲で撹拌した。次に反応物を0℃でNaHCO3飽和溶液を滴下することによって急冷し、生成した二相溶液をCH2Cl2(3×30ml)によって抽出した。合わせた有機層は、Na2SO4で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物を溶離剤としてMeOH : CH2Cl2(又はヘキサン : EtOAc)混合物とのシリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィによって精製して、還元的アミノ化生成物を得た。
(0366)
1-(1-(メシチルスルホニル)ピペリジン-4-イル)-4-メチルピペラジン: 反応時間20時間による1-(メシチルスルホニル)ピペリジン-4-オンと1-メチルピペラジン間の還元的アミノ化後にフラッシュクロマトグラフィ(1:9のMeOH : CH2Cl2)によってこの化合物を無色のゲル(74%)として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.91 (s, 2 H), 3.59 (d, J = 12.6 Hz, 2 H), 2.73 (t, J = 12.3 Hz, 2 H), 2.58 (s, 6 H), 2.55 (s, br, 4 H), 2.49 - 2.35 (s, br, 4 H), 2.36 - 2.29 (s, 1 H), 2.26 (s, 3 H), 2.25 (s, 3 H), 1.84 (d, J = 11.6 Hz, 2 H), 1.59 - 1.34 (m, 2 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 142.5, 140.4, 131.8, 131.7, 61.2, 55.3, 48.9, 45.9, 43.7, 27.8, 22.8, 20.9; MS (ESI) m/z 366.2 (100 %, [M+H]+).
(0367)
2-(1'-((2-ニトロフェニル)スルホニル)-[1,4'-ビピペリジン]-4-イル)エタノール: 反応時間38時間による1-((2-ニトロフェニル)スルホニル)ピペリジン-4-オンと2-(ピペリジン-4-イル)エタノール間の還元的アミノ化後にフラッシュクロマトグラフィ(1:9のMeOH : CH2Cl2)によってこの化合物を淡黄色固形物(37%)として得た。mp 130 - 133℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.96 (d, J = 7.3 Hz, 1 H), 7.74 - 7.61 (m, 2 H), 7.61 - 7.51 (m, 1 H), 3.88 (d, J = 12.9 Hz, 2 H), 3.65 (t, J = 6.6 Hz, 2 H), 2.82 (d, J = 11.6 Hz, 2 H), 2.73 (t, J = 12.5 Hz, 2 H), 2.33 (tt, J = 11.5, 3.6 Hz, 1 H), 2.14 (t, J = 11.6 Hz, 2 H), 1.84 (d, J = 10.7 Hz, 2 H), 1.73 - 1.65 (m, 2 H), 1.59 (qd, J = 12.3, 4.2 Hz, 3 H), 1.48 (q, J = 6.6 Hz, 2 H), 1.38 (m, 1 H), 1.20 (qd, J = 12.1, 3.8 Hz, 2 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 148.3, 133.5, 131.8, 131.5, 130.9, 124.0, 61.4, 60.5, 49.4, 45.9, 39.4, 32.6, 32.6, 27.7; MS (ESI) m/z 398.2 (100 %, [M+H]+).
(0368)
2-(1'-((4-ニトロフェニル)スルホニル)-[1,4'-ビピペリジン]-4-イル)エタノール: 反応時間71時間による1-((4-ニトロフェニル)スルホニル)ピペリジン-4-オンと2-(ピペリジン-4-イル)エタノールの還元的アミノ化後にフラッシュクロマトグラフィ(1:9のMeOH : CH2Cl2)によってこの化合物を淡黄色固形物(20%)として得た。mp 126 - 129℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.36 (d, J = 8.8 Hz, 2 H), 7.92 (d, J = 8.9 Hz, 2 H), 3.88 (d, J = 11.8 Hz, 2 H), 3.66 (t, J = 6.5 Hz, 2 H), 2.82 (d, J = 11.0 Hz, 2 H), 2.33 (td, J = 11.9, 2.2 Hz, 2 H), 2.25 (m, 1 H), 2.14 (t, J = 11.4 Hz, 2 H), 1.87 (d, J = 12.7 Hz, 2 H), 1.66 (m, 4 H), 1.48 (q, J = 6.6 Hz, 2 H), 1.40 (m, 1H), 1.32 - 1.13 (m, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 150.1, 142.4, 128.7, 124.3, 61.2, 60.4, 49.4, 46.1, 39.3, 32.5, 27.3; MS (ESI) m/z 398.2 (100 %, [M+H]+).
(0369)
2-(1'-((3-ニトロフェニル)スルホニル)-[1,4'-ビピペリジン]-4-イル)エタノール: 反応時間64時間による1-((3-ニトロフェニル)スルホニル)ピペリジン-4-オンと2-(ピペリジン-4-イル)エタノールの還元的アミノ化後にフラッシュクロマトグラフィ(1:9のMeOH : CH2Cl2)によってこの化合物を淡黄色固形物(25%)として得た。mp 128 - 131℃; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.59 (s, 1 H), 8.46 (d, J = 8.2 Hz, 1 H), 8.09 (d, J = 7.8 Hz, 1 H), 7.77 (t, J = 8.0 Hz, 1 H), 3.92 (d, J = 11.8 Hz, 2 H), 3.68 (t, J = 6.6 Hz, 2 H), 2.84 (d, J = 11.2 Hz, 2 H), 2.35 (t, J = 12.0 Hz, 2 H), 2.27 (tt, J = 11.6, 3.5 Hz, 1 H), 2.16 (t, J = 11.7 Hz, 3 H), 1.89 (d, J = 11.2 Hz, 2 H), 1.69 (m, 4 H), 1.50 (q, J = 6.7 Hz, 2 H), 1.47 - 1.35 (m, 1 H), 1.23 (qd, J = 12.0, 3.8 Hz, 2 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 148.3, 138.8, 133.0, 130.5, 127.2, 122.6, 61.2, 60.4, 49.4, 46.1, 39.2, 32.5, 32.4, 27.3; MS (ESI) m/z 398.2 (100 %, [M+H]+).
(0370)
1'-(メシチルスルホニル)-1,4'-ビピペリジン: 反応時間24時間による1-(メシチルスルホニル)ピペリジン-4-オンとピペリジン間の還元的アミノ化後にフラッシュクロマトグラフィ(1:9のMeOH : CH2Cl2)によってこの化合物を無色のゲル(67%)として得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (s, 2 H), 3.62 (d, J = 11.7 Hz, 2 H), 2.74 (t, J = 12.1 Hz, 2 H), 2.60 (s, 6 H), 2.52 - 2.40 (s, 4 H), 2.38 - 2.30 (m, 1 H), 2.28 (s, 3 H), 1.85 (d, J = 11.5 Hz, 2 H), 1.56 (m, 4 H), 1.52 - 1.44 (m, 2 H), 1.41 (m, 2 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 142.4, 140.4, 131.8, 131.8, 62.2, 50.2, 44.1, 27.5, 26.3, 24.6, 22.8, 20.9; MS (ESI) m/z 351.2 (100 %, [M+H]+).
(0371)
4-(1-(メシチルスルホニル)ピペリジン-4-イル)モルホリン: 反応時間89時間による1-(メシチルスルホニル)ピペリジン-4-オンとモルホリン間の還元的アミノ化後にフラッシュクロマトグラフィ(1:9のMeOH : CH2Cl2)によってこの化合物を無色のゲル(74%)として得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.92 (s, 2 H), 3.68 (s, 4 H), 3.60 (d, J = 12.9 Hz, 2 H), 2.75 (t, J = 12.3 Hz, 2 H), 2.59 (s, 6 H), 2.55 - 2.45 (s, 4 H), 2.27 (s, 4 H), 1.87 (d, J = 14.5 Hz, 2 H), 1.46 (qd, J = 11.6, 3.4 Hz, 2 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 142.5, 140.4, 140.4, 131.9, 131.6, 67.1, 61.5, 49.7, 43.6, 27.7, 22.8, 20.9; MS (ESI) m/z 353.2 (100 %, [M+H]+).
(0372)
1'-(メシチルスルホニル)-4-フェニル-1,4'-ビピペリジン: 反応時間48時間による1-(メシチルスルホニル)ピペリジン-4-オンと4-フェニルピペリジン間の還元的アミノ化後にフラッシュクロマトグラフィ(2:1のヘキサン : EtOAc)によってこの化合物を白色固形物(90%)として得た。mp 141 - 144℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.34 - 7.26 (m, 2 H), 7.25 - 7.16 (m, 3 H), 6.95 (s, 2 H), 3.66 (d, J = 12.5 Hz, 2 H), 3.03 (d, J = 11.0 Hz, 2 H), 2.78 (t, J = 12.5 Hz, 2 H), 2.62 (s, 6 H), 2.47 (m, 2 H), 2.30 (s, 3 H), 2.30 - 2.20 (m, 2 H), 1.99 - 1.66 (m, 6 H), 1.56 (qd, J = 12.2, 4.3 Hz, 2 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 142.5, 140.5, 131.9, 131.7, 128.4, 126.8, 126.2, 61.9, 50.0, 44.0, 42.9, 33.7, 27.7, 22.8, 21.0; MS (ESI) m/z 427.2 (100 %, [M+H]+).
(0373)
4-ベンジル-1'-(メシチルスルホニル)-1,4'-ビピペリジン: 反応時間48による1-(メシチルスルホニル)ピペリジン-4-オンと4-ベンジルピペリジン間の還元的アミノ化後にフラッシュクロマトグラフィ(2:1のヘキサン : EtOAc)によってこの化合物を淡褐色油状物(68%)として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.36 - 7.22 (m, 2 H), 7.21 - 7.06 (m, 3 H), 6.92 (s, 2 H), 3.61 (d, J = 12.4 Hz, 2 H), 2.92 (s, 2 H), 2.72 (td, J = 12.5, 2.4 Hz, 2 H), 2.58 (s, 6 H), 2.50 (d, J = 7.0 Hz, 2 H), 2.40-2.26(s, br, 1 H), 2.28 (s, 3 H), 2.08 (t, J = 17.9 Hz, 1 H), 1.85 (d, J = 12.8 Hz, 2 H), 1.64 (d, J = 12.8 Hz, 2 H), 1.49 (d, J = 11.5 Hz, 3 H), 1.41 - 1.12 (s, br, 2 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 142.5, 140.5, 140.4, 131.9, 131.7, 129.1, 128.2, 125.8, 61.9, 49.6, 44.0, 43.1, 38.1, 32.3, 27.6, 22.8, 21.0; MS (ESI) m/z 441.3 (100 %, [M+H]+).
(0374)
1'-(メシチルスルホニル)-3,5-ジメチル-1,4'-ビピペリジン: 反応時間88時間による3,5-ジメチルピペリジンと1-(メシチルスルホニル)ピペリジン-4-オン間の還元的アミノ化後にフラッシュクロマトグラフィ(1:19のMeOH : CH2Cl2)によってこの化合物を無色油状物(36%)として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.92 (s, 2 H), 3.61 (d, J = 12.4 Hz, 2 H), 2.87 - 2.66 (m, 4 H), 2.59 (s, 6 H), 2.47 - 2.29 (m, 1 H), 2.27 (s, 3 H), 1.82 (d, J = 13.6 Hz, 2 H), 1.74 - 1.39 (m, 7 H), 0.81 (d, J = 5.8 Hz, 6 H), 0.47 (q, J = 11.4 Hz, 1 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 142.4, 140.4, 131.8, 131.8, 61.8, 57.2, 44.1, 42.3, 31.4, 27.5, 22.8, 20.9, 19.7; MS (ESI) m/z 379.3 (100 %, [M+H]+).
(0375)
4-イソプロピル-1'-(メシチルスルホニル)-1,4'-ビピペリジン: 反応時間30時間による4-イソプロピルピペリジンと1-(メシチルスルホニル)ピペリジン-4-オン間の還元的アミノ化後にフラッシュクロマトグラフィ(1:19のMeOH : CH2Cl2)によってこの化合物を黄色油状物(46%)として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.91 (s, 2 H), 3.60 (d, J = 12.7 Hz, 2 H), 2.90 (dd, J = 11.5 Hz, 2 H), 2.72 (t, J = 12.4 Hz, 2 H), 2.59 (d, J = 2.3 Hz, 6 H), 2.38 - 2.29 (m, 1 H), 2.28 (s, 3 H), 2.06 (t, J = 10.6 Hz, 2 H), 1.85 (d, J = 11.2 Hz, 2 H), 1.63 (d, J = 11.3 Hz, 2 H), 1.49 (td, J = 12.1, 4.1 Hz, 2 H), 1.44 - 1.32 (m, 1 H), 1.30 - 1.14 (m, 2 H), 0.95 (m, 1 H), 0.83 (d, J = 6.7 Hz, 6 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 142.4, 140.4, 131.8, 131.7, 61.8, 50.0, 44.0, 42.6, 32.4, 29.6, 27.7, 22.8, 20.9, 19.8; MS (ESI) m/z 393.3(100 %, [M+H]+).
VII. 1'-(フェニルスルホニル)-2-(2-(プロパ-2-イン-1-イルオキシ)エチル)-1,4'-ビピペリジン及び1'-(フェニルスルホニル)-2-(プロパ-2-イン-1-イル)-1,4'-ビピペリジンの合成
(0376)
(0377)
2-(1'-(フェニルスルホニル)-[1,4'-ビピペリジン]-2-イル)エタン-1-オール: 1-(フェニルスルホニル)ピペリジン-4-オン(0.6004g、2.51mmol)及び2-(ピペリジン-2-イル)エタン-1-オール(0.9701g、7.52mmol)をトルエン(5mL)に溶解し、続いてAcOH(0.62ml、10.84mmol)を添加した。得られた溶液を80℃で3時間撹拌し、次に室温に冷却した。メタノール(5mL)中のNaCNBH3(0.2031g、3.22mmol)を滴下し、反応混合物を30分間撹拌した。反応物を0℃でNaHCO3飽和溶液(20mL)によって急冷した。得られた二相溶液をCH2Cl2(3×25mL)によって抽出し、合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物を溶離剤として1:19のMeOH : CH2Cl2の混合物とのシリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィによって精製して、還元的アミノ化生成物を黄色油状物(0.4445g、50%)として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.74 (d, J = 8.5 Hz, 2 H), 7.65 - 7.57 (m, 1 H), 7.56 - 7.47 (m, 2 H), 3.86 (dd, J = 11.1, 4.7 Hz, 3 H), 3.64 (dt, J = 11.1, 5.6 Hz, 1 H), 3.05 - 2.87 (m, 3 H), 2.44 - 2.30 (m, 2 H), 2.26 (td, J = 12.1, 2.5 Hz, 1 H), 1.88 - 1.29 (m, 12 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 135.9, 132.9, 129.1, 127.6, 60.7, 56.7, 56.0, 46.1, 45.8, 44.9, 31.1, 29.7, 28.5, 25.0, 24.2, 22.4; MS (ESI) m/z 353.2 (100 %, [M+H]+).
(0378)
(0379)
1'-(フェニルスルホニル)-2-(2-(プロパ-2-イン-1-イルオキシ)エチル)-1,4'-ビピペリジン: 2-(1'-(フェニルスルホニル)-[1,4'-ビピペリジン]-2-イル)エタン-1-オール(0.0830g、0.24mmol)を無水THF(2mL)に溶解し、続いてNaH(60%、0.0192g、0.48mmol)を0℃で添加した。次にフラスコをアルゴン流によって直ちにフラッシュし、アルゴンバルーンを取り付けたゴムセプタムによって密封した。反応溶液を0℃で15分間の撹拌し、臭化プロパルギル(トルエン中80%、0.075ml、0.67mmol)を注射器によって添加した。反応溶液を0℃で更に30分間撹拌し、室温に温め、3時間撹拌した後、無水THF(1mL)中の第2部分のNaH(60%、0.0175g、0.44mmol)を導入した。次に反応溶液を室温で18時間撹拌し、水(10mL)を添加して、反応物を急冷し、続いてCH2Cl2(3×10mL)で抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。シリカゲル(1:19のCH3OH : CH2Cl2)によるフラッシュクロマトグラフィによって精製した後、生成物を黄色ゲル(0.0132g、18%)として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.82 - 7.69 (m, 2 H), 7.64 - 7.56 (m, 1 H), 7.53 (m, 2 H), 4.06 (d, J = 2.4 Hz, 2 H), 3.83 (d, J = 11.9 Hz, 2H), 3.58 - 3.37 (m, 2 H), 2.73 (dd, J = 39.3, 10.5 Hz, 3 H), 2.35 (t, J = 2.4 Hz, 1 H), 2.25 (dtd, J = 26.4, 12.1, 11.7, 2.9 Hz, 3 H), 1.88 - 1.70 (m, 4 H), 1.69 - 1.19 (m, 8 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 136.0, 132.8, 129.1, 127.6, 79.6, 74.4, 67.1, 58.2, 55.5, 55.0, 46.4, 45.9, 45.4, 30.3, 29.8, 29.7, 25.6, 24.2, 23.0; MS (ESI) m/z 391.2 (100 %, [M+H]+).
(0380)
1'-(フェニルスルホニル)-2-(プロパ-2-イン-1-イル)-1,4'-ビピペリジン: 磁気撹拌棒を備えた25mLの火炎乾燥フラスコをアルゴンによってパージし、次に、アルゴンバルーンを取り付けたゴムセプタムで密封した。無水CH2Cl2(1mL)及び塩化オキサリル(0.039ml、0.45mmol)を順次注射器によって添加した。得られた溶液をドライアイス - アセトン浴中で-78℃に冷却した。無水DMSO(0.066ml、0.93mmol)を導入し、この溶液を-78℃で1.5時間撹拌した。1mLの無水CH2Cl2中の2-(1'-(フェニルスルホニル)-[1,4'-ビピペリジン]-2-イル)エタノール(0.1344g、0.38mmol)を滴下した。反応混合物を-78℃で1時間撹拌した後、Et3N(0.20mL、1.44mmol)を添加し、15分後に、反応溶液を室温に温め、2時間撹拌した後、6mLの水によって急冷した。NaHCO3飽和溶液(10mL)を添加し、得られた溶液をCH2Cl2(3×20mL)によって抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して、アルデヒド中間体を得、これを精製せずに次の工程に直接用いた。
(0381)無水CH2Cl2(2mL)中のトリフェニルホスフィン(0.4429g、1.69mmol)の溶液に、CH2Cl2(1mL)中の四臭化炭素(0.2653g、0.80mmol)の溶液を室温で滴下し、Et3N(0.45mL、3.39mmol)を注射器によって添加した後に得られた溶液を30分間撹拌した。次に、CH2Cl2(2mL)に溶解した上記アルデヒド中間体を滴下することによってその溶液を-78℃に冷却した。反応混合物を室温に温め、一晩撹拌した後、セライトパッドによって濾過した。濾液を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィ(2回、1:19のCH3OH : CH2Cl2、次に1:1のヘキサン : EtOAc)によって精製して、対応する二臭化物(0.0505g)を無色油状物として得た。
(0382)上記の二臭化物を無水THF(1mL)に溶解し、-78℃に冷却した。n-BuLi(0.090mL、ヘキサン中2.5M、0.225mmol)を注射器によって導入した。反応混合物を同じ温度で2.5時間撹拌し、NH4Cl(15mL)飽和溶液を添加することによって急冷した。次に、この混合物をEtOAc(3×15mL)によって抽出した。合わせた有機層をNa2SO4によって乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィ(1:1のヘキサン : EtOAc)によって精製して、最終アルキン(0.0165g、12% 3工程)を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.82 - 7.70 (m, 2 H), 7.63 - 7.57 (m, 1 H), 7.57 - 7.50 (m, 2 H), 3.85 (d, J = 12.1 Hz, 2 H), 2.78 - 2.57 (m, 3 H), 2.36 - 2.19 (m, 4 H), 1.94 (t, J = 2.7 Hz, 1 H), 1.89 - 1.39 (m, 9 H), 1.35 - 1.19 (m, 2 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 136.2, 232.7, 129.0, 127.6, 82.1, 70.0, 56.4, 55.5, 46.5, 46.0, 45.2, 31.8, 30.1, 26.0, 24.2, 23.2, 21.7; MS (ESI) m/z 347.2 (100 %, [M+H]+).
VIII. 1'-(フェニルスルホニル)-4-(2-(プロパ-2-イン-1-イルオキシ)エチル)-1,4'-ビピペリジン及び1'-(フェニルスルホニル)-4-(プロパ-2-イン-1-イル)-1,4'-ビピペリジンの合成
(0383)


(0384)
2-(1'-(フェニルスルホニル)-[1,4'-ビピペリジン]-4-イル)エタノール: 1-(フェニルスルホニル)ピペリジン-4-1(0.4923g、2.06mmol)及びAcOH(0.24mL、4.20mmol)をトルエン(4mL)に溶解し、得られた溶液を還流条件下で30分間撹拌し、続いて2-(ピペリジン-4-イル)エタノール(0.2562g、1.99mmol)を添加した。反応混合物を還流条件下で更に2時間撹拌し、次に室温に冷却した。メタノール(4mL)中のNaCNBH3(0.1590g、2.52mmol)を滴下し、この溶液を50分間撹拌した。反応物をNaHCO3飽和溶液(10mL)によって0℃に急冷した。得られた溶液をCH2Cl2(3×15mL)によって抽出し、合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。シリカゲル(1:19のCH3OH : CH2Cl2)によるフラッシュクロマトグラフィ処理して、望ましい生成物を黄色油状物(0.1613g、21%)として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.78 - 7.72 (m, 2 H), 7.62 - 7.56 (m, 1 H), 7.53 (ddt, J = 8.4, 6.7, 1.4 Hz, 2 H), 3.85 (d, J = 12.1 Hz, 2 H), 3.66 (t, J = 6.6 Hz, 2 H), 2.81 (d, J = 11.6 Hz, 2 H), 2.32 - 2.04 (m, 5 H), 1.83 (d, J = 13.0 Hz, 3 H), 1.75 - 1.54 (m, 4 H), 1.49 (q, J = 6.6 Hz, 2 H), 1.45 - 1.32 (m, 1 H), 1.29 - 1.14 (m, 2 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 136.1, 132.7, 129.0, 127.6, 61.4, 60.4, 49.4, 46.1, 39.3, 32.5, 27.3; MS (ESI) m/z 353.2 (100 %, [M+H]+).
(0385)
(0386)
1'-(フェニルスルホニル)-4-(2-(プロパ-2-イン-1-イルオキシ)エチル)-1,4'-ビピペリジン: 2-(1'-(フェニルスルホニル)-[1,4'-ビピペリジン]-4-イル)エタノール(0.0585g、0.17mmol)を無水THF(1mL)に溶解し、次にフラスコをアルゴン流によって直ちにフラッシュし、アルゴンバルーンを取り付けたゴムセプタムによって密封した。無水THF(0.5mL)に懸濁したKH(鉱油中30%、0.0275g、0.21mmol)を室温で注射器によって添加した。反応溶液を室温で45分間撹拌し、臭化プロパルギル(トルエン中80%、0.038mL、0.43mmol)を注射器によって滴下した。この溶液を室温で7.5時間撹拌した。溶媒を蒸発させた後、残留物をシリカゲル(1:19のCH3OH : CH2Cl2)によるフラッシュクロマトグラフィによって精製して、望ましい生成物を黄色ゲル(0.0072g、11%)として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.83 - 7.69 (m, 2 H), 7.63 - 7.57 (m, 1 H), 7.57 - 7.49 (m, 2 H), 4.11 (d, J = 2.3 Hz, 2 H), 3.95 - 3.80 (m, 2 H), 3.53 (t, J = 6.4 Hz, 2 H), 2.85 (d, J = 10.7 Hz, 2 H), 2.41 (t, J = 2.4 Hz, 1 H), 2.22 (m, 5 H), 1.87 (d, J = 12.6 Hz, 2 H), 1.79 - 1.59 (m, 4 H), 1.52 (q, J = 6.5 Hz, 2 H), 1.45 - 1.36 (m, 1 H), 1.25 (m, 2 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 136.06, 132.74, 129.01, 127.63, 79.89, 74.18, 67.58, 61.57, 58.05, 49.34, 46.08, 35.88, 32.57, 32.15, 27.11; MS (ESI) m/z 391.1 (100 %, [M+H]+).
(0387)
1'-(フェニルスルホニル)-4-(プロパ-2-イン-1-イル)-1,4'-ビピペリジン: 磁気撹拌棒を備えた25mLの火炎乾燥フラスコをアルゴンによってパージし、次にアルゴンバルーンを取り付けたゴムセプタムで密封した。無水CH2Cl2(1.5mL)及び塩化オキサリル(0.10mL、CH2Cl2中2M、0.20mmol)を順次注射器によって添加した。得られた溶液をドライアイス - アセトン浴中で-78℃に冷却した。無水DMSO(0.030mL、0.42mmol)を導入し、この溶液を-78℃で40分間撹拌した。1.5mLの無水CH2Cl2中の2-(1'-(フェニルスルホニル)-[1,4'-ビピペリジン]-4-イル)エタノール(0.0570g、0.16mmol)を滴下した。反応混合物を-78℃で2時間撹拌した後、Et3N(0.085mL、0.61mmol)を添加し、反応溶液を室温に温め、2時間撹拌した後に、25mLのNaHCO3飽和溶液によって急冷した。得られた溶液をCH2Cl2(3×25mL)によって抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して、アルデヒド中間体を得、精製せずに次の工程に直接用いた。
(0388)Bestmann Ohira試薬(ジメチル(1-ジアゾ-2-オキソプロピル)ホスホネート)をPietruszka, J.et al.[Pietruszka, J.et al.Synthesis 2006, 24, 4266-4268]によって報告されている実験手順に従って前もって調製した。Bestmann Ohira試薬(0.0441g、0.023mmol)及びメタノール(2mL)を0℃で混合し、続いてアルデヒド(0.5mLのCH2Cl2に溶解した)及びK2CO3(0.0523g、0.38mmol)を添加した。次にこの反応溶液を室温まで温め、一晩撹拌した。スラリー溶液を濾過し、分液ロートに注入し、25mLのCH2Cl2で希釈し、1N NaOH(25mL)によって洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過し、濃縮した。残留物をシリカゲル(1:9のCH3OH : CH2Cl2)によるフラッシュクロマトグラフィによって精製して、表題生成物(0.0282g、50%)を黄色固形物として得た。生成物が充分に純粋でない場合には、少量のヘキサンにより超音波で分解することができ、ヘキサン層の上澄みをガラスピペットによって除去して、不純物を取り除くことができる。mp 109 - 111℃; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.82 - 7.73 (m, 2 H), 7.67 - 7.59 (m, 1 H), 7.55 (dd, J = 8.4, 7.0 Hz, 2 H), 3.88 (d, J = 12.0 Hz, 2 H), 2.84 (s, 2 H), 2.35 - 2.03 (m, 7 H), 1.97 (t, J = 2.7 Hz, 1 H), 1.92 - 1.74 (m, 4 H), 1.67 (tt, J = 15.6, 7.8 Hz, 2 H), 1.46 (s, br, 1 H), 1.30 (s, br, 2 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 136.1, 132.8, 129.0, 127.6, 82.5, 69.5, 61.6, 49.1, 46.0, 35.4, 31.5, 27.0, 25.2; MS (ESI) m/z 347.2 (100 %, [M+H]+).
IX. (3-((4-メチル-[1,4'-ビピペリジン]-1'-イル)スルホニル)-4-(プロパ-2-イン-1-イルオキシ)フェニル)(フェニル)メタノンの合成
(0389)
(0390)
(4-メトキシ-3-((4-メチル-[1,4'-ビピペリジン]-1'-イル)スルホニル)フェニル)(フェニル)メタノン: 磁気撹拌棒を備えた25mlの火炎乾燥フラスコに1'-((5-ブロモ-2-メトキシフェニル)スルホニル)-4-メチル-1,4'-ビピペリジン(0.3686g、0.86mmol)及び無水THF(2.5mL)を添加した。フラスコをアルゴンによってパージし、次に、アルゴンバルーンを取り付けたゴムセプタムで密封した。得られた溶液をドライアイス-アセトン浴中で-78℃に冷却し、n-BuLi(0.68mL、ヘキサン中2.5M、1.70mmol)を注射器によって導入した。反応混合物を室温で50分間撹拌した。ベンズアルデヒド(0.125mL、1.23mmol)を注射器によって添加した。反応混合物を10分間撹拌した後、室温に温め、3時間にわたって撹拌した。次にこの反応物を20mLのNaHCO3飽和溶液によって急冷し、得られた溶液をCH2Cl2(3×20mL)によって抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィ(1:19のメタノール : CH2Cl2)によって精製して、アルコール中間体を無色のゲルとして得た。
(0391)二酸化マンガン(IV)(2.0087g、22.32mmol)をCH2Cl2(7mL)中のアルコール中間体の溶液に添加した。懸濁溶液を室温で36時間撹拌した。次に反応混合物をセライトのパッドによって濾過し、濾液を減圧下で濃縮して、望ましい生成物を白色固形物(0.2329g、60% 2工程)として得た。mp 52 - 56℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.33 (d, J = 2.2 Hz, 1 H), 8.04 (dd, J = 8.6, 2.2 Hz, 1 H), 7.82 - 7.67 (m, 2 H), 7.67 - 7.54 (m, 1 H), 7.48 (m, 2 H), 7.09 (d, J = 8.7 Hz, 1 H), 4.00 (s, 3 H), 3.91 (d, J = 12.7 Hz, 2 H), 2.79 (d, J = 11.1 Hz, 2 H), 2.63 (td, J = 12.5, 2.4 Hz, 2 H), 2.30 (tt, J = 11.6, 3.2 Hz, 1 H), 2.12 (t, J = 10.2 Hz, 2 H), ), 1.81 (d, J = 12.7 Hz, 2 H), 1.60 - 1.48 (m, 4 H), 1.29 (m, 1 H), 1.18 (qd, J = 11.6, 7.9 Hz, 2 H), 0.88 (d, J = 6.4 Hz, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 194.3, 159.9, 137.2, 136.4, 133.8, 132.6, 129.9, 129.8, 128.5, 127.0, 112.0, 61.8, 56.4, 49.5, 45.9, 34.6, 31.0, 28.0, 21.9; MS (ESI) m/z 457.1 (100 %, [M+H]+).
(0392)
(4-ヒドロキシ-3-((4-メチル-[1,4'-ビピペリジン]-1'-イル)スルホニル)フェニル)(フェニル)メタノン: 15mLフラスコ中のLiCl(0.0672g、1.6mmol)を真空中で火炎乾燥し、次にフラスコにアルゴンを充填した。無水DMF(3mL)中の(4-メトキシ-3-((4-メチル-[1,4'-ビピペリジン]-1'-イル)スルホニル)フェニル)(フェニル)メタノン(0.0733g、0.16mmol)を注射器によってフラスコに添加した。次にフラスコにアルゴンバルーンを取り付けた還流冷却器を備えつけた。反応を還流条件下で21.5時間行った。反応混合物を室温に冷却した後、懸濁液をセライトパッドによって濾過し、CH2Cl2によって洗浄した。溶媒を蒸発させた後、残留物をシリカゲル(1:19のメタノール : CH2Cl2)によるフラッシュクロマトグラフィによって精製して、望ましい生成物を橙色固形物(0.0560g、79%)として得た。mp 153 - 156℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.11 (d, J = 2.1 Hz, 1 H), 7.91 (dd, J = 8.6, 2.2 Hz, 1 H), 7.75 - 7.69 (m, 2 H), 7.63 - 7.55 (m, 1 H), 7.48 (ddd, J = 8.2, 6.6, 1.3 Hz, 2 H), 7.21 (d, J = 8.6 Hz, 1 H), 3.94 (d, J = 12.9 Hz, 2 H), 3.32 (d, J = 11.3 Hz, 2 H), 3.06 (t, J = 12.3 Hz, 1 H), 2.79 - 2.50 (m, 4 H), 2.25 (d, J = 12.3 Hz, 2 H), 1.83 (s, br, 6 H), 1.57 (m, 1 H), 0.98 (d, J = 6.4 Hz, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 194.3, 161.0, 137.4, 136.9, 133.2, 132.5, 129.7, 128.5, 128.1, 122.6, 119.1, 62.7, 49.5, 44.8, 30.9, 29.1, 26.0, 20.7; MS (ESI) m/z 443.1 (100 %, [M+H]+).
(0393)
(3-((4-メチル-[1,4'-ビピペリジン]-1'-イル)スルホニル)-4-(プロパ-2-イン-1-イルオキシ)フェニル)(フェニル)メタノン: (4-ヒドロキシ-3-((4-メチル-[1,4'-ビピペリジン]-1'-イル)スルホニル)フェニル)(フェニル)メタノン(0.1103g、0.25mmol)を無水DMF(1.5mL)に溶解し、続いてNaH(95%、0.0095g、0.38mmol)を0℃で添加した。次にフラスコをアルゴン流によって直ちにフラッシュし、アルゴンバルーンを取り付けたゴムセプタムによって密封した。反応溶液を室温に温め、30分間撹拌した。次にこの溶液を0℃に冷却し、臭化プロパルギル(トルエン中80%、0.032ml、0.29mmol)を注射器によって添加した。この溶液を室温まで徐々に温め、17時間撹拌した。反応溶液をCH2Cl2(25mL)で希釈し、NaHCO3飽和溶液(25ml)及び20% LiCl溶液(25mL)によって洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。シリカゲル(1:19のメタノール : CH2Cl2)によりフラッシュクロマトグラフィ処理して、望ましい生成物を黄色油状物(0.0290g、24%)として得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.37 (d, J = 2.2 Hz, 1 H), 8.07 (dd, J = 8.6, 2.2 Hz, 1 H), 7.76 (dd, J = 8.0, 1.5 Hz, 2 H), 7.67 - 7.58 (m, 1 H), 7.51 (t, J = 7.7 Hz, 2 H), 7.24 (d, J = 8.6 Hz, 1 H), 4.93 (d, J = 2.4 Hz, 2 H), 3.96 (d, J = 12.5 Hz, 2 H), 2.89 (d, J = 12.7 Hz, 2 H), 2.72 (t, J = 12.5 Hz, 2 H), 2.62 (t, J = 2.3 Hz, 1 H), 2.46 (s, 1 H), 2.24 (t, J = 11.4 Hz, 2 H), 1.90 (d, J = 11.4 Hz, 2 H), 1.73 - 1.56 (m, 4 H), 1.44 - 1.27 (m, 3 H), 0.93 (d, J = 5.8 Hz, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 194.2, 157.6, 137.0, 136.1, 133.9, 132.7, 130.8, 129.8, 128.5, 127.7, 113.5, 77.4, 77.4, 62.0, 56.8, 49.4, 45.9, 34.2, 30.9, 27.8, 21.7; MS (ESI) m/z 481.2 (100 %, [M+H]+).
X. 1'-(3-アジド-4-(プロパ-2-イン-1-イルオキシベンジル)-4-メチル-1,4'-ビピペリジンの合成:
(0394)
(0395)
1'-(3-アジド-4-(プロパ-2-イン-1-イルオキシ)ベンジル)-4-メチル-1,4'-ビピペリジン: メチル3-アジド-4-(プロパ-2-イン-1-イルオキシ)ベンゾエート(0.1085g,0.47 mmol)を無水CH2Cl2(2mL)に溶解し、この溶液を-78℃に冷却した。DIBAL-H(ヘキサン中1.2M、1.1mL、1.32mmol)を注射器によって滴下した。次に反応混合物を-78℃で1時間撹拌した後、1.5mLのCH3OH及び15mLのHCl(2.5M)を添加することによって急冷した。得られた溶液をCH2Cl2(4×15mL)で抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して、(3-アジド-4-(プロパ-2-イン-1-イルオキシ)フェニル)メタノールを得、これを次の工程に直接用いた。
(0396)CH2Cl2(2mL)中の(3-アジド-4-(プロパ-2-イン-1-イルオキシ)フェニル)メタノール(上記)の溶液にピリジニウムクロロクロメート(PCC)(0.3103g、1.44mmol)を添加した。反応混合物を室温で30分間撹拌し、1:1のヘキサン: EtOAcで希釈した。得られたる懸濁液を短いシリカゲルパッドで濾過し、濾過したケークを1:1のEt2O : ヘキサン及びEt2Oによって洗浄した。溶媒を蒸発させて、3-アジド-4-(プロパ-2-イン-1-イルオキシ)ベンズアルデヒドを得、プロトンNMRによって確認し、次の工程に直接用いた。
(0397)3-メチル-1,4'-ビピペリジン(0.0865g、0.048mmol)、3-アジド-4-(プロパ-2-イン-1-イルオキシ)ベンズアルデヒド(上記)、CH2Cl2(2mL)、AcOH(0.027mL、0.47mmol)及びNaBH(OAc)3(0.1425g、0.67mmol)の混合物を室温で28時間撹拌した。次に反応物をNaHCO3飽和溶液(20ml)によって0℃に急冷し、生成された二相溶液をCH2Cl2(4×15mL)によって抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。シリカゲル(1:9のメタノール : CH2Cl2)によりフラッシュクロマトグラフィ処理して、望ましい生成物を黄色ゲル(0.0378g、3工程にわたって22%)として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.10 - 6.87 (m, 3 H), 4.72 (d, J = 2.4 Hz, 2 H), 3.38 (s, 2 H), 3.03 - 2.85 (m, 4 H), 2.51 (t, J = 2.4 Hz, 1 H), 2.41 (s, 1 H), 2.24 (d, J = 11.8 Hz, 2 H), 1.93 (td, J = 11.9, 2.2 Hz, 2H), 1.84 (d, J = 9.9 Hz, 2 H), 1.61 (m, 5 H), 1.37 (s, 2 H), 0.91 (d, J = 5.4 Hz, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 148.5, 133.0, 128.9, 125.9, 120.9, 114.1, 78.0, 76.1, 62.7, 61.9, 56.9, 53.1, 49.4, 33.8, 30.8, 27.5, 21.7; MS (ESI) m/z 368.2 (100 %, [M+H]+).
XI. 1'-((5-アジド-2-(プロパ-2-イン-1-イルオキシ)フェニル)スルホニル)-4-メチル-1,4'-ビピペリジン
(0398)
(0399)
(4-メトキシ-3-((4-メチル-[1,4'-ビピペリジン]-1'-イル)スルホニル)フェニル)カルバメート: p-アニシジン-3-スルホン酸(1.2215g、6.02mmol)、水(10mL)、ベンジルクロロホーメート(1.03mL、7.21mmol)、K2CO3(2.0854g、15.11mmol)及びCHCl3(10mL)をフラスコに順次添加した。二相溶液を71時間激しく撹拌した。75mLの水を添加した後、この溶液をCHCl3(2×75mL)によって洗浄し、水性溶液を真空中で濃縮して、5-(((ベンジロキシ)カルボニル)アミノ)-2-メトキシベンゼンスルホネートカリウム塩を黄色固形物として形成した。
(0400)この塩をDMF(20mL)と混合し、懸濁液を0℃に冷却した。SOCl2(1.80mL、25.02mmol)を15分以内に滴下した。次に反応混合物を室温に温め、3時間撹拌した。反応溶液を氷水(50mL)に注入し、CH2Cl2(3×60ml)によって抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮し、ベンジル(3-(クロロスルホニル)-4-メトキシフェニル)カルバメートを形成し、これを精製せずに用いた。
(0401)4-メチル-1,4'-ビピペリジン(1.2090g、6.64mmol)、ベンジル(3-(クロロスルホニル)-4-メトキシフェニル)カルバメート(上記)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(3mL、18.19mmol)、及びCH2Cl2(15mL)の混合物を室温で21時間撹拌した。次にこの溶液をCH2Cl2(20mL)で希釈し、NaHCO3飽和溶液(35mL)及び食塩水(35mL)によって洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲル(1:19のメタノール : CH2Cl2)によるフラッシュクロマトグラフィによって精製して、望ましい生成物を白色固形物(2.3318g、77% 3工程)として得た。mp 124 - 127℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.80 (s, br, 1 H), 7.67 (d, J = 2.8 Hz, 1 H), 7.43 - 7.30 (m, 4 H), 6.95 (d, J = 9.0 Hz, 1 H), 6.89 (s, 1 H), 5.18 (s, 2 H), 3.89 (s, J = 3.4 Hz, 1 H), 3.87 (s, 3 H), 2.79 (d, J = 11.5 Hz, 2 H), 2.66 - 2.53 (m, 2 H), 2.29 (tt, J = 11.6, 3.5 Hz, 1 H), 2.19 - 2.06 (m, 2 H), 1.96 - 1.72 (m, 3 H), 1.68 - 1.48 (m, 4 H), 1.31 (ddt, J = 14.5, 6.7, 3.7 Hz, 1 H), 1.25 - 1.10 (m, 2 H), 0.89 (d, J = 6.3 Hz, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 153.6, 153.0, 135.9, 130.8, 128.6, 128.4, 128.3, 126.9, 125.1, 122.2, 113.2, 67.2, 61.8, 56.4, 49.5, 45.9, 34.6, 31.1, 27.9, 21.9; MS (ESI) m/z 502.2 (100 %, [M+H]+).
(0402)
4-メトキシ-3-((4-メチル-[1,4'-ビピペリジン]-1'-イル)スルホニル)アニリン: フラスコにメタノール(6mL)、ベンジル(4-メトキシ-3-((4-メチル-[1,4'-ビピペリジン]-1'-イル)スルホニル)フェニル)カルバメート(0.5270g、1.05mmol)及び3スパチュラの炭素上パラジウム(10質量%)を添加した。フラスコをゴムセプタムで密封し、続いて真空を用いて空気を排除し、水素バルーンを用いて水素を充填した。反応混合物を27時間撹拌し、セライトパッドによって濾過し、CH2Cl2によって洗浄した。溶媒を蒸発させて、生成物を黄色固形物(0.3591g、93%)として得た。mp 54 - 57℃; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.24 (d, J = 2.5 Hz, 1 H), 6.89 - 6.79 (m, 2 H), 3.91 (d, J = 13.0 Hz, 2 H), 3.84 (s, 3 H), 3.59 (s, 2 H), 2.84 (d, J = 9.3 Hz, 2 H), 2.60 (t, J = 12.5 Hz, 2 H), 2.36 (t, J = 11.9 Hz, 1 H), 2.19 (td, J = 11.6, 10.0, 2.7 Hz, 2 H), 1.84 (d, J = 12.5 Hz, 2 H), 1.70 - 1.50 (m, 4 H), 1.35 (s, br, 1 H), 1.26 (m, 2 H), 0.92 (d, J = 6.3 Hz, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 149.6, 140.0, 126.8, 120.8, 117.7, 114.3, 62.7, 56.7, 49.2, 45.4, 32.3, 30.1, 26.8, 21.2; MS (ESI) m/z 502.2 (100 %, [M+H]+).
(0403)
4-アジド-2-((4-メチル-[1,4'-ビピペリジン]-1'-イル)スルホニル)フェノール: 還流冷却器を備えた5mlの火炎乾燥フラスコに4-メトキシ-3-((4-メチル-[1,4'-ビピペリジン]-1'-イル)スルホニル)アニリン(0.2546g、0.69mmol)、無水トルエン(6mL)、無水CH2Cl2(1.5mL)及びBBr3(CH2Cl2中1M、3.5mL、3.5mmol)を添加した。得られた溶液を油浴中70℃で3時間実施した後、0℃に冷却し、6mLのメタノールによって急冷した。この溶液をセライトパッドによって濾過し、メタノールによって洗浄した。溶媒の蒸発させた後、残留物をシリカゲル(1.5:8.5のメタノール : CH2Cl2)によるフラッシュクロマトグラフィによって精製して、脱メチル化生成物を得た。1H NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ 7.79 (d, J = 2.7 Hz, 1 H), 7.51 (dd, J = 8.8, 2.7 Hz, 1 H), 7.13 (d, J = 8.7 Hz, 1 H), 3.95 (d, J = 13.2 Hz, 2 H), 3.49 (d, J = 10.8 Hz, 2H), 3.40 (m, 1 H), 3.26 (m, 2 H), 3.05 (t, J = 13.7 Hz, 2 H), 2.82 (t, J = 12.5 Hz, 2 H), 2.21 (dd, J = 11.6, 3.3 Hz, 2 H), 1.88 (d, J = 14.7 Hz, 2 H), 1.75 (d, J = 14.2 Hz, 3 H), 1.53 (q, J = 12.7 Hz, 2 H), 0.94 (d, J = 6.2 Hz, 3 H); 13C NMR (100 MHz, メタノール-d4) δ 155.9, 129.3, 125.2, 125.0, 121.6, 118.8, 62.9, 49.8, 44.5, 31.1, 28.5, 26.3, 20.0.
(0404)脱メチル化生成物(上記)を含有するフラスコに6M HCl(3mL)、THF(3mL)及びDMF(3mL)を添加した。この混合物を0℃に冷却し、H2O(1mL)中のNaNO2(0.0612g、0.89mmol)を5分間で滴下した。反応溶液を0℃で40分間撹拌し、H2O(1mL)中のNaN3(0.0699g、1.08mmol)を滴下した。次に得られた溶液を室温まで温め、その反応溶液を水(10mL)で希釈し、1MのNaOH溶液で塩基性にした後に、一晩撹拌した。得られた溶液をCH2Cl2(3×25mL)によって抽出し、合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲル(1:9のメタノール : CH2Cl2)によるフラッシュクロマトグラフィによって精製して、望ましい生成物(0.1921g、73% 2工程)を緑色油状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.15 (dd, J = 2.1, 1.0 Hz, 1 H), 7.12 - 7.08 (m, 2 H), 3.85 (d, J = 12.5 Hz, 2 H), 3.05 (d, J = 10.9 Hz, 2 H), 2.67 (t, J = 11.8 Hz, 1 H), 2.51 (td, J = 12.4, 2.4 Hz, 2 H), 2.40 (t, J = 10.4 Hz, 2 H), 2.04 (d, J = 11.1 Hz, 2 H), 1.83 - 1.61 (m, 4 H), 1.46 (dt, J = 19.6, 7.8 Hz, 3 H), 0.91 (d, J = 5.5 Hz, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 152.8, 132.1, 125.9, 121.3, 120.5, 118.8, 61.8, 49.4, 45.4, 32.7, 30.1, 26.5, 21.3; MS (ESI) m/z 380.2 (100 %, [M+H]+).
(0405)
1'-((5-アジド-2-(プロパ-2-イン-1-イルオキシ)フェニル)スルホニル)-4-メチル-1,4'-ビピペリジン: 4-アジド-2-((4-メチル-[1,4'-ビピペリジン]-1'-イル)スルホニル)フェノール(0.1190g、0.31mmol)を無水DMF(2.5mL)に溶解し、続いてNaH(60%、0.163g、0.41mmol)を0℃で添加した。次にフラスコをアルゴン流によって直ちにフラッシュし、アルゴンバルーンを取り付けたゴムセプタムによって密封した。反応溶液を0℃で15分間撹拌し、臭化プロパルギル(トルエン中80%、0.035mL、0.31mmol)を注射器によって添加した。この溶液を室温まで徐々に温め、一晩撹拌した。次にNaHCO3飽和溶液(20mL)を添加することによって反応物を急冷し、続いてEtOAc(3×25mL)で抽出した。有機相をNa2SO4で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した後に、合わせた有機層を水(40mL)及び食塩水(40mL)によって洗浄した。シリカゲル(1:19のメタノール : CH2Cl2)によるフラッシュクロマトグラフィ処理して、望ましい生成物(0.0442g、34%)を黄色ゲルとして得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.57 (dd, J = 2.1, 1.1 Hz, 1 H), 7.17 - 7.07 (m, 2 H), 4.77 (d, J = 2.4 Hz, 2 H), 3.90 (d, J = 12.9 Hz, 2 H), 2.80 (d, J = 11.3 Hz, 2 H), 2.66 (td, J = 12.5, 2.4 Hz, 2 H), 2.54 (t, J = 2.4 Hz, 1 H), 2.34 (tt, J = 11.6, 3.5 Hz, 1 H), 2.15 (td, J = 11.5, 2.7 Hz, 2 H), 1.90 - 1.75 (m, 2 H), 1.71 - 1.52 (m, 4 H), 1.42 - 1.27 (m, 1 H), 1.27 - 1.11 (m, 2 H), 0.88 (d, J = 6.3 Hz, 3 H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 151.7, 133.8, 129.5, 124.2, 122.0, 115.9, 77.3, 76.9, 61.9, 57.2, 49.4, 46.0, 34.4, 31.0, 27.8, 21.9; MS (ESI) m/z 418.2 (100 %, [M+H]+).
XII. アリールアジドによる1'-(フェニルスルホニル)-4-(プロパ-2-イン-1-イル)-1,4'-ビピペリジン化合物の合成
(0406)
(0407)1'-((4-アジドフェニル)スルホニル)-4-(プロパ-2-イン-1-イル)-1,4'-ビピペリジンの調製によって合成実験手順を表す。
(0408)
上記の詳細な確認によるスルホニルクロリド及びアミン塩酸塩からスルホンアミドの調製のための一般手順に従って1-((4-ニトロフェニル)スルホニル)ピペリジン-4-オンを調製した。
(0409)
上記の詳細な確認による還元的アミノ化のための一般の手順に従って2-(1'-((4-ニトロフェニル)スルホニル)-[1,4'-ビピペリジン]-4-イル)エタノールを調製した。
(0410)
2-(1'-((4-アミノフェニル)スルホニル)-[1,4'-ビピペリジン]-4-イル)エタノール: 10mLのフラスコに2-(1'-((4-ニトロフェニル)スルホニル)-[1,4'-ビピペリジン]-4-イル)エタノール(0.1002g、0.25mmol)、メタノール(3.5mL)及び1スパチュラの炭素上パラジウム(10質量%)を添加した。フラスコをゴムセプタムで密封し、続いて真空を用いて空気を排除し、水素バルーンを用いて水素を充填した。反応混合物を21時間撹拌し、セライトパッドによって濾過し、CH2Cl2によって洗浄した。溶媒を蒸発させて、生成物を黄色固形物(0.0815g、88%)として得た。mp 59 - 62℃; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.53 (d, J = 8.6 Hz, 2 H), 6.70 (d, J = 8.6 Hz, 2 H), 4.15 (s, 2 H), 3.80 (dt, J = 10.9, 3.1 Hz, 2 H), 3.68 (t, J = 6.7 Hz, 2 H), 2.82 (d, J = 10.7 Hz, 2 ), 2.30 - 2.06 (m, 5 H), 1.83 (d, J = 11.8 Hz, 2 H), 1.67 (m, 4 H), 1.50 (q, J = 6.7 Hz, 2H), 1.45 - 1.35 (m, 1 H), 1.35 - 1.15 (m, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 150.5, 129.8, 124.2, 113.9, 61.6, 60.5, 49.4, 46.1, 39.3, 32.6, 32.5, 27.3; MS (ESI) m/z 368.2 (100 %, [M+H]+).
(0411)
2-(1'-((4-アジドフェニル)スルホニル)-[1,4'-ビピペリジン]-4-イル)エタノール: 2-(1'-((4-アミノフェニル)スルホニル)-[1,4'-ビピペリジン]-4-イル)エタノール(0.1822g、0.50mmol)を含有する25mLのフラスコに6M HCl(2mL)、THF(2mL)及びDMF(2mL)を添加した。この混合物を0℃に冷却し、H2O(0.7mL)中のNaNO2(0.0445g、0.64mmol)を5分間で滴下した。反応溶液を0℃で20分間撹拌し、NaN3(0.0521g、0.80mmol)を添加した。次に得られた溶液を室温まで徐々に温め、一晩撹拌した。次に1M NaOH(30mL)を添加することによってこの反応物を急冷し、続いてCH2Cl2(3×30mL)で抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物をEtOAc(30mL)に溶解し、10% LiCl溶液(30mL)及び食塩水(3×30mL)によって洗浄して、表題生成物(0.0719g、36%)を淡黄色固形物として得た。mp 165-167℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.72 (d, J = 8.6 Hz, 2 H), 7.12 (d, J = 8.6 Hz, 2 H), 3.81 (d, J = 11.5 Hz, 2 H), 3.65 (t, J = 6.6 Hz, 2 H), 2.80 (d, J = 10.9 Hz, 2 H), 2.33 - 2.04 (m, 5 H), ), 1.82 (d, J = 12.1 Hz, 2 H), 1.64 (m, 5 H), 1.47 (q, J = 6.6 Hz, 2 H), 1.38 (m, 1 H), 1.18 (ddd, J = 15.4, 10.3, 3.7 Hz, 2 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 144.8, 132.3, 129.5, 119.4, 61.4, 60.4, 49.4, 46.1, 39.3, 32.6, 32.5, 27.3; MS (ESI) m/z 394.2 (100 %, [M+H]+).
(0412)
1'-((4-アジドフェニル)スルホニル)-4-(プロパ-2-イン-1-イル)-1,4'-ビピペリジン: 磁気撹拌棒を備えた25mlの火炎乾燥フラスコをアルゴンによってパージし、次にアルゴンバルーンを取り付けたゴムセプタムで密封した。無水CH2Cl2(1.5mL)及び塩化オキサリル(0.30mL、CH2Cl2中2M、0.60mmol)を順次注射器によって添加した。得られた溶液をドライアイス - アセトン浴中で-78℃に冷却した。無水DMSO(0.085mL、1.20mmol)を導入し、この溶液を-78℃で25分間撹拌した。2mLのCH2Cl2中の2-(1'-((4-アジドフェニル)スルホニル)-[1,4'-ビピペリジン]-4-イル)エタノール(0.1910g、0.49mmol)を滴下した。反応混合物を-78℃1時間撹拌した後、Et3N(0.24mL、1.73mmol)を添加し、反応溶液を室温に温め、1.5時間撹拌されした後に、20mLのNaHCO3飽和溶液によって急冷した。得られた二相溶液をCH2Cl2(3×20mL)によって抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して、アルデヒド中間体を得、これを精製せずに次工程に直接用いた。
(0413)生成されたアルデヒドを2mLのCH2Cl2に溶解し、それの半分はBestmann Ohira試薬反応のためのものであった。Bestmann Ohira試薬反応の手順を次の通り記載する。Bestmann Ohira試薬(ジメチル(1-ジアゾ-2-オキソプロピル)ホスホネート)(0.0570g、0.030mmol)及びメタノール(2mL)を0℃で混合し、続いてアルデヒド(1mLのCH2Cl2に溶解した)及びK2CO3(0.0670g、0.49mmol)を添加した。次に反応懸濁液を室温まで温め、一晩撹拌した。スラリー溶液を濾過し、分液ロートに注入し、20mLのCH2Cl2で希釈し、NaHCO3飽和溶液(20ml)及び1N NaOH(20mL)によって洗浄した。有機層をNa2SO4によって乾燥し、濾過し、真空中で濃縮した。残留物を少量のヘキサンにより超音波で分解し、ヘキサン層の上澄みをガラスピペットによって除去し、次にシリカゲル(1:9のCH3OH : CH2Cl2)によるフラッシュクロマトグラフィによって精製して、表題生成物を黄色固形物(0.0454g、48%)として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.74 (d, J = 8.7 Hz, 2 H), 7.15 (d, J = 8.7 Hz, 2 H), 3.85 (dd, J = 11.5, 3.8 Hz, 2 H), 2.87 (s, 2 H), 2.39 - 2.05 (m, 7 H), 1.97 (t, J = 2.1 Hz, 1 H), 1.85 (m, 4 H), 1.67 (q, J = 12.5 Hz, 2 H), 1.46 (s, br, 1 H), 1.30 (s, br, 2 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 144.8, 132.3, 129.5, 119.4, 82.6, 69.4, 61.5, 49.2, 46.0, 35.4, 31.7, 27.2, 25.3; MS (ESI) m/z 388.2 (100 %, [M+H]+).
(0414)
2-(1'-((4-アミノフェニル)スルホニル)-[1,4'-ビピペリジン]-4-イル)エタノールの合成の実験手順に従って2-(1'-((3-アミノフェニル)スルホニル)-[1,4'-ビピペリジン]-4-イル)エタノールを黄色固形物(91%)として調製した。mp 61-64℃; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.27 (t, J = 7.9 Hz, 1 H), 7.03 (s, 1 H), 6.97 (d, J = 7.7 Hz, 1 H), 6.91 (dd, J = 8.1, 2.3 Hz, 1 H), 3.82 (d, J = 12.8 Hz, 2 H), 3.60 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.32 (s, 2 H), 3.05 (d, J = 11.5 Hz, 2 H), 2.49 (t, J = 11.7 Hz, 1 H), 2.45 - 2.26 (m, 4 H), 1.97 (d, J = 11.8 Hz, 2 H), 1.80 (d, J = 13.3 Hz, 2 H), 1.62 (qd, J = 12.3, 4.1 Hz, 2 H), 1.57 - 1.50 (m, 1 H), 1.48 (q, J = 6.4 Hz, 2 H), 1.37 - 1.22 (m, 2 H); 13C NMR (100MHz, CD3OD) δ 149.2, 136.3, 129.4, 118.5, 115.4, 112.5, 61.6, 58.9, 49.2, 45.6, 38.4, 31.7, 31.0, 26.6; MS (ESI) m/z 368.2 (100 %, [M+H]+).
(0415)
2-(1'-((4-アジドフェニル)スルホニル)-[1,4'-ビピペリジン]-4-イル)エタノールの合成の実験手順に従って2-(1'-((3-アジドフェニル)スルホニル)-[1,4'-ビピペリジン]-4-イル)エタノールを淡黄色の固形物(>95%)として調製した。mp 168 - 171℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.54 - 7.45 (m, 2 H), 7.36 (s, 1 H), 7.24 - 7.18 (m, 1 H), 3.83 (d, J = 12.4 Hz, 2 H), 3.65 (t, J = 6.6 Hz, 2 H), ), 2.79 (d, J = 11.0 Hz, 2 H), 2.37 - 2.07 (m, 5 H), 1.83 (d, J = 11.0 Hz, 2 H), 1.72 - 1.54 (m, 5 H), 1.47 (q, J = 6.6 Hz, 2 H), 1.43 - 1.34 (m, 1 H), 1.20 (tdd, J = 15.5, 9.6, 4.2 Hz, 2 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 141.4, 138.2, 130.5, 123.8, 123.0, 118.0, 61.4, 60.4, 49.4, 46.1, 39.3, 32.6, 32.5, 27.3; MS (ESI) m/z 394.2 (100 %, [M+H]+).
(0416)
1'-((4-アジドフェニル)スルホニル)-4-(プロパ-2-イン-1-イル)-1,4'-ビピペリジンの合成の実験手順に従って1'-((3-アジドフェニル)スルホニル)-4-(プロパ-2-イン-1-イル)-1,4'-ビピペリジンを黄色固形物(49%)として調製した。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.59 - 7.48 (m, 2 H), 7.38 (s, 1 H), 7.27 - 7.23 (m, 1 H), 3.90 (d, J = 11.8 Hz, 2 H), 3.02 (s, 2 H), 2.53 (s, br, 1 H), 2.33 (m, 4 H), 2.16 (s, 2 H), 2.04 (d, J = 11.8 Hz, 2 H), 1.99 (t, J = 2.6 Hz, 1 H), 1.89 (d, J = 10.7 Hz, 2 H), 1.73 (qd, J = 12.3, 4.2 Hz, 2 H), 1.66 - 1.46 (s, br, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 141.6, 137.9, 130.6, 123.7, 123.2, 118.0, 82.1, 69.8, 61.8, 49.0, 45.7, 35.0, 30.6, 26.6, 25.0; MS (ESI) m/z 388.1 (100 %, [M+H]+).
(0417)
2-(1'-((4-アミノフェニル)スルホニル)-[1,4'-ビピペリジン]-4-イル)エタノールの合成の実験手順に従って2-(1'-((2-アミノフェニル)スルホニル)-[1,4'-ビピペリジン]-4-イル)エタノールを黄色固形物(90%)として調製した。mp 204 - 206℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.52 (dd, J = 8.1, 1.6 Hz, 1 H), 7.37 - 7.18 (m, 1 H), 6.85 - 6.58 (m, 2 H), 5.04 (s, 2 H), 3.84 (d, J = 12.4 Hz, 2 H), 3.64 (t, J = 6.4 Hz, 2 H), 2.86 (d, J = 10.7 Hz, 2 H), 2.45 (td, J = 12.3, 2.4 Hz, 2 H), 2.34 (t, J = 11.8 Hz, 1 H), 2.26 - 2.13 (m, 2 H), 1.86 (d, J = 13.3 Hz, 2 H), 1.70 (d, J = 11.4 Hz, 2 H), 1.60 (qd, J = 12.3, 4.1 Hz, 2 H), 1.52 - 1.20 (m, 6 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 146.2, 134.2, 130.3, 117.8, 117.6, 117.2, 61.7, 60.3, 49.4, 45.8, 39.1, 32.3, 32.0, 27.0; MS (ESI) m/z 368.2 (100 %, [M+H]+).
(0418)
2-(1'-((4-アジドフェニル)スルホニル)-[1,4'-ビピペリジン]-4-イル)エタノールの合成の実験手順に従って2-(1'-((2-アジドフェニル)スルホニル)-[1,4'-ビピペリジン]-4-イル)エタノールを淡黄色固形物(78%)として調製した。mp 152 - 155℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.92 (dd, J = 7.9, 1.5 Hz, 1 H), 7.56 (td, J = 7.7, 1.6 Hz, 1 H), 7.38 - 7.12 (m, 2 H), 3.94 (d, J = 13.0 Hz, 2 H), ), 3.67 (s, 2 H), 2.87 (d, J = 10.9 Hz, 2 H), 2.66 (td, J = 12.7, 2.4 Hz, 2 H), 2.35 (d, J = 12.5 Hz, 1 H), 2.18 (t, J = 11.3 Hz, 2 H), 1.87 (d, J = 12.6 Hz, 2 H), 1.71 (d, J = 10.8 Hz, 2 H), 1.66 - 1.54 (m, 2 H), 1.54 - 1.21 (m, 6 H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 138.3, 133.9, 131.7, 129.3, 124.6, 119.9, 61.9, 60.4, 49.4, 45.8, 39.2, 32.4, 32.3, 27.8; MS (ESI) m/z 394.2 (100 %, [M+H]+).
(0419)
1'-((4-アジドフェニル)スルホニル)-4-(プロパ-2-イン-1-イル)-1,4'-ビピペリジンの合成の実験手順に従って1'-((2-アジドフェニル)スルホニル)-4-(プロパ-2-イン-1-イル)-1,4'-ビピペリジンを黄色固形物(40%)として調製した。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.94 (dd, J = 7.9, 1.6 Hz, 1 H), 7.57 (td, J = 7.8, 1.6 Hz, 1 H), 7.31 - 7.27 (m, 1 H), 7.23 (td, J = 7.7, 1.1 Hz, 1 H), 3.94 (d, J = 12.7 Hz, 2 H), 2.87 (d, J = 11.0 Hz, 2 H), 2.67 (td, J = 12.4, 2.4 Hz, 2 H), 2.34 (ddt, J = 11.5, 7.3, 3.7 Hz, 1 H), 2.12 (m, 3 H), 1.96 (t, J = 2.6 Hz, 1 H), 1.82 (t, J = 15.2 Hz, 4 H), 1.60 (qd, J = 12.1, 4.2 Hz, 2 H), 1.46 (m, 1 H), 1.29 (ddd, J = 24.3, 12.1, 3.7 Hz, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 138.3, 133.8, 131.7, 129.4, 124.6, 119.9, 82.8, 69.3, 61.6, 49.2, 45.9, 35.6, 32.0, 28.0, 25.4; MS (ESI) m/z 388.1 (100 %, [M+H]+).
XIII. 3-(1'-(メシチルスルホニル)-[1,4'-ビピペリジン]-4-イル)プロパンニトリルの合成
(0420)
(0421)
t-ブチル4-(2-(トシルオキシ)エチル)ピペリジン-1-カルボキシレート: 2-(ピペリジン-4-イル)エタノール(1.3091g、10.15mmol)、Et3N(4.20mL、30.19mmol)及びCHCl3(10mL)を混合し、0℃で撹拌し、続いてCHCl3(4mL)中のジ-tert-ブチル-ジカルボネート(2.5770g、11.81mmol)を30分間滴下した。次に反応溶液を室温に温め、9時間撹拌した。反応溶液をNaHCO3飽和溶液(30mL)に注入し、CHCl3(3×30mL)によって抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して、Boc保護2-(ピペリジン-4-イル)エタノールを得、精製せずに次の工程に用いた。
(0422)Boc保護2-(ピペリジン-4-イル)エタノールをトシルクロリド(3.8988g、20.46mmol)及びDMAP(0.2514g、2.06mmol)とCH2Cl2(20ml)中で撹拌し、続いてEt3N(4.25mL、30.55mmol)を10分間滴下した。反応溶液を14時間撹拌し、NaHCO3飽和溶液(70mL)にゆっくりと注入し、CH2Cl2(3×70mL)によって抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィ(1:4のEtOAc : ヘキサン)によって精製して、表題生成物(2.6127g、67% 2工程)を黄色油状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.76 (d, J = 8.3 Hz, 2 H), 7.33 (d, J = 8.3 Hz, 2 H), 4.21 - 3.86 (m, 4 H), 2.58 (t, J = 12.8 Hz, 2 H), 2.43 (s, 3 H), 1.65 - 1.46 (m, 5 H), 1.46 - 1.30 (s, 9 H), 1.14 - 0.87 (m, 2 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 154.7, 144.8, 132.9, 129.8, 127.9, 79.3, 68.0, 43.7, 35.2, 32.1, 31.6, 28.4, 21.6; MS (ESI) m/z 406.2 (100 %, [M+H]+).
(0423)
tert-ブチル4-(2-シアノエチル)ピペリジン-1-カルボキシレート: 15mlのフラスコにtert-ブチル4-(2-(トシルオキシ)エチル)ピペリジン-1-カルボキシレート(0.4975g、1.30mmol)、KCN(0.6981g、10.74mmol)及びDMF(5mL)を添加した。得られた懸濁液を100℃で4時間激しく撹拌し、室温に冷却した。次に懸濁液をNaHCO3飽和溶液(30mL)にゆっくり注入し、CH2Cl2(3×30mL)によって抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。シリカゲル(2:1のヘキサン : EtOAc)によりフラッシュクロマトグラフィ処理して、望ましい生成物(0.2901g、94%)を無色のゲルとして得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.09 (s, 2 H), 2.67 (t, J = 12.4 Hz, 2 H), 2.36 (td, J = 7.1, 0.9 Hz, 2 H), 1.80 - 1.50 (m, 5 H), 1.42 (s, 9 H), 1.08 (qd, J = 12.2, 4.2 Hz, 2 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 154.7, 119.5, 79.4, 43.6, 34.9, 31.7, 31.4, 28.4, 14.5.
(0424)
3-(1'-(メシチルスルホニル)-[1,4'-ビピペリジン]-4-イル)プロパンニトリル: tert-ブチル4-(2-シアノエチル)ピペリジン-1-カルボキシレート(0.3280g、1.38mmol)を混合し、1,4-ジオキサン(4mL)中のHCl(1mL)と室温で2時間撹拌した。溶媒の蒸発させた後、生成された4-(2-シアノエチル)ピペリジン塩酸塩をNaHCO3飽和溶液によって0℃で中和し、続いてCH2Cl2(3×25mL)で抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過し、減圧下(低真空)で濃縮して、3-(ピペリジン-4-イル)プロパンニトリルを得、これを精製せずに次の工程に用いた。
(0425)上記3-(ピペリジン-4-イル)プロパンニトリル、1-(メシチルスルホニル)ピペリジン-4-オン(0.3860g、1.37mmol)、CH2Cl2(4mL)、AcOH(0.080mL、1.40mmol)を室温で25分間撹拌し、NaBH(OAc)3(0.4298g、2.03mmol)を添加した。得られた溶液を室温で50時間撹拌した。次にその反応物をNaHCO3飽和溶液によって0℃に急冷し、続いてCH2Cl2(3×25mL)で抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィ(1:19のMeOH : CH2Cl2)によって精製して、望ましい生成物(0.0252g、5% 2工程)を白色ゲルとして得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.94 (s, 2 H), 3.63 (d, J = 12.3 Hz, 2 H), 2.90 (d, J = 10.7 Hz, 2 H), 2.74 (td, J = 12.4, 2.4 Hz, 2 H), 2.60 (s, 6 H), 2.35 (t, J = 7.2 Hz, 3 H), 2.29 (s, 3 H), 2.14 (t, J = 9.6 Hz, 2 H), 1.84 (d, J = 12.7 Hz, 2 H), 1.71 (d, J = 12.3 Hz, 2 H), 1.63 - 1.34 (m, 5 H), 1.24 (m, 2 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 142.5, 140.4, 131.9, 131.7, 119.7, 61.8, 49.2, 44.0, 34.8, 31.8, 31.7, 27.6, 22.8, 21.0, 14.6; MS (ESI) m/z 404.2 (100 %, [M+H]+).
XIV. 3-(1-(メシチルスルホニル)ピペリジン-4-イル)-6-メチル-1,3-オキサジナンの合成
(0426)
(0427)
反応時間27時間による4-アミノブタン-2-オールと1-(メシチルスルホニル)ピペリジン-4-オンの間の還元的アミノ化後にフラッシュクロマトグラフィ(1:19のMeOH : CH2Cl2)によって4-((1-(メシチルスルホニル)ピペリジン-4-イル)アミノ)ブタン-2-オールを白色の固形物(82%)として得た。mp 105 - 108℃; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.95 (s, 2 H), 3.96 (ddd, J = 8.9, 5.8, 2.4 Hz, 1 H), 3.55 (d, J = 12.5 Hz, 2 H), 3.05 (dt, J = 11.9, 4.2 Hz, 1 H), 2.83 (tt, J = 12.5, 3.3 Hz, 2 H), 2.76 (td, J = 11.1, 2.9 Hz, 1 H), 2.61 (s, 7 H), 2.30 (s, 3 H), 1.96 (t, J = 12.8 Hz, 2 H), 1.63 (d, J = 14.9 Hz, 1 H), 1.47 (m, 1 H), 1.34 (m, 2 H), 1.16 (d, J = 6.2 Hz, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 142.6, 140.4, 131.9, 131.6, 69.5, 54.4, 45.5, 43.1, 43.0, 37.0, 31.8, 31.5, 23.6, 22.8, 21.0; MS (ESI) m/z 355.2 (100 %, [M+H]+).
(0428)
3-(1-(メシチルスルホニル)ピペリジン-4-イル)-6-メチル-1,3-オキサジナン: 還流冷却器を備えた15mLのフラスコに4-((1-(メシチルスルホニル)ピペリジン-4-イル)アミノ)ブタン-2-オール(0.1192g、0.34mmol)、パラホルムアルデヒド(0.0143g、0.48mmol)、Mg2SO4(0.2091g、1.74mmol)、ピリジニウムpトルエンスルホネート(PPTS)(0.0025g、0.01mmol)、及び無水トルエン(4mL)を添加した。懸濁液を3時間還流撹拌し、室温に冷却した。次に懸濁液を30mLのNaHCO3飽和溶液を含有する分液ロートに注入し、続いてCH2Cl2(3×30mL)で抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲル(1:19のMeOH : CH2Cl2)によるフラッシュクロマトグラフィによって精製して、望ましい生成物を無色ゲル(0.0555g、45%)として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.91 (s, 2 H), 4.61 (dd, J = 10.0, 2.3 Hz, 1 H), 4.16 (d, J = 10.1 Hz, 1 H), 3.57 (m, 3 H), 3.11 (ddt, J = 13.4, 4.4, 2.2 Hz, 1 H), 2.89 - 2.68 (m, 4 H), 2.58 (s, 6 H), 2.27 (s, 3 H), 1.92 (dp, J = 12.2, 2.8 Hz, 2 H), 1.65 - 1.29 (m, 4 H), 1.15 (d, J = 6.1 Hz, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 142.5, 140.4, 131.9, 131.6, 81.6, 73.6, 55.0, 46.5, 43.4, 30.3, 29.8, 29.2, 22.8, 21.8, 20.9; MS (ESI) m/z 367.2 (100 %, [M+H]+).
XV. 1'-([1,1'-ビフェニル]-4-イルスルホニル)-4-メチル-1,4'-ビピペリジンの合成
(0429)
(0430)
4-ブロモベンゼン-1-スルホニルクロリドと4-メチル-1,4'-ビピペリジン間のスルホンアミド形成反応後にフラッシュクロマトグラフィ(1:19のMeOH : CH2Cl2)によって1'-((4-ブロモフェニル)スルホニル)-4-メチル-1,4'-ビピペリジンを白色固形物(83%)として得た。mp 165-1 68℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.75 - 7.45 (m, 4 H), 3.81 (d, J = 11.9 Hz, 2 H), 2.75 (d, J = 11.5 Hz, 2 H), 2.38 - 1.96 (m, 5 H), 1.81 (d, J = 11.8 Hz, 2 H), 1.73 - 1.52 (m, 4 H), 1.28 (m, 1 H), 1.22 - 1.06 (m, 2 H), 0.87 (d, J = 6.4 Hz, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 135.2, 132.3, 129.1, 127.7, 61.3, 49.5, 46.1, 34.6, 31.0, 27.3, 21.9; MS (ESI) m/z 403.1 (100 %, [M+H]+).
(0431)
1'-([1,1'-ビフェニル]-4-イルスルホニル)-4-メチル-1,4'-ビピペリジン: 還流冷却器を備えた火炎乾燥フラスコに1'-((4-ブロモフェニル)スルホニル)-4-メチル-1,4'-ビピペリジン(0.2200g、0.55mmol)、フェニルボロン酸(0.1065g、0.87mmol)、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0.0609g、0.053mmol)、THF(8mL)及びNa2CO3(2M、0.8mL)を添加した。この混合物をFreeze Pump Thawサイクルによって脱ガスし、3時間還流した。室温に冷却した後に、反応懸濁液を水(25mL)で希釈し、10分間撹拌し、DCM(3×30mL)で抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過し、濃縮し、残留物をシリカゲル(1:19のMeOH : CH2Cl2)によるフラッシュクロマトグラフィによって精製して、標記生成物を白色固形物(0.0433g、21%)として得た。mp 178 - 181℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.81 (d, J = 8.4 Hz, 2 H), 7.72 (d, J = 8.4 Hz, 2 H), 7.64 - 7.56 (m, 2 H), 7.52 - 7.45 (m, 2 H), 7.45 - 7.37 (m, 1 H), 3.90 (d, J = 12.1 Hz, 2 H), 2.84 (d, J = 10.8 Hz, 2 H), 2.32 (td, J = 12.1, 2.5 Hz, 3 H), 2.20 (t, J = 11.9 Hz, 2 H), 1.91 (d, J = 12.6 Hz, 2 H), 1.77 - 1.57 (m, 4 H), 1.42 - 1.12 (m, 3 H), 0.90 (d, J = 5.9 Hz, 3 H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 145.6, 139.2, 134.6, 129.1, 129.1, 128.5, 128.2, 127.6, 127.3, 61.6, 49.4, 46.1, 34.1, 30.8, 27.1, 21.7; m/z 399.2 (100 %, [M+H]+).
実施例2. 生体外APC阻害分析
(0432)低分子抗がん化合物について生体外分析におけるAPC活性を阻害する能力を評価した。表Aは、各々の例示された化合物を測定したIC50を示すものである。
(0433)分析に必要とされる試薬は、(3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド; チアゾリルブルー; RPI corp.、cat# M92050); RPMI-1640又は最適な培地(すなわちDMEM)、フェノールレッド不含; 1M Hepes; 100mM ピルビン酸ナトリウム; 1000Xゲンタマイシン(50mg/ml); 100Xペニシリン/ストレプトマイシン/ファンギゾン; 1X PBS; トリトンX-100; 1N HCl及びイソプロパノールである。MTT溶液(10×)を作るために、MTT粉末を5mg/mLの最終濃度に完全RPMI(又はDMEM溶液)に溶解し、0.2μmフィルターでろ過によって滅菌した。MTT可溶化溶液は、10%トリトンX-100、0.1N及び80%イソプロパノールを含有した。MTT溶液を1プレートにつき12mLの完全培地で1Xに希釈した。培養皿(96ウェル)をインキュベータから取り出し、培養液を捨てた。プレートを1×PBSで3回洗浄した。100μlの1X MTT溶液を各ウェルに添加し、プレートを組織培養インキュベータにおいて細胞系によっては2〜4時間、インキュベートした。細胞をインキュベータから取り出し、MTT溶液を捨てた。200μlの1X MTT可溶化溶液を、マルチチャンネルピペッターを用いて各ウェルに添加し、細胞をオービタルシェーカーに10分間載置した。結果はマイクロタイタープレートリーダ(吸光度= 570nm、参照= 700nm)に読み込まれ、データを保存した。
(0434)阻害パーセントを阻害剤のない対照反応と相対して定量し、半数最大阻害濃度(IC50)値を阻害データにあてはめた4標準パラメータを用いて定量した。本明細書に用いられる用語「IC50」は、所定の生物学的プロセス(又はプロセスの成分)を50%だけ阻害するのに必要である量を示す生物学的又は生化学的な機能を阻害する際の化合物の有効性の定量的基準を意味する。
表A
結腸がんの治療のための類縁体。DLD-1においてIC50が100nM未満の類縁体を太字体で示す。









実施例3. 短縮型APC選択的阻害剤-1(TASIN-1)は、正常ヒト結腸上皮細胞(HCEC)及び野生型(WT) APCを有する他のがん細胞を残しつつAPCトランケーションを有するCRC系を死滅させ、固有の紡錘体形成を妨害し、APC切断細胞においてJNK依存的アポトーシス細胞死を誘導する。
(0435)2つの標準CRC細胞系における用量応答解析: HCT116(WT APC)及びDLD1(短縮型APC)により、リード化合物TASIN-1(短縮型APC選択的阻害剤)(図7(d))の識別につながった。この化合物は、DLD1細胞(IC50 = 63nM)に対して強力且つ選択的毒性を示したがHCT116細胞(IC50>10μM)に対しては示さなかった(図7(e))。TASIN-1の持続した処理はDLD1において軟寒天成長を阻止したがHCT116細胞においては阻止しなかった(図7(f)、11)
(0436)APCトランケーション依存性を確認するために、shRNAsを発現する2つの安定な非依存的ノックダウンDLD1細胞系を、短縮型APCに対して生成した。短縮型APC発現のノックダウンは、>90%のタンパク質減少によりTASIN-1に対してDLD1細胞の感受性を低下させ(図8、9)、関連したAPC依存的経路におけるAPC又はタンパク質がTASIN-1の標的であることを支持した。同様の作用が短縮型APCタンパク質を減少させたHT29細胞に見られた(図9a)。更に、短縮型APCの異所性発現は、TASIN-1に対してHCT116細胞及びHCT116 p53ヌル細胞を部分的に感受性にする(図9)。
(0437)APC状態を変化させたCRC細胞系のパネルにおいてTASIN-1を試験した。高度に異質な遺伝的背景にもかかわらず、結果はTASIN-1感受性とAPC状態間で一致した相関を示した(図9、10)。TASIN-1は、正常組織だけでなくWT APCを有する他のがん細胞型に由来するHCEC、ヒト気管支上皮細胞(HBEC)及びBJ線維芽細胞の生存度に影響しなかった。しかしながら、DU4475、短縮型APC 15を発現する乳がん細胞系は、TASIN-1に感受性があり、APCトランケーション依存性を再び支持した(図9'、データ表1)。
データ表1. 他のがんタイプのAPC状態及び由来.
(0438)TASIN-1は、DLD1細胞において、アポトーシスの誘発を表す、ポリ(ADPリボース)ポリメラーゼ1(PARP1)切断、ミトコンドリアからのシトクロムc放出を引き起こし、カスパーゼ3/7活性を誘導したが、HCT116細胞にはなかった(図12、12'(a〜c)、13)。更に、TASIN-1処理により48時間後にJNKの活性化がDLD1細胞に生じたが、HCT116細胞にはなく、この活性化は72時間持続した(図12'(d))。JNK阻害剤SP600125(Millipore)との共同処理は、TASIN-1の作用を減弱させ且つJNK活性化を効率的に阻害し且つPARP1切断だけでなくカスパーゼ3/7活性化を消失させた(図12'(e〜g))。あわせて、これらのデータは、TASIN-1がDLD1細胞においてJNK依存的アポトーシス細胞死を誘導することを証明している。
実施例4. 異種移植片マウスモデルにおけるTASIN-1の生体内抗腫瘍活性
(0439)TASIN-1の生体内抗腫瘍活性を異種移植マウスモデルにおいて調べた。確立したDLD1腫瘍をもつヌードマウスに溶媒(対照)又は40mg/kgのTASIN-1を1日2回18日間腹腔内に注射した。TASIN-1処理は、対照マウスと比較して、腫瘍異種移植片のサイズを減少させ(図17、17')、腫瘍成長速度(図17'(b))を低下させた。対照グループとTASIN-1処理グループの間のマウスの体重に明らかな毒性も統計的有意な差も見られなかった(図20(a))。同様の抗腫瘍活性が短縮型APCを収容しているHT29異種移植片においても見られ、生体外でDLD1と同様の感受性を証明した(図17'(c))。しかしながら、TASIN-1はHCT116(WT APC)異種移植片において腫瘍成長を阻止せず(図19)、TASIN-1が生体内で選択性を維持することを証明した。切除された腫瘍の免疫組織化学分析は、TASIN-1が対照腫瘍と比較してTASIN-1処理DLD1腫瘍においてアポトーシスマーカーの有意な増大、切断されたカスパーゼ3を誘導することを示した(図20(b))。アポトーシスの誘発は、対照及びTASIN-1処理DLD1異種移植片からの腫瘍溶解物において切断されたPARP1の検出によって確認した(図20(c))。
実施例5. CPC;ApcマウスにおけるTASIN-1の抗腫瘍作用
(0440)TASIN-1がマウス大腸組織における保持時間が長いことを考えて(図19)、CPC;Apcマウス、大腸がんを主に発症する遺伝子工学によるマウスモデルにおける抗腫瘍作用を更に試験した。これらのマウスは、エキソン14を欠失しているCDX2P-NLS Creリコンビナーゼ導入遺伝子とloxP標的Apc対立遺伝子をもち、コドン580のフレームシフト及び短縮型APCタンパク質が生じる(Hinoi, T.et al.Mouse model of colonic adenoma-carcinoma progression based on somatic Apc inactivation.Cancer Res 67, 9721-9730 (2007))。生後〜110日のマウスに溶媒又は20mg/kg/TASIN-1の注射を週に2回90日間腹腔内に注入した。
処理期間にわたって15日毎に体重を測定した。これらの実験はテキサス大学サウスウェスタン動物実験委員会のガイドラインに従って行った。
(0441)TASIN-1処理により、CPC;Apcマウスの結腸において腫瘍形成が著しく減少した(図17'、19')。TASIN-1処理CPC;Apcマウスにおいて発症した良性腫瘍(ポリープ)は、対照グループと比較して非常に小さかった(図3f)。更に、腫瘍の負担の少ないTASIN-1処理マウスは、90日間の処理にわたって野生型マウスと同様のレベルまで体重が増えた(図17')。最後に、TASIN-1処理マウスは炎症反応遺伝子のパネルの発現抑制を示し(図19')、Ki67及びサイクリンD1の染色が低下し、結腸腫瘍切片において切断されたカスパーゼ3の染色増加を伴った。まとめると、これらの生体内実験は、TASIN-1が双方のヒト異種移植片と遺伝子工学によるCRCマウスモデル双方において腫瘍形成を効率的に目立つ毒性もなく減弱させることを示している。
(0442)記載されている発明をその個々の実施態様によって記載してきたが、種々の変更がなされてもよく且つ等価物が本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなく置換されてもよいことを当業者は理解すべきである。更に、多くの修正が、具体的な状況、材料、組成物、プロセス、プロセス工程又は工程群を記載されている発明の客観的な精神及び範囲に対して用いるようになされてもよい。このような修正はすべて、これに添付された特許請求の範囲の範囲内であることを意図する。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕式Ｉの化合物、又はその医薬的に許容され得る塩、プロドラッグ、活性代謝物、又は溶媒和物:
[式Ｉ]
(式中
Y 1 及びY 2 は、各々独立して、CH又はNであり;
Lは、SO 2 、CO、CH 2 、又はCHMeであり;
X 2 は、CH 2 、CHR 2 、NR 3 、O、及びSからなる群より選ばれ;
X 1 は、CH 2 、CHR 4 、NR 5 、O、及びSからなる群より選ばれ;
n = 0、1、2
R 1 及びR 2 は、各々独立して、H、C 1-4 アルキル、C 1-4 アルケニル、C 1-4 アルキニル、CH 2 アリール、及びCH 2 ヘテロアリールからなる群より選ばれ
R 3 、R 4 及びR 5 は、各々独立して、C 1-6 アルキル; C 1-6 シクロアルキル、C 1-6 アルケニル、C 1-6 アルキニル、アリール、ヘテロアリール、CH 2 アリール、及びCH 2 ヘテロアリールからなる群より選ばれ;
R 3 は、その他の環原子の1つにメチレン橋又はエチレン橋を形成することができるので、二環式環構造をもたらし得て;
Lに接続しているRingは、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、縮合シクロアルキルアリール、縮合ヘテロシクリルアリール、縮合アリールヘテロシクリル、縮合シクロアルキルヘテロアリール、縮合ヘテロシクリルヘテロアリール、又は縮合ヘテロアリールヘテロシクリルであり;
ここで、立体中心が存在するときは、光学活性異性体を含めてすべての可能な立体異性体が含まれる)。
〔２〕n = 0; Y 1 = CH; X 1 = X 2 = CH 2 ; L = SO 2 ; Y 2 = N; 及びR 1 = Hである、前記〔1〕に記載の化合物。
〔３〕前記化合物が、式I-aを有する、前記〔1〕に記載の化合物:
[式I-a]
(式中
Y 1 及びY 2 は、各々独立して、CH又はNであり;
Lは、SO 2 、CO、CH 2 、又はCHMeであり;
X 1 は、CH 2 、CHR 4 、NR 5 、O、及びSからなる群より選ばれ;
R 1 及びR 2 は、各々独立して、H又はMeであり;
R 4 及びR 5 は、各々独立して、C 1-6 アルキル; C 1-6 シクロアルキル、C 1-6 アルケニル、C 1-6 アルキニル、アリール、ヘテロアリール、CH 2 アリール、及びCH 2 ヘテロアリールからなる群より選ばれ;
Lに接続しているRingは、アリール、ヘテロアリール、又は縮合ヘテロシクリルアリールである)。
〔４〕L = SO 2 ; X 1 = CH 2 又はCHR 4 ; Y 1 = CH; 及びY 2 = Nである、前記〔3〕に記載の化合物。
〔５〕前記化合物が、式I-bを有する、前記〔1〕に記載の化合物:
[式I-b]
(式中
Lは、SO 2 、CO、CH 2 、又はCHMeであり;
R 1 及びR 2 は、各々独立して、H又はMeであり;
R 4 は、C 1-6 アルキル; C 1-6 アルキニル、アリール、及びCH 2 アリールからなる群より選ばれ;
Lに接続しているRingは、アリール、ヘテロアリール、又は縮合ヘテロシクリルアリールである)。
〔６〕L = SO 2 ; R 4 = Me、イソプロピル、シクロプロピル、プロパルギル、又はCH 2 アリールである、前記〔5〕に記載の化合物。
〔７〕前記化合物が、構造式I-cを有する、前記〔1〕に記載の化合物:
[式I-c]
(式中
Lは、SO 2 、CH 2 、又はCHMeであり;
Lに接続しているRingは、アリール、ヘテロアリール、又は縮合ヘテロシクリルアリールである)。
〔８〕前記化合物が、構造式I-dを有する、前記〔1〕に記載の化合物:
[式I-d]
(式中
Lは、SO 2 、CH 2 、又はCHMeであり;
R 4 は、C 1-6 アルキル; C 1-6 アルキニル、アリール、CH 2 アリールからなる群より選ばれ; Lに接続しているRingは、アリール、ヘテロアリール、又は縮合ヘテロシクリルアリールである)。
〔９〕L = SO 2 ; R 4 = C 1-6 アルキル; C 1-6 アルキニル、又はCH 2 アリールである、前記〔8〕に記載の化合物。
〔１０〕前記化合物が、式I-eを有する、前記〔1〕に記載の化合物:
[式I-e]
(式中
Lは、SO 2 、CH 2 、又はCHMeであり;
R 1 及びR 2 は、各々独立して、H又はMeであり;
R 4 は、H、Me、プロパルギル、イソプロピル、シクロプロピル、及びCH 2 アリールからなる群より選ばれ;
R 6-10 は、各々独立して、H、F、Cl、Br、Me、Et、CF 3 、シクロプロピル、イソプロピル、tert-ブチル、アリール、OMe、OCF 3 、OCHF 2 、Oアリール、CN、N 3 、COアリール、CO 2 H、CO 2 R、CHO、CONH 2 、CONR 2 、及びCONHRからなる群より選ばれ、この項に関連して、Rは、独立して、H、C 1-4 アルキル、C 1-4 シクロアルキル、アリール、CH 2 アリール、及びCH 2 ヘテロアリールからなる群より選ばれる)。
〔１１〕R 6-10 が、各々独立して、H、F、Cl、Br、Me、Et、CF 3 、シクロプロピル、イソプロピル、アリール、OMe、OCF 3 、OCHF 2 、及びOアリールより選ばれる、前記〔10〕に記載の化合物。
〔１２〕R 6 がアリールであり; R 7-10 が、各々独立して、H、F、Cl、CF 3 、Me、シクロプロピル、イソプロピル、OMe、OCF 3 、及びOCHF 2 より選ばれる、前記〔10〕に記載の化合物。
〔１３〕R 7 がアリールであり; R 6 、R 8 、R 9 及びR 10 が、各々独立して、H、F、Cl、CF 3 、Me、シクロプロピル、イソプロピル、OMe、OCF 3 、及びOCHF 2 より選ばれる、前記〔10〕に記載の化合物。
〔１４〕R 8 がアリールであり; R 6 、R 7 、R 9 及びR 10 が、各々独立して、H、F、Cl、CF 3 、Me、シクロプロピル、イソプロピル、OMe、OCF 3 、及びOCHF 2 より選ばれる、前記〔10〕に記載の化合物。
〔１５〕R 7 がCOアリールであり; R 6 、R 8 、R 9 及びR 10 が、各々独立して、H、F、Cl、CF 3 、Me、シクロプロピル、イソプロピル、OMe、OCF 3 、及びOCHF 2 より選ばれる、前記〔10〕に記載の化合物。
〔１６〕前記化合物が、式I-fを有する、前記〔1〕に記載の化合物:
[式I-f]
(式中
Y 1 及びY 2 は、各々独立して、CH又はNであり;
R 1 及びR 2 は、各々独立して、H又はMeであり;
R 4 は、C 1-6 アルキル; C 1-6 シクロアルキル、C 1-6 アルケニル、C 1-6 アルキニル、及びCH 2 アリールからなる群より選ばれ;
R 11 及びR 12 は、各々独立して、H、F、Cl、Br、Me、CF 3 、シクロプロピル、アリール、及びヘテロアリールより選ばれる)。
〔１７〕Y 1 がCHであり; Y 2 がNであり; R 4 がH、Me、プロパルギル、イソプロピル、シクロプロピル、及びCH 2 アリールより選ばれ; R 11 がH、Me、CF 3 、シクロプロピル、又はアリールであり; R 12 がH、F、Cl、CF 3 、及びアリールより選ばれる、前記〔16〕に記載の化合物。
〔１８〕以下の群より選ばれる化合物、又はその医薬的に許容され得る塩。




〔１９〕以下の群より選ばれる、前記〔１８〕に記載の化合物、又はその医薬的に許容され得る塩。

〔２０〕前記化合物のIC 50 が、0.01nMから5μMまでである、前記〔1〕に記載の化合物。
〔２１〕前記化合物が、治療量の前記化合物及び医薬的に許容され得る担体を含む医薬組成物の形態である、前記〔1〕に記載の化合物。
〔２２〕前記治療量が、腫瘍成長を阻止するか、腫瘍増殖を阻害するか、細胞死を誘導するか又はこれらの組み合わせに有効である、前記〔21〕に記載の化合物。
〔２３〕結腸上皮細胞が少なくとも1種の短縮型APCタンパク質を発現している被検者において大腸がんを治療する方法であって、治療量の前記〔1〕〜〔19〕に記載の少なくとも1種の低分子化合物及び医薬的に許容され得る担体を含む医薬組成物を前記被検者に投与する工程を含み、前記治療量が腫瘍成長を阻止するか、腫瘍増殖を阻害するか、細胞死を誘導するか、又はこれらの組み合わせに有効であることを特徴とする、方法。
〔２４〕全長野生型APC遺伝子を含む不死化ヒト結腸上皮細胞(HCEC)であって、前記細胞が、以下の少なくとも1種: Kirstenラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ(Kras v12 )を含有する異所的発現ベクター、腫瘍タンパク質p53に対する小ヘアピンRNA(shp53)、及びAPCに対する小ヘアピンRNA(shAPC)、を含んでいることを特徴とする、細胞。
〔２５〕前記APC遺伝子が、コドン1450に体細胞変異を有する、前記〔24〕に記載の細胞。
〔２６〕前記APC遺伝子が、コドン1309に体細胞変異を有する、前記〔24〕に記載の細胞。
〔２７〕LacZタンパク質を発現している、前記〔24〕に記載の細胞。
〔２８〕前記Kirstenラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ(Kras v12 )及び前記APCに対する小ヘアピンRNA(shAPC)を発現している、前記〔24〕に記載の細胞。
〔２９〕前記細胞が、レトロウイルスサイクリン依存性キナーゼ4(Cdk4)、及び、ヒトテロメラーゼ(hTERT)の触媒コンポーネントを含んでいる、前記〔24〕に記載の細胞。

Claims (13)

  1. 以下の群より選ばれる化合物、又はその医薬的に許容され得る塩。





  2. 以下の群より選ばれる、請求項１に記載の化合物、又はその医薬的に許容され得る塩。


  3. DLD1細胞において短縮型APCタンパク質を阻害する前記化合物の半数最大阻害濃度（IC50）が、0.01nMから5μMまでである、請求項2に記載の化合物。
  4. 治療量の請求項2に記載の化合物及び医薬的に許容され得る担体を含む、医薬組成物。
  5. 前記治療量が、腫瘍成長を阻止するか、腫瘍増殖を阻害するか、細胞死を誘導するか又はこれらの組み合わせに有効である、請求項4に記載の医薬組成物。
  6. 結腸上皮細胞が少なくとも1種の短縮型APCタンパク質を発現している被検者において大腸がんを治療するための医薬組成物であって、治療量の請求項2に記載の少なくとも1種の低分子化合物及び医薬的に許容され得る担体を含み、前記治療量が腫瘍成長を阻止するか、腫瘍増殖を阻害するか、細胞死を誘導するか、又はこれらの組み合わせに有効であることを特徴とする、医薬組成物。
  7. 式Ｉ：
    （式中、
    Y1は、CHであり；
    Y2は、Nであり；
    Lは、SO2であり;
    n = 1であり；
    X1は、CHR4 であり；
    X2は、CHR2 であり；
    R1及びR2は、各々独立して、H又はメチルであり；
    R4は、メチル、-CH2CH2-O-CH2C≡CH、イソプロピル、-CH2C≡C-SiMe3、-CH2CH2OH、C 2 H 4 -CN、CH2-C≡CH、フェニル、及びベンジルからなる群より選ばれ；
    Ringは、
    （ここで、
    各R6及びR10は、独立して、H、Br、メチル、エチル、イソプロピル、N3、NH2、OCF3、-OCH3、-OCH2C≡CH、及びCF3で任意に置換されるフェニルからなる群から選ばれ；
    各R7及びR9は、独立して、H、Br、tert-ブチル、N3、NH2、OCF3、-OCH3、ベンゾイル、及びフェニルからなる群から選ばれ；
    R8は、H、イソプロピル、Br、N3、NH2、-OCHF2、ベンゾイル、フェノキシ、及び、F、Cl、又はメトキシで任意に置換されるフェニルからなる群から選ばれる）である）
    の化合物。
  8. 治療量の請求項7に記載の化合物及び医薬的に許容され得る担体を含む、医薬組成物。
  9. 前記治療量が、腫瘍成長を阻止するか、腫瘍増殖を阻害するか、細胞死を誘導するか又はこれらの組み合わせに有効である、請求項8に記載の医薬組成物。
  10. 結腸上皮細胞が少なくとも1種の短縮型APCタンパク質を発現している被検者において大腸がんを治療するのに使用するための、請求項8に記載の医薬組成物。
  11. 請求項1、2、3、及び7のいずれか一項に記載の化合物の立体異性体。
  12. 請求項1、2、3、及び7のいずれか一項に記載の化合物の医薬的に許容され得る塩又は溶媒和物。
  13. 結腸上皮細胞が少なくとも1種の短縮型APCタンパク質を発現している被検者において大腸がんを治療するための医薬組成物であって、治療量の請求項7に記載の少なくとも1種の低分子化合物及び医薬的に許容され得る担体を含み、前記治療量が、腫瘍成長を阻止するか、腫瘍増殖を阻害するか、細胞死を誘導するか、又はこれらの組み合わせに有効であることを特徴とする、医薬組成物。
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