JP6419097B2

JP6419097B2 - ヤマノイモ属植物からのディオスコリンの製造方法

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Publication number: JP6419097B2
Application number: JP2016004979A
Authority: JP
Inventors: 洋三中澤; 一喜戸枝; 英樹臼井; 大樹内山
Original assignee: Tokyo University of Agriculture
Current assignee: Tokyo University of Agriculture
Priority date: 2016-01-14
Filing date: 2016-01-14
Publication date: 2018-11-07
Anticipated expiration: 2036-01-14
Also published as: JP2017123811A

Description

本発明は、ヤマノイモ属（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ）植物、特にナガイモから抗ウイルス作用を有するタンパク質の一種であるディオスコリンを高純度で製造する方法、特にディオスコリン並びにマンノース及びマンノオリゴ糖を製造する方法に関する。

ヤマノイモ属（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ）植物はヤマノイモ科（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｃｅａｅ）の単子葉植物で、その地下茎は古くから食用又は薬用として利用されている。食素材としてのヤマノイモ属植物、その代表例であるナガイモの特徴は、可食部を裁断したり、すり潰したりすることで生じる粘りと、シャキシャキとした食感にある。

近年、ナガイモの地下茎（以下、単にナガイモと表すこともある）に含まれる貯蔵タンパク質ＤＢ２（ディオスコリンＡ）に抗インフルエンザウイルス作用があることが見いだされ、インフルエンザ予防食品への応用が報告されている（例えば、特許文献１、非特許文献１）。また、粘りの元となるムチンにも免疫力を高める力があるとも報告されている（非特許文献２）。

しかし、ナガイモを裁断したりすり潰したりすることで生じる粘りは、そのまま食用とする場合を除き、ナガイモに含まれるディオスコリン等の有用成分を回収して利用するには作業性、加工性等において障害となり得る。

前記特許文献１は、ナガイモを擂り下ろし、これを１０，０００ｒｐｍ以下１時間以下で遠心分離することにより得られる上清液の粘度を低下させるため、超音波処理を行うことを開示している。しかし、かかる処理は粘りの元となっている物質を物理的に破壊等することで粘度を下げるものであり、回収される有用物質の化学的純度を高めるものではない。また、超音波処理は、ナガイモからディオスコリン等の有用物質を大量に回収する方法としては、効率的であるとは言い難い。

特開２０１０−１３２６３０

工藤重光ら、生物工学、２００９年、第８７巻、第５号、２５６−２５７ページぶぎんレポート，Ｎｏ．１８５、２０１５年２月号

本発明は、簡便かつ安価に、ヤマノイモ属植物特にナガイモの地下茎から有用物質であるディオスコリンを回収する方法を提供することを目的とするものである。

本発明者らは、ナガイモを裁断したりすり潰したりすることで生じる粘りの主因であるムチンに着目し、マンナナーゼなどの酵素を作用させることで粘度を大きく低下させることでディオスコリンを容易に回収することができることを見いだし、以下の発明を完成させた。

（１）ヤマノイモ属植物の地下茎の細砕物を遠心分離して粘質液を回収する前処理工程、粘質液にマンナナーゼを作用させる酵素処理工程及び酵素処理後の液を遠心分離してディオスコリンを含有する上清液を回収する回収工程を含む、ヤマノイモ属植物からディオスコリンを製造する方法。
（２）酵素処理工程がさらにペクチンメチルエステラーゼを作用させることを含む、（１）に記載の製造方法。
（３）ディオスコリンを含有する上清液からディオスコリンを沈殿させて回収する精製工程をさらに含む、（１）又は（２）に記載の製造方法。
（４）精製工程がエタノールの添加によってディオスコリンを沈殿させて回収する工程である、（３）に記載の製造方法。

本発明によれば、産業用酵素として市販されている安価な酵素を利用することで、ナガイモから大量のディオスコリンを安価に製造することができる。また、ディオスコリンに加えてマンノースやマンノオリゴ糖も製造することができる。

本発明の前処理工程で調製される粘質液にβ−マンナナーゼ（ＧＭ５）及び／又はペクチンメチルエステラーゼ（ＰＭＥ）を作用させたときの、粘質液の粘度低下を表したグラフである。各グラフのバー上の数値は、各試料の粘度（ｃＰ）を示す。本発明の前処理工程で調製される粘質液、及び本発明の精製工程で回収されるタンパク質について行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルの写真である。本発明の精製工程をエタノール沈殿で行ったときの上清について行った薄層クロマトグラフィーの結果を示す写真である。図中、レーン１は酵素処理開始から１時間後のサンプル、レーン２はマンノース標品、レーン３は酵素処理開始から２４時間後のサンプルである。

本発明は、ヤマノイモ属植物の地下茎の細砕物を遠心分離して粘質液を回収する前処理工程、粘質液にマンナナーゼを作用させる酵素処理工程及び酵素処理後の液を遠心分離して得られるディオスコリンを含有する上清液を回収する回収工程を含む、ヤマイモ属植物からディオスコリンを製造する方法に関する。

ヤマノイモ属植物はヤマノイモ科（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｃｅａｅ）の単子葉植物で、特に日本において食用として利用されてきたものとしては、イチョウイモ、ツクネイモ、丹波ヤマノイモ、大和イモ、伊勢イモ、ヤマイモ（自然薯）、ナガイモなどを挙げることができる。本発明は、ヤマノイモ属植物のうち、地下茎にディオスコリンが含まれているものであればいずれも利用可能であるが、栽培面積、地下茎の生産量及びディオスコリンの含有量等の観点から、ナガイモを対象とすることが好ましい。特に、商品規格外のナガイモを利用することで、製造コストを低減させることができる。

本発明は、ヤマノイモ属植物の地下茎の細砕物を遠心分離して粘質液を回収する前処理工程を含む。本発明で用いられるヤマノイモ属植物の部位は、一般的に食用として用いられる地下茎である。植物学的には、ヤマノイモ属植物の地下茎は担根体と称されることもあるが、本発明ではいずれで呼称されるものであってもよい。

地下茎の細砕物は、地下茎をそのまま又は必要に応じて洗浄、皮剥き等を行ったものを細断、磨砕、摺り下ろし、押し潰しその他の方法によって調製することができる。後に行われる酵素処理の効率を高める観点から、細砕物は、例えば調理用のジューサー、フードプロセッサー、ミキサー又はこれらと機能を同じくする食材加工用装置などを用いて、いわゆるホモジナイズされたものであることが好ましい。

細砕物の遠心分離は、上記の細砕物に固形物として存在するものを沈殿として大まかに除去して、酵素処理に適した粘質液を回収する目的で行われる。遠心分離の条件は、細砕物の性状又は大きさなどに応じて適宜設定すればよい。細砕物がホモジナイズされたものであるときの遠心分離の条件の例としては、１０，０００〜１５，０００×ｇ、１５〜３０分間を挙げることができる。上清として回収される粘質液は、ヤマノイモ属植物を摺り下ろしたときによく経験される粘りを有する。

本発明は、粘質液にマンナナーゼを作用させる酵素処理工程を含む。マンナナーゼは、マンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、ガラクトグルコマンナンなどの主要骨格であるβ−１，４−Ｄ−マンノピラノシド結合を加水分解する酵素の総称名である。本発明で利用可能なマンナナーゼは、植物由来、微生物その他の生物種由来のいずれを利用してもよいが、工業用酵素として市販されているマンナナーゼの利用が好ましい。そのような例としては、セルロシンＧＭ５（エイチビィアイ株式会社）、マンナナーゼＢＧＭ（アマノ社製）、スミチームＡＣＨ（新日本化学工業株式会社）などを挙げることができる。

本発明では、酵素処理工程においてマンナナーゼに加えてペクチンメチルエステラーゼを作用させることが好ましい。マンナナーゼ及びペクチンメチルエステラーゼを作用させることによって、粘質液の粘度は速やかに低下し、酵素処理工程に要する時間を短縮することができる。

また、マンナナーゼ及びペクチンメチルエステラーゼを作用させることによって、ディオスコリンのみならず、マンノース及びマンノオリゴ糖の生産量も高めることができる。マンノース及びマンノオリゴ糖は、マクロファージを活性化して生体内に侵入した細菌、ウイルス等による感染防止に有効であり、特に鶏におけるサルモネラ排菌効果も報告されている。抗インフルエンザウイルス作用が期待されるディオスコリンとマンノース／マンノオリゴ糖の併用は、畜養特に養鶏にとって有利である。ディオスコリン及びマンノース／マンノオリゴ糖の生産量が高い本発明の製造方法は、家畜用特に養鶏用防除剤の原料供給に当たって有利である。

ペクチンメチルエステラーゼは、ペクチンのメチルエステルを加水分解して低メチルエステル型ペクチンを与える酵素であり、トマト、オレンジ等の植物由来の他に、微生物由来のものが知られている。本発明では、植物由来又は微生物由来のいずれのペクチンメチルエステラーゼも利用することができる。その例としては、スミチームＰＭＥ（新日本化学工業株式会社）を挙げることができる。

また、本発明は工業用酵素として市販されるペクチナーゼも利用することができる。ペクチナーゼは高等植物の細胞壁に含まれているペクチンを分解する酵素群の総称であり、主にポリガラクチュロナーゼ、ペクチンリアーゼ及びペクチンメチルエステラーゼの３種類が用語ペクチナーゼに包含され、工業用酵素として市販されているペクチナーゼはかかる３種類の酵素を含む混合物であることが多い。市販ペクチナーゼの例としては、可溶性ペクチナーゼＴ（エイチビィアイ株式会社）、ペクチナーゼＧ「アマノ」（アマノ社製）、スクラーゼ（登録商標）（三菱化学フーズ）などを挙げることができる。その他、本発明ではマンナンの脱アセチル化が可能なエステラーゼであればいずれも利用可能である。

マンナナーゼ及びペクチンメチルエステラーゼは、それぞれ別々に又は両方の酵素を同時に粘質液に作用させてもよく、別々に作用させるときの順序はいずれの酵素を先であってもよい。また、ｐＨ、温度その他の酵素反応条件は、別々に作用させるときは各酵素について公知の条件の範囲内で設定すればよく、両方の酵素を同時に作用させるときは、各酵素に関する反応条件が重複する範囲で、両酵素の反応がいずれも進行する条件を適宜設定すればよい。酵素処理工程に要する時間は、粘質液の量にもよるが、概ね１０分〜２４時間程度であればよい。

本発明は、酵素処理後の液を遠心分離してディオスコリンを含む上清液を回収する回収工程を含む。回収工程における遠心分離は、概ね１０，０００〜１５，０００×ｇで１５〜３０分間行えばよい。処理前の粘質液の粘度は酵素処理によって低下するが、本発明では、かかる液を遠心分離することで、ディオスコリン及び低分子化された糖類、特にマンノースを含む上清液を回収するものである。

また、この遠心分離によって難消化性澱粉が沈殿として回収される。ヤマノイモ属植物の難消化性澱粉は血糖値上昇抑制効果を有することが知られており、またその適度な粘性によって嚥下障害を緩和することができるとろみ剤として利用することができる。本発明の製造方法は、かかる難消化性澱粉を供給することも可能な方法として有用である。

本発明は、上記上清液からディオスコリンを沈殿させて回収する精製工程をさらに含むことが好ましい。ディオスコリンは、エタノール沈殿、塩析その他の公知の手法で沈殿として回収することができるが、特にエタノール沈殿が好ましい。エタノール沈殿は、上清液の体積１に対して２〜３倍体積の純エタノール（エタノール濃度９９％以上）を加えて行えばよい。

本発明の酵素処理工程においてマンナナーゼ及びペクチンメチルエステラーゼを作用させた場合、上記のエタノール沈殿を行うことで、ディオスコリンは沈殿として、マンノースは上清として、それぞれ分離して回収することができる。

精製工程を含む本発明の方法によって、ディオスコリンは、沈殿中の総タンパク質量の少なくとも９０％以上、特に９５％以上という高い純度を伴って製造される。製造されたディオスコリンは、そのまま又は他の成分と組み合わせて抗ウイルス用の医薬、食品、家畜飼料その他の製品として利用することが可能である。本発明によるディオスコリンの高い純度は、そのような有用製品の製造においてコストダウンその他のメリットをもたらし得る。

ディオスコリンを含む医薬、食品、家畜飼料その他の製品は、それぞれに関して公知の方法によって、種々の形態を伴って製造することができる。そのような製造は、当業者の通常の実施能力の範囲内である。

以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。

＜実施例１＞
１）前処理工程及び酵素処理工程
洗浄後、皮を剥いだ網走産のナガイモを家庭用フードプロセッサーを用いて５ｍｍ以下に磨砕して細砕物を得た。細砕物を遠心チューブに移して１１，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離して、上清として粘質液を調製した。

粘質液２５ｇずつを容器１〜４に移し、水、β―マンナナーゼ（セルロシンＧＭ５、エイチビィアイ株式会社、０．０２ｍｇ／０．１ｍＬ、以下ＧＭ５と表す）及び／又はペクチンメチルエステラーゼ（スミチームＰＭＥ、以下、ＰＭＥと表す、新日本化学工業株式会社、０．０２ｍｇ／０．１ｍＬ、）を、表１に示す量（ｍＬ）で添加し、スターラーを用いて攪拌しながら、２５℃で２４時間、酵素処理を行った。

２）粘度の測定
酵素処理開始から１５分後にサンプリングし、ラビットビスコアナライザー（ＲＶＡ、ＮｅｗｐｏｒｔＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用い、温度２５℃、回転数３２０ｒｐｍ（３０秒）、１６０ｒｐｍ（９０秒）、測定時間１２０秒の条件下で、５５秒、８４秒、１１５秒及び１２１秒時の粘度をそれぞれ測定して、平均値を算出した。酵素処理開始から１５分後の結果を図１に示す。粘質液の粘度は、ＧＭ５又はＰＭＥのみを作用させる場合と比較して、両酵素を併用することで１５分という短時間で粘度に差異が生じることが確認された。なお、２４時間処理することで液の粘度は水（約３０ｃＰ）と殆ど差がない程度まで低下した。

３）精製工程及び回収物の確認
酵素処理開始から２４時間後に容器４からサンプリングした酵素処理液を遠心チューブに移し、１１，０００×ｇ、２０分間遠心分離して上清液を得た。上清液１ｍＬ当たり、純エタノールを２ｍＬ加えて攪拌し、６０分間静置させたのち、１１，０００×ｇ、２０分間遠心分離して、沈殿を得た。沈殿を乾燥させてエタノールを除去したのち、適量の泳動用緩衝液に溶解して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。比較対象として酵素処理前の粘質液についてもＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果（ゲル写真）を図２に示す。

泳動後のゲルについて、デンシトメトリック法を用いて、泳動前の試料に含まれる観察されたバンドに対応するタンパク質の量を算出した。また、バンドの一部を切り出し、そのＮ末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサー４７７Ａ／１２０Ａ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて決定した。

図のレーン３で確認される主要なバンドは、そのＮ末端アミノ酸配列からディオスコリン（分子量約３０ｋＤａ）と、またその純度は９５％と確認された。分子量約２０ｋＤａに僅かに観察されるバンドは、そのＮ末端アミノ酸配列はディオスコリンと同じであることから、Ｃ末端側のいずれかでペプチドが切断されたものと推察された。また、粘質液においては、ディスコリン（分子量約３０ｋＤａ、純度７６％）の他に、マンノース結合型レクチン（分子量約１０ｋＤａ）が観察されたが、精製工程後の試料で当該バンドは消失した。このことは、エタノール沈殿により低分子量の夾雑物が除去されたことを示している。

４）マンノースの生産
酵素処理開始から１時間後及び２４時間後に容器４からサンプリングした酵素処理液を遠心チューブに移し、１１，０００×ｇ、２０分間遠心分離して上清液を得た。上清液１ｍＬ当たり、純エタノールを２ｍＬ加えて攪拌し、６０分間静置させたのち、１１，０００×ｇ、２０分間遠心分離して上清（エタノール溶性画分）を回収した。

エタノール溶性画分について、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣプレート：シリカゲル６０ＴＬＣプレート（メルク社）、展開溶媒：酢酸／クロロホルム／水＝３．５／３／０．５）を行い、ジフェニルアミン・アニリン試薬を用いて発色させた。発色後のプレートの写真を図３に示す。図中、レーン１は酵素処理開始から１時間後のサンプル、レーン２はマンノース標品、レーン３は酵素処理開始から２４時間後のサンプルである。

酵素処理開始から１時間後のサンプルには、マンノース（単糖）のほか、マンノビオース（二糖類）とマンノトリオース（三糖類）が含まれている一方、酵素処理開始から２４時間後のサンプルでは、ほぼマンノースのみが生成されていることが確認された。

本発明は、抗ウイルス作用、特に抗インフルエンザ作用を有するディオスコリンを簡便かつ対象に生産することができるという、産業上の利用可能性を有する。

Claims

ヤマノイモ属植物の地下茎の細砕物を遠心分離して粘質液を回収する前処理工程、粘質液にマンナナーゼ及びペクチンメチルエステラーゼを作用させる酵素処理工程並びに酵素処理後の液を遠心分離してディオスコリンを含有する上清液を回収する回収工程を含む、ヤマノイモ属植物からディオスコリンを製造する方法。
ディオスコリンを含有する上清液からディオスコリンを沈殿させて回収する精製工程をさらに含む、請求項１に記載の製造方法。
精製工程がエタノールの添加によってディオスコリンを沈殿させて回収する工程である、請求項２に記載の製造方法。