BRPI0709666A2 - composições de glicosamina e n-acetilglicosamina e métodos de produção das mesmas a partir de biomassa fúngica - Google Patents

Abstract

COMPOSIçõES DE GLICOSAMINA E N-ACETILGLICOSAMINA E MéTODOS DE PRODUçãO DAS MESMAS A PARTIR DE BIOMASSA FúNGICA. São reveladas composições de Glicosamina, N-acetilglicosamina, e <225>-glicano adequadas para consumo ou uso humano ou animal. As composições de glicosamina, N-acetilglicosamina e <225>-glicano são derivadas de biomassa fúngica contendo quitina. São revelados também vários métodos de produção de composições de glicosamina, N-acetilglicosamina e <225>-glicano.

Description

"COMPOSIÇÕES DE GLICOSAMINA E N-ACETILGLICOSAMINA E MÉTODOSDE PRODUÇÃO DAS MESMAS A PARTIR DE BIOMASSA FÚNGICA"

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados

O presente pedido PCT reivindica o benefício do Pedido de Patente U.S. n°11/395.013, depositado em 31 de março de 2006, o qual é uma continuação parcial doPedido de Patente U.S. pendente n° 10/685.125, depositado em 13 de outubro de 2003, oqual é uma continuação parcial do Pedido de Patente U.S. copendente n° 10/326.549,depositado em 19 de dezembro de 2002, o qual é uma continuação do Pedido de Patenteu.S. n° 09.785.695, depositado em 16 de fevereiro de 2001, e reivindica prioridade doPedido PCT n° PCT/US02/04468, depositado em 15 de fevereiro de 2002, cada um dosquais estando ora incorporado por referência. O pedido de Patente U.S. n° 11/395.013também é uma continuação parcial do Pedido PCT pendente N" PCT/US03/34846,depositado em 31 de outubro de 2003, que reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S.n° 60/423.119, depositado em 1 de novembro de 2002, tratando-se de uma continuaçãoparcial do PCT/US02/25121, depositado em 7 de agosto de 2002, que reivindica prioridadedo Pedido U.S. n° 09/924.865, depositado em 8 de agosto de 2001, que é agora a PatenteU.S. n° 6.693.188, cada um dos quais estando também ora incorporado por referência.

Campo

A presente invenção direciona-se a composições de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina e/ou β-glicano hidrossolúvel e a métodos de produção dos mesmos, apartir de biomassa fúngica.

Antecedentes

Glicosamina é um suplemento nutracêutico que demonstrou proporcionar alívioterapêutico significativo para artrite e dor nas articulações, embora o mecanismo não sejatotalmente conhecido, acredita-se que, a glicosamina funciona como auxiliar na restauraçãoda cartilagem para alívio da inflamação nas articulações, propiciando assim, benefíciosignificante aos usuários. N-acetilglicosamina é útil para várias aplicações tais como aditivosalimentícios e para emprego em cosméticos e composições farmacêuticas.

Atualmente a glicosamina é principalmente derivada de fontes de colheita natural,tais como molusco e outros organismos aquáticos. A quitina da concha ou exoesqueletodesses organismos é convertida em glicosamina e/ou N-acetilglicosamina usando variadastécnicas de produção. Essas fontes naturais são aceitáveis para produção de glicosaminae/ou N-acetilglicosamina para algumas aplicações, tendo porém, limitações. Essaslimitações incluem o fato de que o molusco in natura pode ter variações significativas emsua composição de exoesqueleto porque eles crescem naturalmente sob circunstancias nãocontroladas. O molusco pode variar nesses aspectos, como seu tamanho e composição,dependendo das condições de desenvolvimento, bem como de suas espécies. Ainda, semcontrole sobre as condições de crescimento o molusco pode ser exposto a contaminantesambientais, incluindo metais pesados, que podem ficar retidos na glicosamina, N-acetilglicosamina ou outros produtos derivados ou produzidos pelo molusco. A coleta domolusco é o mais das vezes sazonal, e assim, o suprimento e o preço do moluscodemonstra variação significativa com o tempo.

Um outro problema com relação a glicosamina e/ou N-acetilglicosamina derivadasde molusco, é que grande parte da população humana têm alergia a moluscos, sendoincapazes de usar produtos que contenham ingredientes derivados de molusco. Umagrande percentagem de alérgenos de molusco são proteínas específicas. Alérgenos demoluscos tais como proteínas musculares (por exemplo, tropomiosina) são encontrados naglicosamina derivada de fontes de molusco. Não é economicamente prático, e até mesmopossível garantir que os produtos de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina derivados demolusco sejam completamente isentos de traços de alérgenos de molusco. Assim,indivíduos hiper-alérgicos que devem evitar todos os produtos de molusco não podemingerir materiais derivados de moluscos tais como glicosamina e/ou N-acetilglicosamina.

Um problema adicional associado com fontes existentes de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina derivadas de molusco é que algum suprimento de molusco é colhido demares e oceanos do mundo. A colheita excessiva de molusco poderia ter um enormeimpacto ambiental negativo. Assim, acredita-se que alguns consumidores prefeririam usarglicosamina que não seja colhida à custa da vida marítima. Mesmo se o impacto ambientalda coleta dos moluscos não fosse negativo, ainda permaneceria o problema do fato dosuprimento de molusco in natura estar limitado na quantidade e inconsistente na qualidadede ano para ano.

Um outro problema associado a composições de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina derivadas de molusco é que essas composições não são "kosher"."Kosher" significa justo ou adequado, e geralmente é empregado para descrever alimentosque são preparados de acordo com leis da dieta especial de judeus. Muitas pessoas quepraticam o Judaísmo preferem ingerir apenas produtos kosher. Todos os moluscos sãoalimentos "não kosher" e assim, todos os produtos derivados de moluscos sãoimediatamente considerados não kosher. Para algumas aplicações medicinais, um produtoglicosamina de molusco pode receber dispensa especial, de modo a poder ser consideradokosher. Glicosamina derivada de molusco kosher especialmente licenciada, pode ser usadasomente para aplicações medicinais e até mesmo só podendo ser ingeridas na forma depílula ou comprimido. Portanto, faz-se necessário composições de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina "com certificado total kosher" (ou seja produtos kosher não requeremdispensa especial ou restrita a usos medicinais na forma de pílula ou comprimido) . Demodo similar, muitos vegans necessitam de composições glicosamina e/ou N-acetilglicosamina isentas de produto animal, de modo que as composições de glicosaminae/ou N-acetilglicosamina derivados de molusco não satisfazem suas necessidadesdietéticas.

Portanto, há uma premência quanto a uma origem de composições de glicosaminae/ou N-acetilglicosamina seguras, kosher, não derivadas de produto animal, de altaqualidade, que possam ser criadas economicamente e com mínimo impacto ambiental.

Além disso, fontes de fungos para produção de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina contém β-glicanos e outros componentes, β-glicanos soa polímeros deglicose contendo ligações glicosídicas entre as unidades de glicose, β-glicanos são glicanosonde as pontes glicosídicas são predominantemente ligações β. Os β-glicanos nessasfontes compreendem pontes glicosídicas β-1,3-glicanos, bem como β-1,4- e β-1,6 eramificações compreendendo ligações β-1,3,6 glicosídicas. Os tipos e números de ligaçõesglicosídicas dependem, em uma grande extensão da fonte de β-glicanos. Por exemplo,fontes de levedura de β-glicanos não foram descritas como incluindo β-glicanos comligações β-1,4.

β-glicanos são naturalmente insolúveis em água, soluções acidas ou básicas ou emsolventes orgânicos. Foi desenvolvida uma série de processos para o isolamento epurificação de β-glicanos. Os métodos conhecidos contudo, utilizam álcali quente, ácidos ouuma combinação destes para solubilizar as proteínas e outros componentes da biomassa,deixando os β-glicanos insolúveis. O ácido ou base deve então ser removido dos β-glicanosinsolúveis por lavagem com água. A grande capacidade de absorção de água dos β-glicanos faz com estes intumesçam significativamente, tornando esta etapa difícil e tediosa.

A digestibilidade ou aplicabilidade dos β-glicanos dessas fontes fica limitada por suainsolubilidade. A conversão dos β-glicanos em formas solúveis exigiu empregos de ácidosbases ou agentes oxidantes para romper os polímeros em polímero menores tornando-ossolúveis. Esses mesmos agentes químicos podem ter efeitos adversos nas unidades deglicose, tais como oxidação do álcool em aldéído ou formas de ácido. Isto é desvantajosonão apenas porque as aplicações de β-glicanos preferem β-glicanos que não sejamquimicamente alterados, mas também porque essas oxidações são difíceis de controlar demodo preciso. Além disso, os tratamentos químicos requerem etapas de purificaçãoadicionais para remover os ácidos bases ou agentes oxidantes. Um processo que requer umtratamento químico mínimo e nenhuma ou mínima alteração da estrutura química para aestrutura de β-glicano é desejável.

A fim de manter a estrutura nativa dos β-glicanos enquanto os torna hidrossolúveis,por exemplo, por controle do peso molecular, há uma necessidade quanto a um processo demanufatura brando em que o β-glicano não seja degradado ou quimicamente alteradodurante o processo, seja obtido uma produção suficiente de β-glicano; e componentesindesejáveis tais como proteínas, Iipidios outros polissacarídeos, bem como outroscomponentes indesejáveis na fonte do β-glicano sejam removidos das composições de β-glicano.

Não obstante, os β-glicanos estão atualmente em demanda para uma série deaplicações, tais como imunoestimulantes para uso de alimentação animal,imunoestimulantes, e/ou tratamentos do colesterol, e/ou como fontes de fibras deglutíveispara uso humano, como tratamento na agricultura, e para emprego em produtos detratamento de pele tais como hidratantes.

O mecanismo do efeito dos β-glicanos e em particular β-1,3-D-glicanos, não étotalmente entendido, porém parece depender, parcialmente, da estrutura molecularespecífica, que é influenciada pelo peso molecular e a solubilidade dos polímeros. Alguns β-glicanos foram vistos ser mais eficazes do que outros, sendo os β-1,3-D-glicanos maisespecialmente eficazes.

Sumário

Revelam-se composições de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina, incluindoprodutos de composição de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina adequados para consumohumano ou animal. As composições de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina apresentadassão derivadas de biomassa fúngica contendo quitina. Materiais de partida adequadosincluem fontes fúngicas microbianas, tais como fontes fúngicas derivadas de Aspergillus sp,Penicillium sp, Mucor sp, e combinações destes. O uso de uma biomassa fúngica resulta emcomposições de glicosamina de alta qualidade as quais são geralmente uniformes combaixos níveis de impurezas. As composições de glicosamina têm, normalmente, um teor decinzas relativamente baixo, e são isentas ou substancialmente isentas de contaminantes demetal pesado. Além disso, como um produto da biomassa fúngica, as composições deglicosamina e/ou N-acetilglicosamina não colocam um perigo a pessoas que sofrem dealergia a moluscos. Ou seja, tropomiosina e outras proteínas derivadas de músculo nãoestão presentes na biomassa fúngica. Devido as composições de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina apresentadas não serem derivadas de molusco (ou outra fonte animal) ascomposições reveladas são ambas kosher e podem ser consumidas por vegetarianosradicais. Moluscos e produtos derivados de moluscos não são considerados kosher porquaisquer linhas de referência mencionando produtos kosher.

Modalidades particulares das composições de glicosamina reveladas compreendemglicosamina e nenhum alérgeno de molusco. Outras modalidades das composições deglicosamina apresentadas incluem glicosamina kosher. Outras modalidades dascomposições de glicosamina reveladas compreendem glicosamina e uma ausência deprodutos de fonte animal. Ainda outras modalidades das composições de glicosaminadescritas, compreendem glicosamina e melanoidina.s Modalidades adicionais dascomposições de glicosamina apresentadas compreendem glicosamina, melanoidinas, e/ouácido levulínico. Outras modalidades das composições de glicosamina apresentadaspossuem valores de capacidade de absorbância radical de oxigênio lipofílico (ORAC) de 30μmol TE/g a 150 μmol TE/g ou de 5 μmol TE/g a 100 μmol TE/g ou de 35 μmol TE/g a 50μmol TE/g. Algumas composições de N-acetilglicosamina são composições de N-acetilglicosamina kosher e são isentas de alérgeno de molusco (e da ameaça ou incertezade conter quaisquer alérgenos de molusco) e são isentas desses alérgenos semnecessidade de qualquer purificação das composições, para dirimir uma dúvida acerca daexistência desses alérgenos nas composições.

Também se revela vários métodos para produção de composições de glicosaminapor hidrólise acida da biomassa fúngica. Os métodos para obtenção de composições deglicosamina a partir de biomassa microbiana incluem, por exemplo, reagir a biomassacontendo quitina em uma solução acida relativamente concentrada a uma temperaturarelativamente elevada. Também se revelam métodos para obtenção de composições deglicosamina a partir de biomassa fúngica, por exemplo, por reação da biomassa contendoquitina em uma solução ácida relativamente branda e a seguir em uma solução acidarelativamente concentrada, numa modalidade alternativa, a biomassa contendo quitinamicrobiana é reagida com uma solução básica antes ou depois do tratamento com hidróliseácida. Numa outra modalidade ainda, a biomassa fúngica é tratada com uma solução acidaa uma temperatura e/ou pressão elevada para produzir composições de glicosamina.

Também são revelados métodos para produção de, glicosamina e/ou N-acetilglicosamina. Em algumas dessas modalidades mais que cerca de 80% da quitinarestante na biomassa fúngica é convertida em N-acetilglicosamina (NAG). Em modalidadesparticulares, a biomassa fúngica é novamente tratada com um pré-tratamento enzimáticoe/ou um pré-tratamento com ácido brando para romper, parcialmente, as paredes celularesda biomassa e para converter alguns produtos indesejáveis a formas solúveis. O sólidos sãoseparados e são utilizados a seguir, tratamento enzimático para converter a quitina emNAG. Em algumas modalidades, o produto resultante, incluído o produto N-acetilglicosaminadesejado também inclui produtos indesejáveis tais como glicose.

Portanto, em algumas modalidades, a mistura de N-acetilglicosamina e glicose sãotratadas novamente com determinadas enzimas para converter a glicose a formas iônicasque são prontamente removidas da N-acetilglicosamina na mistura. Em outras modalidades,as enzimas para converter quitina em NAG e as enzimas para converter glicose em formasiônicas são aplicadas em uma única etapa.

Algumas modalidades do método apresentado também incluem uma purificaçãoadicional das composições de N-acetilglicosamina. Em ainda outros métodos revelados, aN-acetilglicosamina purificada é tratada para formar cristais de n-acetilglicosamina. Emoutros dos métodos revelados, a composição de N-acetilglicosamina purificada édesacetilada para formar cloridrato de glicosamina.

Em modalidades alternativas, a biomassa é pré-tratada enzimaticamente e/ou comum pré-cozimento de ácido brando, sendo a quitina enzimaticamente convertida em N-acetilglicosamina e a composição resultante é a seguir desacetilada para formarglicosamina. Em outras modalidades, a biomassa é pré-tratada enzimaticamente e/ou comum tratamento com ácido brando, sendo a quitina convertida enzimaticamente em N-acetilglicosamina, e a glicose é convertida enzimaticamente em formas iônicas, sendo a N-acetilglicosamina desacetilada para formar glicosamina. Em outras modalidades, abiomassa é pré-tratada enzimaticamente e/ou com um pré-tratamento com ácido brando,sendo a quitina convertida enzimaticamente em N-acetilglicosamina e a glicose presente naN-acetilglicosamina enzimaticamente tratada para remoção, e a composição de N-acetilglicosamina é a seguir purificada e a composição de N-acetilglicosamina édesacetilada para formar glicosamina.

Também são reveladas composições de β-glicanos compreendendo β-glicanoshidrossolúveis. Em algumas modalidades de composição, as composições de β-glicanocompreendem β-glicanos hidrossolúveis derivados da biomassa fúngica. Em algumasmodalidades, as composições de β-glicanos hidrossolúveis compreendem β-1,3-D-glicanoscom um peso molecular médio inferior a cerca de 1.000.000. Determinadas modalidadesincluem composições de β-glicanos hidrossolúveis compreendendo β-1,3-D-glicanos comuma faixa de peso molecular desde cerca de 346 a cerca de 5.000.000. Em outrasmodalidades, as composições de β-glicano hidrossolúveis compreendem pelo menos 50%em peso de β-1,3-D-glicanos. em outras modalidades, as composições de β-glicanoshidrossolúveis compreendem pelo menos cerca de 70% em peso de β-1,3-D-glicanos. Emalgumas modalidades, as composições de β-glicanos hidrossolúveis compreendem umarazão de α para β de cerca de 1 a cerca de 8. Em outras modalidades, as composições deβ-glicanos hidrossolúveis compreendem uma relação de ligações glicosídicas para ligaçõesβ-glicosídicas de cerca de 1 a cerca de 20 para cerca de 1 a cerca de 5. Em algumasmodalidades, as composições de β-glicano hidrossolúveis compreendem pelo menos 50 a70% em peso seco de 1,3^-D-glicanos e menos que cerca de 8% em peso sedo de 1,4-β-D-glicanos.

Em algumas modalidades, os β-glicanos nas composições de β-glicanoshidrossolúveis têm solubilidades na solução aquosa desde cerca de 20% em peso a cercade 60% em peso ou de cerca de 30% em peso a cerca de 50% em peso ou de cerca de40% em peso a cerca de 50% em peso.Também são revelados (1) métodos de produção das composições de β-glicanossupracitadas, (2) método de isolamento dos β-glicanos, (3) métodos de isolamento de β-glicanos das fontes de biomassa fúngicas pela formação de β-glicanos fúngicos solúveis emágua, (4) métodos de tratamento de alimentação animal, colheitas, e/ou humanos com ascomposições de β-glicanos apresentadas. Modalidades particulares dos métodosapresentados que produzem composições de β-glicano incluem um processo de manufaturabrando em que, os pesos moleculares do β-glicano são controlados pelo processo, umrendimento suficiente de β-glicano obtido e componentes indesejáveis tais como proteínas,lipídios, outros polissacarídeos, bem como outros componentes indesejáveis na fonte de β-glicano são removidos das composições de β-glicano.

DESENHOS

A figura 1 e um fluxograma da técnica precedente ilustrando um processo paraprodução de glicosamina a partir de molusco.

A figura 2 é um fluxograma de um dos métodos revelados para produção demodalidades particulares das composições de glicosamina.

A figura 3 é um fluxograma de mais um dos métodos revelados para produção demodalidades das composições de glicosamina.

A figura 4 é um gráfico ilustrando o rendimento percentual de glicosamina numamodalidade da composição de glicosamina apresentada produzida por um modalidade dosmétodos de composições de glicosamina.

A figura 5 é um cromatograma de fluido de uma modalidade das composições deglicosamina reveladas.

A figura 6 é um cromatograma de líquido de uma modalidade das composições deglicosamina apresentadas.

A figura 7 é uma série de espectros FTIR mostrando a comparação de algumas dascomposições de glicosamina atualmente apresentadas para materiais de glicosaminaderivados de molusco.

A figura 8 é um cromatograma de HPLC comparando os componenteshidrossolúveis de uma modalidade da composição apresentada para glicosamina derivadade biomassa fúngica indicando que nenhum ácido levulínico ou glicose foram detectados naglicosamina derivada de molusco.

A figura 9 é um fluxograma de alguns dos métodos apresentados para produzirmodalidades das composições de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina.

A figura 10 é um gráfico ilustrando o percentual de N-acetilglicosamina obtido com otempo.

A figura 11 é um cromatograma de HPLC ilustrando N-acetilglicosamina separadados outros componentes usando uma resina de troca catiônica.A figura 12 é um fluxograma de determinados métodos apresentados paraprodução de modalidades das composições de β-glicanos secas, purificadas.

A figura 13 é um fluxograma de determinados métodos apresentados paraprodução de modalidades de composições de β-glicanos purificadas, ou não purificadas,líquidas o sólidas.

DESCRIÇÃO DETALHADA

São reveladas composições de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina e produtos decomposição de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina, tais como suplementos nutricionais,adequados para consumo humano ou animal. As composições de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina são derivadas da quitina presente em vários tipos de biomassa fúngica . Aquitina é um polissacarídeo natural, tendo a estrutura de um polímero não ramificado de 2-acetoamido-2-desoxi-D-glicose (poli(N-acetil-D-glicosamina)). A quitina contém unidades N-acetilglicosamina e também pode conter até cerca de 50% de unidades desacetiladas. Afórmula para quitina pode ser representada pela estrutura de repetição geral:

A quitina é tipicamente um sólido amorfo amplamente insolúvel em água, ácidosdiluídos e álcali. Embora a quitina tenha várias aplicações comerciais, a utilidade comercialpode ser encontrada por transformação da estrutura polimérica em componentes individuaisde 2-amino-2-desoxi-D-glicose, que é conhecida como glicosamina. Estruturalmente, aglicosamina é glicose modificada com um grupo amina substituindo o grupo OH encontradono átomo de carbono dois (C-2)(. A estrutura geral da glicosamina é:

<formula>formula see original document page 9</formula>

A quitina também pode ser despolimerizada para formar o amino-açúcar N-acetilglicosamina (NAG). Composições de N-acetilglicosamina incluem, tipicamente, umúnico monômero acetilglicosamina, mas também pode incluir pequenas quantidades deoligômeros que têm, por exemplo, duas ou três unidades acetilglicosamina. N-acetilglicosamina pode ser usada em muitas aplicações, tais como aditivos nutricionais,suplementos dietéticos, cosméticos ou em composições farmacêuticas.

Como descrito supra, composições de glicosamina, aqui reveladas incluemglicosamina e N-acetilglicosamina derivadas de biomassa fúngica contendo quitina e podemincluir outros componentes também. Materiais de partida adequados para produzir ascomposições de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina incluem, fontes fúngicas microbianassubstancialmente uniformes, tais como fontes fúngicas derivadas de Aspergillus sp,Penicillium sp, Mucor sp, Absidia sp., Actiomucor sp, Actostelium sp, Agarieus sp, Allomyeessp, Amylomyees sp, Coprinus, sp., Cunninghamella sp., Didymium sp., Fusarium sp.,Gongronella sp., Lentinula sp., Mortierella sp., Mucoriopsis sp., Phyeomyees sp.,- Rhizomueor sp., e Rhizopus sp., e combinações destes. Outras fontes úteis de biomassafúngica podem incluir, sem limitação, Absidia ramosa, Gongronella butlerrii, Mortierellaspinosa, Mueor raeemosus, Rhizopus nigrieans, R. stolonifer, R. oryzae, A nidulans,Thelavia terricola, Saccharomyees eerevisiae, Cheatomium Iunsporium e combinaçõesdestes. O uso de uma biomassa fúngica resulta num produto de alta qualidade que produzcomposições de glicosamina com baixos níveis de impurezas, tais como mineraisindesejáveis. As composições de glicosamina têm, normalmente, um teor de cinzasrelativamente baixo, e portanto, nenhum ou, no máximo, traços de metais pesados. Alémdisso, um teor de cinzas baixo propicia soluções relativamente límpidas produzidas dascomposições de glicosamina.

Além disso, devido às composições de glicosamina serem produtos da biomassafúngica, a composições de glicosamina aqui apresentadas não são submetida à inclusão dealérgenos de proteína encontrados na glicosamina produzida a partir de molusco.

A. Composições de Glicosamina e N-Acetilglicosamina

As composições de glicosamina e N-acetilglicosamina podem ser derivadas defontes de biomassa fúngica relativamente uniformes, de modo que, as composições deglicosamina tenham uma uniformidade genérica "biomassa fúngica uniforme" refere-se àbiomassa fúngica compreendendo substancialmente, as mesmas espécies cultivas emsubstancialmente mesmo meio, crescido num ambiente relativamente controlada, ou outrasde tais condições, que levem a uniformidade substancia, na composição bioquímica dabiomassa.

Dependendo da metodologia usada para purificar as composições de glicosamina,tais como composições de sal de glicosamina desejadas, as composição contendoglicosamina resultantes, podem ser produzidas com quantidades variadas de glicosamina,incluindo composições que excedem 95% de glicosamina, 98% de glicosamina e até mesmo99,8% de glicosamina. As composições de glicosamina podem conter ingredientesadicionais, tais como sais, melanoidinas e ácidos, por exemplo, ácido levulínico (conformeabaixo). Determinadas composições de glicosamina incluem 0,01 a 10% de glicose, 0,01% a5% de glicose, ou 0,01 a 2% de glicose.

Similarmente, dependendo da metodologia empregada para purificar ascomposições de glicosamina, as composições resultantes contendo N-acetilglicosamina,podem ser produzidas com quantidades variadas de N-acetilglicosamina, incluindocomposições excedendo 9% de N-acetilglicosamina, 95% de N-acetilglicosamina, e mesmo99,8% de N-acetilglicosamina em peso. Além disso, em algumas modalidades dos métodos(descritos em detalhe abaixo) apresentados aqui para formação de N-acetilglicosaminaconvertem pelo menos cerca de 80% de quitina obtida da biomassa em N-acetilglicosaminae alguns métodos apresentados, convertem pelo menos cerca de 95% da quitina obtida dabiomassa em N-acetilglicosamina.

A menos que de outro modo indicado, todos os números expressando quantidadesde ingredientes, propriedades tais como peso molecular, percentagens, condições dereação e assim por diante, usadas na descrição e reivindicações devem ser entendidascomo estando modificadas pelo termo "cerca de". Portanto, a menos que de outro modoindicado, os parâmetros numéricos descritos são aproximações que podem depender daspropriedades desejadas solicitadas.

A glicosamina nas composições descritas possui a fórmula geral representada aseguir:

Esta fórmula geral varia em diferentes modalidades das composições deglicosamina, dependendo da presença de vários sais de glicosamina, incluindo citrato,acetato, fosfato, sulfato, cloreto, lactato, gluconato, etc. Ainda, a glicosamina nascomposições de glicosamina pode ser substituída ou modificada sem afastar-se do escopoda invenção. Assim, conforme aqui empregado, o termo glicosamina, refere-se a varaisformas de glicosamina, incluindo sais complexos e glicosamina substituída. Similarmente, otermo composição de glicosamina refere-se a composições incluindo glicosamina nessasformas variadas.Modalidades das composições de glicosamina incluem componentes particulares,além da glicosamina, tais como quito-oligossacarídeos e produtos da despolimerização deglicano, reação, e degradação tais como glicose, melanoidinas e ácido levulínico.

Melanoidinas são polímeros relativamente complexos de alto peso molecular,irregulares e estão presentes em modalidades particulares das composições deglicosamina. Por exemplo, modalidades particulares das composições de glicosaminaapresentadas incluem de 0,001 a 15% em peso de melanoidinas ou de 0,001 a 1,0% empeso de melanoidinas ou de 0,01 a 0,1% em peso de melanoidinas. Sem querer estar presoa qualquer teoria em particular, as melanoidinas são desse modo, formadas por conversãodos glicanos em glicose em hidroximetilfurfural (HMF) para produzir as melanoidinas (Areação pode produzir outros produtos derivado de glicano e aminas de proteínas numaorigem de biomassa , bem como lipídios nessa fonte). Esse processo químico é conhecidocomo Reação de Maillard.

O ácido levulínico (também conhecido como ácido acetil-propiônico) está presente,em modalidades particulares das composições de glicosamina apresentadas. Sem quererestar preso a qualquer teoria em particular, ácido levulínico é similarmente formado quandoos glicanos na biomassa fúngica são convertidos em glicose, que é convertida em HMF,para finalmente, formar ácidos fórmico e levulínico. O ácido levulínico não é um componenteperigoso, ou seja, um acidulante valioso usado nesses produtos como bebidascarbonatadas e suco de frutas, geléias, e gelatina. Assim, a adição de modalidades dascomposições de glicosamina para tais produtos propicia um acidulante benéfico, bem comoos benefícios proporcionados pela glicosamina na composição. Modalidades particularesdas composições de glicosamina incluem de 0,0001 a 1% em peso de ácido levulínico, oude 0,001 a 0,7% em peso de ácido levulínico ou de 0,01 a 0,4% em peso de ácido levulínico/

Devido às melanoidinas e ácido levulínico serem formados, quando se produz ascomposições de glicosamina de acordo com os métodos apresentados, nenhuma etapaadicional deve ser feita pra inclusão desses componentes nas composições. Melanoidinas eácido levulínico não eram esperados nas composições de glicosamina derivadas demolusco, e a análise de seis lotes de glicosamina derivada de molusco (obtida de cincodiferentes fornecedores) não continha qualquer quantidade detectável de melanoidina ou deácido levulínico.

Conforme se descreveu, carboidratos complexos na biomassa fúngica tais comoglicanos, são convertidos em melanoidinas no meio de redução do processo. Essescarboidratos complexos não estão presentes nas carapaças de molusco usados em outrosprocessos e assim, não se formam melanoidinas. A comparação dos espectros FTIR (figura7) dos materiais insolúveis em água em algumas modalidades das composições deglicosamina apresentadas àqueles encontrados numa glicosamina típica derivada demolusco evidencia que, as melanoidinas não estão presentes em composições deglicosamina derivadas de molusco. O espectro FTIR do material insolúvel da composição deglicosamina apresentada possui várias faixas amplas sem estrutura fina, típico de materiaispoliméricos. AS faixas entre 2800 a 3000 números de onda no espectro das presentescomposições são típicas de grupos amida na melanoidina. O material insolúvel do produtoglicosamina derivado de molusco não possui essas indicações da presença de melanoidinasnos espectros FTIR.

Devido às melanoidinas serem polímeros irregulares com carbono reduzido, algumgrau de conjugação existe entre as ligações π (pi). Esta conjugação resulta no tan típicopara coloração castanho das melanoidinas. Essa coloração estava claramente presente nasmodalidades das composições de glicosamina atualmente reveladas, porém estava ausentenas amostras de glicosamina derivadas de molusco, indicando novamente que, ascomposições de glicosamina derivadas de molusco não incluem melanoidinas.

Melanoidinas estão descritas como possuindo caráter antioxidante e/ouremovedoras de radical livre. Ver por exemplo, Gow-Chin Yen, et al., Antioxidant Activity andScavenging Effects on Active Oxygen of Xyiose-Lysine Mailiard REaetion Products, J. SciFood Agric, 67, 415-420 (1995); K. Eichner, Antioxidant Effeet of Maiilard Reaetionlntermediates, Prog. Fd. Nutr. sei, 5, 441-451 (1981); Fumitaka Hayase etal., Seavenging ofAetive Oxygens by Melanoidins, Agric, Biol. Chem. 53(12), 3383-3385 (1989); Deijia Huang,et al., High-Throughput Assay of Oxygen radical absorbance Capacity (ORAC) Using aMultichannel Handling system Coupled with a Microplate Fluorescence Reader in 96-WellFormat, J. Agric. Food Chem., 50, No. 16, 4437-4444 (2002) cada um dos quais oraincorporado por referencia. Algumas modalidades das composições de glicosaminaapresentadas têm valores de capacidade de absorbância de radical oxigênio lipofílico (lipo-ORAC) desde 30 μηηοΙ TE/g (Equivalente TROLOX por grama) a 150 μηηοΙ TE/g ou valoresIipo-ORAC desde 35 μΐηοΙ TE/g a 100 μΐηοΙ TE/g ou de 35 μίτιοΙ TE/g a 50 μίτιοΙ TE/g.TROLOX também é conhecido como ácido 6-hidróxi-2,5,7,8-tetrametil-2-carboxílico.

Os valores lipo-ORAC podem ser determinados, por exemplo, pelo uso de um testeORAC usando fluoresceína 9FL0 como uma sonda fluorescente conforme descrito emDejian Huang, et al., Development and Validation of Oxygen Radical Absorbance capaeityAssay for Lipophilic Antioxidants Using Randomly Methylated β-Cyclodextrin as the SolubilityEnhancer, J. Agric. Food Chem, 50 N 7 (2002), que está ora incorporado por referência.

β-ciclodextrina aleatoriamente metilada (RMCD) é empregada como u intensificadorde solubilidade em água para antioxidantes lipofílicos. sete por cento de RMCD (p/v) numamistura acetona/água a 50% é empregado para solubilizar o s antioxidantes lipofílicos emtampão de fosfato a 75 mM (pH 7,4). Quando do uso de TROLOX como o padrão (1.0), a-tocoferol, (+) γ-tocoferol, (+)-5-tocoferòl, acetato de α-tocoferol, tocotrienóis, 2,6-diterc-butil-4-metilfenol, e γ-orizanol têm valores ORAC de 0,5 +/- 0,02, 0,74 +/-0,03, 1,36 +/- 0,14, 0,00,0,91 +/- 0,04, 0,165 +/- 0,01 e 3,00 +/- 0,26, respectivamente, quando se usa este método.

O ácido levulínico e glicose presentes em algumas modalidades das composiçõesde glicosamina apresentadas não são esperados estarem presentes na glicosaminaderivada de molusco. A cromatografia líquida de alto desempenho demonstra as diferençasentre as modalidades da composição de glicosamina aqui apresentada e composições deglicosamina derivada de molusco. Nem ácido levulínico nem glicose foram detectados emquaisquer produtos de glicosamina derivada de molusco.

Especificamente, amostras das presentes composições e composições deglicosamina derivadas de molusco foram dissolvidas em ácido sulfúrico 0,01 N a umaconcentração de 4% p/v.. Amostras diluídas foram dissolvidas em ácido sulfúrico 0,01 N auma concentração de 4% p/v. As amostras diluídas foram filtradas através de filtros denáilon de 0,2 mm em frascos de HPLC. Os cromatogramas foram coletados usando umacoluna Metacarb H Plus (Vatian, lnc, Torrence, CA) usando ácido sulfúrico 0,01 N como oeluente a 0,4 mL/min. Identificou-se os picos por tempo de retenção contra padrõesconhecidos. Como fica evidente da Figura 8, o ácido levulínico e glicose estavam presentesapenas nas composições de glicosamina atualmente reveladas e não nas composiçõesderivadas de molusco.

Com referência à Tabela 1, modalidades das composições de glicosaminacompreendem glicosamina derivada de biomassa fúngica e podem compreender tambémum ou mais dos componentes relacionados na Tabela 1 os mostrados na Tabela 2 e outroscomponentes como aqui descritos. Concentrações de cada componente podem ficar nasfaixas mostradas ou podem variar alterando-se quaisquer de uma série de parâmetros deprodução.

Tabela 1

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Com referência à Tabela 2, são descritas duas modalidades específicas dascomposições de glicosamina. Os métodos utilizados para determinar os componentespresentes e as concentrações das mesmas são descritos a seguir:Tabela 2

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* as percentagens relacionadas são por cento em peso

Determinadas modalidades das composições de glicosamina possuem teor decinzas relativamente baixo. O teor de cinzas pode ser menor do que 5 por cento, menor que2 por cento ou menor que 1 por cento. Há poucos, caso algum, componentes de metalpesado nas composições de glicosamina; s concentrações do componente de metal pesadonas composições de glicosamina apresentadas ficam abaixo de 100 ppm, mis tipicamente,abaixo de 50 ppm, mais tipicamente ainda abaixo de 20 ppm. Em algumas modalidades, oscomponentes de metal pesado estão presentes em menos que 10 ppm.

O componente glicosamina das composições de glicosamina pode ter uma rotaçãopositiva específica, tal como uma rotação específica positiva de 69 a 74° para o sal cloridratode glicosamina. As composições de glicosamina são normalmente relativamente brancasquando na forma seca purificada, porém incolores quando dissolvidas numa solução aquosa.Em um exemplo, uma solução de 20% em peso da glicosamina possui uma cor segundoAmerican Public Health Associaton (APHA) menor do que 50.

A N-acetilglicosamina nas composições reveladas possui a fórmula geral abaixo:Esta fórmula geral varia em diferentes modalidades das composições de N- '-acetilglicosamina dependendo da presença de oligômeros de N-acetilglicosamina, tais comodímeros, trímeros etc. até cerca de dez unidades de repetição. Ainda, a N-acetilglicosaminanas composições de N-acetilglicosamina podem ser substituídas ou modificadas sem seafastar do escopo da invenção. Assim, conforme aqui empregado, o termo N-acetilglicosamina refere-s às varias formas de N-acetilglicosamina incluindo oligômeros.Similarmente, o termo composição de N-acetilglicosamina refere-se a composições incluindoN-acetilglicosamina nessas formas variadas.

As composições de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina também pode sercombinadas com outros componentes para formar um suplemento alimentar para ingestãohumana e/ou animal. Por exemplo, as composições de glicosamina e/ou N-acetilglicosaminapodem ser ainda combinadas com excipientes, aglutinantes farmacêuticos comuns (porexemplo, sacarose, glicose, etil celulose, metil celulose, polivinilpirrolidona, polietileno glicol,lactose, fosfato de dicálcio, crosprovidona, croscarmelose e outros) ácidos orgânicoscomuns (por exemplo, ácido cítrico, ácido málico, ácido tartárico, ácido láctico, e similar),e/ou carboidratos (por exemplo, amido, glicose, sacarose e similar). Tais composições deglicosamina e/ou N-acetilglicosamina podem também ser combinadas com açúcares,adoçantes artificiais, colorantes naturais e artificiais, aromatizantes naturais e artificiais,acidulantes, espessantes, e similar, para formar uma série de suplementos nutricionais. Taissuplementos nutricionais da composição de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina sãotipicamente produzidos em alimentos e/ou bebidas de suplemento alimentar, barras,concentrados, bebidas mistas secas ou concentradas, pós, gomas de mascas, confeitos,chicletes, iogurte, adesivos, pastilhas, e similares,

B. Materiais de Partida da Biomassa fúngica

Materiais de partida adequados para produção das composições de glicosaminaincluem fontes da biomassa microbiana, tipicamente biomassa fúngica, tal como fungosfilamentosos com mais que 10 por cento de quitina por peso da célula seca total, tal comofontes fúngicas derivadas de Aspergillus sp, Penicillium sp, Mucor sp, Absidia sp.,Actiomucor sp, Actostelium sp, Agarieus sp, Allomyees sp, Amylomyees sp, Coprinus, sp.,Cunninghamella sp., Didymium sp., Fusarium sp., Gongronella sp., Lentinula sp., Mortierellasp., Mucoriopsis sp., Phyeomyees sp., Rhizomueor sp., e Rhizopus sp., e combinaçõesdestes. Outras fontes úteis de biomassa fúngica podem incluir, sem limitação, Aspergillusniger, Aspergillus terreus, aspergillus oryzae, Mueor rouxii, Penieillium ehrysogenum,Penieillium notatum, Saccharomyees eerevisiae; Saccaromyees uvarum, Absidia ramosa,Gopngronella butlerrii, Mueor raeemosus, e particularmente, Candida guillermondi,Aspergillus niger e Aspergillus terreus. A biomassa pode ser recuperada de uma reação defermentação comercial, tal como a produção comercial de ácidos orgânicos, incluindo ácidocítrico. Ainda, a biomassa adequada para produção dè glicosamina e/ou N-acetilglicosaminapode ser gerada especificamente para este processo e não como um subproduto de outrosprocessos. Conforme aqui empregado, o termo microbiano não inclui o fitoplâncton ecrustáceos ou moluscos.

Biomassas com níveis de quitina maiores de 5 por cento da biomassa seca empeso são adequadas para a prática dos métodos revelados. Essa biomassa normalmentepossui entre 5 e 25 por cento de quitina, e pode ter de 10 a 20 por cento de quitina combase no peso seco da biomassa. Ainda, de modo a preparar composições de glicosaminae/ou N-acetilglicosamina de grau alimentício ou suplemento alimentício é um poucodesejável que a biomassa microbiana seja crescida num modo substancialmente controladocom temperatura relativamente uniforme e/ou níveis de nutrientes durante o crescimento dabiomassa. Níveis de nutriente podem ser controlados por qualquer modo adequado, porexemplo, como apresentado na Patente U.S. n° 2.739.923, 2.353.771, e 2.674.561 oraincorporadas por referência ao presente.

As mesmas fontes de biomassa microbiana, tipicamente fontes de biomassafúngica podem ser usadas para produzir as composições de β-glicano aqui apresentadas.Em algumas modalidades, a fonte de β-glicano e o produto "refugo" separado dos líquidosnos métodos de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina aqui revelados. Conforme aquidescrito, (ver as Figuras 2, 3 e 9-11) apresenta-se um processo geral para desenvolvimentode composições de glicosamina composições de N-acetilglicosamina e composições de β-glicano todas de uma única fonte de partida da biomassa fúngica. Processos convencionaispara execução de produtos de composições de glicosamina e/ou N-acetilglicosaminarequerem a fonte de molusco indesejável e quaisquer das três composições exigem o usode processos químicos indesejáveis e/ou quantidades relativamente grandes de refugoquímico do processo, incluindo refugos de ácido e base fortes que podem ser caros paradescarte adequado. Além disso, os processos existentes para produzir composições deglicosamina composições de N-acetilglicosamina, ou composições de β-glicano recuperaramapenas as composições individuais da fonte (ou seja, produzem apenas os produtos deglicosamina e/ou N-acetilglicosamina ou β-glicano porém não produzem mais de umproduto) A abordagem múltipla de produto aqui apresentada resulta em emprego maiseficiente de capital, custos mais baixos de manufatura, menos refugo químico de processo euso mais eficiente da matéria prima (menos dejeto dos materiais de origem).

C. Métodos Para Produção de Composições de glicosamina da Biomassa fúngica

Também são apresentados métodos para produção de composições deglicosamina a partir de fontes de biomassa fúngica, incluindo produção dessas composiçõespor hidrólise acida da biomassa fúngica. A hidrólise ácida quebra ligações éter na biomassae desacetila moléculas de quitina para gerar glicosamina livre. A hidrólise ácida podequebrar a quitina em glicosamina, porém deixa a molécula de glicosamina substancialmenteintacta. Dependendo dos parâmetros da hidrólise ácida, condições de hidrólise ácida,quebra também outros componentes (tais como glicanos, proteínas e lipídios) que existemna biomassa fúngica.

Em um método específico apresentado, para produção de composições deglicosamina da biomassa fúngica, a hidrólise ácida é realizada por tratamento da biomassafúngica por um período de tempo relativamente longo, por exemplo, mais de 4 horas, numasolução de ácido relativamente agressivo.

Com referência à Figura 2, a biomassa fúngica contendo quitina (a) pode serprimeiro reagida numa solução ácida relativamente agressiva (c). Ácidos relativamentefortes (agressivos) podem ser empregados para hidrolisar a biomassa fúngica, Incluindoácidos de concentrações menores que 50 por cento. Ácidos de composição desde 5 a 25por cento também são adequados. Ácidos fortes adequados incluem ácido clorídrico, ácidosulfúrico, ácido fosfórico, e ácido cítrico a concentrações adequadas.

Em modalidades particulares dos métodos revelados as composições deglicosamina particulares são formadas por um tratamento com ácido agressivo, reagindo de5 a 20 por cento de ácido com 2 a 50 por cento da biomassa pré-tratada (com base no pesoseco, embora a biomassa seja tipicamente processa com água) e de 35 a 93 por cento deágua. Em determinadas implementações a mistura de reação compreende de 8 a 12 porcento de ácido clorídrico, de 4 a 8 por cento da biomassa (com base no peso seco) e de 80a 90 por cento de água. Em ainda uma outra modalidade, a solução ácida constitui de 17 a20 por cento de solução de ácido clorídrico.

A mistura de tratamento com ácido agressivo contendo a biomassa, ácido e água éaquecida e mantida a uma temperatura relativamente elevada. A mistura é normalmenteaquecida a uma temperatura no seu ponto de ebulição ou próxima deste (tipicamente, 90°Ca 106°C) sendo mantida sob condições de refluxo por 5 horas ou mais, tipicamente mais que8 horas, e normalmente menos que 16 horas. A reação pode continuar por um tempobastante para ter-se uma quebra completa da quitina, porém não tão longo a ser ineficaz oua decompor excessivamente as composições de glicosamina.

Embora a reação na solução de ácido relativamente agressivo produza umacomposição de glicosamina podem ser feitas etapas de purificação. Uma primeira etapa depurificação inclui uma etapa de separação, tal como filtração, para remover impurezasparticuladas, resultando numa solução substancialmente límpida da composição deglicosamina (d) na Figura 2. A solução contém uma modalidade da composição deglicosamina bem, como pequenas quantidades de glicose e de outros componentes dacomposição. A composição de glicosamina pode ser concentrada e algum teor de ácidorecuperado pode ser reciclado e reutilizado.A composição de glicosamina pode ser cristalizada (e) na Figura 2. Por exemplo, acomposição de glicosamina pode ser cristalizada adicionando-se etanol para as soluçõesconcentradas ou por evaporação contínua até o limite de solubilidade da composição deglicosamina.

A composição de glicosamina pode ser recuperada por um processo de separação,tal como filtração ou centrifugação, seguido por secagem. A composição de glicosaminaseca é opcionalmente ainda tratada pra remover açúcares residuais indesejáveis. Ummétodo de remoção desses açúcares é por dissolução da composição de glicosamina emágua e adição de etanol para precipitar outra vez a composição de glicosamina, enquanto osaçúcares indesejáveis permanecem na solução. Alternativamente, a solução pode sertratada por eletrodiálise, cromatografia, filtração com membrana ou outros procedimentosadequados par aumentar mais ainda a concentração de glicosamina na composição deglicosamina. A composição de glicosamina pode, opcionalmente, ser descolorida e/oudesodorizada, por exemplo, por tratamento da composição com etanol, carbono outromaterial ou método adequado.

Um método de hidrólise com ácido agressivo tem, tipicamente um rendimento dacomposição de glicosamina maior que 50 por cento do teor de quitina total do material departida da biomassa fúngica.

Numa modalidade alternativa do método descrito acima, a biomassa pode serinicialmente tratada para remover algumas impurezas e/ou melhorar a produção dacomposição de glicosamina. Esses tratamentos podem incluir, por exemplo, aquecimento dabiomassa, adição de enzimas digestivas, mistura com um ácido ou base, agitação mecânica,rompimento ultra-sônico da célula ou retirada da água por compressão. Um tratamentoopcional pare remoção de proteína, lipídios e ácido cítrico residual envolve o pré-tratamentoda biomassa na presença de uma base tal como hidróxido de sódio ((b) na Figura 2).

Em algumas modalidades, uma concentração inferior menor que 10% de hidróxidode sódio é adicionada para a biomassa fúngica. a solução básica é aquecida a umatemperatura relativamente elevada durante um período de tempo suficiente para removeruma quantidade considerável do material que não contém quitina, tal como proteínas elipídios. Este período de tempo pode ser menor do que duas horas. Um exemplo específicodesse método de pré-tratamento envolve o aquecimento da biomassa fúngica desde 100° a125°C numa solução 1-8% de hidróxido de sódio durante 20 a 60 minutos. Alternativamente,a concentração de hidróxido de sódio pode ficar em 1-4%. Modalidades onde a biomassa étratada com uma solução básica, as proteínas e glicanos são hidrolisados na biomassa.

Esses subprodutos podem ser opcionalmente, removidos por exemplo, por filtração. Aremoção dessas proteínas e outros produtos de refugo pode ser seguida por tratamentopara remover proteínas solúveis aminoácidos e outras impurezas. Uma alternativa paratratamento da biomassa com uma solução básica poderia incluir, por exemplo, tratamentoda biomassa fúngica em solução com enzimas protease ou outras enzimas adequadas pararemover componentes indesejáveis tais como proteínas e lipídios. Ainda uma outramodalidade alternativa compreende o tratamento mecânico da biomassa fúngica paraquebrar, fisicamente as paredes celulares de modo que as proteínas indesejáveis e oslipídios dentro das células possam ser removidos antes de extrair a quitina das própriasparedes celulares. Em uma outra modalidade alternativa ainda, são empregados álcooispara remover componentes indesejáveis da biomassa fúngica antes da hidrólise ácida.

Numa outra modalidade dos métodos para produzir composição de glicosamina dabiomassa fúngica, o material da biomassa pode passar por um pré-tratamento com ácidobrando, seguido por um tratamento com ácido agressivo.

Mais especificamente, com referência à Figura 3 a biomassa contendo quitina (a)pode primeiramente passar por um pré-tratamento com ácido brando (d). As condições dehidrólise acida (parâmetros compreendendo tempo, temperatura e concentração de ácido)usadas soa "brandas" em comparação com o tratamento com ácido agressivo subseqüente9f). A hidrólise ácida que ocorre sob as condições relativamente brandas permite a remoçãodos constituintes indesejáveis da biomassa antes do tratamento com ácido agressivo (f). Umtratamento com ácido brando, portanto, pode ser empregado pra melhorar quaisquer dosvários aspectos de produção da composição de glicosamina da biomassa fúngica. Um ácidobrando pode ser empregado para quebrar as paredes celulares da biomassa fúngica demodo tal que, os constituintes estranhos da biomassa, tais como proteínas lipídios epolissacarídeos indesejáveis possam ser removidos antes da hidrólise da quitina. Aconcentração de ácido durante o tratamento com adi brando pode ser de 0,01 a 20% ou 0,1a 15%, ou de 0,5 a 5% p/p de ácido, tal como HCI. O pré-tratamento com ácido brando podeser feito usando-se ácidos orgânicos, tais como ácido cíttrico, ácido oxálico, ácido málico,ácido maléico, ácido itacônico, ou ácido succínico. Esses ácidos orgânicos podem serusados a concentrações que variam desde 0,01 a 16% em peso a temperatura entre 110°Ca 200°C durante 10 minutos a 15 horas. Composições de ácido menores exigem tempos dereação maiores, maiores temperaturas ou ambas. Por exemplo, ácido cítrico a 0,1% podeser usado a uma temperatura de cerca de 130 a 160°C por duas a seis horas. Uma soluçãode ácido cítrico a 15% pode ser usada em temperaturas entre cerca de 110-130°C durante15 minutos a três horas. Concentrações mais elevadas de soluções de ácido forte ou o usode diferentes ácidos ou ácidos mistos podem ser usadas para quebrar as paredes celularesmais rapidamente, embora as condições de reação devam ser adaptadas para controle daconversão prematura, indesejável da quitina em glicosamina. Similarmente, concentraçõesmenores de ácidos fortes, ácidos fracos ou ácidos mistos podem ser usadas (especialmentea temperaturas relativamente mais altas, durante períodos de tempo maiores, ou aconcentrações mais altas), de modo que, as paredes celulares seja quebradas o bastantepara obter-se a remoção de uma parte substancial ou desejável dos constituintes estranhosà biomassa, por exemplo, lipídios, proteínas e polissacarídeos indesejáveis.s

Um tratamento com ácido brando (d) pode ser realizado reagindo-se os seguintescomponentes: de 0,05 a 20% de ácido, e de 1 a 50% de biomassa (com base no peso seco).Em determinada implementações, a mistura de reação de ácido brando compreende de 0,1a 12% de ácido clorídrico, e de 3 a 25% da biomassa (com base no peso seco). Em umaoutra modalidade ainda a proporção da solução compreende de 0,5 a 5% de ácido clorídricoe de 5 a 15% da biomassa (com base no peso seco).

O tratamento com ácido brando pode ser feito a uma temperatura de 60°C a 200°Cou de 100°C a 165°C, ou a uma temperatura de 125°C a 145°C. Temperaturas mais elevadapodem ser usadas desde que esta não seja tão alta a converter uma quantidade significativa- da quitina em formas solúveis. Similarmente, temperatura mais baixas (tais como 60°C-90°C) podem ser empregadas (especialmente com ácidos fortes relativamente concentrados,tais como HCI) desde que as paredes celulares sejam suficientemente rompidas para liberaros produtos de refugo, por exemplo lipídios, proteínas e polissacarídeos indesejáveis, semconverter uma quantidade significativa de quitina em formas solúveis.. Conforme aquiempregado, "uma quantidade significativa de quitina em formas solúveis" em relação aosprocessos descritos significa menos do que uma quantidade que proporcionaria um baixorendimento de glicosamina na composição de glicosamina final menos que 10% da quitina,ou menos que 5% da quitina, ou menos que 2% da quitina.

Antes de, ou seguinte ao tratamento com ácido brando, a biomassa fúngica (a) ouos sólidos (e) retidos após o tratamento com ácido brando (d) a remoção dos produtosindesejáveis podem ser opcionalmente, tratada com uma solução suavemente básica (b)conforme descrito supra e como referenciado na Figura 3. Embora etapas do método sejamdemonstradas e descritas na ordem específica, deve ficar entendido que, a ordem dessasetapas pode variar sem se afastar dos métodos apresentados.

Os sólidos (e) retidos após tratamento com ácido brando (e, opcionalmentetratamento com base branda (b)) são a seguir tratados com um ácido agressivo (f) conformedescrito nas modalidades supra. Nesta modalidade, contudo, uma grande parte deimpurezas, principalmente glicanos, já foram removidos da solução (entre as etapas (d) e(e)). Portanto, o tratamento com ácido agressivo (f) para converter a quitina nos sólidosrestantes da biomassa fúngica em uma composição de glicosamina requersignificativamente menos ácido. Por exemplo, com um tratamento com ácido agressivo sobcondições tais como 17% de HCI e 10% de sólidos da biomassa seca durante 9 horas a100°C, o ácido clorídrico necessário na etapa de ácido agressivo poderia ficar reduzido de20 a 60%.Quando um processo de pré-tratamento com ácido brando e remoção de produtode refugo é realizado antes de um tratamento com ácido agressivo, devido a ser necessáriomenos ácido para emprego, a quantidade da solução de refugo resultante final (entre etapas(h) e (i) é um volume significativamente menor, se comparado com o método que omite opré-tratamento com ácido brando. O ácido necessário para tratar a biomassa é tipicamentecaro; um volume menor de ácido é uma economia significativa, especialmente quando daprodução de um produto numa escala comercial. O menor volume de solução ácida tambémpermite menor aparelhagem de separação para separar a composição de glicosamina dasolução ácida. Devido ao aparelho necessário para separa ruma solução de ácidoconcentrado ser formada de materiais especiais (e caros) resistentes para atividadescorrosivas de ácidos concentrados, menor aparelhagem de separação, economiza umaproporção significativa de composição de glicosamina para manufatura da biomassa fúngica,especialmente numa escala comercial. Quando um pré-tratamento com ácido brandoprecede o tratamento com ácido agressivo, o menor volume de solução ácida resulta emmenos solução de refugo para tratamento, uma vez que a composição de glicosamina éremovida desta.

Composição de glicosamina são formadas durante o tratamento com ácidoagressivo seguinte a um pré-tratamento com ácido brando do mesmo modo dascomposições formadas com tratamento de ácido agressivo apenas.

Quando a quitina no sólido restante (e) é tratada com ácido agressivo (f), osglicanos não removidos no processo de separação precedente são convertidos emcomponentes da composição de glicosamina benéficos, tal como melanoidinas e ácidolevulínico. Para alterar as concentrações desses componentes de composição deglicosamina, pode-ser permitir que mais glicanos permaneçam no sólido restante (c).

Etapas de processo seguinte ao tratamento com ácido agressivo (f) sãosubstancialmente similares àquelas descritas acima.

Em ainda uma outra modalidade dos métodos para produzir composições deglicosamina da biomassa fúngica, temperaturas maiores e/ou pressões são utilizada comum tratamento de ácido agressivo, isto permite que a reação ocorra usando menos ácido ounum período de tempo mais curto do que o tratamento com ácido agressivo supracitado.Faixa de temperatura para isto a temperatura aumentada, tratamento com ácido agressivoda de 90°C a 160°C, por exemplo, de 105°C a 160°C. A pressão pode ser deixada crescercomo uma função das reações que ocorrem num vaso fechado.

Mais especificamente a biomassa fúngica é tratada na fase de tratamento comácido agressivo com um ácido tal como desde 4 a 20% de ácido ou de 6 a 13%. Asconcentrações menores de ácido ainda convertes a quitina em solução em glicosamina,porque as condições de reação são alteradas para aumentar a temperatura e/ou pressão.De modo especifico, a solução de ácido/biomassa é colocada num vaso fechado de modoque a reação possa ocorrer a pressões ligeiramente acima da atmosférica a 10 atmosferas,ou ligeiramente acima da pressão atmosférica a 4 atmosferas, tal como 2 atmosferas. Oaumento de pressão pode ser devido à reação ocorrer numa temperatura maior num vasofechado ou a reação pode ocorrer num vaso em que a pressão é, diferentemente,aumentada de propósito.

A temperatura, caso seja elevada, é preferivelmente de 90°C a 160°C, ou 100°C a140°C, tal como 110°C a 130°C. A reação pode ocorrer a temperaturas elevada a pressõesdescritas sura ou fora de um vaso fechado a pressão atmosférica. Caso a temperatura dareação ocorra desde 90°C a 160°C num vaso fechado, as pressões estarão, em geral apressão atmosférica de 5 atmosferas (65 psig). Obtém-se bons resultados com umatemperatura de reação, por exemplo, de 120°C e uma pressão de 1 atm (ou 15 psig).

Outros métodos de aumento da temperatura estão disponíveis e incluídos nosmétodos propostos, estão, por exemplo, aumento do ponto de ebulição, por adição de sais.

O restante dos métodos de temperatura e/ou pressão aumentados para produçãodas composições de glicosamina da biomassa fúngica seguem as etapas esboçadas nosmétodos supracitados (tais como demonstrados nas Figuras 2 ou 3% Exemplos específicosdestes métodos de temperatura e/ou pressão aumentados, para produção de composiçõesde glicosamina são dados a seguir.

D. Métodos para Produção de Composições de N-acetilglicosamina ouComposições de Glicosamina da Biomassa Fúngica

Também são revelados métodos para produção de composições de N-acetilglicosamina (NAG) e/ou glicosamina da biomassa fúngica onde uma etapa de pré-tratamento enzimático, uma etapa de separação e a seguir uma segunda etapa enzimáticasão utilizadas, Além disso, apresentam-se métodos para produção de composições deglicosamina e/ou N-acetilglicosamina da biomassa fúngica onde uma etapa de pré-tratamento com ácido brando (ou outra etapa de pré-tratamento), uma etapa de separação euma subseqüente etapa enzimática para converter quitina em N-acetilglicosamina sãoutilizadas. Além disso, são revelados métodos onde a glicose presente na composição apósconversão de quitina em N-acetilglicosamina é enzimaticamente tratada para converter aglicose em formas iônicas removíveis. Também se apresentam métodos onde ascomposições de N-acetilglicosamina são desacetiladas formando composições deglicosamina.

A biomassa fúngica inclui, tipicamente, uma parte significativa (pelo menos 15% eaté cerca de 50% a cerca de 60%) de glicanos misturados intimamente com a quitina. Alémdisso, devido aos glicanos não serem hidrossolúveis, eles não são prontamente removíveisda biomassa fúngica. Em métodos precedentes, tais como os revelados ma Patente U.S/.6.693.188, as enzimas são utilizadas para degradar os glicanos na biomassa ao mesmotempo que a quitina é degradada pelas enzimas para converter a quitina em NAG.Infelizmente, esses métodos propiciam uma quantidade malograda de quitina na biomassasendo convertida em NAG1 em grande parte, devido aos glicanos estarem ainda presentesna biomassa, quando a quitina disponível está sendo convertida em N-acetilglicosamina portratamento enzimático. Esses glicanos interferem com a disponibilidade da quitina parainteração com as enzimas deixando uma grande parte de quitina intacta (ou seja, umagrande partes da quitina não é convertida em NAG). Além da conversão de baixaporcentagem do método da patente Ί88 de quitina na biomassa fúngica em NAG, avelocidade de conversão também é relativamente lenta (cerca de 72 horas são necessáriaspara se conseguir a conversão máxima de quitina em NAG). A tabela 3 a seguir mostradados de comparação para o tratamento da biomassa com uma etapa de pré-tratamentoantes de uma etapa de conversão com esse método, onde não foi realizado nenhum pré-tratamento antes da conversão da quitina em N-acetilglicosamina.

A tabela 3 mostra uma comparação de altos rendimentos de NAG obtidos pordigestão enzimática de quitina a partir da biomassa fúngica pré-tratada, versus baixosrendimentos e longos tempos de reação na biomassa não tratada.

Tabela 3

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Os primeiros três tratamentos relacionados na Tabela 3 foram realizados conformedescrito na Patente US 6.693.188. Os quatro e quinto tratamentos, utilizaram os métodosatualmente apresentados usando uma modalidade da biomassa pré-tratada com ácidobrando (ácido cítrico a 0,1%). A digestão enzimático no tratamento 4 utilizou umacombinação de quitinase e celulase, enquanto a digestão enzimática no tratamento 5 utilizouapenas quitinase. Os tratamentos 4 e 5 demonstram rápida conversão de quitina em NAg,se comparado com a técnica descrita na patente Ί88. Além disso, mais de 95% de quitinafoi digerida nos tratamentos 4 e 5, indicando maior disponibilidade de quitina para digestãoenzimática, devido ao pré-tratamento da biomassa. A capacidade da quitinase em ligar-se edigerir rapidamente a quitina na biomassa pré-tratada é ainda demonstrada na Figura 10,que ilustra a velocidade relativa da formação de NAG durante as condições empregadas notratamento 4 da Tabela 3. Neste tratamento, mais de 80% da digestão de quitina ocorreu em7 horas.

Resultados inesperadamente superiores foram vistos, quando os métodosatualmente apresentados foram utilizados tal que a biomassa fúngica foi tratadaprimeiramente, com pré-tratamento enzimático de modo que uma grande parte dos glicanosfoi prontamente removível de modo a não estar mais presente para competição com aquitina para exposição e conversão por um tratamento enzimático. Mais especificamente,em algumas modalidades dos métodos apresentados, a biomassa fúngica é primeiramentesubmetida a uma etapa de pré-tratamento enzimático. A biomassa é pré-tratada não apenaspara liberar a separação de pelo menos uma parte das proteínas lipídios e polissacarídeosda biomassa, mas também de modo que, uma parte significativa dos glicanos (cerca de 30%dos glicanos presentes na biomassa ou mais) seja pré-tratados com enzimas de modo aconverter os glicanos na forma solúvel e assim serem removíveis.

Com referência à Figura 9, a biomassa fúngica é submetida a uma etapa A de pré-tratamento. A etapa A de pré-tratamento quebra pelo menos uma parte dos glicanos nabiomassa, mas não atua na conversão de uma parte significativa da quitina em formassolúveis, tais como N-acetilglicosamina ou glicosamina. Conforme aqui empregado, "umaquantidade significativa de quitina em formas solúveis" em relação aos processos descritosna Figura 9 significa menos que uma quantidade que proporcionaria um baixo rendimentode glicosamina na composição de glicosamina final, por exemplo, menos que cerca de 30%de quitina original, ou menos que 10% de quitina, ou menos que 5% de quitina, sãoconvertidos em formas solúveis. Os indesejáveis glicanos e outros componentesindesejáveis da biomassa são separados da quitina, por exemplo, por filtração.

De modo específico, a etapa A de pré-tratamento remove pelo menos algunsglicanos, proteínas e/ou lipídios na fonte de biomassa fúngica convertendo estes na formasolúvel, que são a seguir separados da fração sólida por exemplo, por filtração, comodescrito a seguir(em algumas modalidades, cerca de 30% dos polissacarídeos sãoconvertidos em formas solúveis. Os sólidos restantes contém uma concentraçãosignificativamente maior de quitina, que na etapa de tratamento converte a quitina em NAGou em glicosamina (descrito abaixo). Caso uma etapa de pré-tratamento convertesse aquitina em formas solúveis tais como glicosamina, NAG ou oligômeros de NAG, essasformas solúveis seriam removidas na etapa de separação entre o pré-tratamento etratamento, resultando em perdas de rendimento. Com a etapa A de pré-tratamento comopré-tratamento com ácido brando, por exemplo, um método de alta temperatura/ácido cítrico,há pouca, caso haja, conversão de quitina em formas solúveis. Assim, um pré-tratamentocom ácido brando (abaixo descrito) converte uma parte significativa dos glicanos,polissacarídeos, lipídios e proteínas em formas solúveis sem converter uma partesignificativa da quitina em formas solúveis.s

Na etapa A1 de pré-tratamento, a biomassa é misturada com enzimas de modo aconverter uma parte significativa (pelo menos cerca de 20%) dos glicanos presentes nabiomassa em formas solúveis. As enzimas são derivadas, tipicamente, de microorganismos.As enzimas podem ser introduzidas na biomassa, na presença de microrganismos dos quaiselas são derivadas, que tem a vantagem de evitar uma etapa de separação de enzimas deseus organismos de origem. A inclusão dos organismos de origem pode ser vantajosa, naimplementação, onde os microorganismos continuam a criar enzimas após terem sidoadicionados à biomassa fúngica.

Enzimas adequadas para a etapa de pré-tratamento (A1 na Figura 9) incluemglicanases, laminarases, proteases ou celulases, de modo a romper parcialmente asparedes celulares da biomassa fúngica e converter os glicanos sólidos, bem como oslipídios e/ou proteínas em formas solúveis sem converter uma parte significativa de quitinaem formas solúveis, tais como glicosamina e/ou N-acetilglicosamina. Os glicanos solúveis eoutros componentes solúveis indesejáveis da biomassa fúngica são então removidos ,porseparação dos sólidos da parte líquida, (usando meios convencionais como filtração,centrifugação, decantação ou outros métodos de separação razoáveis).

Em modalidades alternativas, outras etapas de pré-tratamento podem ser usadasem combinação com a etapa A1 de pré-tratamento enzimático ou como alternativas a esta.Em algumas modalidades,a biomassa fúngica é pré-tratada com um pré-tratamento comácido brando, ver A2. Uma tal etapa de pré-tratamento com ácido brando está descritaacima em relação aos métodos da composição de glicosamina.

De modo específico, em algumas modalidades, o material da biomassa podepassar por um pré-tratamento com ácido brando (A2, Figura (), seguido pelo tratamentoenzimático (B, Figura 9). Similar como se vê na Figura 3 para formação de uma composiçãode glicosamina, nesta modalidade para produção de N-acetilglicosamina, a biomassacontendo quitina (a) passa primeiramente por um pré-tratamento com ácido brando (d). Ascondições de pré-tratamento com ácido (os parâmetros compreendendo tempo, temperatura,tipo de ácido, e concentração de ácido) usados são "brandos" em comparação com otratamento com ácido agressivo (f) usado em determinados métodos de produção deglicosamina. a hidrólise ácida que ocorre sob as condições relativamente brandas permite aremoção dos constituintes indesejáveis da biomassa antes do pré-tratamento A1 enzimáticoou o tratamento B enzimático como se vê na Figura 9.Um ácido brando pode ser usado para romper as paredes celulares da biomassafúngica de modo que proteínas lipídios e polissacarídeos indesejáveis possam serremovidos antes de converter a quitina em N-acetilglicosamina por um tratamentoenzimático (B, Figura 9).

A concentração de ácido durante o tratamento com ácido brando pode ser de 0,01a 20% ou de 0,05 a 1% p/p de ácido como HCI ou um ou mais ácidos orgânicos tal comoácido cítrico. As faixas percentuais de ácido podem variar, dependendo da temperatura etempo de pré-tratamento. Maiores concentrações de soluções de ácido forte ou o uso dediferentes ácidos ou ácidos mistos pode ser feita para romper as paredes celulares maisrapidamente, ainda que, condições de reação devem ser adaptadas a controlar a conversãoprematura, indesejável de quitina em formas solúveis. Similarmente, menoresconcentrações de ácidos fortes, ácidos fracos ou ácidos mistos podem ser usadas(especialmente a temperaturas relativamente maiores, por períodos de tempo maiores, ou aconcentrações maiores) de modo que as paredes celulares sejam suficientementequebradas, para ter-se uma remoção de uma parte substancial ou desejável dosconstituintes estranhos à biomassa, por exemplo, lipídios proteínas e polissacarídeosindesejáveis.

Um tratamento com ácido brando pode ser realizado reagindo-se os seguintescomponentes: de 0,01 a 16% de ácido cítrico, e de 5 a 30% de biomassa (com base no pesoseco). Em determinadas implementações, a mistura de reação de ácido brando compreendede 0,01 a 3%de ácido clorídrico e de 3 a 25% de biomassa (com base no peso seco) Emuma outra modalidade ainda, as quantidades em solução compreendem de 0,05 a 5% deácido clorídrico e de 5 a 15% de biomassa (com base no peso seco).

O tratamento com ácido brando pode ser realizado a uma temperatura de 60°C a200°C ou de 70°C a 105°C, ou a uma temperatura de 80°C a 120°C. Temperaturas maiselevadas (por exemplo, 100-200°C com um ácido orgânico como ácido cítrico) podem serusadas, desde que não seja tão alta que converta uma parte significativa de quitina emformas solúveis. Similarmente, temperaturas menores (como 60°C-90°C) podem serempregadas (especialmente com ácidos fortes relativamente concentrados) desde que asparedes celulares sejam suficientemente rompidas para liberar os produtos de refugo, porexemplo, lipídios proteínas e polissacarídeos indesejáveis, sem converter uma partesignificativa de quitina em formas solúveis. Conforme aqui empregado, "uma quantidadesignificativa de quitina em formas solúveis" significa menos que uma quantidade queproporcionaria um baixo rendimento de N-acetilglicosamina na composição de N-acetilglicosamina final menos que 10% de quitina, ou menos que 5% de quitina ou menosque 2% de quitina.Antes de, seguinte a ou em vez de, um pré-tratamento enzimático e/ou pré-tratamento com ácido brando, a biomassa fúngica (ou os sólidos retidos após o tratamentocom ácido brando e remoção dos produtos indesejáveis) pode ser tratada, opcionalmente,com uma solução suavemente básica (A3, Figura 9), conforme descrito supra e comoreferenciado na Figura 3 em relação aos métodos da composição de glicosamina. Emboraetapas do processo sejam mostradas e descritas na ordem específica, deve fica entendidoque, a ordem dessas etapas pode variar sem se afastar dos métodos apresentados.

Por exemplo, em algumas modalidades, uma concentração inferior a 10% dehidróxido de sódio é adicionado para a biomassa fúngica ou os sólidos separados seguinteao pré-tratamento usando enzimas e/ou pré-cozimento com ácido brando. A solução básicaé aquecida até uma temperatura relativamente elevada durante um período de temposuficiente para remover uma quantidade desejável do material não contendo quitina, talcomo proteínas e lipídios. Este período de tempo deve ser inferior a duas horas. Umexemplo específico deste método de pré-tratamento envolve o aquecimento da biomassafúngica ou sólidos separados a 100°-125°C numa solução de hidróxido de sódio a 1-8%durante 20 a 60 minutos. Alternativamente, a concentração de hidróxido de sódio pode serde 1-4%. Modalidades onde a biomassa é tratada com uma solução básica, as proteína eglicanos são hidrolisados na biomassa. Esses subprodutos são removidos, por exemplo, porfiltração. A remoção dessas proteínas e outros produtos de refugo pode seguir-se atratamento para remoção de proteínas solúveis, aminoácidos e outras impurezas.

Ainda uma outra alternativa para tratamento da biomassa com um pré-tratamentoenzimático ou um ácido brando ou pré-tratamento básico, pode compreender o pré-traamento mecânico e/ou ultra-sônico da biomassa fúngica para romper fisicamente asparedes celulares, de modo que proteínas e lipídios indesejáveis dentro das células possamser removidos antes de extrair a quitina das próprias paredes celulares. Tal tratamentomecânico pode seguir-se a quaisquer outros pré-tratamentos apresentados. A1, A3, Figura 9seguinte ao pré-tratamento da biomassa fúngica os sólidos são isolados usando qualquermétodo de separação adequado tal como filtração, pressão por filtro, e/ou centrífuga dedecantação. Os sólidos separados são então submetidos à tratamento de conversãoenzimática para converter a quitina em N-acetilglicosamina (B, Figura 9). Novamente, asenzimas são derivadas, tipicamente de microorganismos. As enzimas podem serintroduzidas aos sólidos pré-tratados na presença de microorganismos dos quais elas sederivam, tendo a vantagem de evitar uma etapa de separação das enzimas de seusorganismos de origem. A inclusão dos organismos de origem pode ser vantajosa naimplementação onde os microorganismos continuam a criar enzimas após terem sidoadicionados aos sólidos pré-tratados.Enzimas adequadas para a etapa de tratamento de conversão enzimática (B naFigura 9) inclui quitinases, glicanases, celulases e outras enzimas que tem atividadeespecífica ou não específica permitindo-as hidrolisar formas polimérica ou oligoméricas dequitina e/ou glicano, tal como laminarase, amilase, glicoamilase e outras. Combinaçõesdessas enzimas podem ser empregadas como quitinase e celulase, conforme se demonstrana Tabela 4. Sob determinadas condições de reação, tal como variação do pH, composiçãotampão, e temperatura, a inclusão de outras enzimas, além de quitinase, resulta emdigestão mais rápida ou completa de quitina em NAG.

Tabela 4

NAG de Quitinase e Celulase

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Glc = glicose

O tratamento de conversão enzimática pode ocorrer a uma temperatura desdecerca de 25°C a cerca de 90°C ou a partir de uma temperatura de cerca de 50°C a cerca de70°C, ou preferivelmente, cerca de 50°C a cerca de 55°C. A conversão nessas temperaturasrelativamente altas propicia a eliminação ou destruição de micro-contaminação dacomposição de N-acetilglicosamina resultante com contaminantes tais como a maioria dasbactérias, fungos e leveduras.

O pH do tratamento de conversão enzimática (B, Figura (O pode se de cerca de 3,0a cerca de 9,0 ou de cerca de 4,5 a cerca de 8,0, ou de cerca de 5,0 a cerca de 7,5.Tampões úteis para a prática do tratamento de conversão enzimática inclui quaisquertampões adequados, como acetatos, fosfatos e citratos. O tratamento de conversãoenzimática propicia excelente rendimento de N-acetilglicosamina em um período de tempode cerca de 2 horas-a cerca de 24 horas, ou de cerca de 4 horas a cerca de 16 horas, ou decerca de 5 horas a cerca de 10 horas.

Usando o tratamento de conversão enzimática apresentado providencia-se um altorendimento de conversão de quitina em N-acetilglicosamina, algumas modalidadesconvertem pelo menos cerca de 90% ou mais de quitina nos sólidos pré-tratados e emalgumas modalidades, pelo menos cerca de 95% ou mais da quitina é convertida em NAG(Ver a Tabela 4).

Seguinte ao tratamento de conversão enzimática o filtrado líquido é isolado usandométodos de separação convencionais tais como centrifugação, filtração, etc. O filtrado é aseguir tratado para formar glicosamina em algumas modalidades da invenção (E, Figura 9).Esta modalidade particular para formação de glicosamina é descrita a seguir. Caso o filtradonão deva ser tratado para formar glicosamina a partir de NAG1 então esta etapa deisolamento pode ser realizada após o tratamento de glicose enzimática (C, Figura 9).

O filtrado líquido obtido quando a quitina é convertida em N-acetilglicosaminatambém contém uma proporção significativa de glicose (desde cerca de 10% a cerca de100% da concentração de NAG - dependendo esta quantidade da extensão e eficácia daetapa de pré-tratamento conforme ilustrado nos Exemplos abaixo) bem como enzimas,tampões e íons residuais da biomassa. a glicose pode ser separada da N-acetilglicosaminausando resinas de cromatografia ou outros métodos similares, porém tais métodos deseparação são tipicamente difíceis e caros. O filtrado líquido contendo a N-acetilglicosaminae glicose (seja isolado como descrito abaixo ou não) em algumas modalidades dos métodosapresentados é portanto, tratado em um segundo tratamento enzimático a fim de converter aglicose em formas iônicas de glicose que são mais facilmente separadas da N-acetilglicosamina (C, Figura 9). A glicose é portanto, de preferência, tratadaenzimaticamente para conversão da glicose em formas iônicas (C, Figura (), como porexemplo, ácido glucônico usando glicose oxidase. As composições de NAG resultantes,podem incluir algumas quantidades secundárias de glicose remanescente, bem como de salde ácido glucônico o outras espécies iônicas, que são a seguir separadas das moléculas deN-acetilglicosamina neutras juntamente com as enzimas tampões e outros sais que podemestar presentes (ver os Exemplos a seguir) Métodos de separação incluem resina de trocaiônica e eletrodiálise.

As enzimas adequadas para conversão da glicose incluem, sem limitação,glicoseoxidase, glicose-1-desidrogenase e hexoquinase.

O tratamento de conversão enzimática pode ocorrer a uma temperatura desde 40°Ca cerca de 60°C, ou de uma temperatura desde cerca de 45°C a cerca de 55°C, oupreferivelmente a cerca de 50°C a cerca de 55°C. A conversão nessas temperaturasrelativamente altas propicia eliminação ou destruição de microcontaminantes da composiçãode N-acetilglicosamina resultante com contaminantes tais como a maioria das bactérias,fungos e leveduras.

O pH do tratamento da conversão enzimática pode ser de cerca de 3,5 a cerca de7,5 ou de cerca de 4,5 a cerca de 7,0, ou de cerca de 5,0 a cerca de 6,0. Tampões úteispara a prática do tratamento de conversão enzimática incluem quaisquer tampõesadequados, como acetatos, fosfatos e citratos. O tratamento de conversão enzimáticapropicia excelente conversão da glicose em um período de tempo de cerca de 1 hora acerca de 24 horas, ou de cerca de 2 horas a cerca de 16 horas, ou de cerca de 5 horas acerca de 10 horas.

Usando o tratamento de conversão enzimática apresentado providencia-se um altopercentual de conversão de glicose em ácido glucônico. Algumas modalidades convertempelo menos cerca de 90% ou mais de glicose no filtrado líquido, a partir do tratamento B e,em algumas modalidades, pelo menos cerca de 95% ou mais de glicose é convertida emácido glucônico (Ver a Tabela 15).

Alternativamente, outros métodos podem ser empregados para separar a glicose daN-acetilglicosamina tal como o emprego de resinas cromatográficas para separar N-acetilglicosamina da glicose, sais, tampões e enzimas, Resinas típicas são baseadas naafinidade para grupos funcionais das moléculas. Resinas com base em polissulfonas ou comgrupos amino livres são adequadas para separação, em vez de tratamento enzimático.

Em algumas modalidades, para produção das composições de N-acetilglicosaminaas etapas BeC (Figura 9) são realizadas simultaneamente. OU seja, em algumasmodalidades, os sólidos pré-tratados isolados são tratados com enzimas para conversão daquitina em N-acetilglicosamina e para converter glicose em formas iônicas. Taismodalidades incluem combinações de enzimas incluindo quitinases ou quitinases maisenzimas auxiliares (tais como glicanase, celulases, aminarase, ou outras) que convertem aquitina em N-acetilglicosamina, juntamente com glicose oxidase ou outras enzimas queconvertem a glicose em formas iônicas tais como ácido glucônico. Realizando-sesimultaneamente as etapas BeC economiza-se nos custos do processo.

Os tratamentos de conversão enzimática combinados descritos nas etapas B e Cpodem ocorrer a uma temperatura desde cerca de 40°C a cerca de 60°C, ou de umatemperatura desde cerca de 45°C a cerca de 55°C, ou preferivelmente a cerca de 50°C acerca de 55°C. A conversão nessas temperaturas relativamente altas propicia eliminação oudestruição de microcontaminantes da composição de N-acetilglicosamina resultante comcontaminantes tais como a maioria das bactérias, fungos e leveduras.

O pH do tratamento da conversão enzimática pode ser de cerca de 3,5 a cerca de7,5 ou de cerca de 4,5 a cerca de 7,0, ou de cerca de 5,0 a cerca de 6,0. Tampões úteispara a prática do tratamento de conversão enzimática incluem quaisquer tampõesadequados, como acetatos, fosfatos e citratos. O tratamento de conversão enzimáticapropicia excelente conversão de quitina N-acetilglicosamina e excelente conversão deglicose em ácido glucônico, num período de tempo de cerca de 1 hora a cerca de 24 horas,ou de cerca de 2 horas a cerca de 16 horas, ou de cerca de 5 horas a cerca de 10 horas.(ver a Tabela 18).

Usando o tratamento de conversão enzimática apresentado providencia-se um altopercentual simultâneo, de conversão de glicose em ácido glucônico e conversão de quitinaem N-acetilglicosamina. (ver a Tabela 18).

Com referência à Figura 9, em algumas modalidades, após o tratamento deconversão enzimático de glicose (C, Figura 9), a N-acetilglicosamina no Aldo é convertidaem glicosamina (E, Figura 9), conforme descrito abaixo. Em modalidades onde se desejacomposições de N-acetilglicosamina a N-acetilglicosamina é separada do caldo ( caldocontendo as formas iônicas de glicose e NAG) utilizando resinas de troca iônica tais comoPurolite PCR-822 (Purolite Co. Philadelphia, PA) ou Diaion UBK530 (Mitshubishi ChemicalCorp. Tokyo, Japan). (Ver Exemplos a seguir) ou cromatografia de afinidade tal comoresinas de ácido polissulfônico, etc, (D, Figura 9). ou por filtração de membrana oueletrodiálise. Para separação com resina de troca iônica, o pH do caldo é ajustado a umafaixa desde cerca de 5 a cerca de 9, usando, por exemplo, hidróxido de sódio ou hidróxidode potássio. Tipicamente, as resinas são operadas a temperatura algo elevada, tal como 40-80°C ou mais, preferivelmente 50-60°C a fim de minimizar a contaminação microbiológica. AN-acetilglicosamina separada é a seguir cristalizada e seca (F, Figura 9), usando métodosconvencionais tais como cristalização por evaporação ou precipitação, com solventesmiscíveis em água tais como etanol, isopropanol, ou acetona, seguido por uma etapa desecagem tal como secagem rápida, secagem com tampos duplo, ou secagem a vácuo.

Alternativamente, a N-acetilglicosamina pode ser seca usando secagem por pulverização ousecagem com tambor duplo com ou sem uma etapa preliminar de evaporação /concentração.A tecnologia de membrana também pode ser empregada para remover pelo menos algumaágua das composições de N-acetilglicosamina antes da secagem tal como membrana denanofiltração Koch SR3. Devido às composições de N-acetilglicosamina aqui reveladasserem formadas por utilização de conversão enzimática de quitina, diferentemente dascomposições de N-acetilglicosamina comercialmente disponíveis, as presentes composiçõesnão são apenas kosher (não sendo formadas de moluscos) e são isentas de alérgenos demolusco, porém também são formadas de uma origem natural. Meios convencionais paraprodução de N-acetilglicosamina incluem processos de desacetilação e reacetilação querequerem alterações estruturais químicas das moléculas.

Em algumas modalidades dos métodos apresentados a N-acetilglicosamina nosfiltrados das etapas B e/ou C é convertida em glicosamina (E, Figura 9). A N-acetilglicosamina é desacetilada para formar glicosamina, por exemplo, por hidrólise ácidaou desacetilação enzimática. A N-acetilglicosamina é convertida em glicosamina por adiçãode cerca de 10-800% excesso molar de HCI com relação à N-acetilglicosamina presente nofiltrado. Por exemplo, um filtrado de N-acetilglicosamina a 7% em peso necessitaria entrecerca de 11 e 80 g de HCI por quilograma do filtrado (cerca de 1 a 8% em peso).Composições mais altas der ácido rendem velocidades de hidrólise mais rápidas e, em geralrequerem menores temperaturas de hidrólise. Outros ácidos minerais, tais como ácidosulfúrico e ácido fosfórico podem ser usados, mas seu emprego leva a etapas de purificaçãoulteriores mais difíceis no processo, devido a sua baixa volatilidade. A mistura de filtrado HCIé aquecida a uma temperatura desde cerca de 80 a cerca de 100°C (por exemplo, cerca de95°C) por cerca de 1 a cerca de 6 horas (por exemplo, 3 horas). A N-acetilglicosamina podeser desacetilada em glicosamina, seja sem conversão anterior da glicose ou após otratamento de conversão enzimática da glicose (C, Figura 9). Caso a N-acetilglicosaminaseja convertida em glicosamina (E, Figura 9) sem antes conversão da glicose (Após B,Figura 9), então em algumas modalidade dos métodos apresentados uma pressão por filtropode ser empregada nas composição de glicosamina antes de solidificar a glicosamina (F,Figura 9). A composição de glicosamina pode ser solidificada (F, Figura 9), por métodosconvencionais tais como cristalização evaporativa, cristalização por retirada de água damembrana, evaporação ou retirada de água da membrana seguido por precipitação usandoum solvente orgânico tal como etanol ou isopropanol, secagem, liofilização, etc.

A formação de glicosamina com os métodos supracitados permite a produção deglicosamina usando quantidades relativamente pequenas de ácidos a concentraçõesrelativamente baixas (por exemplo, 3% de HCI). Mais especificamente, a formação dascomposição de glicosamina das composições de N-acetilglicosamina conforme descrito,utiliza pelo menos cerca de 50% menos HCI ( ou outro ácido ) se comparado a métodosonde a glicosamina é formada diretamente da quitina. Menores quantidades de ácidopropiciam menores custos, devido a menos oxidação do equipamento e a capacidade deusar-se algum equipamento que, de outro modo, se degradaria quando concentrações equantidades de ácido mais elevadas fossem necessárias.

Além disso, a glicosamina através de métodos de conversão de N-acetilglicosaminareduz perigos de segurança na instalação industrial onde se forma a glicosamina em parte,devido à menor concentração de ácido e porque a conversão de glicosamina ocorre emácidos a temperaturas inferiores abaixo do ponto de ebulição dos ácidos usados e/oupressões. As menores quantidades de ácido e menores concentrações também reduzem aquantidade de refugos químicos perigosos que devem ser descartados.

E. Composições de β-qlicanoGlicano refere-se a um polímero ou glicose em geral. Existem muitos tipos deglicanos, que são além disso, definidos pelas ligações (pontes) entre as moléculas deglicose dentro do polímero. A ligação glicosídica pode estar em qualquer forma α ou β, vistoa glicose existir como dois anômeros. Os β-glicanos foram o foco das composições de fibradietética, composições que reduzem o colesterol e outros benefícios saudáveis bem comoimunoestimulantes para alimentação anima, uso humano e para emprego nas colheitas. Asfórmulas gerais variam em diferentes modalidades de β-glicano, como percentagem de β-1-3,β-1,4, β-1,6, β-1,3,6 e a relação de ligações α-glicosídicas para β-glicosídicas, bem comocomprimentos de cadeia e distribuições de peso molecular.

Conforme aqui empregado, composição de β-glicano ou β-glicanos significa, pelomenos em rate, um grupo de polissacarídeos (açúcares) compostos de monômeros de β-D-glicose ligados juntos por pontes glicosídicas incluindo pontes β-1,3, β-1,4 e β-1,6glicosídicas e podem incluir ramificações compreendendo ligações β-1,3,6 glicosídicas.

Conforme aqui empregado ainda, β-glicanos solúveis significa β-glicanos solúveisem sistemas aquosos por pelo menos cerca de 20% em peso. A solubilidade é indicadacomo a quantidade de β-glicanos nas composições produzindo soluções estáveis emsistemas aquosos, incluindo soluções neutras, ácidas ou básicas, sem sinais visíveis desedimentação. A solubilidade é medida por adição de uma quantidade conhecida dacomposição de β-glicano ao solvente, em excesso de solubilidade, então separando-se aparte solúvel dos sólidos não dissolvidos, medindo-se os sólidos secos na soluçãoresultante. A separação da parte não dissolvida pode ser conseguida por centrifugação ousimplesmente sedimentando-se com o tempo por força da gravidade. Alternativamente,pequenas quantidades da composição de β-glicanos são adicionadas ao solvente até adissolução não ocorrer mais dentro de um período de tempo razoável, por exemplo, uma ouduas horas. A soma das quantidades adicionadas que produziram uma solução estávelrepresenta a solubilidade da composição.

Conforme aqui empregado, uma solução estável não possui sedimentação visívelou substancialmente, nenhuma sedimentação, onde os sólidos ficam assentados ao fundoou estão no topo da solução. Significantemente nenhuma sedimentação ousubstancialmente nenhuma sedimentação significa menos que cerca de 5% de matériainsolúvel numa composição não purificada, ou para uma composição purificada, menos quecerca de 2% de matéria insolúvel e preferível mente menos que cerca de 1% de matériainsolúvel, na solução estável. Um outro modo para se determinar se a solução é umasolução estável, de modo que a solução seja hidrossolúvel conforme aqui empregado, équando um feixe de luz, tal como de um indicador a laser usado para apresentação, parteem sua maioria, de uma cuba contendo uma solução de amostra com o mesmo vetor doincidente, ou um feixe de luz que chega. Caso a maioria ou toda a luz seja difundida emmuitas direções, pela amostra, então não é uma solução, mas uma suspensão, ou seja, nãoé hidrossolúvel como aqui descrito.

Por exemplo, uma amostra da composição de β-glicano purificada, precipitada foitestada adicionando-a á água a 55, 10%, 15%, e 20% em peso. As soluções forammisturadas usando um misturador de turbilhão, deixando-se repousar por duas horas. NOfinal desse tempo, o sedimento, caso algum, era pouco demais para ser observado a olhonu. Um feixe de um indicador a laser vermelho (W R Scientific), transmitiu pela solução eapareceu numa peça de papel branco por trás da amostra indicando que a luz não foisignificativamente propagada em muitas direções pela amostra.

Conforme aqui empregado, β-glicano fúngico ou β-glicanos significa um grupo depolissacarídeos fúngicos (açúcares compostos, predominantemente de monômeros de β-D-glicose ligados juntos pelas pontes glicosídicas incluindo β-1,3, β-1,4- e β-1,μ glicosídicas epodem incluir ramificações compreendendo ligações p-1,3,6-glicosídícas. β-glicano ou β-glicanos fúngicos solúveis significa um grupo de polissacarídeos fúngicos (açúcares)compostos, predominantemente de monômeros de β-D-glicose ligados juntos por pontesglicosídicas incluindo pontes β-1,3, β-1,4- e β-1,6 glicosídicas e podem incluir ramificaçõescompreendendo ligações β-1,3,6-glicosídicas, onde os β-glicanos são solúveis em sistemasaquosos por pelo menos cerca de 20% em peso. Com os β-glicanos de uma origem fúngicaé especialmente útil com a composição de β-glicano usada em conexão com colheitas detratamento, β-glicanos de fonte fúngica podem ser eficazes na proteção de plantas doataque de fungos, porque os p-1,3-glicanos da biomassa fúngica podem estimular umaresposta imune antifúngica.

Conforme aqui empregado, o termo hidrolisar significa clivar pontes num polímeroou composto através da adição de água. conforme aqui empregado, água não éconsiderado ser um ácido.

As composições de β-glicano aqui apresentadas podem estar na forma purificadaou bruta podendo ser sólidos ou líquidos, tal como xaropes. As composições de β-glicanoincluem β-glicanos solúveis de sistema aquoso e algumas modalidades incluem β-glicanoshidrossolúveis. Os β-glicanos revelados são de biomassa fúngica e estão num estadonatural como químicos (diferentes da água) não são usados nos processos apresentados,tal que a estrutura dos β-glicanos nas composições apresentadas têm alteração geralmínima na estrutura química ou nas formas dos grupos funcionais, como os ocasionadospor agentes oxidantes. Composições de β-glicano solúveis são especialmente úteis paraalgumas aplicações. Por exemplo, β-glicanos solúveis sao facilmente transportados atravésdo trato digestivo e são transportáveis ao sistema circulatório. Além disso, com umacomposição de β-glicano solúvel, purificada, é muito mais fácil garantir que a dosagem de β-glicano oferecida tenha um parâmetro ativo mensurável para garantir segurança.

Em algumas modalidades, os β-glicanos solúveis são coleções de polissacarídeoscom um peso molecular médio de cerca de 342 a cerca de 1.000.000. Em algumasmodalidades mais de cerca de 80% em peso dos β-glicanos solúveis têm um pesomolecular médio de cerca de 1.000 a cerca de 1.000.000. O peso molecular médio dependedas condições de processo, tais como temperatura, tempo e acidez, conforme abaixo. Casopurificado por precipitação, o peso molecular médio pode depender também da relação desolvente orgânico para água e temperatura. Um β-glicano com peso molecular relativamentealto terá uma solubilidade menor num solvente, de modo que uma relação de solvente/ágamenor conduza a um produto de maior peso molecular médio.

A cromatografia por Exclusão de Tamanho usando o sistema Dionex Summit LiquidChromatography (ionex, Sunnyvale, CA) com colunas TSK-GEL(R) , G4000PWXL,G3000PWXL e G2500PWXL 7.8 mmx30cm (Tosoh Bioscience, Montgomeryville, PA), emsérie foram empregadas pra medição do peso molecular de β-glicano solúvel a 30°C. Água epululan (Shodex, P-82, peso molecular 5.650 - 710.500, American Polymer Standards,Mentor OH), glicose, maltose, maltotriose, e maltoexose (Sigma, St. Louis, MO) foramusados como eluente e padrão de calibração. A velocidade de fluxo foi de 0,5 mL/minutos.Os dados foram processados usando software Cirrus (R) GPC (Polymer Laboratories,Amherst, MA).

Algumas modalidades das composições de β-glicano solúveis apresentadasatendem os seguintes critérios (todos os valores estão em por cento em peso do produtoseco)

Tabela 5

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Algumas modalidades dos β-glicanos fúngicos solúveis apresentados atendem osseguintes critérios:

Tabela 6

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Outras modalidades das composições de β-glicano fúngicos solúveis apresentadasatendem os critérios na Tabela 7

Tabela 7

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Em algumas modalidades, as composições de β-glicano fúngicas solúveis aquiapresentadas foram comparadas a β-glicanos não fúngicos para confirmar o entendimentode que os β-glicanos fúngicos contém um grande percentual em peso de p-1,3-glicano.Especificamente, β-glicanos fúngicos solúveis da presente invenção formados usandométodos conforme aqui empregado, para isolar os β-glicanos de uma origem A. niger foramcomparadas a glicanos de cevada com os resultados mostrados na Tabela 8.

Tabela 8

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Algumas composições de β-glicano são úteis como constituintes de fibra dietética.Fibra dietética não é digerida ante de atingir o cólon, ou seja, a parte dos polissacarídeosnão digerida no intestino delgado é considerada fibra dietética. A digestibilidade é umamedida chave de fibra dietética. A digestibilidade mede a fração de glicanos que soaquebrados em glicose antes de atingir o colón. Algumas modalidades dos β-glicanosfúngicos incluem glicanos onde 79-87% em peso dos glicanos não são digeríveis nointestino delgado e são portanto, considerados fibra dietética.

Para se determinar a digestibilidade das composições de β-glicano, foi realizado umensaio de digestibilidade in vitro como a seguir. O teste determina a fração de fibradigestível numa amostra por exposição da amostra a pó intestinal de rato reconstituído. Estematerial contém todo o conteúdo do intestino de rato incluindo enzimas intestinais. A fibranão digerível é considerada fibra dietética. Primeiramente, 2 mL de uma solução de β-glicano a 2% foi misturada com 0,1 g de pó intestinal de rato (Sigma 11630, St. Louis, MO),20 μL de NaN3 a 5%, 0,5 mL de tampão de fosfato a 20 mM, pH 6,5 e 1,48 mL de água. Amistura de reação foi incubada a 37°C com ligeira agitação. Uma fração de 0,5 mL dasamostras foi retirada no tempo 0 e 4 horas com uma pipeta descartável graduada apóscuidadosa misturação, com 1 mL de HCI 1,0 N para interromper mais atividade enzimática.A mistura de reação foi filtrada usando um filtro de seringa. O teor de glicose foi determinadopor HPLC usando uma coluna Varian MetaCarbHPIus, 300 χ 7,8 mm (Varian, Walnut Creek,CA). A fase móvel constituía-se em H2SO4 0,01 Nea velocidade de fluxo era 0,4mL/minutos. Foi usado um detector de índice refrativo como o detector.A digestibilidade foi calculada como a seguir:

Glc(%)amostra = [Cpadraox (PAamostra/PApadrão) X 1,5 mL X D] X 10/CamOstra

onde:

Glc (%)amostra = % de glicose em peso na amostra

Cpadrao = concentração do padrão em mg/mL

PAamostra = área de pico da amostra

PApadrao = área de pico do padrão

D = fator de diluição, 6

Camostra = concentração da amostra em mg/1 OmL

Digestibilidade = [Glc(%)4horas- Glc(%)0hOra]1 - Glc (%)0hora)

TABELA 9

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A fibra beta de cevada foi obtida de Cargill Health & Food Technologies (Excelsior,MN). FiberSoI 2H< Matsutani Chemical (Japão).

Pureza conforme aqui indicado, refere-se a percentagem da composição de β-glicano suscetível de despolimerização por enzimas específicas. Um teste de pureza presta-se a duas funções, no fato de descrever a percentagem da composição suscetível àsenzimas empregadas e também para ilustrar as diferenças entre as composições de glicano.

A pureza de algumas modalidades das composições de β-glicano fúngicosapresentadas foi detemrinada usando um teste enzimático que determina a fraçãoconvertida em glicose pelas enzimas específica. Este teste surgiu com base em que osglicanos podem ser misturas complexas de diferentes biopolímeros, de modo que o testedetermina a "pureza" da estrutura de glicano particular, suscetível às enzimas específicas nokit de teste. Enzimas compreendendo Iiquenase e β-glicosidase, obtidas de MegazymeInternational Ireland Limites(Bray, Co. of Wicklow1 Ireland) são programadas para medir a"pureza" dos glicanos derivados de grãos, tais como de aveia ou cevada. Essas encimas alaltamente específicas na origem. OU seja, glicanos originados de grão, requerem sistemasenzimáticos originados de grão e glicanos fúngicos requerem sistemas enzimáticos fúngicos.Diferentes sistemas enzimáticos requerem diferentes condições tais como temperatura, pH,sistema tampão para atividades ótimas. As enzimas do grão não afetam significativamenteos glicanos da biomassa fúngica tais como A. niger. Caso uma enzima, como β-glicanase deGenencor 750 L disponível de Genencor, Rochester, NY seja utilizada, algumasmodalidades das composições de β-glicano fúngico apresentadas têm uma pureza deglicano de cerca de 60% até no máximo 100% em peso, dependendo das condições deteste, algumas composições de glicano na biomassa fúngica têm 100% em peso de purezade glicano. A especificidade das enzimas necessárias para quebrar os glicanos diferencia aestrutura dos glicanos a partir das varias fontes.

Tabela 10

Resultados da Pureza de Glicano Utilizando Diferentes Sistemas Enzimáticos

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1. Kit de teste MegaZyme compreendendo enzimas Iiquenase e β-glicosidase, oprocedimento providenciado pelo fabricante foi rigorosamente seguido para analisar apureza do glicano de uma farinha de cevada padrão (propiciado pelo fabricante, MegaZymerInternational, Ireland) e os glicanos isolados da biomassa fúngica. O produto final,percentagem de glicose foi determinada por um método de HPLC.

2. Sigma A. niger β-glicanase (disponível de Sigma, n° 49101, St. Louis, MO) foiempregado em excesso da capacidade enzimática a condições ótimas: 50 mM de tampãode acetato de sódio, pH 5,0, 37°C por 1 hora.3. Genencor β-glicanase 750L (102-03338-001, Genencor1 Rochester1 NY) foiusado em excesso da capacidade enzimática a pH 4,0 a 60°C por 17 horas.

4. Farinha de cevada padrão foi providenciada pelo fabricante do kit de teste(MegaZyme International, lreland). O teor de β-glicano descrito foi de 4,19% em peso.

5. Dois lotes de β-glicanos foram preparados em ambiente interno (ver ExemploG3) Não há um método enzimático universal para se determinar a pureza de todas asdiferentes espécies de glicanos. Portanto, a pureza do glicano é dependente do sistemaenzimático e de sua condição de reação usada para determinação. Assim, apresenta-se ométodo de teste específico para determinar a pureza das composições de glicanoapresentas.

Modalidades das composições de β-glicano fúngicos foram analisadas para níveisde pureza como a seguir. Uma parte de 20 mg da composições de β-glicano foi dissolvidaem 25 mL de água. Uma fração composta de 0,1 ml_ da amostra foi transferida para um tubode ensaio de 16 χ 100 mm com uma tampa de rosca revestida de Teflon. Uma fração de 1mL da solução enzimática foi misturada com a amostra. A mistura foi então incubada a 60°Cnum banho de água por 17 horas. NO final da ihcubação 3,9 mL de água foi adicionado. Amistura de reação foi filtrada e o teor de glicose foi medido usando um forno de colunaDionex HPLC consistindo de uma coluna Modelo LC25, bomba de gradiente GP50, detectoreletroquímico ED40, auto-amostragem AS40, e gerador de eluente EG40 com PAD(detector amperimétrico pulsado).

Para cada amostra foi preparada uma amostra neutra adicionando-se 1 mL de águano lugar de 1 mL da solução enzimática.

A pureza da composição de β-glicano foi calculada como a seguir:Pureza (%) = Cpadrao X [(PAamostra - PAamostra neutra)/PAPadrão] x 50 χ 25 mL χ(162/180)/Wamostra

F. Métodos para Produção de Composições de β-glicano FúngicosTambém são apresentados métodos para produção de composições de β-glicanosolúveis da biomassa fúngica. Com referência à Figura 12, a biomassa fúngica é escolhidacomo descrito acima. Em algumas modalidades, a biomassa é tipicamente composta decerca de 60-65% em peso de glicano, 18-22% de quitina e proteínas, lipídios, manans egalactans. O material de partida da biomassa pode ser A. niger que pode ter sidoprimeiramente empregada para produzir ácido cítrico (ácido pode ser ácido cítrico residualno material de partida) e pode então ter sido usado para produzir glicosamina e/ou N-acetilglicosamina. Assim, as composições de glicano solúveis podem ser formadas como umsubproduto ou quaisquer desses outros métodos e produtos.

A água é adicionada para a biomassa para obter-se cerca de 5-18% ou 8-14% desólidos na mistura . (A biomassa pode conter alguns ácidos dependendo da fonte dabiomassa ou alguns ácidos podem ser adicionados tais como ácidos policarboxílicos, porexemplo, ácido cítrico, ácido oxálico, ácido maléico, ácido itacônico, ácido succínico oumisturas destes). Em algumas modalidades, adiciona-se água para obter-se entre cerca de9-13% de sólidos na mistura. A mistura é então colocada em um tanque de pré-cozimento epode ser agitada suavemente (baixo cisalhamento) bem como aquecida acima do ponto deebulição da água, por exemplo, cerca de 110°C ou algo em torno de cerca de 110 a cercade 200°C durante 10 minutos a cerca de 15 horas, ou 1-8 horas ou por várias horas tal comode cerca de 4 a cerca de 6 horas. Esta etapa é realizada para solubilizar os β-glicanos ,emoutras palavras, o material de partida glicanos na biomassa fúngica é insolúvel antes destetratamento e solúveis a cerca de 20 a 70% em peso após esta etapa de tratamento. Otempo, temperatura e teor de ácido cítrico do material de partida soa parâmetrosentrelaçados. Portanto, caso haja um teor maior de ácido cítrico, então o tempo e atemperatura podem ser ambos baixados e os β-glicanos ainda solubilizados. Numamodalidade preferida a mistura é aquecida e gentilmente agitada por 4-6 horas, quando omaterial de partida inclui cerca de 0,4% de ácido cítrico.

A mistura é a seguir resfriada para menos que 80°C. O produto é filtrado e emmodalidades preferidas ela é lavada para aumentar a recuperação dos glicanos solúveis ediminuir a carga de sacarídeos (para partes que irão ser empregadas para formar produtosde glicosamina e/ou N-acetilglicosamina. A separação é alternativamente realizada usandooutros métodos de separação tais como centrífuga de decantação, prensa de filtro, filtro avácuo, ou filtro de tambor giratório. O enxágüe é tipicamente um enxágüe aquoso.

O filtrado é a seguir concentrado usando, por exemplo, filtração com membrana(aumenta os sólidos e permite a seleção da faixa de peso molecular do produto). Outrosmétodos de concentração podem ser empregados, tais como evaporação térmica comvácuo, secagem com infravermelho, secagem a tambor, secagem por pulverização de cercade 2-10 DS a cerca de 40-50DS, onde DS é a percentagem total de sólidos secos nasolução.

O produto é a seguir precipitado usando etanol ( ou qualquer solvente miscível emágua, tal como isopropanol, n-propanol, acetona, ou acetonitrila. A relação de solvente paraágua pode variar desde cerca de 1:2 a cerca de 6:1, dependendo do solvente usado e afaixa de peso molecular desejada da composição de β-glicano. A mistura é deixada digerirpor 15 minutos a cerca de quatro horas a fim de aumentar o tamanho médio da partícula doprecipitado e reduzir a inclusão de impurezas. Existem tipicamente, impurezas presentestais como glicose, sais e outras impurezas da biomassa, de modo que, a concentração e aprecipitação deixa algumas dessas impurezas em solução, enquanto a composição de β-glicano desejada torna-se insolúvel. Em algumas modalidades, a precipitação édesnecessária caso a filtração com membrana seja utilizada, porque esta removeria asimpurezas. Assim, algumas modalidades após evaporação do material com filtração demembrana, podem ser evitadas, como a etapa de precipitação com etanol e o produtosimplesmente seco. A filtração com membrana pode ser utilizada para selecionar faixasdesejadas de peso molecular médio para os glicanos solúveis por seleção das membranasde tamanho de poro apropriado. Filtros de membrana são específicos em grande parte, porsua MWCO (faixa de peso molecular). Usando um filtro de membrana com uma MWCO de2000 remover-se-ia a maioria dos sais, monossacarídeos e pequenos oligômeros compesos moleculares de menos que cerca de 2000. Filtros de membrana com MWCO de, porexemplo, 5.000, 20.000 ou 100.000 podem ser empregados separadamente ou em sériepara dar composições de β-glicano de desejada faixas de peso moleculares e com a maioriadas impurezas removidas.

O produto é opcionalmente filtrado e enxaguado novamente como acima. O filtradoindesejável inclui tipicamente, etanol, água, glicose e outras impurezas tais como pequenosoligômeros, etc. que não se precipitaram quando se adicionou etanol (como se vê na Figura 12).

O produto é então seco por secagem instantânea, secagem a vácuo, liofilização,secagem com infravermelho, secagem com tambor duplo, secagem por pulverização eoutros métodos de secagem conhecidos aos de prática ordinária na técnica. Preferivelmente,a umidade é reduzida a cerca de 20% em peso ou menos.

Com referência à Figura 13, o produto pode ser descolorido por métodosdisponíveis aos de prática ordinária na técnica, por exemplo, tratamentos com resina, pelouso de carbono ativado, descoloração de resinas, ou outros métodos conhecidos paraclarear a composição de β-glicano. Os produtos para cosméticos ou consumo humanopodem preferir um maior grau de pureza, e menor grau de cor. O produto descolorido éentão seco usando secagem com bandeja, secagem instantânea, liofilização, secagem aVasco secagem por pulverização, secagem em leito fluidizado, ou outros métodosconhecidos. A secagem, é feita, preferivelmente a temperaturas inferiores a cerca de 95°Cou tais temperaturas poderiam ocasionar formação de cor, de modo a se evitar colorir oproduto já descolorido. Como se vê na Figura 13, opcionalmente um xarope pode ser obtidosem secagem do produto. O xarope é tipicamente de baixa viscosidade (por exemplo, 26centipoises). O xarope é uma solução aquosa de β-glicano com cerca de 10 a cerca de 50%de sólidos em peso a temperatura ambiente.

G. Exemplos

A invenção será melhor explicada pelos exemplos ilustrativos a seguir, nãolimitantes. A menos que, de outro modo indicado, todas as proporções são expressas comopartes em peso.

Exemplo 1A biomassa fúngica foi pré-tratada com uma solução aquosa de hidróxido de sódioa 4% numa autoclave a 120°C durante 1 hora. Esta etapa removeu o excesso de proteínas eoutros materiais indesejáveis. A biomassa foi a seguir cuidadosamente lavada com águadeionizada até seu pH ficar em aproximadamente 7,0. Este material lavado foi misturadocom ácido clorídrico concentrado (HCVI) e água formando uma mistura de 10 a 15% de HCIe 5-6% de biomassa, com base no peso seco da biomassa. Esta mistura foi aquecida aorefluxo. As amostras foram retiradas em tempos marcados e a reação analisada com umcromatograma líquido de alta pressão disponível de Dionex HPLC sob a indicação comercial"DX-500".

Os resultados são dados na Figura 4, que mostra um gráfico indicando a produçãode glicosamina, e mostra que, a glicosamina foi crescentemente produzida à medida que areação prosseguia durante 8 horas, porém a quantidade de glicose diminuiu após 4 horas.Após 8 horas a glicosamina produzida foi de 14%. Um cromatograma do produto é dado naFigura 5.

Seguinte a reação, a mistura foi filtrada, e o filtrado evaporado usando umevaporador rotativo manufaturado por RotaVap para aumentar a concentração deglicosamina da solução. O volume final ficou reduzido em 10 a 20 mL. Para esta soluçãoadicionou-se 20 mL de etanol e a solução turbilhonada para promover precipitação daglicosamina e intensificar o rendimento. Esses precipitados de glicosamina foram obtidospor filtração e foram ainda lavados com álcool até a coloração tornar-se branca. A figura 6mostra um cromatograma do produto, indicando mais de 97% de glicosamina nacomposição de glicosamina.

Exemplo 2

O Exemplo 1 foi repetido, porém a biomassa pré-tratada foi mantida sob condiçõesde refluxo por 13 horas. A composição de glicosamina resultante continha mais que 98% deglicosamina.

A descrição precedente detalhada e os exemplos foram dados por motivo deentendimento apenas. Nenhuma limitação desnecessária deve ser evidenciada destadescrição ou dos exemplos. A invenção não está limitada aos detalhes exatos mostrados edescritos, porque variações serão incluídas dentro da invenção indicada pelasreivindicações.

Exemplo 3

A biomassa filtrada (3900g) de um processo de produção de ácido cítrico foicombinada com 100 mL de ácido clorídrico concentrado e 4,5 L de água. A soluçãoresultante (0,5% de HCI, 7,8% de sólidos da biomassa) foi mantida a 90-100°C por 2 horas.

A mistura de reação (71,9g) foi filtrada e lavada com 5 partes de água a 60-70°C para umalavagem total de 400 mL. Os sólidos da biomassa lavada portanto, continham 3,9 g de'sólidos retirados de 71,9 g ou 5,4% de sólidos após tratamento com ácido brando, conformeacima. Quanto comparado com os 7,8% de sólidos iniciais antes do tratamento com ácidobrando, foi calculada uma redução de 31% nos sólidos da biomassa.

Para se estimar a quantidade do componente desejável da biomassa filtrada(quitina) sacrificada durante o tratamento com ácido brando foi realizado um tratamento comácido agressivo usando tanto biomassa pré-tratada e não previamente tratada para seproduzir cloridrato de glicosamina do seguinte modo:

A biomassa seca (pré-tratada ou não previamente tratada) (0,40 g) foi combinadacom 3,60 g de 22,5% de ácido clorídrico num pequeno tubo de ensaio. As soluçõesresultantes (20% de HCI, 10,0% de sólidos na biomassa), foram mantidos a 105°C por 2,5horas num bloco aquecido. A análise por HPLC Dionex das duas amostras hidrolisadas comácido permitiram a determinação e comparação do cloridrato de glicosamina percentual empeso. Especificamente, a quantidade da glicosamina livre foi determinada usandocromatografia de troca aniônica de alto desempenho com detecção amperimétrica pulsada(HPAEC-PAD). O sistema consistiu de um gerador de eluente EG40, bomba de gradienteGP50, auto-amostragem As40, forno de coluna LC25, e detector eletroquímico ED40, todosproduzidos pela Dionex Corporation, Sunnyvale, Califórnia,a USA. O método foi adaptadoda Dionex Corporation Technical Note 40, ora incorporado por referência. Uma colunaDionex CarboPac PA-20 foi usada ao invés de uma coluna PA-10. O eluente era KOH 8 mMa 0,5 mL/minutos. A coluna e o detector foram mantidos a 30°C. O volume da injeção foi 10μL. O padrão era cloridrato de glicosamina a 10,8 mg/L. As amostras foram diluídas comágua deionizada, ASTM Tipo II, e filtradas através de filtros de frasco de 0,2 μΐη numa auto-amostragem. Padrões múltiplos foram analisados antes e após de cada lote de amostra.

A amostra da biomassa não pré-tratada continha 2,1% de cloridrato de glicosamina.A quantidade teórica máxima de cloridrato de glicosamina disponível na biomassa pré-tratada ficou em 3,0% (presumindo-se que toda a redução de 31% nos sólidos da biomassanão seja quitina). A amostra da biomassa pré-tratada foi medida a 2,7% de cloridrato deglicosamina em peso. Assim, o pré-tratamento com ácido brando resultou numenriquecimento de quitina em 29% dos sólidos na biomassa, ainda assim, reduzindo aprodução de cloridrato de glicosamina da biomassa original em 10%.

Exemplo 4

Biomassa filtrada (3900 g) de um processo de produção de ácido cítrico foicombinada com 100 mL de ácido clorídrico concentrado e 4,5 L de água. A soluçãoresultante (0,5% de HCI1 7,8% de sólidos na biomassa) foi mantida a 90-100°C por 20 horas.A mistura de reação (95,2 g) foi filtrada e lavada com 5 partes de água a 54-70°C para umalavagem total de 320 mL. Os sólidos na biomassa lavados pesaram 26,9 g e verificou-seconterem 16,0% de sólidos com a secagem. Os sólidos na biomassa lavada portantocontinham 4,3 g de sólidos do total de 95,2 g ou 4,5% de 'sólidos após um tratamento comácido suave como descrito antes. Quando se compara com os 7,8% de sólidos antes dotratamento com ácido brando pode-se calcular uma redução de 42% nos sólidos dabiomassa.

Para calcular a proporção do componente desejável da biomassa filtrada (quitina)sacrificada durante o tratamento com ácido brando, realizou-se um tratamento com ácidoagressivo usando, tanto biomassa pré-tratada como biomassa sem tratamento prévio paraproduzir cloridrato de glicosamina do seguinte modo:

Biomassa seca (pré-tratada ou sem pré-tratamento) (0,40 g) foi combinada com3,60 g de 22,5 % de ácido clorídrico num pequeno tubo de ensaio. As soluções resultantes(20% de HCI, 10% de sólidos da biomassa) foram mantidos a 105°C por 2,5 horas numbloco aquecido. A análise HPLC Dionex (realizada conforme descrito no Exemplo 4) dasduas amostras hidrolisadas com ácido permitiu que a percentagem de cloridrato deglicosamina em peso fosse determinada e comparada. A amostra da biomassa não pré-tratada continha 2,1% de cloridrato de glicosamina. A quantidade teórica máxima decloridrato de glicosamina obtenível da biomassa pré-tratada é 3,6 % (presumindo-se quetoda a redução de 42% nos sólidos da biomassa não seja quitina). A amostra de biomassapré-tratada foi medida a 3,0% de cloridrato de glicosamina em peso. Assim, o pré-tratamento com ácido brando resultou num enriquecimento de quitina em 43% dos sólidosna biomassa ainda assim, reduzindo o rendimento de cloridrato de glicosamina da biomassaoriginal em 17%.

Exemplo 5

A biomassa filtrada (2000 g) de um processo de produção de ácido cítrico foicombinada com 3000 g de uma solução de ácido clorídrico a 7,5%. A solução resultante(4,5% de HCI, 6,0% de soldios na biomassa) foi mantida a 90-100°C por 2 horas. Uma parte(40,7 g) da mistura de reação foi transferida para um tubo centrífugo de 50 ml_. A amostrafoi centrifugada e o líquido decantado. Os sólidos restantes foram lavados a seguir cincovezes com partes de 25-30 mL da solução de NaOH (pH 13,1)., a seguir lavado quatrovezes com partes de 25 mL de solução de HCI (pH 1,3). Um ajuste final do pH a próximo doneutro rendeu o isolamento dos sólidos na biomassa lavada por decantação. Os sólidos nabiomassa pesaram 5,9 g e verificou-se conterem 14,2% de sólidos com a secagem. Ossólidos na biomassa lavada portanto, continham 0,84 g de sólidos no total de 40,7 g ou 2,1%de sólidos para o tratamento com ácido brando conforme descrito acima. Quanto secomparou aos 6,0% de sólidos iniciais antes do tratamento com ácido brando, foi calculadauma redução de 65% nos sólidos da biomassa.

Para calcular a quantidade do componente desejável da biomassa filtrada (quitina)sacrificada durante o tratamento com ácido brando foi realizado um tratamento com ácidoagressivo usando, tanto biomassa pré-tratada eximo biomassa sem prévio tratamento parase produzir cloridrato de glicosamina do seguinte modo:

Biomassa seca (pré-tratada ou sem tratamento prévio) (0,10 g) foi combinada com1,90 g de ácido clorídrico a 20,3% num pequeno tubo de ensaio. As soluções resultantes(19,3% HCI, 5,0% de 'soldios na biomassa) foram mantidos a 105°C por 4 horas num blocoaquecido. A análise HPLC Dionex (realizada conforme descrito acima) das duas amostrashidrolisadas com ácido permitiu que a percentagem de cloridrato de glicosamina em pesofosse determinada e comparada. A amostra da biomassa não pré-tratada continha 1,0% decloridrato de glicosamina. A quantidade teórica máxima de cloridrato de glicosaminaobtenível da biomassa pré-tratada é 2,9 % (presumindo-se que toda a redução de 65% nossólidos da biomassa não seja quitina). A amostra de biomassa pré-tratada foi medida a 2,1%de cloridrato de glicosamina em peso. Assim, o pré-tratamento com ácido brando resultounum enriquecimento de quitina em 110% dos sólidos na biomassa ainda assim, reduzindo orendimento de cloridrato de glicosamina da biomassa original em 28%.

Exemplo 6

A biomassa filtrada (3000 g) de um processo de produção de ácido cítrico foicombinada com 3000 g de uma solução de ácido clorídrico a 8,7%. A solução resultante(4,4% de HCI, 8,1% de sólidos na biomassa) foi mantida a 90-100°C por 45 minutos. Amistura de reação foi filtrada e lavada com água a 40-50°C até que o NaOH percentualrestante nos sólidos d biomassa lavada fosse menos que 0,06%. Os sólidos na biomassalavada pesaram 1479 g e viu-se conterem 22,9% de sólidos com a secagem. Os sólidos nabiomassa lavada portanto, continham 339 g de sólidos no total de 6000 g ou 5,7% desólidos após tratamento com ácido brando conforme descrito acima. Quanto se comparouaos 8,1% de sólidos iniciais antes do tratamento com ácido brando, calculou-se umaredução de 30% nos sólidos da biomassa.

Os sólidos na biomassa lavada obtidos do tratamento com base branda foram aseguir submetidos a um tratamento com ácido brando. Os sólidos na biomassa lavada (1310g) foram combinados com 3665 g de solução de ácido clorídrico a 5,5% e 25g de ácidoglacial acético. A solução resultante (4,0% de HCI, 0,5% ácido acético, 6,0% de sólidos nabiomassa) foi mantida a 90-100°C por 3,5 horas. Nesta ocasião, uma parte, 944 g da misturade reação foi filtrada e lavada com 1409 g de água em duas partes. Os sólidos na biomassalavada pesaram 298 g verificando-se conter 12,5% de 'sólidos com a secagem. Os sólidosna biomassa lavada portanto, continham 37,3 g de sólido s de 944 g ou 4,0% de sólidosapós tratamento com ácido brando. Quanto se comparou aos 6,0% de sólidos iniciais dotratamento com ácido brando, calculou-se uma redução em 33% nos sólidos da biomassa.

Uma redução geral de 53% nos sólidos da biomassa resultou do efeito combinado dotratamento com base banda seguido por um tratamento com ácido brando.Para se calcular a quantidade do componente desejável da biomassa filtrada(quitina ) sacrificada durante o tratamento com base branda e ácido brando, foi realizado umtratamento com ácido agressivo usando, tanto biomassa pré-tratada como não pré-tratadapara se produzir cloridrato de glicosamina do seguinte modo:

Biomassa seca (pré-tratada ou sem tratamento prévio) (0,10 g) foi combinada com1,90 g de ácido clorídrico a 22,8% num pequeno tubo de ensaio. As soluções resultantes(21,6% HCI, 5,1% de 'soldios na biomassa) foram mantidas a 105°C por 4 horas num blocoaquecido. A análise HPLC Dionex (realizada conforme descrito acima) das três amostrashidrolisadas com ácido permitiu que a percentagem de cloridrato de glicosamina em pesofosse determinada e comparada. A amostra da biomassa não pré-tratada continha 0,92% decloridrato de glicosamina. A quantidade teórica máxima de cloridrato de glicosaminaobtenível da biomassa pré-tratada com base suave foi 1,3 % (presumindo-se que toda aredução de 30% de sólidos da biomassa não seja quitina). A amostra de biomassa pré-tratada com base branda foi medida a 1,3% de cloridrato de glicosamina em peso. Assim, opré-tratamento com base branda resultou num enriquecimento de quitina em 41% dossólidos na biomassa sem reduzir o rendimento de cloridrato de glicosamina da biomassaoriginal. A quantidade máxima teórica de cloridrato de glicosamina obtenível da biomassapré-tratada com ácido brando foi de 2,0% (presumindo que a redução geral de 54% nossólidos da biomassa não seja quitina). A amostra e biomassa pré-tratada com ácido brandofoi medida em 1,5% de cloridrato de glicosamina em peso. Assim, o pré-tratamento comácido brando seguinte ao pré-tratamento com base branda resultou num enriquecimento dequitina de 63% dos sólidos na biomassa original, ainda assim, reduzindo o rendimento decloridrato de glicosamina da biomassa original em 25%.

Exemplo 7

Uma amostra de biomassa de um processo de fermentação de ácido cítrico foicombinada com HCI para formar uma pasta aquosa de 13% de HCI e 10,5% de sólidos nabiomassa. A lama foi colocada num reator vedado e elevada a 113°C por 10 horas.Amostras da composição resultante foram retirada a intervalos de uma hora e analisadasquanto ao teor de glicosamina. Esses resultados foram a seguir convertidos a uma produçãocom base na quantidade teórica de quitina na biomassa.

Este procedimento repetiu-se usando lamas de 11% e 9% de HCI, com sólidos nabiomassa de 12%. Os resultados são mostrados na Tabela 11.

Tabela 11

<table>table see original document page 47</column></row><table><table>table see original document page 48</column></row><table>

Exemplo 8

Biomassa de fermentação com ácido cítrico (A niger) foi misturada com ácidoclorídrico (Grau de regente JT Bakers a 37%) e colocada numa bomba de digestão demicroondas em pequena escala vedada, disponível de Alltech. Amostras preparadas foramcolocadas num forno de laboratório a vácuo, sem aplicação de vácuo. O forno era capaz demanter uma temperatura de 160°C. As amostras foram preparadas e tratadas sob condicoesdescritas na Tabela 12 a seguir.

As amostra foram diluídas com água nano-pura até uma faixa de concentração dafaixa padrão (<10 mg/L de glicosamina) usando um sistema de HPLC Dionex (realizando asanálises conforme descrito acima). De modo específico duas diluições foram realizadas auma diluição de 1:50, seguido por uma diluição de 1:6. As amostras diluídas foram filtradasatravés de um filtro de 0,45 μΐη e analisadas quanto a concentrações de glicose eglicosamina usando um sistema HPIC Dionex.

Os resultados são dados na Tabela 12 a seguir. Devido a cada teste ter (nomáximo) quatro pontos de amostra, foram registrados os maiores resultados de glicosaminapara cada teste. Os resultados da amostra não foram corrigidos por quaisquer perdas porevaporação na amostra durante a reação.

Tabela 12

<table>table see original document page 48</column></row><table><table>table see original document page 49</column></row><table>

* Rendimentos percentuais de glicosamina com base em 24% de quitina teórica nabiomassa seca, Rendimentos de glicosamina não foram ajustados para perdas porevaporação. A perda por evaporação é dada para uma indicação de uma origem de erro noteste de topo da bancada.

Os resultados dessas modalidades das composições de glicosamina como se vênos Exemplos 8 e 9 indicam que, usando os métodos apresentados para temperatura e/oupressão aumentados para produção das mesmas, indicam que, quantidadessignificativamente menores ou concentrações de ácido clorídrico soa necessários paraproduzir rendimentos significativos das composição de glicosamina.

Para todos os pontos na amostra selecionados para a Tabela 12 as concentraçõesde glicose estavam próximas de zero.

Exemplo 9

Uma série de modalidades de suplementos alimentícios incorporando modalidadesparticulares das composições de glicosamina está dada na Tabela 13 a seguir (a mesmaabordagem básica pode ser utilizada para a N-acetilglicosamina revelada e/ou ascomposições de glicanos solúveis e estes podem ser adicionados sozinhos ou além daglicosamina). Os suplementos alimentícios nesses exemplos particulares estão na forma decomprimido, cápsula, goma mastigável, líquido ou barra alimentício, porém poderiam estarem qualquer forma física adequada de suplemento alimentício.

Tabela 13

<table>table see original document page 49</column></row><table><table>table see original document page 50</column></row><table>

Exemplo 10

Modalidade do Processo para Produção de N-acetilglicosamina Usando Pré-tratamento com Ácido Brando e Conversão Enzimática em N-acetilglicosamina

Uma amostra de 121,5 g da biomassa fúngica contendo ácido cítrico e 78m5 g deágua foram misturados num reator de pressão. A mistura com 12,0% de teor de sólidos e0,6% de ácido cítrico, foi aquecida a 150°C sob agitação branda. Após 4 horas, a reação foiresfriada para temperatura ambiente. A mistura de reação foi filtrada por um tecido de filtroseguido por lavagem com água. Uma parte de 63% dos sólidos na biomassa foi removida nafração solúvel. A biomassa sólida residual e os glicanos solúveis no filtrado foramsubmetidos a tratamento posterior.

A biomassa sólida residual foi tratada enzimaticamente para converter a quitina emN-acetilglicosamina. De modo específico, 4,00 g da biomassa pré-cozida com ácido brandoúmido (equivalente a 0,8 g de peso seco) foram pesados em cada um dos quatro tubos detampa de rosca de 50 mL. Tampão de acetato de pH 4,5, pH 5,5, pH 6,5 ou pH 7,5 foiadicionado para separar os tubos trazendo o volume de cada tubo a 25,0 mL. O pH de cadatubo foi ajustado para ajustar-se àquele do tampão de partida. Uma alíquota de 6 mL decada suspensão de biomassa foi distribuída em 3 tubos separados de tampa de rosca de 15mL. A quitinase foi suspensa em 0,0030 g/ml em cada um dos 4 diferentes tampões de pH.Tratamentos com apenas quitinase receberam 2 mL da suspensão de pH apropriado. Ostratamentos em que se combinou a quitinase com celulase receberam 0,5 mL de suspensãode quitinase e celulase adicionada a 0,5 mL por tratamento para aquelas amostra quereceberam apenas celulase, e a 0,375 L para aquelas amostras que também receberamquitinase. A celulase pode ser obtida de Genencor International (Rochester, NY) - GC880Cellulase ou de Dyadic International, Inc. (Júpiter, FL) - Celulase Fúngica Neutra. Os tubosforam incubados a 50°C por 16 horas. As amostras foram analisadas quanto ao teor de NAGe glicose por HPLC. Os tratamentos rotulados de KC contém celulase. Os tratamentosrotulados de Ch contém quitinase.

Tabela 14

<table>table see original document page 51</column></row><table><table>table see original document page 52</column></row><table>

Esses resultados demonstram que, o pH eficaz da enzima é amplo porém aomesmo tempo, a atividade enzimática é uma função do pH. Como se pode entender daprática comum na técnica, a partir desses exemplos, m sob determinadas condições de pH,a combinação de quitinase e celulase propicia concentrações substancialmente maiores deNAG se comparado a quaisquer enzimas propriamente. Com as modalidades de mistura deenzima a concentração de quitinase na mistura pode ser reduzida, enquanto ainda retendoaltos níveis de degradação de quitina (ou seja, geração de NAG). Essas modalidades dosmétodos apresentados de produção de NAG são muito úteis porque a enzima quitinase émuito cara, e combinações de enzima auxiliar mais quitinase de concentração reduzidapropicia uma alternativa econômica mais favorável para apenas quitinase. Parece que, acelulase sozinha foi capaz de gerar modestas concentrações de NAG, sugerindo que, ou acelulase possui atividade limitada de quitinase não específica, ou que os microorganismosusados para produzir a celulase também produziram algum nível de quitinase. Exemplosnão Iimitantes de outras enzimas que propiciam uma função auxiliar são glicanases,laminarase, amilases, glicoamilases e outras.

Uma amostras foi tratada para remover a glicose por tratamento pós-hidrólise deglicose oxidase. Esta modalidade utilizou uma suspensão de NAG/glicose gerada dabiomassa tratada pelo pré-tratamento com ácido brando usando tratamento enzimático comquitinase e celulase. Análise de HPLC da amostra indicou concentrações de 8,7 g/L de NAGe 6,3 g/L de glicose. Uma alíquota de 50 mL da solução de NAG-glicose teve o pH ajustadoem 5,25 com H2SO4 1N. Uma alíquota de 10 mL foi adicionada para cada um dos 4 tuboscom tampa de rosca de 15 mL. Tubos individuais foram dosados com 0,4 μΙ (dose A), 40 μΙ(dose B), e 200 μί (dose C) de glicose oxidase (Genencor OxyGO 1500). Os tubos foramcolocados num banho de água a 50°C. Após, 2, 4, e 8 horas, 1,0 mL da amostra foiremovida e analisada por HPLC para NAg, glicose e teor de ácido glucônico, usandodetectores Rl e UV.

Tabela 15

<table>table see original document page 52</column></row><table><table>table see original document page 53</column></row><table>

Tabela 16

<table>table see original document page 53</column></row><table>

Esses dados demonstram que, a glicose oxidase é capaz de converter mais de95% da glicose na solução de NAG/glicose em ácido glucônico. O esvaziamento de glicoseé acompanhado por um aumento na concentração de ácido glucônico. A perda de NAGdurante as 22 horas de reação é de aproximadamente 1%, tanto nos tratamentos decontrole como na Dose C. Portanto, nenhuma perda de NAG é atribuída à atividade aglicose oxidase.

A seguir a N-acetilglicosamina é separada dos sais e gluconatos e outroscomponentes usando resina de troca catiônica Purolite PCR-822. A separação foimonitorada por coleta das frações eluindo da coluna, a seguir analisando as frações porHPLC.

Tabela 17

Caldo tratado com Glicose oxidase; Purga de N2 da fase móvel, Resina Purolitecom base em Gluconato e NAG com base apenas em Gluconato, Acetato, Citrato e NAG

<table>table see original document page 53</column></row><table><table>table see original document page 54</column></row><table>

A parte da Tabela 17 à esquerda ilustra o grau de separação de NAG do gluconato.Caso as frações 9-14 sejam coletadas e o resto das frações descartadas, 88,7% do NAGtotal é recuperado com quase 95% de pureza. Caso seja usado tampão de acetato paracontrole do pH durante o processo enzimático, então alguma impureza de acetato seráincorporada ao produto, como se vê à direita da tabela, diminuindo a pureza de NAG emcerca de 90% com cerca de 81% de recuperação. As mesmas resinas ou similares foramincapazes de separar NAG da glicose, porque elas são ambas moléculas neutras.

Exemplo 11

Modalidade do Processo para Conversão Simultânea de Quitina em N-acetilglicosamina e Glicose em Gluconato

A biomassa foi tratada com o pré-tratamento de ácido brando descrito no Exemplo10 (etapas A e A2 na Figura 9). A biomassa pré-tratada foi a seguir enzimaticamente tratadapara produzir N-acetilglicosamina e gluconato. As reações foram feitas por suspensão de1,0 g da biomassa pré-tratada (0,2 g em peso seco) em tampão de acetato ou citrato 50 mMaté um volume de 6,0 mL em tubos de tampa rosqueada de 15 mL. Para cada tuboadicionou-se 2,0 mL de quitinase (0,0030 g/mL) dissolvido em tampão similar aostratamentos para os quais ele foi adicionado. Os tubos foram incubados a 50°C por 22 horas.

Os tratamentos 1 a 3 foram tratados com quitinase apenas por 22 horas, após o que,adicionou-se glicose oxidase e os tubos foram incubados por um período adicional de 2horas. Os tratamentos 4 e 5 receberam tanto quitinase como glicose oxidase (160 μL deGenencor OxyGO 1500) simultaneamente. As amostras foram analisadas a 2, 4, 7 e 22horas para o sobrenadante para NAG, glicose e ácido glucônico (GA) por HPLC.

Tabela 18

<table>table see original document page 54</column></row><table><table>table see original document page 55</column></row><table>

Parece que a quitinase tem atividade ligeiramente aumentada em tampão de citratoa pH 6,0 do que em tampão de acetato. De modo inverso, glicose oxidase teve atividadeligeiramente mais alta em tampão de acetato a pH 6,0 do que em tampão de citrato. Nostratamentos 4 e 5, demonstrou-se que, reações de quitinase e glicose podem ocorrersimultaneamente. A quantidade de ácido glucônico gerado após 22 horas nas reaçõessimultâneas foi igual àquela obtida nos tratamentos 1, 2 e 3, onde a glicose oxidase foiadicionada independentemente após ter ocorrido a reação de quitinase. Portanto, otratamento com glicose oxidase pode ser feito separadamente ou em combinação comquitinase.

A solução resultante foi a seguir tratada de modo igual à separação da resina noExemplo 10.

Exemplo 12

Modalidade do Processo Apresentado para Preparação de Glicosamina a partir daProdução Enzimática de N-acetilglicosamina

A N-acetilglicosamina do Exemplo 10 (etapa B Figura 9), foi tratada a 95°C em HCIa 3% e 6% pelos períodos de tempo indicados na tabela a seguir para produzir cloridrato deglicosamina. Os dados demonstram que HCI a 6% desempenho ligeiramente melhor do queHCVI a 3% sob as mesmas condições.O nível mais baixo de ácido pode ser empregado com,ou temperaturas mais altas ou tempos de reação mais longos. Sob essas condiçõesbrandas, muito pouco da glicose reagiu. O ácido acético é formado pela hidrólise.

Tabela 19

<table>table see original document page 55</column></row><table>Após quatro horas, cerca de 90% de NAG foi convertido, enquanto 100% foiconvertido entre três e quatro horas. A glicose ficou virtualmente inalterada dentro do erroanalítico.

Exemplo 13

Modalidade do Processo Apresentado Usando um Pré-tratamento com Ácido

Brando Seguido por Digestão com Ácido Agressivo para Produção de Glicosamina

Primeiramente, 120,1 g de biomassa fúngica úmida contendo ácido cítrico e 80,0 gde água foram misturados num reator de pressão. A mistura constava de 12,7% de sólidossecos e 0,31% de ácido cítrico e foi aquecida a 150°C sob agitação branda. Após 4 horas areação foi resfriada para temperatura ambiente. A mistura de reação foi filtrada por umtecido de filtro seguido por lavagem com água. Uma parte compreendendo 55,2% de sólidosna biomassa foi removida.

A seguir, 9,77 g da biomassa pré-cozida úmida e 8,25 g de HCI a 37% forammisturados num reator de pressão. A mistura contendo 13,3% de teor de sólidos e 16,9% deHCI foi aquecida a 100°C com agitação. Após 8 horas, a reação foi resfriada paratemperatura ambiente. A mistura de reação foi filtrada por um pano de filtro seguido porlavagem com água. Dados cromatográficos mostraram o rendimento de glicosamina em38,8% com base na biomassa pré-cozida e o rendimento total de glicosamina foi 18,5% combase no material de biomassa de partida original.

Exemplo 14

Uma modalidade das composições de β-glicano foi produzida utilizando 101,7 g dabiomassa fúngica contendo ácido cítrico e 98,3 g de água misturados num reator de pressão.A mistura com 12,0% de teor de sólidos e 0,144% de ácido cítrico foi aquecida a 150°C sobagitação branda. Após 7 horas, a reação foi resfriada para temperatura ambiente. A misturade reação foi filtrada em um pano de filtro seguido por lavagem com água. Com a análisedos sólidos remanescentes após esta etapa, determinou-se que 46,5% dos sólidos nomaterial de biomassa de partida foi hidrolisado. A distribuição de peso molecular foi medidapor SEC (cromatografía por exclusão de tamanho) usando um detector de índice refrativo(RID). Um RID mede a massa dos materiais comparáveis que fluem através de céluladetetora, tal como polissacarídeos. Uma produção em % de área indica a percentagem dospolissacarídeos totais medidos eluindo a tempos relativos aos padrões de pululam usadospara calibrar o instrumento. Aproximadamente 76% da massa de β-glicano teve pesosmoleculares entre 1.000 e 1.000.000. A quebra do peso molecular foi como a seguir:

Tabela 20

<table>table see original document page 56</column></row><table><table>table see original document page 57</column></row><table>

% Area = percentagem dos β-glicanos solúveis eluindo em suas respectivas faixasde peso molecular comparado aos padrões conhecidos.

Exemplo 15

Uma modalidade das composições de β-glicano fúngico solúveis apresentadas foiproduzida utilizando 75,6 g da biomassa fúngica contendo ácido cítrico e 74,9 g de águamisturando-se num reator de pressão. A mistura com 11,9% de teor de sólidos e 0,16% deácido cítrico foi aquecida a 150°C sob agitação branda. Após 5 horas a reação foi resfriadapara temperatura ambiente. A mistura de reação foi filtrada por um pano de filtro seguido porlavagem com água. Com a análise da solubilidade da composição de β-glicano rfesultante,determinou-se que, 40,1% dos sólidos no material de biomassa de partida foi hidrolisado. Opeso molecular ponderai médio dos β-glicanos solúveis ficou em 232.500.

Exemplo 16

O glicano fúngico 1 descrito no teste de pureza foi preparado por aquecimento de32 quilogramas de biomassa fúngica a 12% em peso de sólidos durante 5 horas a 136°C. Aconcentração de ácido cítrico era 0,22% em peso. O glicano fúngico 1 teve um pesomolecular médio de cerca de 35.000.

O glicano fúngico 2 descrito no teste de pureza foi preparado por aquecimento de170 quilogramas da biomassa fúngica a 12% em peso de sólidos por quatro horas a 132°C.A concentração de ácido cítrico ficou em 0,6% em peso. O glicano fúngico 2 tinha um pesomolecular médio de cerca de 450.0000.

Embora os métodos e composições aqui apresentados possam ser modificados,especificidades dos mesmos foram demonstrados à guisa de exemplo, sendo descritas emdetalhe. Deve ficar entendido, contudo, que as modalidades específicas apresentadas edescritas não devem ser interpretadas como Iimitantes da invenção reivindicada.

Claims (14)

1. Método CARACTERIZADO por compreender:a) proporcionar uma fonte de biomassa fúngica contendo quitina tendo células comparedes celulares dotadas de glicanos, proteínas e/ou polissacarídeos,b) realizar um primeiro tratamento enzimático para romper, pelo menosparcialmente, as paredes celulares da biomassa fúngica e converter pelo menos uma partedos glicanos em formas solúveis, sem converter uma quantidade substancial de quitina emN-acetilglicosamina; ec) realizar um segundo tratamento enzimático convertendo a quitina na biomassafúngica em N-acetilglicosamina.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato darealização do segundo tratamento enzimático produzir uma mistura de N-acetilglicosamina eglicose e a N-acetilglicosamina é a seguir separada da glicose.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato darealização do segundo tratamento enzimático produzir uma mistura de N-acetilglicosamina eglicose e a realização de um terceiro tratamento enzimático na mistura para converter umaparte substancial da glicose em uma forma iônica.

4. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO por compreenderainda antes da etapa (c) a separação de pelo menos uma parte dos glicanos da biomassafúngica para produzir uma fonte de biomassa fúngica semi-purificada contendo quitina erealizar o segundo tratamento enzimático na fonte de biomassa fúngica semi-purificada.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por compreenderainda o pré-tratamento da biomassa fúngica com cerca de 0,05% a cerca de 20% p/p deHCI, ácido mineral e/ou ácido orgânico para romper, pelo menos parcialmente, as paredescelulares da biomassa fúngica sem converter uma quantidade substancial de quitina emformas solúveis, antes ou depois de realizar o primeiro pré-tratamento enzimático.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por compreenderainda a desacetilação da N-acetilglicosamina para produzir glicosamina.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato dosglicanos solúveis serem isolados para formar uma composição compreendendo pelo menoscerca de 50% em peso de β-glicanos solúveis.

8. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO por compreenderainda a desacetilação de N-acetilglicosamina para produzir glicosamina.

9. Método, CARACTERIZADO por compreender:(a) proporcionar uma fonte de biomassa fúngica contendo quitina dotada de célulascom paredes celulares dotadas de glicanos, proteínas lipídios e polissacarídeos em seuinterior;(b) pré-tratamento da biomassa fúngica (i) com menos que cerca de 1% p/p deácido orgânico selecionado do grupo consistindo de ácido cítrico, ácido oxálico, málico,maléico, itacônico, succínico, e misturas de dois ou mais dos ácidos orgânicos ou (ii) commenos que cerca de 10% p/p de hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou misturasdestes ou (iii) com emprego de agitação mecânica ou (iv) com um primeiro tratamentoenzimático para romper, pelo menos parcialmente, as paredes celulares da biomassafúngica sem converter uma quantidade substancial de quitina em uma forma solúvel,glicosamina ou N-acetilglicosamina,(c) separar pelo menos uma parte dos glicanos, proteínas e lipídios da biomassafúngica, para produzir uma fonte semi-purificada contendo quitina da biomassa fúngica, e(d) realizar um tratamento enzimático na fonte semi-purificada da biomassa fúngica,convertendo a quitina na biomassa fúngica, em N-acetilglicosamina.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO por compreenderainda o tratamento enzimático da biomassa fúngica pré-tratada para converter pelo menosuma parte dos glicanos na forma solúvel, sem converter uma quantidade substancial dequitina em N-acetilglicosamina.

11. Método, CARACTERIZADO por compreender:(a) proporcionar uma fonte de biomassa fúngica contendo quitina tendo células comparedes celulares dotadas de glicanos, proteínas e polissacarídeos,b) realizar um pré-tratamento da biomassa fúngica para romper, pelo menosparcialmente, as paredes celulares da biomassa fúngica ou para converter pelo menos umaparte dos glicanos à forma solúvel, sem converter uma proporção substancial de quitina emglicosamina e/ou N-acetilglicosamina;(c) separar pelo menos uma parte dos glicanos, proteínas e/ou polissacarídeos dabiomassa fúngica, para produzir uma fonte semi-purificada contendo quitina da biomassafúngica,(d) realizar um tratamento enzimático na fonte semi-purificada da biomassa fúngicaconvertendo a quitina na biomassa fúngica, em N-acetilglicosamina, e(e) desacetilar a N-acetilglicosamina para produzir glicosamina.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelos glicanosseparados serem isolados para formar uma composição de β-glicano solúvelcompreendendo pelo menos cerca de 50% em peso de β-glicano solúvel.

13. Método, CARACTERIZADO por compreender:(a) providenciar uma fonte de biomassa fúngica contendo quitina dotadas de célulascom paredes celulares tendo glicanos, proteínas e polissacarídeos;(b) realizar um primeiro tratamento enzimático para converter pelo menos umaparte dos glicanos à forma solúvel, sem converter uma quantidade substancial de quitinanas formas hidrossolúveis de quitina;(c) realizar um segundo tratamento enzimático convertendo a quitina na biomassafúngica, em N-acetilglicosamina para produzir uma mistura compreendendo N-acetilglicosamina e glicose; e(d) tratar a mistura para converter a glicose em uma forma iônica.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato daglicose ser convertida na forma iônica usando um tratamento enzimático.