JP6384351B2

JP6384351B2 - アミノ酸配列分析装置

Info

Publication number: JP6384351B2
Application number: JP2015024094A
Authority: JP
Inventors: 伸幸秋永; 松本　博幸; 博幸松本; 竜此下; 徹江連
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 2015-02-10
Filing date: 2015-02-10
Publication date: 2018-09-05
Anticipated expiration: 2035-02-10
Also published as: JP2016148530A

Description

本発明は、エドマン反応を用いてＮ末端から試料アミノ酸を逐次切断して液体クロマトグラフィなどの分析機器で分析することにより、タンパク質やペプチドのアミノ酸配列の分析を行うアミノ酸配列分析装置に関し、さらに詳しくは、試料を収容してエドマン分解反応を生じさせるための反応槽を複数個備え、これらの各反応槽内の試料の分析を順次自動的に行う機能を備えたアミノ酸配列分析装置に関する。

エドマン反応を用いたアミノ酸配列分析装置においては、一般に、タンパク質やペプチドの試料を収容した反応槽（リアクタ）内に各種試薬を順次供給することにより、カップリング反応、切断反応からなるエドマン分解反応を生起させ、Ｎ末端のペプチド結合を切断してＡＴＺアミノ酸を生成し、遊離したＡＴＺアミノ酸をコンバージョンフラスコなどの転換槽（コンバータ）内に抽出した後、試薬を用いて安定したＰＴＨアミノ酸へ転換する。そして、そのＰＴＨアミノ酸をＨＰＬＣなどの分析部に導入して分離および検出することでアミノ酸の同定や定量を行う。この動作を逐次繰り返し行うことで、試料のアミノ酸の配列情報を得る。

反応槽や転換槽内への各種試薬の供給は、各試薬を収容した試薬容器内に窒素ガスなどの不活性ガスを所定の圧力で注入することによって容器内の試薬を試薬供給管内に圧送し、その試薬供給管上に設けた電磁弁を介して反応槽や転換槽に導入する構成が一般に用いられている（例えば特許文献１，２参照）。

このようなアミノ酸配列分析装置では、一つの試料について多数のアミノ酸を切断して分析する必要があることから、分析を完了するまでの所要時間が長時間に及ぶ。そのため、従来から、反応槽を複数個用いて分析の効率化並びに省力化を実現する方法が提案・実用化されている（例えば特許文献３参照）。

複数個の反応槽を用いる手法のうち、複数の反応槽内の試料に対して順次エドマン反応を生起させていく手法、つまり複数の反応槽内にそれぞれ試料を収容し、一つの反応槽内の試料のアミノ酸配列の分析を終了後、次の反応槽内の試料の分析に自動的に移行する手法であれば、例えば休日中にも自動的に分析が実行されるなど、分析の効率化や省力化の点で有益であり、実用に供されている。

この手法を用いた装置では、試薬容器内に不活性ガスを導入することにより試薬供給管から送られてくる試薬を、各反応槽のうち分析に供される一つの反応槽に向けて選択的に導入する構成が採られる。具体的には、共通の試薬供給管上に各反応槽に対応した電磁弁を設け、その電磁弁の作動により一つの反応槽内にのみ試薬を供給してエドマン反応を生起させる構成が採られている。

実開平６−１２９６３号公報実用新案登録第３１８８１６３号公報特開平９−６８５３４号公報

ところで、この種の分析装置においては、エドマン反応の試薬のうちの一つに、強酸であるＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を用いるため、使用する電磁弁のダイヤフラムなどの接合部にはＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）を用いる必要がある。ここで、ＰＴＦＥは多数の微孔が存在するポーラス構造であるため、待機中の試料を収容している反応槽内に意図せずに試薬が入り込み、試料のペプチド結合を無作為に切断してしまう可能性がある。

すなわち、上記したように一つの試料の分析に長時間を要するため、分析待ちの試料は必然的に長時間の待機状態を維持する必要があり、待機中の試料を収容する反応槽は電磁弁によって試薬の侵入が阻止された状態となっているものの、時間の経過とともに接合部のＰＴＦＥを介して各種の試薬が僅かずつではあるが徐々に反応槽内へと拡散する。この拡散した試薬が、反応槽内で待機中の試料に作用し、その試料のペプチド結合を無作為に切断してしまう可能性がある。このことは、待機状態を経た試料についての分析結果に誤りを含む原因となる。

本発明はこのような実情に鑑みてなされたもので、複数の反応槽を設けてその各反応槽内の試料を順番に分析に供するようにしたアミノ酸配列分析装置において、一つの反応槽を用いて単発の分析を行う場合と同等の安定性のもとに複数の試料についての分析を行うことのできる分析装置の提供をその課題としている。

また、本発明の他の課題は、上記の課題を解決するにあたり、装置構成の大幅な改造が不要であって、コストを抑えて実現することのできるアミノ酸配列分析装置を提供することにある。

上記の課題を解決するため、本発明のアミノ酸配列分析装置は、タンパク質もしくはペプチドの試料を収容した反応槽内に試薬を供給してエドマン反応を生起させ、試料のＮ末端のアミノ酸を逐次切断して分析部に導入することにより、試料のアミノ酸配列情報を得るアミノ酸配列分析装置において、上記反応槽を複数個備え、その各反応槽には、試薬容器に連通する試薬供給管からの試薬が電磁弁を介して選択的に供給され、一つの反応槽内の試料の分析動作を終了した後、次の反応槽内の試料の分析動作に移行すべく上記電磁弁を自動的に作動させて試薬の供給先を変更するように構成されているとともに、一つの反応槽内の試料の分析動作中に、分析待ちの試料を収容する反応槽内に定期的にパージガスが導入されるように構成されていることによって特徴づけられる。

ここで、本発明においては、試薬容器内の試薬を、当該試薬容器内に不活性ガス源からの不活性ガスを導入することによって試薬供給管内に導くようにした構成を採る場合、分析待ちの試料を収容する反応槽内へのパージガスは、上記不活性ガス源からの不活性ガスを用い、当該不活性ガス源から上記試薬容器を経ず直接的に上記試薬供給管を介して導入するように構成することができる。

また、本発明において、分析待ちの試料を収容する反応槽内へのパージガス導入のタイミングは、分析中の試料の一つのＮ末端アミノ酸の分離、検出を終了したタイミングとすることができる。

本発明の構成によると、待機中の試料を収容している反応槽内が、所定のタイミングでパージガスにより置換されて試薬がパージされるので、待機中の試料への影響をなくすことができる。

そして、不活性ガスを所定の圧力で試薬容器内に導入してその内部の試薬を試薬供給管に導いて各反応槽内に供給する構成を有する分析装置にあっては、その不活性ガスをパージガスとして、試薬供給管を通じて直接待機中の試料を収容する反応槽内に導入する構成を採用することにより、装置構成を変更することなく電磁弁の動作手順の変更のみで課題を解決することができる。

待機中の試料を収容する反応槽内へのパージガス導入のタイミングについては特に限定されるものではないが、分析中の試料について、一つのアミノ酸の分離、検出を終了するごとに行うことが、特に試薬供給管への試薬の導入において不活性ガスをパージガスとして用いる上記の構成の採用との組み合わせに際し、各電磁弁の動作手順を簡素化する上で有用である。

本発明によれば、複数の反応槽を設けてその各反応槽内の試料を順番に分析するようにしたアミノ酸配列分析装置において、分析待ちの試料を収容する反応槽内に、意図せず試薬が電磁弁のＰＴＦＥ製ダイヤフラムなどを介して侵入しても、その内部に所定のタイミングでパージガスが導入されて試薬が反応槽外に排除されるので、分析待ちの試料に対する影響をなくすことができ、一つの反応槽を用いて単発の分析を行う場合と同等の安定性のもとに複数の試料についてのアミノ酸配列分析が可能となる。

また、試薬容器内に不活性ガスを導入することにより、試薬供給管を介して試薬容器内部の試薬を各反応槽内に供給する構成を採用する場合、不活性ガスをパージガスとして用い、試薬供給管を介して各反応槽内に導くようにすることで、装置構成を変更することなく上記の作用効果を実現することができ、実質的にコストアップを伴うことなく課題を解決することができる。

本発明の実施形態における要部配管図。本発明の実施形態における分析工程を示すフローチャート。

以下、図面を参照しつつ本発明の好適な実施の形態について説明する。
図１は本発明の実施の形態における要部配管図である。この例では、３個の反応槽（リアクタ）１ａ，１ｂ，１ｃを備え、これらの各反応槽１ａ，１ｂ，１ｃそれぞれに試料が収容される。また、分析に際し、一つの反応槽内の試料の分析実行中は他の反応槽内の試料を分析待ち状態とし、一つの試料のアミノ酸配列分析を完了後、自動的に次の反応槽内の試料の分析に移行するように設定されている。

装置は、各反応槽１ａ，１ｂ，１ｃに対して択一的に試薬を供給するための第一試薬供給装置２と、反応槽１ａ，１ｂ，１ｃ内で切断されたＡＴＺアミノ酸が移送される転換槽（コンバージョンフラスコ）３と、転換槽３内に試薬を供給するための第二試料供給装置４と、転換槽３内で転換されたＰＴＨアミノ酸を分析するＰＴＨアミノ酸分析装置５を備えている。

第一試薬供給装置２は、酢酸エチルの試薬容器２１と、塩化ｎ−ブチルの試薬容器２２、トリメチルアミンの試薬容器２３、ＰＩＴＣのｎ−ヘプタン溶液の試薬容器２４、およびトリフルオロ酢酸の試薬容器２５を備えている。これらの各試薬容器２１〜２５には、それぞれガス供給管２６を介して、窒素ガス源２７から所定の圧力の窒素ガスが各試薬容器２１〜２５に対応して設けられた電磁開閉弁２６１〜２６５を開くことによって導入される。また、各試薬容器２１〜２５にはそれぞれ電磁開閉弁２８１〜２８５を備えたドレイン管２８が連通している。

さらに、各試薬容器２１〜２５には、それぞれ試薬供給管２９１〜２９５が連通しており、これらの各試薬供給管２９１〜２９５は、それぞれに対応する電磁三方弁２１１〜２５１を介して共通の試薬供給管２９に連通している。また、電磁三方弁２１１と窒素ガス源２７との間には電磁開閉弁２６０が設けられている。

そして、共通の試薬供給管２９は、電磁三方弁２９ａ，２９ｂ，２９ｃを介して反応槽１ａ，１ｂ，１ｃに連通している。また、電磁三方弁２９ａ，２９ｂ，２９ｃの下流側には電磁開閉弁２９０が設けられている。

以上の構成により、反応槽１ａ，１ｂ，１ｃのうちの任意のものに、試薬容器２１〜２５から任意の試薬を供給することができる。例えば、試薬容器２１内の酢酸エチルを反応槽１ａ内に導入する場合、電磁開閉弁２６１を開いて電磁開閉弁２８１を閉じることによって試薬容器２１内を加圧し、その内部の酢酸エチルを試薬供給管２９１内へ導くとともに、電磁三方弁２１１のみを図中直角方向に連通させ、他の電磁三方弁２２１，２３１，２４１，２５１は図中水平方向に連通させるようにセットすることによって共通の試薬供給管２９へと酢酸エチルを導き、電磁三方弁２９ａ，２９ｂ，２９ｃのうち、電磁三方弁２９ａのみを図中直角方向に連通させることによって、酢酸エチルを反応槽１ａ内にのみ供給することができる。

各反応槽１ａ，１ｂ，１ｃの底部には、それぞれ試料移動管１１ａ，１１ｂ，１１ｃが接続されており、これらの各試料移動管１１ａ，１１ｂ，１１ｃはそれぞれ電磁三方弁１２ａ，１２ｂ，１２ｃおよび電磁三方弁１４を介して共通の試料移動管１６に連通している。そしてこの共通の試料移動管１６は転換槽３に連通している。この構成により、反応槽１ａ，１ｂ，１ｃ内での反応により切断されたＡＴＺアミノ酸を転換槽３内に導くことができる。例えば反応槽１ａ内のＡＴＺアミノ酸を転換槽３に導く場合、電磁三方弁１２ａと１４を図中直交する方向に連通させることにより、反応槽１ａ内の内容物は試料移動管１１ａ，電磁三方弁１２ａ、電磁三方弁１４および共通の試料移動管１６を経て転換槽３内に移動する。

なお、電磁三方弁１２ｃは第一試薬供給装置２の電磁開閉弁２９０と電磁開閉弁１３を介して連通するとともに、電磁三方弁１４は電磁開閉弁１５を備えたドレイン管１７にも連通している。

転換槽３内に試薬を供給する第二試薬供給装置４は、アセトニトリルと水の混合液の試薬容器４１と、トリフルオロ酢酸溶液の試薬容器４２を備え、これらの各試薬容器４１，４２には、それぞれガス供給管２６を介して、窒素ガス源２７から所定の圧力の窒素ガスが各試薬容器４１，４２に対応して設けられた電磁開閉弁４６１，４６２を開くことによって導入される。また、各試薬容器４１，４２にはそれぞれ電磁開閉弁４８１，４８２を備えたドレイン管４８が連通している。

さらに、各試薬容器４１，４２には、それぞれ試薬供給管４９１，４９２が連通しており、これらの各試薬供給管４９１，４９２は、それぞれに対応する電磁三方弁４１１，４２１を介して共通の試薬供給管４９に連通している。また、電磁三方弁４１１と窒素ガス源２７との間には電磁開閉弁４６０が設けられている。この構成により、上記した第一試薬供給装置２と同様に、試薬容器４１，４２に収容された試薬のうち、任意のものを転換槽３内に供給することができる。

転換槽３には、電磁開閉弁３１１を備えたドレイン管３１と、ＰＴＨアミノ酸分析装置５に連通する試料導出管３２が接続されている。転換槽３内の反応により生成されたＰＴＨアミノ酸は電磁開閉弁４６０を開き、転換槽３内を窒素ガスで加圧することによって試料導出管３２を通じてＰＴＨアミノ酸分析装置５に送られる。

ＰＴＨアミノ酸分析装置５は、六方弁５１とポンプ５２、高速液体クロマトグラフィのカラム５３、検出器５４およびデータ処理装置５５を有している。転換槽３に連通する試料導出管３２の出口は六方弁５１に接続されており、この六方弁５１とポンプ５２の駆動により、試料導出管３２を介して導かれたＰＴＨアミノ酸は一定量がカラム５３に送られて分離され、検出器５４で検出される。その検出結果がデータ処理装置５５で解析されることにより、試料のＮ末端のＰＴＨアミノ酸の同定および定量が行われ、これを逐次繰り返すことによって試料のアミノ酸配列情報が得られる。

例えば反応槽１ａ内の試料のアミノ酸配列の分析中は、他の反応槽１ｂ，１ｃは待機状態となっており、この待機状態において反応槽１ｂ，１ｃの試薬の入口部分に設けられた電磁三方弁２９ｂ，２９ｃは閉状態、つまり水平方向に連通した状態を維持するが、そのダイヤフラムなどの接合部に用いられているＰＴＦＥがポーラス構造であるが故に、時間経過とともに試薬が徐々に反応槽１ｂ，１ｃ内へ拡散して試料のペプチド結合を無作為に切断してしまう可能性があることは上記した通りである。

この実施の形態の特徴は、以下に示すように各電磁弁の動作手順の工夫により、上記の課題を解消するようにした点にある。図２のフローチャートにその分析動作手順を示す。

まず、分析に先立ち、各反応槽１ａ，１ｂ，１ｃ内にそれぞれ試料を設置する。具体的には、ガラスファイバフィルタやＰＶＤＦ膜に保持したタンパク質やペプチドの試料を、ＰＴＦＥフィルタとともに上下のガラスブロックで挟み込み、それぞれの反応槽１ａ，１ｂ，１ｃにセットして指令を与えることにより自動運転を開始する。

分析動作においては、該当の電磁弁を作動させることにより、まず、反応槽１ａ内の試料に対するカップリング反応を生起させるべく、試薬容器２３内のトリメチルアミン（気体）で反応槽１ａ内を満たした後、試薬容器２４内のＰＩＴＣのｎ−ヘプタン溶液を供給し、タンパク質のＮ末端アミノ基に反応させ、ＰＴＣ−タンパク質を生成し、試薬容器２１内の酢酸エチルで過剰試薬や副生成物を洗浄する。

その後、切断反応を生起させるべく、試薬容器２５内のトリフルオロ酢酸でＰＴＣ−タンパク質のＮ末端ペプチド結合を切断し、ＡＴＺアミノ酸を生成する。遊離したＡＴＺアミノ酸を試薬容器２２内の塩化ｎ−ブチルで転換槽３に抽出する。

次いで転換槽３内で転換反応を生起させるべく、試薬容器４２内のトリフルオロ酢酸溶液を転換槽３内に導入し、ＡＴＺアミノ酸を安定なＰＴＨアミノ酸へ転換する。次いで試薬容器４１内のアセトニトリルと水の混合液を転換槽３内に導入してＰＴＨアミノ酸を溶解する。

そして、転換槽３内のＰＴＨアミノ酸を六方弁５１に流入させて、六方弁５１とポンプ５２により高速液体クロマトグラフィのカラム５３に注入（インジェクション）し、クロマトグラフィのカラム５３によってＰＴＨアミノ酸を分離して検出器５４で検出する。その検出結果をデータ処理装置５５で解析し、ＰＴＨアミノ酸の同定、定量、収率計算などを行う。

以上は公知の処理であり、これにより一つのＮ末端アミノ酸についての分析を終え、続けて同じ試料について次のＮ末端アミノ酸についての分析に移行すべく、上記の分析動作を繰り返す。

この実施の形態においては、一つのＮ末端アミノ酸の分析を終了して次のＮ末端アミノ酸の分析に移行するタイミングで、待機中の試料を収容している反応槽１ｂ，１ｃの内部に窒素ガスのパージを実行する。具体的には、図１において、第一試薬供給装置２内の電磁開閉弁２６０を開き、電磁三方弁２１１〜２５１の全てを図中水平方向に連通させるとともに、電磁三方弁２９ｃを図中水平方向に連通させて電磁三方弁２９ｂを直角方向に連通させることにより、窒素ガス源２７と反応槽１ｂとを直接連通させて、この反応槽１ｂの底部に連通する試料移動管１１ｂに設けられている電磁三方弁１２ｂを直角方向に連通させ、かつ、電磁三方弁１２ａ〜１４を図中鉛直方向に連通させるとともに、電磁開閉弁１５を開いてドレイン管１７に連通させる。これにより、窒素ガス源２７からの窒素ガスが試薬供給管２９を経て直接反応槽１ｂ内に導入され、試料移動管１１ｂを介してドレイン管１７を通じて外部に排気され、反応槽１ｂ内が窒素ガスでパージされる。なお、反応槽１ｃ内についても該当の電磁弁を上記と同様に制御することによって、その内部が窒素ガスでパージされる。

以上の実施の形態によれば、待機時間が長くても、その間に分析待ちの試料を収容した反応槽内が窒素ガスで定期的にパージされるため、待機中の試料を収容する反応槽内に電磁弁を介して試薬が侵入しても、その影響を抑制ないし解消することができる。

また、以上の実施の形態においては、試薬供給装置で用いる窒素ガス源をパージガス源として用い、また、既存の試薬供給管を利用して電磁弁の制御により待機中の試料を収容した反応槽内をパージしているので、上記した作用効果を実現するための新たな配管やガス源などは必要とせず、コストを抑えて実現することができる。ただし、本発明はこのような構成に限定されるものではなく、別途パージ用の配管や、あるいはこれに加えてパージ用のガス源を設けてもよいことは勿論である。

１ａ，１ｂ，１ｃ反応槽
１１ａ，１１ｂ，１１ｃ試料移動管
１２ａ，１２ｂ，１２ｃ電磁三方弁
１５電磁開閉弁
１６試料移動管
１７ドレイン管
２第一試薬供給装置
２１〜２５試薬容器
２１１，２２１，２３１，２４１、２５１電磁三方弁
２６ガス供給管
２６０〜２６５電磁開閉弁
２７窒素ガス源
２９試薬供給管
３転換槽
３２試料導出管
４第二試薬供給装置
４１，４２試薬容器
４６０〜４６２電磁開閉弁
４９試薬供給管
５ＰＴＨアミノ酸分析装置
５１六方弁
５２ポンプ
５３クロマトグラフィのカラム
５４検出器
５５データ処理装置

Claims

タンパク質もしくはペプチドの試料を収容した反応槽内に試薬を供給してエドマン反応を生起させ、試料のＮ末端のアミノ酸を逐次切断して分析部に導入することにより、試料のアミノ酸配列情報を得るアミノ酸配列分析装置において、
上記反応槽を複数個備え、その各反応槽には、試薬容器に連通する試薬供給管からの試薬が電磁弁を介して選択的に供給され、一つの反応槽内の試料の分析動作を終了した後、次の反応槽内の試料の分析動作に移行すべく上記電磁弁を自動的に作動させて試薬の供給先を変更するように構成されているとともに、
一つの反応槽内の試料の分析動作中に、分析待ちの試料を収容する反応槽内に定期的にパージガスが導入されるように構成されていることを特徴とするアミノ酸配列分析装置。
上記試薬容器内の試薬は、当該試薬容器内に不活性ガス源からの不活性ガスを導入することによって上記試薬供給管内に導かれるように構成され、上記分析待ちの試料を収容する反応槽内へのパージガスは、上記不活性ガス源からの不活性ガスを用い、当該不活性ガス源からの不活性ガスが上記試薬容器を経ず直接的に上記試薬供給管を介して導入されるように構成されていることを特徴とする請求項１に記載のアミノ酸配列分析装置。
上記分析待ちの試料を収容する反応槽内へのパージガスの導入は、分析中の試料の一つのＮ末端アミノ酸の分離、検出を終了したタイミングで行われることを特徴とする請求項１または２に記載のアミノ酸配列分析装置。