JP5448371B2 - 液体クロマトグラフ分析法 - Google Patents

Description

本発明は、液体クロマトグラフ装置を用いた分析方法に関する。

液体クロマトグラフ装置の例として、高速アミノ酸分析計が挙げられる。アミノ酸分析計は大別して２つに分類できる。１つは、タンパク質の加水分解生成物である約20種のアミノ酸を対象とする標準分析法を行うものである。他は、生体液に含まれる約40種又はそれ以上のアミノ酸類縁物質を対象とした生体液分析法を行うものである。

液体クロマトグラフ分析法に求められる条件として、高速かつ高精度の分析が可能であることが挙げられる。近年ではこれに加え、簡便な操作性と、分析の自動化が、重要な課題となっている。

液体クロマトグラフ装置では、通常、互いに異なる複数の分析を連続的に実行する。しかしながら、分析が異なれば、使用する溶離液も異なる。従って、分析毎に、溶離液容器を交換する必要がある。溶離液容器の交換作業は、一般に、時間と手間がかかる。

本発明の目的は、液体クロマトグラフ装置を用いた分析方法において、互いに異なる複数の分析を連続的に実行する場合に、溶離液容器の交換作業を回避することにある。

本発明によると、複数の分析に用いる溶離液の全種類の数を予め求める。溶離液の全種類の数が、液体クロマトグラフ装置に設置可能な容器の数以下であるとき、全種類の溶離液をそれぞれ収納した容器を、液体クロマトグラフ装置に設置する。

本発明によると、液体クロマトグラフ装置を用いた分析方法において、互いに異なる複数の分析を連続的に実行する場合に、溶離液容器の交換作業を回避することができる。

図１を参照して、本発明による液体クロマトグラフ装置の例を説明する。本例の液体クロマトグラフ装置は、アミノ酸分析計である。本例の液体クロマトグラフ装置は、第１〜第５の溶離液容器１Ｂ〜５Ｂ、蒸留水容器６Ｂ、電磁弁１Ｃ〜６Ｃ、溶離液ポンプ８、アンモニアフィルタカラム９、オートサンプラ１０、分離カラム１１、ニンヒドリン試薬容器１２Ｂ、ニンヒドリンポンプ１３、ミキサ１４、反応カラム１５、検出器１６、データ処理装置１７、窒素流路切換弁１８、及び、窒素ボンベ１９を有する。窒素ボンベ１９には、大気圧より高圧の窒素が充填されている。

窒素ボンベ１９と窒素流路切換弁１８は、管２１によって接続されている。溶離液容器１Ｂ〜５Ｂ、及び、蒸留水容器６Ｂ内の気相は管２２によって、窒素流路切換弁１８に接続されている。ニンヒドリン試薬容器１２Ｂ内の気相は管２３によって窒素流路切換弁１８に接続されている。ニンヒドリン試薬容器１２Ｂ内の液相は管２４によって窒素流路切換弁１８に接続されている。

窒素流路切換弁１８を切り替えることによって、管２２、２３は、窒素ボンベ１９に接続されるか、又は、大気開放される。窒素流路切換弁１８によって、管２２、２３が、窒素ボンベ１９に接続されると、溶離液容器１Ｂ〜５Ｂ、蒸留水容器６Ｂ、及び、ニンヒドリン試薬容器１２Ｂ内は、窒素ガスによって加圧される。窒素流路切換弁１８を切り替えることによって、管２４は、窒素ボンベ１９に接続されるか、又は、大気開放される。窒素流路切換弁１８によって、管２４が、窒素ボンベ１９に接続されると、ニンヒドリン試薬容器１２Ｂ内のニンヒドリン試薬１２Ａ内に窒素ガスが供給される。これは、バブリングと称される。

溶離液容器１Ｂ〜５Ｂ内を高圧の窒素ガスによって加圧することによって、溶離液容器１Ｂ〜５Ｂ内の溶離液は電磁弁１Ｃ〜５Ｃに供給される。同様に、蒸留水容器６Ｂ、及び、ニンヒドリン試薬容器１２Ｂ内を高圧の窒素ガスによって加圧することによって、蒸留水、及び、ニンヒドリン試薬は、それぞれ、電磁弁６Ｃ、及び、ニンヒドリンポンプ１３に供給される。

電磁弁１Ｃ〜５Ｃの少なくとも１つが開かれる。例えば、第１の電磁弁１Ｃが開かれたものとする。溶離液１Ａが、溶離液ポンプ８に導かれる。溶離液１Ａは、溶離液ポンプ８によって、先ず、アンモニアフィルタカラム９に導かれ、そこでアンモニアが除去される。溶離液は、更に、オートサンプラ１０に導かれる。オートサンプラ１０では、溶離液１Ａに、試料が加えられる。こうして、試料が加えられた溶離液は、分離カラム１１に導かれ、そこで、試料中のタンパク質は、アミノ酸に分離される。アミノ酸は溶離液と共に、ミキサ１４に供給される。

一方、ニンヒドリンポンプ１３によって、ニンヒドリン試薬容器１２Ｂからニンヒドリン試薬１２Ａがミキサ１４に供給される。ミキサ１４では、アミノ酸を含む溶離液とニンヒドリン試薬が混合され、反応カラム１５に供給される。反応カラム１５はヒータによって加熱されている。アミノ酸とニンヒドリン試薬は、反応カラム１５内にて反応し、アミノ酸は発色する。

発色したアミノ酸（ルーエマン パープル）は検出器１６で連続的に検出され、検出結果は、データ処理装置１７に送られる。データ処理装置１７は、検出結果をクロマトグラム及びデータとして出力する。出力データは、記録、保存される。

溶離液について説明する。ここでは、５つの溶離液１Ａ〜５Ａのうち第１の溶離液１Ａを供給する場合を説明した。他の溶離液２Ａ〜５Ａも同様な方法で供給される。一般に、イオン交換クロマトグラフを用いるアミノ酸分析法では、５つの溶離液を順次切り替えて供給し、試料に含まれるアミノ酸を分離させる。この場合、５つの溶離液１Ａ〜５Ａをそれぞれ順に供給してもよいが、複数の溶離液を適当な割合で混合して供給してもよい。この場合、溶離液の混合の割合を、時間と共に変化させてもよい。

液体クロマトグラフ装置では、複数の分析を連続的に実行する。しかしながら、溶離液の種類は、分析毎に異なる。そこで、分析毎に溶離液容器を交換する必要がある。

図２Ａ及び図２Ｂを参照して複数の分析を繰返し実行する方法を説明する。ここでは、２つの分析Ａ、Ｂを繰返し実行する場合を説明する。分析Ａは、５種類の溶離液、溶離液a、溶離液b、溶離液c、溶離液d、溶離液eを使用し、分析Ｂは、５種類の溶離液、溶離液f、溶離液b、溶離液c、溶離液d、溶離液eを使用するものとする。

図２Ａは、従来の分析方法である。先ず、ステップＳ１０１にて、溶離液容器を設置する。ここでは、分析Ａに用いる５個の溶離液a、溶離液b、溶離液c、溶離液d、及び、溶離液eを、それぞれ収容する容器を設置する。ステップＳ１０２にて、分析Ａを実行する。分析Ａでは、５つの溶離液ａ〜ｅを用いて、アミノ酸分析を行う。ステップＳ１０３にて、洗浄を行う。分析Ａが終了すると、全ての管路内を、所定の溶離液を流し、試料を流し出す。こうして、管路内より試料の痕跡が無くなるまで、溶離液を流す。洗浄工程は、略１時間かかる。ステップＳ１０４にて、溶離液を交換する。ここでは、分析Ｂに用いる５個の溶離液ｆ、溶離液b、溶離液c、溶離液d、及び、溶離液eを、それぞれ収容する容器を用意する。そのために、溶離液ａを収容した容器を、溶離液ｆを収容した容器に交換する。溶離液容器を交換する場合、先ず、電磁弁１Ｃを閉にし、窒素流路切換弁１８を切り替えて、管路２２、２３を大気開放する。こうして、第１の溶離液容器１Ｂ内が大気圧に等しくなったら、それを交換する。交換後、再度、窒素流路切換弁１８を切り替えて、管路２２、２３を窒素ボンベ１９に接続する。こうして、溶離液の交換工程が終了すると、ステップＳ１０５にて、分析Ｂを実行する。

図２Ａに示した従来の分析方法では、ステップＳ１０３の洗浄工程とステップＳ１０４の溶離液の交換工程が必要である。洗浄工程は、略１時間要する。

図２Ｂを参照して本発明による分析方法を説明する。ステップＳ２０１にて、溶離液容器を設置する。ここでは、分析Ａと分析Ｂに用いる全ての溶離液を予め設置する。分析Ａでは、５個の溶離液a、溶離液b、溶離液c、溶離液d、及び、溶離液eを用い、分析Ｂでは５個の溶離液ｆ、溶離液b、溶離液c、溶離液d、及び、溶離液eを用いる。従って、溶離液b、溶離液c、溶離液d、及び、溶離液eは２つの分析にて共通である。

そこで、溶離液a、溶離液b、溶離液c、溶離液d、溶離液e、及び、溶離液ｆを用意すればよい。即ち、６個の溶離液a、溶離液b、溶離液c、溶離液d、溶離液e、及び、溶離液ｆを、それぞれ収容した容器を用意する。図１に示した例では、蒸留水容器６Ｂを除去する。それによって、６個の溶離液ａ〜ｆの容器を設置することができる。

ステップＳ２０２にて、分析Ａを実行する。５個の溶離液a、溶離液b、溶離液c、溶離液d、及び、溶離液eを用いて、分析Ａを実行する。ステップＳ２０３にて、分析Ｂを実行する。５個の溶離液ｆ、溶離液b、溶離液c、溶離液d、及び、溶離液eを用いて分析Ｂを実行する。

本例では、通常使用しない蒸留水容器６Ｂを除去し、そこに、溶離液容器を設置する。そのため、６個の溶離液容器を設置することができる。従って、溶離液容器を交換することなく、分析Ａと分析Ｂを連続的に実行することができる。

ここで、溶離液容器を交換することなく、分析Ａと分析Ｂを連続的に実行することができる条件を考察する。先ず、分析Ａと分析Ｂに用いる全ての溶離液の種類の数を予め求める。本例では、６個である。次に、６個の溶離液の容器を、最初に設置することができるか否かを検討する。本例では、蒸留水容器６Ｂを除去するため、６個の溶離液容器を設置することができる。

以上の考察を集合の概念を用いて説明する。溶離液a、溶離液b、溶離液c、溶離液d、溶離液e、溶離液fの6種の溶離液を、単にa、b、c、d、e、fと表現する。分析Ａで使用する溶離液の集合をαとし、分析Ｂで使用する溶離液の集合をβとし、6種の溶離液からなる集合を全集合Ωとする。集合α、β、全集合Ωは、次の式１によって表される。
式１ α＝{a, b, c, d, e}
β＝{b, c, d, e, f}
Ω＝{a, b, c, d, e, f}

また、集合α及び集合βは、共に、全集合Ωの部分集合である。従って、αとΩの関係及びβとΩの関係は、次の式２によって表される。
式２ α⊂Ω β⊂Ω

集合αと集合βの和集合をα∪βとし、積集合をα∩βとすると、α∪βとα∩βは、次の式３によって表される。
式３ α∪β＝{ a, b, c, d, e, f}
α∩β＝{ b, c, d, e}

集合αの要素の数をn(α)、集合βの要素の数をn(β)、和集合の要素の数をn(α∪β)、積集合の要素の数をn(α∩β)とする。これらは、次の値となる。
式４ n(α)＝５、n(β)＝５、n(α∪β)＝６、n(α∩β)＝４

本例によると、溶離液容器を交換することなく、分析Ａと分析Ｂを連続的に実行することができる条件は次の式５によって表される。
式５ n(α∪β)≦６

即ち、集合αと集合βの和集合の数n(α∪β)が、液体クロマトグラフ装置に設置可能な溶離液容器の数である６以下であればよい。

図３Ａから図３Ｄを参照して、詳細に説明する。液体クロマトグラフ装置に設置可能な溶離液容器の数をＮ、分析Ａに用いる溶離液の集合をα、分析Ｂに用いる溶離液の集合をβとする。集合α、βの間の関係は、図３Ａ〜図３Ｄのいずれかである。

図３Ａに示す場合、集合αと集合βは包含関係を有さず、且つ、共通部分を有する。この場合、２つの集合の和集合が、液体クロマトグラフ装置に設置可能な溶離液容器の数Ｎ以下であればよい。これを式で表すと、次の通りになる。
式６ n(α∪β)≦Ｎ

図３Ｂに示す場合、集合αと集合βは、共通部分を有さない。この場合、２つの集合の和集合が、液体クロマトグラフ装置に設置可能な溶離液容器の数Ｎ以下であればよい。これを式で表すと、次の通りになる。
式７ n(α∪β)＝n(α)＋n(β)≦Ｎ

図３Ｃに示す場合、集合βが集合αの部分集合である。この場合には、集合αの要素の数が、液体クロマトグラフ装置に設置可能な溶離液容器の数Ｎ以下であればよい。これを式で表すと、次の通りになる。
式８ n(α∪β)＝n(α)≦Ｎ

図３Ｄに示す場合、集合αが集合βの部分集合である。従って、集合βの要素の数が、液体クロマトグラフ装置に設置可能な溶離液容器の数Ｎ以下であればよい。これを式で表すと、次の通りになる。
式９ n(α∪β)＝n(β)≦Ｎ

以上より、２つの集合α、βがどのような関係にあっても、両者の和集合の要素の数が、液体クロマトグラフ装置に設置可能な溶離液容器の数Ｎ以下であればよい。２つの集合の和集合の要素の数は、共通部分の要素の数と、非共通部分の要素の数を加算したものである。従って、２つの集合の共通部分の要素の数と、非共通部分の要素の数を加算した数が、液体クロマトグラフ装置に設置可能な溶離液容器の数Ｎ以下であればよい。

これは、別の言い方も可能である。例えば、２つの分析にて用いる全ての溶離液の種類の数が、液体クロマトグラフ装置に設置可能な溶離液容器の数Ｎ以下であればよい。更に、別の言い方をすれば、２つの分析の少なくとも一方で用いる溶離液の種類の数が、液体クロマトグラフ装置に設置可能な溶離液容器の数Ｎ以下であればよい。

このような場合には、予め、２つの分析に使用する溶離液を準備しておけば、溶離液容器の交換を行うことなく、２つの分析Ａ、Ｂを連続的に実行することができる。

ここでは、２つの分析を繰返し実行する場合を説明した。しかしながら、３つ以上の分析を繰り返して実行する場合にも、本発明は適用可能である。例えば、３つの分析Ａ、Ｂ、Ｃに用いる溶離液の集合をそれぞれ、α、β、γとする。３つの集合α、β、γの少なくとも２つの集合に共通の要素の数をｘとし、３つの集合α、β、γのいずれにも共通でない要素の数をｙとする。両者の和ｘ＋ｙが、３つの集合の和集合の要素の数である。従って、３つの集合α、β、γの和集合の要素の数ｘ＋ｙが、液体クロマトグラフ装置に設置可能な溶離液容器の数Ｎ以下であればよい。

以上本発明の例を説明したが、本発明は上述の例に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された発明の範囲にて様々な変更が可能であることは当業者により容易に理解されよう。

本発明にて使用する液体クロマトグラフ装置の構成例を示す図である。 液体クロマトグラフ装置を用いた分析方法の従来の例を説明する図である。 液体クロマトグラフ装置を用いた分析方法の本発明の例を説明する図である。 本発明の分析方法の例を説明する図である。

符号の説明

１Ａ〜５Ａ・・・溶離液、１Ｂ〜５Ｂ・・・溶離液容器、１Ｃ〜６Ｃ・・・電磁弁、６Ａ・・・蒸留水、６Ｂ・・・蒸留水容器、８・・・溶離液ポンプ、９・・・アンモニアフルタカラム、１０・・・オートサンプラ、１１・・・分離カラム、１２Ａ・・・ニンヒドリン試薬、１２Ｂ・・・ニンヒドリン試薬容器、１３・・・ニンヒドリンポンプ、１４・・・ミキサ、１５・・・反応カラム、１６・・・検出器、１７・・・データ処理装置、１８・・・窒素流路切換弁、１９・・・窒素ボンベ、２１、２２、２３、２４…管

Claims (1)

1. 液体クロマトグラフ装置を用いて、複数種類の溶離液を使用して液体試料に含まれるタンパク質を構成するアミノ酸を分析する分析方法において、
   前記液体クロマトグラフ装置が、
   複数の異なる種類の分析について、前記複数種類の溶離液のうち、少なくとも１つ以上の共通する溶離液を使用する場合には、
   前記液体クロマトグラフ装置に設置可能な容器の数を求めるステップと、
   複数の分析に用いる溶離液のうち、共通の溶離液の種類の数と共通でない溶離液の種類の数の和を求めるステップと、
   前記溶離液の種類の数の和を、前記液体クロマトグラフ装置に設置可能な容器の数と比較するステップと、
   前記溶離液の種類の数の和が、前記液体クロマトグラフ装置に設置可能な容器の数以下であるとき、前記溶離液をそれぞれ収納した容器を、前記液体クロマトグラフ装置に設置するステップと、
   当該容器内に収容された溶離液を交換することなく、前記複数の分析を連続的に実行するステップと、
   を実行し、
   前記液体クロマトグラフ装置に設置可能な容器の数は６個であることを特徴とする分析方法。

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