JP6371898B2 - ブチリデンフタリドの用途、その使用方法及びそれを使用して医薬組成物を製造する方法 - Google Patents

Description

本発明は化合物の用途、特にブチリデンフタリドの用途、その使用方法及びそれを使用して医薬組成物を製造する方法に関する。

現代人の寿命が延長しているが、高齢化及び生活上のストレスが高まるにつれて、体の健康を害する様々疾患や、容姿の老化に悩んでいる人が多くなっている。具体的には、アルツハイマー病は発症率が世界最高である神経変性疾患のうちの一種であり、脳内にβ-アミロイドタンパク質が過剰に蓄積して、Ａβプラークを形成すること（Ｇｌｅｎｎｅｒ ａｎｄ Ｗｏｎｇ １９８４；Ｍａｓｔｅｒｓ， Ｃ． Ｌ． ｅｔ ａｌ．， １９８５）、及び細胞内の神経原線維変化（Ｇｒｕｎｄｋｅ−Ｉｑｂａｌ， Ｉ． ｅｔ ａｌ．， １９８６； Ｇｏｅｄｅｒｔ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， １９８８）がその主な病理学的特徴である。Ａβプラークはアミロイドタンパク質前駆体が、ＢＡＣＥ酵素（Ｈｕｓｓａｉｎ， Ｉ． ｅｔ ａｌ．， １９９９； Ｖａｓｓａｒ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．，１９９９）及びγセクレターゼにより切断されて発生するものであり（Ｗｏｌｆｅ， Ｍ． Ｓ． ｅｔ ａｌ．， １９９９；Ｙｕ， Ｇ． ｅｔ ａｌ．， ２０００）、主にＡβ４０及びＡβ４２の２種の形式を含む（Ｊａｒｒｅｔｔ， Ｊ． Ｔ． ｅｔ ａｌ．， １９９３）。細胞内外に大量のβ-アミロイドタンパク質が蓄積すると、神経細胞の死亡を引き起こす要因となっている。

ダウン症患者は２１番染色体が減数分裂する時に、染色体分離にムラが発生して、細胞内に余分な染色体が１本存在することで発症する。アミロイドタンパク質前駆体の遺伝子が２１番染色体に位置するため（Ｒｕｍｂｌｅ， Ｂ． ｅｔ ａｌ．， １９８９； Ｓｅｌｋｏｅ， Ｄ． Ｊ．， １９９６）、アミロイドタンパク質前駆体の過剰発現がダウン症患者の早発性認知障害の病症を引き起こすと考えられる（Ｂｕｒｇｅｒ， Ｐ． Ｃ． ａｎｄ Ｆ． Ｓ． Ｖｏｇｅｌ， １９７３）。従来の多くの研究が示すように、Ａβプラークはダウン症患者の脳内に発生する（Ｍａｓｔｅｒｓ， Ｃ． Ｌ． ｅｔ ａｌ．， １９８５；Ｂｅｙｒｅｕｔｈｅｒ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， １９９２；Ｇｙｕｒｅ， Ｋ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， ２００１；Ｍｏｒ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．， ２００２）。また、別の研究によれば、ダウン症患者由来の人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、 ｉＰＳＣｓ）が生じた神経細胞を使用して、アルツハイマー病の典型的な病理学的特徴、例えばＡβ４２及びＡβ４０の蓄積、高度にリン酸化したＴａｕタンパク質等を再現できる。従って、ダウン症患者由来の人工多能性幹細胞分化システムはβ-アミロイドタンパク質に関連する神経変性疾患を選別・治療又は予防する薬物プラットフォームとして使用できる。

現在、臨床上、アルツハイマー病を治療する薬物は、コリンエステラーゼ阻害剤（Ｂｉｒｋｓ， Ｊ．， ２００６）及びＮＭＤＡ 受容体拮抗薬（ＭｃＳｈａｎｅ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．， ２００６）があり、該２種の薬物は全てアルツハイマー病患者の認知機能改善に有効であるが、アルツハイマー病に起因する疾患、例えばうつ病、不眠症等を治療するには、他の適切な薬物が必要であり（Ｔａｒｉｏｔ， Ｐ． Ｎ． ｅｔ ａｌ．， ２００４；Ｆｅｌｄｍａｎ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， ２００６； Ｈｏｗａｒｄ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．， ２０１２）、且つ、該２種の薬物は疾患を改善するだけで、アルツハイマー病を治癒することができない（Ｆａｒｌｏｗ， Ｍ． Ｒ． ｅｔ ａｌ．， ２０１０）。それ以外、多数の研究では、脳内のＡβ蓄積を減少させることに基づいてアルツハイマー病を治療する新薬を設計するものであり（Ｈｏｎｇ−Ｑｉ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， ２０１２）、具体的には、ＢＡＣＥ阻害剤、例えばＭＫ−８９３１及びＡＣＩ−９１（Ｍｕｌｌａｒｄ Ａ．， ２０１２）、又はγセクレターゼ阻害剤、例えばＬＹ４５０１３９（Ｓｉｅｍｅｒｓ、 Ｅ． ｅｔ ａｌ．， ２００５）及びＢＭＳ−７０８１６３（Ｔｏｎｇ、 Ｇ． ｅｔ ａｌ．， ２０１２）、又は免疫経路によりＡβを抑制する抗体等が含まれる。

更に、部分的な脱毛又は薄毛等が対象の体の健康に悪影響を及ぼすことはないが、それにより対象の容姿が悪くなる。研究によれば、薄毛により気分が悪くなったり、社交的活動の参加が怖くなったりして、社交不安障害、自信不足、自己同一性障害等の心理的な問題を引き起こす恐れがある。従って、脱毛又は薄毛は現代人により益々重視されてきた課題となる。

髪を洗う習慣や、ダイエットを改善することで毛髪の抜けを緩和させるほか、従来、民間では、脱毛改善又は毛髪成長促進用の製品が多数あり、血管拡張薬、プロスタグランジンに関連する誘導体の２種に大別される。更に、血管拡張薬のうち、商品名がミノキシジル（Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ Ａ．Ｇ． ｅｔ ａｌ．， ２００４）である「ロゲイン」は最も有名であり、主成分が２,４−ジアミノ−６ピペリジニルピリミジン−３−オキサイドであり、しかしながら、ロゲインはすべての部分的な薄毛に良好な効果を果たすのではなく、更に、製品使用中に有効であるが、一旦製品の使用を中止したら、新しく成長した毛髪が再び抜けてしまう。プロスタグランジンＦ２α及びプロスタグランジンＥ２について、睫毛と髪の成長を促進できるという報道があり（Ｗｏｏｄｗａｒｄ， Ｄ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， ２０１３）、しかしながら、使用者に例えば発赤やアレルギー、色素沈着等の副作用が発生し、更に、一旦使用を中止したら、新しく成長した毛髪は再び抜けてしまう。

ブチリデンフタリドは、例えばセリ科又はキク科植物の天然植物に存在し、アセトン又はクロロホルムで抽出して得る。従来の研究によれば、ブチリデンフタリドは、痙攣治療（Ｋｏ， Ｗ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．， １９８０）、抗血小板凝集（Ｔｅｎｇ， Ｃ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， １９８７）、細胞成長抑制、癌細胞死亡促進ができ、例えば、テロメラーゼを抑制することにより腫瘍成長を抑制する効能を果たしたり（Ｈｕａｎｇ， Ｍ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．， ２０１４； Ｔｓａｉ， Ｎ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， ２００６）、ＮＦ−κＢを抑制することにより炎症反応（Ｆｕ， Ｒ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．， ２０１１）を抑制する効能を果たしたりする。また、最近の研究では、ブチリデンフタリドはＪａｋ２／ｓｔａｔ３シグナル経路を活性化させることで、胚性幹細胞の成長を維持し、且つ誘導性幹細胞の形成を促進できることが見出された（Ｌｉｕ， Ｓ．Ｐ． ｅｔ ａｌ．， ２０１２）。

Ｗｎｔタンパク質は高度に保存された（ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）分泌性分子であり、胚発育と幹細胞維持に対して重要な因子である。Ｗｎｔは細胞膜での受容体Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｒｚ）及びＬＤＬ受容体関連タンパク質と結合してトライアド構造を形成し、細胞内のディシブルドに作用することができる。ＤｓｈはＧＳＫ−３β、大腸腺腫性ポリポーシスタンパク質及びＡｘｉｎタンパク質と結合して、ＧＳＫ−３βの活性を抑制し、更にβ−カテニンのリン酸化、及びβ−カテニンのユビキチン化作用による分解経路を抑制できる。細胞核内のβ−カテニンがＷｎｔシグナルの活性化によって蓄積される。β−カテニンは細胞核に入った後、他の特殊な転写因子、例えばＴサイトカイン、リンパ球エンハンサー因子及びＳｉａｍｏｉｓ等を起動させ、それにより細胞成長及び対象の発育を調整する。細胞内の活性化されたｗｎｔシグナルの過不足によって、生体の障害を引き起こし、初期胚の発育欠陥を発生させるか、又は後期成体に腫瘍又は機能不全を発生させる（Ｆｏｄｄｅ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．， ２００７）。

従来の多数の研究により、Ｗｎｔの活性化は表皮幹細胞のコピーを刺激することによって、毛髪の成長を促進する効能を果たす（Ｌｉｍ， Ｘ． ｅｔ ａｌ．， ２０１３）ことが証明される。表皮幹細胞は一般的に毛包のバルジ領域（ｂｕｌｇｅ）に存在し、ラベル保持細胞（ｌａｂｅｌ−ｒｅｔａｉｎｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）であり、通常休眠状態であるが、表皮が損傷され又は組織新生が必要な場合にしか活性化されない。Ｗｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎ経路は表皮幹細胞の自己複製を維持するのに重要な分子であり、Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌを活性化させることによって休眠状態にある表皮幹細胞が細胞周期を開始させて、細胞が複製して、成熟した毛細胞に分化する（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｃ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．， ２００６）。Ｗｎｔ７ａを発現させることによって毛包の再生数を増加でき、同様に、β−カテニンを安定させてユビキチン化作用による分解から保護することによって、β−カテニンの細胞核での濃度を向上させて、新生毛包の発生を促進できる（Ｇａｔ， Ｕ． ｅｔ ａｌ．， １９９８）。他方で、Ｗｎｔシグナル（signal）を抑制することによって外傷による毛包形成を防止できる（Ｉｔｏ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， ２００７）。

以上から明らかなように、先行技術では、副作用を引き起こすことなく、アルツハイマー病等の神経変性疾患を治療又は予防するとともに、脱毛を改善し又は毛髪の成長を促進することに有効な組成物を提供できない。従って、上記疾患を効果的に改善又は治療できる組成物の開発は現在の重要な研究課題となっている。

従って、本発明は、毛髪成長促進用の外用組成物の活性成分、又は神経変性疾患を治療又は予防する医薬組成物の活性成分として使用できる、ブチリデンフタリド又は／及びその類似体の用途を開示する。

本発明は、人体への副作用を軽減させ、毛髪の成長を効果的に促進する効能を果たす、毛髪成長促進用の外用組成物を提供することを主な目的とする。

上記目的を達成させるために、本発明は、Ｗｎｔシグナルを活性化させる能力を有するブチリデンフタリド、その類似体又は上記成分の組合せを毛髪成長促進用の外用組成物の製造に応用する、ブチリデンフタリド又は／及びその類似体の用途を開示する。

好ましくは、ブチリデンフタリドは、当業者が公知する技術により、例えばセリ科植物、キク科植物等の天然植物から抽出される。

好ましくは、ブチリデンフタリド又はその類似体は、当業者が公知する化学合成技術により製造される。

本発明は、有効量のブチリデンフタリド、その類似体又は上記成分の組合せ、及び薬学的に又は美容製品として許容可能な担体を含む毛髪成長促進用の外用組成物を対象の皮膚に塗布する、毛髪成長促進方法を提供することを別の目的とする。

好ましくは、該皮膚は毛包のある領域である。

好ましくは、該毛髪成長促進用の外用組成物を該対象の皮膚に直接塗布する。

好ましくは、該毛髪成長促進用の外用組成物を該対象の皮膚にスプレーする。

好ましくは、該ブチリデンフタリドの濃度は１μＭ−１ｍＭである。

本発明は、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病を予防又は治療するためのブチリデンフタリド又は／及びその類似体の用途を提供することを更なる目的とする。

上記目的を達成させるために、本発明の実施例は、有効量のブチリデンフタリド、その類似体又は上記成分の組合せを含有する医薬組成物を対象に投与する神経変性疾患の治療方法を開示する。

好ましくは、該神経変性疾患は、脳内のβ-アミロイドタンパク質の過剰な蓄積による疾患である。

好ましくは、該神経変性疾患はアルツハイマー病である。

好ましくは、ブチリデンフタリドは、当業者が公知する技術により、例えばセリ科植物、キク科植物等の天然植物から抽出される。

好ましくは、ブチリデンフタリドは、当業者が公知する化学合成技術により製造される。

本発明は、医薬組成物の活性成分の細胞毒性を軽減させることで、医薬組成物の安全性を向上させて副作用を減少させる、上記医薬組成物の製造方法を提供することを更なる目的とする。

該目的を達成させるために、本発明は、ブチリデンフタリドと高分子物質を１：１〜１：２の重量比で混合した後、極性有機溶剤及び水を加え、ブチリデンフタリドと高分子物質を水相において分子間引力により吸着作用させて該高分子物質をブチリデンフタリドに被覆し、次に該極性有機溶剤を除去する、医薬組成物の製造方法を開示する。

好ましくは、該極性有機溶剤は、複素環エーテル系化合物である。

好ましくは、該極性有機溶剤はテトラヒドロフランである。

好ましくは、該高分子物質はＦ１２７高分子物質である。

好ましくは、該極性有機溶剤の除去方法は加熱法である。

Ｔｏｐ−ｆｌａｓｈプラスミドＤＮＡをトランスフェクションした各群の細胞を異なる条件で培養した後、各群の細胞のルシフェラーゼ発現を測定して統計分析した結果である。 Ｔｏｐ−ｆｌａｓｈプラスミドＤＮＡ又は該Ｆｏｐ−ｆｌａｓｈプラスミドＤＮＡをトランスフェクションした細胞を異なる条件で培養した後、各群の細胞のルシフェラーゼ発現を測定して統計分析出した結果である。 異なる処理を実施した各群のマウスの外貌の変化である。 高分子物質Ｆ１２７を被覆したブチリデンフタリド及び高分子物質Ｆ１２７を被覆していないブチリデンフタリドについての細胞毒性試験結果である。 Ｔ２１人工多能性細胞の神経分化培養のフローチャートである。 Ｔ２１人工多能性細胞に対して神経分化培養を行った後、免疫蛍光染色分析により細胞内のＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎ発現を観察して取得した結果であり、ここで、赤色は免疫蛍光染色したＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、青色はＤＡＰＩで染色した細胞核である。 Ｔ２１人工多能性細胞に対して神経分化培養を行った後、免疫蛍光染色分析により細胞内のｎｅｓｔｉｎ発現を観察して取得した結果であり、ここで、緑色は免疫蛍光染色したｎｅｓｔｉｎであり、青色はＤＡＰＩで染色した細胞核である。 Ｔ２１人工多能性細胞に対して神経分化培養を行った後、免疫蛍光染色分析により細胞内のＰａｘ−６タンパク質発現を観察して取得した結果であり、ここで、赤色は免疫蛍光染色したＰａｘ−６タンパク質であり、青色はＤＡＰＩで染色した細胞核である。 Ｔ２１人工多能性細胞に対して神経分化培養を行った後、免疫蛍光染色分析により細胞内のβIIIチューブリン発現及び神経突起の成長状況を観察して取得した結果であり、ここで、緑色は免疫蛍光染色したβIIIチューブリンであり、青色はＤＡＰＩで染色した細胞核である。 異なる細胞から分化した神経細胞について、それぞれ酵素結合イムノソルベントアッセイにより統計して分析した各細胞内のＡβ４０発現量の結果である。 Ｔ２１人工多能性細胞から分化した神経細胞を異なる処理条件で培養した後、酵素結合イムノソルベントアッセイにより統計して分析した各細胞内のＡβ４０発現量の結果である。

本発明は、ブチリデンフタリドの用途、その使用方法及びそれを使用して医薬組成物を製造する方法を開示する。ブチリデンフタリドは毛髪を促進して、神経細胞内のβ-アミロイドタンパク質の含有量を低下させる能力を有するため、有効量のブチリデンフタリドを生体に投与することによって対象の健康及び外貌を改善する効能を果たし、具体的には、ブチリデンフタリドは、β-アミロイドタンパク質の細胞内での過剰な蓄積による神経変性疾患、例えばアルツハイマー病に対して、予防又は治療の効能を有し、且つ、ブチリデンフタリドは外用組成物の活性成分として、投与部位での毛髪の成長を効果的に促進できる。また、本発明で開示される医薬組成物の製造方法は、有機合成反応により該医薬組成物を製造することであり、例えば、Ｆ１２７のような高分子物質とブチリデンフタリドとの間に共有結合を発生させて、高分子物質をブチリデンフタリドに被覆することにより、医薬組成物による生体細胞の毒性を軽減させる効能を果たす。

特に定義しない限り、本発明の明細書及び特許請求の範囲に使用される技術用語及び科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者が一般的に理解する意味を有する。矛盾になる場合は、本発明の内容を基準にする。

本発明の開示するブチリデンフタリドは、構造式が式（Ｉ）
（Ｉ）であり、その製造又は入手方式が当業者の常識であり、且つ本発明の技術的特徴ではないことから、本発明では詳細な説明を省略する。例えば、中国特許出願第２００９１００６６６６６号には、有機溶剤を使用してセリ科又はキク科植物からブチリデンフタリドを抽出することが開示され、中国特許公告第１０４１７２５Ｃ号には、チリデンフタリドを化学合成方式により合成することが開示されている。

本発明の開示する用語「毛髪」は、対象の全身の毛髪を意味し、髪、体毛、睫毛、眉毛を含むがこれらに限定されない。

本発明の開示する用語「抽出」は、物質の異なる抽出剤での溶解度差を利用して、混合物中の特定成分を甲相から乙相に移すことで、分離の目的を実現することを意味し、例えば、溶媒抽出、超臨界抽出が挙げられる。一般的には、抽出剤はアセトン、クロロホルム、二酸化炭素を含むがこれらに限定されない。

本発明の開示する用語「化学合成技術」は、特定生成物を得るために行われる一連の化学反応、例えば有機反応、無機反応を意味する。

本発明の開示する用語「有効量」は、期待される効果を果たすのに必要な化合物又は活性成分の量を意味し、組成物における重量比で示される。当業者が公知するように、該有効量は、期待される特定効果を果たすための投与方式によって異なる。一般的には、組成物における活性成分又は化合物の量は該組成物の重量の約１％〜約１００％、好ましくは約３０％〜約１００％である。

本発明の開示する「薬学的に又は美容製品として許容可能な担体」は、医薬又は美容製品に使用される任意の標準担体を含み、該担体は、組成物の形態に応じて、固体、半固体又は液体であってもよい。例えば、担体はゼラチン、乳化剤、炭化水素類混合物、水、グリセリン、生理食塩水、緩衝生理食塩水、ラノリン、パラフィン、蜜ろう、シメチコン、エタノールを含むが、これらに限定されない。

本発明の開示する用語「類似体」は、化合物を含有する塩類、そのエステル類、その構造異性物例えばＺ型構造又はＥ型構造、又は構造修飾を行った生成物である。

本発明の開示する高分子物質Ｆ１２７は、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンのトリブロックポリマーであり、化学式が式（ＩＩ）
（ＩＩ）（式中、ｘ、ｙ、ｚはそれぞれ１より大きい整数である。）である。高分子物質Ｆ１２７の両端におけるポリオキシエチレンが親水性を有し、中部におけるポリオキシプロピレンが疎水性であるため、高分子物質Ｆ１２７は両性物質になる。高分子物質Ｆ１２７は、水溶液に存在する場合に、徐々に界面へ拡散して界面に吸着して、表面張力を低下させ、且つ、高分子物質内における親水基と疎水基の比率を制御することによって、高分子物質の表面活性を制御できる。

本発明の開示する「分子間引力」は、ファンデルワールス力、クーロン力、水素結合、疎水結合力を含むが、これらに限定されない。

本発明の開示する用語「医薬組成物」は、期待される特定効果を果たすのに必要な有効量の化合物又は活性成分、及び少なくとも薬学的に許容可能な担体を含む。当業者が公知するように、医薬組成物の剤型は特定効果を果たすための投与方式によって異なり、例えば錠剤、粉剤、注射剤等が挙げられ、更に、該担体は医薬組成物の錠型に応じて、固体、半固体又は液体である。例えば、担体はゼラチン、乳化剤、炭化水素類混合物、水、グリセリン、生理食塩水、緩衝生理食塩水、ラノリン、パラフィン、蜜ろう、シメチコン、エタノールを含むが、これらに限定されない。

本発明の開示する用語「高分子物質」は、重合反応により生成した高分子量のある大分子であり、一般的に、高分子物質は全て有機分子である。

以下、本発明の効能を更に説明するために、いくつかの実施例を挙げて詳細に説明するが、該当実施例は説明するための例示に過ぎず、使用される用語が本発明の明細書及び特許請求の範囲の範囲や意味を制限するものではない。

なお、下記実施例に使用されるブチリデンフタリド（ｎ−ｂｕｔｙｌｉｄｅｎｅｐｈｔｈａｌｉｄｅ、Ｂｄｐｈ、Ｗ３３３３０１）は、米国のシグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）製の製品である。

実施例１：Ｗｎｔ活性テスト

６ウェル培養皿にベビーハムスター腎線維芽細胞ＢＨＫ２１を約半分用意して、培養皿のウェル毎に５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）と２μｌのリポソーム２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１．５ｍｌの微小遠心管において５分間混合して、リポソーム混合液を得る。

５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地と９．６μｇのＴｏｐ−ｆｌａｓｈプラスミドＤＮＡ又はＦｏｐ−ｆｌａｓｈプラスミドＤＮＡを混合して、Ｔｏｐ−ｆｌａｓｈプラスミド混合液及びＦｏｐ−ｆｌａｓｈプラスミド混合液を得た。Ｔｏｐ−ｆｌａｓｈプラスミドは野生型ＴＣＦ結合部位（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ ＴＣＦ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）を有し、実験群とし、Ｆｏｐ−ｆｌａｓｈプラスミドは突然変異ＴＣＦ結合部位を有し、対照群とし、該２群のプラスミドのいずれにもルシフェラーゼの配列が接続されている。

第一テスト群において、Ｔｏｐ−ｆｌａｓｈプラスミド混合液を該リポソーム混合液に加えて、全体積１００μｌの混合液を得て、合計で３群の混合液を調製した。各群の混合液を室温で静置して２０分間反応させた後、各組の該混合液を取り出して、それぞれ培養皿に加え、軽く振とうさせて均一に分布させた後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を液面が細胞ＢＨＫ２１を超えるまで補充して、３７℃で４時間培養し、次に、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地をウェル毎の培地体積が２ｍｌになるまで補充し、約１８〜２４時間後に培地を交換し、且つ、各群に異なる培養条件を提供し、そのうち、第一群は空白群であり、第二群は０．４μＭの化合物ＢＩＯを添加し、第三群は０．４μＭのブチリデンフタリドを添加する。更に、各群を約１８〜２４時間培養し、次に、それぞれ各群の該培養皿から細胞ＢＨＫ２１を収集して、ルシフェラーゼ活性を測定し、結果を図１に示し、なお、符号＊は有意的なレベルである０．０５以下であることを示す。

第二テスト群において、該Ｔｏｐ−ｆｌａｓｈプラスミド混合液又は該Ｆｏｐ−ｆｌａｓｈプラスミド混合液の生成物を該リポソーム混合液に加え、それぞれ全体積１００μｌのＴｏｐ−ｆｌａｓｈ混合液又はＦｏｐ−ｆｌａｓｈ混合液を得て、合計で４群の混合液を調製し、そのうち、第一群はＦｏｐ−ｆｌａｓｈ混合液、第二群−第四群はＴｏｐ−ｆｌａｓｈ混合液であった。各群の混合液を室温で静置して２０分間反応させた後、取り出して培養皿に加え、軽く振とうさせて均一に分布させた後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を液面が細胞ＢＨＫ２１を超えるまで補充し、３７℃で４時間培養し、次に、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地をウェル毎の培地体積が２ｍｌになるまで補充し、約１８〜２４時間後に培地を交換し、且つ、各群に異なる培養条件を提供し、そのうち、第一群は４μＭのブチリデンフタリドを添加し、第二群はいずれの化合物も添加しておらず、第三群は１μＭのブチリデンフタリドを添加し、第四群は４μＭのブチリデンフタリドを添加する。更に、各群を約１８〜２４時間培養し、次に、それぞれ各群の該培養皿から細胞ＢＨＫ２１を収集して、ルシフェラーゼ活性を測定し、結果を図２に示し、なお、符号＊は有意的なレベルである０．０５以下であることを示す。

ルシフェラーゼ活性の測定方法：先ず細胞ＢＨＫ２１の培養液を吸い取って捨てて、次にリン酸塩緩衝液で２回洗浄した。培養皿のウェル毎に２００μｌの１Ｘ ＰＬＢ試薬（Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を加えて、室温で１５分間振とうさせて、細胞が分解した後、細胞溶解物を取って、回転数１２０００ｒｐｍ、４℃で１分間遠分離して、上澄み液を収集した。２０μｌの上澄み液を９６ウェルプレートに取って、１００μｌのルシフェラーゼ分析試薬（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ）を加え、ルミノメーター（Luminometer）に投入して、波長５９５ｎｍでルシフェラーゼの活性を測定した。

図１の結果に示されるように、化合物で処理されていない第一群のルミネセンス値は実験の参照値とすることができる。第一群に比べて、細胞が０．４μＭの化合物ＢＩＯ又はブチリデンフタリドを処理する場合（第二群及び第三群）、Ｔｏｐ−ｆｌａｓｈプラスミドＤＮＡをトランスフェクションした細胞のルミネセンス値（発光量）は著しく高くなり、それによって、細胞中のＴＣＦプロモーターが活性化されたことを示し、細胞のルシフェラーゼ活性及び発現が検出された。

図２の結果に示されるように、第一群には突然変異したＦｏｐ−Ｆｌａｓｈレポーター遺伝子があるため、ブチリデンフタリドを添加しても、第一群にはルシフェラーゼ活性が測定できず、言い換えれば、細胞のルミネセンス値が増加しない。第二群−第四群の細胞のルミネセンス値はブチリデンフタリド添加量の増加に伴って向上する。以上から明らかなように、ルシフェラーゼの活性化は特異性を有することにつれて用量効果がある。

従来の文献に記載されるように、ＢＩＯはＷｎｔ活性化剤であり、Ｔｏｐ−ｆｌａｓｈプラスミドにおけるＴＣＦ結合部位と結合でき、細胞Ｗｎｔシグナルが活性化された条件下で、ルシフェラーゼの発現を促進でき、且つ、図１及び図２の結果から明らかなように、ブチリデンフタリドは添加量の増加に伴って、ルシフェラーゼの活性を著しく向上させ、それによって、本発明の開示するブチリデンフタリドはＷｎｔシグナルを活性化させる能力を有する。

実施例２：動物試験

６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウスを用意して３群に分け、１群毎に２匹の雄マウスがあり、該マウスのそれぞれの尾部に近い背部に２ｃｍ^２の無毛部位があり、毎日、異なる条件で無毛部位を処理し、２１日間後、該群のそれぞれのマウスの毛成長長さ、体重、外貌の異常の有無を観察した。第一群は対照群で、無毛部位にリン酸生理食塩水だけを塗布し、第二群は実験群で、無毛部位に濃度１０μＭのブチリデンフタリドを含有する乳化組成物を塗布し、第二群は実験群で、無毛部位に濃度１００μＭのブチリデンフタリドを含有する乳化組成物を塗布する。結果は図３に示される。

図３の結果に示されるように、該群のそれぞれのマウス之の体重に異常がなかった。第一群に比べて、第二群及び第三群のマウスの背部の無毛部位に毛が明らかに成長し、且つ、第三群のマウスの背部の無毛部位での毛の成長がより著しい。以上から明らかなように、本発明の開示するブチリデンフタリドを塗布することによって毛髪の成長を効果的に促進でき、更に、成長効果は用量の増加に伴って著しく向上する。

実施例４：水相ブチリデンフタリドの合成

米国のシグマ - アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）製のブチリデンフタリド（ｎ−ｂｕｔｙｌｉｄｅｎｅｐｈｔｈａｌｉｄｅ、Ｂｄｐｈ、Ｗ３３３３０１）及びＦ１２７高分子物質（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７、Ｐ２４４３）を用意した。１０ミリグラムのブチリデンフタリドとＦ１２７高分子物質を１：１又は１：２の重量比で混合した後、２ミリリットルのテトラヒドロフランに溶解し、更に１０ミリリットルの水に加え、次に、迅速に加熱してテトラヒドロフランを除去して、凍結乾燥を行った。その後、再び水に溶解して、溶液において乳化したブチリデンフタリド微粒子はサイズが約３０〜２００ｎｍ、多分散性指数が０．２−０．５であった。

実施例５：細胞培養

ヒト多能性幹細胞を無血清培地Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８^ＴＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、米国）において培養して、ｍａｔｒｉｇｅｌ ^ＴＭマトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製、米国）で付着培養を行った。培養液を吸い取って捨てて、リン酸塩緩衝液で細胞を２回洗浄し、次に酵素Ａｃｃｕｔａｓｅ ^ＴＭ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、米国）を加えて２〜５分間反応させた後に培養液で中和し、細胞を洗い落として小さな塊に分散させて、１０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、更に上澄み液を吸い取って捨てて、新しい培養皿に投入して約３〜５日間継代培養し、且つ、培養期間に培養液を毎日交換した。

実施例６：神経細胞分化

ヒト多能性幹細胞を８−９０パーセントまで培養して、リン酸塩緩衝液で細胞を２回洗浄した後、酵素Ａｃｃｕｔａｓｅ ^ＴＭで２〜５分間作用し、次に培養液を加えて酵素を希釈し、更に細胞を洗い落として、適当なサイズに分散させた後に８００ｒｐｍの速度で約２分間遠心分離し、細胞を２０％の血清代替物（ｋｎｏｃｋ ｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、ＫＳＲと略称Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、米国）を含有するＤＭＥＭ−Ｆ１２培地に加え、蓋無し培養皿で２日間懸濁培養して、胚様体懸濁液を得た。

懸濁させた胚様体を遠心分離管に投入して、自然沈降後、上澄み液を除去し、ＢｉＳＦ小分子薬物を含有する神経誘導培地で２日間懸濁培養した後、懸濁させた胚様体に環状の上皮細胞構造が発生した。なお、小分子薬物は０．５μＭのＢＩＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、米国）、１０ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞成長因子−２（ＦＧＦ−２、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製、米国）及び１０μＭのＳＢ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、米国）を含有し、神経誘導培養液の成分は表１に示される。

更に胚様体を沈降した後、１０ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞成長因子−２を含有し且つ表２に示される成分を含む神経基礎培地に投入して培養した。２日間懸濁させて、胚様体が沈降した後、外力又は酵素Ａｃｃｕｔａｓｅ ^ＴＭにより小さな塊に分散させて、１％ｍａｔｒｉｇｅｌ ^ＴＭマトリゲルを塗布して１時間経た培養皿に投入して細胞を付着させた。約２〜７日間後、細胞が付着して神経構造を成長した。細胞が７〜８０パーセントまで成長すると、別のプレートに分けて、具体的には、細胞を別のプレートに分けるに当たって、リン酸塩緩衝液で１回洗浄した後、リン酸塩緩衝液と酵素Ａｃｃｕｔａｓｅ ^ＴＭが同比率で混合した酵素溶液で約２〜５分間作用し、更に神経基礎培地で希釈し、次にセルスクレーパーを使用して細胞を掻き取って機械力により小さな塊又は単細胞に分散させ、８００〜１０００ｒｐｍで約２〜５分間遠心分離した後、上澄み液を吸い取っ捨てて、プレートに付着させ、且つ、細胞付着を助けるように、プレートに付着させる時に１０μＭのＹ２７６３２（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社製、米国）を１日間添加した。

実施例７：細胞毒性試験

ヒト胚性幹細胞ＴＷ１をＥｓｓｅｎｔｉａｌ８^ＴＭ培地において培養し、継代際に３群に分けて、それぞれ６ウェルプレートに１．２×１０^５の細胞量を投入して培養し、培養条件としては、第一群は培地だけで培養し、第二群は培地にＦ１２７高分子物質を被覆していないブチリデンフタリドを濃度が１０μＭになるように添加し、第三群は培地に実施例１で製造してＦ１２７高分子物質を被覆したブチリデンフタリドを、濃度が１０μＭになるまで添加する。培養過程において各群の細胞形態を観察し、且つ、４〜５日間培養するたびに、細胞を計数し、群毎に１〜３回繰り返し、結果を図４に示した。なお、図４の結果は、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）及び多重比較検定（Ｔｕｋｅｙ'ｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｔｅｓｔ 分析）により取得したものであり、Ｐ値が０．０５未満で、９５％の信頼水準であり、符号＊は有意的なレベルである０．０５以下、符号＊＊は有意的なレベルである０．０１以下であることを示す。

図４の結果から明らかなように、５日間培養後、第二群の細胞数が第一群又は第三群の細胞数よりも遥かに少なかった。それから分かるように、ブチリデンフタリドは細胞に対して高い細胞毒性を有するが、高分子物質Ｆ１２７を被覆することによってブチリデンフタリドの細胞毒性を効果的に軽減できる。

実施例８：Ｔ２１人工多能性細胞の神経細胞分化培養

実施例５及び図５と同様に、Ｔ２１人工多能性細胞（Ｔ２１−ｉＰＳＣｓ）に対して実施例２の記載に従って神経分化を行い、且つ８日目に付着させた。細胞付着後の１２日目に免疫蛍光染色分析を行い、それによって、Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｎｅｓｔｉｎ及びＰａｘ−６タンパク質の発現を含む神経幹細胞標的を観察し、結果を図６−図８に示す。また、神経分化培養を行ったＴ２１人工多能性細胞の神経突起の成長状況を観察して、培養後の２７日目に免疫蛍光染色分析を行い、Ｔｕｊ−１抗体によって細胞内のβIIIチューブリン（ｔｕｂｕｌｉｎ）等の成熟神経標識の発現を観察して、結果を図９に示す。

免疫蛍光染色分析の操作手順：細胞をカバーガラスの４ウェル培養皿において培養して、染色の際、先ず細胞培養液を吸い取って捨てて、次にリン酸塩緩衝液で２回洗浄した後、４％のパラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ、ＰＦＡ）を加えて氷において５分間作用して細胞を固定化した後に取り出し、更にリン酸塩緩衝液で３回洗浄した後、０．３％のｔｒｉｔｏｎ（ＰＢＳＴ）を加えて氷において１０分間作用して孔を開け、次にリン酸塩緩衝液で３回洗浄した後、濃度５％のウマ血清を加えて１時間遮断し（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）、液体を吸い取って捨てて且つ濃度３％に調製したウマ血清の一次抗体を加え、室温で４時間作用し又は４℃で１６時間反応させた。その後、一次抗体を吸い取って捨てて且つＰＢＳＴリンス液で３回（１回につき５分間）洗浄した。リン酸塩緩衝時に二次抗体を調製して、ＰＢＳＴを吸い取って捨てた後、二次抗体を加えて遮光下で１時間作用した後、ＰＢＳＴリンス液で３回洗浄して、濃度１μｇ／ｍｌの細胞核染色剤ＤＡＰＩを加えて、室温で１０分間避光下で作用し、次にＰＢＳＴリンス液で２回洗浄し、更にグリセリンとリン酸塩緩衝液を等比率で混合した溶液２００μｌで湿潤した後、選別、シールを行い、次に直立蛍光顕微鏡下で蛍光を観察した。

図６−図８の結果から明らかなように、Ｔ２１人工多能性細胞は、神経細胞分化培養の１２日目にＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｎｅｓｔｉｎ及びＰａｘ−６神経幹細胞の特殊タンパク質を発現させ、それによって、Ｔ２１人工多能性細胞は上記培地で培養された後にＴ２１神経細胞に分化できることが示される。また、図９の結果から明らかなように、Ｔ２１人工多能性細胞は、２７日間の培養分化を経た後、大量の神経突起を有するとともに、成熟神経標的であるβIIIチューブリンを発現でき、それによって、Ｔ２１人工多能性細胞は２７日間分化培養して成熟したＴ２１神経細胞になる。

実施例６：神経細胞のＡβ４０発現量

付着培養したＴ２１人工多能性細胞が分化して得た神経細胞について細胞計数をした後、４ウェル培養皿中に付着して、４８時間毎に培養液を１回交換して、４８時間毎に収集した培養液を−２０℃に保存し、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によってＡβ４０発現量を分析し、更に核型が正常なヒト胚性幹細胞ＴＷ１が分化して得た神経細胞を対照群とした。なお、１群について試験を２回又は３回繰り返した。分析結果は図１０に示される。

酵素結合イムノソルベントアッセイの操作手順：培養緩衝液（ｗｏｒｋｉｎｇ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）を使用してＥＬＩＳＡキットのＡβ標準タンパク質に対して連続希釈を行って、標準曲線とした。収集した細胞培養液と該培養緩衝液を１：２の比率で希釈した。１００μｌの標準品溶液及びサンプルをそれぞれ取って９６ウェルプレートに入れて、４℃で１６時間放置した。液体を吸い取って捨てた後、３００μｌでウェルプレートをリンスして乾燥させた。２００μｌのＴＭＢ基質を加えて、室温で約４０〜４５分間暗反応した後、６２０ｎｍでの吸光値を読み取った。

図１０の結果から明らかなように、分化の２０日目から、Ｔ２１人工多能性細胞が分化して得た神経細胞内のＡβ４０発現量はヒト胚性幹細胞ＴＷ１が分化して得た神経細胞より高まり始め、分化の２５日目に差異が発生し始める。具体的には、Ｔ２１人工多能性細胞が分化して得た神経細胞内のＡβ４０発現量は、分化の２５日目に１０５．３８ ｐｇ／ｍｌ、分化の３０日目に１５５．６８ ｐｇ／ｍｌ、分化の４２日目に２６４．４７ｐｇ／ｍｌであった。

以上から明らかなように、Ｔ２１人工多能性細胞が分化して得た神経細胞内のＡβ４０発現量は、分化経時に伴って著しく上昇し、したがって、神経変性疾患を選別・治療又は予防するプラットフォームとして使用できる。

実施例１０：薬物スクリーニング

神経分化培養の３９日目にあるＴ２１人工多能性細胞を３群に分け、それぞれ異なる培養条件を与えて、更に３日間培養した後、即ち４２日目に、酵素結合免疫吸着により該群のそれぞれのＡβ４０濃度を分析し、更に神経分化培養を行っていないＴ２１人工多能性細胞と比較して、結果を図１１に示した。第一群は神経分化培養を行っていないＴ２１人工多能性細胞、第二群−第四群は神経分化培養を行ったＴ２１人工多能性細胞であり、第二群は培養過程にいずれの薬剤も添加されず、第三群は培養の３９日目にγセクレチン阻害剤ＤＡＰＴを添加し、第四群は培養の３９日目にＦ１２７高分子物質を被覆したブチリデンフタリドを１０μＭ添加する。１群について２〜３回試験し、且つ一元配置分散分析及び多重比較検定によって値には有意的な差異が存在するか否かを分析し、そのうち、Ｐ値は０．０５未満で、９５％の信頼水準であり、符号＊は有意的なレベルである０．０５以下、符号＊＊は有意的なレベルである０．０１以下であることを示す。

図１１の結果から明らかなように、第一群のＡβ４０濃度は第二群のＡβ４０濃度より遥かに低く、第三群及び第四群のＡβ４０濃度はそれぞれ第二群より低下する。以上から明らかなように、本発明の開示するブチリデンフタリドは、神経細胞内のＡβ４０濃度を大幅に低下させ、且つ、効果はγセクレチン阻害剤ＤＡＰＴの投与による効果に相当する。それによって、本発明の開示するブチリデンフタリドは、細胞内のβ-アミロイドタンパク質の過剰な蓄積を改善又は緩和する能力を有するため、神経変性疾患を治療又は予防する効能を果たす。

上記実験例の結果から明らかなように、本発明の開示するブチリデンフタリドはＷｎｔシグナルを活性化させる能力を有するため、毛髪の成長を確実に促進する効能を有し、それによって、本発明の開示するブチリデンフタリド又はその類似体は毛髪成長促進用の外用組成物の活性成分として、スプレー、塗布等の方式によって対象の特定部位の皮膚に投与することで、毛髪の成長を促進すると同時に対象の外貌を改善する効能を果たし、更に、従来の製品による対象への副作用を回避する。更に、本発明の開示する医薬組成物の製造方法は、高分子物質を薬物担体とすることで、ブチリデンフタリドの細胞毒性を緩和又は軽減させ、医薬組成物の安全性を確実且つ効果的に向上させることができる。上記方法により製造された医薬組成物は細胞内のβ-アミロイドタンパク質の濃度を低下させる機能を確実に有することから、有効量の医薬組成物を生体に投与することによって、神経変性疾患を治療又は予防する効能を果たす。

以上は該実施例を利用して本発明を詳細に説明したが、当業者であれば、本発明の主旨を脱逸せずに、明細書の実施例を簡単に改良又は変化することができ、これらの全部は本案の特許請求の範囲に属する。

Claims (5)

1. 毛髪成長促進用の外用組成物の製造における下記式（１）で表される化合物の使用であって、
   前記式（１）で表される化合物の濃度が１μＭ〜１ｍＭである使用。
2. 前記式（１）で表される化合物はセリ科植物から抽出される請求項１に記載の使用。
3. 前記式（１）で表される化合物はキク科植物から抽出される請求項１に記載の使用。
4. 前記式（１）で表される化合物は化学合成技術によって製造される請求項１に記載の使用。
5. 前記式（１）で表される化合物はＷｎｔシグナル(Ｗｎｔ signal)を活性化する能力を有する請求項１に記載の使用。