TWI530285B - A method for promoting hair growth and a composition for use thereof - Google Patents

Description

促進毛髮生長之方法及其所使用之組合物

本發明係有關於一種毛髮增生組合物，特別係指一種促進毛髮生長之方法及其所使用之組合物。

按，除藥物副作用外，由於現代人之存活年齡增加，因而隨著年紀老化及生活壓力倍增，目前越來越多人面臨局部脫髮、掉髮或毛髮稀疏等問題，雖然毛髮稀疏或脫髮對於個體之身體健康係不會產生不良影響，但是，不可否認地會影響個體之外在觀感，並且據研究指出，毛髮稀疏者較為容易導致個體情緒不佳，無法進行社交活動，可能造成個體產生社交障礙、自信心不足、自我認同等心理問題。因此，毛髮稀疏或脫髮係成為現代人逐漸重視之問題。

除藉由改變洗髮習慣、飲食習慣延緩毛髮掉落外，目前坊間出現許多改善毛髮脫落或是促進毛髮生長之產品，主要可分為兩類，其中一類係為血管舒張劑，另一類為前列腺素相關衍生物。更進一步來說，血管舒張劑中最為人所熟知者為「落健」其商業名稱為米諾地爾(Minoxidil)(Messenger A.G. et al.,2004)，主要成份為2,4-二胺基酸-6哌啶基嘧啶-3-氧化物(2,4-diamino-6-piperidinopyrimidine 3-oxide)，惟，落健並非對於所有部份之毛髮稀疏皆具有良好效果，並且，效果僅只於有使用產品時，一旦停止使用產品，新生長出之毛髮係會再次脫落。而前列腺素F2α以及前 列腺素E2係分別被報導指出可用以促進睫毛與頭髮生長(Woodward,D.F.et al.,2013)，不過，對於使用者造成如紅腫過敏、色素沈澱等副作用，並且，一旦停止使用，新生長出之毛髮亦會脫落。

丁烯基苯酞(butylidenephthalide，Bdph)係存在於天然植物中，例如傘形科或菊科之植物，得由丙酮或氯仿萃取而得。過去研究指出丁烯基苯酞係可用於治療痙攣(Ko,W.C.et al.,1980)、抗血小板凝集(Teng,C.M.et al.,1987)，並且能抑制細胞生長、促進癌細胞死亡，例如，透過抑制端粒酶達到抑制腫瘤生長之功效(Huang,M.H.et al.,2014；Tsai,N.M.et al.,2006)、透過抑制NF-κB達到抑制發炎反應(Fu,R.H.et al.,2011)之功效。再者，近期研究亦發現，丁烯基苯酞得藉由活化Jak2/stat3訊息路徑，維持胚胎幹細胞之生長，以及促進誘導型幹細胞之形成(Liu,S.P.et al.,2012)。

Wnt蛋白質是高度保守(highly conserved)之分泌性分子，為調控胚胎發育與幹細胞維持之重要因子。Wnt得藉由和其在細胞膜上之受體Frizzled(Frz)及LDL受體相關蛋白質(LDL-receptor-related protein，LRP5/6)結合形成三元體結構，並且作用於細胞內之蓬亂蛋白質(Dishevelled，Dsh)。Dsh能與肝醣合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)、腺瘤性結腸息肉蛋白質(adenomatous polyposis coli，APC)以及Axin蛋白質(axis inhibitor protein)結合，以抑制肝醣合成酶激酶-3β之活性，進而抑制β-鏈蛋白質(β-catenin)磷酸化，以及β-鏈蛋白質經由泛素化作用(ubiquitination)分解之途徑。活化Wnt訊息得引發細胞核內β-鏈蛋白質之累積。β-鏈蛋白質進入細胞核後，可啟動其他特殊轉 錄因子，如T細胞因子(T cell factor,Tcf)，以及淋巴增強因子(lymphoid enhancer factor，Lef)，與Siamois等，藉此以調控細胞之成長與個體之發育。活化細胞內wnt訊息太多或不及，均會導致生物體之損害，造成早期胚胎發育上之缺陷，或導致晚期成體中產生腫瘤或功能不全(Fodde,R.et al.,2007)。

目前許多研究均已證實，活化Wnt可以藉由刺激表皮幹細胞之複製，達到促進毛髮生長之功效(Lim,X.et al.,2013)。表皮幹細胞多存在於毛囊隆起區域(bulge)，為一標誌殘留細胞(Iabel-retaining cells)，平時細胞多處於休眠狀態，於表皮受損或組織需要更新時，才會活化。Wnt/β-catenin路徑為維持表皮幹細胞自我複製之重要分子，活化Wnt signal可使休眠狀態之表皮幹細胞進入細胞週期，使細胞進行複製，並分化為成熟之毛髮細胞(Thompson,C.C.et al.,2006)。表現Wnt7a則可以增加毛囊再生的數目，相同地，穩定β-鏈蛋白質而不受泛素化作用分解，得提高β-鏈蛋白質於細胞核之濃度，促使新生毛囊之產生(Gat,U.et al.,1998)。相反地，抑制Wnt訊息可以防止創傷引起之毛囊形成(Ito,M.et al.,2007)。

由上可知，目前仍欠缺一種得以有效且無副作用之促進毛髮生長產品，因此，開發一種新穎且有效之毛髮生長促進劑係為目前最重要之研究課題。

因此，本發明之主要目的即在於提供一種製備促進毛髮生長之外用組合物，其係能夠減少對於人體副作用，並且達到有效促進毛髮生 長之功效。

為了達成上述目的，本發明係揭露式(I)化合物：或/及其類似物之用途，其係將式(I)化合物、其類似物或上述成份之組合用於製備促進毛髮生長之外用組合物，其中，該式(I)化合物係具有活化Wnt訊號之能力。

較佳地，該式(I)化合物係得由天然植物中萃取而得，如傘形科植物、菊科植物等，其中，所使用之萃取技術係為該技術領域且具通常知識者周知者。

較佳地，該式(I)化合物或其類似物係得由化學合成技術所製備而得，其中，所使用之化學合成技術乃係該技術領域且具通常知識者周知之化學合成方法。

本發明之另一目的係在於提供一種促進毛髮增生之方法，其係將一促進毛髮生長之外用組合物，塗抹於一個體之皮膚上，其中，該外用組合物係包含有一有效量之式(I)化合物：、其類似物或上述成份之組合，以及一藥學或美容產品上能接受之載體。

較佳地，該皮膚係為具有毛囊之區域。

較佳地，該促進毛髮生長之外用組合物係直接塗抹於該個體之皮膚上。

較佳地，該促進毛髮生長之外用組合物係噴灑於該個體之皮膚上。

較佳地，該式(I)化合物之濃度係為1μM-1mM。

第一圖係為各組轉染Top-flash質體DNA之細胞經不同條件培養後，偵測各組細胞之冷光酶表現並且經統計分析出之結果。

第二圖係為轉染Top-flash質體DNA或該Fop-flash質體DNA之細胞經不同條件培養後，偵測各組細胞之冷光酶表現並且經統計分析出之結果。

第三圖係為各組小鼠分別經不同處理後之外觀變化。

除非另有定義，於本發明之說明書及申請專利範圍所使用之技術及科學名詞之意義，其係與本發明所屬技術領域且具通常知識者之一般理解者相同。若有矛盾之情形，以本發明內容為準。

所謂「毛髮」乙詞係包含個體身上各處之毛髮，包含有，但不限於，頭髮、體毛、睫毛、眉毛。

所謂「萃取」乙詞係指利用物質於不同萃取劑中溶解度之差異，將混合物中特定成份由甲相轉移到乙相中，達到分離之目的，例如溶劑萃取、超臨界萃取。一般來說，萃取劑包含有，但不限於，丙酮、氯仿、二氧化碳。

所謂「化學合成技術」乙詞係指為得到特定產物而進行之一系列化學反應，如有機反應、無機反應。

所謂「有效量」乙詞係指欲產生所求特定效果所需化合物或活性成份之量，得以其在組合物中所佔重量百分比表示。如同本發明所屬技術領域中具有通常知識者所瞭解者，該有效量會因為欲引起特定效果之投予方式而有所不同。一般來說，活性成分或化合物於組合物中之量可佔該組合物重量之約1%至約100%，較佳者係為約30%至約100%。

所謂「藥學或美容產品上能接受之載體」乙詞係包含任何標準於醫藥或美容產品上所使用之載體，而該載體係依據組合物之型態，得為固態、半固態或液態。舉例來說，載體包含，但不限於，明膠、乳化劑、烴類混合物、水、甘油、生理食鹽水、緩衝生理鹽水、羊毛脂、石蠟、蜂蠟、二甲基硅油、乙醇。

所謂「類似物」乙詞係包含有化合物之鹽類、其酯類、其結構異構物，如Z型結構或E型結構，或進行結構修飾後之產物。

本發明所揭式(I)化合物：，如同先前技術中所述者，得以有機溶劑自傘形科或菊科植物萃取而得，如中國專利申請第200910066666號，或是得以化學合成方式合成，如中國專利公告第1041725C號。由於式(I)化合物之製備乃為該所屬技術領域且具通常知識者之一般知識，故於此不加以贅述。

以下，為能更進一步說明本發明之功效，將茲舉若干實例作詳細說明，惟，該等實例係為用以解說之例示，其中所使用之任何詞彙並不限制本發明說明書及申請專利範圍之範圍及意義。

而下列實例中所使用之式(I)化合物係購於Sigma-Aldrich(W333301)。

實例一：Wnt活性測試

於六孔培養皿準備幼倉鼠腎臟纖維母細胞BHK21數量約5分滿，每孔培養皿係分別以50μl之Opti-MEM培養基(Invitrogen公司)與2μl之微脂粒2000(Lipofectamine 2000，Invitrogen公司)於1.5ml微量離心管混合5分鐘，形成一微脂粒混合液。

分別將50μl之Opti-MEM培養基與9.6μg之Top-flash質體DNA或Fop-flash質體DNA混合，形成一Top-flash質體混合液及一Fop-flash質體混合液，其中，Top-flash質體具有原生型TCF結合點(wild-type TCF binding site)，用以作為實驗組；Fop-flash質體具有突變TCF結合點(mutant TCF binding site)，控制組；而該二質體均接有冷光酶(Luciferase)之序列。

於第一測試組中，將Top-flash質體混合液加入該微脂粒混合液中，使其成為一總體積為100μl之混合液，共有3組混合液。將各組混合液於室溫靜置反應20分鐘後，抽出各組該混合液，分別加入培養皿中，輕搖使其均勻分布，再以Opti-MEM培養基補滿到液面剛好覆蓋過細胞BHK21，於37℃培養4小時，而後再以Opti-MEM培養基補至每孔2ml之培養基體積，約18~24小時後更換培養基，並且給予各組不同培養條件，其 中，第一組為空白組，第二組加入0.4μM之化合物BIO，第三組加入0.4μM之式(I)化合物。將各組再進行培養約18~24小時，而後分別自各組之該培養皿中收集細胞BHK21，偵測其冷光酶活性，結果如第一圖所示，其中，*號表示在0.05之顯著水準之下。

於第二測試組中，將該Top-flash質體混合液或該Fop-flash質體混合液之產物加入該微脂粒混合液中，分別使其成為一總體積為100μl之Top-flash混合液或Fop-flash混合液，而共有4組混合液，其中，第一組為Fop-flash混合液，第二至四組皆為Top-flash混合液。將各組混合液於室溫靜置反應20分鐘，並且抽出而加入培養皿中，輕搖使其均勻分布，再以Opti-MEM培養基補滿到液面剛好覆蓋過細胞BHK21，於37℃培養4小時，而後再以Opti-MEM培養基補至每孔2ml之培養基體積，約18~24小時後更換培養基，並且給予各組不同培養條件，其中，第一組加入4μM之式(I)化合物，第二組未添加任何化合物，第三組加入1μM之式(I)化合物，第四組加入4μM之式(I)化合物。將各組再進行培養約18~24小時，而後分別自各組之該培養皿中收集細胞BHK21，偵測其冷光酶活性，結果如第二圖所示，其中，*號表示在0.05之顯著水準之下。

而偵測冷光酶活性之方法如下：先吸除細胞BHK21之培養液，再以磷酸鹽緩衝液清洗2次。每孔培養皿加入200μl之1X PLB試劑(Passive Lysis Buffer，Promega公司)，於室溫下震盪15分鐘後，待細胞裂解，取其細胞溶解物，再以轉速12000rpm，於4℃下離心1分鐘後，收集其上清液。取20μl之上清液至96孔盤，加入100μl冷光酶分析試劑(Luciferase Assay Reagent)，置入冷光儀，以波長595nm測量冷光酶之 活性。

由第一圖之結果顯示，藉由未經化合物處理之第一組，其冷光值係可作為實驗之參考值。相對於第一組，當細胞處理0.4μM之化合物BIO或式(I)化合物時(第二組及第三組)，有轉染Top-flash質體DNA之細胞冷光值係顯著升高，表示細胞中TCF啟動子被活化，而使細胞冷光酶之活性及表現被偵測到。

由第二圖之結果顯示，由於第一組具有突變之Fop-Flash報導基因，因此，即使加入式(I)化合物，第一組中亦無法偵測到冷光酶活性，換言之，細胞冷光值係未增加。第二組至第四組之細胞冷光值係隨著式(I)化合物添加劑量增加而提昇。由此可知，冷光酶之活化係具有專一性並且具有劑量效應。

如同過去文獻中所指出，BIO係為一種Wnt活化劑，能與Top-flash質體中之TCF結合點結合，而於細胞Wnt訊號被活化下，會促進冷光酶之表現，並且，由第一圖及第二圖之結果可知，式(I)化合物係能隨著添加劑量增加，而能顯著提高冷光酶之活性，據此，本發明所揭式(I)化合物係具有活化Wnt訊息之能力。

實例二：動物試驗

選取6~8週齡之C57BL/6小公鼠，分為三組，每組2隻小公鼠，而各該小鼠之無毛處係分別為背部近尾端處表皮，面積為2平方公分，每日分別以不同條件予以處理其無毛處，經過21天後，觀察各該組小鼠之毛髮生長、體重、外觀有無異常，其中，第一組為對照組，於無毛處僅塗抹磷酸生理食鹽水；第二組係為實驗組，於無毛處塗抹經乳化之組合物， 其含有式(I)化合物，濃度為10μM；第二組係為實驗組，於無毛處塗抹經乳化之組合物，其含有式(I)化合物，濃度為100μM。結果如第三圖所示。

由第三圖之結果顯示，各該組小鼠之體重係不具有異常現象。相較於第一組，第二組及第三組小鼠背部無毛處之毛髮有明顯增生，並且，第三組小鼠背部無毛處之毛髮增生現象更為顯著。由此可知，塗抹本發明所揭式(I)化合物係能有效促進毛髮增生，並且增生之效果係能隨著劑量提昇而顯著增加。

藉由上述實驗例結果可知，本發明所揭式(I)化合物係具有活化Wnt訊息之能力，而能確實地達到促進毛髮增生之功效。因此，本發明所揭式(I)化合物或其類似物係能作為於促進毛髮生長之外用組合物之活性成份，而藉由以如噴灑、塗抹等方式投予於個體特定部位之皮膚上，達到促進毛髮增生，同時提昇個體外觀之功效，亦能達到避免習知產品對於個體具有副作用之功效。

以上僅是藉由各該實例詳細說明本發明，熟知該技術領域者於不脫離本發明精神下，而對於說明書中之實施例所做的任何簡單修改或是變化，均應為本案申請專利範圍所得涵攝者。

參考文獻

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Claims (5)

1. 一種將式(I)化合物用於製備促進毛髮生長之外用組合物之用途，其中，該式(I)化合物：。
2. 依據申請專利範圍第1項所述用途，其中，式(I)化合物係萃取自傘形科植物。
3. 依據申請專利範圍第1項所述用途，其中，式(I)化合物係萃取自菊科植物。
4. 依據申請專利範圍第1項所述用途，其中，式(I)化合物或其類似物係由化學合成技術所製備而得。
5. 依據申請專利範圍第1項所述用途，其中，式(I)化合物係具有活化Wnt訊號之能力。