CN105310896B - 促进毛发生长的方法及其所使用的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进毛发生长的方法及其所使用的组合物。将式(I)化合物

其类似物或上述成分的组合用于制备促进毛发生长的外用组合物，其中，所述式(I)化合物具有活化Wnt信号的能力。本发明促进毛发增生的方法为：将一促进毛发生长的外用组合物，投予至一个体的皮肤上，其中，该外用组合物包含有一有效量的式(I)化合物、或其类似物，以及一药学或美容产品上能接受的载体。本发明所揭式(I)化合物或其类似物能作为于促进毛发生长的外用组合物的活性成分，而通过以如喷洒、涂抹等方式投予于个体特定部位的皮肤上，达到促进毛发增生，同时提升个体外观的功效，也能达到避免已知产品对于个体具有副作用的功效。

Description

促进毛发生长的方法及其所使用的组合物

技术领域

本发明涉及一种毛发增生组合物，特别涉及一种促进毛发生长的方法及其所使用的组合物。

背景技术

除药物副作用外，由于现代人的存活年龄增加，因而随着年纪老化及生活压力倍增，目前越来越多人面临局部脱发、掉发或毛发稀疏等问题，虽然毛发稀疏或脱发对于个体的身体健康不会产生不良影响，但是，不可否认地会影响个体的外在观感，并且据研究指出，毛发稀疏的人较为容易导致个体情绪不佳，无法进行社交活动，可能造成个体产生社交障碍、自信心不足、自我认同等心理问题。因此，毛发稀疏或脱发成为现代人逐渐重视的问题。

除通过改变洗发习惯、饮食习惯延缓毛发掉落外，目前坊间出现许多改善毛发脱落或是促进毛发生长的产品，主要可分为两类，其中一类为血管舒张剂，另一类为前列腺素相关衍生物。更进一步来说，血管舒张剂中最为人所熟知的为“落健”其商业名称为米诺地尔(Minoxidil)(Messenger A.G.et al.，2004)，主要成分为2，4-二胺基酸-6哌啶基嘧啶-3-氧化物 (2，4-diamino-6-piperidinopyrimidine 3-oxide)，但是，落健并非对于所有部分的毛发稀疏皆具有良好效果，并且，效果仅只于有使用产品时，一旦停止使用产品，新生长出的毛发会再次脱落。而前列腺素F2α以及前列腺素E2分别被报导指出可用以促进睫毛与头发生长(Woodward，D.F.et al.，2013)，不过，对于使用者造成如红肿过敏、色素沉淀等副作用，并且，一旦停止使用，新生长出的毛发也会脱落。

丁烯基苯酞(butylidenephthalide，Bdph)存在于天然植物中，例如伞形科或菊科的植物，由丙酮或氯仿萃取而得。过去研究指出丁烯基苯酞可用于治疗痉挛(Ko，W.C.etal.，1980)、抗血小板凝集(Teng，C.M.et al.，1987)，并且能抑制细胞生长、促进癌细胞死亡，例如，通过抑制端粒酶达到抑制肿瘤生长的功效 (Huang，M.H.et al.，2014；Tsai，N.M.et al.，2006)、通过抑制NF-κB达到抑制发炎反应(Fu，R.H.et al.，2011)的功效。再者，近期研究也发现，丁烯基苯酞通过活化Jak2/stat3信息路径，维持胚胎干细胞的生长，以及促进诱导型干细胞的形成(Liu，S.P.et al.，2012)。

Wnt蛋白质是高度保守(highly conserved)的分泌性分子，为调控胚胎发育与干细胞维持的重要因子。Wnt通过和其在细胞膜上的受体Frizzled(Frz) 及LDL受体相关蛋白质(LDL-receptor-related protein，LRP5/6)结合形成三元体结构，并且作用于细胞内的蓬乱蛋白质(Dishevelled，Dsh)。Dsh能与肝醣合成酶激酶-3β(glycogen synthasekinase-3β，GSK-3β)、腺瘤性结肠息肉蛋白质(adenomatous polyposis coli，APC)以及Axin蛋白质(axis inhibitor protein) 结合，以抑制肝醣合成酶激酶-3β的活性，进而抑制β-链蛋白质(β-catenin)磷酸化，以及β-链蛋白质经由泛素化作用(ubiquitination)分解的途径。活化Wnt 信息引发细胞核内β-链蛋白质的累积。β-链蛋白质进入细胞核后，可启动其他特殊转录因子，如T细胞因子(T cell factor，Tcf)，以及淋巴增强因子(lymphoidenhancer factor，Lef)，与Siamois等，藉此调控细胞的成长与个体的发育。活化细胞内Wnt信息太多或不及，均会导致生物体的损害，造成早期胚胎发育上的缺陷，或导致晚期成体中产生肿瘤或功能不全(Fodde，R.et al.，2007)。

目前许多研究均已证实，活化Wnt可以通过刺激表皮干细胞的复制，达到促进毛发生长的功效(Lim，X.et al.，2013)。表皮干细胞多存在于毛囊隆起区域(bulge)，为一标志残留细胞(label-retaining cells)，平时细胞多处于休眠状态，在表皮受损或组织需要更新时，才会活化。Wnt/β-catenin路径为维持表皮干细胞自我复制的重要分子，活化Wntsignal可使休眠状态的表皮干细胞进入细胞周期，使细胞进行复制，并分化为成熟的毛发细胞(Thompson，C.C.et al.， 2006)。表现Wnt7a则可以增加毛囊再生的数目，相同地，稳定β-链蛋白质而不受泛素化作用分解，提高β-链蛋白质于细胞核的浓度，促使新生毛囊的产生 (Gat，U.et al.，1998)。相反地，抑制Wnt信息可以防止创伤引起的毛囊形成 (Ito，M.etal.，2007)。

由上可知，目前仍欠缺一种可以有效且无副作用的促进毛发生长产品，因此，开发一种新颖且有效的毛发生长促进剂为目前最重要的研究课题。

发明内容

因此，本发明的主要目的在于提供一种制备促进毛发生长的外用组合物，其能够减少对于人体副作用，并且达到有效促进毛发生长的功效。

为了达成上述目的，本发明揭露式(I)化合物：

或/及其类似物的用途，其将式(I)化合物、其类似物或上述成分的组合用于制备促进毛发生长的外用组合物，其中，所述式(I)化合物具有活化Wnt信号的能力。

较佳地，所述式(I)化合物由天然植物中萃取而得，如伞形科植物、菊科植物等，其中，所使用的萃取技术为该技术领域且具通常知识者周知。

较佳地，所述式(I)化合物或其类似物由化学合成技术所制备而得，其中，所使用的化学合成技术为该技术领域且具通常知识的人周知的化学合成方法。

本发明的另一目的在于提供一种促进毛发增生的方法，其将一促进毛发生长的外用组合物，涂抹于一个体的皮肤上，其中，该外用组合物包含一有效量的式(I)化合物：

其类似物或上述成分的组合，以及一药学或美容产品上能接受的载体。

较佳地，该皮肤为具有毛囊的区域。

较佳地，该促进毛发生长的外用组合物直接涂抹于该个体的皮肤上。

较佳地，该促进毛发生长的外用组合物喷洒于该个体的皮肤上。

较佳地，该式(I)化合物的浓度为1μM-1mM。

本发明的有益效果为：

本发明所揭式(I)化合物具有活化Wnt信息的能力，能确实地达到促进毛发增生的功效。本发明所揭式(I)化合物或其类似物能作为于促进毛发生长的外用组合物的活性成分，而通过以如喷洒、涂抹等方式投予于个体特定部位的皮肤上，达到促进毛发增生，同时提升个体外观的功效，也能达到避免已知产品对于个体具有副作用的功效。

附图说明

图1为各组转染Top-flash质体DNA的细胞经不同条件培养后，侦测各组细胞的冷光酶表现并且经统计分析出的结果。

图2为转染Top-flash质体DNA或该Fop-flash质体DNA的细胞经不同条件培养后，侦测各组细胞的冷光酶表现并且经统计分析出的结果。

图3为各组小鼠分别经不同处理后的外观变化。

具体实施方式

除非另有定义，本发明的说明书及权利要求书所使用的技术及科学名词的意义，其与本发明所属技术领域且具通常知识者的一般理解相同。若有矛盾的情形，以本发明内容为准。

所谓“毛发”一词包含个体身上各处的毛发，包含有，但不限于，头发、体毛、睫毛、眉毛。

所谓“萃取”一词指利用物质在不同萃取剂中溶解度的差异，将混合物中特定成分由甲相转移到乙相中，达到分离的目的，例如溶剂萃取、超临界萃取。一般来说，萃取剂包含有，但不限于，丙酮、氯仿、二氧化碳。

所谓“化学合成技术”一词指为得到特定产物而进行的一列化学反应，如有机反应、无机反应。

所谓“有效量”一词指要产生所求特定效果所需化合物或活性成分的量，可以其在组合物中所占重量百分比表示。如同本发明所属技术领域中具通常知识者所了解，该有效量会因为欲引起特定效果的投予方式而有所不同。一般来说，活性成分或化合物于组合物中的量可占该组合物重量的约1％至约100％，较佳为约30％至约 100％。

所谓“药学或美容产品上能接受的载体”一词包含任何标准于医药或美容产品上所使用的载体，而该载体依据组合物的型态，可为固态、半固态或液态。举例来说，载体包含，但不限于，明胶、乳化剂、烃类混合物、水、甘油、生理食盐水、缓冲生理盐水、羊毛脂、石蜡、蜂蜡、二甲基硅油、乙醇。

所谓“类似物”一词包含有化合物的盐类、其酯类、其结构异构物，如Z型结构或E型结构，或进行结构修饰后的产物。

本发明所揭式(I)化合物：

如同背景技术中所述，可以有机溶剂自伞形科或菊科植物萃取而得，如中国专利申请，申请号为 20091006666.6，或是可以化学合成方式合成，如中国专利公告第1041725C号。由于式(I)化合物的制备为该所属技术领域且具通常知识者的一般知识，故在此不加以赘述。

以下，为能更进一步说明本发明的功效，将举若干实施例作详细说明，这些实施例为用以解说的例示，其中所使用的任何词汇并不限制本发明说明书及权利要求的范围及意义。

而下列实施例中所使用的式(I)化合物购于Sigma-Aldrich(W333301)。

实施例1：Wnt活性测试

于六孔培养皿准备幼仓鼠肾脏纤维母细胞BHK21数量约5分满，每孔培养皿分别以50μL的Opti-MEM培养基(Invitrogen公司)与2μL的微脂粒2000(Lipofectamine 2000，Invitrogen公司)于1.5mL微量离心管混合5分钟，形成一微脂粒混合液。

分别将50μL的Opti-MEM培养基与9.6μg的Top-flash质体DNA或Fop-flash质体DNA混合，形成一Top-flash质体混合液及一Fop-flash质体混合液，其中，Top-flash 质体具有原生型TCF结合点(wild-type TCF binding site)，用以作为实验组；Fop-flash 质体具有突变TCF结合点(mutant TCF binding site)，控制组；而该两种质体均接有冷光酶(Luciferase)的序列。

于第一测试组中，将Top-flash质体混合液加入该微脂粒混合液中，使其成为一总体积为100μL的混合液，共有3组混合液。将各组混合液于室温静置反应20分钟后，抽出各组该混合液，分别加入培养皿中，轻摇使其均匀分布，再以Opti-MEM培养基补满到液面刚好覆盖过细胞BHK21，于37℃培养4小时，而后再以Opti-MEM培养基补至每孔2mL的培养基体积，约18～24小时后更换培养基，并且给予各组不同培养条件，其中，第一组为空白组，第二组加入0.4μM的化合物BIO，第三组加入0.4μM 的式(I)化合物。将各组再进行培养约18～24小时，而后分别自各组的该培养皿中收集细胞BHK21，侦测其冷光酶活性，结果如图1所示，其中，*号表示在0.05的显著水准之下。

于第二测试组中，将该Top-flash质体混合液或该Fop-flash质体混合液的产物加入该微脂粒混合液中，分别使其成为一总体积为100μL的Top-flash混合液或Fop-flash 混合液，而共有4组混合液，其中，第一组为Fop-flash混合液，第二至四组皆为 Top-flash混合液。将各组混合液于室温静置反应20分钟，并且抽出而加入培养皿中，轻摇使其均匀分布，再以Opti-MEM培养基补满到液面刚好覆盖过细胞BHK21，于 37℃培养4小时，而后再以Opti-MEM培养基补至每孔2mL的培养基体积，约18～24 小时后更换培养基，并且给予各组不同培养条件，其中，第一组加入4μM的式(I) 化合物，第二组未添加任何化合物，第三组加入1μM的式(I)化合物，第四组加入 4μM的式(I)化合物。将各组再进行培养约18～24小时，而后分别自各组的该培养皿中收集细胞BHK21，侦测其冷光酶活性，结果如图2所示，其中，*号表示在0.05 的显著水准之下。

而侦测冷光酶活性的方法如下：先吸除细胞BHK21的培养液，再以磷酸盐缓冲液清洗2次。每孔培养皿加入200μL的1X PLB试剂(Passive Lysis Buffer，Promega 公司)，于室温下震荡15分钟后，待细胞裂解，取其细胞溶解物，再以转速12000rpm，于4℃下离心1分钟后，收集其上清液。取20μL的上清液至96孔盘，加入100μL冷光酶分析试剂(LuciferaseAssay Reagent)，置入冷光仪，以波长595nm测量冷光酶的活性。

由图1的结果显示，通过未经化合物处理的第一组，其冷光值可作为实验的参考值。相对于第一组，当细胞处理0.4μM的化合物BIO或式(I)化合物时(第二组及第三组)，有转染Top-flash质体DNA的细胞冷光值显著升高，表示细胞中TCF启动子被活化，而使细胞冷光酶的活性及表现被侦测到。

由图2的结果显示，由于第一组具有突变的Fop-Flash报导基因，因此，即使加入式(I)化合物，第一组中也无法侦测到冷光酶活性，换言之，细胞冷光值未增加。第二组至第四组的细胞冷光值随着式(I)化合物添加剂量增加而提升。由此可知，冷光酶的活化具有专一性并且具有剂量效应。

如同过去文献中所指出，BIO为一种Wnt活化剂，能与Top-flash质体中的TCF 结合点结合，而于细胞Wnt信号被活化下，会促进冷光酶的表现，并且，由图1及图 2的结果可知，式(I)化合物能随着添加剂量增加，而能显著提高冷光酶的活性，据此，本发明所揭式(I)化合物具有活化Wnt信息的能力。

实施例2：动物试验

选取6～8周龄的C57BL/6小公鼠，分为三组，每组2只小公鼠，而各该小鼠的无毛处分别为背部近尾端处表皮，面积为2平方公分，每日分别以不同条件予以处理其无毛处，经过21天后，观察各该组小鼠的毛发生长、体重、外观有无异常，其中，第一组为对照组，于无毛处仅涂抹磷酸生理食盐水；第二组为实验组，于无毛处涂抹经乳化的组合物，其含有式(I)化合物，浓度为10μM；第三组为实验组，于无毛处涂抹经乳化的组合物，其含有式(I)化合物，浓度为100μM。结果如第三图所示。

由图3的结果显示，各组小鼠的体重不具有异常现象。相较于第一组，第二组及第三组小鼠背部无毛处的毛发有明显增生，并且，第三组小鼠背部无毛处的毛发增生现象更为显著。由此可知，涂抹本发明所揭式(I)化合物能有效促进毛发增生，并且增生的效果能随着剂量提升而显著增加。

通过上述实验例结果可知，本发明所揭式(I)化合物具有活化Wnt信息的能力，而能确实地达到促进毛发增生的功效。因此，本发明所揭式(I)化合物或其类似物能作为于促进毛发生长的外用组合物的活性成分，而通过以如喷洒、涂抹等方式投予于个体特定部位的皮肤上，达到促进毛发增生，同时提升个体外观的功效，也能达到避免已知产品对于个体具有副作用的功效。

以上仅是通过各该实施例详细说明本发明，熟知该技术领域且不脱离本发明精神下，而对于说明书中的实施例所做的任何简单修改或是变化，均应为本案申请专利范围所涵摄。

参考文献：

Messenger，A.G.and J.Rundegren，Minoxidil：mechanisms of action on hairgrowth.Br J Dermatol，2004.150(2)：p.186-94.

Woodward，D.F.，J.W.Wang，and N.J.Poloso，Recent progress inprostaglandin F2alpha ethanolamide(prostamide F2alpha)research andtherapeutics.Pharmacol Rev， 2013.65(4)：p.1135-47.

Ko，W.C.，A newly isolated antispasmodic--butylidenephthalide.Jpn JPharmacol， 1980.30(1)：p.85-91.

Teng，C.M.，et a1.，Antiplatelet effect of butylidenephthalide.BiochimBiophys Acta，1987.924(3)：p.375-82.

Huang，M.H.，et al.，Brain tumor senescence might be mediated bydownregulation of S-phase kinase-associated protein 2 via butylidenephthalideleading to decreased cell viability.Tumour Biol，2014.

Tsai，N.M.，et al.，The natural compound n-butylidenephthalide derivedfrom Angelica sinensis inhibits malignant brain tumor growth in vitro and invivo.J Neurochem，2006.99(4)：p.1251-62.

Fu，R.H.，et al.，Lipopolysaccharide-stimulated activation of murineDC2.4 cells is attenuated by n-butylidenephthalide through suppression of theNF-kappaB pathway. Biotechnol Lett，2011.33(5)：p.903-10.

Liu，S.P.，et al.，n-Butylidenephthalide(BP)maintains stem cellpluripotency by activating Jak2/Stat3 pathway and increases the efficiency ofiPS cells generation.PLoS One，2012.7(9)：p.e44024.

Fodde，R.and T.Brabletz.Wnt/beta-catenin signaling in cancer stemnessand malignant behavior.Curr Opin Cell Biol，2007.19(2)：p.150-8.

Lim，X.and R.Nusse，Wnt signaling in skin development，homeostasis，anddisease.Cold Spring Harb Perspect Biol，2013.5(2).

Thompson，C.C.，J.M.Sisk，and G.M.Beaudoin，3rd，Hairless and Wntsignaling： allies in epithelial stem cell differentiation.Cell Cycle，2006.5(17)：p.1913-7.

Gat，U.，et al.，De NOvo hair follicle morphogenesis and hair tumors inmice expressing a truncated beta-catenin in skin.Cell，1998.95(5)：p.605-14..Ito，M.，et al.， Wnt-dependent de novo hair follicle regeneration in adultmouse skin after wounding. Nature，2007.447(7142)：p.316-20.

Claims (4)

1.一种将式(I)化合物用于制备促进毛发生长的外用组合物的用途，该式(I)化合物：

其特征在于，所述式(I)化合物的浓度为10μM-1mM；

所述式(I)化合物具有活化Wnt信号的能力。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述式(I)化合物萃取自伞形科植物。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述式(I)化合物萃取自菊科植物。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述式(I)化合物由化学合成技术所制备而得。

Images