WO2021028996A1 - 神経活性化を指標とした線維芽細胞ｉ型コラーゲン産生促進剤のスクリーニング方法、及び神経活性化剤を含む線維芽細胞ｉ型コラーゲン産生促進剤 - Google Patents

神経活性化を指標とした線維芽細胞ｉ型コラーゲン産生促進剤のスクリーニング方法、及び神経活性化剤を含む線維芽細胞ｉ型コラーゲン産生促進剤 Download PDF

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も絵 東條
早苗 野見山
健太朗 加治屋
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株式会社 資生堂
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Definitions

  • the present invention relates to a collagen production promoter, specifically, a screening method for a fibroblast type I collagen production promoter using nerve activation as an index, and a fibroblast type I collagen production promoter containing a nerve activator. ..
  • Fibroblasts present in the dermis of the skin produce components such as collagen, elastin, and hyaluronic acid.
  • Collagen is an indispensable component that maintains the elasticity of the skin by forming a network structure.
  • the amount of collagen produced decreases due to aging, ultraviolet rays, stress, etc., it causes a decrease in skin elasticity, wrinkles, and sagging.
  • a collagen production promoter can be mentioned.
  • a method for screening a collagen production promoter there are a method using the intracellular glutathione amount as an index (Patent Document 1), a method using a fusion protein for detecting the secretion of procollagen (Patent Document 2), and the like. Further methods are needed to search for agents that promote collagen production in fibroblasts.
  • An object of the present invention is to provide a screening method for a fibroblast type I collagen production promoter using a novel mechanism of action as an index.
  • the present invention relates to the following invention: [1] A method for screening a fibroblast type I collagen production promoter using nerve activation as an index. [2] The screening method is The process of culturing sensory nerve cells in contact with candidate drugs, The step of measuring the neural activity of the cells, A step of selecting a fibroblast type I collagen production promoter based on the nerve activating action of a candidate drug, The method according to item 1, including. [3] The method according to item 1 or 2, wherein the nerve activation is measured by the intracellular cation concentration in the sensory nerve cell. [4] The screening method according to any one of items 1 to 3, wherein the nerve activation is achieved by activating somatosensory nerve receptors.
  • FIG. 1 shows each TRP receptor by showing the intracellular Ca 2+ concentration as the fluorescence intensity (Ft) at each time point (t) and the fluorescence intensity (F0) at the start of measurement as a ratio (Ft / F0).
  • Ft fluorescence intensity
  • F0 fluorescence intensity
  • the horizontal axis is time, and the time when lavender oil and positive control were added is indicated by an arrow.
  • the solid line shows the case where lavender oil is added and then the positive control is added, and the broken line shows the case where only the positive control is added as the control without stimulation with lavender oil.
  • FIG. 2A shows iPS cell-derived sensory nerve progenitor cells.
  • FIG. 3A shows I when the medium supernatant of iPS cell-derived sensory nerve progenitor cells stimulated with the test substances (capsaicin: Cap 0.25 ⁇ M, cinnamaldehyde: CNM 125 ⁇ M, lavender oil: LO 0.005%) was added to fibroblasts.
  • FIG. 3B shows the mRNA expression level of type I collagen when the test substance was directly added to fibroblasts so as to have the same concentration.
  • collagen production is shown as a relative value with the control (no test substance added: Control) as 100%.
  • Error bars indicate mean ⁇ SD, * indicates that there is a statistically significant difference by unpaired t-test (* P ⁇ 0.05), and n.s. indicates that there is no statistically significant difference.
  • FIG. 4 shows type I collagen when a higher concentration (4 times) of the test substance (capsaicin: Cap 1 ⁇ M, cinnamaldehyde: CNM 500 ⁇ M, lavender oil: LO 0.02%) was directly added to the fibroblasts than in the case of FIG. 3B.
  • the mRNA expression level of is shown.
  • Collagen production is shown as a relative value with the control (no test substance added: Control) as 100%.
  • Error bars indicate mean ⁇ SD, ** indicates that there is a statistically significant difference by unpaired t-test (** p ⁇ 0.01), and n.s. indicates that there is no statistically significant difference.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 There are various receptors on the skin that sense stimuli such as temperature, touch, and pain, and these stimuli are transmitted to the dorsal root ganglion (DRG).
  • DRG dorsal root ganglion
  • nerve activation refers to activation of sensory nerve cells.
  • the sensory nerve cells used for measuring nerve activation are afferent nerve cells that transmit sensory information from sensory organs such as skin to the center, for example, the dorsal root ganglion of the spinal cord (hereinafter referred to as DRG). ), Progenitor cells thereof, or artificially created cells that are activated via desired neuroreceptors such as TRPA1, TRPM8, and / or TRPV1.
  • DRG dorsal root ganglion of the spinal cord
  • Progenitor cells thereof or artificially created cells that are activated via desired neuroreceptors such as TRPA1, TRPM8, and / or TRPV1.
  • Gene-introduced cells such as kidney epithelial cells may be recombinant by transfection or the like so as to express the above-mentioned receptors, iPS cell-derived sensory neurons prepared from iPS cells, and precursor cells thereof.
  • Nerve activation can be measured, for example, by the influx of cations such as Na + , K + , or Ca 2+ into sensory neurons.
  • cations such as intracellular Ca 2+ of sensory nerve cells increase as compared with before the addition, it can be judged that there is a nerve activating effect. If the nerve activating effect when the candidate drug is added is increased as compared with the nerve activating effect when the control drug is added, it can be determined that the candidate drug has a nerve activating effect.
  • the increase in cation concentration is, for example, 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% when a candidate drug is added. As mentioned above, it can mean an increase of 100% or more, 200% or more, 300% or more, 400% or more, or 500% or more.
  • a candidate drug having a nerve activating effect can be selected as a fibroblast type I collagen production promoter.
  • the nerve activating effect of the control may be predetermined in an experimental system containing only the candidate drug, or may be compared by conducting experiments at the same time. Alternatively, the influx of cations may be measured, but not limited to, by performing intracellular imaging or the like.
  • Activation of sensory neurons can also be achieved by activating DRGs or somatosensory nerve receptors.
  • the activation of DRG can also be measured by, for example, the methods described in Non-Patent Documents 1 and 2.
  • An example of somatosensory nerve receptors is the Transient receptor potential (TRP) channel, which senses stimuli such as temperature.
  • the TRP channel is a 6-transmembrane ion channel that exists in the cell membrane and permeates cations such as Na + , K + , and Ca 2+ .
  • TRPV Transient receptor potential
  • TRPM TRPM
  • TRPA TRPA
  • TRPP TRPML
  • TRPC Transient receptor potential
  • TRPV1 is activated at high temperature or capsaicin
  • TRPM8 is activated at low temperature or menthol
  • TRPA1 is activated at low temperature or cinnamaldehyde.
  • nerve activation is the activation of TRP channels, eg, activation of any one, two, or all of TRPA1, TRPM8, and TRPV1 in the skin. ..
  • the screening method for the fibroblast type I collagen production promoter of the present invention the following: The process of culturing sensory nerve cells in contact with candidate drugs, The process of measuring the nerve activity of sensory nerve cells, A step of selecting a fibroblast type I collagen production promoter based on the neuroactive action of a candidate drug, There is a method including.
  • the step of contacting the sensory nerve cell with the candidate drug is performed by adding the candidate drug to the solution containing the sensory nerve cell or preparing a solution containing the sensory nerve cell and the candidate drug.
  • the step of measuring nerve activation can be measured, for example, by the influx of cations such as Na + , K + , or Ca 2+ into sensory nerve cells as described above.
  • the method of the present invention may further include a step of measuring the type I collagen production of fibroblasts by bringing the culture solution after culturing the sensory nerve cells by stimulating with a candidate drug into contact with the fibroblasts.
  • Type I collagen production in fibroblasts can be determined by measuring the amount of type I collagen mRNA or protein in fibroblasts.
  • the amount of mRNA can be measured by using a method known in the present art such as PCR and Northern blotting. For example, as described in Examples, it can be measured by performing quantitative PCR using a primer of type I collagen.
  • the amount of protein can be determined using any technique known in the art such as Western blotting, immunostaining, FACS and the like. For example, an antibody that specifically binds to type I collagen may be used.
  • the methods described in known documents such as Patent Documents 1 and 2, Non-Patent Document 4 and the like may be used directly or modified.
  • the present invention relates to a fibroblast type I collagen production promoter containing or consisting of a nerve activator.
  • a nerve activator known in the field of neurology or other fields may be used. For example, obtain a substance having a DRG activating effect, or a substance having an activating effect of any one, two, or all of TRPA1, TRPM8, and TRPV1 and apply these substances to fibroblast type I. It can be screened and developed as a collagen production promoter.
  • the proportion of the nerve activator in the fibroblast type I collagen production promoter is not limited as long as the nerve activation action of the present invention is not impaired.
  • the fibroblast type I collagen production promoter of the present invention can be used by any administration route, but transdermal administration is preferable from the viewpoint of directly acting on the skin.
  • the fibroblast type I collagen production promoter of the present invention promotes the production of collagen by skin fibroblasts, thereby preventing problems caused by collagen deficiency such as decreased skin elasticity and barrier function, wrinkles, and sagging. Expected to improve.
  • the fibroblast type I collagen production promoter screened according to the present invention can be used for functional foods, cosmetics, quasi-drugs, pharmaceuticals, etc. for the purpose of improving skin elasticity and preventing / improving wrinkles and sagging. Can be incorporated into the composition.
  • cosmetics to be blended include sunscreens, lotions, beauty essences, beauty creams, aftercare lotions, sun oils, etc., but any cosmetics can be blended as long as they are applied to the skin. .. It is preferably formulated as a skin external preparation that can be applied directly to the skin.
  • the fibroblast type I collagen production promoter of the present invention can appropriately contain any compounding ingredients used in compositions such as cosmetics and pharmaceuticals as long as the effects are not impaired.
  • optional compounding ingredients examples include oils, surfactants, powders, coloring materials, water, alcohols, thickeners, chelating agents, silicones, antioxidants, ultraviolet absorbers, moisturizers, fragrances, and various medicinal properties. Ingredients, preservatives, pH regulators, neutralizers and the like. For example, it may contain other medicinal ingredients that promote collagen production.
  • the nerve activator or fibroblast type I collagen production promoter of the present invention contains or consists of lavender oil.
  • the amount of lavender oil to be blended in the nerve activator, fibroblast type I collagen production promoter, or composition of the present invention is not limited as long as the nerve activation action of the present invention is not impaired, and is, for example, 0.0001 to 0.001 weight. %, 0.001 to 0.005% by weight, 0.005 to 0.01% by weight, 0.01 to 0.02% by weight, 0.02 to 0.05% by weight, 0.05 to 0.1% by weight, 0.1 to 1.0% by weight, 1.0 to 10% by weight, 10 to 50% by weight, It can be set arbitrarily, such as 50 to 100% by weight.
  • Lavender oil is known to have moisturizing, bactericidal, anti-inflammatory, and / or biological tissue repair promoting effects on the skin. It has also been reported that lavender oil affects female hormones such as estrogen, and that such female hormones affect collagen production in fibroblasts (Patent Documents 3 and 4). However, it has not been reported that lavender oil promotes collagen production in fibroblasts through nerve activation.
  • the lavender oil used in the present invention is arbitrary such as steam distillation method, squeezing method, solvent extraction method, etc. by drying the flowers, leaves, peels, bark, roots, seeds, etc. of plants of the genus Lavender of the Labiatae family It refers to the essential oil obtained by the method, and any varieties such as Lavandula vera (Lavandula angustifolia), Lavandula latifolia, Lavandula x intermedia, related species, and hybrids can be used.
  • Example 1 Screening of nerve activator The nerve activator was screened by measuring the intracellular Ca 2+ concentration of cells expressing TRPA1, TRPM8, and TRPV1 by the following method.
  • the plasmid DNA encoding the human TRP receptor was obtained by ligating the nucleic acid encoding each with a vector suitable for each expression in the host cell by a well-known method.
  • Human embryonic kidney cells (HEK293, RIKEN) which are cells commonly used as gene transfer cells, are used in 96-well polyD-lysine-coated polystyrene plates (CORNING).
  • Essential oils and extracts containing lavender oil are prepared in DMSO at a concentration of 20% and stored at -20 ° C. Compounds are dissolved in water, ethanol or DMSO at a concentration of 1% and then dissolved in a suitable solvent-20. Preparations stored in degrees were used.
  • (2-1) Therefore, the intracellular calcium concentration indicator Calcium KitII-Fluo4 (Dojin Kagaku) and FDSS (Functional drug screening system, Hamamatsu Photonics) were used to measure the fluorescence intensity.
  • capsaicin (034-11351), cinnamaldehyde (031-03453), and L-menthol (132-03752) purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd. were used.
  • the above preparation was added 30 seconds after the start of the measurement, a positive control was further added 3 minutes after the start of the measurement, and the measurement was completed in 5 minutes.
  • the final concentration on cells was 0.02% for essential oils and extracts, 0.001% for compounds, and BioMek (Beckman Coulter) was used for dilution at that time.
  • Example 2 Promotion of type I collagen production of fibroblasts by sensory neurons
  • i-SNs Human iPS cell-derived sensory nerve precursor cells (i-SNs, ax0055, Axol Bioscience, Cambridge, United Kingdom) Cultured according to the manufacturer's instructions (Fig. 2A). Specifically, these cells were plated on a 24-well plate coated with Sure-Bond XF (ax0053) to give 25 ng / mL GDNF, 25 ng / mL BDNF, 10 ng / mL NGF, and 10 ng / mL NT-3. The cells were cultured in the added Sensory Neuron Maintenance Medium (SNMM, ax0060).
  • SNMM Sensory Neuron Maintenance Medium
  • the supernatant (300 ⁇ l) of the culture solution obtained by the above method (1) is mixed with the fibroblast culture solution at a ratio of 1: 1 and cultured for 4 hours to produce collagen by the following method (2-2).
  • the medium for iPS cell-derived sensory nerve progenitor cells shown above was mixed with the culture medium of fibroblasts at a ratio of 1: 1.
  • the mRNA expression level of type I collagen was measured by quantitative real-time PCR. Specifically, it was carried out using a TaqMan RNA-to-C 1Step Kit (Applied Biosystems # 4392938), a TaqMan probe and a primer for type I collagen ⁇ 1 (Hs00164004, Taqman, Applied Biosystems). ⁇ -actin (Hs01060665) was used as an internal control, and the expression level was determined by normalizing to ⁇ -actin.
  • Example 3 Collagen production promoting action through nerve activation by stimulation of various substances
  • the substance determined to have a nerve activating action in Example 1 is type I collagen of fibroblasts through nerve activation.
  • type I collagen production was measured with or without nerve cells stimulated with each substance whose concentration was changed.
  • Test substance Lavender oil essential oil containing 30% or more of linaryl acetate obtained by steam distilling flowers of Lavandula vera DC.
  • capsaicin 034 purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd. -11351
  • cinnamaldehyde 031-03453
  • Culturing of human iPS cell-derived sensory neural progenitor cells The entire amount (600 ⁇ l) of the supernatant of neural progenitor cells cultured for 5 weeks or longer using the same materials and methods as in Example 2 was collected, and the test substance of (1) above was used.
  • DMEM prepared by preparing the above test substances to have the same final concentrations of 0.25 ⁇ M capsaicin, 125 ⁇ M cinnamaldehyde, and 0.005% lavender oil was prepared, mixed directly with fibroblasts, and allowed to stand for 4 hours before recovering RNA. ..
  • type I collagen was measured by quantitative real-time PCR in the same manner as in Example 2.
  • FIG. 3A the culture supernatant of iPS cell-derived sensory nerve progenitor cells stimulated with lavender oil resulted in promoting type I collagen production in fibroblasts.
  • FIG. 3B when the same concentration of lavender oil was directly added to fibroblasts without intervention of nerve activation, no significant promotion of type I collagen production was observed.
  • Example 4 Effect of direct addition of high-concentration test substance The effect of direct addition was investigated using a test substance having a higher concentration than that of the subject of Example 3. Specifically, the test substance of Example 3 was directly added by the same method as the control experiment of Example 3 except that the final concentration was quadrupled to 1 ⁇ M capsaicin, 500 ⁇ M cinnamaldehyde, and 0.02% lavender oil. It was applied to cells and collagen was measured. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 4, promotion of type I collagen production in fibroblasts was observed at a high concentration of the test substance. However, in view of the fact that the effect was not observed at a low concentration (Fig. 3B), it was found that the production of type I collagen in fibroblasts was promoted through nerve activation by a nerve activating substance such as lavender oil. It is suggested.
  • a nerve activating substance such as lavender oil
  • Example 5 Screening method A solution containing a candidate drug is injected into iPS cell-derived sensory nerve progenitor cells seeded on a plate. The supernatant of this mixture is added to fibroblasts. Collagen expression after addition can be measured by quantitative PCR and compared with a control to determine the collagen-producing action of the candidate drug in fibroblasts.
  • Candidate agents that promote collagen expression can be screened as fibroblast type I collagen production promoters.

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Abstract

新規の作用メカニズムを指標とした、線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進剤のスクリーニング方法を提供する。　神経活性化を指標とすることで、線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進剤のスクリーニングを行うことができる。

Description

神経活性化を指標とした線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進剤のスクリーニング方法、及び神経活性化剤を含む線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進剤
　本発明は、コラーゲン産生促進剤に関し、具体的には神経活性化を指標とした線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進剤のスクリーニング方法及び神経活性化剤を含む線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進剤に関する。
　皮膚の真皮に存在する線維芽細胞は、コラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸といった成分を産生する。コラーゲンは網目構造を構成することにより皮膚の弾力を保つ不可欠な成分である。しかし、加齢、紫外線、ストレス等により、コラーゲンの産生量が低下すると、皮膚弾力の低下、しわ、たるみの原因となる。
　皮膚におけるコラーゲン産生を促進するための多くの方法が提案されている。例えば、コラーゲン産生促進剤の投与が挙げられる。コラーゲン産生促進剤をスクリーニングするための方法として細胞内グルタチオン量を指標とした方法（特許文献１）、プロコラーゲンの分泌を検出するために融合タンパク質を利用する方法（特許文献２）等がある。線維芽細胞におけるコラーゲン産生を促進する薬剤を探索する更なる方法が求められる。
特開2006-151860号公報 国際公開第2016/152882号 特開2009-155227号公報 特開2006-241042号公報
Kumamoto et. al., Experimental Dermatology, 2014, 23, 58-77 Tsutsumi et. al., Experimental Dermatology, 2012, 21, 876-894 Zhang et. al., PLOS ONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0212659 Sloniecka et. al., PLOS ONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0134157 Liu et.al., Pain. 2013 October; 154(10): 2169-2177. doi:10.1016/j.pain.2013.06.043.
　本発明は、新規の作用メカニズムを指標とした、線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、鋭意研究を行ったところ、感覚神経と線維芽細胞との関係性を見出し、神経細胞又は神経前駆細胞を活性化させると線維芽細胞のＩ型コラーゲン産生が促進されることを発見した。かかる知見に基づき、神経活性化を指標とすることで、線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進剤をスクリーニングできるという新たなスクリーニング方法および線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進剤を発明した。
　本発明は以下の発明に関する：
［1］　神経活性化を指標とした、線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進剤のスクリーニング方法。
［2］　前記スクリーニング方法が、
　感覚神経細胞を候補薬剤に接触させて培養する工程、
　前記細胞の神経活性を測定する工程、
　候補薬剤の神経活性化作用に基づき、線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進剤を選択する工程、
　を含む、項目1に記載の方法。
［3］　前記神経活性化は、感覚神経細胞内の細胞内陽イオン濃度で測定される、項目1又は2に記載の方法。
［4］　前記神経活性化は、体性感覚神経受容器を活性化することにより達成される、項目1～３のいずれか1項に記載のスクリーニング方法。
［5］　前記体性感覚神経受容器が、TRPA1、TRPM8、及び/又はTRPV1である、項目4に記載の方法。
［6］　神経活性化剤を含む、線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進剤。
［7］　前記神経活性化剤がラベンダーオイルを含む、項目6に記載の線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進剤。
　神経活性化を指標とすることで、線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進剤のスクリーニングが可能になる。
図１は、細胞内Ca2+濃度を各時点（t）における蛍光強度（Ft）とし計測開始時点の蛍光強度（F0）を１とした比（Ft/F0）で示すことにより各TRP受容器の活性を表す。横軸は時間であり、ラベンダーオイル及び陽性対照を添加した時期を矢印として示す。実線はラベンダーオイルを添加し、その後陽性対照を添加した場合、破線は対照としてラベンダーオイルで刺激せず陽性対照のみを添加した場合を示す。 図２Ａは、iPS細胞由来感覚神経前駆細胞を示す。図２Ｂは、iPS細胞由来感覚神経前駆細胞の培養上清液を添加した場合（順化培地：右のバー）のＩ型コラーゲンのmRNA発現量を、添加しない場合（対照：左のバー）を100％とした相対値で示す。エラーバーは平均値±SD、**は、対応のないt検定により統計的有意差があることを示す（**P＜0.01）。 図３Ａは、試験物質（カプサイシン:Cap 0.25μM、シンナムアルデヒド:CNM 125μM、ラベンダーオイル:LO 0.005%）で刺激したiPS細胞由来感覚神経前駆細胞の培地上清を線維芽細胞に添加した場合のＩ型コラーゲンのmRNA発現量を示す。図３Ｂは、上記試験物質が同じ濃度になるよう線維芽細胞に直接加えた場合のＩ型コラーゲンのmRNA発現量を示す。各図において、コラーゲン産生は、対照（試験物質無添加:Control）を100％とした相対値で示す。エラーバーは平均値±SD、*は対応のないt検定により統計的有意差があることを示し（*P＜0.05）、n.s.は統計的有意差がないことを示す。 図４は、図３Ｂの場合より高濃度（4倍）の試験物質（カプサイシン:Cap 1μM、シンナムアルデヒド:CNM 500μM、ラベンダーオイル:LO 0.02％）を線維芽細胞に直接加えた場合のＩ型コラーゲンのmRNA発現量を示す。コラーゲン産生は、対照（試験物質無添加:Control）を100％とした相対値で示す。エラーバーは平均値±SD、**は対応のないt検定により統計的有意差があることを示し（**p＜0.01）、n.s.は統計的有意差がないことを示す。
　皮膚には温度、触覚、痛覚といった刺激を感じる各種受容器が存在し、それらの刺激が脊髄後根神経節（DRG：dorsal root ganglion）へと伝達される。皮膚では、表皮細胞と感覚神経との相互作用が報告されており（非特許文献１、２）、線維芽細胞と感覚神経との関係では創傷治癒に関する報告がされている（非特許文献３、４）。しかしながら、正常な皮膚における感覚神経と線維芽細胞との関係はあまり解明がされていない。
　本発明者らの研究により、線維芽細胞におけるコラーゲン産生は神経活性化により促進されることがわかり、神経活性化により線維芽細胞におけるＩ型コラーゲン産生を促進する薬剤がスクリーニングできることが示された。
　本願明細書において、神経活性化とは、感覚神経細胞を活性化することを指す。本願発明において、神経活性化の測定に用いられる感覚神経細胞は、皮膚等の感覚器からの感覚情報を中枢に伝える求心性神経の神経細胞、例えば、脊髄後根神経節（以下、DRGと称する）であってもよいし、その前駆細胞であってもよいし、あるいはTRPA1、TRPM8、及び/又はTRPV1等の所望の神経受容器を介し活性化されるように人工的に作成した細胞、例えば、腎臓上皮細胞等の遺伝子導入細胞を上記受容器を発現するようにトランスフェクション等により組み換えた細胞や、iPS細胞から作成したiPS細胞由来感覚神経細胞およびその前駆細胞であってもよい。
　神経活性化は、例えば、感覚神経細胞内へのNa+、K+、又はCa2+等の陽イオンの流入により測定することができる。例えば、非特許文献５に記載のように、候補薬剤を添加すると添加前に比べて感覚神経細胞の細胞内Ca2+といった陽イオンが増加する場合、神経活性化作用があると判断できる。対照薬剤を添加した場合の神経活性化作用に比べて、候補薬剤を添加した場合の神経活性化作用が増加した場合、候補薬剤が神経活性化作用を有するものと決定することもできる。陽イオン濃度の増加は、候補薬剤を添加した場合に、例えば10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、100％以上、200％以上、300％以上、400％以上、又は500％以上増加することを意味し得る。神経活性化作用を有する候補薬剤を、線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進剤として選択することができる。対照の神経活性化作用は、候補薬剤のみを含まない実験系であらかじめ決定されていてもよいし、同時に実験を行って比較してもよい。あるいは、陽イオンの流入は、限定されないものの、細胞内イメージング等を行うことによっても測定してもよい。
　感覚神経細胞の活性化は、DRG又は体性感覚神経受容器を活性化することによって達成することもできる。DRGの活性化は、例えば非特許文献１、２に記載の方法でも測定できる。体性感覚神経受容器の例として温度等の刺激を感受するTransient receptor potential（TRP）チャネルがある。TRPチャネルは細胞膜に存在する6回膜貫通型のイオンチャネルであり、Na+、K+、Ca2+等の陽イオンを透過する。ヒトではTRPV、TRPM、TRPA、TRPP、TRPML、TRPCの6つのサブファミリーがある。これらの受容器は異なる種類の刺激を受容することがあり、例えば、TRPV1は、高温やカプサイシンで活性化され、TRPM8は低温やメントールで活性化され、TRPA1は低温やシンナムアルデヒドで活性化される。本発明の一態様では、神経活性化は、TRPチャネルを活性化すること、例えば、皮膚におけるTRPA1、TRPM8、及びTRPV1のうちのいずれか1つ、2つ、または全部を活性化することである。
　本発明の線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進剤のスクリーニング方法の一例として、以下の：
　感覚神経細胞を候補薬剤に接触させて培養する工程、
　感覚神経細胞の神経活性を測定する工程、
　候補薬剤の神経活性作用に基づき、線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進剤を選択する工程、
　を含む方法が挙げられる。
　感覚神経細胞と候補薬剤とを接触させる工程は、感覚神経細胞を含む溶液に候補薬剤を添加するか、又は感覚神経細胞と候補薬剤とを含む溶液を調製することで行われる。神経活性化を測定する工程は、例えば上述のように感覚神経細胞内へのNa+、K+、又はCa2+等の陽イオンの流入により測定することができる。
　本発明の方法は、候補薬剤による刺激を与えて感覚神経細胞を培養した後の培養液を線維芽細胞に接触させて、線維芽細胞のＩ型コラーゲン産生を測定する工程を更に含んでもよい。
　線維芽細胞のＩ型コラーゲン産生は、線維芽細胞におけるＩ型コラーゲンのmRNA量又はタンパク量を測定することにより決定できる。mRNA量の測定としては、PCRやノーザンブロティングなど本技術分野に既知の手法を用いて行うことができる。例えば、実施例に記載のように、Ｉ型コラーゲンのプライマーを用いて定量的PCRを行うことにより測定できる。タンパク質量についは、ウエスタンブロッティング、免疫染色、FACSなどの本技術分野に既知の任意の手法を用いて行うことができる。例えば、Ｉ型コラーゲンに特異的に結合する抗体を使用してもよい。コラーゲン産生は、公知文献、例えば、特許文献１、２、非特許文献４等に記載の方法を直接又は改変して使用してもよい。
　本発明の別の態様では、本発明は、神経活性化剤を含む又は神経活性化剤からなる線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進剤に関する。神経活性化剤は、神経学その他の分野において既知の神経活性化剤を使用してもよい。例えば、DRG活性化作用がある物質、あるいはTRPA1、TRPM8、及びTRPV1のうちのいずれか1つ、2つ、または全部の活性化作用がある物質を得て、これらの物質を線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進剤としてスクリーニングし開発することができる。線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進剤における神経活性化剤の割合は、本発明の神経活性化作用を損なわない限り限定されない。本発明の線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進剤は任意の投与経路で用いることができるが、皮膚に直接作用させる観点から経皮投与が好ましい。
　本発明の線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進剤により皮膚の線維芽細胞によるコラーゲンの産生が促進されることにより、皮膚弾力やバリア機能の低下、しわ、たるみといったコラーゲン不足に起因する問題の予防・改善が期待される。
　本発明により、スクリーニングされた線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進剤は、皮膚弾力の向上、しわ、たるみの予防・改善等を目的として、機能性食品、化粧料、医薬部外品、医薬品等の組成物に配合しうる。配合される化粧品としては、日焼け止め、化粧水、美容液、美容クリーム、アフターケアローション、サンオイルなどが挙げられるが、皮膚に適用されるものであれば任意の化粧料に配合することができる。皮膚に直接適用することができる皮膚外用剤として配合されることが好ましい。本発明の線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進剤は、その効果を損なわない範囲で、化粧品や医薬品等の組成物に用いられる任意配合成分を、必要に応じて適宜配合することができる。前記任意配合成分としては、例えば、油分、界面活性剤、粉末、色材、水、アルコール類、増粘剤、キレート剤、シリコーン類、酸化防止剤、紫外線吸収剤、保湿剤、香料、各種薬効成分、防腐剤、pH調整剤、中和剤などが挙げられる。例えば、コラーゲン産生を促進する他の薬効成分などが含まれていてもよい。
　一実施形態では、本発明の神経活性化剤又は線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進剤は、ラベンダーオイルを含む又はラベンダーオイルからなる。本発明の神経活性化剤、線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進剤、又は組成物におけるラベンダーオイルの配合量は、本発明の神経活性化作用を損なわない限り限定されず、例えば、0.0001～0.001重量%、0.001～0.005重量%、0.005～0.01重量%、0.01～0.02重量%、0.02～0.05重量%、0.05～0.1重量%、0.1～1.0重量％、1.0～10重量％、10～50重量％、50～100重量％、等任意に設定できる。
ラベンダーオイルは、肌に対し保湿、殺菌、抗炎症、及び/又は生体組織修復促進作用等の効果があることが知られている。また、ラベンダーオイルはエストロゲンといった女性ホルモンに影響すること、かかる女性ホルモンは線維芽細胞におけるコラーゲン産生に影響することも報告されている（特許文献３、４）。しかし、ラベンダーオイルが神経活性化を介して線維芽細胞におけるコラーゲン産生を促進することは報告されていない。
　実際に、ラベンダーオイルが神経受容体を活性化すること（図１）、ラベンダーオイルを投与した神経前駆体細胞が線維芽細胞コラーゲン産生を促進することが示された（図３Ａ）。つまり、ラベンダーオイルなどの神経活性化物質により線維芽細胞コラーゲン産生が促進されることが見出された。ラベンダーオイルなどの試験物質を高濃度にして神経活性化を介さずに線維芽細胞に直接添加してもコラーゲン産生が促進された（図４）。しかしながら、線維芽細胞に対し直接的な作用が見られないような低濃度（図３Ｂ）であっても、神経活性化を介すると線維芽細胞コラーゲン産生が促進されることが示され（図３Ａ）、線維芽細胞のコラーゲン産生が神経活性化を介して促進されることが確認された。
　本発明で用いられるラベンダーオイルはシソ科ラベンダー属（Lamiaceae Lavandula）の植物体の花、葉、果皮、樹皮、根、種子等を乾燥させて水蒸気蒸留法、圧搾法、溶剤抽出法等の任意の方法により得られる精油を指し、Lavandula vera（Lavandula angustifolia）、Lavandula latifolia、Lavandula x intermediaといった任意の品種、近縁種、交雑種が使用できる。
　本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
　以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
実施例１：神経活性化物質のスクリーニング
　以下の方法により、TRPA1、TRPM8、及びTRPV1を発現する細胞の細胞内Ca2+濃度を測定することにより神経活性化物質のスクリーニングを行った。
（1）TRPA1、TRPM8、及びTRPV1を発現する細胞の作成
（1-1）プラスミドDNA
　ヒトTRP受容体をコードするプラスミドDNAは、各々をコードする核酸と、宿主細胞における各々の発現に適したベクターとを周知の方法で連結させることにより得られた。
（1-2）HEK293細胞へのプラスミドDNAトランスフェクション
　遺伝子導入細胞として汎用される細胞であるヒト腎臓上皮細胞（human embryonic kidney cells; HEK293、理研）を、96 wellのポリDリジン被覆ポリスチレンプレート（CORNING社）に10,000～20,000cells/wellの密度で播種した（100μl/well）。播種2～3時間後にLipofectamineTM LTX（Invitrogen, USA）を用いて各プラスミドを10ng/well、reagentを0.3μl/well、LTXを0.3μl/wellになるよう調製した（20μl/well）。3時間後、培地で2回洗浄し、1～2日後、以下のアッセイを行った。
（2）細胞内Ca2+ハイスループットスクリーニングによる神経活性化アッセイ
（2-1）スクリーニング対象物質
　スクリーニング対象物質として精油33品・植物エキス178品・化合物98品の合計309品の物質を使用した。ラベンダーオイルを含む精油・エキス類については20％濃度でDMSOに溶解し-20度で保存した調製物、化合物については1％濃度で水、エタノール、DMSOのうち適した溶媒に溶解したのち-20度で保存した調製物を用いた。
（2-2）細胞内Ca2+濃度の測定
　（1）で作成した細胞に（2-1）で作成した各スクリーニング対象物質の調製物を添加した場合の細胞内Ca2+濃度を測定するために、細胞内カルシウム濃度指示薬Calcium KitII-Fluo4（同仁化学）およびFDSS（Functional drug screening system, 浜松ホトニクス）を使用し蛍光強度を測定した。陽性対照として、和光純薬工業から購入したカプサイシン（034-11351）、シンナムアルデヒド（031-03453）、L-メントール（132-03752）を使用した。
　測定開始から30秒後に上記調製物を添加し、測定開始から3分後に更に陽性対照を添加し、5分で測定を終了した。細胞に対する最終濃度は精油・エキス類については0.02%とした、化合物については0.001％となるようにし、その際の希釈にはBioMek（Beckman Coulter）を用いた。
　結果を図１に示す。陽性対照であるカプサイシン、L-メントール、シンナムアルデヒドはそれぞれ、TRPV1、TRPM8、TRPA1のみを活性化した（図１の破線矢印に相当）。一方、309種の成分のうちラベンダーオイルはこれらの受容器全てを活性化した（図１の実線矢印に相当）。
実施例２：感覚神経細胞による線維芽細胞のＩ型コラーゲン産生促進作用
（1）感覚神経細胞の培養
　ヒトiPS細胞由来感覚神経前駆細胞（i-SNs, ax0055, Axol Bioscience, Cambridge, United Kingdom）を製造元の説明書に沿って培養した（図２Ａ）。具体的には、これらの細胞をSure-Bond XF（ax0053）でコーティングした24 wellプレートにプレーティングし、25ng/mL GDNF、25ng/mL BDNF、10ng/mL NGF、及び10ng/mL NT-3を添加したSensory Neuron Maintenance Medium（SNMM, ax0060）にて培養した。培地の半量を3～4日毎に交換しつつ5週間培養し、感覚神経細胞に分化させた。5週間の培養後、培養液を収集し上清を得た。
（2）感覚神経細胞による刺激を与えた線維芽細胞におけるＩ型コラーゲン産生
（2-1）感覚神経細胞による刺激
　線維芽細胞は、インフォームドコンセント後に得た新生児包皮線維芽細胞を分離させ、10％ウシ胎児血清を含有するダルベッコの改変イーグル培地（Life Technologies Japan Ltd.、東京、日本）にて37℃、95％大気および5％CO2の加湿雰囲気中で2日間増殖させた。上記（1）の方法で得た培養液の上清（300μl）を繊維芽細胞の培養液に1：1の割合で混合し、4時間培養し、下記（2-2）の方法によりコラーゲン産生を測定した。対照として、培養液の上清の代わりに上記に示したiPS細胞由来感覚神経前駆細胞用の培地を繊維芽細胞の培養液に1：1の割合で混合したものを用いた。
（2-2）定量的リアルタイムPCRによるＩ型コラーゲン産生の測定
　血清飢餓後、神経細胞の培地上清の存在下または非存在下で4時間培養した線維芽細胞からRNeasy Mini Kit(250)（QIAGEN ＃74106）を用いて全RNAを単離した。定量的リアルタイムPCRにより、Ｉ型コラーゲンのmRNA発現量を測定した。具体的には、TaqMan RNA-to-C 1Step Kit（Applied Biosystems #4392938）、TaqManプローブおよびＩ型コラーゲンα1のプライマー（Hs00164004， Taqman, Applied Biosystems）を用いて実施した。内部対照としてβアクチン（Hs01060665）を用い、発現量はβアクチンに対し正規化して求めた。
　結果を図２に示す。神経細胞培養液の上清を添加した場合（順化培地）、添加しない対照（対照）に比べて線維芽細胞のＩ型コラーゲンのmRNA発現量が有意に増加した。これにより、神経細胞に由来する成分が線維芽細胞のコラーゲンの産生を促進する作用があることが示唆される。
実施例３：各種物質の刺激による神経活性化を介するコラーゲン産生促進作用
　次に、実施例１で神経活性化作用があると判断された物質が神経活性化を介して線維芽細胞のＩ型コラーゲンの産生を促進することを確認するために、濃度を変化させた各物質にて刺激した神経細胞を介する又は介さない場合のＩ型コラーゲン産生を測定した。
（1）試験物質
　フランス バイヤン社から購入したラベンダーオイル（Lavandula vera DC.の花を水蒸気蒸留して得られた酢酸リナリルを30％以上含む精油）、並びに、和光純薬工業から購入したカプサイシン（034-11351）、シンナムアルデヒド（031-03453）を使用した。
（2）ヒトiPS細胞由来感覚神経前駆細胞の培養
　実施例２と同じ材料および方法で5週間以上培養した神経前駆細胞の上清の全量（600μl）を回収し、上記（1）の試験物質を線維芽細胞を含む培地における最終濃度が0.25μMカプサイシン、125μMシンナムアルデヒド、0.005%ラベンダーオイルとなるように添加して調製した培地500μlを再び神経前駆細胞に加え、15分間インキュベーター内で静置した。その後、試験物質を含む上清を回収し、DMEMを加え、上清：DMEM＝1：3の割合で混合した。実施例２と同様の方法にて12ウェルプレートで培養した繊維芽細胞に、上記混合物を1mlずつ適用し、4時間静置後RNAを回収した。対照として、上記試験物質を最終濃度が同じく0.25μMカプサイシン、125μMシンナムアルデヒド、0.005%ラベンダーオイルとなるように調製したDMEMを作製し繊維芽細胞に直接混合し、4時間静置後RNAを回収した。回収RNAについて実施例２と同様に定量的リアルタイムPCRによるＩ型コラーゲンの測定を行った。
　結果を図３に示す。図３Ａに示すように、ラベンダーオイルで刺激したiPS細胞由来感覚神経前駆細胞の培養上清は、線維芽細胞のＩ型コラーゲン産生を促進する結果となった。しかしながら、図３Ｂのように、神経活性化を介さず同じ濃度のラベンダーオイルを直接線維芽細胞に添加した場合、有意なＩ型コラーゲン産生の促進は見られなかった。
実施例４：高濃度の試験物質の直接添加による影響
　実施例３の対象よりも高濃度の試験物質を用い直接添加による影響を調べた。具体的には、実施例３の試験物質を最終濃度が4倍の1μMカプサイシン、500μMシンナムアルデヒド、0.02％ラベンダーオイルとなるように添加した以外は実施例３の対照実験と同じ方法により直接線維芽細胞に適用しコラーゲンの測定を行った。
　結果を図４に示す。図４に示すように、高濃度の試験物質では線維芽細胞のＩ型コラーゲン産生促進が見られた。しかしながら、その効果は低濃度では見られなかった（図３Ｂ）ことに鑑みると、線維芽細胞のＩ型コラーゲン産生がラベンダーオイルなどの神経活性化物質による神経活性化を介して促進されたことが示唆される。
実施例５：スクリーニング方法
　プレートに播種したiPS細胞由来感覚神経前駆細胞に候補薬剤を含む溶液を注入する。この混合液の上清を繊維芽細胞に添加する。添加後のコラーゲン発現を定量的PCRで測定し、対照と比較することで候補薬剤の線維芽細胞におけるコラーゲン産生作用を決定することができる。コラーゲン発現促進を有する候補薬剤を、線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進剤としてスクリーニングすることができる。

Claims (7)

  1. 　神経活性化を指標とした、線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進剤のスクリーニング方法。
  2. 　前記スクリーニング方法が、
    　感覚神経細胞を候補薬剤に接触させて培養する工程、
    　前記細胞の神経活性を測定する工程、
    　候補薬剤の神経活性化作用に基づき、線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進剤を選択する工程、
    　を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記神経活性化は、感覚神経細胞内の細胞内陽イオン濃度で測定される、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記神経活性化は、体性感覚神経受容器を活性化することにより達成される、請求項１～３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
  5. 　前記体性感覚神経受容器が、TRPA1、TRPM8、及び/又はTRPV1である、請求項４に記載の方法。
  6. 　神経活性化剤を含む、線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進剤。
  7. 　前記神経活性化剤がラベンダーオイルを含む、請求項６に記載の線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進剤。
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