JP7265015B2 - 神経活性化を指標とした線維芽細胞i型コラーゲン産生促進剤のスクリーニング方法、及び神経活性化剤を含む線維芽細胞i型コラーゲン産生促進剤 - Google Patents
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Description
[1] 神経活性化を指標とした、線維芽細胞I型コラーゲン産生促進剤のスクリーニング方法。
[2] 前記スクリーニング方法が、
感覚神経細胞を候補薬剤に接触させて培養する工程、
前記細胞の神経活性を測定する工程、
候補薬剤の神経活性化作用に基づき、線維芽細胞I型コラーゲン産生促進剤を選択する工程、
を含む、項目1に記載の方法。
[3] 前記神経活性化は、感覚神経細胞内の細胞内陽イオン濃度で測定される、項目1又は2に記載の方法。
[4] 前記神経活性化は、体性感覚神経受容器を活性化することにより達成される、項目1~3のいずれか1項に記載のスクリーニング方法。
[5] 前記体性感覚神経受容器が、TRPA1、TRPM8、及び/又はTRPV1である、項目4に記載の方法。
[6] 神経活性化剤を含む、線維芽細胞I型コラーゲン産生促進剤。
[7] 前記神経活性化剤がラベンダーオイルを含む、項目6に記載の線維芽細胞I型コラーゲン産生促進剤。
感覚神経細胞を候補薬剤に接触させて培養する工程、
感覚神経細胞の神経活性を測定する工程、
候補薬剤の神経活性作用に基づき、線維芽細胞I型コラーゲン産生促進剤を選択する工程、
を含む方法が挙げられる。
以下の方法により、TRPA1、TRPM8、及びTRPV1を発現する細胞の細胞内Ca2+濃度を測定することにより神経活性化物質のスクリーニングを行った。
(1)TRPA1、TRPM8、及びTRPV1を発現する細胞の作成
(1-1)プラスミドDNA
ヒトTRP受容体をコードするプラスミドDNAは、各々をコードする核酸と、宿主細胞における各々の発現に適したベクターとを周知の方法で連結させることにより得られた。
(1-2)HEK293細胞へのプラスミドDNAトランスフェクション
遺伝子導入細胞として汎用される細胞であるヒト腎臓上皮細胞(human embryonic kidney cells; HEK293、理研)を、96 wellのポリDリジン被覆ポリスチレンプレート(CORNING社)に10,000~20,000cells/wellの密度で播種した(100μl/well)。播種2~3時間後にLipofectamineTM LTX(Invitrogen, USA)を用いて各プラスミドを10ng/well、reagentを0.3μl/well、LTXを0.3μl/wellになるよう調製した(20μl/well)。3時間後、培地で2回洗浄し、1~2日後、以下のアッセイを行った。
(2)細胞内Ca2+ハイスループットスクリーニングによる神経活性化アッセイ
(2-1)スクリーニング対象物質
スクリーニング対象物質として精油33品・植物エキス178品・化合物98品の合計309品の物質を使用した。ラベンダーオイルを含む精油・エキス類については20%濃度でDMSOに溶解し-20度で保存した調製物、化合物については1%濃度で水、エタノール、DMSOのうち適した溶媒に溶解したのち-20度で保存した調製物を用いた。
(2-2)細胞内Ca2+濃度の測定
(1)で作成した細胞に(2-1)で作成した各スクリーニング対象物質の調製物を添加した場合の細胞内Ca2+濃度を測定するために、細胞内カルシウム濃度指示薬Calcium KitII-Fluo4(同仁化学)およびFDSS(Functional drug screening system, 浜松ホトニクス)を使用し蛍光強度を測定した。陽性対照として、和光純薬工業から購入したカプサイシン(034-11351)、シンナムアルデヒド(031-03453)、L-メントール(132-03752)を使用した。
測定開始から30秒後に上記調製物を添加し、測定開始から3分後に更に陽性対照を添加し、5分で測定を終了した。細胞に対する最終濃度は精油・エキス類については0.02%とした、化合物については0.001%となるようにし、その際の希釈にはBioMek(Beckman Coulter)を用いた。
(1)感覚神経細胞の培養
ヒトiPS細胞由来感覚神経前駆細胞(i-SNs, ax0055, Axol Bioscience, Cambridge, United Kingdom)を製造元の説明書に沿って培養した(図2A)。具体的には、これらの細胞をSure-Bond XF(ax0053)でコーティングした24 wellプレートにプレーティングし、25ng/mL GDNF、25ng/mL BDNF、10ng/mL NGF、及び10ng/mL NT-3を添加したSensory Neuron Maintenance Medium(SNMM, ax0060)にて培養した。培地の半量を3~4日毎に交換しつつ5週間培養し、感覚神経細胞に分化させた。5週間の培養後、培養液を収集し上清を得た。
(2)感覚神経細胞による刺激を与えた線維芽細胞におけるI型コラーゲン産生
(2-1)感覚神経細胞による刺激
線維芽細胞は、インフォームドコンセント後に得た新生児包皮線維芽細胞を分離させ、10%ウシ胎児血清を含有するダルベッコの改変イーグル培地(Life Technologies Japan Ltd.、東京、日本)にて37℃、95%大気および5%CO2の加湿雰囲気中で2日間増殖させた。上記(1)の方法で得た培養液の上清(300μl)を繊維芽細胞の培養液に1:1の割合で混合し、4時間培養し、下記(2-2)の方法によりコラーゲン産生を測定した。対照として、培養液の上清の代わりに上記に示したiPS細胞由来感覚神経前駆細胞用の培地を繊維芽細胞の培養液に1:1の割合で混合したものを用いた。
(2-2)定量的リアルタイムPCRによるI型コラーゲン産生の測定
血清飢餓後、神経細胞の培地上清の存在下または非存在下で4時間培養した線維芽細胞からRNeasy Mini Kit(250)(QIAGEN #74106)を用いて全RNAを単離した。定量的リアルタイムPCRにより、I型コラーゲンのmRNA発現量を測定した。具体的には、TaqMan RNA-to-C 1Step Kit(Applied Biosystems #4392938)、TaqManプローブおよびI型コラーゲンα1のプライマー(Hs00164004, Taqman, Applied Biosystems)を用いて実施した。内部対照としてβアクチン(Hs01060665)を用い、発現量はβアクチンに対し正規化して求めた。
次に、実施例1で神経活性化作用があると判断された物質が神経活性化を介して線維芽細胞のI型コラーゲンの産生を促進することを確認するために、濃度を変化させた各物質にて刺激した神経細胞を介する又は介さない場合のI型コラーゲン産生を測定した。
フランス バイヤン社から購入したラベンダーオイル(Lavandula vera DC.の花を水蒸気蒸留して得られた酢酸リナリルを30%以上含む精油)、並びに、和光純薬工業から購入したカプサイシン(034-11351)、シンナムアルデヒド(031-03453)を使用した。
(2)ヒトiPS細胞由来感覚神経前駆細胞の培養
実施例2と同じ材料および方法で5週間以上培養した神経前駆細胞の上清の全量(600μl)を回収し、上記(1)の試験物質を線維芽細胞を含む培地における最終濃度が0.25μMカプサイシン、125μMシンナムアルデヒド、0.005%ラベンダーオイルとなるように添加して調製した培地500μlを再び神経前駆細胞に加え、15分間インキュベーター内で静置した。その後、試験物質を含む上清を回収し、DMEMを加え、上清:DMEM=1:3の割合で混合した。実施例2と同様の方法にて12ウェルプレートで培養した繊維芽細胞に、上記混合物を1mlずつ適用し、4時間静置後RNAを回収した。対照として、上記試験物質を最終濃度が同じく0.25μMカプサイシン、125μMシンナムアルデヒド、0.005%ラベンダーオイルとなるように調製したDMEMを作製し繊維芽細胞に直接混合し、4時間静置後RNAを回収した。回収RNAについて実施例2と同様に定量的リアルタイムPCRによるI型コラーゲンの測定を行った。
実施例3の対象よりも高濃度の試験物質を用い直接添加による影響を調べた。具体的には、実施例3の試験物質を最終濃度が4倍の1μMカプサイシン、500μMシンナムアルデヒド、0.02%ラベンダーオイルとなるように添加した以外は実施例3の対照実験と同じ方法により直接線維芽細胞に適用しコラーゲンの測定を行った。
結果を図4に示す。図4に示すように、高濃度の試験物質では線維芽細胞のI型コラーゲン産生促進が見られた。しかしながら、その効果は低濃度では見られなかった(図3B)ことに鑑みると、線維芽細胞のI型コラーゲン産生がラベンダーオイルなどの神経活性化物質による神経活性化を介して促進されたことが示唆される。
プレートに播種したiPS細胞由来感覚神経前駆細胞に候補薬剤を含む溶液を注入する。この混合液の上清を繊維芽細胞に添加する。添加後のコラーゲン発現を定量的PCRで測定し、対照と比較することで候補薬剤の線維芽細胞におけるコラーゲン産生作用を決定することができる。コラーゲン発現促進を有する候補薬剤を、線維芽細胞I型コラーゲン産生促進剤としてスクリーニングすることができる。
Claims (6)
- 神経活性化を指標とした、線維芽細胞I型コラーゲン産生促進剤のスクリーニング方法。
- 前記スクリーニング方法が、
感覚神経細胞を候補薬剤に接触させて培養する工程、
前記細胞の神経活性を測定する工程、
候補薬剤の神経活性化作用に基づき、線維芽細胞I型コラーゲン産生促進剤を選択する工程、
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記神経活性化は、感覚神経細胞内の細胞内陽イオン濃度で測定される、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記神経活性化は、体性感覚神経受容器を活性化することにより達成される、請求項1~3のいずれか1項に記載のスクリーニング方法。
- 前記体性感覚神経受容器が、TRPA1、TRPM8、及び/又はTRPV1である、請求項4に記載の方法。
- 神経活性化剤を含む線維芽細胞I型コラーゲン産生促進剤であって、前記神経活性化剤はラベンダーオイルを含む、線維芽細胞I型コラーゲン産生促進剤。
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Title |
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村木克彦,皮膚に存在する環境センサーTRPVチャネルを介した保湿関連物質の分泌制御機構の解明,コスメトロジー研究報告,2013年09月01日,Vol.21,PP.114-116 |
藤田郁尚,皮膚感覚の分子メカニズムの化粧品への産業応用,生産と技術,2019年04月10日,Vol.71,No.2下巻,PP.61-64 |
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