JP6238958B2 - 分泌型免疫グロブリン複合体 - Google Patents

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Description

本発明は、ヒトの乳に由来しない分泌型免疫グロブリンに基づく免疫複合体調製物を産生する方法、該免疫複合体調製物および組換え分泌成分（Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）に関する。
分泌成分（ＳＣ）は、ポリマー性免疫グロブリン受容体（ｐＩｇＲ）の細胞外部分を含む分泌型免疫グロブリン（ＳＩｇＡおよびＳＩｇＭ）の構成要素である。ポリマー性ＩｇＡおよびＩｇＭは、Ｊ鎖によって仲介されて、上皮細胞の側底表面上のポリマー性免疫グロブリン受容体に結合し、そしてこれはトランスサイトーシスを通じて、細胞内に取り込まれる。受容体−免疫グロブリン複合体は、上皮細胞の管腔表面上に分泌される前に、受容体に付着したまま、細胞区画を通過する。受容体のタンパク質分解が起こり、そして二量体ＩｇＡ分子またはＩｇＭは、分泌成分とともに、遊離されて管腔全体に拡散する。
分泌成分は、唾液、涙、粘液および乳などの多様な身体の分泌物中に存在することが記載されてきている。これは、分泌型免疫グロブリン（ＳＩｇ、すなわちＳＩｇＡおよびＳＩｇＭ）ならびに遊離分泌成分（ｆＳＣ）の一部のいずれかとして見出されうる。
ヒト分泌成分（ｈＳＣ）は、トランスサイトーシスのプロセスにおいて、受容体分子の細胞外部分の切断によって、ポリマー性免疫グロブリン受容体から得られる。該分子は、約８０ｋＤａの見かけの分子量を有し、そして５つのＶ型免疫グロブリンドメインに配置されたｐＩｇＲ（ポリマー性Ｉｇ受容体）の最初の約５８５アミノ酸からなる。該分子は７つの潜在的なＮ−グリコシル化部位を有する。この強いグリコシル化は、大きな見かけの分子量に寄与する。これらのグリカンの組成には、二分岐および三分岐構造、ルイス型構造、ならびにガラクトースおよびシアル酸が含まれる。これらのグリカンは、細菌、ウイルス、真菌および原生動物構造、例えばアドヘシンおよび毒素、ならびにムチンおよび宿主組織上の受容体のための結合エピトープを構成する。
分泌成分の提唱される機能は、ポリマー性免疫グロブリンのタンパク質分解からの保護、ならびに病原体関連構造および毒素、例えばヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、腸管病原性大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよびストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）・コリン結合タンパク質Ａへの結合である。ＳＣ上のグリカンは、粘膜病原体に対する生得的な保護に関与することが立証されてきている（Ｐｅｒｒｉｅｒら ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ Ｖｏｌ． ２８１（２０）， ｐｐ． １４２８０−１４２８７， ２００６）。該著者らは、トランスフェクションされたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）から産生された組換えヒトＳＣが、ヒトの乳から精製されたＳＣと、完全に同じように振る舞うことを報告した。病原体抗原との相互作用は、ｈＳＣ上に存在するグリカンによって仲介され、そしてガラクトースおよびシアル酸残基を伴った。ｈＳＣは、身体の上皮表面を保護する抗病原性アーセナル（ａｒｓｅｎａｌ）に寄与する微生物スカベンジャーと同定された。
ヒトの乳から精製されたＳＣは、受容体へのクロストリジウム・ディフィシレ毒素Ａ結合を競合的に阻害することが見出された（Ｄａｌｌａｓら Ｊ． Ｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４７： ８７９−８８８（１９９８））。ＳＩｇＡおよびＳＣから、酵素消化によって炭水化物を取り除くと、クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ａは、グリコシル化ＳＣよりも脱グリコシル化ＳＣにはるかにより少なくしか結合しないことが示された。
ヒトＳＣは、レクチンおよび細菌アドヘシンに潜在的に結合可能な、異なるルイスおよびシアリル−ルイスエピトープのすべてを含む、広範囲のグリカン構造を提示する。ベータ１−４およびベータ１−３の両方でＧｌｃＮＡｃに連結されたグルコース；アルファ１−３およびアルファ１−４でＧｌｃＮＡｃに連結され、そしてアルファ１−２でガラクトースに連結されたフコース、ならびにアルファ２−３およびアルファ２−６の両方で連結されたシアル酸が見出されうる。ヒトの乳由来のＳＣのグリカンの５０％より多くが、多様なタイプの非コア・フコシル化を示し、最も豊富なフコース含有抗原はルイスｘである。ヒトＳＣにおいて、ルイス型フコシル化抗原の約３０％がシアル化されている。総合すると、ヒトの乳由来のＳＣは、５０より多い、異なるグリコフォームを示す。
ＳＣ上のグリカンの提唱される機能は、例えば
・粘液における分泌型免疫グロブリンの係留の仲介、
・分泌型免疫グロブリン／抗原複合体の特定の受容体（例えばＤＣ−ＳＩＧＮ）への結合の仲介、
・例えば病原性毒素、ウイルスおよび細菌によって発現されるレクチン様受容体に関するデコイとして作用することによる、宿主細胞への病原体構造結合の競合的阻害剤（「デコイ」）としての作用、
・プロテアーゼに対する分泌型免疫グロブリンおよびＳＣの防御
である。
天然ＳＣに見られる多数のグリカン構造は、多数の機能を反映する可能性もある。しかし、分泌型免疫グロブリンの特定の療法的および予防的使用のためには、分泌型免疫グロブリンの調製におけるグリカン集団の複雑性を減少させることが好適でありうる。特定のグリカン構造および修飾に向かうバイアスは、有効性を増加させ、そして／またはこうした分泌型免疫グロブリン調製物の潜在的な副作用を減少させる可能性もある。
ヒト分泌成分は、多様な遺伝子操作生物および細胞、例えば細菌（大腸菌）、昆虫細胞（Ｓｆ９細胞）、哺乳動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞、アフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ ｇｒｅｅｎ ｍｏｎｋｅｙ）腎臓ＣＶ−１細胞、ヒト骨肉腫細胞ＴＫ−１４３Ｂ、ヒトＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ヒト腺癌細胞ＨＴ２９、マウス線維芽細胞、マディン・ダービー（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ）イヌ腎臓細胞）および植物において組換え的に発現されてきている（例えば、ＵＳ２００８０２６０８２２、ＥＰ７９９３１０、Ｍｉｃｈｅｔｔｉら １９９１ Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ， ｖｏｌ ３１０， ｐｐ １８３−５； Ｓｕｇｕｒｏら ２０１１， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ． Ｖｏｌ． ７８， ｐｐ １４３−８； Ｐｒｉｎｓｌｏｏら ２００６ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ． ｖｏｌ ４７， ｐｐ １７９−８５； Ｏｇｕｒａ， ２００５， Ｊ Ｏｒａｌ Ｓｃｉ． ｖｏｌ ４７， ｐｐ １５−２０； Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら ２００３ Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｖｏｌ ５８， ｐｐ ４７１−６； Ｊｏｈａｎｓｅｎら １９９９ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．， Ｖｏｌ ２９， ｐｐ １７０１−８； ＣｈｉｎｔａｌａｃｈａｒｕｖｕおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ １９９９， Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｖｏｌ ４， ｐｐ １６５−７４； ｄｅ Ｈｏｏｐら １９９５． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． Ｖｏｌ １３０， ｐｐ １４４７−５９； Ｌａｒｒｉｃｋら ２００１ Ｂｉｏｍｏｌ Ｅｎｇ． Ｖｏｌ １８， ｐｐ ８７−９４； Ｂｅｒｄｏｚら １９９９， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ｖｏｌ ９６， ｐｐ ３０２９−３４； Ｒｉｎｄｉｓｂａｃｈｅｒら １９９５， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ｖｏｌ． ２７０， ｐｐ１４２２０−８）。
組換えＳＣ上に見られるグリカンパターンは、宿主種、宿主生物、起源の組織および遺伝子操作細胞の生理学的状態に応じる。
大腸菌は、Ｎ−グリコシル化タンパク質をまったく産生できず、一方、組換えＳＣを発現させるためにこれまでに用いられた他の宿主の大部分は、ルイスｘフコシル化を生じることができない（Ｓｆ９細胞、植物細胞、ＨｅＬａ、ＣＨＯ細胞、ＣＶ−１細胞、１４３Ｂ細胞、ＢＨＫ細胞、マウス線維芽細胞、ＭＤＣＫ細胞）。記載する条件下では、ＨＴ−２９はＮ−グリカン上でルイス抗原を効率的に産生しない。グルコース中で培養されるＨＴ−２９は、未分化多能性移行細胞の特性を有し、非常に不安定であるが、高マンノースから複合体糖タンパク質への変換は、研究した増殖期に関わらず、分化非許容性条件で増殖させたＨＴ−２９細胞（ＨＴ−２９ Ｇｌｃ＋）では、非常に減少する。
母乳中の炭水化物エピトープは、種間で異なることが知られており、ヒトの乳は、最も複雑なものを発現する。Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎら（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ２２： １０９−１１８（２００５））は、ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ヒトコブラクダ（ｄｒｏｍｅｄａｒｙ）およびウサギ由来の個々の乳試料中の、タンパク質に結合した炭水化物エピトープの発現を調べた。
ＳＣ上で見られるグリカンのパターンは、宿主種、宿主生物、起源の組織および生物の生理学的状態（例えば健康状態、泌乳期）に応じる。
Ｘｕら（Ｗｏｒｌｄ Ｊ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． １０（１４） ２０６３−２０６６（２００４））は、トランスジェニックヤギから得られたフコシル化乳の影響を分析する。ヒトアルファ１−２／４フコシル−トランスフェラーゼ遺伝子がヤギ乳腺において一過性に発現され、「ヒト化」ヤギ乳が産生された。ヤギ乳試料は、ルイスｂ抗原への細菌結合を阻害することが見出された。
ＷＯ９５／２４４９５Ａ１は、ヒトグリコシルトランスフェラーゼを発現するトランスジェニック哺乳動物の乳における、オリゴ糖および複合糖質のトランスジェニック産生を記載する。
Ｇｒａｂｅｎｈｏｒｓｔら（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊｏｕｒｎａｌ １９９９， １６（２）： ８１−９７）は、頻繁に用いられる宿主細胞における組換え糖タンパク質の遺伝子操作、例えばグリコシルトランスフェラーゼでのＣＨＯ細胞のトランスフェクションを記載する。
Ｐｏｒｔｅｒ Ｐ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９７３， ２４（１） １６３−１７６）は、ブタ乳由来のブタ分泌成分および分泌型ＩｇＡの精製を記載する。
Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎら（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ２００５， ２２（３） １０９−１１８）は、ヒトおよび動物乳タンパク質のルイス型Ｎ−グリコシル化を記載する。
ｐＩｇＲ−ｐＩｇ複合体は、細胞を渡ってトランスサイトーシスされ、そして管腔表面で、ｐＩｇＲは、細胞膜に隣接した４２アミノ酸領域内でプロテアーゼによって切断され、したがって、ＳＩｇを管腔内に放出する。
ｐＩｇＲの切断された細胞外部分は、ｐＩｇに結合したままであり、そして本明細書において、分泌成分（ＳＣ）と称される。ｐＩｇＲはまた、ｐＩｇが結合していない場合であっても、粘膜内に輸送されることも可能であり、したがって、大部分の外分泌液は、ＳＩｇ内に結合したＳＣおよびまた遊離ＳＣの両方を含有する。
正確な切断部位はなお曖昧であるが、これはヒトＳＣが、Ａｌａ−５５０からＬｙｓ−５５９で多様な不規則なＣ末端を有することが見出されているためであり、Ｓｅｒ−５５２が主なＣ末端残基である。
ｐＩｇＲの切断後、さらなるタンパク質分解が生じうる可能性がある。異なる粘液由来の遊離ＳＣがわずかに異なる分子量を有するようであるという事実は、ｐＩｇＲからの遊離ＳＣの放出後、タンパク質分解がｉｎ ｖｉｖｏで起こることを示唆している可能性もある。
初乳由来の遊離ＳＣは、ｄＩｇＡに結合したＳＣがおよそ８０ｋＤａであるのに比較して、およそ７６．５ｋＤａの分子量を有する。相違は、ポリペプチド鎖の長さの相違に起因することが示されてきている。しかし、ポリマー性免疫グロブリンに結合した乳由来ＳＣのＣ末端に関しては明確なコンセンサスはない。
一般的に、ＳＩｇＡ１およびＳＩｇＡ２中のＳＣが、遊離ＳＣに比較してより大きなサイズであるのは、前者に二量体ＩｇＡが存在するためであり、該二量体ＩｇＡはｐＩｇＲがトランスサイトーシス後に切断された際にＳＣのＣ末端リンカーをシールドする可能性もある。二量体ＩｇＡによるこのシールドは、同様の環境において、遊離ＳＣが切断されている場合は存在しないであろう。
ヒト初乳および乳には、プロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤の両方が豊富である。プロテアーゼに対する阻害剤の比は、活性プロテアーゼが存在しているかどうかを定義する。この比は、誕生後の時間とともに顕著に変化し、そして異なる個体で異なるようである。遊離ＳＣ Ｃ末端リンカーペプチドは、プロテアーゼに非常に感受性であるため、初乳および乳遊離ＳＣに関して「正しい」Ｃ末端はないことも十分ありうる。さらに、乳腺以外の他の組織（例えば腸、気管支、鼻組織）由来のＳＣに関するＣ末端は、ｐＩｇＲからの異なる酵素切断によって、あるいは遊離ＳＣまたはｐＩｇ結合ＳＣをトリミングする異なるプロテアーゼの存在によってのいずれかで、異なるＣ末端を示す可能性もある。
粘膜部位（眼、鼻、口、肺、耳、気管、食道、胃管、腸、泌尿生殖器管および結腸）で、ヒトの感染に対して防御するための最も重要な分子の１つは、分泌型ＩｇＡであり、これは４つの抗原結合部位を通じて、ならびに分泌成分のグリカン仲介性結合を通じての両方で作用しうる。
多くの研究によって、分泌物中の特異的ＳＩｇＡ抗体の力価および感染に対する耐性間に強い相関が立証されている。いくつかの研究によって、莢膜形成細菌病原体への全身曝露に対する防御が立証されている。
正常な被験体由来の唾液および初乳は、多様な自己抗原およびいくつかの細菌抗原を認識する、多重反応性ＳＩｇＡ抗体を含有する。これらがＢ−１細胞の産物であり、生殖系列においてコードされる「自然抗体」の一部を構成し、そして記憶能およびアフィニティ成熟を欠くことが示唆されてきている。これらの抗体は、名目上の抗原への曝露後、慣用的Ｂ−２細胞由来の特異的抗体の生成前に、粘膜表面の防御を提供しうる。これらは抗原に対して低い内在性アフィニティを有するが、ＳＩｇＡにおける４つの抗原結合部位の存在は、その機能的活性を増加させる。実際、これらの天然存在多重反応性抗体による認識を回避することが可能であるため、細菌アドヘシンが発展してきたことを示唆する証拠がある。
ヒトにおいて、２つのユニークなＩｇＡサブクラス（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）がある。ヒトＩｇＡ２の２または３つのアロタイプが記載されてきている（アルファ重鎖の定常領域ドメインの異なる組み合わせ）。二量体（ポリマー性）ｐＩｇＡが上皮において産生され、そしてＳＩｇＡとして分泌物内に輸送されるのとは対照的に、循環（血漿）ＩｇＡの主な分子型は単量体である。
ヒトＩｇＡ１およびＩｇＡ２（アロタイプを含む）は、あるとしてもわずかしか別個の生物学的特性を持たないようであるが、細菌プロテアーゼに対する感受性には、ＩｇＡサブクラス間で相違がある点に顕著な例外が見出される。ＩｇＡ１およびＩｇＡ２はまた、抗体特異性の分布も異なる。
タンパク質抗原での成人の免疫は、主にＩｇＡ１を誘発し、そして多糖での免疫は、主に、ＩｇＡ２抗体反応を誘起する。粘膜表面に到達する免疫グロブリンアイソタイプのうち、ＳＩｇＡは、最も安定なものの１つであり、そしてこの安定性は、主に、Ｆｃ部分内の潜在的な切断部位をマスキングするＳＣに帰されてきた。
咽頭、腸、泌尿生殖器管および歯肉上皮への接着を阻害するための、微生物表面の表面構造に対するＳＩｇＡ抗体の特異性が立証された。接着の特異的抗体仲介性阻害に加えて、ヒトＩｇＡ、および特にＳＩｇＡは、その炭水化物鎖によって、多くの細菌種および抗原に結合する。この注目すべき例が、ＩｇＡ２の場合に見られ、大腸菌の上皮細胞への、Ｉ型（マンノース依存性）線毛およびＩ型線毛依存性接着を伴う機構によって、大腸菌を凝集させうる。
外分泌におけるＩｇＭもまた、ｐＩｇＲによる分泌物内への輸送から生じる、分泌成分（分泌型ＩｇＭ、ＳＩｇＭ）と関連する。粘膜組織中のＩｇＭ産生細胞の比率がより低いため、またはｐＩｇＲ依存性輸送における分子量制限により、ｐＩｇＡよりもＩｇＭがより劣って輸送されうるためのいずれかにより、ＳＩｇＭの濃度はＳＩｇＡのものより低い。
自然抗体は、定義により、抗原刺激が見かけ上存在しない際に産生される。これらは、Ｂ細胞の特異的サブセットによって産生され、そしてさほどアフィニティ成熟しない。クラスＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧの自然抗体が記載されてきている。これらの抗体は、通常、生殖系列遺伝子によってコードされ、あるとしてもわずかな突然変異しかなく、そして多くの場合、ＰＡＭＰ（病原体関連分子パターン）、腫瘍抗原、および多くの自己抗原に対する広い反応性を有する。アフィニティが低く、そして生殖系列配置であるため、こうした多重反応性抗体は、真の自己抗体ではないようであり、そして確かに、抗原特異的、体細胞突然変異性、高アフィニティ病原性自己抗体と同じカテゴリーには適合しない。
自然抗体は、生得的免疫系の一部と見なされる。これらは、特定の療法使用、例えば癌療法または感染性疾患における使用のために提唱されてきている。
多くの多重反応性抗体は、生殖系列配列または生殖系列に近い配列を有し、そして主にＩｇＭであるが、いくつかはまた、ＩｇＧおよびＩｇＡである。
抗原−抗体相互作用の古典的「鍵と鍵穴」の堅固な構造仮説とは対照的に、多重反応性抗体の抗原結合ポケットは、おそらくその生殖系列配置のため、より柔軟であると考えられ、そしてしたがって、異なる抗原配置に順応可能である。
いくつかの報告は、ＳＩｇＡが、事実上、多重反応性であると示唆してきているが、他の知見は、交差反応性でありうる制限された特異性を指摘する。
ＷＯ２００９１３９６２４Ａ１は、非ヒト乳を分画することによって、分泌型ＩｇＡが豊富な組成物を産生するためのプロセスを開示する。こうした組成物は、特に、粘膜表面、例えば胃腸管、泌尿生殖器管、呼吸管、鼻腔または口腔の感染および／または炎症を治療しそして／または防止するため、肥満および関連疾患を治療しそして／または防止するため、あるいはこうした治療が必要な被験体において食物アレルギーを治療しそして／または防止するために、使用可能である。
ヒト乳が、多量のルイス・グリコシル化複合糖質、例えば糖タンパク質（例えばＳＩｇＡおよびＳＣ）を含有することが周知であり、そしてヒト乳の価値の１つが、抗体、グリカン、オリゴ糖および他の活性物質、例えばリゾチームおよびラクトフェリンによって、感染に対して高い防御能を持つことであることがよく認められている。ヒト乳の分析によって、７５％のフコシル化分布が明らかになったが、ウシ乳分析では、３１％のフコシル化分布しか観察されなかった。ウシ乳分析においては、コア・フコシル化しか検出されてきていない。
特定のグリコシル化を伴うヒト分泌型免疫グロブリンが、病原体構造、ムチン、および受容体への結合に関して、好適な効果を持つことが立証されてきているが、これらは望ましい品質で大規模に産生されることがいまだに可能ではなかった。倫理的理由のため、ヒトの乳は典型的には適切な供給源材料とは見なされない。
ＵＳ２００８０２６０８２２ ＥＰ７９９３１０ ＷＯ９５／２４４９５Ａ１ ＷＯ２００９１３９６２４Ａ１
Ｐｅｒｒｉｅｒら ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ Ｖｏｌ． ２８１（２０）， ｐｐ． １４２８０−１４２８７， ２００６ Ｄａｌｌａｓら Ｊ． Ｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４７： ８７９−８８８（１９９８） Ｍｉｃｈｅｔｔｉら １９９１ Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ， ｖｏｌ ３１０， ｐｐ １８３−５ Ｓｕｇｕｒｏら ２０１１， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ． Ｖｏｌ． ７８， ｐｐ １４３−８ Ｐｒｉｎｓｌｏｏら ２００６ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ． ｖｏｌ ４７， ｐｐ １７９−８５ Ｏｇｕｒａ， ２００５， Ｊ Ｏｒａｌ Ｓｃｉ． ｖｏｌ ４７， ｐｐ １５−２０ Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら ２００３ Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｖｏｌ ５８， ｐｐ ４７１−６ Ｊｏｈａｎｓｅｎら １９９９ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．， Ｖｏｌ ２９， ｐｐ １７０１−８ ＣｈｉｎｔａｌａｃｈａｒｕｖｕおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ １９９９， Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｖｏｌ ４， ｐｐ １６５−７４ ｄｅ Ｈｏｏｐら １９９５． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． Ｖｏｌ １３０， ｐｐ １４４７−５９ Ｌａｒｒｉｃｋら ２００１ Ｂｉｏｍｏｌ Ｅｎｇ． Ｖｏｌ １８， ｐｐ ８７−９４ Ｂｅｒｄｏｚら １９９９， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ｖｏｌ ９６， ｐｐ ３０２９−３４ Ｒｉｎｄｉｓｂａｃｈｅｒら １９９５， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ｖｏｌ． ２７０， ｐｐ１４２２０−８ Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎら（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ２２： １０９−１１８（２００５）） Ｘｕら（Ｗｏｒｌｄ Ｊ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． １０（１４） ２０６３−２０６６（２００４）） Ｇｒａｂｅｎｈｏｒｓｔら（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊｏｕｒｎａｌ １９９９， １６（２）： ８１−９７） Ｐｏｒｔｅｒ Ｐ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９７３， ２４（１） １６３−１７６）
本発明の目的は、産業規模で高品質の分泌型免疫グロブリン調製物を産生するための改善された方法を提供することである。さらに、本発明の目的は、粘膜適用に特に適した、改善されたＳＣおよび免疫複合体調製物を提供することである。
この目的は、請求項の主題によって解決されてきている。
本発明にしたがって、非ヒト分泌物由来である、分泌型免疫グロブリンに基づく免疫複合体調製物を産生する方法であって
Ｎ−グリコシル化分泌成分を産生することが可能な、産業規模の産生系を提供し、
こうした系によって、分泌成分モルあたり、少なくとも０．０１モルの非コア・フコースを含む分泌成分を産生し、そして
前記分泌成分を、天然グリコシル化パターンを有するＩｇＡまたはＩｇＭ免疫グロブリンの少なくとも１つと組み合わせて、特に天然Ｎ−グリコシル化パターンの、免疫複合体を得る
工程を含む、前記方法を提供する。こうした免疫複合体調製物は、本明細書において、特に、生得的免疫複合体調製物と理解され、これは哺乳動物の自然免疫系を特異的に支持するであろう。
非コア・フコースは、ルイスエピトープを特異的に提供する。したがって、本発明記載の免疫複合体は、本明細書において、また、分泌成分モルあたり、少なくとも０．０１モルのルイスエピトープを含むとも称される。しかし、大部分の場合、ＳＣの非コア・フコシル化は、適切なアッセイにおいて決定される。
産生系は、適切な分析手段、例えば電気泳動、クロマトグラフィー、質量分析、化学的および酵素的技術またはその組み合わせによって決定されるような、ルイス型Ｎ−グリコシル化タンパク質、特に末梢またはアンテナ、例えば外側アームフコシル化を持つ分泌成分を産生することが可能であることが好ましい。
特に、本発明は、哺乳動物起源、特にヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、非ヒト霊長類、ブタ、ラクダ（ｃａｍｅｌ）、ヒトコブラクダ、ロバまたはウマのアミノ酸またはヌクレオチド配列、あるいはそのキメラ配列から得られる、分泌成分を提供する。
特に、本発明記載の方法は、乳腺分泌物のプールした供給源および組換え細胞培養より選択される産生系を使用する。
特定の態様において、前記分泌成分は、ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、非ヒト霊長類、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ワラビー（ｗａｌｌａｂｙ）、フクロネズミ（ｐｏｓｓｕｍ）、パンダ、魚類、ニワトリ、鳥類、カエルなどの種のアミノ酸またはヌクレオチド配列、あるいはそのキメラ配列から得られる。好ましくは、分泌成分は、哺乳動物起源、特にヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、非ヒト霊長類、ブタ、ラクダ、ヒトコブラクダ、ロバまたはウマのアミノ酸またはヌクレオチド配列、あるいはそのキメラ配列から得られる。
好ましい方法において、分泌成分は、産生系の分画、例えば乳分画中に濃縮され、そして場合によって前記分画から単離される。特に、本発明の分泌成分調製物は、こうした濃縮分画より得られる。特に、前記分泌成分は、免疫複合体として、分画中に濃縮される。
特定の方法にしたがって、前記分泌成分は、泌乳期の少なくとも１０の雌性個体から得られる、乳、乳濃縮物、粉乳、ホエイ、ホエイ濃縮物およびホエイ粉末からなる群より選択される、プールした供給源から得られる。
本発明記載の免疫複合体調製物は、乳、唾液、または粘膜排出物などの分泌物のプールから選択される場合、特に、多様なＣ末端を持つＳＣ混合物を含有する。
具体的には、前記個体は、非トランスジェニックであり、そしてヤギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ロバ、ヒトコブラクダおよびラクダからなる群より選択される種であり、ヤギ、ブタ、ウシおよびヒツジが好ましい。
好ましくは、前記個体は、ルイス型Ｎ−グリコシル化を含む糖タンパク質を産生する能力に関して、集団から選択される。特異的選択は、天然Ｎ−グリコシル化タンパク質、すなわち非組換えタンパク質を発現する能力に関して、集団または群れから行われてもよい。こうした個体は、「ヒト様」ＳＣを産生するが、グリコシル化パターンに不必要な変化を含有するであろう「ヒト化」乳を産生しないであろう。例えば、こうした個体は、ＳＣ上のルイスエピトープを含む天然グリコシル化パターンを持つ、特に非コア・フコースまたは末梢フコシル化におけるルイスエピトープを持つが、免疫グロブリン重鎖のＮ−グリコシル化部位には持たない、免疫複合体を発現する、天然Ｎ−グリコシル化タンパク質を産生するよう選択される。
天然グリコシル化免疫グロブリンは、コア・フコシル化Ｎ−グリカンしか持たない。これは、異種グリコシルトランスフェラーゼを発現するトランスジェニック動物由来の免疫グロブリンとは対照的であり、こうした酵素は、過剰な非コアまたは末梢フコシル化およびルイスエピトープを含む免疫グロブリン調製物を生じるであろう。
ヒトまたは動物由来の天然グリコシル化パターンを持つ、本発明にしたがった免疫複合体調製物を得る努力において、こうした調製物は、非組換えタンパク質に基づくか、または異種グリコシルトランスフェラーゼを発現しているこうしたトランスジェニック動物から得られたのではないことが好ましい。
例えば、個々の哺乳動物または細胞が、ＳＣ上にルイス型Ｎ−グリコシル化、特に非コア・フコシル化またはルイス型グリコシル化を含む糖タンパク質を産生する能力にしたがって、選択を行う。
好ましくは、非コア・フコースの相対含量は、少なくとも０．０１モル／モルＳＣ、好ましくは少なくとも０．０２モル／モルＳＣ、より好ましくは少なくとも０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、または０．１モル／モルＳＣ、より好ましくは少なくとも０．２、０．３、０．４、または０．５モル／モルＳＣ、さらにより好ましくは少なくとも１モル／モルＳＣまたはさらに高く、例えば少なくとも２モル／モルＳＣ、少なくとも３モル／モルＳＣ、少なくとも４モル／モルＳＣ、少なくとも５モル／モルＳＣ、少なくとも６モル／モルＳＣ、少なくとも７モル／モルＳＣ、少なくとも８モル／モルＳＣ、少なくとも９モル／モルＳＣ、または少なくとも１０モル／モルＳＣである。
特定の場合、Ｎ−グリコシル化部位の理論的な数は、２（魚類）、３（ウシ）、４（ウマ、イヌ、ラット）、５（ニワトリ、オランウータン（ｏｒａｎｇ−ｕｔａｎ）、ブタ）、６（チンパンジー（ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ）、カエル）、または７（ヒト、マウス、軟骨魚類）モル／モルＳＣに達する。本発明にしたがって、非コア・フコースまたはルイスエピトープの量が、Ｎ−グリコシル化部位の理論値の少なくとも１％、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０％、より好ましくは理論値までの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％に達することが特に好ましい。非コア・フコースの量は、例えばＮ−グリコシル化部位あたりの多重フコシル化を通じて、Ｎ−グリコシル化部位の理論量を超過してもよく、それによって、モル濃度に基づくＮ−グリコシル化部位の数より多いルイスエピトープを得てもよい。特に好ましい場合、非コア・フコースまたはルイスエピトープの量は、Ｎ−グリコシル化部位の理論量の少なくとも１．１倍、好ましくは少なくとも１．２倍、または少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、または少なくとも２倍であり、特定の場合、量はさらに高く、例えば少なくとも３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍、または少なくとも６倍、または少なくとも７倍、または少なくとも８倍、または少なくとも９倍、例えば最大１０倍である。
より低い閾値、例えばモルＳＣあたり少なくとも０．０１モルの非コア・フコースの閾値は、特にウシまたは反芻動物のＳＣ調製物が高品質であることを反映するが、より高い閾値、例えば少なくとも０．１または少なくとも０．５、さらに少なくとも１．０モル／モルの閾値は、ウマ、ロバまたはブタのような供給源から得られる高品質のＳＣ調製物に適用可能でありうる。
調製物における非コア・フコシル化の度合いは、高い非コア・フコシル化を持つＳＣ（ＳＣのモルあたり）に関する選択によって増加させうる。これを、産生宿主の選択（細胞株、微生物クローンまたは生物に関するこうしたスクリーニング）のレベルで行うことも可能であるし、またはこれらの試料のその後のプールのため、高いモル濃度の非コア・フコシル化を持つＳＣを含有する分泌物を提供するように選択される、個々のドナーのレベルで行うことも可能である。本発明のＳＣまたは免疫複合体の調製物の酵素的または化学的フコシル化によって、フコシル化を増加させてもよい。
特定の態様にしたがって、ＳＣおよび／または免疫グロブリンは、中間体として提供される、望ましい品質のＳＣおよび／または免疫グロブリンを含むプールされた供給源から得られる。こうした中間体は、プールされ、そして乾燥した乳またはホエイ粉末、例えば凍結乾燥またはスプレー乾燥されたもの、あるいは血漿免疫グロブリンを含有する血漿プールまたはプールされた血漿分画より選択されることも可能である。次いで、中間体をさらにプロセシングして、ＳＣおよび／または免疫グロブリン分画を、例えば少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも２０倍またはさらにより高く、濃縮してもよい。
ＳＣおよび／またはＳＩｇＡが濃縮された本発明記載の特異的調製物は、特に、少なくとも２０％のＳＣおよび／またはＳＩｇＡ、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％（ｗ／ｗ総タンパク質）を含む。
ＳＩｇＡまたはＳＩｇＭ免疫複合体は、特に、好ましくは非組換え体である免疫複合体のＩｇＡまたはＩｇＭ構成要素に関して、好ましくは、組換え供給源、例えばトランスジェニック動物または遺伝子操作細胞から全てを得ることは好ましくないが、特定の態様にしたがって、分泌成分は、組換え宿主細胞から得てもよく、例えば自己または異種Ｎ−グルコシルトランスフェラーゼ、および特にフコシルトランスフェラーゼを発現している宿主細胞、好ましくは、ヒト細胞株、哺乳動物細胞株、鳥類細胞株、細菌、植物、酵母、昆虫、真菌、蘚類および古細菌からなる群より選択される、自己または異種機能性アルファ−１，ｘ−フコシルトランスフェラーゼ、ここでｘは２、３または４である、を発現している、好ましくは組換え産生宿主細胞株から得てもよい。
特定の側面にしたがって、本発明は、ルイス型Ｎ−グリコシル化パターンおよびモル分泌成分あたり少なくとも２モルの非コア・フコースを有する、配列番号１のアミノ酸配列またはその機能的に活性である変異体を含む、単離された組換え分泌成分を提供する。特に、組換えＳＣは、ヒトＳＣ配列、またはヒトＳＣ起源の配列を含む。好ましい態様にしたがって、組換えＳＣは、ヒトＳＣまたはその機能的に活性である変異体である。
特に、本発明の組換え分泌成分は、シアル酸、好ましくはモル分泌成分あたり少なくとも２モルのシアル酸を含む。より具体的には、組換えＳＣは、モルＳＣあたり少なくとも２モルのシアリルルイスｘを含む。
あるいは、本発明の組換え分泌成分は、非シアル化であり、好ましくはモル分泌成分あたり０．１モル未満のシアル酸を含む。
組換えＳＣは、ｐＩｇＲ、例えばヒトｐＩｇＲのいずれかの完全遺伝子を宿主細胞内に導入し、続いて膜貫通タンパク質ｐＩｇＲを発現させた後、細胞外部分、ＳＣを切断し、そして培養上清内に遊離させることによって産生可能である。代替発現は、ＳＣの、すなわち細胞外ドメインのみの、例えば配列番号１のアミノ酸配列をコードする、ヌクレオチド配列の転写である。すべての場合で、組換えＳＣの発現によって、最終産物の均質なＣ末端を保証する、産生条件の正確な選択を可能にする。
これはまた、必要に応じて、翻訳終結部位を選択することも可能にする。好ましくは、発現しようとするＳＣ遺伝子上の停止コドンは、最後の細胞外免疫グロブリン様ドメイン（ドメイン５）をコードする領域および膜貫通領域の間に位置する。しかし、本発明の組換えＳＣは、ポリマー性免疫グロブリンに結合可能であり、そして必要なレベルの非コア・フコースを含有する限り、さらにより短くてもよい。
配列番号１の最初の１８アミノ酸は、シグナルペプチドを含み、これは、用いる宿主細胞または生物および必要な分泌効率に応じて、異なるシグナルペプチドによって置換されてもよい。ＳＣの化学合成による産生または細胞内産生に関しては、シグナルペプチドは必要ではない（例えば大腸菌封入体における非グリコシル化型の産生のため）。また、配列番号１のＣ末端にさらなるアミノ酸を含有するように、該タンパク質を修飾してもよい。
それぞれ、アミノ酸Ｇ５４５のコドンの後で、好ましくはＫ５６６およびＥ６０７の間の任意のアミノ酸部位で（これらの部位を含む）、より好ましくはＲ６０３およびＥ６０７の間（これらの部位を含む）、またはＥ６０７の後で、核酸中の必要な位で、停止コドンによって、タンパク質を終結させてもよい。最も好ましくは、ＳＣはＲ６０３の後で終結する。番号付けは配列番号１を指す。
好ましくは、本発明のＳＣ調製物は均質であり、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、最大１００％のＳＣ分子が同じＣ末端を有する。
組換えＳＣのグリカンパターンは、宿主種、宿主生物、起源の組織および遺伝子操作細胞の生理学的状態に応じる。
好ましくは、宿主細胞は、ヒト細胞、例えばＰｅｒＣ．６、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ネズミ細胞、鳥類細胞株、細菌、酵母、真菌、植物および昆虫細胞からなる群より選択される。組換えＳＣは、望ましい非コア・フコシル化またはルイス型Ｎ−グリコシル化を伴って得られてもよい。好ましくは、宿主細胞は、非コアＮ−グリコシル化フコシル化を産生する、必要なグリコシル−トランスフェラーゼを発現するよう選択されるかまたは修飾される。例えば酵素的または化学的または化学酵素的技術によって、組換えＳＣを発現させた後、非コア・フコシル化を導入するかまたは増加させてもよい。
高い非コア・フコシル化（ＳＣモルあたり）を伴うＳＣを選択することによって、本発明の調製物における非コア・フコシル化の度合いを増加させてもよい。これは、産生宿主の選択レベルで実行可能であり（細胞株、微生物クローンまたはトランスジェニック生物に関するこうしたスクリーニング）、これはまた、これらの試料のその後のプールのため、高いモル濃度の非コア・フコシル化を伴うＳＣを含有する分泌物を提供するよう選択される個々のドナーのレベルでも実行可能である。本発明のＳＣまたは自然免疫複合体の調製物の酵素的または化学的フコシル化によって、フコシル化を導入するかまたは増加させてもよい。
好ましくは、本発明にしたがって用いられるような、ＳＣ上のルイスｘエピトープの相対含量は、少なくとも０．０１モル／モルＳＣ、好ましくは少なくとも０．０２モル／モルＳＣ、より好ましくは少なくとも０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、または０．１モル／モルＳＣ、より好ましくは、少なくとも０．２、０．３、０．４、または０．５モル／モルＳＣ、さらにより好ましくは少なくとも１モル／モルＳＣまたはさらにより高く、例えば少なくとも２モル／モルＳＣ、３モル／モルＳＣ、４モル／モルＳＣ、５モル／モルＳＣ、６モル／モルＳＣ、７モル／モルＳＣ、８モル／モルＳＣ、９モル／モルＳＣ、または少なくとも１０モル／モルＳＣである。
例えば組換えＳＣ調製物中の、特に好ましい単離された組換えＳＣは、ルイス型Ｎ−グルコシル化パターン、およびモル分泌成分あたり少なくとも２モルの非コア・フコースを有する。
特に、該ＳＣは、モルＳＣあたり少なくとも２モルのルイスｘエピトープを含み、いくつかの場合、少なくとも６モル／モルを含む。
特に、該ＳＣはシアル酸、好ましくはモル分泌成分あたり少なくとも２モルのシアル酸を含む。特に、該ＳＣは、モル分泌成分あたり少なくとも２モルのシアリルルイスｘを含む。
あるいは、組換えＳＣは、特に非シアル化であり、好ましくはモル分泌成分あたり０．１モル未満のシアル酸を含む。
特定の側面にしたがって、本発明の組換え分泌成分、およびＩｇＡまたはＩｇＭ免疫グロブリン、好ましくはヒト免疫グロブリンの少なくとも１つを含む、免疫複合体調製物を提供する。特に、免疫グロブリンは、例えばヒト血漿または血漿分画由来の、血漿免疫グロブリンである。
本発明にしたがって、ヒト分泌物以外の供給源から得られる、分泌型免疫グロブリンに基づく免疫複合体調製物であって、
ルイス型Ｎ−グルコシル化パターンおよびモル分泌成分あたり少なくとも０．０１モルのルイスエピトープを持つ、分泌成分、ならびに
天然グリコシル化パターンを有するＩｇＡまたはＩｇＭ免疫グロブリンの少なくとも１つ
を含む、前記免疫複合体調製物をさらに提供する。
本発明にしたがった調製物は、特に、ポリマー性免疫グロブリン、例えば二量体、または五量体または他のポリマー性免疫グロブリン、例えば二量体ＳＩｇＡまたは五量体ＳＩｇＭを含む。好ましくは、免疫グロブリンは、動物乳、初乳、あるいは乳または初乳分画または濃縮物のいずれか、および血漿またはその分画から得られる。
特に、本発明記載の調製物は、多重反応性免疫グロブリン、好ましくは天然免疫グロブリンを含み、生殖系列抗体を含む。
特定の態様にしたがって、液体、エマルジョンまたは懸濁物の型の、あるいは乾燥型、好ましくはスプレー乾燥または凍結乾燥型の、本発明の単離されたまたは精製された（組換え）分泌成分あるいは本発明の免疫複合体調製物を含む配合物をさらに提供する。
本発明記載の配合物は、特に、乳製品のような天然配合の形で提供されてもよく、この場合、免疫複合体は、天然背景中で、例えば乳、あるいは乳製品、例えばチーズ、ヨーグルト、ホエイ、ホエイ濃縮物、あるいはそうでなければ単離されたまたは精製されたＳＣまたは免疫複合体を含む合成配合物中で提供される。特に、本発明記載の配合物は、液体、シロップ、ロゼンジ、錠剤、例えば発泡錠、スプレー、吸入具配合物、粉末、即席粉末、顆粒、座薬、カプセル、クリーム、ペースト、ジェル、ドロップ、懸濁物、エマルジョン、または乳製品およびチューインガムを含む食品の型で提供されうる。
好ましくは、配合物は粘膜使用のための、特に経口使用のための配合物である。
さらなる特定の態様にしたがって、本発明は、免疫グロブリン不全、例えば選択的ＩｇＡ不全、選択的ＩｇＭ不全、またはＣＶＩＤ、特に粘膜免疫グロブリン不全の療法または予防において使用するための、好ましくは粘膜適用、好ましくは経口、気管支、鼻、膣、胃内または直腸使用のための配合物中の、本発明の単離されたまたは精製された（組換え）分泌成分、または本発明の免疫複合体調製物、または本発明の配合物を提供する。
したがって、本発明はさらに、有効量の本発明の化合物または組成物を、治療が必要な被験体に投与することによって、粘膜免疫グロブリン不全を治療または防止するそれぞれの方法を提供する。
被験体、特にヒト被験体は、一過性、後天性および慢性免疫不全の治療の必要があり、例えば粘膜免疫グロブリン不全のリスクがあるかまたは該疾患に罹患しており、そしてしたがって、例えば粘膜試料において、または間接的に血液において決定されるような、粘膜におけるＳＩｇＡおよび／またはＳＩｇＭのレベルを正常化し、そして／または上昇させる治療に適格である可能性もある。
特定の療法的適応症は、例えば感染性疾患、例えば鼻咽頭管、泌尿生殖器管、眼および胃管の感染性疾患、例えば近位小腸における細菌異常増殖、再発性尿管感染または慢性気管支肺感染である。
好ましい使用は、微生物物質または生物、抗原または疾患誘発剤、例えば毒素を含む病原体によって引き起こされる疾患または障害の防止である。
特に、感染、アレルギーのリスクがあるかまたはこれらに罹患している被験体、例えばアレルギー症状および自己免疫疾患のリスクがあるかまたはこれに罹患している被験体を治療する。特に、被験体は、選択的ＩｇＡおよび／またはＩｇＭ不全、ＳＩｇＡ不全および／またはＳＩｇＭ不全、ならびに特に組み合わせ分泌型ＩｇＡ／ＩｇＭ不全を含む、ＩｇＡおよび／またはＩｇＭ不全に罹患している。
さらなる特定の側面にしたがって、例えば１０ｍｇ〜１０ｇのＳＩｇＡおよび／またはＳＩｇＭの単回用量を提供する経口調製物、例えば主な免疫グロブリンとして、投与単位あたり１０ｍｇ〜１０ｇの量で、ＳＩｇＡまたはＳＩｇＭのいずれかが含有されるか、あるいは総計１０ｍｇ〜１０ｇの量のＳＩｇＡおよびＳＩｇＭの組み合わせが含有される調製物で被験体を治療する。
本発明記載の配合物を、特に、食品として使用するために、および／または療法的使用のために提供してもよい。特に、配合物を、食事補助剤、栄養管理食品、食品添加物または医学的食品として提供してもよい。
図１は、ヒト分泌成分のアミノ酸配列を示す。 図２は、５’および３’端のクローニング部位を含む、ヒト分泌成分の核酸配列を示す。 図３は、アルファ１，２−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ２）のアミノ酸配列を示す。 図４は、それぞれのクローニング部位（下線）を含むアルファ１，２−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ２）の遺伝子を示す。 図５は、フコシルトランスフェラーゼ３のタンパク質配列を示す。 図６は、それぞれのクローニング部位（下線、イタリック）を含む、フコシルトランスフェラーゼ３の遺伝子を示す。 図７は、ベータ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼＩのアミノ酸配列を示す。 図８は、それぞれのクローニング部位（下線、イタリック）を含む、ベータ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼＩの遺伝子を示す。 図９は、ベータ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼＶのアミノ酸配列を示す。 図１０は、それぞれのクローニング部位（下線、イタリック）を含む、ベータ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼＶの遺伝子を示す。 図１１は、ベータ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼＩＩのアミノ酸配列を示す。 図１２は、それぞれのクローニング部位（下線、イタリック）を含む、ベータ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼＩＩの遺伝子を示す。 図１３は、キメラ抗ニトロフェニルＩｇＡ重鎖（小文字＝リーダーペプチド、下線＝ネズミＶＨ）のタンパク質配列を示す。 図１４は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限部位（下線）を含む、キメラ抗ニトロフェニルＩｇＡ重鎖構築物のＤＮＡ配列を示す。 図１５は、非コア・フコシル化（ルイスグリコシル化）分泌型免疫グロブリンを検出するための迅速アッセイのスキームを示す。 図１６は、分泌型免疫グロブリンの調製物とのインキュベーションに際して、クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ａの細胞傷害性の減少を示す。異なる非コア・フコシル化を伴う個々のヤギの２つのＳＩｇＡ調製物を、ウシＳＩｇＡ試料と比較して試験し、これらは各々、毒素に対して等モルの量である。陽性対照として、ヒトＳＩｇＡを等モル量および１０倍高い量で用いる。陰性対照として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いる。 図１７は、個々の動物の乳から得られるＳＩｇＡ調製物のスクリーニングの結果を示す。ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、レクチンＤＣ−ＳＩＧＮへのルイス特異的グリコシル化結合によって、ＳＩｇＡの非コア・フコシル化を決定する。陽性対照として、ヒト乳由来のＳＩｇＡを用いる。陰性対照として、商業的ヤギ乳（個々の動物由来の乳をスクリーニングせずにプールしたもの）由来のＳＩｇＡを用いる。
用語「ヒト様」または「ヒト化」は、本明細書において、分泌成分（ＳＣ）または免疫複合体調製物に関して、ヒトＳＣ、例えば組換えヒトＳＣ、あるいは他の種から得られており、ヒト分泌物、例えばヒトの乳に由来しないものを指すものとする。ヒト化ＳＣは、非コア・フコースまたはルイスエピトープを含むＮ−グリコシル化パターンを伴うＳＣ調製物を得るために、特に操作されるかまたは選択される。特に、乳腺の非ヒト分泌物から得られ、そしてルイスエピトープを含むグリコシル化が高い度合いであるように選択されたか、あるいは望ましいルイスエピトープを含むフコシル化パターンを伴う、ヒト起源の配列またはヒト化配列に基づく組換えＳＣとして得られるか、いずれかの、ヒト様またはヒト化ＳＣを含む、「ヒト様」または「ヒト化」ＳＣまたは免疫複合体が好ましい。ヒト化ＳＣは、特に、抗病原体効果および特異的受容体結合特性（例えば樹状細胞上のＤＣ−ＳＩＧＮへの結合）を与えることが立証されている、末梢、アンテナまたは外側アームフコシル化（用語「非コア・フコシル化」下に要約する）を含む。
本明細書に記載するような「ヒト化」ＳＣまたは免疫複合体は、本質的に、ＳＣ上に選択された高レベルのルイスエピトープを有し、そしてなお過剰なフコシル化、特に過剰な末梢フコシル化を回避するように、免疫グロブリンなどの他の糖タンパク質上の天然Ｎ−グリコシル化パターンを有する点で、トランスジェニック動物から得られる「ヒト化」乳とは異なる。したがって、免疫複合体中の免疫グロブリンは、天然グリコシル化パターン、例えばコア・フコシル化Ｎ−グリカンのみを持つ、天然Ｎ−グリコシル化パターンを有する。
用語「天然」は、本明細書において、免疫グロブリン、特にＩｇＡおよび／またはＩｇＭのグリコシル化パターンに関して、哺乳動物のＢ細胞によって産生されるグリコシル化を意味するものとし、これは特に、非コア・フコシル化を伴わず、そして特にルイスエピトープを伴わないグリコシル化によって特徴付けられる。ルイスエピトープは、典型的には、哺乳動物の天然または非修飾Ｂ細胞によって産生されない。
用語「非コア・フコシル化」または「ルイスエピトープ」は、本明細書において、特に非コア位置での、末梢、アンテナまたは外側アームフコシル化を含む、フコシル化のグリカンアンテナを指すものとする。具体的には、該用語は、特異的免疫グロブリンまたは抗体によって認識可能なルイス抗原またはＨ型抗原のエピトープを指す。ルイスエピトープは、ルイス式血液型抗原によって示されることも可能であり、ルイスｘ（ＬｅＸ）、ルイスｙ（ＬｅＹ）、ルイスｂ（ＬｅＢ）およびルイスａ（ＬｅＡ）抗原が含まれる。用語「ルイスエピトープ」はまた、Ｈ Ｉ型およびＨ ＩＩ型抗原、ならびに血液抗原ＡおよびＢも指すものとする。ルイス抗原は、さらに、例えばシアル酸によって修飾されて、例えばシアル化ルイスエピトープを形成することも可能である。ルイス抗原をシアル化し、そして／または硫酸化してもよい。好ましいルイスエピトープは、ＬｅＸおよびシアル化ＬｅＸ抗原に由来する。
本明細書で作製されるようなＳＣに関する特異的「非コア・フコシル化」に関する言及は、ＳＣ糖タンパク質調製物、例えば単離された組換えＳＣ、あるいはプールされた供給源、例えば乳または乳分画から単離されたものを指すものとする。したがって、これは、各々、特異的グリコシル化パターンを有する、例えば付着した１またはそれより多い外側アンテナ（または非コア）フコース残基を有する、個々のＳＣ分子を含む調製物に当てはまる。したがって、ＳＣグリコシル化は、本明細書に記載されるような調製物中で決定される。
例示の目的のため、そして限定ではなく、組換えＳＣは、本明細書に記載するような遺伝子操作（修飾）ＣＨＯ細胞において発現されてもよく、そして個々のＳＣ分子の大部分は、ＳＣの特異的Ｎ−グリコシル化部位上に非コア・フコース残基を有してもよい。こうした「非コア・フコシル化」は、多様な方法で特徴付け可能である。言及は、各場合で、本発明記載の修飾を欠く細胞株において作製されるＳＣ糖タンパク質分子の集団と比較した際の、ＳＣ上に非コア・フコース残基を有する集団の比較的多数の（または増加した数の）ＳＣ糖タンパク質分子に対して行われる。
分泌成分の特異的非コア・フコシル化はまた、付加前に低い非フコシル化を示すかまたはまったくフコシル化を示さない部位への、フコースの酵素的および／または化学的付加によって産生されることも可能である。
本発明記載のＳＣ糖タンパク質調製物を特徴付ける別の方式は、産生される単離された分泌成分における全体のグリコシル化に対する非コア・フコシル化の比による。本発明記載の組換え分泌成分は、約１：１〜１：５、１：５〜１：１０、１：１０〜１：３０、１：３０〜１：１００の非コア・フコシル化Ｎ−グリコシル化：全体のＮ−グリコシル化の比を有する。
単離された組換え分泌成分を特徴付ける別の方法は、ＳＣ糖タンパク質のグリカン構成要素に対する、非コア・フコース残基によって形成されるエピトープ（フコシル化血液型構造）の相対量である。
用語「天然グリコシル化パターン」は、本明細書において、ＩｇＡおよびＩｇＭに関して、ルイスエピトープを本質的に含有しないが、あるとしてもコア・フコシル化のみを含有する、ＩｇＡまたはＩｇＭの重鎖に見られるＮ−グリコシル化パターンを指すものとする。糖タンパク質の天然グリコシル化パターンは種間で異なるが、種内の集団内には、理論的数値および炭水化物部位の位置などのグリコシル化特性の典型的な範囲がある。ウシ、ヤギおよびヒツジなどの動物の分泌型免疫グロブリンは、通常、理論的グリコシル化部位に関して、種内で類似のグリコシル化パターンを有する。
なお、グリコシル化パターン内の実際のグリコシル化部位の割合は、主に、亜種（ｒａｃｅ）、年齢、家族、摂食、泌乳期、健康状態、生理学的状態および乳プロセシングのようなパラメーターに応じて、０〜１００％の範囲であることが見出された。
用語「非コア・フコシル化パターン」または「ルイス型Ｎ−グリコシル化パターン」は、本明細書において、本発明にしたがって用いられるようなＳＣに関して、非コア位、例えば末梢、アンテナまたは外側位で、Ｎ−連結フコースおよびルイスエピトープを含むグリコシル化パターンを指すものとする。グリコシル化中、Ｎ−連結またはＯ−連結糖タンパク質のいずれかが形成される。Ｎ連結糖タンパク質は、細胞表面タンパク質および分泌タンパク質の大部分を構成する。ルイス血液型構造は、アンテナグリカンの特定のフコシル化によって形成される。例えば、ルイスｘおよびルイスａ構造は、それぞれ、（Ｇａｌ−ベータ１−４）（Ｆｕｃ−アルファ１−３）ＧｌｃＮａｃおよび（Ｇａｌ−ベータ１−３）（Ｆｕｃ−アルファ１−４）ＧｌｃＮａｃである。これらの構造をさらにシアル化（ＮｅｕＡｃａ２，３−）して、対応するシアル化構造を形成してもよい。関心対象の他のルイス血液型構造は、それぞれ、（Ｆｕｃ−アルファ１−２）Ｇａｌ−ベータ１−４（Ｆｕｃ−アルファ１−３）ＧｌｃＮＡｃおよび（Ｆｕｃ−アルファ１−２）Ｇａｌ−ベータ−１−３（Ｆｕｃ−アルファ１−４）ＧｌｃＮＡｃである、ルイスｙおよびルイスｂ構造である。さらなるルイスエピトープは、Ｈ Ｉ型およびＨ ＩＩ型抗原由来である（それぞれ、（Ｆｕｃ−アルファ１−２）Ｇａｌ−ベータ１−３ＧｌｃＮａｃおよび（Ｆｕｃ−アルファ１−２）Ｇａｌ−ベータ１−４ＧｌｃＮａｃ）ならびに血液抗原ＡおよびＢ（（ＧａｌＮＡｃ−アルファ１−３）Ｆｕｃ−アルファ１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび（Ｇａｌ−アルファ１−３）Ｆｕｃ−アルファ１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ）。ＡＢＯの構造およびルイス血液型構造ならびにその合成に関与する酵素の説明に関しては、Ｍａら， ２００６， Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１６， ｎｏ．１２ ｐｐ １５８Ｒ−１８４Ｒを参照されたい。
ＳＣの例示的非コア・フコシル化またはルイス型Ｎ−グリコシル化パターンは、以下のように記載される：
Ｎ−グリカン（Ｎ−連結オリゴ糖、Ｎ−（Ａｓｎ）−連結オリゴ糖）は、一般的に、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基およびコンセンサスペプチド配列：Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒを伴う、ポリペプチド鎖のアスパラギン残基に共有結合する糖鎖である。Ｎ−グリカンは、一般的な五糖コア領域を共有し、そして一般的に、３つの主な種類：オリゴマンノース（または高マンノース）型、複合型、およびハイブリッド型に分けられうる。
脊椎動物Ｎ−グリカンにおいて、主なコア修飾は、コア中のアスパラギンに隣接したＮ−アセチルグルコサミンへのアルファ１−６連結におけるフコースの付加である（＝コア・フコシル化）。
複合体およびハイブリッドＮ−グリカンの大部分は、開始Ｎ−アセチルグルコサミンへのβ−連結ガラクトース残基の付加によって作製される、伸長された分枝を有し、２型Ｎ−アセチルラクトサミンまたは「ＬａｃＮＡｃ」配列と称される普遍的な構築ブロックＧａｌベータ１−４ＧｌｃＮＡｃを産生する。アンテナは、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびガラクトース残基の連続付加によってさらに延長されうる。
最も重要な「キャップ化」または「装飾」モチーフは、分枝上に、シアル酸、フコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、および硫酸を伴う。すべてのこれらのフコース残基は、本明細書において、非コア・フコース残基と称される：
ルイス血液型および関連抗原は、アルファ１−２、アルファ１−３、アルファ１−４フコース残基またはその組み合わせを所持するグリカンのセットである。１型および２型血液型抗原上のＡ、Ｂ、およびＨ決定因子血液型決定因子は、アルファ１−２連結中にフコースを示す。
以下の特異的構造は、ＳＣ上の「非コア・フコシル化」と見なされる：アルファ１−２、アルファ１−３、アルファ１−４フコース残基またはその組み合わせ、ルイスａ、ルイスｂ、ルイスｘ、ルイスｙ、１型および２型血液型抗原上のＡ、ＢおよびＨ決定因子血液型決定因子、ならびにそのシアル化および／または硫酸化型。
糖タンパク質のルイスエピトープの最大値または理論値は、例えば分枝、伸長および構造の反復によって、Ｎ−グリコシル化部位あたり多数のルイスエピトープがある可能性もあるため、グリコシル化部位の数に等しいかまたはこれを超過することも可能である。例えば、ヒトＳＣは、７つのグリコシル化部位を有し、したがって、７より多いルイスエピトープが可能である。ルイスエピトープは、１またはそれより多い非コア・フコースを含むことも可能であるため、非コア・フコースの数は、糖タンパク質中のルイスエピトープの数を超過していてもよい。
特に好ましい場合、非コア・フコースまたはルイスエピトープの量は、Ｎ−グリコシル化部位の理論量の少なくとも１．１倍、好ましくは少なくとも１．２倍、または少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、または少なくとも２倍であり、特定の場合、量はさらにより高く、例えば少なくとも３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍、または少なくとも６倍、または少なくとも７倍、または少なくとも８倍、または少なくとも９倍、例えば最大１０倍である。
ルイス型Ｎ−グリコシル化は、それぞれのフコシルトランスフェラーゼによって与えられることも可能であり、これらは、フコース単位をグアノシン−５’−ジホスホフコースから糖アクセプターの特定のヒドロキシルにトランスファーするため、合成経路において用いられてきている。異種フコシルトランスフェラーゼを、組換え生物によって発現させて、フコシル化糖タンパク質を発現させることも可能である。
用語「免疫複合体」は、本明細書において、非共有結合または共有結合を通じて、分泌成分に結合した少なくとも１つの免疫グロブリン分子を含む、タンパク質複合体を指すものとする。非共有結合は、例えば、静電または疎水性相互作用を含む。本発明にしたがった免疫複合体内で、少なくとも１つのＩｇＡおよび／または少なくとも１つのＩｇＭ分子が提供され、これは、ポリマー性免疫グロブリンが形成されるように、さらなる免疫グロブリンに共有結合していてもよい。天然には、こうした多量体化は、ポリマー性抗体のＪ鎖を通じて、または他の非共有相互作用によってのいずれかで、起こる。
用語「産業規模」は、天然供給源または細胞培養を含む組換え発現系からの免疫複合体の大規模産生を指すものとする。本明細書に記載するような産業規模発現系は、例えばプールした供給源を通じて、好ましくは、リットルあたり少なくとも１０ｍｇ、好ましくはリットルあたり１００ｍｇの免疫複合体、および少なくとも１００リットルの好ましい体積、より好ましくは少なくとも１０００リットルの、立証された生産性を有する。
用語「生得的（ｉｎｎａｔｅ）」は、免疫複合体に関して、哺乳動物を含む動物において、とりわけヒト被験体または患者の中で、自然免疫反応または機能を支配するかまたは刺激する免疫複合体を指すものとする。本発明記載の自然免疫複合体は、比較的非特異的な方式で、病原体に対する免疫防御を補助することも可能であるが、粒子状のエピトープまたは溶解した抗原性物質もまた、特異的に認識可能である。
用語「単離された」または「精製された」は、本発明記載のＳＣまたは免疫複合体などのタンパク質に関して、本明細書において、動物の体液または分泌物の、したがって天然起源の、あるいは細胞培養上清または組織もしくは細胞抽出物のような細胞培養物の、複雑な混合物から得られるタンパク質を指す。これらのタンパク質は、典型的には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した際、少なくとも５０％純粋、好ましくは少なくとも６０％純粋、より好ましくは少なくとも７０％純粋、さらにより好ましくは８０％純粋、最も好ましくは少なくとも９０％純粋、そしてさらに最も好ましくは少なくとも９５％純粋である。
用語「分泌成分」または「ＳＣ」は、本明細書において、ヒトを含む動物の乳腺によって分泌可能な分泌成分、または機能変異体を含むその変異体を指すものとし、このＳＣは、例えば免疫グロブリンから分離された、または例えば分泌型免疫複合体を形成するため、例えばＪ鎖（またはその変異体）またはポリ免疫グロブリン受容体（ｐＩｇＲ）に特異的に結合する免疫グロブリンの他の構造によって仲介された、免疫グロブリンと複合体化した糖タンパク質である。ＳＣは、初乳または乳などの天然供給源から得られてもよいし、あるいはそうでなければ合成的に、または組換え発現技術によって産生されてもよい。
本明細書において、ＳＣは、具体的には、本明細書にさらに記載するように、非コア・フコシル化されている。さらに、グリコシル化パターンは、シアリルエピトープを含んでもよいしまたは含まなくてもよい。
具体的には、ＳＣは、シアル化または無シアル化タンパク質調製物のいずれかとして提供される。好ましくは、本発明にしたがって提供されるようなシアル化および無シアル化グリカンの間の比は、好ましくは少なくとも３：１、好ましくは少なくとも４：１、または少なくとも５：１、または少なくとも６：１、または少なくとも７；１である。非シアル化（無シアル化）タンパク質を含む、低シアル化の調製物における比は、本明細書において、また、無シアル化調製物としても理解され、１：３未満、好ましくは１：４未満、または１：５未満、または１：６未満、または１：７未満と理解される。好ましくは、こうした調製物中で提供されるようなＳＣは、無シアル化グリカンまたはシアル化グリカンいずれかのみを含有する。
好ましくは、組換えＳＣ上のシアリル−ルイスｘエピトープの相対含量は、少なくとも０．０２モル／モルＳＣ、より好ましくは少なくとも０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、または０．１モル／モルＳＣ、より好ましくは少なくとも０．２、０．３、０．４、または０．５モル／モルＳＣ、さらにより好ましくは少なくとも１モル／モルＳＣまたはさらにより高く、例えば少なくとも２モル／モルＳＣ、３モル／モルＳＣ、４モル／モルＳＣ、５モル／モルＳＣ、６モル／モルＳＣ、７モル／モルＳＣ、８モル／モルＳＣ、９モル／モルＳＣ、または少なくとも１０モル／モルＳＣである。特に好ましいＳＣ調製物は、モルＳＣあたり少なくとも２モルのシアリル−ルイスｘエピトープ、いくつかの場合、少なくとも６モル／モルを含む。
本発明のＳＣおよび免疫複合体は、粘膜効果を改善可能なより均質なグリコシル化の利点を有し、例えば均質なグリコシル化は、高い度合いの非コア・フコシル化を有するにもかかわらず、より少ない異なるグリコフォーム、例えば２０未満の異なるＳＣグリコフォーム、または１０未満の異なるＳＣグリコフォーム、またはさらに５未満の異なるＳＣグリコフォームによるものである。
分泌型免疫グロブリンの主な機能は、抗原および病原体の排除を促進することであるようである一方、分泌された抗体の分画が、実際に粘膜に戻って「逆行」輸送される証拠がある。
ＳＩｇＡが樹状細胞（ＤＣ）の細胞表面上のＤＣ−ＳＩＧＮと会合した後、エンドサイトーシスされる証拠がある。これらの結果に基づいて、ＤＣ−ＳＩＧＮがＳＩｇＡ、そしておそらくＳＩｇＡ−抗原複合体の認識および内在化に関与する粘膜ＤＣ上の受容体として働きうることが提唱された。
ＤＣ−ＳＩＧＮへの分泌型免疫グロブリンの結合が、分泌成分のグリカンによって仲介されることが周知である。ＤＣ−ＳＩＧＮは、複雑な高マンノース含有複合糖質であるマンナン、および無シアル化ルイス血液型抗原を含むある範囲のオリゴ糖リガンドを認識する。
ＤＣ−ＳＩＧＮを通じた樹状細胞への免疫複合体の結合を増進させるため、分泌型免疫グロブリン調製物に関して、低シアル化グレードであるが、高非コア・フコシル化を伴うＳＣを用いることが好適である。こうした最小限にシアル化されたＳＣまたはさらに無シアル化ＳＣを利用して、生物が寛容化する必要がある抗原（例えば食餌性抗原、アレルゲン）に結合するモノクローナルまたはポリクローナルポリマー性免疫グロブリン調製物を産生することも可能である。
他方で、ＤＣ−ＳＩＧＮを通じて樹状細胞に結合しないか、またはＤＣ−ＳＩＧＮへの結合においてより低い有効性を有する、分泌型免疫グロブリン調製物を提供することが好適でありうる。これは、本発明の自然免疫複合体の調製のため、高シアル化非コア・フコシル化ＳＣを利用することによって達成可能である。こうした調製物を利用して、特定のウイルス、毒素および他の病原体構造に関する分泌型免疫グロブリンのデコイ効果を増進させることも可能である。
シアリルルイスｘは、顆粒球および単球上に恒常的に発現される決定因子であり、そしてこれらの細胞の炎症性血管外漏出を仲介する。
本発明の免疫複合体上のシアリルルイスｘの存在または非存在は、炎症性状況に干渉するかまたは干渉を回避することによって、本発明の免疫複合体を用いた治療の有効性を増加させるかまたは副作用を減少させることも可能である。
それぞれ高または低モルシアル化（ＳＣモルあたり）を伴うＳＣに関して選択することによって、調製物におけるシアル化の度合いを増加させるかまたは減少させることも可能である。これは、産生宿主の選択レベルで実行可能であり（例えば細胞株、微生物クローンまたは生物）、これは、これらの試料のその後のプールのため、それぞれ、高または低モル濃度シアル化を伴うＳＣを含有する分泌物を提供するよう選択される個々のドナーのレベルでも実行可能である。本発明のＳＣまたは自然免疫複合体の調製物の、それぞれ、酵素的または化学的シアル化、および脱シアル化によって、シアル化を増加させるかまたは減少させることも可能である。
糖タンパク質試料のシアル酸の絶対定量化のため（モルシアル酸／モル糖タンパク質）、質量分析に基づく糖分析法を適用してもよい。あるいは、エリスロポエチンに関する欧州薬局方のモノグラフ１３１６に記載されるような比色法を用いてもよい。この方法は、Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ， １９５７， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ． Ｖｏｌ ２４， ｐｐ ６０４−１１に基づく。
したがって、ＳＣの定義された量の純粋な調製物を、レゾルシノールおよび塩酸で、１００℃で処理し、形成された青い複合体をブチルアルコール／酢酸ブチルで分離し、その後、５８０ｎｍで測光測定する。シアル酸で産生された検量線によって、測光読み取り値を質量に変換する。
用語「分泌型免疫グロブリン」は、本明細書において、例えばｐＩｇＲまたは機能性変異体を含むその変異体によって仲介されて、ヒトを含む動物の乳腺によって分泌されうる、免疫グロブリンを指すものとする。分泌型免疫グロブリンは、天然供給源、例えば初乳または乳から、特にＳＩｇＡおよび／またはＳＩｇＭとして得られてもよいし、あるいはそうでなければ、合成的に、または組換え発現技術によって、または血漿および組換えＳＣなどの天然供給源由来のポリマー性免疫グロブリンの組み合わせによって、または組換え発現技術によって産生されたポリマー性免疫グロブリンおよび乳または他の体液などの天然供給源由来のＳＣの組み合わせによって、産生されてもよい。
用語「組換え」は、本明細書において、例えば、酵母、真菌、細菌または古細菌のような産生宿主細胞株または系統、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞またはそれぞれの組織由来の細胞株を使用して、微生物発酵または細胞培養などの、閉鎖された（ｃｏｎｔａｉｎｅｄ）反応装置系において、宿主生物、例えば原核生物または真核生物のような、組換え発現系を使用する、遺伝子操作または遺伝子組換え技術によって、産生されるタンパク質（ポリペプチドを含む）を指す。
用語「発現系」または「産生系」は、本明細書において、細胞培養、またはより高次の真核生物、例えば望ましい品質および量のタンパク質および免疫複合体を産生可能な選択された泌乳動物であるが、ヒトを含まない生物を指すものとする。好ましい系は、真核宿主で使用するための発現ベクターを使用する。
「発現ベクター」または「ベクター」は、本明細書において、適切な宿主生物において、クローニングされた組換えヌクレオチド配列、すなわち組換え遺伝子の転写、およびｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列と定義される。こうした発現ベクターは、宿主細胞における自律性複製のための起点、選択可能マーカー（例えば必須アミノ酸合成遺伝子またはゼオシン、カナマイシン、Ｇ４１８またはハイグロマイシンなどの抗生物質に対する耐性を与える遺伝子）、いくつかの制限酵素切断部位、適切なプロモーター配列および転写終結因子を含んでもよく、こうした構成要素は機能可能であるようにともに連結される。
用語「真核宿主」は、タンパク質を発現するために培養可能である、任意の真核細胞、組織または生物を意味するものとする。特に、真核宿主は、真核宿主細胞株である。該用語にはヒトが含まれないことが十分に理解される。本発明記載のＳＣを発現する好ましい宿主は、真核宿主である。
用語「宿主細胞」または「宿主細胞株」は、本発明にしたがって用いられるような、組換えタンパク質を産生する組換え遺伝子の発現に用いられる、微生物または細胞株を指す。好ましい宿主細胞は、哺乳動物、鳥類、昆虫または植物細胞、酵母、糸状菌または細菌からなる群より選択される。本発明の分泌成分を産生するため、好ましくは、非コア・フコシル化またはルイス型Ｎ−グリコシル化を伴う糖タンパク質を産生可能な宿主細胞が用いられる。増殖している培養宿主細胞の宿主細胞クローンは、一般的に、宿主細胞株と理解される。産生宿主細胞株は、一般的に、産業規模で産物を得るため、バイオリアクター中の培養のために準備が出来ている細胞株と理解される。
用語「ポリマー性免疫グロブリン」は、本明細書において、少なくとも２、３、４、５またはさらにより多数の、最大１０の免疫グロブリン分子の会合を指すものとする。ポリマー性免疫グロブリンは、したがって、少なくとも二量体性の免疫グロブリン、例えば二量体ＩｇＡ、三量体、四量体、五量体、例えばＳＩｇＭ、六量体免疫グロブリン、またはさらにより高次のポリマーまたは凝集物と見なされる。ポリマー性免疫グロブリンは、共有結合、あるいは静電、疎水性、イオン性相互作用、またはＪ鎖を伴うもしくは伴わないアフィニティ結合のような他の相互作用によって互いに会合した免疫グロブリン分子を含んでもよい。
用語「多重反応性免疫グロブリン」は、本明細書において、少なくとも２つの特異性を持つ免疫グロブリンを指すものとし、これは少なくとも２つの異なるエピトープを認識することを意味し、交差反応性としても知られる。典型的には、自然免疫系の多重反応性免疫グロブリンは、最も一般的には低いかまたは中程度のアフィニティで、エピトープおよび抗原に結合する、少なくとも３、４、５またはそれより多い適切な（例えば生理学的に適切なまたは薬理学的に活性である）特異性を有するであろう。
用語「食物」または「食品」は、動物によって摂取されるのに適したまたは摂取されるよう意図された、任意の化合物、調製物、混合物、または組成物を指すものとする。これには、栄養、栄養補助または食品補助剤、ダイエット食品またはサプリメントである任意の化合物、あるいはおそらくダイエットとして用いられる、食品への栄養または機能補助剤と理解される病人用特別食が含まれる。典型的には、機能性食品は、毒素を含む病原体に関連する疾患状態の防止または予防および／または治療、あるいは身体の生理学的不均衡の治療を補助する。該用語はまた、非ヒト動物に給餌するための食餌としておそらく用いられる、餌または餌製品を指すものとする。食物は、有機または合成供給源のものであってもよく、乳製品、または混合する前に適切に精製されている物質の人工的混合物に基づく合成組成物を含む、天然または天然様組成物中に配合される。本発明記載の食品は、典型的には、食品等級品質で提供される。等級品質は、動物に対して許容されうる食物の品質特性である。これには、外見（大きさ、形状、色、光沢、およびコンシステンシー）、テクスチャーおよびフレーバーのような外因が含まれる。品質標準はまた、混入物質の許容されうる最大量も提供する。成分品質に加えて、また、病原体を不活性化するかまたは枯渇させる、衛生設備の必要性もある。消費者にとって最も安全でありうる食品を産生するため、食品プロセシング環境は、可能な限り清浄であることを確実にすることが重要である。
分泌成分または免疫グロブリンのようなタンパク質の、用語「変異体」または「機能的に活性である変異体」は、本明細書において、配列内の、あるいは配列の遠位端のいずれかまたは両方での、１またはそれより多いアミノ酸またはヌクレオチドの挿入、欠失または置換による親配列の修飾から生じる配列を意味し、そして修飾はこの配列の活性に影響を及ぼさない（特に損なわない）。好ましい態様において、変異体は、機能的に活性である変異体であり、これは、ａ）アミノ酸またはヌクレオチド配列の生物学的活性断片であり、機能的に活性である断片は、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは約９５％、そして最も好ましくは少なくとも９７％、９８％、または９９％を含み；ｂ）少なくとも１つのアミノ酸置換、付加および／または欠失によって、アミノ酸またはヌクレオチド配列から得られ、ここで機能的に活性である変異体は、アミノ酸またはヌクレオチド配列に、あるいはａ）において定義されるような機能性活性断片に、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、そして最も好ましくは少なくとも９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し；そして／またはｃ）該アミノ酸またはヌクレオチド配列、およびさらに該アミノ酸またはヌクレオチド配列に異種性である少なくとも１つのアミノ酸またはヌクレオチドからなり、好ましくは、ここで、機能的に活性である変異体は、多様な遺伝子およびタンパク質データベース中に見られる任意の配列の天然存在変異体のいずれかに由来するかまたはこれらと同一である。本明細書に記載するような、好ましいグリコシル化パターン、特にルイス型Ｎ−グリコシル化パターンおよびＳＣの非コア・フコシル化を含む、こうした機能的に活性である変異体が特に好ましい。さらに好ましい機能的に活性である変異体は、ポリマー性免疫グロブリン、例えばＩｇＡ二量体またはＩｇＭ五量体に結合可能な能力によって特徴付けられ、分泌性免疫複合体を形成する。
大部分のＳＣ配列は、完全ポリ免疫グロブリン受容体（ｐＩｇＲ）と記載され、本発明の目的のため、これらの配列の細胞外部分のみが適切であり、例えば配列番号１に提供するようなヒトＳＣの配列、または以下に含まれるかもしくは本質的に同一である配列がある：
ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：遺伝子座 ＰＩＧＲ＿ＢＯＶＩＮ、寄託番号Ｐ８１２６５（ウシｐＩｇＲ）
ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：遺伝子座 ＰＩＧＲ＿ＨＵＭＡＮ、寄託番号Ｐ０１８３３（ヒトｐＩｇＲ）
ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：遺伝子座 ＰＩＧＲ＿ＲＡＴ、寄託番号Ｐ１５０８３（ラットｐＩｇＲ）
ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：遺伝子座 ＰＩＧＲ＿ＭＯＵＳＥ、寄託番号Ｏ７０５７０（マウスｐＩｇＲ）
ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：遺伝子座 ＰＩＧＲ＿ＲＡＢＩＴ、寄託番号Ｐ０１８３２（ウサギｐＩｇＲ）
ＮＣＢＩ ＲＥＦＳＥＱ： 寄託番号ＮＭ＿１７４１４３．１（ウシｐＩｇＲ）
ｅｍｂｌ 寄託番号Ｘ８１３７１．１（ウシｐＩｇＲ）
ＧｅｎＢａｎｋ ＧｅｎＢａｎｋ： ＤＡＡ２１４８０．１（ウシｐＩｇＲ）
ＧｅｎＢａｎｋ： ＡＡＩ４９０３３．１（ウシｐＩｇＲ）
ＮＣＢＩ ＲＥＦＳＥＱ： 寄託番号ＸＭ＿５３７１３３．２（ウシｐＩｇＲ）
ＮＣＢＩ参照配列： ＮＰ＿００２６３５．２（ヒトｐＩｇＲ）
ＮＣＢＩ参照配列： ＮＰ＿０３５２１２．２（マウスｐＩｇＲ）
ＮＣＢＩ参照配列： ＮＰ＿０３６８５５．１（ラットｐＩｇＲ）
ＧｅｎＢａｎｋ： ＡＡＫ６９５９３．１（ワラビーｐＩｇＲ）
ＮＣＢＩ参照配列： ＮＰ＿００１１２５０９８．１（オランウータンｐＩｇＲ）
ＧｅｎＢａｎｋ： ＥＡＷ９３５１６．１（ヒトｐＩｇＲ）
ＧｅｎＢａｎｋ： ＥＡＷ９３５１５．１（ヒトｐＩｇＲ）
ＮＣＢＩ参照配列： ＮＰ＿９９９３２４．１（ブタｐＩｇＲ）
ＧｅｎＢａｎｋ： ＢＡＪ２０７８４．１（ヒトｐＩｇＲ）
ＮＣＢＩ参照配列： ＸＰ＿００１０８３３０７．２（マカク（ｍａｃａｃｃａ）ｐＩｇＲ）
ＮＣＢＩ参照配列： ＸＰ＿００２７６０７８３．１（マーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）ｐＩｇＲ）
ＧｅｎＢａｎｋ： ＡＡＤ４１６８８．１（フクロネズミｐＩｇＲ）
ＧｅｎＢａｎｋ： ＥＤＭ０９８４３．１（ラットｐＩｇＲ）
ＧｅｎＢａｎｋ： ＡＡＩ１０４９５．１（ヒトｐＩｇＲ）
ＧｅｎＢａｎｋ： ＡＡＩ１０４９６．１（ヒトｐＩｇＲ）
ＮＣＢＩ参照配列： ＸＰ＿５１４１５３．２（チンパンジーｐＩｇＲ）
ＧｅｎＢａｎｋ： ＡＡＣ５３５８５．１（マウスｐＩｇＲ）
ＧｅｎＢａｎｋ： ＡＡＱ１４４９３．１（ニワトリｐＩｇＲ）
ＮＣＢＩ参照配列： ＮＰ＿００１０３８１０９．１（ニワトリｐＩｇＲ）
ＧｅｎＢａｎｋ： ＡＡＰ６９５９８．１（ニワトリｐＩｇＲ）
ＧｅｎＢａｎｋ： ＡＡＷ７１９９４．１（ニワトリｐＩｇＲ）
ＧｅｎＢａｎｋ： ＡＡＨ１３５５６．１（マウスｐＩｇＲ）
ＧｅｎＢａｎｋ： ＥＤＬ３９７２９．１（マウスｐＩｇＲ）
ＧｅｎＢａｎｋ： ＣＡＡ７６２７２．１（マウスｐＩｇＲ）
ＧｅｎＢａｎｋ： ＢＡＡ２４４３１．１（マウスｐＩｇＲ）
ＮＣＢＩ参照配列： ＮＰ＿００１１６４５１６．１（ウサギｐＩｇＲ）
ＮＣＢＩ参照配列： ＸＰ＿００１４９２３４８．２（ウマｐＩｇＲ）
ＧｅｎＢａｎｋ： ＡＡＣ４１６２０．１（ウシｐＩｇＲ）
ＧｅｎＢａｎｋ： ＡＡＢ２３１７６．１（ヒトｐＩｇＲ）
ＧｅｎＢａｎｋ： ＡＡＢ２０２０３．１（ヒトｐＩｇＲ）
ＧｅｎＢａｎｋ： ＡＢＫ６２７７２．１（ゼノパスｐＩｇＲ）
本明細書に同定されるポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性のパーセント（％）」は、配列を整列させ、そして必要であればギャップを導入して、最大配列同一性パーセントを達成した後、そしていかなる保存的置換も配列同一性の一部と見なさない、特定のポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の割合と定義される。当業者は、比較中の配列の全長に渡る最大整列を達成するために必要とされるような、任意のアルゴリズムを含めて、整列を測定するための適切なパラメーターを決定可能である。
機能的に活性である変異体は、アミノ酸またはヌクレオチド配列中の配列改変によって得られることも可能であり、ここで、配列改変は、本発明と組み合わせて用いられた際、非改変アミノ酸またはヌクレオチド配列の機能を保持する。こうした配列改変には、限定されるわけではないが、（保存的）置換、付加、欠失、突然変異および挿入が含まれうる。
異なる種由来のＳＣ間のドメイン交換によって、あるいはドメインの欠失または付加によって、機能的に活性であるＳＣ変異体を得ることも可能である。ドメインの天然の順（例えば哺乳動物ＳＣに関する１−２−３−４−５）の変更もまた、機能的に活性である変異体を生じうる（例えば１−４−３−２−５）。
本発明の特定の態様において、上に定義するようなポリペプチドまたはヌクレオチド配列を、多様な化学的技術によって修飾して、修飾ポリペプチドまたはヌクレオチド配列と本質的に同じ活性（断片および変異体に関して上に定義するようなもの）を有し、そして場合によって他の望ましい特性、例えば反応性、Ｎ−グリコシル化部位および安定性（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性）を有する誘導体を産生することも可能である。望ましい特性は、例えば、タンパク質のｐＨ安定性および／またはプロテアーゼ（例えば膵臓）安定性によって測定されるような、熱安定性および／または胃腸安定性の増加である。免疫グロブリンのグリコシル化パターンは、可溶性、タンパク質分解的攻撃および熱不活性化に対する耐性、免疫原性、半減期、生物活性および安定性、またはポリマー性免疫グロブリンに結合する能力に影響を及ぼしうる。
本発明のＳＣの変異体は、さらなるグリコシル化部位を導入するため、改変されたアミノ酸配列を有することも可能である。本発明の好ましい態様は、Ｎ−グリコシル化部位の付加である。これは、遺伝子操作技術、ならびに化学的および酵素的手段によって達成可能である。配列モチーフＡｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒ−Ｘａａ（配列番号１５）またはＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ−Ｘａａ（配列番号１６）（ここで、Ｘａａは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）をＳＣの多様な部位に導入すると、改善された特性（例えば安定性、病原体構造への結合、ｐＩｇへの結合）を持つ、機能的に活性である変異体の選択が可能になりうる。これによって、ヒト由来ＳＣが７より多いグリコシル化部位を有することが可能になりうる。
ポリペプチドまたはヌクレオチド配列の変異体は、変異体を含む（が元来のものを含まない）本発明の組成物の活性が、配列改変を伴わないアミノ酸またはヌクレオチド配列（すなわち元来のポリペプチドまたはヌクレオチド配列）を含む、本発明にしたがって用いられるような免疫グロブリンまたはＳＣの活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、特に少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％に達する場合、本発明の背景において、機能的に活性である。
機能的に活性である変異体は、上に定義されるような配列を変化させることによって得られることも可能であり、そしてこうした変異体は、病原体に対する免疫反応、病原体構造および他の分子への結合を修飾する能力を含めて、変異体が由来するそれぞれの配列によって示されるものと類似の、またはヒトＳＣに類似の生物学的活性を有することによって特徴付けられる。
なお、用語「機能的に活性である変異体」には、天然存在アレル変異体、ならびに突然変異体または任意の他の非天然存在変異体が含まれる。当該技術分野に知られるように、アレル変異体は、ポリペプチドの生物学的機能を本質的には改変しない、１またはそれより多いアミノ酸の置換、欠失、または付加を有すると特徴付けられる（ポリ）ペプチドの代替型である。
好ましい態様において、アミノ酸交換、欠失または挿入によって、上に定義されるようなアミノ酸またはヌクレオチド配列から得られる機能的に活性である変異体はまた、活性を保存するかまたはより好ましくは改善することも可能である。
保存的置換は、側鎖および化学的特性において関連するアミノ酸ファミリー内で行われるものである。こうしたファミリーの例は、塩基性側鎖、酸性側鎖、非極性脂肪族側鎖、非極性芳香族側鎖、非荷電極性側鎖、小側鎖、巨大側鎖を持つアミノ酸である。
用語「粘膜免疫グロブリン不全」は、正常または参照範囲未満の粘膜試料に存在する免疫グロブリン濃度を意味するものとする。これは、特に、ＳＩｇＡまたはＳＩｇＭのいずれかあるいはＳＩｇＡおよびＳＩｇＭの両方の組み合わせの含有量を指す。
用語「分泌型ＩｇＡ不全」または「ＳＩｇＡ不全」は、分泌型ＩｇＡの不全である。用語「分泌型ＩｇＭ不全」または「ＳＩｇＭ不全」は、分泌型ＩｇＭの不全である。
これらの分泌型免疫グロブリン不全は、遺伝子配置、化学薬品によって、あるいは例えばストレス、栄養不全、傷害または手術による粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）におけるＳＩｇ産生の局所障害によって引き起こされうる。
ＭＡＬＴは、ヒトにおいて、例えば
・ＧＡＬＴ（腸関連リンパ組織、パイエル板は、小腸の裏打ちに見られるＧＡＬＴの構成要素である）
・ＢＡＬＴ（気管支関連リンパ組織）
・ＮＡＬＴ（鼻関連リンパ組織）
・ＬＡＬＴ（喉頭関連リンパ組織）
・ＳＡＬＴ（皮膚関連リンパ組織）
・ＶＡＬＴ（血管関連リンパ組織）
・ＥＡＬＴ（結膜［ＣＡＬＴ］および涙管［ＬＤＡＬＴ］関連リンパ組織で構成される眼関連リンパ組織）
と理解される。
ＳＩｇＡ不全は、ＳＩｇＭ不全と関連する可能性もある。
分泌型ＩｇＡおよび／または分泌型ＩｇＭ不全の検出は、標準的イムノアッセイ技術による、または分子生物学技術による、唾液、頸管粘液、鼻粘液、胃液、汗、尿または糞便などの分泌物中のＳＩｇＡおよび／またはＳＩｇＭの測定によって行われる。分泌物中のＳＩｇＡおよび／またはＳＩｇＭの免疫学的検出は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡによって、蛍光に基づく免疫アッセイ、時間分解蛍光光度法、沈降アッセイ、比濁アッセイ、表面プラズモン共鳴に基づくアッセイ、ならびに標識を伴うおよび伴わない類似のセットアップによって、実行可能である。重要な必要条件は、ＩｇＡおよび／またはＩｇＭからＳＩｇＡおよび／またはＳＩｇＭを区別することが可能であるための、免疫グロブリン分子に結合した分泌成分の検出である。
ＳＩｇ不全の分子生物学的検出は、それぞれの組織および細胞において、Ｊ鎖および／またはｐＩｇＲの発現のために、こうした分子に特異的な抗体を用いてタンパク質レベルで、またはこうした分子の遺伝子に特異的なプローブを用いて遺伝子レベルでのいずれかで、アッセイすることによって実行可能である。ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を調べてもよい。検出法は、テンプレート増幅（例えばＰＣＲ）またはシグナル増幅を伴うまたは伴わないハイブリダイゼーションに基づくアッセイであってもよい。
粘膜ＳＩｇＡ不全は、一般的な分泌型ＩｇＡ不全の強い指標でありうる。粘膜ＳＩｇＭ不全は、一般的な分泌型ＩｇＭ不全の強い指標でありうる。併せた粘膜ＳＩｇＡ／ＳＩｇＭ不全は、併せた一般的な分泌型ＩｇＡおよびＩｇＭ不全の強い指標である。
粘膜ＳＩｇレベルが、正常値または同じタイプの健康な被験体の値のいずれかである参照値に比較した際、５０％未満である場合、特に４０％、３０％、２０％または１０％未満である場合、ＳＩｇ不全が特に示される。
異なる個体において、分泌型免疫グロブリンレベルにはかなりの変動がある。個体の免疫状態の正確な測定はまず、優れた健康状態であり、そして低度から中程度の身体活動の期間中、数日から数週間に渡る、個体の通常のＳＩｇＡおよび／またはＳＩｇＭ値のベースラインを確立することも可能である。ベースラインはまた、個体の年齢で多様でありうる。しかし、この方法は、慢性分泌型免疫不全の個体にはふさわしくない。したがって、正常集団の参照値もまた、考慮してもよい。
ヒトに関しては、正常唾液ＳＩｇＡレベルは１１〜６５ｍｇ／ｄＬであり、正常唾液ＳＩｇＭレベルは１ｍｇ／ｄＬである。正常ＳＩｇ値は、典型的には、健康な被験体の試料において決定される。減少した唾液免疫グロブリンは、再発性上気道感染、選択的ＩｇＡおよび／またはＩｇＭ不全を持つ小児において、そしてときに、食物アレルギーを持つ個体において、存在する可能性がある。
イムノアッセイによって決定されるような、ヒト唾液試料におけるＳＩｇＡ不全は、典型的には、ＳＩｇＡ濃度がリットルあたり１００ミリグラムＳＩｇＡ未満であるか、または唾液ＳＩｇＡ流速が１分あたり５０マイクログラムＳＩｇＡ未満であるか、またはＳＩｇＡ対アルブミン比が４未満である場合、示される（Ｄｗｙｅｒらによって、Ａｖｉａｔｉｏｎ， Ｓｐａｃｅ， ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ２０１０， 第８１巻， ページ５８２ ｆｆに提唱されるとおり）。イムノアッセイによって決定されるような、ヒト糞便におけるＳＩｇＡ不全は、典型的には、ＳＩｇＡ濃度が、糞便１００ｇあたり１０ミリグラム未満である場合、示される。
イムノアッセイによって決定されるような、ヒト涙におけるＳＩｇＡ不全は、典型的には、ＳＩｇＡ濃度が、ミリリットルあたり５０ｍｇ ＳＩｇＡ未満である場合、示される。
イムノアッセイによって決定されるような、ヒト鼻分泌物または唾液におけるＳＩｇＭ不全は、典型的には、ＳＩｇＭ濃度が、鼻分泌物リットルあたり５０ｍｇ未満である場合そして／またはＳＩｇＭ濃度が、唾液中１ｍｇ／ｄＬ未満である場合、示される。
ＳＩｇ不全に関して特定するためには、粘膜関連リンパ組織の少なくとも１つの区画のみで、ＳＩｇレベル減少が見出されればよい。
ＳＩｇＡ不全は、ときに、ＳＩｇＭ不全もまた決定された試料において決定されうる。したがって、好ましくは、ＳＩｇＡおよびＳＩｇＭの両方を含む本発明の調製物を、ＳＩｇＡおよびＳＩｇＭ不全のリスクがある被験体において用いる。
用語「粘膜」は、免疫グロブリン不全に関して、粘膜試料、例えば、被験体の唾液、胃液、頸管粘液、鼻粘液、胃洗浄液、胃液、気管支洗浄液、尿、涙および糞便において決定されるような免疫グロブリンレベルを指す。
用語「粘膜」は、被験体を治療するための調製物、またはそれぞれの配合物の投与または適用または別の粘膜使用に関して、全身性または局所投与を含む粘膜経路を通じた投与を指し、ここで、活性成分は、粘膜表面との接触によって取り込まれる。これには、経口、鼻、膣、直腸、気管支投与および配合物、例えば液体、シロップ、ロゼンジ、錠剤、例えば発泡錠、スプレー、吸入具配合物、粉末、即席粉末、顆粒、座薬、カプセル、クリーム、ペースト、ジェル、ドロップ、懸濁物、エマルジョン、または乳製品およびチューインガムを含む食品が含まれる。
用語「被験体」は、本明細書において、診断、スクリーニング、監視または治療が意図される、本明細書において好ましくは哺乳動物および特にヒトを含む、任意の動物を指す。被験体は、特定の疾患状態のリスクがある可能性もあり、例えば疾患状態に罹患した、あるいは疾患状態が決定されようとしているかまたは疾患状態リスクが決定されようとしている患者である。用語「患者」には、本明細書において、常に、健康な被験体が含まれる。いくつかの態様において、本明細書に開示する方法には、ＳＩｇ補充療法が必要な被験体、例えば立証されたＳＩｇ不全を有する被験体を選択し、そして本発明にしたがって前記被験体をさらに治療する工程が含まれうる。
用語、特定の疾患状態、例えばＳＩｇ不全または粘膜免疫グロブリン不全「のリスクがある」は、例えば特定の素因によって、こうした疾患状態を潜在的に発展させるか、またはすでに、先天的または後天的状態を含み、一過性疾患を含む、多様な段階でこうした疾患状態を患い、特に他の原因疾患状態、あるいはこうした免疫グロブリン不全の結果として続く、他の状態または合併症に関連している被験体を指す。
粘膜Ｉｇ不全のリスク決定および診断は、Ｉｇ不全がまだ診断されていない被験体において、特に重要である。このリスク決定には、したがって、予防的療法を可能にする初期診断が含まれる。
特に、本発明の調製物を、高リスク、例えば症状を伴わない粘膜Ｉｇ不全の高い確率を持つ患者（例えば４歳未満の小児、手術直前および手術後まもない患者、極度の身体的ストレス、例えば激しい運動を伴うスポーツまたは仕事の前後、あるいは病原体感染リスクが増加した旅行の際）に用いる。
リスク評価、および特に本発明にしたがった粘膜Ｉｇ不全の治療は、口、喉、鼻および耳、眼および食道、胃管および結腸管の感染性疾患で特に示される。
さらに好ましい使用は、微生物物質または生物、抗原または疾患を引き起こす剤、例えば毒素を含む病原体によって引き起こされる、疾患状態の防止である。例えば、入院患者は、院内感染のリスクを減少させるため、その免疫系を補強する必要がありうる。本発明記載の補助食品を与えられている新生ヒトまたは動物は、母親またはそれぞれの乳母から十分な母乳を得ることが不可能である場合に、生存のより高い可能性を有しうる。さらに、動物およびヒトにおける腸管病原性疾患のリスクは、本発明記載の食品によって減少させうる。特に、被験体がＳＩｇ不全に罹患している場合、病原体は、過剰毒性効果、すなわちそうでなければ疾患状態を引き起こさないであろう疾患誘発剤の用量での曝露に際しての疾患状態を誘導しうる。したがって、本発明記載の調製物は、ＳＩｇ不全のリスクがあるかまたはＳＩｇ不全に罹患している被験体において、こうした過剰毒性効果を防止するために特に提供される。
したがって、本発明は、上述のような免疫複合体調製物を産生する新規方法であって、産業規模産生を通じて、十分な量の安定で高品質な調製物を提供する大きな利点を有する、前記方法を指す。組換えＳＣおよび免疫複合体の新規調製物を改善された品質で提供する。
それによって、食品、健康維持製品として特に有用であり、釣り合いが取れた生理機能を回復し、そして維持するか、あるいは療法的および予防的使用を含む医学的目的のための、自然免疫複合体を提供することも可能である。
非コア・フコース、特にルイスグリカンが、生物の自然免疫の一部としてもまた、重要な役割を果たすことがわかった。表面抗原、毒素または受容体などの病原体構造、および宿主のグリカン構造の間の相互作用の解明が詳細に研究されている。
特に、ルイスグリコシル化は、宿主細胞へのヘリコバクター・ピロリ付着と相互作用しうる。８０％を超えるＨ．ピロリ株がＩＩ型ルイス抗原（ＬｅＸおよび／またはＬｅＹ）を発現し、そしてその半数は両方を発現する。より少ない比率のＨ．ピロリ株がＩ型ルイス血液型抗原（ＬｅＡおよび／またはＬｅＢ）を発現し、そして非常に少数がシアリル−ＬｅＸを発現する。
同様に、シアリル−ＬｅＸは、感染性心内膜炎と関連するいくつかの口腔細菌、例えばストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）およびエイケネラ・コロデンス（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）の細胞表面上で発現される。
ノロウイルスは、例えば急性胃腸炎の原因病原体である。これらは、宿主細胞上の組織−血液型抗原（ＨＢＧＡ）、すなわちＡＢＨ抗原およびルイス抗原に結合し、ここで、１型および２型炭水化物コア構造は、抗原的に別個の変異体を構成する。ヒト・ノロウイルスは、シアリルルイスｘネオ糖タンパク質を認識する。
クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ａおよび腸管病原性大腸菌のインチミンは、ＳＣのガラクトシルおよび／またはシアル酸残基に結合する。粘膜樹状細胞上のＤＣ−ＳＩＧＮは、ＳＩｇＡの推定上の受容体として作用し、そしてしたがって、樹状細胞は、粘膜表面の免疫監視において、Ｍ細胞と協力しうることが示されてきている。
本発明は、ＳＣのヒト様グリコシル化が、非ヒト種の選択された個体において見出され、そしてこうしたヒト様ＳＣが、ヒト様ＳＣを安定化させ、そして分泌型免疫グロブリンの天然機能を保持するのに有用な天然グリコシル化パターンを有する天然免疫グロブリンと、優先的に組み合わせて用いられるという発見に基づく。同じ種内のＳＣのグリコシル化パターンが広範囲で多様であり、したがって、乳製品を調製するために典型的に用いられる提供の大きなプールは、単離されたＳＣ上にルイスエピトープを含む有意なレベルのＮ−グリコシル化を含有しないであろうことがわかった。こうした一般的な大規模プールは、本発明の目的のための原材料には有用でないであろう。しかし、いくつかの個体において、ＳＣは、ヒト様の高レベルのルイスエピトープを有しうる。こうした個体は、大規模に、本発明にしたがった免疫複合体を製造するための原材料として使用可能な、大規模産生プールを調製するために適切であろう。あるいは、組換え産生法によって、それぞれのヒト様ＳＣを産生してもよい。次いで、原材料から得られるＳＣを、特に天然グリコシル化パターンを有するポリマー性免疫グロブリン分子を含むＩｇＡまたはＩｇＭ、特に非コア・フコシル化された免疫グロブリン鎖を含むものと組み合わせる。ポリマー性免疫グロブリンは、乳または血漿などの天然供給源から得られてもよいし、あるいは組換え的に産生されてもよい。あるいは、ＳＣおよび免疫グロブリンを含む本発明の免疫複合体を、例えば非コア・フコースまたはルイスエピトープの含量に関して選択された、大規模産生プールから直接単離し、そして精製してもよい。したがって、ｉｎ ｖｉｖｏで増加した安定性を持ち、粘膜中の回収および／または半減期の増加を生じる、貯蔵安定性製品または免疫複合体調製物を提供する度合いまで、安定化されたＳＣを含む、免疫複合体調製物を調製してもよい。
グリコシル化変動は、ＳＣを産生する細胞または生物の異なる生理学的状態、例えば感染、炎症性因子の存在、食物および栄養供給、ストレスなどで起こりうる。混合物におけるグリコシル化変動のさらなる供給源は、異なる遺伝的バックグラウンドおよびＳＣを産生する個々の生物または細胞の構成（例えば種、亜種、血液型、ｐＩｇＲ遺伝子型およびハプロタイプ等）でありうる。グリコシル化パターンを決定する、適切な分析法は、例えばＤｅｓｈｐａｎｄｅら（Ｊ． Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ． ２０１０， ９， １０６３−１０７５）に記載される。
ヒト乳は、ルイスエピトープを含有し、またブタ、ウマおよび他の種由来の乳は、ルイス抗原を含む糖タンパク質を含有すると報告されている。哺乳動物α１，２−およびα１，３／４−フコシルトランスフェラーゼは、Ａ、Ｂ、およびＨルイス血液型抗原およびルイス血液型関連炭水化物抗原（すなわち、ＬｅＸ、ＬｅＹ、ＬｅＡ、ＬｅＢ、シアリル−ＬｅＸ、およびシアリル−ＬｅＡ）の合成の最後の工程に関与する。産業規模で、非コア・フコシル化またはルイスグリコシル化ＳＣまたは免疫グロブリンを含むＳＣ免疫複合体を提供することは、未だに不可能である。
驚くべきことに、コア・フコシル化ＳＣに対して非コア・ルイスフコシル化ＳＣを、ＳＣグリコフォームの異種混合物（遊離または免疫グロブリンに結合）の平均よりも有意により多く産生する個々の発現系、例えば細胞クローンまたは動物、組換え生物または微生物を同定することが可能である。個々のクローンまたは動物間の相違は、予想外に高い可能性もある。
非コア・フコシル化が、クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ａへの組換えＳＣの結合において、役割を果たすことは、驚くべき発見である。これは、フコース残基が会合に関与しないと結論づけたＰｅｒｒｉｅｒら ２００６ Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ｖｏｌ． ２８１（２０）， ｐｐ． １４２８０−１４２８７とは対照的である。
別の驚くべき発見は、特定のグリコシル化モチーフのレベルが、ＳＣが特定の病原体抗原を中和する強度と相関しうることである。
さらなる驚くべき知見は、受容体ＤＣ−ＳＩＧＮに対する結合のレベルが、個々の乳試料間で非常に多様であり、そしてＤＣ−ＳＩＧＮへのＳＣの結合が、高マンノース含有グリカンの存在にもかかわらず、ルイスグリカンによって影響を受けることである。
ヒト様ＳＣを提供するため、非ヒト乳を改善されたＳＣの供給源として用いてもよい。個々の動物の乳試料から単離されたＳＣまたは免疫複合体を、非コア・フコースまたはルイスエピトープのモル濃度含有量に関して分析する。動物は、特定のヒトまたは獣医学的病原体に対して免疫されて高度免疫乳を提供してもまたは免疫されていなくてもよい。
遺伝的手段によって、例えばｐＩｇ受容体の発現に関するアッセイ、ｐＩｇＲハプロタイプ、および／または特定のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子、例えばＦＵＴ３、４、５、６、７、９、１０、１１および／または他のグリコシルトランスフェラーゼ（例えばベータ−３−ガラクトシル−トランスフェラーゼまたはベータ−４−ガラクトシル−トランスフェラーゼ）に関するアッセイによって、動物がより多くのＳＩｇＡまたはより多くの特定のグリコシル化を産生する可能性に関して、動物をあらかじめスクリーニングしてもよく、そしてこうした目的のために、集団を交配させてもよい。
次いで、こうした動物を同定し、そして適切な発現産物のために選択する。
次いで、上に記載するような非コア・フコシル化またはルイスフコシル化ＳＣを含む発現産物を、好ましくはプールし、そして本発明にしたがった免疫複合体の調製のための供給源として用いる。
実際、ヒト母乳以外の供給源に由来する、本発明にしたがって用いられるようなヒト様ＳＣは、多くの病原体に対して広い範囲の中和活性を持つヒト天然ＳＣと比較して、類似のまたはさらに改善された特性を有する。本明細書において、用語「病原体」には、常に、微生物および毒素が含まれ、また、細菌、真菌、ウイルスおよび原生動物細胞および産物、特にヒトまたは獣医学的病原体が含まれる。
本発明記載の調製物が、経口摂取後、粘膜通過を含む天然機能を維持する免疫グロブリンの適切な混合物を高い力価で含むことが好ましい。
本発明記載の免疫複合体調製物は、ＳＣのＮ−グリコシル化パターンにおける標準化された多量の非コア・フコースまたはルイスエピトープのため、強度が高い利点を有する。それによって、免疫複合体調製物の抗微生物または抗毒素効果を含む、抗病原体効果が有意に増加しうる。
主な選択基準は、望ましい免疫を与えることが立証されている、ルイスエピトープのタイプおよび量に関する。好ましいルイスエピトープは、天然供給源において、平均的な普及よりも有意に増加している、ＬｅＢエピトープである。やはり好ましいのは、ＳＣ上のルイスｘおよびシアル化ルイスｘエピトープの存在である。乳由来産物中の好ましい相対増加は、プールサイズが少なくとも１００個体から得られる、選択されない個体由来のプールされた供給源のシグナルを、非選択試料の標準偏差の少なくとも２倍超過したＥＬＩＳＡシグナルの増加である。典型的には、特に反芻動物、例えばウシ、ヒツジまたはヤギの、少なくとも１００個体由来の乳腺産物のプールは、標準ＥＬＩＳＡ技術によって決定された際、平均して、０．０１モルより有意に低い非コア・フコースまたはルイスエピトープ／モルＳＣ、通常、０．００５モル未満／モル、大部分の場合、さらに検出不能なルイス抗原を有する。
しかし、本発明は、少なくとも０．０１モル／モルＳＣ、そして特に理論値の少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％または少なくとも１０％の非コア・フコースまたはルイスエピトープである、非コア・フコースまたはルイスエピトープに関するその品質にしたがって、個体、乳腺分泌物の個々の試料またはプール、培養上清または細胞抽出物の好ましい選択を提供する。より高い非コア・フコースまたはルイスグリコシル化レベル、例えば少なくとも０．０１モル／モルＳＣ、好ましくは少なくとも０．０２モル／モルＳＣ、より好ましくは少なくとも０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、または０．１モル／モルＳＣ、より好ましくは、少なくとも０．２、０．３、０．４、または０．５モル／モルＳＣ、さらにより好ましくは少なくとも１モル／モルＳＣまたはさらにより高く、例えば少なくとも２モル／モルＳＣ、少なくとも３モル／モルＳＣ、少なくとも４モル／モルＳＣ、少なくとも５モル／モルＳＣ、少なくとも６モル／モルＳＣ、少なくとも７モル／モルＳＣ、少なくとも８モル／モルＳＣ、少なくとも９モル／モルＳＣ、または少なくとも１０モル／モルＳＣにしたがって、さらにより好ましい選択を行う。特定の場合、Ｎ−グリコシル化部位の理論値は、２（天然ウシＳＣ）、３（天然ウマＳＣ）、および７（天然ヒトＳＣ）モル／モルに達する。本発明にしたがって、グリコシル化部位の理論値の少なくとも１％、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０％、より好ましくはグリコシル化部位の理論値の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または最大９０％のルイスエピトープの量にしたがって、選択を行うことが特に好ましい。
非コア・フコースの量は、例えばＮ−グリコシル化部位あたりの多数のフコシル化を通じて、Ｎ−グリコシル化部位の理論的量を超過し、それによって、モルに基づいてＮ−グリコシル化部位の数よりも多いルイスエピトープ、例えば少なくとも１．１倍、好ましくは少なくとも１．２倍、または少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、または少なくとも２倍のルイスエピトープを得ることも可能であり、特定の場合、量はさらに高く、例えばＮ−グリコシル化部位の理論量の少なくとも３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍、または少なくとも６倍、または少なくとも７倍、または少なくとも８倍、または少なくとも９倍、例えば最大１０倍である。
個体由来または選択プール、すなわちプールした試料由来の試料の決定に基づいて、選択を行ってもよく、ここで、プールは１０またはそれより多い個体から得られる。次いで、選択基準にしたがって、非コア・フコースまたはルイス陽性であることが立証されている材料をプールして、本発明にしたがった免疫複合体調製物の産業規模産生に用いようとする原材料として産生プールを提供してもよい。立証された高品質グリコシル化プロファイルを有する産生プールは、少なくとも１０、より好ましくは少なくとも５０、１００、５００、１，０００または２，０００提供の好ましいサイズ、あるいは好ましくは少なくとも１０、５０、１００、５００、１０００、２０００、１０，０００または２０，０００リットルを有する。品質管理測定として、通常、適切なグリコシル化の存在を工程内管理および／または最終産物管理によって確認する。最終産物は、典型的には、望ましいグリコシル化パターンにしたがって標準化される。
ＳＣおよび／またはＳＩｇＡまたはＳＩｇＭ上の非コア・フコースを決定するための例示的な試験系を、以下の実施例セクションに記載する。高感度の決定法は、標準ＲＰ−ＥＳＩ−ＭＳＭＳ（ＲＰ−ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳＭＳ、逆相高性能液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレーイオン化−タンデム質量分析）によるグリカン分析を指す。以下の原理に基づいて、非コア・フコースまたはルイス型フコシル化のレベルまたは度合いを試験してもよい：
グリカンプロファイルおよびしたがって、所定のグリコシル化部位に付着したオリゴ糖の特定の組成の量を、ＳＣ由来の糖ペプチドの質量分析によって、決定してもよい（Ｓｔａｄｌｍａｎｎ ２００８， Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ８， ２８５８−２８７１； Ｗｕｈｒｅｒ ２００７， Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ７， ４０７０−４０８１）。いくつかの潜在的なグリコシル化部位を含む、ＳＣ上のグリカンのアンテナに付着したフコース−残基の特定の場合（ルイスグリコシル化）、以下の戦略を適用してもよい。
ＳＩｇＡ調製物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、そしてＳＣバンドを溶出させる。該ＳＣは、Ｓ−アルキル化されており、そしてトリプシンまたは別の適切なプロテアーゼで消化させる。該試料をさらに、最も内部のＧｌｃＮＡｃ残基へのアルファ−１，６−連結中のフコース残基（コア・フコシル化）を特異的に除去することが可能なフコシダーゼでの処理に供する。こうした酵素の例は、ウシ腎臓由来のフコシダーゼである。
ペプチドおよび糖ペプチドの生じる混合物を、次いで、好ましくは例えば逆相クロマトグラフィによるクロマトグラフィ分離の後に、質量分析によって分析する。プロテアーゼ、クロマトグラフィカラムおよび溶媒勾配を適切に選択すると、各グリコシル化部位は、ピークによって示される。タンパク質のアミノ酸配列から、Ａｓｎ連結グリコシル化の潜在的な部位を推定することも可能である。
最も逆相であるカラム上での、例えばＷａｔｅｒｓ ＢｉｏＢａｓｉｃ Ｃ１８カラム上での保持は、単に、ペプチド部分に頼るため、このピークは、所定のペプチドのすべてのグリコフォームおよびしたがってグリコシル化部位をカバーする。
所定の部位の糖ペプチドは、いくつかの手段によって同定可能である：
１．）通常観察される不均一性のため、これらは、例えばヘキソース（１６２，０５Ｄａ）、シアル酸（２９１．０９Ｄａ）、Ｎ−アセチルヘキソサミン（２０３．０８Ｄａ）またはフコース残基（１４６．０６Ｄａ）の質量によって異なる、一連のピークを形成する。
２．）ＥＳＬ−またはＭＡＬＤＩ−ＭＳによるＭＳＭＳ断片化は、グリカンの配列および根底にあるペプチドの質量を明らかにしうる。
３．）ペプチド：Ｎ−グリコシダーゼ（ＦまたはＡ）による酵素的除去は、Ｇｌｎ（グルタミン）残基の代わりにＧｌｕ（グルタミン酸）を含有する脱グリコシル化ペプチドを生じ、これは、１Ｄａの質量相違を生じるであろう。この脱グリコシル化ペプチドの質量は、１．）および２．）で得られたかまたは用いられた仮定とマッチしなければならない。
糖ペプチドピークがひとたび同定されたら、ピーク「量」すなわち特定の糖ペプチド種に対応するピーク下面積を適切な方法によって測定するが、これは、１つの分析物がしばしば、２またはそれより多い電荷状態を生じることを考慮に入れることも可能である。イオン化およびしたがって糖ペプチドの検出は、ペプチド部分によって支配されるため、ピーク量を、直接、グリコフォームのモル比率に置き換えることも可能である（Ｓｔａｄｌｍａｎｎ， ２００８， Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ８， ２８５８−２８７１）。
特定の部位に存在するグリコフォームのリストから、フコシル化グリカンのモル分画を計算する。異なる部位に関する結果を付加して、特定の構造特徴が、特定のＳＣ試料上に存在するモル比率に到達する。例えば、ＭＳ検出を伴う多孔性黒鉛上のクロマトグラフィによる遊離Ｎ−グリカンの分析によって、コア−フコース除去の完全性を検証することも可能である（Ｐａｂｓｔ ２００７， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ７９， ５０５１−５０５７）。
多数の個々の供給源または調製物をスクリーニングするため、単純でそして迅速なアッセイ、例えば側方流動アッセイを用いてもよい。さらにまたはあるいは、ルイス型グリコシル化特異的リガンド、例えば多様なルイスエピトープに対する抗体または別の足場結合剤（例えば抗ルイスａ、抗ルイスｂ、抗ルイスｘ、抗ルイスｙ、抗シアリルルイスｘ）、ヒトレクチンＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＤ２０９（表面抗原分類２０９）としても知られる樹状細胞特異的細胞間接着分子３−非インテグリングラビングを使用したＥＬＩＳＡアッセイを用いる。ルイスエピトープに対する他のレクチン結合の例は、イソレクチンＡ、ヒイロチャワンタケ（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ）凝集素、トロンボモジュリン、ランゲリン、スカベンジャー受容体Ｃ型レクチン、Ｅ−セレクチン、シグレック、ＳＩＧＮ−受容体およびヒト・ロタウイルスのウイルスタンパク質８（ＶＰ８）である。
陽性対照として、典型的にはヒト材料を用いる。陰性対照として、プールされた商業的（すなわち選択されない、非ヒト）供給源由来の非フコシル化タンパク質、例えばＢＳＡまたは任意の分泌型免疫グロブリン調製物を用い、こうした供給源は、いかなる場合でも、モルＳＣあたり、平均０．０１モル未満の非コア・フコースを含む。ＳＣおよび／または分泌型免疫グロブリン調製物における非コア・フコースまたはルイスエピトープを決定する結果を、典型的には、モルＳＣあたりの非コア・フコースあるいはＳＩｇＡまたはＳＩｇＭのあらかじめ決定された量、例えば０．０１モル／モル（＋／−２０％）を伴う参照に比較する。したがって、結果は、半定量的であることも可能であり、そして参照量「より高い」または「未満」と称する。あるいは、例えば、異なるレベルの非コア・フコシル化またはルイスエピトープを含む一連の参照を含む適切な較正によって、定量的決定が可能であろう。標準的強度試験は、クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ａ、ヘリコバクター属、大腸菌毒素、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ロタウイルス、ノロウイルスの少なくとも１つの中和活性または結合アッセイ、あるいはリポ多糖、リポテイコ酸、ペプチドグリカン、キーホールリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン、ＤＣ−ＳＩＧＮ、イソレクチンＡ、ヒイロチャワンタケ凝集素、トロンボモジュリン、ランゲリン、スカベンジャー受容体Ｃ型レクチン、Ｅ−セレクチン、シグレック、ＳＩＧＮ−受容体との競合、結合阻害または他の相互作用を指す。
好ましくは、ドナー発現系は、ドナーの乳または乳分画から、分泌成分および場合によって免疫複合体調製物を得るため、泌乳期中の非ヒト雌性個体で構成される。例示的な原材料は、それぞれ、遊離分泌成分、ポリマー性免疫グロブリンおよび免疫複合体を濃縮された形で含有する、例えば、ホエイ、または乾燥ホエイである。好ましい原材料は、免疫グロブリンが、少なくとも２倍、３倍、４倍、または５倍濃縮されている可能性もある。
次いで、ＳＣまたは免疫複合体を、精製された型で、こうした原材料から得て、本発明にしたがった免疫複合体産物を調製することも可能である。
本発明にしたがった免疫複合体を産生するために別に用いられる発現系はまた、組換え発現系であることも可能であり、とりわけ、すべての種および分類群の組換え宿主細胞、例えば組換え真核宿主であることも可能である。
したがって、アミノ酸配列、例えば配列番号１または任意の機能的に活性である変異体配列、あるいはＳＣをコードするヌクレオチド配列を使用して、組換え宿主を調製してもよい。配列は、好ましくは、哺乳動物起源、例えばヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジまたは非ヒトＳＣ配列のヒト化型、あるいはキメラのＳＣをコードし、常に機能性変異体が含まれる。それぞれの配列情報は図に提供されるか、または適切であるように公的データベースから得られうる。
現在までの組換えＳＣは、分泌成分のグリカンにルイス型フコシル化を付加することが不可能な宿主において産生されてきている。一般的に用いられる精製組換えＳＣの宿主は、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、マウスＪ５５８Ｌ細胞、昆虫細胞およびタバコ植物であった。
ｐＩｇＲ、例えばヒトｐＩｇＲの完全遺伝子のいずれかを宿主細胞に導入し、続いて膜貫通タンパク質ｐＩｇＲを発現させ、その後、細胞外部分、ＳＣを切断し、そして培養上清に遊離させることによって、組換えＳＣを産生することも可能である。別の発現は、ＳＣ、すなわち細胞外ドメインのみのヌクレオチド配列、例えば配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列の転写である。すべての場合で、組換えＳＣの発現によって、最終産物の均質なＣ末端を保証する産生条件の正確な選択が可能になる。
これはまた、必要に応じた翻訳終結部位を選択することも可能にする。好ましくは、発現しようとするＳＣ遺伝子上の停止コドンは、最後の細胞外免疫グロブリン様ドメインをコードする領域（すなわちヒトＳＣ中のドメイン５）および膜貫通領域の間に位置する。しかし、本発明の組換えＳＣは、結合可能であり、そして非コア・フコースの必要なレベルを含有する限り、さらに短くてもよく、例えば５全長ドメイン未満、または４ドメイン未満、または３ドメイン未満、または２ドメイン未満、例えば少なくとも第一のドメインを含む。
配列番号１の最初の１８アミノ酸は、用いる宿主細胞または生物、および必要な分泌効率に応じて、異なるシグナルペプチドによって置換されてもよいシグナルペプチドを含む。ＳＣの化学合成による産生または細胞内産生のため、シグナルペプチドは必要ではない（例えば大腸菌封入体における非グリコシル化型の産生のため）。また、タンパク質を修飾して、配列番号１のＣ末端でさらなるアミノ酸を含有させてもよい。
タンパク質は、アミノ酸Ｇ５４５の後のそれぞれの核酸の必要な位の停止コドンによって、好ましくはＫ５６６およびＥ６０７の間の任意のアミノ酸で（これらの部位を含む）、より好ましくはＲ６０３およびＥ６０７の間（これらの部位を含む）、またはＥ６０７の後でタンパク質を終結させてもよい。より好ましくは、ＳＣはＲ６０３の後で終結する。番号付けは配列番号１を指す。
好ましくは、本発明のＳＣ調製物は均質であり、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、最大１００％のＳＣ分子が同じＣ末端を有する。
組換えＳＣのグリカンパターンは、宿主種、宿主生物、起源の組織および遺伝子操作細胞の生理学的状態に応じる。
好ましくは、宿主細胞は、ヒト細胞、例えばＰｅｒＣ．６、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ネズミ細胞、鳥類細胞株、細菌、酵母、真菌、植物および昆虫細胞からなる群より選択される。それによって、組換えＳＣは、望ましい非コア・フコシル化またはルイス型Ｎ−グリコシル化を伴って得られることも可能である。
高い非コア・フコシル化（ＳＣモルあたり）を伴うＳＣを選択することによって、本発明の調製物における非コア・フコシル化の度合いを増加させてもよい。これは、産生宿主の選択レベルで実行可能であり（細胞株、微生物クローンまたは生物に関するスクリーニングなど）、これはまた、これらの試料のその後のプールのため、高モル非コア・フコシル化を伴うＳＣを含有する分泌物を提供するよう選択される個々のドナーのレベルでも実行可能である。本発明のＳＣまたは自然免疫複合体の調製物の酵素的または化学的フコシル化によって、フコシル化を増加させてもよい。
正常組織は、特定の部位（例えば結腸、精巣）で、そして特定の発生段階（胎児抗原）中に、ルイスエピトープの発現を示す。その結果、特定の部位由来の特定の細胞株、例えば結腸癌細胞株がルイス抗原を発現する。Ｃａｃｏ−２細胞は、分化中に、Ｈ １型血液型抗原および少量のＬｅＢのみを発現する。多様な細胞株（ＨＴ−２９、ＡＧＳ、Ｋａｔｏ ＩＩＩ、ＨｕＴｕ−８０、およびＨＥｐ−２）、ならびに初代胃細胞が、ルイス抗原発現に関して研究されてきている。しかし、これらの多くは、培養が困難であり、そして生得的な遺伝的不安定性のため、それぞれのルイス型Ｎ−グルコシル化を産生する産生宿主として適していないであろう。
植物Ｎ−グリカンは、オリゴマンノース性（Ｍａｎ＞５ＧｌｃＮＡｃ２）、パウシマンノース性および複合タイプの型である。ＬｅＡ部分は、Ｎ−グリカンのアンテナに位置し、単子葉植物および双子葉植物だけでなく、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）（雌雄同体のコケ）および多様なコケ植物（ｂｒｙｏｐｈｙｔｅ）種においても検出されてきている。ＬｅＡは、すべての植物組織（花、葉、根、および実生）中で発現され、若い組織（葉および根）では、原因であるα１，４−ＦｕｃＴ活性が支配的である。しかし、植物において発現されるＳＩｇＡは、これまで、いかなるルイス型グリコシル化も示していなかった。
ルイスエピトープを含むＮ−グリコシル化タンパク質を産生可能である同じ宿主における、ポリマー性免疫グロブリン（例えば二量体ＩｇＡまたは五量体ＩｇＭ）およびＳＣの同時発現は、非天然であり、そしてしたがって好ましくない、ルイスグリコシル化重鎖を導く。
したがって、本質的に望ましい方式で、すなわち遺伝的方式で、あるいは、そうでなければそれぞれの遺伝子修飾を通じて、例えば組換え技術を通じて、後天性または一過性能力によって、糖タンパク質をグリコシル化することが可能な発現系を用いて、それぞれのグリコシル化パターンを提供することが特に好ましい。例示的な発現系は、例えばフコシルトランスフェラーゼ２および３、ならびにベータ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼＩ、ＩＩおよびＶの同時発現を通じて、ルイス−フコシル化Ｎ−糖タンパク質を産生する増進した能力を有する。
非コア・フコシル化またはルイスグリコシル化オリゴ糖および複合糖質を産生するよう操作された宿主は、例えば、血液型関連抗原を含むオリゴ糖、糖タンパク質または糖脂質を産生するため、多様なグリコシルトランスフェラーゼ、例えばフコシルトランスフェラーゼを発現する産生細胞株である。
血液型関連グリコシル化を生成するトランスジェニック動物が記載されてきている（例えばＷＯ１９９５０２４４９５Ａ１またはＸｕら。上記を参照されたい）。しかし、先行技術のトランスジェニック生物は、ルイス−フコシル化ＩｇＡまたはＩｇＭを同時に提供するであろうし、これは過剰な非コア・フコシル化および非天然グリコシル化パターンを有するであろう。したがって、免疫複合体調製物は、特に、こうしたトランスジェニック動物の乳から得られない。
操作されたＣＨＯ細胞は、ルイス型フコシル化を生じることが記載されてきている（Ｌｏｅｆｌｉｎｇら ２００８， Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ． １８ ｎｏ． ７ ｐｐ． ４９４−５０１）。また、ルイス型フコシル化Ｎ−グリカンを生成する能力を持つＣＨＯ細胞の機能獲得型突然変異体が記載されてきている（Ｎｏｒｔｈら ２０１０， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ｖｏｌ ２８５ ｐｐ． ５７５９−５７７５）。しかし、こうした宿主細胞における完全ＳＩｇＡの発現は、非天然グリコシル化を伴うルイス−フコシル化アルファ−免疫グロブリン鎖を導くであろう。こうした細胞は、したがって、本発明にしたがった適切なグリコシル化の選択後、ヒト様ＳＣを産生するためだけに使用可能である。上述のような乳試料のスクリーニングのために記載されるように、適切な組換え宿主細胞クローンの選択が行われる。ＬｏｅｆｌｉｎｇらおよびＮｏｒｔｈらに記載されるものと、より異なるルイス型グリコシル化およびより遺伝的に安定な突然変異体に関して、操作し、スクリーニングし、そして選択することが好ましい。次いで、こうした宿主細胞由来の組換えＳＣを用いて、任意の供給源由来の非ルイスフコシル化（すなわち天然グリコシル化）免疫グロブリンを含む、本発明記載の免疫複合体を調製する。
具体的には、パイロットまたは産業規模のバイオリアクター中で、少なくとも１ｍｇ／Ｌ培地、好ましくは少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは少なくとも１ｇ／Ｌの収量で、ルイス−グリコシル化ＳＣを発現する条件を使用して、組換え宿主細胞株を培養することが好ましい。
本発明記載の宿主細胞は、好ましくは、以下の試験によってその発現能または収量に関して試験される：ＥＬＩＳＡ、活性アッセイ、ＨＰＬＣ、あるいは本発明にしたがったＳＣまたは免疫複合体の量および品質を示す、他の適切な試験。発現レベルに関してだけでなく、提供可能なＳＣのグリコシル化パターンに関しても、宿主細胞を選択する：例えばルイスａ、ルイスｂ、ルイスｘおよびルイスｙまたはそのシアル化型の少なくとも１つが、組換えＳＣ上で見出されるはずである。好ましくは、ルイスｘおよび／またはシアリル−ルイスｘが試料中に存在する。より好ましくは、ＳＣ上の１より多いタイプのルイス抗原が試料中に存在する。
好ましい発酵技術は、バッチ、流加培養、または連続培養、例えば灌流培養である。
好ましくは、産生細胞株を、適切な炭素供給源を含む無機培地中で培養し、それによって、単離プロセスを有意にさらに単純化させる。好ましい無機培地の例は、利用可能な炭素供給源（例えばグルコース、グリセロールまたはメタノール）、多量元素（カリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウム、塩素、硫酸、リン酸）および希元素（銅、ヨウ素、マンガン、モリブデン、コバルト、亜鉛、および鉄塩、ならびにホウ酸）、ならびに場合によって例えば栄養要求性を補完するためのビタミンまたはアミノ酸を含有するものである。
発現系の性質に応じて、細胞または培地から精製可能なＳＣの発現を達成するのに適した条件下で、形質転換細胞を培養する。当業者に理解されるであろうように、培養条件は、宿主細胞のタイプおよび使用する特定の発現ベクターを含む要因に応じて、多様であろう。
ＳＣが細胞から分泌される場合、最新技術を用いて、培地から単離し、そして精製することも可能である。組換え発現産物の分泌は、産物が典型的には、細胞が破壊されて細胞内タンパク質が遊離する結果、タンパク質の複雑な混合物からよりも培養上清から回収されるため、一般的に、精製プロセスを促進する工程を含むため、好適である。
また、培養形質転換細胞を、超音波でまたは機械的に、酵素的にまたは化学的に破壊して、ＳＣを単離しそして精製する、望ましいＳＣを含有する細胞抽出物を得ることも可能である。
遺伝子操作技術に加えて、ＳＣへのルイス−グリコシル化オリゴ糖の化学的コンジュゲート化、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＳＣ上のルイス抗原を生成するフコースの酵素的付加、あるいはルイス−グリコシル化特異的リガンド結合による、プールされた供給源からのＳＣまたは分泌型免疫グロブリンの濃縮を提供することもまた可能である（例えばルイス抗原への特異的な抗体または別の足場の結合、特異的レクチン、例えばＤＣ−ＳＩＧＮ、トロンボモジュリン、ロータス・テトラゴノロブス（Ｌｏｔｕｓ ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ）由来のイソレクチンＡおよびヒイロチャワンタケ凝集素、特定のシグレック、セレクチン）。
ＳＣまたは免疫複合体を得るために用いられる、本発明にしたがった単離および精製法は、可溶性の相違を利用する、例えば塩析および溶媒沈降、分子量の相違、例えば限外濾過およびゲル電気泳動、電荷の相違、例えばイオン交換クロマトグラフィであるか、あるいは、特異的アフィニティを利用する、例えばアフィニティクロマトグラフィであるか、あるいは疎水性の相違を利用する、例えば逆相高性能液体クロマトグラフィであるか、あるいは等電点の相違を利用する、例えば等電点電気泳動であることも可能である。好ましくは、任意のＳＣポリペプチドのみを、または免疫グロブリンと複合体化したＳＣポリペプチドを分離するために使用される特定の精製工程は、１００ｋＤａ〜５００ｋＤａの間の分子カットオフを用いた限外濾過技術、および硫酸アンモニウムなどの塩または有機溶媒を用いた沈降などの沈降技術である。
慣用的な方法、例えばウェスタンブロットまたはその活性のアッセイ、例えば二量体ＩｇＡまたはＪ鎖に結合する能力によって、またはＳＣに対する特異的抗血清での検出によって、単離されおよび精製されたＳＣを同定しそして分析してもよい。
アミノ酸分析、アミノ末端分析、一次構造分析、糖分析等によって、精製化合物の構造を定義してもよい。ＳＣ化合物が多量にそして特定の場合、高純度で得られうることが好ましく、したがって、薬学的組成物中の活性成分として用いようとする本発明記載の免疫複合体の一部として用いられるための必要要件を満たす。
本発明記載の免疫複合体調製物は、好ましくは、食品として用いられ、例えば、病原体によって引き起こされる疾患状態のリスクがあるかまたはこれに罹患している、特定の食餌の必要がある被験体に、特定の食餌を提供する。
さらなる好ましい使用は、微生物物質または生物、抗原または疾患誘因剤、例えば毒素を含む、病原体によって引き起こされる疾患または障害の防止である。例えば、入院患者は、院内感染のリスクを減少させるため、その免疫系を補強する必要がありうる。本発明記載の補助食品を与えられている新生ヒトまたは動物は、母親またはそれぞれの乳母から十分な初乳を得ることが不可能である場合に、生存のより高い可能性を有しうる。さらに、動物およびヒトにおける腸管病原性疾患のリスクは、こうした食品によって減少させうる。
本発明記載の調製物を用いて、口、喉、鼻および耳、眼および食道、胃管および結腸管の感染性疾患を治療することも可能である。
適切には、本発明記載の調製物を、場合によって、タンパク質、炭水化物、脂質、および他の生理学的活性物質などのさらなる栄養物質を提供する配合物中で提供してもよい。
本発明記載にしたがって産生される調製物には、牛乳およびいずれかの乳製品の副産物であるホエイ粉末が含まれる。本発明記載のホエイに基づく製品は、さらに、例えば、血清アルブミン、ラクトアルブミン、ラクトグロブリン、ラクトフェリン、ラクトペルオキシダーゼ、オリゴ糖、ペプチド、ラクトースおよびミネラルを含む。いくつかの場合、過剰免疫成体由来の乳またはホエイから産物を得て、本発明にしたがった調製物が、疾患生物、病原体または疾患関連抗原の特定の群と反応性である、ある程度増加したレベルの免疫グロブリンを含有する。
本発明は特に、天然グリコシル化パターンを有する、すなわちＮ−グリカン上にルイスエピトープを含まない、ＩｇＡまたはＩｇＭ分子による、ルイスグリコシル化機能性ヒト様ＳＣの安定化を含む。
安定化免疫複合体は、タンパク質のｐＨ安定性および／またはプロテアーゼ安定性によって測定した際、増加した熱安定性および／または胃腸安定性を有し、これが回収増加またはｉｎ ｖｉｖｏ半減期の延長を生じうる。安定化効果は、粘膜回復に特に重要である。本発明記載の調製物の投与に際して、ＥＬＩＳＡなどの免疫学的技術によって、粘膜における免疫複合体の免疫活性を決定してもよい。粘膜中の免疫グロブリンの増加したレベルは、増加した回復を示す。
本発明記載の調製物は、さらに、遊離未結合ＳＣ、ならびに免疫グロブリンと複合体化したＳＣを含んでもよく、こうしたＳＣはその機能特性をさらに増進しうる。
本発明の好ましい態様は、多様な病原性抗原を中和することが可能な、タンパク質分解的に安定な多価および多重特異性分子を提供するため、自然抗体に付着する本発明にしたがったＳＣ分子である。
本発明にしたがった免疫複合体調製物が、５〜１００％ｗ／ｗ分泌型免疫グロブリン（すなわちＳＣと複合体化した多重免疫グロブリン）を含有することがさらに好ましい。より具体的には、調製物は、２０〜７０％のｗ／ｗ分泌型免疫グロブリンを含有してもよい。
本発明にしたがった調製物はまた、好ましくは、炭水化物などの他の構成要素を含有することも可能である。炭水化物は、好ましくは、ホエイタンパク質濃縮物から供給され、そして０〜９５％ｗ／ｗの間の濃度で、調製物中に存在する。より好ましくは、炭水化物は、３０〜９０％ｗ／ｗの間で存在する。炭水化物は、容易に利用可能なエネルギー供給源を提供する。
デキストロースもまた、好ましくは、炭水化物添加物として用いられ、これは、粉末の凝集を防止するのを補助し、そして炭水化物のさらなる型を提供する調製物中に含まれてもよい。
さらに好ましい添加物は、ホエイタンパク質であり、これはさらに、免疫グロブリン調製物、栄養目的のためのアミノ酸、オリゴ糖、および調製物の生理学的値を増進させる物質を安定化させうる。
本発明記載の配合物中に、有機酸、植物エッセンシャルオイル、カチオン、コロイド銀または四級アンモニウム塩を含む、抗微生物物質、例えば抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤、または殺微生物物質を含むこともまた好ましい可能性もある。
本発明記載の配合物を、液体、エマルジョン、懸濁物、スラリーとして、あるいは乾燥型、例えば粉末または顆粒の形で、提供することが特に好ましい。
特に好ましい配合物を、粉末または顆粒として製造し、これは使用直前に液体内に配合することも可能である。
さらに好ましい投与型は、錠剤、ロゼンジ、カプセル、ペースト、顆粒、クリーム等であり、これらは、標準法によって産生可能である。錠剤は、好ましくは、補助添加剤、例えば充填剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、フレーバー等を含有する。イソマルトースを用いて、顆粒を産生してもよい。１ｍｇ〜１０ｇの免疫複合体の１日用量を、ヒトにおいて使用するための本発明記載の配合物中で提供してもよい。
粘膜の部位で、例えば粘膜部位（鼻、口、眼、食道、喉、肺、耳、胃管、腸および結腸）、例えば局所的であって全身作用を伴わずに、作用するように配合された調製物を提供することがさらに好ましい。本発明記載の調製物は、典型的には、口、鼻、気管支、膣、結腸使用を含む、経口または粘膜使用のために提供されて、例えば、咽頭、腸、泌尿生殖器管および歯肉上皮への接着を阻害する。局所適用に適した型で、例えばクリーム、スプレーまたは小滴中で、特定の医学的適応のため、調製物を提供してもよい。
本発明にしたがった免疫複合体調製物を、感染および／または炎症および／またはアレルギー症状および／または自己免疫疾患症状および／または粘膜表面、例えば胃腸管、泌尿生殖器管、呼吸管、鼻腔、眼または口腔の免疫グロブリン不全を治療しそして／または防止するため、特に術後または入院中に、特に用いてもよい。
前述の説明は、以下の実施例を参照するとより完全に理解されるであろう。しかし、こうした例は、単に本発明の１またはそれより多い態様を実施する方法の代表的なものであり、そして本発明の範囲を限定すると読み取ってはならない。
実施例１
ルイスグリコシル化ＳＩｇＡのための乳およびホエイ試料のスクリーニング
試料調製物（乳、ホエイ）
ヤギ、ヒツジまたはウシ由来の１０ｍｌの乳を、新鮮に試料採取し、そして４０，０００ｘｇで３０分間、４℃で遠心分離する。脂肪層をスパーテルで取り除き；残った液体を新規遠心管内に移し、そして再び、４０，０００ｘｇで３０分間遠心分離した。
液層（乳清）を分注し、そして−２０℃で保存するかまたは直接スクリーニングに用いた。
陽性対照試料
陽性試料として、ヒト乳を上述のように調製する。
陰性対照試料
ウシ乳の陰性対照として、（Ｖｏｌｌｍｉｌｃｈ、３．５％脂肪、Ｎｉｅｄｅｒｏｅｓｔｅｒｒｅｉｃｈｉｓｃｈｅ Ｍｏｌｋｅｒｅｉ、オーストリア）を用いる。
ヤギ乳の陰性対照「Ｊａ Ｎａｔｕｅｒｌｉｃｈ」、Ｚｉｅｇｅｎｍｉｌｃｈ、Ｓｅｎｎｅｒｅｉ Ｚｉｌｌｅｒｔａｌ、オーストリアを用いる。
スクリーニングＥＬＩＳＡ
標準的ＥＬＩＳＡ形式でスクリーニングを行う：ヤギ乳試料のスクリーニングのため、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉ−Ｓｏｒｐ Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｌａｔｅ）を、ウェルあたり１００マイクロリットルで、ｍｌコーティング緩衝液（１０００ｍｌ蒸留水中、３．０３ｇ Ｎａ２ＣＯ３、６．０ｇ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）あたり１マイクログラムの濃度で、ポリクローナルウサギ抗ヤギＩｇＡ（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ第ＡＡＩ４４）でコーティングする。ウシ乳試料またはヒツジ乳試料のスクリーニングのため、抗ウシＩｇＡ（Ｇｅｎａｔａｕｒ、第ＲＡ−１０Ａ、ベルギー）または抗ヒツジＩｇＡ（ＬＳＢｉｏ、第ＬＳ−Ｃ５７１１０、ＵＳＡ）を、それぞれ、プレートにコーティングする。陽性対照試料のため、抗ヒトＩｇＡ抗体をそれぞれのウェルにコーティングする（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、第Ａ８０−１０３Ａ、ＵＳＡ）。プレートを蓋で閉じて、そして４℃で一晩インキュベーションする。
次の工程の前に、コーティング溶液を取り除き、そして２００μｌのＴＰＢＳ（５００ｍｌ蒸留水、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０中、１．１６ｇ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．１ｇ ＫＣｌ、０．１ｇ Ｋ３ＰＯ４、４．０ｇ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）でウェルを満たすことによって、プレートを３回洗浄する。プレートをシンクの上で軽く叩くことによって、溶液または洗浄液を除去する。紙タオル上でプレートを軽く叩くことによって、残りの滴を除去する。あるいは、ＥＬＩＳＡ洗浄装置で洗浄を行ってもよい。
プレートをＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ、第３７５１５）１５０マイクロリットル／ウェルで満たし、そして室温で２時間インキュベーションする。
再び、プレートを上述のように洗浄する。
乳清試料を試料ＴＰＢＳで希釈する（１：２および１：１０）。各希釈（１：２および１：１０）に関して１６の陰性対照を各プレートに添加する。各希釈に関する４つの陽性対照試料をプレートに添加する。それぞれの希釈の１００マイクロリットルを、洗浄したプレートのウェルに添加し、そして室温で２時間インキュベーションする。
洗浄後、ＴＰＢＳ中の抗ルイスｘ抗体（ＬＳＢｉｏ、第ＬＳ−Ｃ７５８２９）、抗シアリル−ルイスａ抗体（ＬＳＢｉｏ、第ＬＳ−Ｃ３３８２０）、抗ルイスａ抗体（ＬＳＢｉｏ、第ＬＳ−Ｃ５０５１２）、抗シアリル−ルイスｂ抗体（Ｇｅｎｅ Ｔｅｘ、第ＧＴＸ７２３７８、ＵＳＡ １：３００）、抗ルイスｂ抗体（ＬＳＢｉｏ、第ＬＳ−Ｃ４６０４９）および抗ルイスｙ抗体（ＬＳＢｉｏ、第ＬＳ−Ｃ７１６７４、ＵＳＡ、１：５０）希釈の１００マイクロリットルの混合物を、それぞれの試料ウェルに、そして陰性および陽性対照試料ウェルに添加する。
プレートを再び室温で２時間インキュベーションし、そして続いて洗浄する。
ニワトリ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ、第ＳＡ１−７２０２９、ＴＰＢＳ中、１：５００）のウェルあたり１００マイクロリットルを添加し、そして室温で２時間インキュベーションする。続いて、プレートをＴＰＢＳで３回洗浄する。
基質緩衝液（ＴＭＢ基質キット；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、第ＳＫ−４４００、ＵＳＡ）で、さらなる洗浄工程を行う。その後、色素原基質を添加する（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＳＫ−４４００）。短期間インキュベーションした後（ＯＤ６５０＞１．０の陽性対照、ＯＤ＜０．２の陰性対照の測定）、５０マイクロリットルの１Ｎ硫酸を添加し、そしてプレートをマイクロプレート読み取り装置中、ＯＤ４５０で読み取り、ＴＭＢを基質として利用する標準的ＥＬＩＳＡ技術におけるように、ＯＤ６００によって補正する。
評価：
各希釈に関する１６の陰性対照のＯＤ値を、陰性シグナルの平均および標準偏差の計算に用いる。
少なくとも１つの希釈で、同じ希釈の陰性対照の標準偏差の２倍を加えた平均吸光度より高い吸光度を示すならば、乳清試料は、このスクリーニングアッセイにおいて、陽性と見なされる。
陽性乳清試料をさらなる分析に用いる。
本実施例は、現在商業的に入手可能な乳よりも実質的により高い含量のルイス−グリコシル化ＳＩｇＡを含む乳を産生するため、動物種、個体および亜種を選択し、そしてスクリーニングすることが可能であることを立証する。
実施例２
哺乳動物細胞におけるルイスフコシル化組換えヒト分泌成分の発現
本実施例は、多様なグリコシルトランスフェラーゼによって修飾された分泌成分を発現する哺乳動物細胞の確立、およびそれに続く、ルイス−フコシル化分泌成分を産生するクローンに関するスクリーニングを記載する。
分泌成分タンパク質配列（ｐＩｇＲの細胞外部分）を図１に示す。
タンパク質配列をＤＮＡ（哺乳動物細胞発現のために最適化）に逆翻訳し、そしてデノボ合成する（Ｇｅｎｅａｒｔ、ドイツ）。クローニング目的のため、ＤＮＡにＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ認識および切断部位（イタリックおよび下線）を提供する。図２を参照されたい。
遺伝子を、ベクターｐＣＤＮＡ３．１＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）中のＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ部位に挿入する。
安定なトランスフェクタントを生成するため、プラスミドをＰｖｕＩで直線化し、そして続いて、製造者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にしたがって、リポフェクタミン２０００を用い、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＣＨＯ ＤＵＫ−；ＡＴＣＣ ＣＲＬ ９０９６）内にトランスフェクションする。トランスフェクションの２４時間後、各Ｔフラスコ中の細胞を、１００ｍｍペトリ皿に分け、そして選択培地中でインキュベーションする。Ｇ４１８の濃度は２００〜４００マイクログラム／ｍＬである。選択培地を３日ごとに交換する。薬剤耐性クローンは、およそ２週間後に判別可能であり、顕微鏡下で同定され、そしてピペットマンを用いて手で摘み取られる。選択したコロニーを、Ｇ４１８の存在下で２週間、９６ウェルプレート中で培養する。増殖した細胞を２つ組ウェルに分け、そして標準的ＥＬＩＳＡにおいて、分泌成分の発現に関して、上清を試験する。簡潔には、ヤギ抗分泌成分抗体（Ａｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＡＰ２１４７６ＦＣ−Ｎ）をプレートにコーティングし、インキュベーションおよび洗浄後、細胞上清を添加する（１：２および１：１０希釈）。インキュベーションおよび洗浄後、マウス抗ヒトＳＣを添加し（Ｓｉｇｍａ Ｉ６６３５）、そして続いて、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰで検出する。選択した陽性クローンを、分泌成分の精製に、そしてさらにグリコシルトランスフェラーゼでのトランスフェクションに用いる。
多様なグリコシルトランスフェラーゼでのトランスフェクション：分泌成分を発現する安定陽性クローンを選択し、そして一方はフコシルトランスフェラーゼ２およびフコシルトランスフェラーゼ３を、他方はベータ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする、２つのプラスミドでトランスフェクションする。
アルファ１，２−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ２）のタンパク質配列を図３に示す。
５’および３’端に、ＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩ認識および切断部位を含む、ＦＵＴ２の逆翻訳配列。遺伝子をデノボ合成する（Ｇｅｎｅａｒｔ、ドイツ）、図４を参照されたい。該遺伝子を、ベクターｐＩＲＥＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、第６３１６０５）のマルチクローニング部位Ａ内のＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩを用いてクローニングし、ｐＩＲＥＳＦ２を生じる。
フコシルトランスフェラーゼ３のタンパク質配列を図５に示す。
配列を最適化コドン使用配列に逆翻訳して、そしてごく末端にＸｂａＩおよびＮｏｔＩ認識部位を提供する、図６を参照されたい。
ＤＮＡをデノボ合成し、そして上述のようにＦＵＴ２遺伝子を含有するｐＩＲＥＳＦ２ベクターのマルチクローニング部位ＢのＸｂａＩおよびＮｏｔＩ部位内にクローニングして、プラスミドｐＩＲＥＳＦ２３を生じる。
トランスフェクションのため、ＦＵＴ２およびＦＵＴ３遺伝子を含有するｐＩＲＥＳＦ２３ベクターをＢｐｍＩで直線化する。
多様なベータ１，３−ガラクトシル−トランスフェラーゼを含有する多数の発現プラスミドを調製する。したがって、ガラクトシルトランスフェラーゼのタンパク質配列を、ＤＮＡ配列（哺乳動物細胞における発現のために最適化）に逆翻訳し、そしてごく末端にユニークな制限部位（ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ）を提供する。ＤＮＡを合成し、そしてｐＥＦ１アルファＩＲＥＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ６３１９７０）のＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ部位内にクローニングする。それぞれのプラスミドをＡａｔＩＩで直線化した後、ＦＵＴ２およびＦＵＴ３を含有するｐＩＲＥＳＦ２３とともに、組換えヒト分泌成分を発現しているＣＨＯ細胞に同時トランスフェクションする。
ベータ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼＩのタンパク質配列を図７に示す。
ベータ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼＩの遺伝子を図８に示す。
ベータ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼＶのタンパク質配列を図９に示し、クローニングの準備が出来ているそれぞれの遺伝子を図１０に示す。
ベータ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼＩＩのタンパク質配列を図１１に示し、クローニング部位を伴うそれぞれの遺伝子を図１２に示す。
トランスフェクションおよび選択法
ヒト分泌成分を発現するＣＨＯ細胞クローンは、標準的トランスフェクション法において、プラスミド混合物でトランスフェクションされている；直線化ｐＩＲＥＳＦ２３を、それぞれ、ベータ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼＩ、ベータ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼＩＩおよびベータ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼＶをコードする直線化プラスミドと組み合わせる。該トランスフェクションの後に、標準的選択法を行って、安定なクローンを得る（Ｇ４１８濃度は、選択培地ｍｌあたり１０００マイクログラムまで増加させることも可能である）。
ルイスグリコシル化分泌成分を発現するクローンに関するスクリーニング
ＣＨＯクローンの上清を、分泌成分およびルイスグリコシル化に特異的なＥＬＩＳＡにおいて、試験する：
標準的ＥＬＩＳＡ形式でスクリーニングを行う：細胞培養上清をスクリーニングするため、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉ−Ｓｏｒｐ Ｉｍｍｕｎｏプレート）を、
ウェルあたり１００マイクロリットルで、ｍｌコーティング緩衝液（１０００ｍｌ蒸留水中、３．０３ｇ Ｎａ２Ｃｏ３、６．０ｇ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）あたり１マイクログラムの濃度のヒト分泌成分抗体（Ｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ、第ＤＳ−ＰＢ−０３０１０、米国）でコーティングする。
プレートを蓋で閉じて、そして４℃で一晩インキュベーションする。
次の工程の前に、コーティング溶液を取り除き、そして２００μｌのＴＰＢＳ（５００ｍｌ蒸留水、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０中、１．１６ｇ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．１ｇ ＫＣｌ、０．１ｇ Ｋ３ＰＯ４、４．０ｇ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）でウェルを満たすことによって、プレートを３回洗浄する。プレートをシンクの上で軽く叩くことによって、溶液または洗浄液を除去する。紙タオル上でプレートを軽く叩くことによって、残りの滴を除去する。あるいは、ＥＬＩＳＡ洗浄装置で洗浄を行ってもよい。
プレートをＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ、第３７５１５）１５０マイクロリットル／ウェルで満たし、そして室温で２時間インキュベーションする。
再び、プレートを上述のように洗浄する。
細胞培養上清を試料ＴＰＢＳで希釈する（１：２および１：１０）。各希釈（１：２および１：１０）に関して１６の陰性対照を各プレートに添加する。各希釈に関する４つの陽性対照試料をプレートに添加する。それぞれの希釈の１００マイクロリットルを、洗浄したプレートのウェルに添加し、そして室温で２時間インキュベーションする。
洗浄後、ＴＰＢＳ中の抗ルイスｘ抗体（ＬＳＢｉｏ、第ＬＳ−Ｃ７５８２９）、抗シアリル−ルイスａ抗体（ＬＳＢｉｏ、第ＬＳ−Ｃ３３８２０）、抗ルイスａ抗体（ＬＳＢｉｏ、第ＬＳ−Ｃ５０５１２）、抗シアリル−ルイスｂ抗体（Ｇｅｎｅ Ｔｅｘ、第ＧＴＸ７２３７８、ＵＳＡ １：３００）、抗ルイスｂ抗体（ＬＳＢｉｏ、第ＬＳ−Ｃ４６０４９）および抗ルイスｙ抗体（ＬＳＢｉｏ、第ＬＳ−Ｃ７１６７４、ＵＳＡ、１：５０）希釈の１００マイクロリットルの混合物を、それぞれの試料ウェルに、そして陰性および陽性対照試料ウェルに添加する。
プレートを再び室温で２時間インキュベーションし、そして続いて洗浄する。
ニワトリ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ、第ＳＡ１−７２０２９、ＴＰＢＳ中１：５００）のウェルあたり１００マイクロリットルを添加し、そして室温で２時間インキュベーションする。続いて、プレートをＴＰＢＳで３回洗浄する。
基質緩衝液（ＴＭＢ基質キット；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、第ＳＫ−４４００、ＵＳＡ）で、さらなる洗浄工程を行う。その後、色素原基質を添加する（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＳＫ−４４００）。短期間インキュベーションした後（ＯＤ６５０＞１．０の陽性対照、ＯＤ＜０．２の陰性対照の測定）、５０マイクロリットルの１Ｎ硫酸を添加し、そしてプレートをマイクロプレート読み取り装置中、ＯＤ４５０で読み取り、ＴＭＢを基質として利用する標準的ＥＬＩＳＡ技術におけるように、ＯＤ６００によって補正する。
評価：
各希釈に関する１６の陰性対照を、陰性シグナルの平均および標準偏差の計算に用いる。
少なくとも１つの希釈で、同じ希釈の陰性対照の標準偏差の２倍を加えた平均吸光度より高い吸光度を示すならば、試料は、このスクリーニングアッセイにおいて、陽性と見なされる。
陽性試料をタンパク質精製およびさらなる分析に用いる。
本実施例は、高いモル比率のルイス−エピトープを含む、ヒト乳由来でない分泌成分を生成することが可能であることを立証する。
実施例３：
分泌成分上のルイスエピトープの存在の定量的評価
標準的プロトコルにしたがって、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅにカップリングしたウサギ抗ヒト分泌成分を含むアフィニティクロマトグラフィによって、動物細胞の上清由来の組換え分泌成分および分泌型ＩｇＡの精製を行う。
グリカン分析のための試料調製：
還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８０ｘ８０ｘ１ｍｍ、１０％ＢｉｓＴｒｉｓ ＮｕＰＡＧＥゲル、ＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））によって、精製分泌型ＩｇＡをＳＣ、Ｊ鎖、Ｈ鎖、および軽鎖に分離する。クーマシー染色によって、タンパク質バンドを視覚化する。分子量標準を用いる。
〜８０ｋＤａのクーマシー染色バンドを切り出し、そしてトリプシンでゲル内消化して、そしてアルキル化する（ゲル内トリプシン消化キット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、製品番号８９８７１）。
分泌成分の精製し、還元し、そしてアルキル化したペプチドを、１０ｍＭ ＮＨ４Ａｃ（ｐＨ５．０）中、３７℃で、ウシ腎臓由来のアルファ−１−６−フコシダーゼ（ＰｒｏＺｙｍｅ、第ＧＫＸ−５００６、米国）で一晩処理することによって、最も内側のＧｌｃＮＡｃ残基で脱フコシル化する。必要であれば、ＭＳ検出を伴う多孔性黒鉛上のクロマトグラフィによる遊離Ｎ−グリカンの分析によって、コア−フコース除去の完全性を検証することも可能である。
Ａｑｕａｓｉｌ Ｃ−１８プレカラム（３０ｍｍｘ０．３２ｍｍ、５マイクロメートル、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＢｉｏＢａｓｉｃ Ｃ１８分析カラム（１５０ｍｍｘ０．１８ｍｍ、５マイクロメートル、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｗａｔｅｒｓ ＣａｐＬＣ、Ｒｈｅｏｄｙｎｅ １０ポートバルブおよび標準ＥＳＩ源を備えた、Ｗａｔｅｒｓ Ｑ−ＴＯＦ ＵｌｔｉｍａからなるキャピラリーＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ系上で、ペプチドおよび糖ペプチドの分析を行う。
溶媒Ａは、ｐＨ３．０の６５ｍＭギ酸アンモニウムからなり、そして溶媒Ｂは溶媒Ａ中の８０％アセトニトリル（ＡＣＮ）である。ＡＣＮの非存在下で、プレカラムを平衡化し、そして装填する。その後、６．３から６２．５％溶媒Ｂまでの勾配を４５分間に渡って発展させる。ｍ／ｚ １５０〜１８００の範囲で、陽性イオンを測定する。キャピラリー電圧は３．２ｋＶであり、そしてコーン電圧は３５Ｖであり、供給源温度は１００℃であり、脱溶媒和温度は１２０℃である。
ＭａｘＥｎｔ３デコンボルーション／脱同位体（ｄｅｉｓｏｔｏｐｉｎｇ）特徴を含むＭａｓｓＬｙｎｘ４．０ソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて、データを評価する。
ＰＮＧナーゼＦ（Ｒｏｃｈｅ）での脱グリコシル化によってグリコシル化ペプチドを同定し、そして逆相ＨＰＬＣ、その後、質量分析によって、さらに分離する。脱グリコシル化ペプチドは、グルタミン残基の代わりにグルタミン酸残基を含有し、これは１Ｄａの質量相違を生じる。
同じペプチド骨格上の異なるグリカン構造は、ありうる糖ペプチドシグナルを異なる質量のいくつかの分子種に分割する。糖ペプチドの存在はまた、異なるグリコフォーム間で、特異的単糖相違に基づく工程で、質量のはしごとして、総質量スペクトル中で示されうる（例えばｍ／ｚ１４６［フコース］、１６２［ヘキソース］、２０３［Ｎ−アセチルヘキソサミン］、２９１［Ｎ−アセチルノイラミン酸］）。
糖ペプチドピークがひとたび同定されたら、ピーク「量」すなわち特定の糖ペプチドに対応するピーク下面積を測定する。イオン化およびしたがって糖ペプチドの検出は、ペプチド部分によって支配されるため、ピーク量を、直接、グリコフォームのモル比率に置き換えることも可能である。
同定されたまたは潜在的な糖ペプチドの溶出時間に渡って、質量スペクトルを得て、そしてこれを合計し、平滑化し、そして重心を求めた（ｃｅｎｔｒｏｉｄｅｄ）後、ｍ／ｚ対強度スペクトルを、分析のため、ソフトウェアに提示する。
低強度グリコフォームに関してシグナル対ノイズ比を増加させるため、より広いクロマトグラフィ時間枠に渡るよりも、それぞれの溶出ピークのみに渡って、ＭＳスペクトルを合計することが推奨される。
特定のグリコシル化部位で生じるグリコフォームのリストから、フコシル化グリカンのモル分率を計算する。異なる部位の結果を付加して、分泌成分中で生じるモル比率フコシル化グリカンに到達する。
ヒト分泌成分の試料での、例示的な結果および計算を示す：
各ペプチドグリコフォームの相対量：
ペプチド８２〜１０９
グリコシル化部位Ａｓｎ８３およびＡｓｎ９０では、グリコフォームの９５％が非コア・フコース残基を所持する
ペプチド１６８〜１９０
グリコシル化部位Ａｓｎ１８６では、グリコフォームの９７％が非コア・フコース残基を所持する
ペプチド４１３〜４３４
グリコシル化部位Ａｓｎ４２１では、グリコフォームの１００％が非コア・フコース残基を所持する
ペプチド４５７〜４７９
グリコシル化部位Ａｓｎ４６９では、グリコフォームの８９％が非コア・フコース残基を所持する
ペプチド４９８〜５１５
グリコシル化部位Ａｓｎ４９９では、グリコフォームの６４％が非コア・フコース残基を所持する。
試料の非コア（ルイス）フコシル化＝０，９５モル＋０，９７モル＋１モル＋０，８９モル＋０，６４モル＝４，４５モル／モル分泌成分
実施例４
哺乳動物細胞における二量体ＩｇＡの発現および組換えルイスグリコシル化分泌成分を含むＳＩｇＡ分子の再構成
ネズミＪ５５８Ｌ細胞を、ハプテン・ニトロフェニルへの生殖系列抗体結合の発現のための宿主として用いる。この目的のため、キメラ重鎖（ネズミＶＨ／ヒトＩｇＡ２定常領域）を哺乳動物発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１にクローニングし、このプラスミドをＪ５５８Ｌ細胞にトランスフェクションし、そしてｄＩｇＡを安定発現しているクローンを選択し、そしてスクリーニングする。ＩｇＡ２重鎖と平行に、ＩｇＡ１重鎖を含む構築物を調製し、そして用いる。
二量体ＩｇＡを精製し、そしてＣＨＯ細胞由来の組換え分泌成分で再構成する（実施例２を参照されたい）。
キメラ抗ニトロフェニルＩｇＡ重鎖のタンパク質配列（小文字＝リーダーペプチド、下線＝ネズミＶＨ）を図１３に示し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限部位を含む重鎖構築物のＤＮＡ配列を図１４に示す。
ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ部位とともに遺伝子を完全に合成し（Ｇｅｎｅａｒｔ、ドイツ）、そしてｐＣＤＮＡ３．１＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）のそれぞれの部位内にクローニングする。トランスフェクション前に、組換えプラスミドをＰｖｕＩで直線化する。
Ｊ鎖およびＮＩＰに特異的なラムダ軽鎖の恒常的な合成を示す、ネズミＪ５５８Ｌ細胞（Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｃｙ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、第８８０３２９０２）を、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００マイクロｇ／ｍｌ；Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ、メリーランド州ウォーカーズビル）および１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えたＲＰＭＩ培地中、３７℃、５％ＣＯ２を含む大気中で増殖させる。エレクトロポレーションによってＪ５５８Ｌの安定トランスフェクションを達成し、そして５００マイクロｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Ｓｉｇｍａ）を含有する培地中で、クローンを選択する。細胞を２〜３週間インキュベーションした後、上清液を採取し、そして酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって免疫グロブリン産生に関してスクリーニングする。
ＥＬＩＳＡのため、マイクロプレートを抗ｊ鎖抗体（ヤギ抗Ｊ鎖、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ−３４６５４）でコーティングする。洗浄後、細胞培養上清（１：２および１：１０に希釈）を添加する。インキュベーションおよび洗浄に続いて、抗ヒトＩｇＡアルファ鎖−ＨＲＰコンジュゲートを、ＩｇＡを発現する細胞株の検出に用いる。
製造者および標準的アフィニティクロマトグラフィ法にしたがった、抗ヒトＩｇＡカップリングＳｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｓｉｇｍａ Ａ２６９１）を利用したアフィニティクロマトグラフィによって、選択したクローンの培養上清からの組換えｄＩｇＡの精製を行う。
ＩｇＡおよび組換え分泌成分由来のＳＩｇＡの再構成
１００マイクロリットルあたり１０マイクログラムの濃度で、等モルの精製ｄＩｇＡおよび精製分泌成分（それぞれ、フコシル化および非フコシル化）をＰＢＳ緩衝液中で一晩混合することによって、ｄＩｇＡ分泌成分複合体の再構築をｉｎ ｖｉｔｒｏで行った。
再構成した複合体を、非還元および還元６％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上にそれぞれ装填し、二フッ化ポリビニリデン膜にブロッティングし、そして分泌成分に対する抗血清で検出する。
ｄＩｇＡおよびｐＩｇＡ分子の位に対する分泌成分のシフトによって、共有再構成を行う。還元条件下で、すべてのレーンで類似の度合いに、遊離分泌成分のみが検出可能であり、これによって、分泌成分およびＩｇＡがジスルフィド架橋によって連結されることが示される。
複合体をＨＰＬＣによってさらに精製する。ＰＢＳ中のこうした精製ＳＩｇＡ（ルイスグリコシル化および非フコシル化）を定量化し、そして抗原結合および安定性実験において用いる。
実施例５：
組換えルイスグリコシル化ＳＩｇＡの安定性試験
本発明の分子の生物物理学的、生化学的および生物学的安定性を示すため、多様なアッセイを行う。
生物物理学的安定性に関しては、試料を示差走査熱量測定によって分析する：
免疫複合体および抗体を２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ６．０に対して透析する。抗体濃度をＵＶ吸光度によって測定する。透析液を用いて、抗体を１ｍｇ／ｍＬに希釈する。自動化キャピラリーＤＳＣ（ＭｉｃｒｏＣａｌ、ＬＬＣ）を用いてスキャンを行う。ベースライン減算のため、透析液を用いた２回のスキャンを行う。中程度のフィードバックモードを用いて、２０〜９５℃、１℃／分で、スキャンを実行する。Ｏｒｉｇｉｎ ７．０を用いてスキャンを分析する。三次多項式を用いて、非ゼロベースラインを修正する。ソフトウェア内の非２状態アンフォールディングモデルを用いて、各免疫複合体のアンフォールディング遷移を適合させる。
生化学的安定性（酸インキュベーション後のゲル電気泳動）：免疫複合体および対照を含むすべての試料を、脱塩カラム（ＮＡＰ２５カラム、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いることによって、多様なｐＨ値（４．０、５，０、６，０および７．０）の配合物に緩衝液交換し、そしてその濃度を５ｍｇ／ｍｌに調整する。配合した抗体溶液を０．２２マイクロメートルフィルターによって滅菌し、そして１ｍｌの各溶液を無菌化Ｉ型ＵＳＰ ５ｍｌガラスバイアルに満たし、そしてオートクレーブ処理したゴム栓で密封する。これらの調製した試料を、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）分析前に、４０℃の温度管理インキュベーター中、１日保存した。
サイズ排除クロマトグラフィ：凝集物（高分子量産物）および分解種（低分子量産物）のある量を、Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（７．８ｍｍ内径、３０ｃｍ；日本・東ソー社）を用いたＳＥＣによって分析する。可動相は、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）および５００ｍＭ塩化ナトリウムからなる。実験条件は以下の通りである。注入タンパク質、２０ｍｇ；流速、０．５ｍｌ／分；検出波長、２１５および２８０ｎｍ；ならびに分析時間、３０分間。ガラスバイアル中に４０℃で１日間保存されている試料中に存在する高分子量産物および低分子量産物の量を、決定し、そしてそれぞれの新鮮に調製した試料のものと比較した相対増分として表す。
プロテアーゼ安定性
すべての消化を、５ｍｇ／ｍｌの試料タンパク質濃度および１ｍｌの総体積を用いて、３７℃で８時間行う。トリプシンおよびペプシン（Ｓｉｇｍａ、米国）をタンパク質分解酵素として用いる。０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．０中で、トリプシン消化を行う。０．０５酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．０で、ペプシンでの消化を行う。消化前に、すべてのタンパク質をこれらの緩衝液に対して２４時間透析する。酵素対タンパク質比は、どちらの酵素に関しても１：２５または１：５０である。反応混合物に等モル量のダイズ（ｓｏｙｂｅａｎ）トリプシン阻害剤（Ｓｉｇｍａ）を添加することによって、トリプシン消化を停止する一方、１００マイクロリットルの２．５Ｍ Ｔｒｉｓを添加することにより、溶液ｐＨを約８に上昇させることによって、ペプシン消化を終結させる。消化後、さらなる分析の前に、すべての反応混合物を凍結させる。
消化の評価：各消化物を融解し、そしてＩｇＡ二量体、ＩｇＧ、およびウシ血清アルブミンで較正したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のカラム（１．５ｘ９０ｃｍ）に適用する。溶出物の吸光度を２８０ｎｍで記録する。
出現ピークに関するピーク下面積および損なわれていない分子に対応する位置を、全面積のパーセントとして示す。
実施例６：
異なってグリコシル化されたＳＩｇＡの特異性試験
多様なルイス陽性およびルイス陰性ＳＩｇＡ（先の実施例に記載するような再構成ＳＩｇＡ）を、広範囲の病原体構造への結合に関して試験してもよい。
本発明の精製免疫複合体の力価を、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来リポ多糖（ＬＰＳ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来リポタイコ酸（Ｌ２５１５、Ｓｉｇｍａ、米国）、黄色ブドウ球菌由来ペプチドグリカン（ＰＧＮ）およびキーホールリンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）結合に関して、ＥＬＩＳＡ法において試験してもよい。該アッセイは、Ｊ． Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ． ｖｏｌ．９３ ｐｐ． ５４６７−５４７３に記載される：
プレートを、１００μＬ／ウェルの、炭酸緩衝液（１０．６ｇ／Ｌ Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ９．６）ｍＬあたり１μｇのＫＬＨ、４μｇのＬＰＳ、５μｇのＬＴＡ、または２μｇのＰＧＮでコーティングする。洗浄後、プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ中の１００μＬ／ウェルの２．５％ウサギ血清で、室温（２１℃）で少なくとも３０分間ブロッキングする。ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、および２．５％ウサギ血清中の試料の連続希釈（１：４）を添加する。プレートを室温（２１℃）で１時間インキュベーションする。
１００μＬ／ウェルの１：１５，０００希釈のペルオキシダーゼにカップリングしたウサギ抗ウシ−（抗ヒト、抗ヤギ）−ＩｇＡを用いて、免疫複合体および抗体のＬＰＳ、ＬＴＡ、ＰＧＮ、またはＫＬＨへの結合を検出する。洗浄後、１００μＬ／ウェルのテトラメチルベンジジン（７１．７μｇ／ｍＬ）および０．０５％Ｈ２Ｏ２をウェルに添加し、そして室温（２１℃）で１０分間インキュベーションする。５０μＬ／ウェルの２．５ＮのＨ２ＳＯ４を用いて反応を停止する。４５０ｎｍの波長でマイクロプレート分光光度計を用いて、吸光度を測定する。力価としてレベルを計算し、そして力価をＥｍａｘの５０％に最も近い吸光度を生じる希釈のｌｏｇ２値として表し、ここでＥｍａｘはすべてのマイクロタイタープレート上の２つ組に存在する標準陽性試料の最高の平均吸光度を示す。
クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ａおよび大腸菌インチミンへの結合は、例えば、ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＶＯＬ． ２８１， ＮＯ． ２０， ｐｐ． １４２８０−１４２８７に記載されてきており、ノロウイルス−ＶＬＰへの結合は、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ７９， ｐｐ． ６７１４−６７２２に記載される：
マイクロウェル結合アッセイ−Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレートのウェルを、５０ｍＭ重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）の１００マイクロリットル中の２００ｎｇの免疫複合体、抗体、または分泌成分で、室温で１時間、コーティングする。５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳を含有する２００マイクロリットルのＰＢＳ−Ｔで、ウェルをブロッキングする。１００マイクロリットルのＰＢＳ中の毒素Ａ（５００ｎｇ／ｍｌ）またはＧＳＴ−インチミン（２００ｎｇ／ｍｌ）またはノロウイルスＶＬＰ（１マイクログラム／ｍｌ）を室温で２時間インキュベーションする。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、特異的抗体を用いて（ＳＣ−毒素Ａ相互作用をネズミ抗毒素Ａ ＩｇＧで検出し、ノロウイルスＶＬＰをマウス抗ノロウイルスで検出し、そしてＧＳＴに対するネズミｍＡｂを用いてＧＳＴ−インチミンを検出する）、その後、西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）・ペルオキシダーゼコンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧおよび色素源としての１，２−フェニレンジアミンを用いて、結合を検出する。１体積の２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を用いて反応を停止し、そして参照波長として６２０ｎｍを用いて、光学密度を４９２ｎｍで測定する。
実施例７：
実施例１１にしたがって得られたヤギＳＩｇＡの抗細菌活性−細菌抗原への自然抗体の結合
大腸菌由来リポ多糖（ＬＰＳ）およびクロストリジウム・ディフィシレ毒素Ａと本発明の精製免疫複合体の反応性をＥＬＩＳＡにおいて試験する。
プレートを、１００μＬ／ウェルの、炭酸緩衝液（１０．６ｇ／Ｌ Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ９．６）のｍＬあたり４μｇのＬＰＳ（大腸菌Ｏ１５７Ｈ７由来のリポ多糖、Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリフォルニア州キャンベル、カタログ番号２０６）または１μｇのクロストリジウム・ディフィシレ毒素Ａ（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリフォルニア州キャンベル、カタログ番号１５２）でコーティングした。洗浄後、プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ中の１００μＬ／ウェルの２．５％ウサギ血清で、室温（２１℃）で少なくとも３０分間ブロッキングする。ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、および２．５％ウサギ血清中の試料の連続希釈（１：４）を添加する。プレートを室温（２１℃）で１時間インキュベーションする。
１００μＬ／ウェルのそれぞれ１：１５，０００希釈のアルカリホスファターゼにカップリングしたウサギ抗ヤギ−ＩｇＡ（および抗ヒト−ＩｇＡ）を用いて、免疫複合体および抗体のＬＰＳまたはＣ．ディフィシレ毒素Ａへの結合を検出する。洗浄後、１００μＬ／ウェルのパラニトロフェニルホスフェートをウェルに添加し、そして室温（２１℃）で３０分間インキュベーションする。
４０５ｎｍの波長で、マイクロプレート分光光度計を用い、光学密度を測定する。
試験した調製物は、以下の実施例１１にしたがって異なる試料から調製した、ヒトＳＩｇＡ（Ｓｉｇｍａ Ｉ２６３６）およびいくつかのヤギＳＩｇＡであり、すべて、モルＳＩｇＡあたり少なくとも０．０１モルの非コア・フコースを有した。その結果、すべてのヤギＳＩｇＡは、ヒト参照よりも約５倍高く、Ｃ．ディフィシレ毒素ＡおよびＬＰＳ（大腸菌Ｏ１５７Ｈ７）に結合した。
実施例８：
側方流動アッセイによる、乳またはホエイ試料における非コア・フコシル化免疫複合体を決定するための迅速スクリーニング試験
単純および迅速アッセイを用いて、プール中の分泌成分上のルイスエピトープを伴うＮ−グリコシル化のレベルを増加させるため、プール内への特定の乳試料の包含に関して決定してもよい。
こうしたオンサイトアッセイは、乳またはホエイ試料で、特定の閾値で陽性を示すよう最適化された迅速イムノアッセイであってもよい。
側方流動試験（側方流動免疫クロマトグラフィアッセイ）は、試料中のターゲット分析物の存在を検出するよう意図された単純なデバイスである。しばしば、ディップスティック形式で産生され、側方流動試験は、毛細管現象を通じて、固体支持体に沿って試験試料が流動するイムノアッセイの型である。試料を試験に適用した後、試料は、試料と混合される着色試薬と遭遇し、そして固定されている結合タンパク質である、基質遭遇ラインまたはゾーンを通過する。試料に存在する分析物に応じて、着色試薬は、試験ラインまたはゾーンで結合しうる。こうしたアッセイのスキームを図１５に示す。
側方流動イムノアッセイを１５分以内に行うことも可能であり、そしてこれを用いて、非コア・フコシル化が増加した、免疫複合体を含有する乳またはホエイ試料を選択することも可能である。
アッセイの仕様は、グリコシル化の特定の閾値（モル分泌成分あたりモル非コア・フコースで表される）での乳またはホエイマトリックス中の非コア・グリコシル化分泌成分の検出である。こうしたアッセイの最適化のため、非コア・フコシル化を含まない、低非コア・フコシル化および高非コア・フコシル化（糖分析によって決定される通り、例えば実施例９を参照されたい）を伴う精製ＳＩｇＡを用いる。
特定の仕様を伴うこうしたアッセイは、請負業者、例えばＫｅｓｔｒｅｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（米国カールスバッド）、Ｂｉｏｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（中国香洲区）、Ｂｉｏｔｅｍ（フランス）およびその他で開発可能である。
あるいは、一般的な迅速アッセイデバイス（ｇＲＡＤ、ＲａｐｉｄＡｓｓａｙｓ、デンマーク・コペンハーゲン）を用いることによって、アッセイを設計する。基本的に、ビオチン化捕捉試薬、金標識検出試薬および試料を混合し、そして次いで、側方流動アッセイデバイスに適用する。この実施例で用いるｇＲＡＤデバイスは、固定抗ウサギ抗体ゾーンおよびビオチン結合ゾーン（対照）を含有する。
本実施例中の捕捉試薬は、ビオチン化ＤＣ−ＳＩＧＮ−Ｆｃ融合タンパク質である。
本実施例中の金標識検出抗体は、ウサギ抗ヤギＩｇＡである。
ＲａｐｉｄＡｓｓａｙｓ、デンマークに提供された指示にしたがって、検出および捕捉試薬を産生する。ＲａｐｉｄＡｓｓａｙｓ試薬キットの指示にしたがって、アッセイを最適化する。
ビオチン化：
ＤＣ−ＳＩＧＮ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、第１６１−ＤＣ−０５０）をまず、ビオチン化試薬と混合し、これが、タンパク質上に存在する遊離一級アミンと反応する。次いで、クロマトグラフィを通じて、非タンパク質カップリングビオチン試薬を除去する。ｇＲＡＤで用いるためには、リンカーは可能な限り長くなければならない。ＥＺ−Ｌｉｎｋ ＮＨＳ−ＰＥＧ１２−ビオチン、ビオチン−ＮＨＳ、ビオチン−ＬＣ−ＮＨＳおよびビオチン−ＰＥＧ４−ＮＨＳ（Ｐｉｅｒｃｅ）を試し、そしてアッセイ最適化相において比較しなければならない。
ＰＢＳ ｐＨ７．４および１００ｍＭ炭酸緩衝液ｐＨ８．０を、ＤＣ−ＳＩＧＮ−Ｆｃのビオチン化にそれぞれ用いる（Ｔｒｉｓ緩衝液中であってはならないし、またはアジ化ナトリウムを含有してはならず、これはこれらがコンジュゲート化をブロックするであろうためである）。ＤＣ−ＳＩＧＮ−Ｆｃ濃度は１ｍｇ／ｍｌでなければならない。
２μｌのビオチン化ストック（ｍｇ／ｍｌ ＤＭＳＯでのストック濃度：ビオチン−ＮＨＳ（４０）、ビオチン−ＬＣ−ＮＨＳ（５３）、ビオチン−ＰＥＧ４−ＮＨＳ（６９）、ビオチン−ＰＥＧ１２−ＮＨＳ（１１０））をＤＣ−ＳＩＧＮ−Ｆｃのｍｇあたり添加する。
次いで、反応混合物を暗所中、室温で２時間混合する。残った活性ビオチン−ＮＨＳを１０μｌの３Ｍエタノール−アミンの添加およびさらに３０分間のインキュベーションでブロッキングする。
Ｓｐｈａｄｅｘ Ｇ２５媒体でのゲル濾過／緩衝液交換を用いて、遊離ビオチンを除去する。より少ない体積に関しては、小さい使い捨てカラム、例えばＰＤ１０（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）を用いて、ゲル濾過を実行してもよい。未結合ビオチンは、試験ラインに対する結合に関して干渉して、生じる反応を低下させるであろうため、プロセスを反復して、未結合ビオチンを出来る限り多く除去する。
コロイド性金コーティング検出試薬の調製（ＲａｐｉｄＡｓｓａｙｓ使用説明書による）
ポリクローナルウサギ抗ヤギＩｇＡ（Ａｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＧｍｂＨ、ドイツ、第ＡＰ０５５４８ＰＵ−Ｎ）を用い、そしてこれを１ｍｇ／ｍｌまたはそれより高い濃度で調製し、そしてこれは、０．５ｘＰＢＳ緩衝溶液中でなければならない。
Ｎａｋｅｄ Ｇｏｌｄゾル４０ｎｍおよびＮａｋｅｄ Ｇｏｌｄゾル２０ｎｍを用いる。
１． 金を攪拌するかまたは回転させて、沈殿したいかなる金も再懸濁する。０．５ｍｌのＮａｋｅｄ Ｇｏｌｄゾルを、１０の清浄な個々の試験管に入れる。
２． 各試験管を、提供するｐＨチャートからのｐＨ値（または１〜１０）でラベルする：ｐＨ５．４、ｐＨ６．６、ｐＨ７．３、ｐＨ７．８、ｐＨ８．２、ｐＨ８．４、ｐＨ８．８、ｐＨ９．２、ｐＨ９．６、ｐＨ１０．１。
３． ｐＨチャートを用いて、マイクロリットルで多様な量の緩衝液を各試験管に添加する。攪拌して混合する。
４． 各試験管を低速ボルテックス装置に入れ、そして抗体溶液（試料調製セクションを参照されたい）を添加する。完全に混合する（約２〜３秒）。
理想的には、４０ｎｍ金に関して、７μｌの２ｍｇ／ｍｌ抗体溶液が最適である。２０ｎｍ金に関して、理想的には、１４μｌの２ｍｇ／ｍｌ抗体溶液が最適である。
５． いくつかの試験管で、深い紫色および／または黒い沈殿物は、抗体またはタンパク質が等電点の下であり、個々の金ゾルの架橋を導くことを示す。架橋ゾルを免疫学的アッセイで用いることは不可能であり、そしてこのゾルは廃棄しなければならない。深い紫色のゾルは通常多くが不活性でもある。わずかな紫色または色の変化がない試験管のみが免疫学的アッセイに有用である。
６． 反応を全部で３０分間続ける。
７． ５０μｌのブロッキング安定化剤溶液を添加することによって、反応を停止する。
ブロッキング剤をさらに、室温で１６時間、反応させることを可能にすることが最適である。
コンジュゲート化反応の有効性を試験するため、１０μｌのコーティング金ゾル（ＢＳＡブロッキング溶液の添加前）を、１０μｌの１Ｍ ＮａＣｌと混合する。不完全コーティングを伴うゾルは、溶液から抜け出すであろう（黒くなる）が、完全にコーティングされたゾルは安定なままであろう（赤）。
次いで、上述のような試薬、および製造者にしたがったｇＲＡＤデバイス（Ｒａｐｉｄ Ａｓｓａｙｓ、デンマーク）を用いて、側方流動アッセイを最適化する。ヤギ乳より精製され、そしてルイスグリコシル化に関して分析されたＳＩｇＡを、最適化法のために用いる。０．００モル非コア・フコース／モル分泌成分を伴うＳＩｇＡを陰性対照として用いる。陽性対照として、あらかじめ定義された非コア・フコシル化を伴うヤギＳＩｇＡを用いる（少なくとも０．０１モル非コア・フコース／モル分泌成分を伴うＳＩｇＡを含有する乳に関するスクリーニングが望ましい場合、この量のグリコシル化を伴うＳＩｇＡ調製物を、最適化のため、参照として用いる、例えば実施例９の試料１２）。マトリックスとして、ルイスグリコシル化を含まないヤギ乳を用いる。５０μｇの精製ＳＩｇＡをマトリックスのｍｌあたり添加する。試験最適化のため、これらの混合物を陽性および陰性試料として用いる。
大規模に、上昇したレベルの非コア・フコシル化分泌免疫グロブリンを含む乳を提供するため、記載するアッセイを用いて、非コア・フコシル化免疫グロブリンに関して、潜在的な乳供給源を試験する。
陽性（すなわち閾値より高い非コア・フコシル化）試料のみをプールのために選択する。
実施例９：
主要フコシル化構造を示すヤギ分泌成分のグリカン分析
ヤギ分泌成分の以下の配列を分析のために用いた（配列番号１７）
（太字の文字は、Ｎ−グリコシル化部位を示す。）
全体グリコシル化
実施例１１にしたがって、分泌型免疫グロブリンを調製する。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８０ｘ８０ｘ１ｍｍ、１０％ＢｉｓＴｒｉｓ ＮｕＰＡＧＥゲル、ＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））によって、精製分泌型免疫グロブリンを、分泌成分、Ｊ鎖、Ｈ鎖、および軽鎖に分離する。クーマシー染色によって、タンパク質バンドを視覚化する。分子量標準を用いる。およそ８０ｋＤａのクーマシー染色バンドを切り出し、そしてゲル内消化する。ＰＮＧＡｓｅＦを用いて、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルから直接、分泌成分よりグリカンを遊離させた後、１６時間トリプシン消化して、続いて、ホウ化水素還元を行った（トリプシンでのプロテアーゼ処理後のＰＮＧＡｓｅ Ｆ／Ａ消化は、グリコサイト（ｇｌｙｃｏｓｉｔｅ）４番を未消化のままにし、そしてしたがって完全ではないであろう）。ＰＧＣ（多孔性黒鉛クロマトグラフィ）およびＥＳＩ−ＭＳ検出によって、グリカン分析を行った。分析系に注射する前に、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｇｅｎｓ）由来の連結非特異的シアリダーゼを用いて、グリカンを脱シアル化し、そして溶出時間にしたがって分析した。非コア・フコースおよびコア・フコースを含むグリカンを分離することも可能であり、そしてこれは、完全グリカンのパーセントとして表される。
糖ペプチド分析
ＲＰ−ＥＳＩ−ＭＳＭＳを用いることによって、ペプチドと同じ方式で、グリコサイトを分析する。ペプチド骨格にしたがって、構造を溶出させ、そしてグリコシル化不均一性のため、特定の質量分布を示す。
ペプチドおよび糖ペプチドの分析を、Ａｑｕａｓｉｌ Ｃ−１８プレカラム（３０ｍｍｘ０．３２ｍｍ、５マイクロメートル、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＢｉｏＢａｓｉｃ Ｃ１８分析カラム（１５０ｍｍｘ０．１８ｍｍ、５マイクロメートル、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｗａｔｅｒｓ ＣａｐＬＣ、Ｒｈｅｏｄｙｎｅ １０ポートバルブおよび標準ＥＳＩ源を備えた、Ｗａｔｅｒｓ Ｑ−ＴＯＦ ＵｌｔｉｍａからなるキャピラリーＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ系上で、ペプチドおよび糖ペプチドの分析を行う。溶媒Ａは、ｐＨ３．０の６５ｍＭギ酸アンモニウムからなり、そして溶媒Ｂは溶媒Ａ中の８０％アセトニトリル（ＡＣＮ）である。ＡＣＮの非存在下で、プレカラムを平衡化し、そして装填する。その後、６．３から６２．５％溶媒Ｂまでの勾配を４５分間に渡って発展させる。ｍ／ｚ １５０〜１８００の範囲で、陽性イオンを測定する。キャピラリー電圧は３．２ｋＶであり、そしてコーン電圧は３５Ｖであり、供給源温度は１００℃であり、脱溶媒和温度は１２０℃である。
ＭａｘＥｎｔ３デコンボルーション／脱同位体（ｄｅｉｓｏｔｏｐｉｎｇ）特徴を含むＭａｓｓＬｙｎｘ４．０ソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて、データを評価する。ＰＮＧナーゼＦ（Ｒｏｃｈｅ）での脱グリコシル化によってグリコシル化ペプチドを同定し、そして逆相ＨＰＬＣ、その後、質量分析によって、さらに分離する。脱グリコシル化ペプチドは、グルタミン残基の代わりにグルタミン酸残基を含有し、これは１Ｄａの質量相違を生じる。
同じペプチド骨格上の異なるグリカン構造は、ありうる糖ペプチドシグナルを異なる質量のいくつかの分子種に分割する。糖ペプチドの存在はまた、異なるグリコフォーム間で、特異的単糖相違に基づく工程で、質量のはしごとして、総質量スペクトル中で示されうる（例えばｍ／ｚ１４６［フコース］、１６２［ヘキソース］、２０３［Ｎ−アセチルヘキソサミン］、２９１［Ｎ−アセチルノイラミン酸］）。
糖ペプチドピークがひとたび同定されたら、ピーク「量」すなわち特定の糖ペプチドに対応するピーク下面積を測定する。イオン化およびしたがって糖ペプチドの検出は、ペプチド部分によって支配されるため、ピーク量を、直接、グリコフォームのモル比率に置き換えることも可能である。同定されたまたは潜在的な糖ペプチドの溶出時間に渡って、質量スペクトルを得て、そしてこれを合計し、平滑化し、そして重心を求めた後、ｍ／ｚ対強度スペクトルを、分析のため、ソフトウェアに提示する。
低強度グリコフォームに関してシグナル対ノイズ比を増加させるため、より広いクロマトグラフィ時間枠に渡るよりも、それぞれの溶出ピークのみに渡って、ＭＳスペクトルを合計することが推奨される。特定のグリコシル化部位で生じるグリコフォームのリストから、フコシル化グリカンのモル分率を計算する。異なる部位に関する結果を付加して、分泌成分中で生じるフコシル化グリカンのモル比に到達する。
以下のグリコサイトペプチドを同定した：
グリコサイト番号１ ＡＮＬＴＮＦＰＥ（配列番号１８） ８２〜８９位
グリコサイト番号２ ＮＤＳＧＲ（配列番号１９） １０３〜１０７位
グリコサイト番号３ ＬＡＬＬＡＱＰＧＮＧＴＹＴＶＩＬＮＱＬＴＤＱＤＡＧＦＹＷＣＶＴＤＧＤＴＳＷＴＳＴＶＱＬＫ（配列番号２０） ４１２〜４５５位
グリコサイト番号４ ＮＶＴＡＷＬＧＥ（配列番号２１） ４６８〜４７６位
グリコサイト１、２および４は、分析法中に検出可能であるが、グリコサイトペプチド番号３は、調べられないままであり、他のプロテアーゼおよび質量分析もまた用いる。
以下の表は、多様なヤギ乳試料の分泌成分の非コア・フコースのモル含量を示す。
表１：非コア・フコースに関するヤギ分泌成分分析（グリコシル化部位１、２および４（モルＳＣあたりのｍｍｏｌ））
実施例１０：
細胞傷害性アッセイ
Ｖｅｒｏ細胞を周密単層に増殖させ、そして１ｍＭ ＥＤＴＡ中の０．１％トリプシン２ｍｌとインキュベーションすることによって継代培養する。細胞を計数し、そして６．２５ｘ１０４細胞／ｍｌを、８０μｌの総体積中、９６ウェルプレート内に植え付ける。プレートを３７℃および５％ＣＯ２中、２０〜２４時間インキュベーションする。クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ａ（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリフォルニア州キャンベル、カタログ番号１５２）をＰＢＳ（ＰＡＡ、オーストリア）で０．２μｇ／ｍｌの最終濃度まで希釈し、そしてヒトｈＳＩｇＡ（Ｓｉｇｍａ、第Ｉ１０１０）の希釈と、それぞれ、実施例１１にしたがって得られたウシＳＩｇＡ（＜１０ｍｍｏｌ非コア・フコース／モル）およびヤギＳＩｇＡ（試料番号６ ＜１０ｍｍｏｌ非コア・フコース／モル、試料番号１２ ＞１０ｍｍｏｌ非コア・フコース／モル）と３７℃で１時間、インキュベーションする。ヒトＳＩｇＡを毒素に比較して１０倍モル過剰で、ならびに等モルで用いる。ウシおよびヤギＳＩｇＡを等モルで用いる。ウシ血清アルブミン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）は陰性対照として働く。毒素Ａ／抗体混合物をランダムな順序で９６ウェルプレートに添加し、そしてさらに４８時間インキュベーションする。１０μｌのＷＳＴ−８（Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに添加し、そしてプレートを３７℃で２〜４時間インキュベーションする。生存細胞は、細胞数に比例して、デヒドロゲナーゼでの還元により、水溶性の黄色いホルマザン色素を産生する。マイクロプレート読み取り装置（Ｔｅｃａｎ（登録商標）Ｉｎｆｉｎｉｔｙ−１０００）を用いて、４５０ｎｍでの吸光度を決定する。各データ点を３つ組で行う。図１６は、２つのＳＩｇＡヤギ試料、１つのウシＳＩｇＡ試料および対照としてのヒトｈＳＩｇＡ試料の結果を示す。この結果は、このアッセイにおける毒素Ａの中和のレベルが、それぞれの試料上の非コア・フコシル化の量と相関することを示す。
実施例１１：
乳試料からの分泌型免疫グロブリンの調製
本実施例は、乳試料からの分泌型免疫グロブリンのパイロット規模調製を記載する。
材料および方法
ホエイの調製
すべての遠心分離工程に関して、ローターＪＬＡ １０．５００とともに、Ｂｅｃｋｍａｎ−ＣｏｕｌｔｅｒＴＭ Ａｖａｎｔｉ Ｊ−２５遠心分離装置を用いた。０．５Ｌの名目体積を持つビーカーを用いたが、最大０．４Ｌまでしか満たさなかった。
脱脂質化
１１８２７ｇ（８０００ＲＰＭ）、３０分間、室温の遠心分離によって、脱脂質化を行った。上清をさらなる調製に用いた。ペレット（脂肪）を廃棄した。
カゼインの酸性沈殿
４．６のｐＨが得られるまで、脱脂質化乳を一定して勢いよく攪拌しながら、５％ＨＣｌ溶液をゆっくりと添加することによって、酸性沈殿を行った。
沈殿物の除去
１４９６９ｇ（９０００ＲＰＭ）、４５分間、室温の遠心分離によって、沈殿物の除去を行った。上清をさらなる調製に用いた。ペレット（沈殿物）を廃棄した。
深層濾過
蠕動ポンプ（Ｗａｔｓｏｎ−Ｍａｒｌｏｗ Ｘ−１００）および無菌フィルター装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ−Ｓｔｅｄｉｍ Ｓａｒｔｏｂｒａｎ Ｐ ０．４５＋０．２μｍ孔サイズ；濾過面積０．１ｍ２）を用いて、ホエイを濾過した。
限外濾過／ディアフィルトレーション
装置
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＬａｂｓｃａｌｅＴＭ ＴＦＦ系
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｇｅｎｔ μＳｃａｌｅ ＴＦＦ系
濾過膜
ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＫｖｉｃｋＴＭ Ｓｔａｒｔ １００ｋＤ ５０ｃｍ２
ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＫｖｉｃｋＴＭ Ｌａｂ １００ｋＤ １００ｃｍ２
ホエイの濃縮およびディアフィルトレーション
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＬａｂｓｃａｌｅＴＭ ＴＦＦ系に関して、総膜面積０．０１５ｍ２で、ホエイの限外濾過およびディアフィルトレーションのため、３つの膜を用いた。ポンプ設定は２であり、そしておよそ２．５バールの膜差圧を調整した。ホエイを〜１：２５に濃縮し、そしてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でディアフィルトレーションする一方、濃縮ホエイを７倍過剰のＰＢＳで緩衝液交換した。
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｇｅｎｔ μＳｃａｌｅ ＴＦＦ系：総膜面積０．０３ｍ２の３つの膜を用いた。ポンプ設定は最大流量の４０％であり、およそ１５０ｍＬ／分に相当し、膜差圧は２．５バールであった。
別個の時間間隔で、浸透試料の重量を測定することによって、浸透流を測定した。
調製用ＳＥＣ
Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６
ＨｉＳｃａｌｅＴＭカラム２６／４０内にパッキングされたＳｕｐｅｒｏｓｅ ６調製等級を用いた。ベッド高は３２．５ｃｍであり、そしてカラム体積は１７３ｍＬであった。流速は３０ｃｍ／時間（２．６５ｍｌ／分）であり、そして試料体積は１５ｍＬであり、カラム体積（ＣＶ）の４．７％に相当した。０．３ＣＶ〜０．５７ＣＶまで、分画を行い、分画サイズは５ｍｌであった。平衡化および流動緩衝液は１ｘＰＢＳであった。
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００調製等級ＨｉＬｏａｄＴＭカラム２６／６０を用いた。ベッド高は５９．７ｃｍであり、そしてカラム体積は３１７ｍＬであった。流動条件はＳｕｐｅｒｏｓｅ６に記載するものと同じであった。
乳試料
地区の食料品店からウシおよびヒツジ乳を得て、ヤギホエイおよびヤギ乳のすべての試料を、Ｈｏｆｋａｅｓｅｒｅｉ Ｄｏｅｒｆｌ（Ｕｎｔｅｒｅ Ｂｅｒｇｓｔｒａｓｓｅ １， ３０４１ Ｄｏｅｒｆｌ、オーストリア）から得た。
分析用ＳＥＣ
ＨＰ Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ １１００（Ａｇｉｌｅｎｔ）を分析用ＳＥＣに用いた。カラムは、どちらもＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＳｕｐｅｒｏｓｅ６ １０／３００ＧＬおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ＧＬであった。流速は０．５ｍＬ／分であり、そして注入体積は５０μＬであった。平衡化および泳動緩衝液は１ｘＰＢＳであった。ＵＶシグナルを２１４ｎｍで記録した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
最終濃度２００ｍＭまでのＤＴＴおよびＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ試料緩衝液（４ｘ）とともに試料を添加し、そして１０分間煮沸した。試料をＴｒｉｓ−酢酸 ３〜８％ゲル上に装填し、泳動緩衝液は、１ｘＮｕＰＡＧＥ Ｔｒｉｓ−酢酸ＳＤＳ泳動緩衝液であった。泳動条件は、１５０Ｖ、最大アンペア、１．５時間であった。マーカーは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＨｉＭａｒｋプレ染色高分子量タンパク質標準であった。タンパク質染色をクーマシーブルーで行った。
ドットブロット
調製用ＳＥＣ実験由来の試料の５μｌ部分をニトロセルロース膜に適用した。試料を風乾した後、膜を３％ＢＳＡで１時間ブロッキングし、そして０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ緩衝液（洗浄緩衝液）で、３回洗浄した。その後、膜を特異的抗体−ＨＲＰコンジュゲートと１時間インキュベーションした。以下のコンジュゲートを用いた：１）ウサギ抗ヤギＩｇＭ−ＨＲＰ、製品番号ＡＡＩ４５Ｐ；２）ウサギ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ／Ｌ）−ＨＲＰ、製品番号５１６０−２５０４；３）ウサギ抗ヤギＩｇＡ−ＨＲＰ、製品番号ＡＡＩ４４Ｐ（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ、ドイツ）。コンジュゲートストックを、１％ＢＳＡを含有する洗浄緩衝液で１：３００００〜１：５００００に希釈した。洗浄緩衝液で３回洗浄した後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ、ドイツ）およびＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ＭａｎｎｈｅｉｍのＬｕｍｉ−ＩｍａｇｅｒＴＭスキャナを用いてシグナル化を行った。
３．４．１に記載するようにプロセスの完全質量バランスを確立し、そしてこれを表２中、２つのヤギ乳試料（実施例９の試料番号１１および１２）に関して示す。ＨＰＬＣ分析由来のすべてのピークプロファイルを個々の免疫グロブリンにデコンボルーションした。次いで、調製用実行データから得たタンパク質の純度および量に基づいて、ＳＩｇＡ含量を計算した。文献データ由来のヤギ乳のＩｇＡ含量は３０〜８０μｇ／ｍｌである。これらの値は、理論的収量計算の基準として働いた。
表２：試料１１および１２のプロセシングの質量バランス、収量および純度
１試料体積の４２％に基づく総ＩｇＡの理論的収量を用いた
実施例１２：
ＤＣ−ＳＩＧＮ結合に関するＥＬＩＳＡ
本実施例は、分泌型ＩｇＡ上のルイス特異的グリコシル化に関して、個々の乳試料をスクリーニングすることが可能であることを示す。レクチンＤＣ−ＳＩＧＮは、ルイス血液型構造に結合することが知られ、そしてしたがって、スクリーニング抗原として使用可能である。
個々のヤギ乳試料におけるＳＩｇＡのＤＣ−ＳＩＧＮ反応性に関するスクリーニングＥＬＩＳＡ
９６ウェルＮＵＮＣイムノプレート中でＥＬＩＳＡを行う。
コーティング：新鮮なコーティング緩衝液１００μｌ／ウェル中、１：１００に希釈したＤＣ−ＳＩＧＮ−Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、第１６１−ＤＣ−０５０；ストック溶液１００μｇ／ｍｌ）を４℃で一晩インキュベーションする。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ３００μｌ／ウェルと室温で３０分間インキュベーションする。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄する。
試料調製：個々のヤギ由来の１０ｍｌの乳を新鮮に採取し、そして４０，０００ｘｇ、４℃で３０分間遠心分離する。脂肪層をスパーテルで取り除き；残った液体を新規遠心管に移し、そして再び、４０，０００ｘｇで３０分間遠心分離する。液層（乳清）を分注し、そして−２０℃で保存するかまたは直接スクリーニングに用いる。
陽性試料として、ヒトｈＳＩｇＡ（Ｓｉｇｍａ第Ｉ１０１０）を５μｇ／ｍＬの濃度で用いる。
陰性対照として、ヤギ乳「Ｊａ Ｎａｔｕｅｒｌｉｃｈ」、Ｚｉｅｇｅｎｍｉｌｃｈ、Ｓｅｎｎｅｒｅｉ Ｚｉｌｌｅｒｔａｌ、オーストリアを用いる。
試料を常に、コンジュゲート緩衝液中で希釈した２つの希釈、１：２および１：１０で、１００μｌ／ウェルで添加し、室温で２時間インキュベーションする。
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、コンジュゲートをウェルに添加し（１００μｌ、ウサギ抗ヤギＩｇＡ−アルカリホスファターゼ・コンジュゲート、ａｂｃａｍ第１１２８６４、コンジュゲート緩衝液中、１：１０００で希釈）、そして暗所中、室温で１．５時間インキュベーションする。
陽性対照のため、抗ヒトＩｇＡ−アルカリホスファターゼ（Ａｃｒｉｓ、第Ｒ１３４２ＡＰ、１：１０００）を用いる。ウェルを続いて、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄する。１００μｌ色素原基質（１ｍｇパラニトロフェニルホスフェート／ｍｌ染色緩衝液）と、室温でインキュベーションして、検出を行う。
３０分後、マイクロプレート光度計で４０５ｎｍでプレートを測定する（参照波長６２０ｎｍ）。
コーティング緩衝液：０，４２ｇ Ｎａ２ＣＯ３＋０，８４ｇ ＮａＨＣＯ３＋１００ｍｌ Ａ．Ｄ．，＝ｐＨ９．７、４℃で保存、最大３日間使用。
ブロッキング溶液／洗浄緩衝液：１００ｍｌ ＰＢＳ＋１００μｌ Ｔｗｅｅｎ２０（＝０，１％）、常に新鮮。
コンジュゲート緩衝液：１０ｇ ＰＶＰ＋２５０μｌ Ｔｗｅｅｎ２０＋０．１ｇ ＭｇＣｌ２＋５００ｍｌ ＰＢＳ、７．４にｐＨ調整。
４℃で保存、場合によってＮａＨ３を添加することによって保存。
染色緩衝液：４７．８ｍｌジエタノールアミン＋３．３ｍｌ ７５ｍＭ ＭｇＣｌ２溶液＋４４８．９ｍｌ Ａ．Ｄ．、ｐＨを９．８に調整（急いでいる場合は、コーティング緩衝液を代わりに使用してもよいが、シグナルは弱くなるであろう）、４℃で保存、場合によってＮａＨ３を添加することによって保存。
２つのＥＬＩＳＡプレートの結果を図１７に示す。
ＥＬＩＳＡデータの統計的評価（評価の例示のために、希釈１：２のＯＤ（光学密度）値のみを用いる）：
プレートＡ：
陰性対照の平均ＯＤ： ０．０８２
陰性対照の標準偏差： ０．０６１
陽性に関する閾値（対照の平均に、標準偏差の３倍を加える）： ０．２６５
陽性試料（閾値より高いＯＤ）
試料４１（１．０４１）
試料４８（０．７４４）
試料５６（０．６９１）
試料６９（０．２８６）
プレートＢ：
陰性対照のＯＤ： ０．１３０
陰性対照の標準偏差： ０．０７４
陽性に関する閾値（対照の平均に、標準偏差の３倍を加える）： ０．３５２
陽性試料（閾値より高いＯＤ）
試料９０ （０．５８４）
試料９１ （０．３８５）
試料１０７ （１．６２７）
試料１０９ （０．４９８）
試料１１２ （１．１００）
試料１１５ （０．３７１）
試料１３２ （０．８８９）
すべての陽性試料をプールする。
ＤＣ−ＳＩＧＮ結合（ルイスグリコシル化に相当）に関する陽性は、亜種、摂食、健康状態等の意味で、他の動物に比較して、これらの動物が異なるためでありうる。
本発明記載の免疫複合体を含有する乳の産業的調製のため、高い非コア・フコシル化分泌型免疫グロブリンを含む乳の収集を確実にするために、個々の動物を再試験する。
ＤＣ−ＳＩＧＮ陽性ＥＬＩＳＡを生じる、こうした動物由来の乳を別個に収集し、そして続いてプロセシングする。個体由来の乳が陰性であるとの試験結果を得たら直ちに、それぞれの個体由来のそのミルクはもはや、ルイスグリコシル化濃縮分泌成分および免疫複合体を含有する乳のプールの調製には用いられない。
モルＳＣまたはＳＩｇＡあたり少なくとも１０ｍｍｏｌ非コア・フコースの試料を参照として用いた際、試験を較正して、参照より高いまたは低いレベルを決定することも可能である。
実施例１３
ＤＣ−ＳＩＧＮへの組換えヒトＳＣの結合
組換えＳＣの非コア・フコシル化の驚くべき効果を示すため、適切な細胞にＳＣの遺伝子をトランスフェクションすることによって、タンパク質を産生する。
実施例２に記載するように、ＣＨＯ ＬＥＣ１１内で、ベクターｐＣＤＮＡ３．１＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）中のＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ部位で、図２の遺伝子を挿入する（細胞株およびトランスフェクション技術は、Ｒｉｔｔｅｒｓｈａｕｓら Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． Ｖｏｌ． ２７４， ｐｐ．１１２３７−４４にしたがう）。
対照として、Ｐｈａｌｉｐｏｎら ２００２， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， Ｖｏｌ． １７， ｐｐ１０７−１１５）によるＣＨＯ ＤＵＫ−（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ９０９６）を、分泌成分遺伝子の発現宿主として用いる。
ＣＨＯクローンの上清を、分泌成分およびルイスグリコシル化に特異的なＥＬＩＳＡで試験する：
標準的ＥＬＩＳＡ形式でスクリーニングを行う。細胞培養上清ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉ−Ｓｏｒｐ Ｉｍｍｕｎｏプレート）を、ウェルあたり１００マイクロリットルの、ｍｌコーティング緩衝液（１０００ｍｌ蒸留水中、３．０３ｇ Ｎａ２ＣＯ３、６．０ｇ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ ９．６）あたり１マイクログラムの濃度の抗ヒト分泌成分抗体（Ｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ、第ＤＳ−ＰＢ−０３０１０、米国）でコーティングする。
プレートの蓋を閉じて、そして４℃で一晩インキュベーションする。
次の工程の前に、コーティング溶液を取り除き、そして２００μｌのＴＰＢＳ（５００ｍｌ蒸留水、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０中、１．１６ｇ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．１ｇ ＫＣｌ、０．１ｇ Ｋ３ＰＯ４、４．０ｇ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）でウェルを満たすことによって、プレートを３回洗浄する。プレートをシンクの上で軽く叩くことによって、溶液または洗浄液を除去する。紙タオル上でプレートを軽く叩くことによって、残りの滴を除去する。あるいは、ＥＬＩＳＡ洗浄装置で洗浄を行ってもよい。
プレートをＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ、第３７５１５）１５０マイクロリットル／ウェルで満たし、そして室温で２時間インキュベーションする。
再び、プレートを上述のように洗浄する。
細胞培養上清を試料ＴＰＢＳで希釈する（１：２および１：１０）。各希釈（１：２および１：１０）に関して１６の陰性対照を各プレートに添加する。各希釈に関する４つの陽性対照試料をプレートに添加する。それぞれの希釈の１００マイクロリットルを、洗浄したプレートのウェルに添加し、そして室温で２時間インキュベーションする。
洗浄後、ＴＰＢＳ中、１：１００希釈の抗シアリル−ルイスｘ抗体（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢ２０９６）１００マイクロリットルを、それぞれの試料ウェルに、そして陰性および陽性対照試料ウェルに添加する。
プレートを再び室温で２時間インキュベーションし、そして続いて洗浄する。
次いで、ニワトリ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ、第ＳＡ１−７２０２９、ＴＰＢＳ中１：５００）のウェルあたり１００マイクロリットルを添加し、そして室温で２時間インキュベーションする。続いて、プレートをＴＰＢＳで３回洗浄する。
次いで、基質緩衝液（ＴＭＢ基質キット；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、第ＳＫ−４４００、ＵＳＡ）で、さらなる洗浄工程を行う。その後、色素原基質を添加する（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＳＫ−４４００）。短期間インキュベーションした後（ＯＤ６５０＞１．０の陽性対照、ＯＤ＜０．２の陰性対照の測定）、５０マイクロリットルの１Ｎ硫酸を添加し、そしてプレートをマイクロプレート読み取り装置中、ＯＤ４５０で読み取り、ＴＭＢを基質として利用する標準的ＥＬＩＳＡ技術におけるように、ＯＤ６００によって補正する。
ＬＥＣ１１中で発現された組換えヒトＳＣが、シアリル−ルイスｘを示すことが示されうる。対照的に、正常ＣＨＯ（ＣＨＯ ＤＵＫ−）中の組換えＳＣの発現は、いかなる非コア・フコシル化も示さない。
精製：
アフィニティクロマトグラフィの標準的プロトコルにしたがって、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅにカップリングしたウサギ抗ヒト分泌成分を伴うアフィニティクロマトグラフィによって、動物細胞上清からの組換え分泌成分および分泌型ＩｇＡの精製を行う。
脱シアル化：
１００マイクログラムの組換えＳＣを、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０中の０．１単位のシアリダーゼ（Ｐｒｏｚｙｍｅ、カタログ番号ＧＫ８００４０）を含む３０マイクロリットルの反応体積中で、３７℃で８時間脱シアル化する。
製造者にしたがって、ＰＤ ＳｐｉｎＴｒａｐ Ｇ−２５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号２８−９１８０−０４）を通じて脱塩した後、ＤＣ−ＳＩＧＮへの結合に関して、ＥＬＩＳＡにおいて、組換えＳＣタンパク質を試験する。
ＤＣ−ＳＩＧＮ ＥＬＩＳＡ
９６ウェルＮＵＮＣイムノプレート中でＥＬＩＳＡを行う。
コーティング：新鮮なコーティング緩衝液（０，４２ｇ Ｎａ２ＣＯ３＋０，８４ｇ ＮａＨＣＯ３＋１００ｍｌＡ．Ｄ．，＝ｐＨ９．７、４℃で保存、最大３日間使用）中、ＤＣ−ＳＩＧＮ−Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、第１６１−ＤＣ−０５０；ストック溶液１００μｇ／ｍｌ）を１：１００に希釈する。
コーティングを１００μｌ／ウェルで添加し、４℃で一晩、インキュベーションを行う。
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ３００μｌ／ウェルと室温で３０分間インキュベーションする。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄する。
試料：
ＣＨＯ ＤＵＫ−細胞ならびにＣＨＯ ＬＥＣ１１で産生した組換えＳＣ調製物を、それぞれシアリダーゼ処理の前および後で、ｍｌあたり１マイクログラムの出発濃度で、コンジュゲート緩衝液中で連続希釈する（１：５段階で）。１００μｌの各希釈をコーティングプレートに２つ組で添加し、そして室温で２時間インキュベーションする。
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、コンジュゲートをウェルに添加し（１００μｌ、抗ヒトＳＣ−ＨＲＰコンジュゲート、Ａｃｒｉｓ、第ＡＰ２１４７６ＨＲ−Ｎ、コンジュゲート緩衝液中、１：１０００希釈）、そして室温で１．５時間インキュベーションする。
続いて、ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄する。次いで、基質緩衝液（ＴＭＢ基質キット；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 第ＳＫ−４４００、米国）で、さらなる洗浄工程を行う。その後、色素原基質を添加する（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＳＫ−４４００）。短期間インキュベーションした後、５０マイクロリットルの１Ｎ硫酸を添加し、そしてプレートをマイクロプレート読み取り装置中、ＯＤ４５０で読み取り、ＴＭＢを基質として利用する標準的ＥＬＩＳＡ技術におけるように、ＯＤ６００によって補正する。
ブロッキング溶液／洗浄緩衝液： １００ｍｌ ＰＢＳ＋１００μｌ Ｔｗｅｅｎ２０（＝０，１％）
コンジュゲート緩衝液： １０ｇ ＰＶＰ＋２５０μｌ Ｔｗｅｅｎ２０＋０．１ｇ ＭｇＣｌ２＋１ｍＭ ＣａＣｌ２＋５００ｍｌ ＰＢＳ、ｐＨを７．４に調整
ＰＢＳは、１ｍＭ Ｃａを含むリン酸緩衝生理食塩水である。
４℃で保存、場合によってＮａＨ３を添加することによって保存。
ＣＨＯ ＬＥＣ１１由来の脱シアル化組換えＳＣは、ＣＨＯ ＣＨＯ ＤＵＫ−中で産生された脱シアル化分泌成分ならびにＣＨＯ ＬＥＣ１１中で発現されたシアル化ＳＣに比較した際、ＤＣ−ＳＩＧＮにより強く結合することが示されうる。

Claims (11)

  1. 分泌型免疫グロブリンに基づく免疫複合体調製物を産生する方法であって
    Ｎ−グリコシル化分泌成分（Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）を産生することが可能な、自己または異種機能性アルファ−１，ｘ−フコシルトランスフェラーゼ、ここで、ｘは２、３または４である、を発現している組換え産生宿主細胞株を提供し、
    こうした宿主細胞株によって、モル分泌成分あたり、少なくとも２モルの非コア・フコースを含む分泌成分を産生し、そして
    前記分泌成分を、天然グリコシル化パターンを有するＩｇＡまたはＩｇＭ免疫グロブリンの少なくとも１つと組み合わせて、免疫複合体を得る
    工程を含む、前記方法。
  2. 前記分泌成分が、哺乳動物起源、特にヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、非ヒト霊長類、ブタ、ラクダ（ｃａｍｅｌ）、ヒトコブラクダ（ｄｒｏｍｅｄａｒｙ）、ロバまたはウマのアミノ酸またはヌクレオチド配列、あるいはそのキメラ配列から得られる、請求項１に記載の方法。
  3. 前記分泌成分が、前記宿主細胞株の細胞培養物の分画中で濃縮され、そして前記分画から単離される、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記宿主細胞株が、ヒト細胞株、哺乳動物細胞株、鳥類細胞株、細菌、植物、酵母、昆虫、真菌、蘚類および古細菌からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか1項に記載の方法。
  5. ヒト分泌物以外の供給源から得られる、分泌型免疫グロブリンに基づく免疫複合体調製物であって、
    ルイス型Ｎ−グルコシル化パターンおよびモル分泌成分あたり少なくとも２モルの非コア・フコースを持つ、分泌成分、ならびに
    天然グリコシル化パターンを有するＩｇＡまたはＩｇＭ免疫グロブリンの少なくとも１つ
    を含む、前記免疫複合体調製物。
  6. ポリマー性免疫グロブリンを含む、請求項５に記載の調製物。
  7. 多重反応性免疫グロブリン、好ましくは自然抗体を含む、請求項５または６に記載の調製物。
  8. 液体、エマルジョンまたは懸濁物の型の、あるいは乾燥型、好ましくはスプレー乾燥または凍結乾燥型の、請求項５〜７のいずれか1項に記載の調製物を含む配合物。
  9. 液体、シロップ、ロゼンジ、錠剤、例えば発泡錠、スプレー、吸入具配合物、粉末、即席粉末、顆粒、座薬、カプセル、クリーム、ペースト、ジェル、ドロップ、懸濁物、エマルジョン、または乳製品およびチューインガムを含む食品の型の、請求項８に記載の配合物。
  10. 食品として使用するためのおよび／または療法使用のための、請求項８または９に記載の配合物。
  11. 粘膜免疫グロブリン不全の療法または予防において使用するための医薬、好ましくは粘膜適用、好ましくは経口、気管支、鼻、膣、胃内または直腸使用のための配合物中の製造における、請求項５〜７のいずれか記載の免疫複合体調製物、または請求項８〜１０のいずれか記載の配合物の使用。
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