CN104349789A

CN104349789A - 分泌性免疫球蛋白复合物

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Publication number: CN104349789A
Application number: CN201380029959.1A
Authority: CN
Inventors: 戈特弗里德·希姆莱
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Current assignee: Individual
Priority date: 2012-04-05
Filing date: 2013-04-05
Publication date: 2015-02-11
Anticipated expiration: 2033-04-05
Also published as: AU2013244916B2; ES2691619T3; EP3427747A1; CA2869023A1; KR20150003195A; EP2833903B1; CN104349789B; JP6238958B2; WO2013150138A1; US10059777B2; AU2013244916A1; EP2833903A1; US20150166679A1; JP2015516962A

Abstract

本发明提供一种以为非人分泌物来源的分泌性免疫球蛋白为基础的免疫复合物制剂的生产方法，所述方法包括-提供工业规模的生产体系，能够生产N-糖基化分泌成分，-通过此类体系生产分泌成分，所述分泌成分包括相对于每摩尔分泌成分的至少0.01mol的非核心岩藻糖，和-将所述分泌成分与具有天然糖基化模式的IgA或IgM免疫球蛋白的至少之一相结合，从而获得免疫复合物。本发明提供包括氨基酸序列SEQ ID 1或其功能性活性变体的分离的重组分泌成分，所述分离的重组分泌成分具有路易斯型N糖基化模式和相对于每摩尔分泌成分的至少2mol非核心岩藻糖；还提供一种以源自除人分泌物以外来源的分泌性免疫球蛋白为基础的免疫复合物制剂，其包括-分泌成分，所述分泌成分具有路易斯型N糖基化模式和相对于每摩尔分泌成分的至少0.01mol非核心岩藻糖，和-具有天然糖基化模式的IgA或IgM免疫球蛋白的至少之一。

Description

分泌性免疫球蛋白复合物

技术领域

本发明涉及生产以不源自人乳的分泌性免疫球蛋白为基础的免疫复合物制剂(preparation)的方法、免疫复合物制剂和重组分泌成分。

背景技术

分泌成分(Secretory Component，SC)为分泌性免疫球蛋白(SIgA和SIgM)的成分，包括多聚免疫球蛋白受体(pIgR)的胞外部分。多聚IgA和IgM通过J链介导而在上皮细胞的基底外侧面上结合至多聚免疫球蛋白受体，并且经胞转(transcytosis)吸收至细胞中。受体-免疫球蛋白复合物在分泌至上皮细胞腔表面上之前穿过细胞区室(cellular compartment)，仍与受体附着。受体的蛋白水解作用发生并且二聚IgA分子或IgM，与分泌成分一起，在整个腔内自由扩散。

已记载了分泌成分在各种分泌体如唾液、眼泪、粘液和乳中产生。可作为分泌性免疫球蛋白(SIg，即SIgA和SIgM)的一部分以及游离的分泌成分(fSC)而发现。

人分泌成分(hSC)通过在胞转过程中受体分子胞外部分的切割而衍生自多聚免疫球蛋白受体。其具有约80kDa的表观分子量并由排列在五个V型免疫球蛋白结构域中的约前585个氨基酸的pIgR(多聚Ig受体)组成。其具有7个潜在的N-糖基化位点。这种强烈的糖基化作用有助于大的表观分子量。这些聚糖的组成包括二-和三触角结构、路易斯型结构以及半乳糖和唾液酸。这些聚糖构成细菌、病毒、真菌和原生动物结构如黏附素和毒素以及宿主组织上的黏蛋白和受体的结合表位。

分泌成分的一项拟议的功能是保护多聚免疫球蛋白免受蛋白降解并结合至与结构相关的病原体和毒素如幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic E.coli)、艰难梭菌(Clostridium difficile)毒素A和肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)胆碱结合蛋白A。SC上的聚糖已证实参与对粘膜病原体的固有保护(Perrier等人，THE JOURNAL OF BIOLOGICALCHEMISTRY Vol.281(20),pp.14280-14287,2006)。作者报道了由转染的中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary cells,CHO))产生的重组人SC与由人乳纯化的SC表现相同。与病原体抗原的相互作用由存在于hSC上的聚糖介导并涉及半乳糖和唾液酸残基。hSC被认为是有助于保护身体上皮表面的抗病原库(antipathogenic arsenal)的微生物清除剂。

发现由人乳纯化的SC竞争性抑制艰难梭菌毒素A结合至受体(Dallas等人，J.Med.Microbiol.47:879-888(1998))。通过酶消化从SIgA和SC除去糖类显示出艰难梭菌毒素A与去糖基化SC的结合比与糖基化SC的结合少。

人SC存在大范围的聚糖结构，包括可能结合凝集素和细菌黏附素的所有不同的路易斯和唾液酸化(sialyl)-路易斯表位。人们可发现半乳糖与GlcNAc连接成β1-4和β1-3；岩藻糖与GlcNAc连接成α1-3和α1-4且与半乳糖连接成α1-2，以及α2-3-和α2-6-连接的唾液酸。来自人乳的SC的超过50％的聚糖显示各种类型的非核心岩藻糖基化(non-core fucosylation)，最丰富的含岩藻糖的抗原为路易斯x。人SC中约30％的路易斯型岩藻糖基化抗原被唾液酸化。总之，来自人乳的SC显示超过50种不同的糖型。

SC上聚糖的拟议功能为例如

·分泌性免疫球蛋白在粘液中锚定的介导，

·分泌性免疫球蛋白/抗原复合物与特定受体(如DC-SIGN)结合的介导，

·作为结合至宿主细胞的病原体结构的竞争性抑制剂(“诱饵(decoy)”)的作用，例如通过作为由病原体毒素、病毒和细菌表达的凝集素样受体的诱饵而起作用，

·分泌性免疫球蛋白和对抗蛋白酶的SC(SC against proteases)的保护。

天然SC中发现的众多聚糖结构可反映众多功能。然而，对于分泌性免疫球蛋白的特定治疗和预防用途，可有利地减少聚糖种群(population)在分泌性免疫球蛋白制备中的复杂度。对特定聚糖结构和修饰的偏向可增加分泌性免疫球蛋白制剂的效力和/或减少分泌性免疫球蛋白制剂的潜在副反应。

人分泌成分已重组表达在各种基因工程生物体和细胞例如细菌(大肠杆菌)、昆虫细胞(Sf9细胞)、哺乳动物细胞(中国仓鼠卵巢细胞、非洲绿猴肾CV-1细胞、人骨肉瘤细胞TK-143B、人HeLa细胞、仓鼠崽肾细胞、人腺癌细胞HT29、小鼠成纤维细胞、马-达二氏犬肾细胞(Madin-Darby canine kidney cells))和植物(例如US20080260822，EP799310，Michetti等人，1991Adv Exp MedBiol,vol 310,pp 183-5；Suguro等人，2011,Protein Expr Purif.Vol.78,pp 143-8；Prinsloo等人，2006Protein Expr Purif.vol 47,pp 179-85；Ogura,2005,J OralSci.vol 47,pp 15-20；Matsumoto等人，2003Scand J Immunol.Vol 58,pp471-6；Johansen等人，1999Eur J Immunol.,Vol 29,pp 1701-8；Chintalacharuvu和Morrison 1999,Immunotechnology.Vol 4,pp 165-74；de Hoop等人，1995.JCell Biol.Vol 130,pp 1447-59；Larrick等人，2001Biomol Eng.Vol 18,pp87-94；Berdoz等人，1999,Proc Natl Acad Sci U S A.vol 96,pp 3029-34；Rindisbacher等人，1995,J Biol Chem vol.270,pp14220-8)中。

发现于重组SC的聚糖模式依赖于宿主物种，宿主有机体(host organism)、组织来源，以及基因工程细胞的生理状态。

虽然大肠杆菌根本不能产生N-糖基化蛋白，但迄今为止用于表达重组SC的大多数其它宿主不能产生路易斯x岩藻糖基化(Sf9细胞、植物细胞、HeLa、CHO细胞、CV-1细胞、143B细胞、BHK细胞、小鼠成纤维细胞、MDCK细胞)。在所述条件下，HT-29不会有效地在N-聚糖上产生路易斯抗原。在葡萄糖中培养的HT-29细胞具有未分化多能过渡细胞(transit cells)的性质，非常不稳定，然而，在分化非许可条件(HT-29Glc+)下生长的HT-29细胞中高甘露糖向复合物糖蛋白的转化严重减少，而不管研究任何生长阶段。

母乳中的糖类表位已知在物种间不同，其中人乳表达最复杂的一种。Gustafsson等人(Glycoconjugate 22:109-118(2005))研究了在来自人、牛、山羊、绵羊、猪、马、单峰驼(dromedary)和兔的个体乳样品中的蛋白-结合糖类表位的表达。

发现于SC的聚糖模式依赖于宿主物种、宿主有机体、组织来源和生物体的生理状态(如健康状态、泌乳期)。

Xu等人(World J.Gastroenterol.10(14)2063-2066(2004))分析了从转基因山羊获得的岩藻糖基化乳的作用。人α1-2/4岩藻糖基转移酶(fucosyl-transferase)基因在山羊乳腺中瞬时表达，从而产生“人源化”山羊乳。发现山羊乳样品抑制细菌结合至路易斯b抗原。

WO95/24495A1记载了在表达人糖基转移酶的转基因哺乳动物的乳中转基因生产寡糖和复合糖(glycoconjugates)。

Grabenhorst等人(Glycoconjugate Journal 1999,16(2):81-97)描述了在经常使用的宿主细胞中重组糖蛋白的基因工程，例如CHO细胞用糖基转移酶转染。

Porter P(Immunology 1973,24(1)163-176)描述了来自母猪乳的猪分泌成分和分泌性IgA的纯化。

Gustafsson等人(Glycoconjugate Journal 2005,22(3)109-118)描述了人和动物乳蛋白的路易斯型N-糖基化。

pIgR-pIg复合物穿过细胞胞转，并且在腔表面pIgR在毗邻细胞膜的42-氨基酸区域(region)内被蛋白酶切割，由此将SIg释放至腔内。

pIgR的切割的胞外部分仍结合至pIg，并在此命名为分泌成分(SC)。pIgR还可转运至粘膜内，即使pIg未结合于此，因此大多数外分泌液包含结合在SIg内的SC，还包含游离的SC。

精确的切割位点仍旧是模糊不清的，例如人SC发现具有参差不齐的C-末端，从Ala-550至Lys-559变化，其中Ser-552为主要的C-末端残基。

可能的是额外的蛋白水解可在pIgR切割后发生。事实上，来自不同粘膜液的游离的SC似乎具有稍微不同的分子量，这可能教导了蛋白水解的确在游离的SC从pIgR释放后在体内发生。

来自初乳的游离的SC具有大约76.5kDa的分子质量，与之相比，结合至dIgA的SC的分子质量大约80kDa。已显示该差异起源于多肽链长度的差异。然而，关于乳源SC的C末端结合至多聚免疫球蛋白还没有明确的共识。

SIgA1和SIgA2中通常较大尺寸的SC与游离的SC相比可起因于前者中二聚IgA的存在，在pIgR于胞转后切割时二聚IgA可保护SC的C-末端连接子。而在游离的SC于类似情况下切割时该由二聚IgA提供的保护将会缺失。

人初乳和乳富含蛋白酶和蛋白酶抑制剂二者。抑制剂与蛋白酶之比限定了活性蛋白酶是否存在。在出生后该比例随时间显著变化且似乎在不同个体间存在差异。由于游离的SC的C-末端连接子肽对蛋白酶高度敏感，有可能对于初乳和乳的游离的SC来说存在没有“正确”的C-末端的情况。此外，来自除乳腺以外的其它组织(例如消化道(gut)、支气管、鼻组织)的SC的C-末端可显示不同的C-末端，或者是因为来自pIgR的不同酶切割，或者是因为存在不同蛋白酶修剪(trimming)游离的SC或pIg-结合的SC。

防护人在粘膜部位(眼、鼻、口、肺、耳、气管(traches)、食管、胃道(gastrictract)、肠、泌尿生殖道和结肠)的感染的最重要的分子之一为分泌性IgA，其可经由其四个抗原结合位点起作用，也可经由聚糖介导的分泌成分的结合起作用。

许多研究证实了分泌物中特定SIgA抗体的效价(titer)与抗感染性之间的强相关。某些研究证实了防护由形成细菌病原体的被囊(capsule)造成的全身激发(system challenge)。

来自正常受试者的唾液和初乳包含多反应性SIgA抗体，识别各种自身抗原和多种细菌抗原。已表明，这些为B-1细胞的产物，构成在种系中编码的“天然抗体”所有组成成分(repertoire)的一部分，并且缺乏记忆能力和亲和性成熟。这些抗体可提供在常规B-2-细胞暴露于标称抗原(nominal antigen)后生成特定抗体之前的粘膜表面的保护。尽管它们具有低的对抗原的固有亲和力，但SIgA中四个抗原结合位点的存在增加了其功能活性。的确有迹象教导了细菌黏附素已进化(evolved)，因为它们能够避免被这些自然发生的多反应性抗体所识别。

在人类中，存在两种独特的IgA-亚类(IgA1和IgA2)。已记载了人IgA2的两种或三种异型(α-重链的恒定区结构域的不同组合)。循环(血浆)IgA的主要分子形式为单体，与上皮中产生的二聚(多聚)pIgA相反，且转运至分泌物中成为SIgA。

人IgA1和IgA2(包括异型)似乎具有很少的(若有的话)不同生物特性，但显著例外可见于IgA亚类之间对细菌蛋白酶的敏感性的差异。IgA1和IgA2的抗体特异性分布也不同。

成人用蛋白质抗原的免疫主要产生IgA1，用多糖的免疫主要引起IgA2抗体应答。到达粘膜表面的免疫球蛋白同种型中，SIgA为最稳定的之一，该稳定性已很大程度上归因于掩饰了Fc部分内潜在的切割位点的SC。

证实了SIgA抗体对微生物表面的表面结构的特异性抑制了对咽、肠、泌尿生殖道和牙龈上皮细胞的附着。除特异性的抗体介导的附着抑制以外，人IgA，特别是SIgA，借助其糖链结合至多种细菌物种和抗原。其显著的实例见于IgA2的情况，其中IgA2可通过涉及大肠杆菌与上皮细胞的I型(甘露糖依赖性)菌毛和I型菌毛依赖性粘合的机理粘合大肠杆菌。

外分泌中的IgM还与由通过pIgR转运至分泌物产生的分泌成分(分泌性IgM，SIgM)相关。SIgM的浓度低于SIgA的浓度，或者是因为粘膜组织中IgM-产生细胞较低的比例，或者是因为IgM由于pIgR-依赖型转运的分子量限制而比pIgA转运稍差。

天然抗体，根据定义，在明显缺乏抗原刺激下产生。它们由特定的B细胞亚单位产生，且不广泛地亲和力成熟。已描述了IgA、IgM和IgG类别的天然抗体。这些抗体一般由生殖系基因编码，其中具有很少(若有的话)突变，且在许多情况下具有与PAMP(pathogen-associated molecular pattern，病原体相关分子模式)、肿瘤抗原和多种自身抗原的广泛反应性。由于它们的低亲和力和种系构造，此类多反应性抗体似乎不是真正的自身抗体，当然也不与抗原特异性、体细胞突变、高亲和力病理自身抗体属于相同的类别。

天然抗体被认为是固有免疫系统的一部分。它们已拟议用于某些治疗用途，例如癌症治疗，或传染性疾病。

许多多反应性抗体具有种系或近种系序列，且主要为IgM，但有些也为IgG和IgA。

与抗原-抗体相互作用的典型“锁钥”刚性结构假设相反，多反应性抗体的抗原结合口袋(antigen binding pocket)，或许是由于它们的种系构造，被认为更加柔性，因而可适应不同抗原构造。

尽管某些报道已建议SIgA本质上为多反应性的，但其它发现指出限制的特异性可为交叉反应性。

WO2009139624A1公开了通过分级非人乳生产富含分泌性IgA的组合物的方法。此类组合物可特别用于治疗和/或预防需要此类处理的受试者的粘膜表面例如胃肠道、泌尿生殖道、呼吸道、鼻腔或口腔的感染和/或炎症，治疗和/或预防需要此类处理的受试者的肥胖症及相关疾病，或者治疗和/或预防需要此类处理的受试者的食物过敏。

公知的是，人乳包含大量的路易斯-糖基化的复合糖如糖蛋白(例如SIgA和SC)，并且普遍接受的是人乳的值之一为其对由抗体、聚糖、寡糖和其它活性物质如溶菌酶和乳铁蛋白引起的感染的高保护性效价。虽然人乳分析揭示了75％的岩藻糖基化分布，但在牛乳分析中仅观察到31％的岩藻糖基化分布。在牛乳分析中仅检测到核心岩藻糖基化。

尽管具有特定糖基化的人分泌性免疫球蛋白已证实了关于结合至病原体结构、黏蛋白和受体的有利效果，但它们还不能以期望品质大规模生产。对于伦理理由，人乳典型地不视为适合的原料。

发明内容

本发明的目的为提供改进的以工业规模生产高品质分泌性免疫球蛋白制剂的方法。进一步的目的为提供特别适用于粘膜应用的改进的SC和免疫复合物制剂。

所述目的已被权利要求的主题解决。

根据本发明，提供有生产以为非人分泌物来源的分泌性免疫球蛋白为基础的免疫复合物制剂的方法，所述方法包括

-提供能够生产N-糖基化分泌成分的工业规模的生产体系，

-通过此类体系生产分泌成分，所述分泌成分包括相对于每摩尔分泌成分的至少0.01mol非核心岩藻糖，和

-将所述分泌成分与具有天然糖基化模式的IgA或IgM免疫球蛋白的至少之一相结合，从而获得免疫复合物，特别是天然N-糖基化模式。此类免疫复合物制剂在本文中具体理解为固有免疫复合物制剂，其将具体支持哺乳动物的固有免疫系统。

非核心岩藻糖具体提供路易斯表位。因此，根据本发明的免疫复合物在此指包括相对于每摩尔分泌成分的至少0.01mol路易斯表位。然而，在大多数情况下，SC的非核心岩藻糖基化以适当的分析确定。

优选该生产体系能够生产路易斯型N-糖基化蛋白，具体为具有末梢(peripheral)或触角例如外臂的分泌成分，岩藻糖基化通过适当的分析手段例如电泳技术、色谱分析技术、质谱分析技术、化学和酶技术或其组合来确定。

具体地，本发明提供分泌成分，所述分泌成分源自哺乳动物来源的氨基酸或核苷酸序列，或其嵌合序列，所述哺乳动物来源具体为人、牛、山羊、绵羊、非人灵长类动物、猪、骆驼、单峰驼、驴或马。

具体地，根据本发明的方法采用选自乳腺分泌物和重组细胞培养物的合并来源(pooled sources)的生产体系。

在具体的实施方案中，所述分泌成分源自物种例如人、牛、山羊、绵羊、非人灵长类动物、猪、小鼠、大鼠、兔、狗、小袋鼠(wallaby)、负鼠、熊猫、鱼、鸡、鸟、青蛙的氨基酸或核苷酸序列，或其嵌合序列。优选地，所述分泌成分源自哺乳动物来源的氨基酸或核苷酸序列，或其嵌合序列，所述哺乳动物来源具体为人、牛、山羊、绵羊、非人灵长类动物、猪、骆驼、单峰驼、驴或马。

在优选的方法中，分泌成分富集在生产体系的级分中，例如乳级分，任选地从所述级分分离。具体地，本发明的分泌成分制剂从此类富集的级分中获得。具体地所述分泌成分富集在级分中作为免疫复合物。

根据具体方法，所述分泌成分由选自由源自至少10个泌乳期雌性个体的乳、乳浓缩物、乳粉、乳清、乳清浓缩物和乳清粉组成的组的合并来源获得。

根据本发明的免疫复合物制剂，如果选自分泌物的池(pool)，例如乳、唾液、或粘膜分泌物(mucosal excretions)，具体包含具有变化的C-末端的SC的混合物。

具体地所述个体为非转基因的且为选自由山羊、猪、牛、绵羊、马、驴、单峰驼和骆驼组成的组的物种，其中优选山羊、猪、牛和绵羊。

优选地所述个体选自能够生产具有路易斯型N-糖基化的糖蛋白的种群。具体的选择可从种群或畜群针对表达天然N-糖基化蛋白，即非重组蛋白的能力而作出。此类个体将产生“人样”SC，但不是将包含糖基化模式中不必要改变的“人源化”乳。例如，选择此类个体用于生产天然N-糖基化蛋白来表达具有天然糖基化模式的免疫复合物，包括SC上的路易斯表位，具体地在末梢岩藻糖基化中具有非核心岩藻糖或路易斯表位，而不在免疫球蛋白重链的N-糖基化位点上。

天然糖基化免疫球蛋白仅具有核心岩藻糖基化的N-聚糖。这与来自表达异源糖基转移酶的转基因动物的免疫球蛋白相反，后者将产生包括过剩的非核心或末梢岩藻糖基化以及路易斯表位的免疫球蛋白制剂。

在获得来自人类或动物的具有天然糖基化模式的根据本发明的免疫复合物制剂的努力中，优选此类制剂基于非重组蛋白，或者不从此类表达异源糖基转移酶的转基因动物中获得。

例如根据个体哺乳动物或细胞生产具有路易斯型N-糖基化、特别是在SC上具有非核心岩藻糖基化或路易斯型糖基化的糖蛋白的能力作出选择。

优选地，非核心岩藻糖的相对含量为至少0.01mol/mol SC，优选至少0.02mol/mol SC，更优选至少0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09或0.1mol/mol SC，更优选至少0.2、0.3、0.4或0.5mol/mol SC，甚至更优选至少1mol/mol SC，或甚至更高，例如至少2mol/mol SC、至少3mol/mol SC、至少4mol/mol SC、至少5mol/mol SC、至少6mol/mol SC、至少7mol/mol SC、至少8mol/mol SC、至少9mol/mol SC或至少10mol/mol SC。

在具体情况中，N糖基化位点量的理论值为2(鱼)、3(牛)、4(马、狗、大鼠)、5(鸡、猩猩(orang-utan)、猪)、6(黑猩猩、青蛙)或7(人、小鼠、软骨鱼类)mol/mol SC。根据本发明，具体优选非核心岩藻糖的量或路易斯表位的量为至少1％，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9或10％的N-糖基化位点的理论值，更优选至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，上至理论值。非核心岩藻糖的量可超过N-糖基化位点的理论值，例如，通过每个N-糖基化位点的多个岩藻糖基化，从而获得比N-糖基化位点数多的基于摩尔的路易斯表位。在具体的优选情况中，非核心岩藻糖或路易斯表位的量为至少1.1倍、优选至少1.2倍、或至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍或至少2倍，在具体情况中，该量甚至更高，例如至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍或至少9倍，例如多至10倍的N-糖基化位点的理论量。

而下限阈值，例如相对于每摩尔SC的至少0.01mol非核心岩藻糖，反应了高品质的SC制剂，特别是在牛或反刍动物中，较高的阈值，例如至少0.1或至少0.5，甚至至少1.0mol/mol，可应用于从来源如马、驴或猪获得的高品质SC制剂。

非核心岩藻糖基化在制剂中的程度可通过选择具有高非核心岩藻糖基化(相对于每摩尔SC)的SC来增加。这可在选择生产型宿主(例如筛选细胞系、微生物克隆或生物体)的水平下进行，或者可在下述个体供体的水平下进行，选择所述个体供体来为这些样品的随后合并提供包含具有高摩尔非核心岩藻糖基化的SC的分泌物。岩藻糖基化可通过本发明的SC制剂或免疫复合物的酶或化学岩藻糖基化来增加。

根据具体实施方案，SC和/或免疫球蛋白由作为中间物提供的包括期望品质的SC和/或免疫球蛋白的合并来源获得。此类中间物可选自合并干燥的乳或乳清粉，例如冻干或喷雾干燥的，或者包含血浆免疫球蛋白的血浆池或合并的血浆级分。然后将中间物进一步加工以富集SC和/或免疫球蛋白级分，例如至少10倍、优选至少20倍，或甚至更高。

根据本发明的富含SC和/或SIgA的具体制剂具体包括至少20％SC和/或SIgA，或者至少30％、至少40％或至少50％(w/w总蛋白)。

尽管SIgA或SIgM免疫复合物优选不完全由重组来源例如转基因动物或基因工程细胞获得，特别是对于免疫复合物的IgA或IgM成分，来源优选非重组体，根据具体实施方案，分泌成分可由重组宿主细胞获得，例如由表达自身或异源N-糖基转移酶和特别是岩藻糖基转移酶的宿主细胞获得，优选表达自身或异源功能性α-1,x-岩藻糖基转移酶的重组生产型宿主细胞系，其中x为2、3或4，优选选自由人细胞系、哺乳动物细胞系、鸟类细胞系、细菌、植物、酵母、昆虫、真菌、苔藓和古菌(archaea)组成的组。

根据具体方面，本发明提供一种分离的重组分泌成分，所述分泌成分包括氨基酸序列SEQ ID 1，或其功能性活性变体，该分泌成分具有路易斯型N糖基化模式和相对于每摩尔分泌成分的至少2mol非核心岩藻糖。具体地，重组SC包括人SC序列，或人SC来源的序列。根据优选的实施方案，重组SC为人SC，或其功能性活性变体。

具体地，本发明的重组分泌成分包括唾液酸，优选相对于每摩尔分泌成分的至少2mol唾液酸。更具体地，重组SC包括相对于每摩尔分泌成分的至少2mol唾液酸化路易斯x。

可选地，本发明的重组分泌成分为非唾液酸化的，优选包括相对于每摩尔分泌成分小于0.1mol唾液酸。

重组SC可通过将pIgR完整基因如人pIgR引入宿主细胞，随后表达跨膜蛋白pIgR，接着将胞外部分-SC切割并释放至培养上清液中来生产。可选的表达为SC的核苷酸序列的转录，即仅胞外结构域，例如编码氨基酸序列SEQ ID1。在所有情况下，重组SC的表达允许生产条件的精确选择，确保终产物的均一C-末端。

还允许根据需要选择翻译终止位点。优选要表达的SC基因上的终止密码子位于编码最后的胞外免疫球蛋白-样结构域(结构域5)和跨膜区之间。然而，本发明的重组SC可甚至更短，只要其能够结合多聚免疫球蛋白并包含所需水平的非核心岩藻糖即可。

SEQ ID 1中前18个氨基酸包括信号肽，其可被不同信号肽所取代，取决于所使用的宿主细胞或有机体以及所需的分泌效率。对于通过化学合成生产或细胞内生产SC，不需要信号肽(例如对于大肠杆菌内含体中非糖基化形式的生产)。蛋白质还可修饰成在SEQ ID 1的C-末端包含额外的氨基酸。

该蛋白质可在核酸中的需要位置处通过终止密码子来终止，该位置分别在氨基酸G545的密码子之后，优选位于K566和E607之间(包括这些位点)的任意氨基酸位点，更优选在R603和E607之间(包括这些位点)，或者在E607之后。最优选SC在R603之后终止。编号指的是SEQ ID 1。

优选地，本发明的SC制剂为均一的，其中至少80％、至少90％或至少95％，多至100％的SC分子具有相同的C-末端。

重组SC的聚糖模式依赖于宿主物种、宿主有机体、组织来源和基因工程细胞的生理状态。

优选宿主细胞选自由人细胞如PerC.6、中国仓鼠卵巢细胞、仓鼠崽肾细胞、鼠类细胞、鸟类细胞系、细菌细胞、酵母真菌细胞、植物细胞和昆虫细胞组成的组。重组SC可获得期望的非核心岩藻糖基化或路易斯型N-糖基化。优选选择或修饰宿主细胞以表达需要的糖基转移酶，从而产生非核心N-糖基化岩藻糖基化。非核心岩藻糖基化可例如通过酶或化学或化学酶技术在表达重组SC之后引入或增加。

在本发明的制剂中非核心岩藻糖基化的程度可通过选择具有高非核心岩藻糖基化(相对于每摩尔SC)的SC来增加。这可在生产型宿主的选择水平下操作(这样的筛选用于细胞系、微生物克隆或转基因有机体)，其还可在个体供体被选择来为这些样品的随后合并提供包含具有高摩尔非核心岩藻糖基化的SC的分泌物的水平下操作。岩藻糖基化可通过本发明的SC制剂或固有免疫复合物的酶或化学岩藻糖基化引入或增加。

优选根据本发明使用的SC上的路易斯x表位的相对含量为至少0.01mol/mol SC，优选至少0.02mol/mol SC，更优选至少0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09或0.1mol/mol SC，更优选至少0.2、0.3、0.4或0.5mol/molSC，甚至更优选至少1mol/mol SC，或甚至更高，例如至少2mol/mol SC、3mol/mol SC、4mol/mol SC、5mol/mol SC、6mol/mol SC、7mol/mol SC、8mol/mol SC、9mol/mol SC，或至少10mol/mol SC。

具体优选的分离的重组SC，例如在重组SC制剂中，具有路易斯型N糖基化模式和相对于每摩尔分泌成分的至少2mol非核心岩藻糖。

具体地，其包括相对于每摩尔SC的至少2mol路易斯x表位，在某些情况中为至少6mol/mol。

具体地，其包括唾液酸，优选相对于每摩尔分泌成分的至少2mol唾液酸。具体地，其包括相对于每摩尔分泌成分的至少2mol唾液酸化路易斯x。

可选地，重组SC具体为非唾液酸化的，优选包括相对于每摩尔分泌成分小于0.1mol唾液酸。

根据具体方面，提供一种免疫复合物制剂，所述免疫复合物制剂包括本发明的重组分泌成分，和IgA或IgM免疫球蛋白的至少之一，优选人免疫球蛋白。具体地，所述免疫球蛋白为血浆免疫球蛋白，例如，源自人血浆或血浆级分。

根据本发明，进一步提供一种免疫复合物制剂，其以分泌性免疫球蛋白为基础，源自除人分泌物以外的其它来源，所述免疫复合物制剂包括

-分泌成分，其具有非核心岩藻糖基化模式或路易斯型N糖基化模式和相对于每摩尔分泌成分至少0.01mol路易斯表位，和

-具有天然糖基化模式的IgA或IgM免疫球蛋白的至少之一。

根据本发明的制剂具体包括多聚免疫球蛋白，例如，二聚或五聚或其它多聚免疫球蛋白，例如二聚SIgA或五聚SIgM。优选地，免疫球蛋白由动物乳，初乳，乳或初乳级分或浓缩物中任一种，以及血浆或其级分获得。

具体地，根据本发明的制剂包括多反应性免疫球蛋白，优选包括种系抗体的天然免疫球蛋白。

根据具体实施方案，进一步提供一种制剂品(formulation)，所述制剂品以液剂、乳剂或悬浮剂的形式或以优选喷雾干燥或冷冻干燥的干燥形式，包括本发明的分离或纯化(重组)的分泌成分或本发明的免疫复合物制剂。

根据本发明的制剂品具体可以用以下形式提供：天然制剂品如其中免疫复合物以天然背景提供的乳制品(dairy product)，例如乳，或奶制品(milkproduct)如奶酪、酸奶、乳清、乳清浓缩物，或者以包括分离的或纯化的SC或免疫复合物的合成制剂品。具体地，根据本发明的制剂品可以液剂、糖浆剂(syrup)、锭剂、片剂的形式提供，例如泡腾片剂、喷雾剂、吸入器制剂品(inhalator formulation)、粉剂、速溶粉、颗粒剂、栓剂、胶囊剂、霜剂、糊剂、凝胶剂、滴剂、悬浮剂、乳剂或包括乳制品和口香糖等的食品。

优选该制剂品为用于粘膜使用的制剂品、特别是用于口服用途的制剂品。

根据另外的具体实施方案，本发明提供本发明的分离或纯化(重组)的分泌成分或本发明的免疫复合物制剂或本发明的制剂品，其用于治疗或预防免疫球蛋白缺陷如选择性IgA缺陷、选择性IgM缺陷或CVID，特别是粘膜免疫球蛋白缺陷，优选以用于粘膜应用(mucosal application)的制剂品，并优选口、支气管、鼻、阴道、胃内或直肠使用。

因此，本发明进一步提供各治疗或预防粘膜免疫球蛋白缺陷的方法，通过向需要其的受试者投与有效量的本发明的化合物(compound)或组合物。

受试者-特别是人受试者-可能需要治疗瞬时、后天和慢性的免疫缺陷，例如处于粘膜免疫球蛋白缺陷的风险或遭受粘膜免疫球蛋白缺陷，因而符合此类治疗的条件，从而例如标准化和/或提升例如如在粘膜样品中确定的或在血液中间接确定的SIgA和/或SIgM在粘膜中的水平。

具体治疗适应症为，例如，诸如鼻-咽道、泌尿生殖道、眼和胃道等的传染病，例如在近端小肠的细菌过度生长、复发性尿路感染或慢性支气管肺的感染。

优选用途为预防由包括微生物的物质或有机体、抗原或致病剂(diseasecausing agents)如毒素等的病原体引起的疾病或紊乱。

具体地，治疗处于感染、过敏风险或遭受感染、过敏的受试者，例如处于过敏症状和自身免疫病的风险或遭受过敏症状和自身免疫病的受试者。具体地，受试者遭受IgA和/或IgM缺陷，包括选择性IgA和/或IgM缺陷、SIgA缺陷和/或SIgM缺陷，具体为组合的分泌性IgA/IgM缺陷。

根据进一步具体的方面，受试者用口服制剂治疗，例如提供一次剂量的10mg至10g SIgA和/或SIgM，例如其中SIgA或SIgM的含量为每投与单位10mg至10g的制剂，例如作为主要的免疫球蛋白，或者SIgA和SIgM的组合总量为10mg至10g。

根据本发明的制剂品可特别提供为用于食品用途和/或用于治疗用途。具体地，该制剂品可提供为膳食增补剂(dietary supplement)、营养管理食物(nutritional management food)、食物添加剂或医药食物。

附图说明

图1示出人分泌成分的氨基酸序列。

图2示出人分泌成分的核酸序列，包括5'和3'端的克隆位点。

图3示出α1,2-岩藻糖基转移酶(FUT2)的氨基酸序列。

图4示出α1,2-岩藻糖基转移酶(FUT2)的基因，带有各克隆位点(下划线)。

图5示出岩藻糖基转移酶3的蛋白序列。

图6示出岩藻糖基转移酶3的基因，带有各克隆位点(下划线，斜体)。

图7示出β1,3-半乳糖基转移酶I的氨基酸序列。

图8示出β1,3-半乳糖基转移酶I的基因，带有各克隆位点(下划线，斜体)。

图9示出β1,3-半乳糖基转移酶V的氨基酸序列。

图10示出β1,3-半乳糖基转移酶V的基因，带有各克隆位点(下划线，斜体)。

图11示出β1,3-半乳糖基转移酶I的氨基酸序列。

图12示出β1,3-半乳糖基转移酶II的基因，带有各克隆位点(下划线，斜体)。

图13示出嵌合抗-硝基苯基IgA重链的蛋白序列(小写字母＝前导肽，下划线＝鼠类VH)。

图14示出嵌合抗-硝基苯基IgA重链构建体的DNA序列，包括HindIII和XbaI限制性位点(下划线)。

图15示出用于检测非核心岩藻糖基化(路易斯-糖基化)分泌性免疫球蛋白的快速测定流程。

图16示出，在用分泌性免疫球蛋白的制剂温育时艰难梭菌毒素A的细胞毒性的减少。以与毒素等摩尔的量试验两种SIgA制剂，其中每种山羊个体具有不同的非核心岩藻糖基化。作为阳性对照，使用等摩尔量和高10倍的量的人SIgA。作为阴性对照，使用牛血清白蛋白(BSA)。

图17示出由动物个体的乳获得的SIgA制剂的筛选结果。在ELISA分析中，SIgA的非核心岩藻糖基化通过结合至凝集素DC-SIGN的路易斯-特异性糖基化来确定。作为阳性对照，使用来自人乳的SIgA。作为阴性对照，使用来自商用羊乳的SIgA(合并的，不从动物个体筛选乳)。

具体实施方式

本文使用的关于分泌成分(SC)或免疫复合物制剂的术语“人样”或“人源化”应指人SC，例如重组人SC，或源自其它物种，但不源自人分泌物，例如人乳。具体工程化或选择人源化SC以获得具有包括非核心岩藻糖或路易斯表位的N-糖基化模式的SC制剂。具体地，“人样”或“人源化”SC或免疫复合物优选包括人样或人源化SC，该人样或人源化SC或者由哺乳动物乳腺的非人分泌物获得并选择具有路易斯表位的高度糖基化，该人样或人源化SC或者基于具有包括期望的路易斯表位的岩藻糖基化模式的人来源的序列或人源化序列作为重组SC而获得。人源化SC具体包括末梢、触角或外臂岩藻糖基化(统称为术语“非核心岩藻糖基化”)，其证实赋予抗病原体作用和特异性受体结合性质(例如，结合至树突细胞上的DC-SIGN)。

如本文所述的“人源化”SC或免疫复合物不同于由转基因动物获得的“人源化”乳，本质在于其具有SC上选定的高水平路易斯表位，并且还在其它糖蛋白如免疫球蛋白上具有天然N-糖基化模式，从而避免过剩的岩藻糖基化，具体地为过量的末梢岩藻糖基化。因此，免疫复合物中的免疫球蛋白具有天然糖基化模式，例如仅具有核心糖基化N聚糖的天然N-糖基化模式。

本文使用的关于免疫球蛋白、特别是IgA和/或IgM的糖基化模式的术语“天然”应意指由哺乳动物的B细胞产生的糖基化，其具体特征在于无非核心岩藻糖基化，且具体无路易斯表位的糖基化。路易斯表位典型地不由天然或未修饰的哺乳动物B细胞产生。

本文使用的术语“非核心岩藻糖基化”或“路易斯表位”应指特别是在非核心位置具有岩藻糖基化的聚糖触角(glycan antennae)，包括末梢、触角或外臂岩藻糖基化。其具体指可被特定免疫球蛋白或抗体识别的路易斯抗原或H型抗原的表位。路易斯表位可以路易斯血型抗原存在，包括路易斯x(LeX)、路易斯y(LeY)、路易斯b(LeB)和路易斯a(LeA)抗原。术语“路易斯表位”还应指H型I和H型II抗原，以及血抗原A和B。路易斯抗原可进一步例如被唾液酸修饰，从而形成例如唾液酸化的路易斯表位。路易斯抗原可为唾液酸化的和/或硫酸化的。优选的路易斯表位起源于LeX和唾液酸化的LeX抗原。

提及关于如本文制备的SC的特定"非核心岩藻糖基化”应指SC糖蛋白制剂，例如分离的重组SC，或从合并来源分离，如乳或乳级分。因此，其应用于包括单个SC分子的制剂，各自具有特定的糖基化模式，例如具有与之附着的一个以上的外触角(或非核心)岩藻糖残基。SC糖基化因而由本文所述的制剂所测定。

出于说明和非限制目的，重组SC可在本文所述的基因工程化(修饰)的CHO细胞中表达，并且大多数SC分子个体可在SC的特定N-糖基化位点上具有非核心岩藻糖残基。此类"非核心岩藻糖基化"可以多种方式表征。在各情况中提及的是，与在缺乏根据本发明的修饰的细胞系中制备的SC糖蛋白分子种群相比，具有非核心岩藻糖残基的SC糖蛋白分子种群的数量相对高(或增加)。

分泌成分的特定非核心岩藻糖基化还可通过酶和/或化学添加岩藻糖至在添加前显示低或非核心藻糖基化的位点来产生。

另一种表征根据本发明的SC糖蛋白制剂的方式为通过所产生的分离的分泌成分中非核心岩藻糖基化与总糖基化之比。根据本发明的重组分泌成分具有约1:1至1:5、1:5至1:10、1:10至1:30、1:30至1:100的非核心岩藻糖基化N糖基化:总N-糖基化之比。

另一种表征分离的重组分泌成分的方式为由非核心岩藻糖残基(岩藻糖基化血型结构)形成的表位与SC糖蛋白的聚糖成分的相对量。

如本文使用的关于IgA和IgM的术语“天然糖基化模式”应指在IgA或IgM的重链中发现的N-糖基化模式，该模式实质上不含有路易斯表位，但仅含有核心岩藻糖基化(若有的话)。虽然糖蛋白的天然糖基化模式在物种之间不同，但在物种内的种群(population)内存在糖基化性质的典型范围，例如糖类位点的理论值和位置。动物如牛、山羊和绵羊的分泌性免疫球蛋白一般在物种内在理论糖基化位点方面具有类似的糖基化模式。

还发现糖基化模式中的实际糖基化位点的百分比在0至100％的范围内，主要取决于如种属(race)、年龄、家族、进食、泌乳期、健康状况、生理状况和乳加工等参数。

本文使用的关于根据本发明的SC的术语“非核心岩藻糖基化模式”或“路易斯型N-糖基化模式”应指包括N-连接的岩藻糖和在非核心位置如末梢、触角或外臂位置的路易斯表位的糖基化模式。糖基化期间，形成N-连接或O-连接糖蛋白。N-连接糖蛋白构成主要的细胞表面蛋白和分泌蛋白。路易斯血型结构通过触角聚糖的特定岩藻糖基化而形成。例如，路易斯x和路易斯a结构分别为(Gal-β1-4)(Fuc-α1-3)GlcNac和(Gal-β1-3)(Fuc-α1-4)GlcNac。这些结构可进一步被唾液酸化(NeuAca2,3-)，从而形成相应的唾液酸化结构。感兴趣的其它路易斯血型结构为路易斯y和路易斯b结构，分别为(Fuc-α1-2)Gal-β1-4(Fuc-α1-3)GlcNAc和(Fuc-α1-2)Gal-β-1-3(Fuc-α1-4)GIcNAc。另外，路易斯表位来自H型I和H型II抗原(分别为(Fuc-α1-2)Gal-β1-3GlcNac和(Fuc-α1-2)Gal-β1-4GlcNac)，以及血抗原A和B(分别为(GalNAc-α1-3)Fuc-α1-2Galβ1-3GlcNAc和(Gal-α1-3)Fuc-α1-2Galβ1-3GlcNAc)。对于ABO和路易斯血型结构以及它们合成中涉及的酶的结构描述，参见Ma等人，2006,Glycobiology vol.16,no.12pp 158R-184R。

SC的示例性非核心岩藻糖基化或路易斯型N-糖基化模式如下所述：

N-聚糖(N-连接寡糖、N-(Asn)-连接寡糖)为共价键和至多肽链的天冬酰胺残基的糖链，一般涉及N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基和一致的肽序列：Asn-X-Ser/Thr。N-聚糖享有共同的戊糖核心区并且通常可分成三个主要类别：甘露寡糖(或高-甘露糖)型、复合型和杂合型。

在脊椎动物N-聚糖中，主要的核心修饰为在与邻近核心中的天冬氨酸的N-乙酰葡糖胺连接的α1-6键中添加岩藻糖(＝核心岩藻糖基化)。

大多数复合和杂合N-聚糖具有通过添加β-连接的半乳糖残基至起始N-乙酰葡糖胺从而产生遍在的结构单元(building block)Galβ1-4GlcNAc而延长的分支，称作2N-乙酰乳糖胺型或“LacNAc”序列。触角可进一步通过顺序添加例如N-乙酰葡糖胺和半乳糖残基来延长。

最重要的“加帽”或“缀饰”基序涉及在支链上的唾液酸、岩藻糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺和硫酸盐。所有这些岩藻糖-残基在本文中称作非核心岩藻糖-残基：

路易斯血型和相关抗原为承载α1-2、α1-3、α1-4岩藻糖残基或其组合的一组聚糖。1型和2型血型抗原上的A、B和H决定簇-血型决定簇显示α1-2连接的岩藻糖。

下列具体结构被认为是SC上的“非核心岩藻糖基化”：承载α1-2、α1-3、α1-4岩藻糖残基或其组合的聚糖，路易斯a，路易斯b，路易斯x，路易斯y，1型和2型血型抗原上的A、B和H决定簇-血型决定簇，及其唾液酸化和/或硫酸化形式。

糖蛋白的路易斯表位的最大或理论数可等于或超过其糖基化位点数，由于每N-糖基化位点可存在多个路易斯表位，例如通过结构的支化、延长和重复。例如，人SC具有7个糖基化位点，因而，超过7个路易斯表位是可能的。由于路易斯表位可包括一个或多个非核心岩藻糖，所以糖蛋白中非核心岩藻糖数可超过路易斯表位数。

在具体优选的情况中，非核心岩藻糖数或路易斯表位数为N-糖基化位点的理论量的至少1.1倍、优选至少1.2倍、或至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、或至少2倍，在具体情况中，该量甚至更高，例如为N-糖基化位点的理论量的至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍或至少9倍，例如多至10倍。

路易斯型N-糖基化可被赋予相应的岩藻糖基转移酶，用于在合成通路中将岩藻糖单元(fucose unit)从鸟苷-5'-二磷酸岩藻糖中转移至糖受体的特定羟基。异源性岩藻糖基转移酶可由重组有机体表达，从而表达岩藻糖基化的糖蛋白。

本文使用的术语“免疫复合物”应指包括通过非共价键或共价键键合至分泌成分的至少一个免疫球蛋白分子的蛋白复合物。非共价缔合(associations)包括例如静电或疏水相互作用。在根据本发明的免疫复合物中，提供可共价键合至另外的免疫球蛋白的至少一种IgA和/或至少一种IgM分子，从而形成多聚免疫球蛋白。事实上，此类多聚发生在多聚抗体的整个J链，或者通过其它非共价相互作用发生。

术语“工业规模”应指来自天然原料或重组表达体系、包括细胞培养物的免疫复合物的大规模生产。如本文所述的工业规模表达体系优选具有经证明的每升至少10mg免疫复合物的生产力，优选100mg每升，优选体积为至少100升，更优选至少1000升，例如通过合并来源。

关于免疫复合物的术语“固有”应指调节或刺激固有免疫应答或在包括哺乳动物的动物中，在其中的人受试者或患者中起作用的免疫复合物。虽然根据本发明的固有免疫复合物可以相对非特异性的方式支持对病原体的免疫防御，但其也可特异性识别特定的或溶解的抗原物质的表位。

本文使用的关于蛋白质如根据本发明的SC或免疫复合物的术语"分离的”或“纯化的”是指由动物体液或分泌物的，由此天然来源的或细胞培养物的，如细胞培养上清液或者组织或细胞提取物的复杂混合物(complex mixture)获得的蛋白质。这些蛋白质典型地为至少50％纯，优选至少60％纯，更优选至少70％纯，甚至更优选至少80％纯，最优选至少90％纯，甚至最优选至少95％纯，纯度通过SDS-PAGE测定。

本文使用的术语“分泌成分”或“SC”应指可由包括人的动物乳腺分泌的分泌成分，或其变体，包括功能性变体，所述SC为例如从免疫球蛋白分离的糖蛋白，或者如通过J链(或其变体)介导与免疫球蛋白复合例如形成分泌型免疫复合物(secretory immune complex)，或者特异性结合至聚免疫球蛋白受体(pIgR)的免疫球蛋白的其它结构。SC可由天然原料如初乳或乳获得，不然可合成或通过重组表达技术生产。

本文使用的SC如本文所述是特异性非核心岩藻糖基化的。另外，糖基化模式可以包括或者可以不包括唾液酸化表位。

具体地，SC作为唾液酸化的或无唾液酸化(asialylated)的蛋白制剂而提供。优选根据本发明提供的唾液酸化的和无唾液酸化(asialyl)-聚糖之间的比例为在高度唾液酸化的制剂中优选至少3:1、优选至少4:1、或至少5:1、或至少6:1，或至少7:1。包括非唾液酸化(无唾液酸化)蛋白质的低唾液酸化的制剂(本文还理解为无唾液酸化制剂)中，该比例小于1:3，优选小于1:4，或小于1:5，或小于1:6，或小于1:7。优选地，以此类制剂提供的SC包含仅无唾液酸化聚糖或唾液酸化聚糖。

优选重组SC上唾液酸化-路易斯x表位的相对含量为至少0.02mol/molSC，更优选至少0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09或0.1mol/mol SC，更优选至少0.2、0.3、0.4或0.5mol/mol SC，甚至更优选至少1mol/mol SC，或甚至更高，例如至少2mol/mol SC、3mol/mol SC、4mol/mol SC、5mol/mol SC、6mol/mol SC、7mol/mol SC、8mol/mol SC、9mol/mol SC，或至少10mol/molSC。具体优选的SC制剂包括相对于每摩尔SC的至少2mol唾液酸化-路易斯x表位，在某些情况下为至少6mol/mol。

本发明的SC和免疫复合物具有更加均一的糖基化的优势，可改善粘膜作用，例如均一的糖基化是由于较少的不同糖型，而无论是否具有高度非核心岩藻糖基化，例如小于20个不同的SC糖型，或小于10个不同SC糖型，或甚至小于5个不同SC糖型。

虽然分泌性免疫球蛋白的主要功能似乎为促进抗原和病原体的排除，但有迹象表明，分泌的抗体的级分实际上“逆行”运输回粘膜。

有迹象表明，SIgA在与树突细胞(DC)的细胞表面上的DC-SIGN缔合后被内吞。基于这些结果，提出了DC-SIGN可能充当在识别和内化SIgA和可能的SIgA-抗原复合物中涉及的粘膜DC的受体。

众所周知的是，分泌性免疫球蛋白与DC-SIGN的结合由分泌成分的聚糖介导。DC-SIGN识别一系列寡糖配体，包括甘露糖、含复合高甘露糖的复合糖和无唾液酸化的路易斯血型抗原。

为了增强免疫复合物与树突细胞经DC-SIGN的结合，有利的是使用低唾液酸化级别而不是高非核心岩藻糖基化的SC用于分泌性免疫球蛋白制剂。此类最低限度的唾液酸化或甚至无唾液酸化的SC可用于生产与有机体应免疫耐受(tolerized)的抗原(例如，膳食抗原、过敏原)结合的单克隆或多克隆多聚免疫球蛋白制剂。

另一方面，可有利地提供不经DC-SIGN结合至树突细胞的分泌性免疫球蛋白制剂，或者在结合DC-SIGN上具有较低效力。这可通过利用高唾液酸化的非核心岩藻糖基化SC用于制备本发明的固有免疫复合物的制剂来完成。此类制剂可用于增强分泌性免疫球蛋白对某些病毒、毒素和其它病原体结构的诱饵效应。

唾液酸化路易斯x为在粒细胞和单核细胞上组成型表达(constitutivelyexpressed)的决定簇并介导这些细胞的炎性外渗。

本发明免疫复合物上唾液酸化路易斯x的有无可通过干涉或避免妨碍炎性状况来增加利用本发明免疫复合物的治疗效力或降低副作用。

制剂中的唾液酸化程度可通过分别选择SC的高或低摩尔唾液酸化(相对于每摩尔SC)来增加或降低。这可在生产型宿主(例如细胞系、微生物克隆或有机体)的选择水平下进行，其可在个体供体的水平上进行，选择所述个体供体来为这些样品的随后合并提供包含各自具有高或低摩尔唾液酸化的SC的分泌物。唾液酸化可通过本发明的SC制剂或固有免疫复合物的酶或化学唾液酸化以及去唾液酸化(desialylation)分别来增加或降低。

对于糖蛋白样品的唾液酸的绝对定量(摩尔唾液酸/摩尔糖蛋白)，可应用基于质谱的糖分析(glycoanalysis)步骤。可选地，可使用如欧洲药典(EuropeanPharmacopoeia)对于红细胞生成素的专著1316中所述的比色法。该方法基于Svennerholm,1957,Biochim Biophys Acta.Vol 24,pp 604-11。

因此，限定量的SC的纯制剂用间苯二酚和盐酸在100℃下处理，将形成的蓝色复合物用丁醇/乙酸丁酯分离，接着在580nm下光度测量。光度读数通过用唾液酸生成的校准曲线转化成质量。

本文使用的术语“分泌性免疫球蛋白”应指可由包括人的动物乳腺分泌的免疫球蛋白，例如通过pIgR或其变体(包括功能性变体)介导。分泌性免疫球蛋白可由天然原料如初乳或乳获得，特别是作为SIgA和/或SIgM，不然可合成生产，或通过重组表达技术生产，或通过来自天然原料如血浆的多聚免疫球蛋白与重组SC的组合来生产，或通过重组表达技术生产的多聚免疫球蛋白与来自天然原料如乳或其它体液的SC的组合来生产。

本文使用的术语“重组”是指通过基因工程或基因重组技术采用重组表达体系如宿主有机体(例如原核生物或真核生物)在控制的反应器体系(contained reactor system)如微生物发酵或细胞培养中生产的蛋白质(包括多肽)，例如采用如酵母、真菌、细菌或古菌等的生产型宿主细胞系或菌株，来自哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或相应组织等的细胞系。

本文使用的术语“表达体系”或“生产体系”应指能够产生期望品质和数量的蛋白质和免疫复合物的有机体如细胞培养物或较高等的真核生物有机体如选定的泌乳动物，然而不包括人。优选的体系采用用于真核宿主的表达载体。

本文使用的"表达载体"或“载体”定义为在适当的宿主有机体中克隆重组核苷酸序列即重组基因的转录及其mRNA的翻译所必须的DNA序列。此类表达载体可包括宿主细胞中自主复制用原点、选择性标记物(如必需氨基酸合成基因或赋予对抗生素如博来霉素(zeocin)、卡那霉素、G418或潮霉素的抗性的基因)、若干限制性酶切位点、适当的启动子序列和翻译终止子，这些组件可操作地连接在一起。

术语“真核宿主”应指可培养表达蛋白质的任何真核细胞、组织或有机体。具体地，真核宿主为真核宿主细胞系。很好理解的是，该术语不包括人类。表达根据本发明的SC的优选宿主为真核宿主。

术语“宿主细胞”或“宿主细胞系”是指用于表达重组基因来生产根据本发明使用的重组蛋白的微生物或细胞系。优选的宿主细胞选自由哺乳动物、鸟类、昆虫或植物细胞、酵母、丝状真菌或细菌组成的组。为了生产本发明的分泌成分，优选使用能够生产具有非核心岩藻糖基化或路易斯型N-糖基化的糖蛋白的宿主细胞。已增殖的培养的宿主细胞宿主细胞克隆通常理解为宿主细胞系。生产型宿主细胞系通常理解为生物反应器中培养即用型细胞系，从而获得工业规模的产物。

本文使用的术语“多聚免疫球蛋白”应指至少2、3、4、5或甚至多至10的更高数量的免疫球蛋白分子的缔合。多聚免疫球蛋白由此被认为是至少二聚免疫球蛋白，例如二聚IgA、三聚、四聚(quatromeric)、五聚(pentameric)，例如SIgM，六聚免疫球蛋白，或甚至更高的聚合物或聚集体。多聚免疫球蛋白可包括通过共价键或其它相互作用如具有或没有J链的静电、疏水、离子相互作用或亲和结合等彼此相连的免疫球蛋白分子。

本文使用的术语“多反应性免疫球蛋白”应指具有至少两个特异性的免疫球蛋白，意指其识别至少两个不同的表位，也称为交叉反应性。典型地，固有免疫系统的多反应性免疫球蛋白将具有至少3、4、5以上相关(例如关于生理相关或药理活性)特异性来结合表位和抗原，最常见的具有低等或中等亲和力。

术语“食物(food)”或“食品(food product)”应包括适用于或意欲被动物摄取的任何化合物、制剂、混合物或组合物。这包括为营养、保健或食物增补剂(food supplement)的任何化合物，可被理解为食品的营养或功能增补剂的营养食物(dietary food)或增补剂或医药食物，可用作膳食(diet)。典型地，功能性食物帮助防止、或预防和/或治疗与包括毒素的病原体相关的病况，或治疗身体的生理不平衡。术语还应包括饲料或饲料类产品，可用作饲养非人动物的膳食。食物可为有机或合成来源，在包括乳制品的天然或天然样组合物或者基于物质的人工混合物(已在混合物前适当纯化)的合成组合物中配制。根据本发明的食品典型地以食品级品质提供。品质级为动物可接受的食物的品质特性。这包括外部因素如外观(大小、形状、颜色、光泽度和一致性)、质地和风味。品质标准还提供可接受的最大量的污染物。除了成分品质以外，还存在对灭活或消除病原体的卫生要求。重要的是确保食物加工环境尽可能清洁，从而为消费者生产最安全可能的食物。

本文使用的蛋白质如分泌成分或免疫球蛋白的术语“变体”或“功能活性变体”意指由亲本序列通过在序列内或在序列的一个或两个末端插入、缺失或取代一个或多个氨基酸或核苷酸而修饰所获得的序列，所述修饰不影响(特别是损害)该序列的活性。在优选的实施方案中，变体为功能性活性变体，其a)为氨基酸或核苷酸序列的生物学活性片段，该功能性活性片段包括至少50％的氨基酸或核苷酸序列的序列，优选至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，仍更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选至少97％、98％或99％；b)源自氨基酸或核苷酸序列，其中至少一个氨基酸取代、添加和/或缺失，其中功能性活性变体具有与氨基酸或核苷酸序列同一或者与a)中限定的功能性活性片段同一的序列，该同一至少50％，优选至少60％，优选至少70％，优选至少80％，仍更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选至少97％、98％或99％；和/或c)由氨基酸或核苷酸序列以及与该氨基酸或核苷酸序列异源的额外的至少一个氨基酸或核苷酸组成，优选其中功能性活性变体源自在各种基因和蛋白质数据库中发现的任何序列的任何自然发生的变体或与之同一。此类功能性活性变体具体优选包括优选的本文所述的糖基化模式，具体为SC的路易斯型N-糖基化模式和非核心岩藻糖基化。进一步优选的功能性活性变体的特征在于，它们能够结合多聚免疫球蛋白如IgA二聚体或IgM五聚体形成分泌型免疫复合物的能力。

大多数SC序列描述为完整的聚免疫球蛋白受体(pIgR)，出于本发明的目的，仅这些序列的胞外部分是相关的，例如：人SC的序列提供为SEQ ID 1，或包括在下述中或实质上与下述同一的序列：

UniProtKB：基因座PIGR_BOVIN，登录号P81265(牛pIgR)

UniProtKB：基因座PIGR_HUMAN，登录号P01833(人pIgR)

UniProtKB：基因座PIGR_RAT，登录号P15083(大鼠pIgR)

UniProtKB：基因座PIGR_MOUSE，登录号O70570(小鼠pIgR)

UniProtKB：基因座PIGR_RABIT，登录号P01832(兔pIgR)

NCBI REFSEQ：登录号NM_174143.1(牛pIgR)

embl登录号X81371.1(牛pIgR)

GenBank GenBank:DAA21480.1(牛pIgR)

GenBank:AAI49033.1(牛pIgR)

NCBI REFSEQ:登录号XM_537133.2(牛pIgR)

NCBI参考序列NP_002635.2(人pIgR)

NCBI参考序列NP_035212.2(小鼠pIgR)

NCBI参考序列NP_036855.1(大鼠pIgR)

GenBank:AAK69593.1(小袋鼠pIgR)

NCBI参考序列NP_001125098.1(猩猩pIgR)

GenBank:EAW93516.1(人pIgR)

GenBank:EAW93515.1(人pIgR)

NCBI参考序列NP_999324.1(猪pIgR)

GenBank:BAJ20784.1(人pIgR)

NCBI参考序列XP_001083307.2(猕猴(macacca)pIgR)

NCBI参考序列XP_002760783.1(狨(Callithrix)pIgR)

GenBank:AAD41688.1(负鼠pIgR)

GenBank:EDM09843.1(大鼠pIgR)

GenBank:AAI10495.1(人pIgR)

GenBank:AAI10496.1(人pIgR)

NCBI参考序列XP_514153.2(黑猩猩pIgR)

GenBank:AAC53585.1(小鼠pIgR)

GenBank:AAQ14493.1(鸡pIgR)

NCBI参考序列NP_001038109.1(鸡pIgR)

GenBank:AAP69598.1(鸡pIgR)

GenBank:AAW71994.1(鸡pIgR)

GenBank:AAH13556.1(小鼠pIgR)

GenBank:EDL39729.1(小鼠pIgR)

GenBank:CAA76272.1(小鼠pIgR)

GenBank:BAA24431.1(小鼠pIgR)

NCBI参考序列NP_001164516.1(兔pIgR)

NCBI参考序列XP_001492348.2(马pIgR)

GenBank:AAC41620.1(牛pIgR)

GenBank:AAB23176.1(人pIgR)

GenBank:AAB20203.1(人pIgR)

GenBank:ABK62772.1(爪蟾(xenopus)pIgR)

关于本文鉴定的多肽序列的"氨基酸序列同一性的百分比(％)"定义为候选序列中的氨基酸残基与特定多肽序列中的氨基酸残基的同一性的百分比，在比对序列并根据需要引入空隙以实现最大序列同一性百分比，且不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分之后得到。本领域技术人员可决定用于测量比对的适当参数，包括实现覆盖要比较的序列全长的最大比对所需的任何算法。

功能性活性变体可通过氨基酸或核苷酸序列中的序列改变来获得，其中当用于本发明的组合时，序列改变保持未改变的氨基酸或核苷酸序列的功能。此类序列改变可包括，但不限于，(保守)置换、添加、删除、突变和插入。

功能性活性SC变体可通过交换来自不同物种的SC之间的结构域来获得，或者通过删除或添加结构域来获得。改变结构域的天然顺序(如，1-2-3-4-5，哺乳动物SC)也可导致功能性活性变体(如1-4-3-2-5)。

在本发明的特定实施方案中，如上所述的多肽或核苷酸序列可通过各种化学技术修饰，从而产生具有实质上相同活性的衍生物(如上所述的片段和变体)作为修饰的多肽或核苷酸序列，且任选地具有其它期望的性质，如反应性、N-糖基化位点和稳定性(体内或体外稳定性)。期望的性质为例如热稳定性和/或胃肠稳定性增加，通过蛋白质的pH稳定性和/或蛋白酶(如胰腺的)稳定性来测量。免疫球蛋白的糖基化模式可影响多个方面的SC治疗效果，例如稳定性、对蛋白水解攻击和热失活的抗性、免疫原性、半衰期、生物活性和稳定性，或结合多聚免疫球蛋白的能力。

本发明SC的变体可具有改变的氨基酸序列，从而引入额外的糖基化位点。本发明的优选实施方案为添加N-糖基化位点。这可通过基因工程技术以及化学和酶手段来实现。将序列基序(Sequence motif)Asn-Xaa-Thr-Xaa(Seq.ID No.15)或Asn-Xaa-Ser-Xaa(Seq.ID.No.16)(其中Xaa为除脯氨酸以外的任意氨基酸)引入SC的各种位点中可使得选择功能性活性变体具有改进的特性(如稳定性、结合至病原体结构、结合至pIg)。可使得人源SC具有超过7个糖基化位点。

多肽或核苷酸序列的变体在本发明的背景下是功能活性的，如果本发明组合物包括变体(但不是原始的)在内的活性总计达到包括无序列改变的氨基酸或核苷酸序列(即原始多肽或核苷酸序列)的根据本发明使用的免疫球蛋白或SC活性的至少50％、优选至少60％、更优选至少70％、仍更优选至少80％、尤其至少90％、特别至少95％、最优选至少99％。

功能性活性变体可通过如上所述改变序列而获得，并且其特征在于具有与由来自该变体所来源的相应序列显示出的类似的或与人SC类似的生物学活性，包括修饰对病原体的免疫应答、结合至病原体结构和其它分子的能力。

但是，术语"功能性活性变体"包括自然发生的等位基因变体，以及突变体或其它任何非自然发生变体。如本领域已知的，等位基因变体为(多)肽的候补形式，其特征为具有置换、删除或添加实质上不改变多肽的生物学功能的一个或多个氨基酸。

在优选的实施方案中，源自如上所述的氨基酸或核苷酸序列的通过氨基酸交换、删除或插入产生的功能性活性变体还可保留或更优选改进活性。

保守置换为在氨基酸家族内发生的那些，涉及它们的侧链和化学性质。此类家族的实例为具有碱性侧链、具有酸性侧链、具有非极性脂族侧链、具有非极性芳族侧链、具有未带电的极性侧链、具有小侧链、具有大侧链等的氨基酸。

术语“粘膜免疫球蛋白缺陷”应指存在于粘膜样品中的免疫球蛋白的浓度在正常或参考范围之下。这具体指SIgA或者SIgM、或者SIgA和SIgM二者的组合的含量。

术语“分泌性IgA缺陷”或“SIgA缺陷”为分泌性IgA中的缺陷。术语“分泌性IgM缺陷”或“SIgM缺陷”为分泌性IgM中的缺陷。

这些分泌性免疫球蛋白缺陷可由遗传倾向、化学引起，或由粘膜相关淋巴组织(mucosa-associated lymphoid tissue，MALT)中SIg生产例如被应激、营养失调、损伤或手术局部干扰所引起。

MALT被理解为在人类(男性)中，例如

·GALT(肠相关淋巴组织。淋巴集结(Peyer's patches)为在小肠内衬(lining)中发现GALT的成分。)

·BALT(支气管相关淋巴组织)

·NALT(鼻相关淋巴组织)

·LALT(喉相关淋巴组织)

·SALT(皮肤相关淋巴组织)

·VALT(血管相关淋巴组织)

·EALT(由结膜[CALT]和泪管(Lacrimal Duct)[LDALT]相关的淋巴组织组成的眼相关淋巴组织)

SIgA缺陷可与SIgM缺陷相关。

分泌性IgA和/或分泌性IgM缺陷的检测通过借助标准免疫分析技术或借助分子生物学技术测量分泌物如唾液、宫颈粘液、鼻粘液、胃液、汗、尿或粪便中的SIgA和/或SIgM来进行。分泌物中的SIgA和/或SIgM的免疫检测可通过ELISA、RIA，通过基于荧光的免疫分析、时间分辨荧光分析法(time-resolved fluorometry)、沉淀试验、浊度法、基于表面等离子体共振的试验和类似的含有或不含有标记的体系进行。重要的要求是检测结合至免疫球蛋白分子的分泌成分，从而能够将SIgA和/或SIgM与IgA和/或IgM相区别。

SIg缺陷的分子生物学检测可通过分析J链和/或pIgR在各组织和细胞中的表达来进行，既可为与这些分子特异的抗体的蛋白水平，或可为与这些分子的基因特异的探针的基因水平。RNA和DNA均可研究。检测方法可基于具有或不具有模板扩增(例如PCR)或信号扩增的杂交来试验。

粘膜SIgA缺陷可为一般性分泌性IgA缺陷的强指示剂。粘膜SIgM缺陷可为一般性分泌性IgM缺陷的强指示剂。组合的粘膜SIgA/SIgM缺陷为组合的一般性分泌性IgA和IgM缺陷的强指示剂。

如果粘膜SIg的水平与参考值(其为正常值或相同类型的健康受试者的值)相比小于50％，具体小于40％、30％、20％或10％，则特别指示SIg缺陷。

不同个体中分泌性免疫球蛋白的水平存在相当大的变化。个体免疫状况的精密测量可首先建立在良好的健康和低度至中度生理活性期间数天至数周的时期内个体的常规SIgA和/或SIgM值的基线。基线还可随个体年龄变化。然而该方法对于患有慢性分泌免疫缺陷的个体不可行。因此，也可考虑正常种群的参考值。

对于人类，正常唾液SIgA水平为11-65mg/dL，正常唾液SIgM水平为1mg/dL。正常SIg值典型地在健康受试者样品中确定。降低的唾液免疫球蛋白可存在于患有复发性上呼吸道感染(选择性IgA和/或IgM缺陷)的儿童中，偶尔存在于食物过敏的个体中。

如果SIgA浓度小于100毫克SIgA每升或SIgA流速(flow rate)小于50毫克SIgA每分钟或SIgA与白蛋白之比小于4，则典型地指示如通过免疫测定确定的人唾液样品中的SIgA缺陷(如Dwyer等人，在Aviation,Space,andEnvironmental Medicine中提出的,2010,81卷,582页之后的内容(ff))。如果SIgA浓度小于10毫克每100g粪便，则典型地指示通过免疫测定确定的人粪便中的SIgA缺陷。

如果SIgA浓度低于50mg SIgA每毫升，则典型地指示如通过免疫测定确定的人眼泪中的SIgA缺陷。

如果鼻分泌物中SIgM浓度小于50mg每升和/或唾液中SIgM浓度小于1mg/dL，则典型地指示如通过免疫测定确定的人鼻分泌物或唾液中的SIgM缺陷。

需要在仅至少一个粘膜相关淋巴组织的区室中发现SIg的降低水平，从而定量SIg缺陷。

SIgA缺陷偶尔可在其中还确定SIgMa缺陷的样品中确定。因此，包括SIgA和SIgM二者的本发明的制剂优选用于处于SIgA和SIgM缺陷的风险的受试者。

关于免疫球蛋白缺陷的术语“粘膜”是指如在粘膜样品，例如从受试者的唾液、胃液、宫颈粘液、鼻粘液、肠道灌洗液(gut lavage)、胃液、支气管灌洗液、尿、泪和粪便中获取的样品中确定的免疫球蛋白的水平。

关于用于治疗受试者的制剂或相应的制剂品的投与或施涂或者其它粘膜用途的术语“粘膜”是指经粘膜途径的投与，包括全身或局部投与，其中活性成分通过与粘膜表面接触而获取。这包括口、鼻、阴道、直肠、和支气管投与，和制剂品如液剂、糖浆剂、锭剂、片剂，例如泡腾片剂、喷雾剂、吸入器制剂品、粉剂、速溶粉、颗粒剂、栓剂、胶囊剂、霜剂、糊剂、凝胶剂、滴剂、悬浮剂、乳剂、或包括乳制品和口香糖等的食品。

本文使用的术语“受试者”是指任何动物，其在本文中优选包括哺乳动物，特别是人，预期对其的诊断、筛选、监控或治疗。受试者可处于某种病况的风险，例如，患有病况的患者，或者对其来说病况有待决定或病况的风险有待决定。本文使用的术语“患者”总是包括健康受试者。在某些实施方案中，本文公开的方法可包括选择需要SIg增补治疗的受试者，例如具有证实的SIg缺陷的受试者，并根据本发明进一步治疗该受试者。

术语“处于……(某些病况如SIg缺陷或粘膜免疫球蛋白缺陷)的风险”，是指受试者例如通过某种倾向而潜在发展此类病况，或已经在包括先天或后天状态的各种阶段遭受此类病况，特别是与其它诱发病况或其它状况相关的暂时性疾病或并发症作为此类免疫球蛋白缺陷的结果。

风险确定和诊断粘膜Ig缺陷在还未诊断出Ig缺陷的受试者中特别重要。因而该风险确定包括能够预防性治疗的早期诊断。

具体地，本发明的制剂用于具有高风险的患者，例如无症状的粘膜Ig缺陷的高可能性(例如，4岁以下的儿童，手术前后不久，大量物理应激如高效运动或工作前后、或者具有病原体感染风险增加的旅行)。

根据本发明的风险评估和特别是粘膜Ig缺陷治疗特别指示口、喉、鼻和耳、眼和食道、胃和结肠道的传染病。

进一步优选的用途为由包括微生物物质或有机体等的病原体、抗原或致病剂如毒素引起的病况的预防。例如，住院患者可能需要增补他们的免疫系统来减少医源性感染(hospital-acquired infection)的风险。接受根据本发明的食物增补剂的初生人类或动物如果不能从母亲或各自的乳母获得足够的母乳也可具有较高的存活机会。此外，动物和人中肠致病性疾病的风险可通过根据本发明的食品减少。具体地，受试者遭受SIg缺陷时，病原体可减少剧毒作用，即致病剂的剂量激发时的病况，否则不会引起此类病况。根据本发明的制剂因而具体提供预防处于SIg缺陷的风险或遭受SIg缺陷的受试者中的此类巨毒作用。

因此，本发明是指生产如上所述的免疫复合物制剂的新方法，其具有很大的优势来足够通过工业规模生产的量提供稳定的高品质制剂。提供具有改进品质的新的重组SC和免疫复合物制剂。

从而，可提供固有免疫复合物，其具体用作食品，恢复和维持生理平衡或出于包括治疗和预防性用途在内的医疗目的的健康产品。

结果证明，非核心岩藻糖，具体为路易斯聚糖，还作为有机体的固有免疫的一部分而起到重要作用。详细研究说明了病原体结构如表面抗原、毒素或受体与宿主的聚糖结构之间的相互作用。

特别地，路易斯糖基化可与附着于宿主细胞的幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)相互作用。超过80％的幽门螺杆菌(H.pylori)菌株表达II型路易斯抗原(LeX和/或LeY)，其中一半表达两种抗原。较小比例的幽门螺杆菌菌株表达I型路易斯血型抗原(LeA和/或LeB)，极少数表达唾液酸化-LeX。

类似地，唾液酸化-LeX在与感染心内膜炎相关的某些口腔细菌如化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、伴放线菌放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)和侵蚀艾肯菌(Eikenella corrodens)的细胞表面上表达。

诺如病毒(Noroviruses)是例如急性肠胃炎的诱发剂(causative agents)。它们结合至宿主细胞上的组织-血型抗原(HBGAs)，即ABH抗原和路易斯抗原，其中1型和2型糖类核心结构构成抗原性不同的变体。人诺如病毒识别唾液酸化路易斯x拟糖蛋白(neoglycoprotein)。

艰难梭菌毒素A和肠致病性大肠杆菌的亲密素接合至SC的半乳糖基和/或唾液酸残基。已显示粘膜树突细胞上的DC-SIGN充当推定的SIgA受体，并且树突细胞能够因而与粘膜表面的免疫监督中的M细胞合作。

本发明说明了以下发现：SC的人样糖基化可发现于非人物种的选定的个体中，且此类人样SC优选用于与具有用于稳定人样SC并保护分泌性免疫球蛋白天然功能的天然糖基化模式的天然免疫球蛋白组合。结果证明，在相同物种内SC的糖基化模式广泛变化，因而，典型用于制备奶制品的大供体池不会在分离的SC上包含显著水平的具有路易斯-表位的N-糖基化。此类常见的大规模池不会用作出于本发明目的的原料。然而，在某些个体中，SC可具有人样的高水平路易斯表位。那些个体将具有资格制备可用作大规模制造根据本发明的免疫复合物的原料的大型生产池。可选地，相应的人样SC可通过重组生产方法来生产。由原料获得的SC接着与IgA或IgM结合，IgA或IgM具体包括具有天然糖基化模式的多聚免疫球蛋白分子，特别是包括被非核心岩藻糖基化的免疫球蛋白链的那些。多聚免疫球蛋白可源自天然原料如乳或血浆或者重组生产。可选地，包括SC和免疫球蛋白的本发明免疫复合物可从大型生产池直接分离纯化，例如选择该免疫复合物的内容物(content)为非核心岩藻糖或路易斯表位。因此，可制备包括稳定化的SC达到提供贮存稳定产物的程度的免疫复合物制剂，或具有提高的体内稳定性而导致粘膜和/或半衰期增加的免疫复合物制剂。

糖基化变化可在生产SC的细胞或有机体的不同生理状态如感染、炎症因子的存在、食物和营养供应、应激等下发生。混合物中糖基化变化的另一来源可为不同的遗传背景以及产生SC的个体有机体或细胞的组成(例如物种、种属、血型、pIgR基因型和单倍型等)。适合确定糖基化模式的分析方法例如由Deshpande等人描述(J.Proteome Res.2010,9,1063-1075)。

人乳包含路易斯表位，并且来自猪、马和其它物种的乳报道称包含具有路易斯-抗原的糖蛋白。哺乳动物α1,2-和α1,3/4-岩藻糖基转移酶包括在A、B和H路易斯血型抗原以及路易斯-血型-相关的糖类抗原(即，LeX、LeY、LeA、LeB、唾液酸化-LeX和唾液酸化-LeA)合成的最后的步骤中。但是，不能在工业规模上提供非核心岩藻糖基化的或路易斯糖基化的具有免疫球蛋白的SC或SC免疫复合物。

出乎意料地可鉴定个体表达体系，例如细胞克隆或动物、重组有机体或微生物，所述个体表达体系产生比SC糖型(游离或结合至免疫球蛋白)的不均匀混合物中的平均值明显更多的非核心路易斯-岩藻糖基化SC与核心-岩藻糖基化SC。个体克隆或动物之间的差异可意想不到的高。

出乎意料的发现是，非核心岩藻糖基化起到将重组SC结合至艰难梭菌毒素A的作用。这与Perrier等人(2006J Biol.Chem.vol.281(20),pp.14280-14287)得出岩藻糖残基不涉及在缔合中的结论形成对照。

另一出乎意料的发现是某些糖基化基序的水平可与SC中和某些病原体抗原的效价相关。

更出乎意料的发现是结合至受体DC-SIGN的水平在个体乳样品之间强烈变化，并且SC与DC-SIGN的结合受路易斯聚糖的影响，而无论复合的含高甘露糖的聚糖存在与否。

为了提供人样SC，非人乳可用作改进的SC的来源。分析从个体动物的乳样品中分离的SC或免疫复合物的非核心岩藻糖或路易斯-表位的摩尔含量。动物可或不可对某些人或兽(veterinary)病原体免疫来提供超免疫乳。

动物可通过遗传手段如pIg-受体表达的试验、pIgR单倍型的试验和/或特定岩藻糖基转移酶基因如FUT3、4、5、6、7、9、10、11和/或其它糖基转移酶(如β-3-半乳糖基转移酶或β-4-半乳糖基转移酶)来预筛产生更多SIgA或更多特定糖基化的可能性，并且可出于此目的来饲养种群。

接着鉴定这些动物并选择适当的表达产物。

如上所述包括核心岩藻糖基化的或路易斯-岩藻糖基化的SC的表达产物接着优选合并，且用作根据本发明的免疫复合物的制剂的来源。

实际上，根据本发明使用的来自除人母乳以外的来源的人样SC与对多种病原体具有广谱中和活性的人天然SC相比具有类似的或甚至改进的性质。本文使用的术语“病原体”总是包括微生物有机体和毒素，还包括细菌、真菌、病毒和原生动物细胞和产物，特别是人或兽(veterinarian)病原体。

优选根据本发明的制剂包括高滴定度的免疫球蛋白相关混合物，维持它们的固有功能，包括口服后的粘膜通过(mucosal passage)。

根据本发明的免疫复合物制剂由于在SC的N-糖基化模式中的标准化大量非核心岩藻糖或路易斯表位而具有高效价的优势。从而可显著增加抗病原作用，包括抗微生物或抗毒素作用。

主要的选择标准涉及已证实赋予期望的免疫力的路易斯表位的类型和数量。优选的路易斯表位为LeB表位，其显著增加超过天然原料中的平均流行性(prevalence)。还优选在SC上发生路易斯x或唾液酸化路易斯x表位。优选的乳源产物的相对增加为至少ELISA信号的增加，该信号超过来自未选择个体的合并来源(其中池大小源自至少100个个体)的信号的以非选择样品的标准差计的2倍。典型地，源自特别是反刍动物如牛、绵羊或山羊的至少100个个体的乳腺产物的池具有明显低于0.01mol非核心岩藻糖或路易斯表位/molSC的平均值，通常低于0.005mol/mol，在大多数情况中，甚至是由标准ELISA技术确定的不可检测的路易斯-抗原。

然而，本发明提供优选选择的个体、个体样品或者乳腺分泌物、培养上清液或细胞提取物的池，根据它们的关于非核心岩藻糖或路易斯表位的品质来选择，其量为至少0.01mol/mol SC，具体为非核心岩藻糖或路易斯表位的理论值的至少1％、优选至少5％或至少10％。甚至更优选的选择根据较高的非核心岩藻糖或路易斯糖基化水平来进行，例如至少0.01mol/mol SC，优选至少0.02mol/mol SC，更优选至少0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09或0.1mol/mol SC，更优选至少0.2、0.3、0.4或0.5mol/mol SC，甚至更优选至少1mol/mol SC，或甚至更高，例如至少2mol/mol SC，至少3mol/mol SC，4至少mol/mol SC，或至少5mol/mol SC，至少6mol/mol SC，至少7mol/mol SC，至少8mol/mol SC，至少9mol/mol SC，或至少10mol/mol SC。在具体情况中，N-糖基化位点的理论数总计为2(天然牛SC)、3(天然马SC)和7(天然人SC)mol/mol。根据本发明，特别优选根据路易斯表位的量进行选择，该量为至少1％。优选糖基化位点理论数的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10％，更优选至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，上至糖基化位点的理论数。

非核心岩藻糖的量可超过N-糖基化位点的理论数，例如通过每个N-糖基化位点多个岩藻糖基化，从而获得基于摩尔的比N-糖基化位点的数量多的路易斯表位，例如至少1.1倍、优选至少1.2倍、或至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、或至少2倍，在具体情况中，该量甚至更高，例如至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍或至少9倍，例如多至N-糖基化位点的理论量的10倍。

选择可基于确定来自个体的样品或来自选择池的样品(即合并样品)来进行，其中所述池源自10个以上的个体。已根据选择标准证实为非核心岩藻糖或路易斯-阳性的材料可接着合并来提供作为根据本发明的免疫复合物制剂的工业规模生产用的原料的生产池。具有经证明的高品质糖基化谱的生产池具有优选大小为至少10，更优选至少50、100、500、1.000或2.000个供给，或优选至少10、50、100、500、1000、2000、10,000or 20,000升。作为品质控制措施，相关的糖基化的存在通常通过过程中控制(in-process controls)和/或终产物控制来证实。终产物典型地根据期望的糖基化模式标准化。

用于确定SC和/或SIgA或SIgM上的非核心岩藻糖的示例性试验体系记载于下述实施例部分。高度选择性的确定方法是指通过标准RP-ESI-MSMS(也称为RP-HPLC-ESI-MSMS，反相-高效液相色谱-电喷射离子化-串联质谱法)的聚糖分析。非核心岩藻糖或路易斯-型岩藻糖基化的水平或程度可基于下列原则来试验：

聚糖谱和由此的附着至给定糖基化位点的寡糖的特定组合物的量可通过源自SC的糖肽的质谱法来确定(Stadlmann 2008,Proteomics 8,2858-2871；Wuhrer 2007,Proteomics 7,4070-4081)。在岩藻糖残基附着至具有多个潜在的糖基化位点的SC上的聚糖的触角(路易斯糖基化)的特定情况中，可应用下列策略。

在SDS-PAGE上分离SIgA-制剂，并洗脱SC-带段(band)。SC被S-烷基化并用胰蛋白酶或其它适当的蛋白酶消化。将样品另外用能够具体将α-1,6-键的岩藻糖残基移至最内的GlcNAc残基(核心-岩藻糖基化)的岩藻糖苷酶进行处理。此类酶的实例为来自牛肾的岩藻糖苷酶。

接着，肽和糖肽的所得混合物优选在通过例如反相色谱的色谱分离后通过质谱分析。在适当选择蛋白酶、色谱柱和溶剂梯度下，各糖基化位点由峰表示。Asn-连接的糖基化的潜在位点可从蛋白质的氨基酸序列推断出。

由于在大部分反相柱上，例如在Waters BioBasic C18柱上的保留仅依赖于肽部分，该峰覆盖给定肽的所有糖型和由此的糖基化位点。

可通过几种手段鉴定给定位点的糖肽：

1.)由于通常观察的异质性，它们形成差别在于质量的一系列峰，例如己糖(162,05Da)、唾液酸(291.09Da)、N-乙酰基己糖胺(203.08Da)或岩藻糖残基(146.06Da)。

2.)ESI-或MALDI-MS的MSMS碎片可揭示聚糖序列和潜在肽的质量。

3.)通过肽的酶去除：N-糖苷酶(F或A)将产生包含Glu(谷氨酸)代替Gln(谷氨酰胺)残基的去糖基化肽，结果产生1Da的质量差。该去糖基化肽的质量必须满足第1.)点和第2.)点中获得的或使用的假设。

一旦鉴定了糖基化峰，对应于特定糖肽物质的峰“体积”，即峰值面积由可考虑通常发生在两个以上的电荷态中的一个分析物的适当方法测量。峰体积可直接翻译成糖型离子化的摩尔比例，因而糖肽的检测由肽部分控制(Stadlmann,2008,Proteomics 8,2858-2871)。

由发生在特定位点上的糖型列表计算岩藻糖基化聚糖的摩尔分数。加入不同位点的结果来达到其中特定结构性质发生在特定SC样品上的摩尔比例。核心-岩藻糖除去的完整性可例如通过分析由多孔石墨碳上的色谱伴有MS检测的释放的N-聚糖来证实(Pabst 2007,Anal.Chem.79,5051-5057)。

对于筛选大量个体来源或制剂，可使用简单快速的试验，例如侧流(lateral flow)测定。另外，或可选地，使用ELISA测定，采用路易斯-型糖基化特异性配体，如对抗各种路易斯表位(如，抗-路易斯a、抗-路易斯b、抗-路易斯x、抗-路易斯y、抗-唾液酸化路易斯x)的抗体或可选的支架连接子(scaffold binders)、人凝集素DC-SIGN、抓获树突细胞-特异性胞间粘附分子-3的非整联蛋白(也称作CD209(分化抗原簇209))。可使用的粘结路易斯表位的其它凝集素的实例为同工凝集素A、橙黄网孢盘菌凝集素(Aleuria aurantiaagglutinin)、血栓调节素(thrombomodulin)、langerin(朗格素，朗格汉斯细胞产生的特异性凝集素)、清除剂受体(scavanger receptor)C-型凝集素、E-选择素、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素(siglecs)、SIGN-受体和人轮状病毒的病毒蛋白8(VP8)。

作为阳性对照，典型的使用人材料。作为阴性对照，使用非-岩藻糖基化蛋白，例如来自合并的商购(即非选择的、非人的)来源的BSA或任何分泌性免疫球蛋白制剂，所述来源在任何情况下包括相对于每摩尔SC小于0.01mol非核心岩藻糖的平均值。将SC和/或分泌性免疫球蛋白制剂中非核心岩藻糖或路易斯表位的确定结果典型地与具有预定量的相对于每摩尔SC或者SIgA或SIgM的非核心岩藻糖如0.01mol/mol(+/-20％)的参考相比较。因此，结果可为半定量的，且是指“高于”或“小于”参考量。可选地，定量确定将是可能的，例如通过利用一系列包括不同水平的非核心岩藻糖基化或路易斯表位的参考进行适当的校正。标准效价测试是指艰难梭菌毒素A、螺杆菌(Helicobacter)、大肠杆菌毒素、弯曲杆菌(Campylobacter)、志贺氏杆菌(Shigella)、轮状病毒、诺如病毒的至少之一的中和活性或粘结试验，或与脂多糖、脂磷壁酸、肽聚糖、钥孔戚血蓝蛋白、DC-SIGN、同工凝集素A、橙黄网孢盘菌凝集素、血栓调节素、朗格素、清除剂受体C-型凝集素、E-选择素、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素、SIGN-受体的竞争、粘结抑制或其它相互作用。

优选供体表达体系由泌乳期的非人雌性个体构成，以获得来自供体的乳或乳级分的分泌成分和任选的免疫复合物制剂。示例性原料为例如分别以富集形式含有游离的分泌成分、多聚免疫球蛋白和免疫复合物的乳清或干燥乳清。优选的原料可为免疫球蛋白中富集的至少2倍、3倍、4倍或5倍。

SC或免疫复合物可由纯化形式的此类原料获得，从而制备根据本发明的免疫复合物。

可选地用于生产根据本发明的免疫复合物的表达体系还可为重组表达体系，其中所有物种和分类群的重组宿主细胞，例如重组真核宿主。

因此，氨基酸序列，如SEQ ID 1或其任意功能性活性变体序列，或编码SC的核苷酸序列可用于制备重组宿主。所述序列优选编码哺乳动物来源如人、牛、山羊、绵羊的SC或非人SC序列的人源化变形(versions)，或嵌合体的，总是包括功能性变体。相应的序列信息提供于图中，或可酌情来源于公开的数据库。

重组SC迄今为止已在不能向分泌成分的聚糖添加路易斯-型岩藻糖基化的宿主中生产。常用的纯化的重组SC用宿主为CHO细胞、BHK细胞、小鼠J558L细胞、昆虫细胞和烟草植物。

重组SC可通过将pIgR的完整基因如人pIgR引入宿主细胞，随后表达跨膜蛋白pIgR，接着将胞外部分SC切割并释放至培养上清液中来生产。可选的表达为SC的核苷酸序列的转录，即仅胞外结构域，例如编码SEQ ID 1的氨基酸序列。在所有情况中，重组SC的表达允许生产条件的精确选择，确保终产物的均一C-末端。

还允许根据需要选择翻译终止位点。优选要表达的SC基因上的终止密码子位于编码最后的胞外免疫球蛋白-样结构域(即人SC中的结构域5)和跨膜区之间。然而，本发明的重组SC可甚至更短，例如包括小于5个完整结构域，或小于4个结构域，或小于3个结构域，或小于2个结构域，例如至少第一结构域，只要其能够结合并包含所需水平的非核心岩藻糖即可。

该蛋白质可在核酸中的需要位置处通过终止密码子来终止，该位置分别在氨基酸G545之后，优选位于K566和E607之间(包括这些位点)的任意氨基酸位点，更优选在R603和E607之间(包括这些位点)，或者在E607之后。最优选SC在R603之后终止。编号指的是SEQ ID 1。

优选宿主细胞选自由人细胞如PerC.6、中国仓鼠卵巢细胞、仓鼠崽肾细胞、鼠类细胞、鸟类细胞系、细菌细胞、酵母真菌细胞、植物细胞和昆虫细胞组成的组。从而，重组SC可获得期望的非核心岩藻糖基化或路易斯型N-糖基化。

在本发明的制剂中非核心岩藻糖基化的程度可通过选择具有高非核心岩藻糖基化(相对于每摩尔SC)的SC来增加。这可在生产型宿主的选择水平下操作(这样的筛选用于细胞系、微生物克隆或有机体)，其还可在个体供体被选择为提供包含具有高摩尔非核心岩藻糖基化的SC的分泌物用于这些样品的随后合并的水平下操作。岩藻糖基化可通过本发明的SC制剂或固有免疫复合物的酶或化学岩藻糖基化增加。

正常组织显示在某些部位(例如结肠、睾丸)和在某些发育阶段(胎儿抗原)期间的路易斯表位的表达。因此，来自某些部位的某些细胞系，例如结肠癌细胞系表达路易斯抗原。Caco-2细胞在分化期间仅表达H型1血型抗原和少量LeB。已开发各种细胞系(HT-29、AGS、Kato III、HuTu-80和HEp-2)以及原代胃细胞用于路易斯抗原表达。然而，它们中的多数难以培养且会由于它们固有的遗传不稳定性而不适于作为生产相应的路易斯-型N-糖基化的生产型宿主。

植物N-聚糖为寡甘露糖型(Man>5GlcNAc2)、少甘露糖(paucimannosidic)型和复合型的形式。不仅已在单子叶植物和双子叶植物中检测位于N-聚糖的触角的LeA部分，而且还在小立碗藓(Physcomitrella patens)(雌雄同株苔藓)和各种苔藓类物种中检测。LeA在所有植物组织(花、叶、根和籽苗)中表达，起作用的α1,4-FucT活性在幼嫩组织(叶和根)中占主导。然而，在植物中表达的SIgA迄今还未显示任何路易斯-型糖基化。

在能够产生具有路易斯表位的N-糖基化蛋白质的同一宿主中多聚免疫球蛋白(例如二聚IgA或五聚IgM)与SC的共表达导致非原生的路易斯糖基化重链，因而不优选。

因此，具体优选使用的表达体系能够以期望的方式，本质上即以遗传方式，或者通过借助相应的遗传修饰如借助重组技术的后天的或瞬时能力使糖蛋白糖基化，从而提供相应的糖基化模式。示例性表达体系例如通过岩藻糖基转移酶2和3以及β1,3-半乳糖基转移酶I、II和V的伴随表达而具有增强的生产路易斯-岩藻糖基化N-糖蛋白的能力。

工程化为生产非核心岩藻糖基化或路易斯-糖基化寡糖和复合糖的宿主为例如生产细胞系，以表达各种糖基转移酶如岩藻糖基转移酶，从而生产具有血型相关抗原的寡糖、糖蛋白或糖脂。

转基因动物已记载产生血型相关的糖基化(如WO1995024495A1或Xu等人，参见上述)。然而，现有技术的转基因有机体会提供伴随的路易斯-岩藻糖基化IgA或IgM，将具有过量的非核心岩藻糖基化和非-天然糖基化模式。因此，免疫复合物制剂具体地不源自此类转基因动物的乳。

工程化CHO细胞已记载产生路易斯型岩藻糖基化(等人，2008,Glycobiology vol.18no.7pp.494-501)。另外，已描述了具有产生路易斯型岩藻糖基化N-聚糖的能力的CHO细胞的功能获得性突变体(North等人，2010,JBiol Chem.vol 285pp.5759-5775)。然而，此类宿主细胞中完整SIgA的表达将产生具有非天然糖基化的路易斯-岩藻糖基化α-免疫球蛋白链。此类细胞可因而在根据本发明的适当糖基化选择后仅用于生产人样SC。适当重组宿主细胞克隆的选择如上述乳样品筛选所记载的进行。优选工程化、筛选和选择比由等人和North等人记载的更不同的路易斯-型糖基化和更遗传稳定的突变体。源自此类宿主细胞的重组SC接着用于制备具有来自任何来源的非-路易斯-岩藻糖基化(即天然糖基化)免疫球蛋白的根据本发明的免疫复合物。

具体地，优选采用表达路易斯-糖基化SC的产量为至少1mg/L培养基、优选至少10mg/L、优选至少100mg/L、最优选至少1g/L的条件在小试验(pilot)或工业规模的生物反应器中培养重组宿主细胞系。

优选通过下列试验测试根据本发明的宿主细胞的表达能力或产量：ELISA、活性测定、HPLC或示出根据本发明的SC或免疫复合物的量和品质的其它适合试验。不仅选择宿主细胞的表达水平，而且还选择宿主细胞的SC的糖基化模式，其能够提供：例如路易斯a、路易斯b、路易斯x和路易斯y的至少之一，或其唾液酸化形式发现于重组SC中。优选地，路易斯x和/或唾液酸化-路易斯x存在于样品中。更优选地，SC上的超过一种路易斯-抗原存在于样品中。

优选的发酵技术为批式、分批补料式(fed batch)或连续培养如灌注培养。

优选生产型细胞系在含有适当碳源的矿物质培养基中培养，从而进一步显著简化分离过程。优选的矿物质培养基的实例为以下培养基，该培养基含有可利用的碳源(如葡萄糖、甘油或甲醇)、含有大量元素(钾、镁、钙、铵、氯化物、硫酸盐、磷酸盐)和微量元素(铜、碘、锰、钼、钴、锌和铁盐，和硼酸)的盐，和任选的例如为了补充营养缺陷型的维生素或氨基酸。

转化细胞在适于造成SC表达的条件下培养，SC可由细胞或培养基纯化，取决于表达体系的性质。如技术人员将会理解的，培养条件将根据包括宿主细胞类型和采用的特定表达载体在内的因素而变化。

如果SC从细胞分泌，其可使用最新水平的技术从培养基分离纯化。重组表达产物的分泌通常由于包括促进纯化过程的原因而是有利的，这是由于产物典型地从培养上清液回收，而不是从蛋白质复合混合物中回收，结果当细胞破坏时释放胞内蛋白。

培养的转化株细胞还可声波或机械、酶或化学破裂，从而获得包含期望的SC的细胞提取物，由此分离纯化SC。

除了基因工程技术以外，还可通过路易斯-糖基化寡糖与SC的化学配合、酶添加岩藻糖而在体外SC上产生路易斯抗原、或者借助路易斯-糖基化特异性配体结合(如与路易斯抗原特异性结合的抗体或可选的支架，特异性凝集素如DC-SIGN、血栓调节素、来自翅荚百脉根(Lotus tetragonolobus)的同工凝集素A和橙黄网孢盘菌凝集素、特定的唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素、选择素)由合并来源富集SC或分泌性免疫球蛋白来提供人样SC。

用于获得根据本发明的SC或免疫复合物的分离纯化方法可利用溶解度的差异例如盐析和溶剂沉淀，分子量的差异例如超滤和凝胶电泳，电荷的差异如离子交换色谱，或可利用特定的亲和力例如亲和色谱，或可利用疏水性的差异如反相高效液相色潽，或利用等电点的差异如等电点聚焦。具体的纯化步骤优选用于分离单独或与免疫球蛋白复合的任意SC多肽，为超滤技术，分子截断在100kDa至500kDa之间，和沉淀技术例如用盐如硫酸铵或有机溶剂沉淀。

分离纯化的SC可通过常规方法如免疫印迹或其活性的测定，例如通过其结合二聚IgA或J链的能力或者通过检测特定抗SC的抗血清来鉴定分析。

纯化的化合物的结构可由氨基酸分析、氨基末端分析、一级结构分析和糖分析等来定义。优选SC化合物可大量地且在特定情况下高纯度地获得，由此满足用作根据本发明的免疫复合物的一部分的必要的要求，从而用作药物组合物中的活性成分。

根据本发明的免疫复合物制剂优选用作食品，例如为需要其的受试者提供特定的饮食，所述受试者为例如处于由病原体引起的病况的风险或遭受由病原体引起的病况。

进一步优选的用途为预防由包括微生物物质或有机体的病原体、抗原或致病剂如毒素引起的疾病或紊乱。例如，住院患者可需要增补它们的免疫系统来减少医源性感染的风险。接受根据本发明的食物增补剂的初生人类或动物如果不能从母亲或各自的乳母获得足够的初乳也可具有较高的存活机会。此外，动物和人中肠致病性疾病的风险可通过此类食品减少。

根据本发明的制剂可用于治疗口、喉、鼻和耳、眼和食道、胃和结肠道的传染病。

适当地，根据本发明的制剂可提供为制剂品，其任选地提供进一步的营养素如蛋白质、糖类、脂质和其它生理活性物质。

根据本发明生产的示例性制剂包括奶制的乳(dairy milk)和为乳制品副产物的乳清粉。基于根据本发明产品的乳清另外包括例如血清白蛋白、乳白蛋白、乳球蛋白、乳铁蛋白、乳过氧化物酶、寡糖、肽、乳糖和矿物质。在某些情况中优选由超免疫成人的乳或乳清获得产物，以使根据本发明的制剂包含与疾病有机体、病原体或疾病相关抗原的特定基团反应的水平些许增加的免疫球蛋白。

本发明具体包括通过具有天然糖基化模式即在N-聚糖上没有路易斯-表位的IgA或IgM分子稳定化路易斯-糖基化功能性人样SC。

稳定化免疫复合物可具有增加的热稳定性和/或胃肠稳定性，如通过pH稳定性和/或蛋白质的蛋白酶稳定性所测量的，导致体内半衰期增加的恢复或延长。稳定化作用对于粘膜恢复特别重要。在投与根据本发明的制剂时，免疫复合物的免疫活性可在粘膜中通过免疫技术如ELISA确定。免疫球蛋白在粘膜中增加的水平表明增加的恢复。

根据本发明的制剂可进一步包括游离的未结合的SC以及与免疫球蛋白复合的SC，这甚至能够增强其功能性质。

本发明优选的实施方案为根据本发明的SC附着至天然抗体，从而提供蛋白水解稳定的、多价且多特异性的分子，所述分子能够中和各种病原体抗原。

进一步优选根据本发明的免疫复合物制剂包含5至100％w/w的分泌性免疫球蛋白(即，与SC复合的聚免疫球蛋白)。更特别地，该制剂可包含20至70％w/w的分泌性免疫球蛋白。

根据本发明的制剂还可优选包含其它成分如糖类。糖类优选源于乳清蛋白浓缩物并以0至95％w/w之间的浓度存在于制剂中。更优选地，糖类在30至90％w/w之间存在。糖类提供现成的能源。

葡萄糖也优选用作糖类添加剂，其可包括在制剂中辅助预防粉末的聚集并提供另一形式的糖类。

另外优选的添加剂为乳清蛋白，其可进一步稳定化免疫球蛋白制剂、出于营养目的的氨基酸、寡糖，和增强制剂的生理值的物质。

还可优选在根据本发明的制剂品中包括抗微生物物质，例如抗生素，抗病毒剂，抗真菌剂，抗寄生虫剂(antiparasitics)，或包括有机酸、植物精油、阳离子、胶体银(collodial silver)或季铵盐等的杀微生物物质。

特别优选根据本发明的制剂品提供为液剂、乳剂、悬浮剂、浆液剂(slurry)或以干燥形式如粉剂或颗粒剂。

具体地，优选的制剂品制造为可在使用前即刻配制成液剂的粉剂或颗粒剂。

进一步优选的投与形式为可通过标准方法生产的片剂、锭剂、胶囊剂、糊剂、颗粒剂、霜剂等。片剂优选包含辅助添加剂如填料、粘结剂、崩解剂、润滑剂或风味剂等。颗粒剂可使用异麦芽糖生产。用于人类的根据本发明的制剂品可提供1mg至10g免疫复合物的每日剂量。

此外，优选提供配制为在粘膜部位起作用的制剂，例如在粘膜部位(鼻、口、眼、食道、喉、肺、耳、胃道、肠和结肠)例如局部而不是全身作用。根据本发明的制剂典型地提供用于口服或粘膜用途，包括口、鼻、支气管、阴道、直肠使用，例如从而抑制对咽、肠、泌尿生殖道和牙龈上皮细胞的粘附。该制剂可以适用于局部应用的形式如以霜剂、喷雾剂或滴剂提供用于特定的医疗指示。

根据本发明的免疫复合物制剂可具体用于治疗和/或预防感染和/或炎症和/或过敏症状和/或自身免疫病的症状和/或粘膜表面的免疫球蛋白缺陷，例如胃肠道、泌尿生殖道、呼吸道、鼻腔、眼或口腔，特别是在术后或住院治疗期间进行。

参考下列实施例，前述说明将更完整地理解。然而，这些实施例仅为实施本发明的一个或多个实施方案的代表性方法，不应当作限定本发明的范围。

实施例

实施例1:

路易斯-糖基化SIgA的乳和乳清样品的筛选

样品制剂(乳，乳清)

新鲜取样10ml来自山羊、绵羊和牛的乳并在40,000×g，4℃下离心30min。用软膏刀(spatula)除去脂肪层；剩余的液体转移至新的离心管中并在40,000×g下再次离心30min。

将液体层(乳清)等分并于-20℃保存或直接用于筛选。

阳性对照样品

作为阳性对照，如上所述制备人乳。

阴性对照样品

作为阴性对照，对于牛乳，使用全脂奶(Vollmilch)(3.5％脂肪，Molkerei,Austria)。

对于山羊乳的阴性对照，使用“Ja Natürlich”Ziegenmilch,SennereiZillertal,Austria。

筛选ELISA

筛选在标准ELISA模式下进行：对于山羊乳样品的筛选，在100微升每孔下以1微克每ml包被缓冲液(coating buffer)(3.03g Na₂CO₃，6.0g NaHCO₃于1000ml蒸馏水中，pH 9.6)的浓度用多克隆兔抗山羊IgA(AbD Serotec no.AAI44)包被ELISA板(Nunc Maxi-Sorp Immuno Plate)。对于牛乳样品或绵羊乳样品的筛选，抗-牛IgA(Genataur no.RA-10A,Belgium)或抗-绵羊IgA(LSBiono.LS-C57110,USA)分别包被至板。对于阳性对照样品，抗-人-IgA抗体包被至各孔(Bethyl Laboratories no.A80-103A,USA)。用盖子封闭板并在4℃下温育过夜。

在下一步骤之前，除去包被液并通过用200μl TPBS(1.16g Na₂HPO₄,0.1gKCl,0.1g K₃PO₄,4.0g NaCl在500ml蒸馏水中，0.05％(v/v)Tween20,pH 7.4)填充孔来洗涤板三次。通过在水槽上轻弹(flicking)板来除去溶液或洗涤废水(washes)。剩余的液滴通过在纸巾上轻拍板来除去。可选地，洗涤可用ELISA洗涤器进行。

将板用Superblock封闭缓冲液(blocking buffer)(Thermo no 37515)150微升/孔填充并室温温育2小时。

再次如上所述洗涤板。

乳清样品在样品TPBS(1:2和1:10)中稀释。将针对各稀释度(1:2和1:10)的16个阴性对照加至各板。将针对各稀释度4个阳性对照样品加至板。100微升的各稀释液加入洗涤板的孔中并室温温育2小时。

洗涤后，将100微升的抗-路易斯x-抗体(LSBio no.LS-C75829)、抗-唾液酸化-路易斯a-抗体(LSBio no.LS-C33820)、抗-路易斯a-抗体(LSBio no.LS-C50512)、抗-唾液酸化-路易斯b-抗体(GeneTex no.GTX72378,USA1:300)、抗-路易斯b抗体(LSBio no.LS-C46049)和抗-路易斯y-抗体(LSBio no.LS-C71674,USA,1:50)的混合物在TPBS中的稀释液加入至各样品孔以及阴性和阳性对照样品孔。

将板再次室温温育2小时，随后洗涤。

接着，添加100微升每孔的鸡抗鼠-IgG-HRP(Thermo,no.SA1-72029,1:500，TPBS中)并室温温育2小时。随后，将板用TPBS洗涤三次。

然后用基质缓冲液(substrate buffer)(TMB基质试剂盒；VectorLaboratories no SK-4400,USA)进行另外的洗涤步骤。之后，添加显色底物(chromogenic substrate)(Vector Laboratories SK-4400)。短暂温育后(测量，阳性对照在OD 650>1.0下，阴性对照OD<0.2)添加50微升的1N硫酸，并在酶标仪(microplate reader)中在OD450下读取板，如在标准ELSA技术中的利用TMB作为底物由OD600补偿。

评价：

各稀释度的16个阴性对照的OD值用于计算负信号(negative signal)的平均值和标准差。

如果乳清样品显示至少一个稀释度具有的吸光度高于同一稀释度下阴性对照的平均吸光度+2倍标准差，则乳清样品在本筛选测定中视为阳性。

阳性乳清样品用于进一步的分析。

实施例证实，可选择并筛选动物物种、个体和种属，从而产生具有基本上高于目前商购可得乳的路易斯-糖基化SIgA含量的乳。

实施例2

路易斯-岩藻糖基化重组人分泌成分在哺乳动物细胞中的表达

本实施例描述了表达由各种糖基转移酶修饰的分泌成分的哺乳动物细胞的建立，以及随后筛选产生路易斯-岩藻糖基化分泌成分的克隆。

分泌成分蛋白序列(pIgR的胞外部分)示于图1。

将蛋白序列反向翻译为DNA(为哺乳动物细胞表达而优化)并从头合成(Geneart,Germany)。出于克隆目的，DNA提供有HindIII和XbaI识别和切割位点(斜体加下划线)。参见图2。

将基因在HindIII和XbaI位点插入载体pCDNA3.1+(invitrogen,USA)中。

为了产生稳定的转染子，用PvuI使质粒线性化并随后根据制造商(Invitrogen)使用Lipofectamine 2000转染至CHO-K1细胞(CHO DUK-；ATCCCRL 9096)中。转染后24小时，将各T-烧瓶中的细胞分离至五个100-mm培养皿中并在选择培养基中温育。G418的浓度为200-400微克/mL。选择培养基每三天更换。抗药性克隆可在大约2周后发现，在显微镜下鉴定，并使用移液器手工挑选。选择的克隆在G418的存在下在96孔板中培养2周。将生长细胞分离至双孔，并在ELISA标准中试验上清液的分泌成分表达。简言之，将山羊抗-分泌成分抗体(Acris Antibodies AP21476FC-N)包被至板，温育并洗涤后，添加细胞上清液(1:2和1:10稀释)。温育并洗涤后，添加小鼠抗人-SC(Sigma I6635)，随后用抗-小鼠-IgG-HRP检测。选择的阳性克隆用于分泌成分的纯化，并用于进一步的用糖基转移酶转染。

用各种糖基转移酶转染：表达分泌成分的稳定的阳性克隆选择并转染有2个质粒，一个编码岩藻糖基转移酶2和岩藻糖基转移酶3，另一个编码β1,3-半乳糖基转移酶。

α1,2-岩藻糖基转移酶(FUT2)的蛋白序列示于图3。

FUT2的反向翻译序列在5'和3'端包括NheI和EcoRI识别和切割位点。基因从头合成(Geneart,Germany)，参见图4。带有NheI和EcoRI的基因克隆至载体pIRES(Clontech,no 631605)的多克隆位点A中，得到pIRESF2。

岩藻糖基转移酶3的蛋白序列示于图5中。

序列反向翻译为最优的密码子选择序列(codon usage sequence)，并提供有在各端的XbaI和NotI识别位点，参见图6。

DNA从头合成并克隆至包含如上所述的FUT 2基因的pIRESF2载体的多克隆位点B的XbaI和NotI位点，产生质粒pIRESF23。

对于转染，包含FUT2和FUT3基因的pIRESF23载体用BpmI线性化。

制备若干包含各种β1,3-半乳糖基-转移酶的表达质粒。因此，将半乳糖基-转移酶的蛋白序列反向翻译成DNA序列(为哺乳动物细胞表达而优化)并在各端提供有独特的限制性位点(NheI and NotI)。DNA合成并克隆至pEF1αIRES(Clontech631970)的NheI和NotI位点。在与包含FUT2和FUT3的pIRESF23共转染至表达重组人分泌成分的CHO细胞之前使各质粒用AatII线性化。

β1,3-半乳糖基转移酶I的蛋白序列示于图7。

β1,3-半乳糖基转移酶I的基因示于图8。

β1,3-半乳糖基转移酶V的蛋白序列示于图9，准备好克隆的相应的基因示于图10。

β1,3-半乳糖基转移酶II的蛋白序列示于图11，具有克隆位点的相应的基因示于图12。

转染和选择步骤

利用质粒混合物：Linearized pIRESF23分别与编码β-1,3-半乳糖基转移酶I、β-1,3-半乳糖基转移酶II和β-1,3-半乳糖基转移酶V的线性化质粒结合，在标准转染步骤中转染表达人分泌成分的CHO细胞克隆。转染接着进行标准选择步骤来产生稳定的克隆(G418浓度可增加至1000微克每ml选择培养基)。

表达路易斯-糖基化分泌成分的克隆的筛选：

在特异性针对分泌成分和路易斯糖基化的ELISA中试验CHO克隆的上清液：

筛选在标准ELISA模式中进行：对于筛选细胞培养上清液，在100微升每孔下以1微克每ml包被缓冲液(3.03g Na₂CO₃，6.0g NaHCO₃于1000ml蒸馏水中，pH 9.6)的浓度用抗人分泌成分抗体(Ray Biotech no.DS-PB-03010,USA)包被ELISA板(Nunc Maxi-Sorp Immuno Plate)。

用盖子封闭板并在4℃下温育过夜。

在下一步骤之前，除去包被液并通过用200μl TPBS(1.16g Na₂HPO₄,0.1gKCl,0.1g K₃PO₄,4.0g NaCl在500ml蒸馏水中，0.05％(v/v)Tween20,pH 7.4)填充孔来洗涤板三次。通过在水槽上轻弹板来除去溶液或洗涤废水。剩余的液滴通过在纸巾上轻拍板来除去。可选地，洗涤可用ELISA洗涤器进行。

将板用Superblock封闭缓冲液(Thermo no 37515)150微升/孔填充并室温温育2小时。

再次如上所述洗涤板。

细胞培养上清液在样品TPBS(1:2和1:10)中稀释。将针对各稀释度(1:2和1:10)的16个阴性对照加至各板。将针对各稀释度4个阳性对照样品加至板。100微升的各稀释液加入洗涤板的孔中并室温温育2小时。

将板再次室温温育2小时，随后洗涤。

然后用基质缓冲液(TMB基质试剂盒；Vector Laboratories no SK-4400,USA)进行另外的洗涤步骤。之后，添加显色底物(Vector LaboratoriesSK-4400)。短暂温育后(测量，阳性对照在OD 650>1.0下，阴性对照OD<0.2)添加50微升的1N硫酸，并在酶标仪中在OD450下读取板，如在标准ELSA技术中的利用TMB作为底物由OD600补偿。

评价：

各稀释度的16个阴性对照用于计算负信号平均值和标准差。

如果样品显示至少一个稀释度具有的吸光度高于同一稀释度下阴性对照的平均吸光度+2倍标准差，则样品在本筛选测定中视为阳性。

阳性样品用于蛋白质纯化和进一步的分析。

本实施例证实，可产生不源自人乳的具有高摩尔比例的路易斯-表位的分泌成分。

实施例3：

定量评价分泌成分上路易斯-表位的存在

来自动物细胞上清液和分泌性IgA的重组分泌成分的纯化通过亲和色谱利用结合到琼脂糖凝胶(Sepharose)的兔抗人分泌成分根据标准实验步骤进行。

聚糖-分析用样品制备：

纯化的分泌性IgA通过还原SDS-PAGE(80×80×1mm,10％BisTrisNuPAGE gel,MES SDS电泳缓冲液(Invitrogen))而分离成SC、J链、H链和轻链。蛋白质带段(protein band)通过考马斯染色而可视化。使用分子质量标准。

约80kDa考马斯染色的带段切离并用胰蛋白酶凝胶内消化并烷基化(凝胶内胰蛋白酶消化试剂盒(In-Gel Tryptic Digestion Kit),Thermo Scientificproduct no.89871)。

纯化的、还原的和烷基化的分泌成分的肽为通过用来自牛肾的α-1-6-岩藻糖苷酶(ProZyme,no GKX-5006,USA)在37℃下在10mM NH4Ac(pH 5.0)中过夜处理而在最内GlcNAc残基去岩藻糖基化的。核心-岩藻糖除去的完整性可通过分析由多孔石墨碳上的色谱伴有MS检测的释放的N-聚糖来证实。

肽和糖肽的分析在由Aquasil C-18柱(30mm×0.32mm,5微米,ThermoScientific)、BioBasic C18分析柱(150mm×0.18mm,5微米,ThermoScientific)、Waters CapLC、Rheodyne 10-口阀和具有标准ESI-来源的WatersQ-TOF Ultima组成的毛细管LC-ESI-MS体系上进行。

溶剂A由pH 3.0的65mM甲酸铵组成，溶剂B为80％乙腈(ACN)在溶剂A中。预置柱在无ACN下平衡并负载。之后，6.3至62.5％的溶剂B的梯度显影45min。测量m/z 150至1800范围内的阳离子。毛细管电压为3.2kV，锥电压为35V，源温度(source temperature)100℃，去溶剂化温度120℃。

使用MassLynx 4.0软件评价数据，包括MaxEnt3去卷积/分离同位素(deisotoping)特征(Waters)。

糖基化肽通过利用PNGnase F(Roche)的去糖基化鉴定，并进一步在反相HPLC接着质谱中分离。去糖基化肽包含谷氨酸代替谷氨酰胺残基，这产生1Da的质量差。

相同肽骨架上不同的聚糖结构将可能的糖肽信号分成几个不同质量的分子种类。糖肽的存在还可在总质谱中表示为在基于特定单糖差异的步骤下的不同糖型之间的质量阶梯(如，m/z 146[岩藻糖]，162[己糖]，203[N-乙酰基己糖胺]，291[N-乙酰神经氨酸])。

一旦鉴定了糖基化峰，测量对应于特定糖肽物质的峰“体积”，即峰值面积。峰体积可直接翻译成糖型离子化的摩尔比例，因而糖肽的检测由肽部分控制。

随鉴定的或潜在的糖肽的洗脱时间获得质谱并在将m/z与强度谱(m/z vsintensity spectrum)提交至软件用于分析之前求和、平滑化和质心化(centroided)。

为了增加低强度糖型的信噪比，推荐仅对相应的洗脱峰而不是较宽的色谱时间框的MS-谱求和。

从发生特定糖基化位点的糖型的列表，计算岩藻糖基化聚糖的摩尔级分。添加不同位点的结果以获得发生在分泌成分中的岩藻糖基化聚糖的摩尔比例。

示例性结果和计算以人分泌成分的样品示出：

各肽糖型的相对量：

肽82-109

2.6％Hex₉HexNAc₇Fuc₃NeuAc₀

5.2％Hex₁₀HexNAc₈Fuc₀NeuAc₀

15.6％Hex₁₀HexNAc₈Fuc₂NeuAc₀

4.2％Hex₁₀HexNAc₇Fuc₄NeuAc₀

21.8％Hex₁₀HexNAc₈Fuc₃NeuAc₀

21.3％Hex₁₀HexNAc₈Fuc₄NeuAc₀

15.9％Hex₁₀HexNAc_8Fuc₃NeuAc₁

8.1％Hex₁₀HexNAc₈Fuc₄NeuAc₁

3.3％Hex₁₀HexNAc₈Fuc₅NeuAc₁

2.0％Hex₁₀HexNAc₈Fuc₄NeuAc₂

在糖基化位点Asn83和Asn90，95％的糖型具有非核心岩藻糖-残基

肽168-190

3.3％Hex₅HexNAc₄Fuc₀NeuAc₀

55.1％Hex₅HexNAc₄Fuc₂NeuAc₀

35.4％Hex₅HexNAc₄Fuc₃NeuAc₀

6.1％Hex₅HexNAc₄Fuc₂NeuAc₁

在糖基化位点Asn186，97％的糖型具有非核心岩藻糖-残基

肽413-434

24.2％Hex₅HexNAc₄Fuc₂NeuAc₀

37.7％Hex₅HexNAc₄Fuc₃NeuAc₀

38.2％Hex₅HexNAc₄Fuc₂NeuAc₁

在糖基化位点Asn421，100％的糖型具有非核心岩藻糖-残基

肽457-479

11.0％Hex₅HexNAc₄Fuc₀NeuAc₀

46.9％Hex₅HexNAc₄Fuc₂NeuAc₀

42.1％Hex₅HexNAc₄Fuc₃NeuAc₀

在糖基化位点Asn469，89％的糖型具有非核心岩藻糖-残基。

肽498-515

6.1％Hex₄HexNAc₃Fuc₀NeuAc₀

7.7％Hex₅HexNAc₃Fuc₀NeuAc₀

3.6％Hex₅HexNAc₄Fuc₀NeuAc₀

18.9％Hex₆HexNAc₃Fuc₀NeuAc₀

23.2％Hex₅HexNAc₄Fuc₁NeuAc₀

7.8％Hex₆HexNAc₃Fuc₂NeuAc₀

25.8％Hex₅HexNAc₄Fuc₂NeuAc₀

5.1％Hex₅HexNAc₄Fuc₃NeuAc₀

1.8％Hex₅HexNAc₄Fuc₂NeuAc₁

在糖基化位点Asn499，64％的糖型具有非核心岩藻糖-残基。

样品的非核心(路易斯)岩藻糖基化＝0,95mol+0,97mol+1mol+0,89mol+0,64mol＝4,45mol/mol分泌成分

实施例4

哺乳动物细胞中二聚IgA的表达和SIgA分子与重组路易斯-糖基化分泌成分的重构

鼠类J558L细胞用作表达结合至半抗原硝基苯基的种系抗体的宿主。为此，嵌合的重链(鼠类VH/人IgA2恒定区)克隆于哺乳动物表达载体pCDNA3.1，将质粒转染至J558L细胞和克隆，选择并筛选稳定表达的dIgA。与IgA2重链平行的，制备并使用具有IgA1重链的构建体。

二聚IgA纯化并与来自CHO细胞的重组分泌成分重构(参见实施例2)。

嵌合抗硝基苯基IgA重链的蛋白序列(小写字母＝前导肽，下划线＝鼠类VH)示于图13，重链构建体的DNA序列，包括HindIII和XbaI限制性位点，示于图14。

基因完全合成有HindIII和XbaI位点(Geneart,Germany)并克隆至pCDNA3.1+(Invitrogen,USA)的相应位点。转染之前，用PvuI使重组质粒线性化。

鼠类J558L细胞(Health Protection Agency Culture Collections no.88032902)，显示NIP特异性J链和λ轻链的组成型合成，在含青霉素(100IU/ml)和链霉素(100microg/ml；Bio Whittaker,Walkersville,MD)和10％胎牛血清(Invitrogen)的RPMI培养基中在37℃下在含5％CO₂的气氛中生长。J558L的稳定转染通过电穿孔实现，克隆在包含500microg/ml G418(Sigma)的培养基中选择。细胞在上清液收集并通过酶联免疫吸附测定(ELISA)筛选免疫球蛋白生产之前温育2-3周。

对于ELISA，微孔板包被有抗-j链抗体(山羊抗-J链，Santa Cruz,sc-34654)。洗涤后，添加细胞培养上清液(稀释1:2和1:10)。温育和洗涤后，抗-人-IgAα链-HRP结合物用于检测表达IgA的细胞系。

来自选择克隆的培养上清液的重组dIgA的纯化通过亲和色谱利用抗人IgA偶联的琼脂糖凝胶(Sigma A2691)根据制造商和标准亲和色谱步骤来进行。

来自IgA和重组分泌成分的SIgA的重构

dIgA-分泌成分复合物的重构在体外通过将等摩尔纯化的dIgA和纯化的分泌成分(分别岩藻糖基化和非-岩藻糖基化)以10微克每100微升的浓度在PBS缓冲液中混合过夜来进行。

重构复合物分别上样于非还原的和还原的6％SDS-聚丙烯酰胺凝胶，印迹至聚偏二氟乙烯膜，并用抗分泌成分的抗血清检测。

如分泌成分移至dIgA和pIgA分子的位置所示发生共价重构。在还原条件下，在每个泳道中仅游离的分泌成分可检测到类似的程度，表明分泌成分和IgA通过二硫键连接。

复合物进一步通过HPLC纯化。定量此类在PBS中的纯化的SIgA(路易斯糖基化和非-岩藻糖基化)并用于抗原结合和稳定性实验。

实施例5:

重组路易斯-糖基化SIgA的稳定性试验

进行各种测定以显示本发明分子的生物物理、生物化学和生物的稳定性。

对于生物物理稳定性，样品通过差示扫描量热法分析：

免疫复合物和抗体在pH 6.0下用20mM柠檬酸、150mM NaCl缓冲液透析。通过UV吸光度测量抗体浓度。抗体使用透析液稀释为1mg/mL。扫描使用自动毛细管DSC(MicroCal,LLC)进行。进行利用透析液的两次扫描用于基线减法。扫描以1℃/min从20-95℃使用中等反馈模式运行。扫描使用Origin 7.0分析。非零基线使用三阶多项式校正。各免疫复合物的解折叠转化使用软件内的非两种状态解折叠模式是合适的。

生物化学稳定性(酸温育后的凝胶电泳)：将含有免疫复合物的样品和对照通过使用脱盐柱(NAP25柱，GE Healthcare)缓冲液更换(buffer exchanged)成各种pH值(4.0、5.0、6.0和7.0)的制剂品，并将它们的浓度调整为5mg/ml。配制的抗体溶液通过0.22微米滤器灭菌，并将1ml的各溶液填入灭菌的USP型I,5-ml容量的玻璃小瓶中并用高压蒸汽处理的橡胶塞密封。这些制备的样品在排阻色谱(SEC)分析之前于40℃保存在控温培养器中1天。

排阻色谱：聚集体(高分子量产物)和降解物质(低分子量产物)的量通过SEC使用G3000SWXL柱(7.8mm i.d.30cm；Tosoh Corp.Japan)分析。流动相由50mM磷酸钠(pH 7.0)和500mM氯化钠组成。实验条件如下：注入蛋白质20mg；流速，0.5ml/min；检测波长，215和280nm；和分析时间，30min。确定存在于已在40℃下在玻璃小瓶中保存1天的样品中的高分子量产物和低分子量产物的量并表示为与相应的新制备样品的那些相比的相对增量。

蛋白酶稳定性

所有消化在37℃下进行8小时，样品的蛋白质浓度为5mg/ml，总体积为1ml。胰蛋白酶和胃蛋白酶(Sigma,USA)用作蛋白水解酶。胰蛋白酶消化在pH8.0的0.05M Tris缓冲液中进行。利用胃蛋白酶的消化在pH 4.0的0.05乙酸钠缓冲液中进行。在消化之前所有蛋白质用这些缓冲液透析24小时。对于两种酶来说，酶与蛋白质之比为1:25或1:50。胰蛋白酶消化通过添加等摩尔量的大豆胰蛋白酶抑制剂(Sigma)至反应混合物来停止，而胃蛋白酶消化通过添加100微升2.5M Tris升高溶液pH至约8来终止。消化后，所有反应混合物在进一步分析之前冷冻。

消化的评价：解冻各消化液并置于Superdex 200(GE Healthcare)的柱(1.5×90cm)中，用IgA二聚体、IgG和牛血清白蛋白校准。280nm下记录洗出液的吸光度。

出现峰且在对应于完整分子的位置的峰值面积表示为总面积的百分比。

实施例6:

不同糖基化SIgA的特异性试验

可试验各种路易斯-阳性和路易斯-阴性SIgA(如前述实施例所述的重构SIgA)与一系列(spectrum of)病原体结构的结合。

纯化的本发明免疫复合物的滴定度可在用于结合大肠杆菌-来源的脂多糖(LPS)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)-来源的脂磷壁酸(L2515,Sigma,USA)、来自金黄色葡萄球菌的肽聚糖(PGN)和钥孔戚血蓝蛋白(KLH,MP Biomedicals)的ELISA步骤中试验。该测定记载于J.Dairy Sci.vol.93pp.5467-5473:

用100μL/孔的1μg KLH、4μg LPS、5μg LTA或2μg PGN每mL的碳酸盐缓冲液(10.6g/L Na₂CO₃,pH 9.6)包被板。洗涤后，用100μL/孔的含0.05％Tween20的PBS中的2.5％兔血清室温(21℃)封闭板至少30min。添加在PBS、0.05％Tween20和2.5％兔血清中连续稀释的样品(1:4)。将板在室温(21℃)温育1h。

免疫复合物和抗体与LPS、LTA、PGN或KLH的结合使用偶联至过氧化物酶的100μL/孔的1:15,000稀释的兔抗牛-(抗人、抗山羊)-IgA来检测。洗涤后，100μL/孔的四甲基联苯胺(71.7μg/mL)和0.05％H₂O₂加入孔中并室温(21℃)温育10min。反应用50μL/孔的2.5N H₂SO₄停止。在450nm波长下用微孔板分光光度计测量消光(extinctions)。将水平计算为滴定度，并将滴定度表示为给出离50％Emax最近的消光的稀释液的log2值，其中Emax表示每个微量滴定板上双份存在的标准阳性样品的最高平均消光。

与艰难梭菌毒素A和大肠杆菌亲密素的结合已记载于例如THEJOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL.281,NO.20,pp.14280-14287，与诺如病毒-VLP的结合记载于例如Journal of Virology,Vol.79,pp.6714-6722：

微孔板结合测定—用在100微升50mM碳酸氢钠(pH 9.6)中的200ng免疫复合物、抗体或分泌成分室温包被Nunc MaxiSorp ELISA板的孔1h。用200微升含5％(w/v)脱脂奶粉的PBS-T封闭孔。在100微升PBS中的毒素A(500ng/ml)或GST-亲密素(200ng/ml)或诺如病毒VLPs(1微克/ml)室温温育2h。接着用PBS-T洗涤三次，使用特异性抗体检测结合(SC-毒素A相互作用用鼠类抗-毒素A IgG检测，诺如病毒VLP用小鼠抗诺如病毒检测，和GST-亲密素使用鼠类mAb抗GST检测)，接着山羊抗-小鼠IgG、山葵(horseradish)过氧化物酶-结合的1,2-苯二胺作为染色体基因。反应用1体积的2M H₂SO₄停止，并在492nm下测量光学密度，使用620nm作为参考波长。

实施例7:

根据实施例11获得的山羊SIgA的抗菌活性-天然抗体与细菌抗原的结合

纯化的本发明的免疫复合物与大肠杆菌来源的脂多糖(LPS)和艰难梭菌毒素A的反应性在ELISA中试验。

用100μL/孔的4μg的LPS(来自大肠杆菌O157H7的脂多糖,List BiologicalLaboratories,Campbell,CA,USA,cat.no.206)或1μg的艰难梭菌毒素A(ListBiological Laboratories,Campbell,CA,USA,cat.no.152)每mL的碳酸盐缓冲液(10.6g/L Na₂CO₃,pH 9.6)包被板。洗涤后，用100μL/孔的含0.05％Tween20的PBS中的2.5％兔血清室温(21℃)封闭板至少30min。添加在PBS、0.05％Tween20和2.5％兔血清中连续稀释的样品(1:4)。将板在室温(21℃)温育1h。

免疫复合物和抗体与LPS或艰难梭菌(C.diff.)毒素A的结合使用偶联至碱性磷酸酶的100μL/孔1:15,000稀释的兔抗山羊-IgA(和分别的抗人-IgA)检测。洗涤后，100μL/孔的磷酸对硝基苯酯(paranitrophenylphosphate)加入孔并室温(21℃)温育30min。

光密度用微孔板分光光度计在405nm波长下测量。

试验的制剂为由根据下述实施例11的不同样品制备的人SIgA(SigmaI2636)和几个山羊SIgA，所有具有每摩尔SIgA至少0.01mol非核心岩藻糖。结果，所有山羊SIgA结合至艰难梭菌毒素A和LPS(大肠杆菌O157H7)约比人对照高五倍。

实施例8:

快速筛选试验以通过侧流测定来确定乳或乳清样品中的非核心岩藻糖基化免疫复合物

简单和快速测定可用于决定将特定乳样品包含进池中，以便增加池中分泌成分上的具有路易斯-表位的N糖基化水平。

此类现场测定(on-site assay)可为优化为在某一阈值具有乳或乳清样品显示阳性的快速免疫测定。

侧流试验(侧流免疫色谱测定)为意欲检测目标分析物在样品中的存在的简单装置。通常在量油尺模式中生产，侧流试验为其中试验样品沿着固体基质经毛细管作用流动的免疫测定形式。在样品用于试验后，其遭遇混有样品的着色试剂并转运已固定化的结合蛋白的基质遭遇线或带(zone)。取决于存在于样品中的分析物，着色试剂可变得在试验线或带受限。此类测定的流程示于图15。

侧流试验免疫测定可在15min内进行，并可用于选择包含具有增加的非核心岩藻糖基化的免疫复合物的乳或乳清样品。

该测定的说明为在糖基化(以每摩尔分泌成分的摩尔非核心岩藻糖表示)的特定阈值下检测乳或乳清基质(matrix)中的非核心糖基化分泌成分。对于此类测定的优化，使用不具有、具有低和高非核心岩藻糖基化的纯化的SIgA(如通过聚糖分析确定的，参见例如实施例9)。

此类附有一定说明的测定由承包公司如Kestrel Biosciences(Carlsbad,USA)、Biocare Diagnostics(Xiangzhou,China)、Biotem(France)等开发。

可选地，测定通过使用通用快速检测装置(gRAD,RapidAssays,Copenhagen,Denmark)来设计。基本上，混合生物素化的捕获试剂、金-标记的检测试剂和样品，接着用于侧流测定装置。用于本实施例的gRAD装置包含固定化的抗-兔抗体带和生物素-结合带(对照)。

本实施例中的捕获试剂为生物素化的DC-SIGN-Fc融合蛋白。

本实施例中金标记的检测抗体为兔抗山羊-IgA。

检测和捕获试剂根据RapidAssays,Denmark提供的说明来制造。测定根据RapidAssays试剂盒的说明优化。

生物素化：

DC-SIGN-Fc(R&D Systems,no.161-DC-050)首先与生物素化试剂混合，该生物素化试剂与蛋白质上游离的伯胺反应。接着经色谱法除去非蛋白偶联生物素试剂。对于具有gRAD的使用，连接子应尽可能长。应在测定优化阶段尝试并比较EZ-Link NHS-PEG12-Biotin、Biotin-NHS、Biotin-LC-NHS和Biotin-PEG4-NHS(Pierce)。

PBS pH 7.4和100mM碳酸盐缓冲液pH8.0分别用于DC-SIGN-Fc的生物素化(不应在Tris缓冲液中或包含叠氮化钠，因为这些将封闭结合物)。DC-SIGN-Fc浓度应为mg/ml。

每mg的DC-SIGN-Fc添加2μl的生物素化原液(biotinylation stock)(原液浓度以mg/ml DMSO计：Biotin-NHS(40)，Biotin-LC-NHS(53)，Biotin-PEG4-NHS(69)，Biotin-PEG12-NHS(110))。

反应混合物接着室温暗处混合2小时。残留的活性生物素-NHS添加10μl的3M乙醇胺封闭并温育另外30分钟。

用Sphadex G25介质的凝胶过滤/缓冲液更换用于除去游离的生物素。对于较小体积的凝胶过滤可在小的一次性柱例如PD10(General Electric)中进行。重复该过程以尽可能多地除去游离的生物素，由于游离的生物素会竞争结合至试验线而降低所得应答。

胶体金包被的检测试剂的制备(根据RapidAssays说明)：

使用多克隆兔抗山羊-IgA(Acris Antibodies GmbH,Germany,no.AP05548PU-N)并以1mg/ml以上的浓度制备，并应在0.5×PBS缓冲液中。

使用裸金溶胶40nm和裸金溶胶20nm。

1.振荡或涡旋金以重悬任意沉降的金。将0.5ml裸金溶胶置于十个(10)干净的独立试管中。

2.用pH值(或1至10)从给定的pH图表标记各管：pH5.4、pH6.6、pH7.3、pH7.8、pH8.2、pH8.4、pH8.8、pH9.2、pH9.6、pH10.1。

3.使用pH图表以向各试管添加变化量的以微升计的缓冲液。振荡至混合。

4.将各管置于低速漩涡振荡器上并添加抗体溶液(参见样品制备部分)。充分混合(约2至3秒)。

理想地，对于40nm金，7μl的2mg/ml抗体溶液是最优的。对于20nm金，理想地，14μl的2mg/ml抗体溶液是最优的。

5.在某些管上的深紫色和/或黑色沉淀表明抗体或蛋白质在其等电点以下，导致单个金溶胶的交联。交联的溶胶不能够用于免疫测定并应丢弃。深紫色溶胶也通常最不活跃。仅具有浅紫色或无颜色变化的试管用于免疫测定。

6.允许反应持续总计30分钟。

7.通过添加50μl的封闭稳定剂溶液停止反应。

最好允许封闭剂室温反应额外16小时。

为了试验结合物反应的有效性，将10μl包被的金溶胶(在BSA封闭液(blocking solution)添加之前)与10μl的1M NaCl混合。不完全包被的溶胶将从溶液析出(变黑)，而完全包被的溶胶将保持稳定(红色)。

侧流测定接着用如上所述的试剂和根据制造商的gRAD装置(RapidAssays,Denmark)优化。将从山羊乳中纯化并用于路易斯糖基化分析的SIgA用于优化步骤。0.00mol非核心岩藻糖/mol分泌成分的SIgA用作阴性对照。作为阳性对照，使用具有预定的非核心岩藻糖基化的山羊SIgA(如果期望筛选包含具有至少0.01mol非核心岩藻糖/mol分泌成分的SIgA的乳，则将具有该糖基化量的SIgA制剂用作参考，例如实施例9的样品12，用于优化。作为基质，使用不具有路易斯糖基化的山羊乳。每ml基质添加50μg纯化的SIgA。这些混合物用作阳性和阴性样品用于试验优化。

为了大规模提供具有升高水平的非核心岩藻糖基化分泌性免疫球蛋白的乳，用所述测定试验潜在的乳源的非核心岩藻糖基化免疫球蛋白。

仅选择阳性(即超过阈值的非核心岩藻糖基化)样品用于合并。

实施例9:

显示主要的岩藻糖基化结构的山羊分泌成分的聚糖分析

山羊分泌成分的下列序列用于分析(SEQ ID 17)

MSRLFLACLLAVFPVVSMKSPIFGPKEVTSVEGRSVSITCYYPATSVNRHTRKYWCRQGATGRCTTLISSEGYVSDDYVGRANFPESGTFVVDISHLTRGRYKCGLGISSRGLNFDVSLEVSQDPAQASDAHIYPVDVGRTVTINCPFTSANSQKRKSLCKKTGQGCFLIIDSTGYKNENYEDRIRLNIAGTDTLVFSVVINRVLLSDAGTYVCQAGDDAKADKSNVYLQVLEPEPELVYRDLRSSVTFDCSLGPEVANTAKFLCQQKNGEACNVVINTLGKKAQDFQGRILFLPKDNGVFSVHIASLRKEDAGRYVCGGQPEGQPEKGWPVQAWELFVNEETAIPASPSVVKGVKGGSVTVSCPYNPKDANSAKYWCRWEEAQNGRCPRLVQSKGLVKEQYKGRLALLAQPGYTVILNQLTDQDAGFYWCVTDGDTSWTSTVQLKVVEGEPSLKVPKAWLGEAFKLSCHFPCKFYSFEKYWCKWSNEGCSPLPTQNDGPSQAFVSCDQNSQIVSLNLDTVTKEDEGWYWCGVKEGPRYGETAAVYVAVESRAKGSQDAKQVNAAPAGGAIESRAGEIQNKALLDPRLFVEEIAVKDAAGGPGAPADPGRPAGHSGSSK

(粗体字母表示N-糖基化位点。)

总糖基化

根据实施例11制备分泌性免疫球蛋白。纯化的分泌性免疫球蛋白通过还原SDS-PAGE(80×80×1mm,10％BisTris NuPAGE凝胶，MES SDS电泳缓冲液(Invitrogen))而分离成分泌成分、J链、H链和轻链。蛋白质带段通过考马斯染色而可视化。使用分子质量标准。约80kDa考马斯染色的带段切离并在凝胶内。在胰蛋白酶消化16小时及随后的硼氢化物还原之前使用PNGAseF直接从SDS page凝胶将聚糖从分泌成分释放(用胰蛋白酶的蛋白酶处理之后PNGAse F/A消化液残留未消化的糖基化位点(glycosite)Nr.4，因而会不完整)。聚糖分析根据PGC(多孔石墨碳色谱)和ESI-MS检测来完成。在注射至分析体系之前，使用来自产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的连接非特异性唾液酸酶将聚糖去唾液酸化并根据洗脱时间分析。具有非核心岩藻糖和核心岩藻糖的聚糖可分离并以完整聚糖的百分比表示。

糖肽分析

以相同的方式通过使用RP-ESI-MSMS分析糖基化位点。结构根据肽骨架洗脱并由于糖基化异质性而示出特定的质量分布。

肽和糖肽的分析在由Aquasil C-18预置柱(30mm×0.32mm,5微米，Thermo Scientific)、BioBasic C18分析柱(150mm×0.18mm,5微米，ThermoScientific)、Waters CapLC、Rheodyne10-口阀和具有标准ESI-来源的WatersQ-TOF Ultima组成的毛细管LC-ESI-MS体系上进行。溶剂A由pH 3.0的65mM甲酸铵组成，溶剂B为80％乙腈(ACN)在溶剂A中。预置柱在无ACN下平衡并负载。之后，6.3至62.5％的溶剂B的梯度显影45min。测量m/z 150至1800范围内的阳离子。毛细管电压为3.2kV，锥电压为35V，源温度100℃，去溶剂化温度120℃。

使用MassLynx 4.0软件评价数据，包括MaxEnt3去卷积/分离同位素特征(Waters)。糖基化肽通过利用PNGnase F(Roche)的去糖基化鉴定，并进一步在反相HPLC接着质谱中分离。去糖基化肽包含谷氨酸代替谷氨酰胺残基，这产生1Da的质量差。

一旦鉴定了糖基化峰，测量对应于特定糖肽物质的峰“体积”，即峰值面积。峰体积可直接翻译成糖型离子化的摩尔比例，因而糖肽的检测由肽部分控制。随鉴定的或潜在的糖肽的洗脱时间获得质谱并在将m/z与强度谱提交至软件用于分析之前求和、平滑化和质心化(centroided)。

为了增加低强度糖型的信噪比，推荐仅对相应的洗脱峰而不是较宽的色谱时间框的MS-谱求和。从发生特定糖基化位点的糖型的列表，计算岩藻糖基化聚糖的摩尔级分。添加不同位点的结果以获得发生在分泌成分中的岩藻糖基化聚糖的摩尔比例。

鉴定下列糖基化位点的肽：

糖基化位点1号ANLTNFPE(SEQ ID 18)82-89位

糖基化位点2号NDSGR(SEQ ID 19)103-107位

糖基化位点3号

LALLAQPGNGTYTVILNQLTDQDAGFYWCVTDGDTSWTSTVQLK(SEQ ID 20)412-455位

糖基化位点4号NVTAWLGE(SEQ ID 21)468-476位

虽然能够在分析步骤中检测糖基化位点1、2和4，但糖基化位点3号仍有待考察，也使用了其他蛋白酶和质谱。

下表示出各种山羊乳样品的分泌成分的非核心岩藻糖的摩尔含量。

表1：山羊分泌成分的非核心岩藻糖的分析(在糖基化位点1、2和4(每molSC的mmol))

实施例10:

细胞的细胞毒性测定

Vero细胞生长为成片的单层细胞(confluent monolayer)并通过温育1mMEDTA中的2ml的0.1％胰蛋白酶来继代培养。细胞计数并将6.25×10⁴细胞/ml接种至96孔板中，总体积为80μl。将板于37℃和5％CO₂中温育20-24h。艰难梭菌毒素A(List Biological Laboratories,Campbell,CA,USA,cat.no.152)用PBS(PAA,Austria)稀释至终浓度为0.2μg/ml并分别用人hSIgA(Sigma no.I1010)的稀释液温育，根据实施例11获得的牛SIgA(<10mmol非核心岩藻糖/mol)和山羊SIgA(样品6号<10mmol非核心岩藻糖/mol,样品12号>10mmol非核心岩藻糖/mol)在37℃下温育1h。人SIgA与等摩尔毒素相比以10倍摩尔过剩的量使用。牛和山羊SIgA等摩尔使用。牛血清白蛋白(New England Biolabs)和PBS(磷酸盐缓冲盐水)用作阴性对照。毒素A/抗体混合物以随机顺序加入96孔板并温育另外48。10μl WST-8(Sigma)加入各孔并将板在37℃下温育2-4h。活细胞经与细胞数成比例的脱氢酶还原产生水溶性黄色甲臜(formazan)染料。使用酶标仪(Infinity-1000)确定450nm的吸光度。各数据点进行三次。图16示出两个SIgA山羊样品、一个牛SIgA样品和作为对照的人hSIgA样品的结果。结果示出毒素A的中和水平在本测定中与各样品上非核心岩藻糖基化的量相关。

实施例11:

来自乳样品的分泌性免疫球蛋白的制备

本实施例描述了来自乳样品的分泌性免疫球蛋白的小试验规模制剂。

材料方法

乳清的制备

对于所有离心步骤，使用带有转子JLA10.500的Beckman-Coulter^TMAvanti J-25离心机。使用标称容积为0.5L的烧杯，但仅装至0.4L。

脱脂

脱脂通过在室温下在11827g(8000RPM)下离心30分钟来进行。上清液用于进一步制备。弃去丸粒(脂肪)。

酪蛋白酸沉降

酸沉降通过在恒定大力搅拌脱脂乳下缓慢加入5％HCl溶液直至获得pH4.6来进行。

沉淀去除

沉淀去除通过在室温下在14969g(9000RPM)下离心45分钟来进行。上清液用于进一步制备。弃去丸粒(脂肪)。

深层过滤

乳清使用蠕动泵(Watson-Marlow X-100)和无菌过滤单元(Sartorius-Stedim Sartobran P 0.45+0.2μm孔径；过滤面积0.1m²)来过滤。

超滤/渗滤

设备

Millipore Labscale^TM TFF系统

Millipore Cogent μScale TFF系统

过滤膜

GE Healthcare Kvick^TM Start 100kD 50cm²

GE Healthcare Kvick^TM Lab 100kD 100cm²

乳清的浓缩和渗滤

对于Millipore Labscale^TM TFF系统，3个膜用于乳清的超滤和渗滤，总膜面积为0.015m²。泵设置为2，调整跨膜压为约2.5。乳清浓缩约1:25，并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)渗滤，而浓缩的乳清用7倍过量的PBS缓冲液更换。

Millipore CogentμScale TFF系统：使用3个膜，总膜面积为0.03m²。泵设置为最大流量的40％，对应于大约150mL/min，跨膜压力为2.5bar。

渗透通量通过在不同的时间间隔称量渗透样品来测量。

准备SEC

Superose 6

使用装入HiScaleTM柱26/40的Superose 6预备级。床高为32.5cm，柱体积为173mL。流速为30cm/h(2.65ml/min)，样品体积为15mL，对应于柱体积(CV)的4.7％。从0.3CV至0.57CV进行分级，级分大小为5ml。平衡和电泳缓冲液为1×PBS。

Superdex 200

使用Superdex 200预备级HiLoadTM柱26/60。床高为59.7cm，柱体积为317mL。电泳条件与Superose 6所述的相同。

乳样品

牛和山羊乳由当地食物店获得，所有山羊乳清和山羊乳样品由(Untere Bergstrasse 1,3041Austria)获得。

分析SEC

将HP Chemstation 1100(Agilent)用于分析SEC。柱为Superose 6 10/300GL和Superdex 200 10/300GL，二者来自GE Healthcare。流速为0.5mL/min，注射体积为50μL。平衡和电泳缓冲液为1×PBS。UV信号在214nm下记录。

SDS-PAGE

样品添加终浓度200mM的DTT和NuPAGE LDS样品缓冲液(4×)，并煮沸10分钟。将样品上样至Tris-乙酸盐3-8％凝胶，电泳缓冲液为1×NuPAGE Tris-乙酸盐SDS电泳缓冲液。电泳条件为150V、最大安培、1.5小时。标记物(marker)为Invitrogen HiMark预染高分子量蛋白标准。蛋白质染色用考马斯蓝进行。

斑点印迹

5μl来自制备SEC电泳的部分样品施涂至硝基纤维素膜。风干样品后，将膜用3％BSA封闭1小时，并用含0.1％Tween 20的PBS缓冲液(洗涤缓冲液)洗涤3次。之后，将膜与特异性抗体-HRP结合物温育1小时。使用下列结合物：1)兔抗山羊-IgM-HRP，产品名称AAI45P；2)兔抗山羊-IgG(H/L)-HRP，产品名称5160-2504；3)兔抗山羊-IgA-HRP，产品名称AAI44P(AbD Serotec,Germany)。结合物原液用含1％BSA的洗涤缓冲液稀释1:30000-1:50000。用洗涤缓冲液洗涤3次后，用SuperSignal West Pico化学发光基质(Pierce,Germany)和来自Boehringer Mannheim的Lumi-ImagerTM扫描仪进行信号传递。

该过程的完整的质量平衡如3.4.1中所述建立并在表2中示出两个山羊乳样品(实施例9的样品编号11和12)。来自HPLC分析的所有峰谱去卷积至其个体免疫球蛋白。接着基于由制备运行数据获得的蛋白质的纯度和量来计算SIgA含量。来自文献数据的山羊乳IgA含量为30-80μg/ml。这些值充当计算理论产量的基线。

表2：样品11和12加工(processing)的质量平衡、产量和纯度

¹使用基于42％的样品体积的总IgA的理论量

实施例12:

DC-SIGN结合用ELISA

本实施例示出可筛选个体乳样品的分泌性IgA上的路易斯-特异性糖基化。凝集素DC-SIGN已知结合至路易斯血型结构并因而可用作筛选抗原。

筛选ELISA用于个体山羊乳样品中SIgA的DC-SIGN反应性

ELISA在96孔NUNC免疫板上进行。

包被：DC-SIGN-Fc融合蛋白(R&D Systems,no.161-DC-050；原液(Stocksolution)100μg/ml)在100μl/孔的新鲜包被缓冲液中1:100稀释，4℃温育过夜。用PBS-Tween洗涤3次，之后用PBS-Tween 300μl/孔室温温育30min。用PBS-Tween洗涤3次。

样品制备：新鲜取样10ml来自个体山羊的乳并在4℃下在40,000×g下离心30min。用软膏刀除去脂肪层；剩余的液体转移至新的离心管中并在40,000×g下再次离心30min。将液体层(乳清)等分并于-20℃保存或直接用于筛选。

作为阳性对照，使用浓度为5μg/mL的人hSIgA(Sigma no.I1010)。

最为阴性对照，使用山羊乳“Ja Natürlich”Ziegenmilch,Sennerei Zillertal,Austria。

以两种稀释度添加样品，1:2和1:10，在100μl/孔的结合缓冲液中稀释，室温温育2h。

用PBS-Tween洗涤3次后，将结合物添加至孔(100μl，兔抗山羊IgA-碱性磷酸酶结合物，abcam no.ab112864，在结合缓冲液中1:1000稀释)并在暗处室温温育1.5小时。

对于阳性对照，使用抗-人IgA-碱性磷酸酶(Acris no.R1342AP,1:1000)。随后用PBS-Tween洗涤孔3次。用100μl发色底物(colorigenic substrate)进行检测(1mg磷酸对硝基苯酯/ml染色缓冲液)，室温下温育。

30分钟后在酶标仪中405nm下测量板(参考波长620nm)。

包被缓冲液：0,42g Na₂CO₃+0,84g NaHCO₃+100ml A.D.,＝pH 9.7,4℃下保存，最多使用3天

封闭液/洗涤缓冲液100ml PBS+100μl Tween 20(＝0,1％),总新鲜(FRESH)

结合缓冲液：10g PVP+250μl Tween 20+0.1g MgCl₂+500ml PBS，调整pH至7.4

4℃保存，任选添加NaH₃防腐。

染色缓冲液：47.8ml二乙醇胺+3.3ml 75mM MgCl₂溶胶+448.9ml A.D.，调整pH至9.8(当紧急时，包被缓冲液可代替使用，但信号会减弱)，4℃保存，任选添加NaH₃防腐。

2个ELISA板的结果示于图17

ELISA数据的统计学评价(仅1:2稀释的OD(光密度)值用于示例评价)：

板A：

阴性对照的平均OD：0.082

阴性对照的标准差：0.061

阳性阈值(对照的平均值+3倍标准差)：0.265

阳性样品(超过阈值的OD)

样品41(1.041)

样品48(0.744)

样品56(0.691)

样品69(0.286)

板B：

阴性对照的平均OD：0.130

阴性对照的标准差：0.074

阳性阈值(对照的平均值+3倍标准差)：0.352

阳性样品(超过阈值的OD)

合并所有阳性样品。

DC-SIGN结合的阳性(对应于路易斯-糖基化)可由于这些动物与其它动物相比在种属、饲养、健康状况等方面的差异。

对于工业制备包含根据本发明免疫复合物的乳，个体动物以规律性间隔复检以便确保收集具有高非核心岩藻糖基化分泌性免疫球蛋白的乳。

产生DC-SIGN阳性ELISA结果的来自此类动物的乳单独收集并随后处理。只要来自个体的乳测试为阴性，随后，来自相应个体的乳不再用于制备包含路易斯-糖基化-富集的分泌成分和免疫复合物的乳的池。

当相对于每摩尔SC或SIgA至少10mmol非核心岩藻糖的样品用作参考时，可校准试验以确定高于或低于参考的水平。

实施例13

重组人SC与DC-SIGN的结合

为了示出重组SC的非核心岩藻糖基化的出乎意料的效果，通过转染SC的基因至适当的细胞中来生产蛋白质。如实施例2所述将图2的基因在HindIII和XbaI位点插入载体pCDNA3.1+(invitrogen,USA)进而插入CHO LEC11中(细胞系和转染技术根据Rittershaus等人，J Biol Chem.Vol.274,pp.11237-44)。

作为对照，根据Phalipon等人(2002,Immunity,Vol.17,pp107-115)的CHODUK-(ATCC CRL 9096)用作分泌成分基因的表达宿主。

CHO克隆的上清液在针对分泌成分和路易斯糖基化的ELISA中试验：

筛选在标准ELISA模式下进行。在100微升每孔下以1微克每ml包被缓冲液(3.03g Na₂CO₃，6.0g NaHCO₃于1000ml蒸馏水中，pH 9.6)的浓度用抗人-分泌成分抗体(Ray Biotech no.DS-PB-03010,USA)包被细胞培养上清液ELISA板(Nunc Maxi-Sorp Immuno Plate)。

用盖子封闭板并在4℃下温育过夜。

再次如上所述洗涤板。

洗涤后，将100微升在TPBS中1:100稀释的抗-唾液酸化路易斯x-抗体(Merck Millipore,MAB2096)加入至各样品孔以及阴性和阳性对照样品孔。

将板再次室温温育2小时，随后洗涤。

可示出在LEC11中表达的重组人SC展示唾液酸化-路易斯x。相反，在正常CHO(CHO DUK-)中表达重组SC不显示任何非核心岩藻糖基化。

纯化：

来自动物细胞和分泌性IgA的重组分泌成分的纯化通过亲和色谱利用偶联琼脂糖凝胶的兔抗人分泌成分根据亲和色谱的标准实验步骤进行。

去唾液酸化：

100微克重组SC于37℃、pH 6.0下在0.1个单位的唾液酸酶A(Prozyme,Cat.no.GK80040)在50mM磷酸钠缓冲液的30微升反应体积中去唾液酸化8小时。

根据制造商经PD SpinTrap G-25(GE Healthcare,cat.no.28-9180-04)脱盐后，重组SC蛋白在结合DC-SIGN用ELISA中检测。

DC-SIGN ELISA

ELISA在96孔NUNC免疫板中进行。

包被：DC-SIGN-Fc融合蛋白(R&D Systems,no.161-DC-050；原液100μg/ml)在新鲜包被缓冲液(0,42g Na₂CO₃+0,84g NaHCO₃+100ml A.D.,＝pH 9.7，于4℃保存，使用最多3天)中1:100稀释。

包被以100μl/孔添加，温育在4℃过夜进行。

用PBS-Tween洗涤3次，之后用PBS-Tween 300μl/孔室温温育30min。用PBS-Tween洗涤3次。

样品：

用CHO DUK-细胞以及CHO LEC11生产的重组SC制剂，分别在唾液酸酶处理前后以1微克/ml的初始浓度，在结合缓冲液中连续稀释(1:5步)。100μl各稀释液二份添加至包被板并室温温育2h。

用PBS-吐温洗涤3次后，将结合物添加至孔(100μl抗-人SC-HRP结合物Acris no.AP21476HR-N，在结合缓冲液中1:1000稀释)并室温温育1.5小时。

随后用PBS-Tween洗涤孔3次。然后用基质缓冲液(TMB基质试剂盒；Vector Laboratories no SK-4400,USA)进行另外的洗涤步骤。之后，添加显色底物(Vector Laboratories SK-4400)。短暂温育后添加50微升的1N硫酸，并在酶标仪中在OD450下读取板，如在标准ELSA技术中的利用TMB作为底物由OD600补偿。

封闭液/洗涤缓冲液：100ml PBS+100μl Tween 20(＝0,1％)

结合缓冲液：10g PVP+250μl Tween 20+0.1g MgCl₂+1mM CaCl₂+500ml PBS，调节pH至7.4

PBS为含1mM Ca的磷酸盐缓冲盐水

4℃下保存，任选添加NaH₃防腐

可示出，来自CHO LEC11的去唾液酸化的重组SC与CHO CHO DUK-中产生的去唾液酸化分泌成分以及CHO LEC11中表达的唾液酸化SC相比较强地结合至DC-SIGN。

Claims

1.一种生产以分泌性免疫球蛋白为基础的免疫复合物制剂的方法，所述免疫复合物制剂为非人分泌物来源的，所述方法包括

-提供能够生产N-糖基化分泌成分的工业规模的生产体系，

-通过此类体系生产分泌成分，所述分泌成分包括相对于每摩尔分泌成分为至少0.01mol的非核心岩藻糖，和

-将所述分泌成分与具有天然糖基化模式的IgA或IgM免疫球蛋白的至少之一相结合，从而获得免疫复合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述分泌成分源自哺乳动物来源的氨基酸或核苷酸序列或其嵌合序列，所述哺乳动物来源具体为人、牛、山羊、绵羊、非人灵长类动物、猪、骆驼、单峰驼、驴或马。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述生产体系选自乳腺分泌物和重组细胞培养物的合并来源。

4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中所述分泌成分富集在所述生产体系的级分中，优选作为免疫复合物，且任选地从所述级分分离。

5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中所述分泌成分由选自由源自至少10个泌乳期雌性个体的乳、乳浓缩物、乳粉、乳清、乳清浓缩物和乳清粉组成的组的合并来源获得。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述个体为非转基因的且为选自由山羊、猪、牛、绵羊、马、驴、单峰驼和骆驼组成的组的物种。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述个体选自能够生产具有路易斯型N-糖基化的糖蛋白的种群。

8.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中所述分泌成分由表达其中x为2、3或4的自身或异源功能性α-1,x-岩藻糖基转移酶的重组生产型宿主细胞系获得，所述重组生产型宿主细胞系优选选自由人细胞系、哺乳动物细胞系、鸟类细胞系、细菌、植物、酵母、昆虫、真菌、苔藓和古菌组成的组。

9.一种分离的重组的分泌成分，其包括氨基酸序列SEQ ID 1，或其功能性活性变体，所述分泌成分具有路易斯型N糖基化模式和相对于每摩尔分泌成分为至少2mol的非核心岩藻糖。

10.根据权利要求9所述的分泌成分，其包括唾液酸，优选相对于每摩尔分泌成分为至少2mol的唾液酸。

11.根据权利要求9所述的分泌成分，其为非唾液酸化的，优选包括相对于每摩尔分泌成分为小于0.1mol的唾液酸。

12.一种免疫复合物制剂，其包括根据权利要求9至11任一项所述的分泌成分，和IgA或IgM免疫球蛋白的至少之一，优选人免疫球蛋白。

13.根据权利要求12所述的免疫复合物制剂，其中所述免疫球蛋白为血浆免疫球蛋白。

14.一种免疫复合物制剂，其以分泌性免疫球蛋白为基础，源自除人分泌物以外的其它来源，所述免疫复合物制剂包括

-分泌成分，其具有路易斯型N糖基化模式和相对于每摩尔分泌成分为至少0.01mol的非核心岩藻糖，和

-具有天然糖基化模式的IgA或IgM免疫球蛋白的至少之一。

15.根据权利要求14所述的制剂，其包括多聚免疫球蛋白。

16.根据权利要求14或15所述的制剂，其包括多反应性免疫球蛋白，优选天然抗体。

17.一种制剂品，其以液剂、乳剂或悬浮剂的形式或以优选喷雾干燥或冷冻干燥的干燥形式，所述制剂品包括根据权利要求9至11任一项所述的分泌成分或根据权利要求12至16任一项所述的制剂。

18.根据权利要求17所述的制剂品，其以液剂、糖浆剂、锭剂、片剂的形式，例如泡腾片剂、喷雾剂、吸入器制剂品、粉剂、速溶粉、颗粒剂、栓剂、胶囊剂、霜剂、糊剂、凝胶剂、滴剂、悬浮剂、乳剂或食品，所述食品包括乳制品和口香糖。

19.根据权利要求17或18所述的制剂品，其用作食品和/或用于治疗用途。

20.一种配制剂，其包括根据权利要求9至11任一项所述的分泌成分、根据权利要求12至16任一项所述的制剂、或根据权利要求17至19所述的制剂品，所述配制剂用于治疗或预防粘膜免疫球蛋白缺陷，优选以用于粘膜应用的制剂品，优选口、支气管、鼻、阴道、胃内或直肠使用。