JP6235755B2 - 高いカーゴ対サーファクタント比を有するサーファクタント除去ミセル組成物 - Google Patents

高いカーゴ対サーファクタント比を有するサーファクタント除去ミセル組成物 Download PDF

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Description

本発明は、国立衛生研究所によって付与された許可番号OD017898の下で政府支援を受けて発明された。政府は、この発明に所定の権利を有する。
この出願は、2014年7月2日に出願された米国仮出願62/020,249及び2014年7月2日に出願された米国仮出願62/020,233に基づく優先権を主張し、それらの開示は参照により本明細書中に包含される。
生物系への輸送のための疎水性分子の封入又は隔離は、幅広い関心と研究のトピックである。疎水性薬物は、現在使用されている全医薬品のかなり大きな割合を占める。これらの薬物は、水への溶解度が低い。正確な投薬が要求される用途に対して、経口送達は、変動する生物学的利用率をもたらしうる。ある場合には、非経口投与は好ましいルートである。ある場合には、疎水性薬物は、溶液のｐＨを変えることによって、又は適切な塩を添加することによって水溶液中にうまく存在するかもしれない。他の場合では、デキストリンや脂質のような少量の可溶化賦形剤で足りる。しかしながら、溶解がより困難な多くの化合物については、他の賦形剤戦略が必要である。これらは、しばしば、サーファクタントと非水溶媒から形成された製剤を含む。Cremophor ELやPolysorbate-80のような非イオン性サ−ファクタントは、非経口製剤のために一般的に使用されているが、アナフィラキシー性過敏症や神経毒性を含むネガティブな副作用を引き起こし得る。非水溶媒は溶血を、且つオイルの場合は、肺微小塞栓症を引き起こす可能性がある。注射製剤については、中性のｐＨ、水中の等張液が好まれる。これらの問題を迂回する新しい薬物送達システムは、次世代製剤を生み出す見込みがあり、実際に臨床に向けて徐々に実現性が高まっている。しかしながら、今日までに報告されている多くの薬物送達システムは、相対的に多量の賦形剤を用いて形成されており、それにより、副作用及び未知の長期間安全性プロフィールをもたらす可能性がある。したがって、現在のナノ粒子送達システムの質量又はモルによる薬物-対-賦形剤の比は、サーファクタント溶液に比べて有意に優れていない可能性があり、それは典型的には１：１０の質量比(薬物：賦形剤)に近い。別の薬物送達システムの臨床での採用は、製剤の複雑性と、低い薬物充填能力の両方により制限されている。
疎水性分子は良く造影剤としても使用されている。消化管の造影は、診断で使用されている。しかしながら、Ｘ線照射、磁気共鳴及び超音波に基づくモダリティは、安全性、到達性又は十分なコントラストの欠如に関する制限に悩まされている。例えば、動的腸管処理の機能的腸管イメージングは、既存の方法を使用して実用化されていない。
本開示は、疎水性物質が、ブロック共重合体(例えば、ポロクサマー(poloxamer)、商品名プルロニック(Pluronic)[登録商標]で入手可能なものなど)のようなサーファクタントと接触した際、ミセルに自己組織化すること、及び、低温処理により、ポロクサマーのほとんど又は全てを取り除くことが可能になり、結果的に、全て又は本質的に全ての残りのポロクサマー分子が、サーファクタント除去-疎水性物質-含有ミセル中に存在する組成物をもたらすという我々の観察に基づいている。これは、高い疎水性物質濃度及び高い疎水性物質-対-サーファクタント・モル比を有するミセル組成物を可能にする。
我々の研究に基づいて、本開示は、疎水性物質-含有(負荷：loaded)ミセルの一部ではないサーファクタントが除かれたミセル製剤に関する組成物と方法を提供する。疎水性物質は、本明細書中で疎水性カーゴ(cargo：積荷)とも称される。前記組成物において、サーファクタント(ポロクサマーなど)は実質的に全てミセル中に存在し、遊離のサーファクタントはほとんど存在しないか、全く存在しない。本開示は、前記組成物を調製する方法及び前記組成物を使用する方法も提供する。
疎水性物質は、生体系中に輸送されることが望まれるいかなる疎水性分子であってもよい。例えば、疎水性物質は、所望の部位に送達されてもよく(その部位での放出のために)、又は放出されることなく、ある部位を通って運ばれてもよい(例えば、イメージング目的のために使用される場合)。一実施形態では、疎水性物質は、薬物である。一実施形態では、疎水性物質は、光学的画像造影剤である。様々な実施形態において、前記組成物は、疎水性薬物-含有ミセル及び／又は疎水性の光学的造影剤(色素)-含有ミセルを含むか、本質的にそれらからなるか、又は、それらのみからなる。
低温処理は、非会合ポロクサマー(温度を下げた際、疎水性物質-含有ミセルに関与しないポロクサマー)の実質的に全てを除去する。例えば、当初のサーファクタントの、８５％以上、９０％以上、９９％以上、又は９９．９％以上が除去される。残りのポロクサマーは、ミセルに存在している。
これらの組成物は、高い安定性と高い負荷(積込)量を示す。最終組成物の疎水性物質：ポロクサマーのモル比は、３：１以上である。例えば、疎水性物質が薬物である場合、我々は、５５：１という高い疎水性物質：ポロクサマーのモル比を観察し、これは他の可溶性賦形剤(典型的に１：１０の範囲にある)を使用する既存の臨床製剤と比べて桁違いに大きい。一実施例において、疎水性物質が薬物である場合、我々は、７：１の薬物：ポロクサマーのモル比を観察した。一実施形態では、本組成物は、６０：１の疎水性薬物：ポロクサマー比を有する。
本ミセル組成物を作るのに適切なサーファクタントは、ブロック共重合体(例えば、ポロクサマー)を含む。一実施形態では、ミセルは、唯一のサーファクタント分子としてポロクサマーから形成され、且つミセルは疎水性物質を含む。一実施形態では、前記サーファクタントはブロック共重合体であり、前記ブロック共重合体は、少なくとも１つの親水性ブロックと１つの疎水性ブロックを含んでいる。一実施形態では、前記ブロック共重合体は、ポロクサマー等のトリブロック共重合体である。前記組成物は、非会合(非関与)サーファクタント分子を実質的に含まない。「非会合サーファクタント分子」という用語又は特定のサーファクタントを指す対応する用語(例えば、「非会合ポロクサマー分子」又は「非会合ポロクサマー127分子」)は、いったん温度を下げると(例えば、室温未満、例えば、１０℃〜−２０℃)ミセルの一部ではなくなるサーファクタント分子を指す意味で用いられる。非会合サーファクタント分子は、互いにゆるく会合している、ユニマー形状(unimeric form)のサーファクタント分子であってもよく(まとめて「遊離(フリー)の」サーファクタント)、又は空のミセル−すなわち、その中に疎水性物質の分子が取り込まれていないミセル−を形成してもよい。非会合サーファクタントの検出は、膜ろ過や透析などのプロセスでごく少量のユニマーのサーファクタントからミセルを分離し、ポロクサマー検出用の比色分析チオシアン酸コバルト法のような当該分野で既知の標準的な分析法により非会合サーファクタントを検出することによって、可能である。
これらのミセルは、他の賦形剤なしで、非経口投与のための溶液中で調製できる。又は、これらのミセルは、クエン酸塩やリン酸塩などのｐＨバッファー及び生理食塩水やスクロースような張性をコントロールするための成分を含む溶液中に存在することができる。ミセルは、水中又は４Ｍ以下のＮａＣｌを含む高張食塩水中で保存することができる。前記高張食塩水は、投与前に希釈されてもよい。前記ミセル組成物は、さらなる薬学的に許容されるキャリア(糖、スターチ、セチルアルコール、セルロース、粉末トラガント、麦芽、ゼラチン、タルク、オイル、グリコール、モノオレイン酸グリセロール、ポリオール、ポリエチレングリコール、エチルアルコール、さらなる乳化剤などを含む)と共に処方されてもよい。
本開示は、前記非会合サーファクタント除去組成物を作る方法も提供する。前記方法は、クロロホルムや塩化メチレン又は他の有機溶媒(例えば、エタノール、メタノール、テトラヒドロフランなどを含む)のような有機溶媒中に溶解した疎水性物質の分子を、サーファクタント分子(例えば、ポロクサマー分子)と接触させ、ミセルを形成することを含み、当該ミセルの少なくとも一部はその中に取り込まれた疎水性物質分子を含む。その後、有機溶媒の蒸発又は部分蒸発(能動的な又は受動的な)が続き、疎水性物質-含有ミセルに関与していないサーファクタント分子の除去が続く。一実施形態では、非会合サーファクタント分子は、非会合サーファクタント分子の全て又は本質的に全てがユニマーになるように温度を低下させ、続いてユニマーのサーファクタント分子を除去することによって(例えば、膜ろ過プロセスのようなろ過プロセスによって)除去される。低温処理は、全ての検出可能な非会合サーファクタントが除去されるまで、所望の程度繰り返される又は続けられる。サーファクタントがもはやミセルから除去できなくなると、そのミセルは、実質的に非会合サーファクタント分子を含んでいない。得られた組成物は、本明細書中で「ss-infroms(surfactant-stripped induced“frozen”micelles)」と呼ばれるミセルを含む。前記組成物は、そのまま使用されてもよく、濃縮されてもよい。例えば、疎水性物質-含有ミセルは、最大で物質濃度１５０ｍｇ／ｍＬまで濃縮されてもよい。
ある場合には、疎水性物質-含有ミセルは、高張塩溶液を使用して、ビタミンＥ又はコエンザイムＱ１０を共負荷(共積込)して、又は関心のある薬物を十分に疎水性にするための脂肪エステル化を使用して形成してもよい。ビタミンＥ又はコエンザイムＱ１０の共負荷は、安定性又は他の負荷疎水性物質を改良するために、ミセル中にそれらの物質を取り込むことを伴う。高張食塩水の役割は、ミセル外の溶液をよりイオン性にすることであり、それはミセル内に疎水性分子を追い込む効果がある。
用語「サーファクタント除去により生じた凍結ミセル(ss-infroms)」、ナノ粒子、又はミセルは、互換的に使用できる。一実施形態では、前記ミセルは疎水性の光学造影剤(色素)を負荷され、前記ss-infromsはナノナップ(nanonaps)とも称される。
一実施形態では、本開示の組成物は、サイズ(ミセルの直径を指す)１５〜２５０ｎｍ(及びその間の全ての整数のナノメートル値)のミセルを複数含む。一実施形態では、前記サイズは２０〜１２０ｎｍである。一実施形態では、前記ミセルの少なくとも８０〜９０％(及びその間の全ての整数のパーセント値)は、２０〜１００ｎｍ又は２０〜１２０ｎｍ(及びその間の全ての整数のナノメートル値)の範囲内にある。
疎水性カーゴの選択次第で、これらの組成物は、例えば、薬物送達及びイメージングを含む様々な用途に有用である。マウスに投与した際、本開示のミセル組成物は、インビボで安全性と有効性を示した。
一実施形態では、本開示は、ミセルを含む水性組成物を提供し、前記ミセルはポロクサマーを含んでおり、且つその中に疎水性物質を取り込んでおり、それにより疎水性物質-含有ポロクサマーミセルを形成しており、当該組成物中での疎水性物質：ポロクサマーのモル比は、少なくとも２：１又は３：１であり、組成物中のポロクサマーの少なくとも９０％又は９５％は、疎水性物質-含有ミセルを形成している。一実施形態では、ミセルを形成する唯一のサーファクタントは一種又は複数種のポロクサマーであり(例えば407、338又は188、これらはそれぞれプルロニックF127、F108又はF68としても知られ、本明細書中でそれぞれ、F127、F108又はF68と称される)、且つ前記ミセルはカーゴとしてその中に疎水性物質を取り込んでいる。前記ポロクサマーは、単一種のポロクサマーであってもよく、２種以上のポロクサマーであってもよい。一実施形態では、製剤中のポロクサマー分子の少なくとも９６、９７、９８又は９９％がミセルとして存在し、当該ミセルは、その中にカーゴとして疎水性物質を包含している。ミセル中へのポロクサマーの取り込みは、温度を−２０〜１０℃に低下させ(非会合ポロクサマーをユニマーにする)、膜分離技術により疎水性物質-含有ミセルを分離して、非会合ポロクサマーの量を量ることによって定量化されてもよい。疎水性物質が治療薬などの薬物の場合、薬物：ポロクサマーのモル比は、７：１〜５５：１又は７：１〜６０：１であってもよい。疎水性物質カーゴがイメージング用造影剤(色素)の場合、色素：ポロクサマーのモル比は、３：１〜１０：１であってもよい。一実施形態では、前記疎水性物質は、少なくとも３、又は３〜１０の、オクタノール-水分配係数(ＬｏｇＰ値)を有することを特徴とする。
本開示は、本組成物を製造する方法を提供し、当該方法は、有機溶媒に溶解した疎水性物質(例えば、ｘモル)をポロクサマー(例えば、ｙモル)の水溶液と接触させ、それにより疎水性物質-含有ポロクサマーミセルを形成すること；疎水性物質-含有ミセルを形成していないポロクサマー分子を単一(ユニタリー)のポロクサマー単位にすること；を含む。ｘとｙは、所望により選択することができる。一実施形態では、ｘ：ｙの比は、０．１：１〜２：１である。単一のポロクサマー分子の形成は、前記組成物を、ポロクサマーのＣＭＴ温度にあるいはＣＭＴ未満にすることによって誘発することができる。様々な実施形態において、低下後の温度は、０℃〜２５℃：０℃〜２０℃；０℃〜１５℃；０〜１０℃であり、高張食塩水の場合―２０℃〜０℃であり、ポロクサマー除去-疎水性物質-含有ミセル組成物をもたらすために単一のポロクサマー単位が取り除かれ、ポロクサマー分子の出発量の少なくとも８５％が除去され、疎水性物質：ポロクサマーのモル比は３：１〜５５：１となり、組成物中の９０％以上(例えば、９５、８６、９７、９８又は９９％、あるいは９９．５、９９．９又は１００％)のポロクサマーが、疎水性物質-含有ミセル中に存在する。前記組成物は、製造してすぐ使用されてもよく、後で使用するために保存されてもよい。前記組成物は、粉末又は凍結乾燥形態で保存されてもよく、後に水性媒体で再構成されてもよい。
本開示は、薬物送達方法も提供し、当該方法は、実質的に非会合ポロクサマーを含まない(すなわち、ポロクサマーの少なくとも９０％が疎水性カーゴ含有ミセルとして存在する)、本明細書に記載された疎水性薬物含有ミセル組成物を準備すること；所望の部位に輸送されるように前記組成物を個体に投与すること；を含む。一実施形態では、本開示はイメージング法(例えば、消化管の)を提供し、当該方法は、実質的に非会合ポロクサマーを含まない(すなわち、ポロクサマーの少なくとも９０％が疎水性色素-含有ミセルとして存在する)、本明細書に記載された疎水性造影剤-含有ミセル組成物を準備すること；組成物が消化管(胃腸管)に輸送され、消化管を通過するように前記組成物を個体に投与すること；管を通じて組成物が運ばれているときに消化管を画像化すること；を含む。画像化は投与直後に行われてもよく、且つ所望の期間にわたって行われてもよく、又は投与から所定の時間経過後に開始されてもよい。薬物送達の目的のために、一例として、前記組成物は、静脈内、腹腔内、筋肉内、局所的、皮下内又は粘膜による送達によって投与されてもよい。消化管イメージングなどの画像化目的のために、前記組成物は経口ルートで投与されてもよく、及び、他の画像化目的のために、前記組成物は、静脈内、腫瘍内、腹腔内、皮下内、皮内又は筋肉内送達によって投与されてもよい。
［図１］遠心ろ過による洗浄後のサーファクタント保持率。サーファクタントの10％(w/v)溶液を、表記温度で回転し、残余分中のサーファクタントを、1,6-ジフェニル-1,3,5-ヘキサトリエン蛍光法と検量線を使用して評価した。
［図２］低温遠心ろ過後に保持され可溶化されているオクタブトキシ-ナフタロシアニンの色素吸光度。サーファクタントの10％(w/v)溶液を、色素を溶解するために使用し、その後３回の遠心ろ過洗浄にかけた。可溶性残余分の吸光度を860 nmで測定した。
［図３］ビタミンＫ・ss-infromsの生成。ａ)ビタミンＫを塩化メチレン中に溶解し、F127の10％(w/v)溶液に添加した。有機溶媒の蒸発に続いて、溶液を低温遠心ろ過洗浄にかけ、残余分中の薬物とプルロニックの量を測定した。ｂ)ビタミンＫ-infromsの吸収スペクトルと写真(挿入図)。ｃ)ビタミンＫ-infromsのサイズ分布。ｄ)F68、F127を用いて形成された精製ビタミンＫ-infroms、及び市販されている混合ミセル臨床製剤のモル比の比較。
［図４］シクロスポリンＡ・ss-infromsの塩を使った生成。ａ)シクロスポリンＡを塩化メチレン中に溶解し、表示量の塩を含むF127の10％(w/v)溶液に添加した。有機溶媒の蒸発に続いて、溶液を低温遠心ろ過洗浄にかけ、薬物収率を測定した。ｂ)洗浄工程(1 M NaCl中)の間のシクロスポリンとプルロニックの保持率。ｃ)シクロスポリン-infromsのサイズ分布。ｄ)シクロスポリン-infromsの吸収スペクトル。
［図５］フルベストラント・ss-infromsの生成。ａ)フルベストラントを塩化メチレン中に溶解し、F127の10％(w/v)溶液に添加した。有機溶媒の蒸発に続いて、溶液を低温遠心ろ過洗浄にかけ、各洗浄工程における薬物とプルロニックの量を測定した。ｂ)フルベストラント-infromsの吸収スペクトル。
［図６］アミオダロン・ss-infromsの生成。ａ)アミオダロンを塩化メチレン中に溶解し、表示量のNaClを含むF127の10％(w/v)溶液に添加した。有機溶媒の蒸発に続いて、溶液を低温遠心ろ過洗浄にかけ、薬物収率を測定した。ｂ)洗浄工程(1 M NaCl中)の間のアミオダロンとプルロニックの保持率。ｃ)アミオダロン-infromsの吸収スペクトル。ｄ)アミオダロン-infromsのサイズ分布。
［図７］イベルメクチン・ss-infromsの生成。ａ)イベルメクチンを塩化メチレン中に溶解し、10％(w/v)溶液に添加した。有機溶媒の蒸発に続いて、溶液を低温遠心ろ過洗浄にかけ、薬物収率を測定した。ｂ)イベルメクチン-infromsの吸収スペクトル。ｃ)イベルメクチン-infromsのサイズ分布。
［図８］ウンデカン酸テストステロン・ss-infromsの生成。ａ)ウンデカン酸テストステロンを塩化メチレン中に溶解し、F127の10％(w/v)溶液に添加した。有機溶媒の蒸発に続いて、溶液を低温遠心ろ過洗浄にかけ、残余分中の薬物とF127の量を測定した。ｂ)ウンデカン酸テストステロン・ss-infromsの吸収スペクトル。
［図９］コレカルシフェロール・ss-infromsの生成。ａ)コレカルシフェロールを塩化メチレン中に溶解し、F127の10％(w/v)溶液に添加した。有機溶媒の蒸発に続いて、溶液を低温遠心ろ過洗浄にかけ、残余分中の薬物とF127の量を測定した。ｂ)コレカルシフェロール・ss-infromsの吸収スペクトル。
［図１０］パルミチン酸レチノール・ss-infromsの生成。ａ)パルミチン酸レチノールを塩化メチレン中に溶解し、F127の10％(w/v)溶液に添加した。有機溶媒の蒸発に続いて、溶液を低温遠心ろ過洗浄にかけ、残余分中の薬物とF127の量を測定した。ｂ)パルミチン酸レチノール-infromsの吸収スペクトル。100 mgのパルミチン酸レチナールを1 mLの塩化メチレン(DCM)中に溶解し、2 MのNaClを含む10 mLの10％(w/v)F127に添加し、有機溶媒が蒸発するまで撹拌した。非取込み型F127の除去プロセスは、ぜん動ポンプ(Masterflex L/S)とチューブ(masterflex 6434-16)を備えた膜ろ過(Sartorius vivaflow, 1501008VS)によって行った。除去プロセスは、−７℃で行い、2 M NaCl溶液を透析ろ過(ダイアフィルトレーション)溶液のために使用した。F127除去パーセンテージを最大にするために、膜モジュール、チューブ及び洗浄される溶液を、エチレングリコールとエタノール(v/v＝9：1)の混合物中に浸漬し、ドライアイスを冷却剤として使用した。
［図１１］テムシロリムス・ss-infromsの生成。ａ)テムシロリムスを塩化メチレン中に溶解し、F127の10％(w/v)溶液に添加した。有機溶媒の蒸発に続いて、溶液を低温遠心ろ過洗浄にかけ、残余分中の薬物とF127の量を測定した。ｂ)テムシロリムス-infromsの吸収スペクトル。
［図１２］ミフェプリストン・ss-infromsの生成。ａ)ウンデカン酸テストステロンを塩化メチレン中に溶解し、F127の10％(w/v)溶液に添加した。有機溶媒の蒸発に続いて、溶液を低温遠心ろ過洗浄にかけ、残余分中の薬物とF127の量を測定した。ｂ)ウンデカン酸テストステロン・ss-infromsの吸収スペクトル。
［図１３］レチノール・ss-infromsの生成。ａ)レチノールを塩化メチレン中に溶解し、F127の10％(w/v)溶液に添加した。有機溶媒の蒸発に続いて、溶液を低温遠心ろ過洗浄にかけ、残余分中の薬物とF127の量を測定した。ｂ)レチノール・ss-infromsの吸収スペクトル。
［図１４］コエンザイムＱ１０・ss-infromsの生成。ａ)コエンザイムＱ１０を塩化メチレン中に溶解し、F127の10％(w/v)溶液に添加した。有機溶媒の蒸発に続いて、溶液を低温遠心ろ過洗浄にかけ、残余分中の薬物とF127の量を測定した。ｂ)コエンザイムＱ１０・ss-infromsの吸収スペクトル。
［図１５］ビタミンＥ共負荷によるタキサン-infrom製剤の強化。ドセタキセル又はパクリタキセルを、表示量のビタミンＥ(αトコフェロール)とともに、塩化メチレン中に溶解し、F127の10％(w/v)溶液に添加した。有機溶媒の蒸発に続いて、可溶化されたタキサンの吸光度を測定するために、溶液を遠心分離にかけた。
［図１６］コエンザイムＱ共負荷によるタキサン-infrom製剤の強化。ドセタキセル又はパクリタキセルを、表示量のコエンザイムＱ１０とともに、塩化メチレン中に溶解し、F127の10％(w/v)溶液に添加した。有機溶媒の蒸発に続いて、可溶化されたタキサンの吸光度を測定するために、溶液を遠心分離にかけた。
［図１７］ＯＮｃ疎水性色素の低温(４℃)洗浄(サーファクタント除去をもたらし、高度に濃縮されたＯＮｃ・ss-infromsを産生する)に対する、サーファクタントのプルロニック・ファミリーの適合性。
［図１８］ａ)低温透析ろ過の間、遊離F127は取り除かれ、一方でビタミンＫ１は完全に保持される。ｂ)ビタミンＫ１・ss-infromsの透過型電子顕微鏡写真。ｃ)サーファクタント除去プロセスが、全ての遊離F127を取り除いたこと(ミセル形成中に伝達された熱によって示唆される)を示す示差走査熱量測定。ｄ)ビタミンＫ１とともに共負荷された少量の疎水性フルオロフォアのミセルに基づく、フェルスター共鳴エネルギー転移(FRET)アッセイであって、カーゴが、サーファクタント除去の前後で、ミセル間交換(inter-micellar exchange)なしに、動力学的凍結ミセル中に閉じ込められていることを明らかにする。ｅ)ビタミンＫ１・ss-infromsは、臨床製剤と比較して、高い薬物-対-可溶化剤・モル比を示す。ｆ)ビタミンＫ１・ss-infromsは、マウスに経口投与されたワルファリンの効果に対抗するのに効率的に働く(血液凝固時間に基づく)。
［図１９］ビタミンＫ１洗浄プロセスの間に、全ての遊離F127は残余分から取り除かれる(ろ液中に流れ出た検出可能なサーファクタントの非存在に基づく)。
［図２０］ａ)高張食塩水は、シクロスポリン-含有ミセルの収率を増加させる。ｂ)F127は、低温で効率的に除去可能である。ｃ)サーファクタント除去シクロスポリンミセルは、臨床製剤と比較して、高いモル比を示す。ｄ)シクロスポリン含有サーファクタント除去ミセルは、免疫抑制剤として効率的に使用できる。
［図２１］ａ)高張食塩水は、塩によりウンデカン酸テストステロン(T-undec)負荷ミセルの収率を向上させる。ｂ)ウンデカン酸テストステロン・ss-infromsは臨床製剤と比較して、高いモル比を示した。
［図２２］ａ)塩はカバジタキセル(ＣＴＸ)-infromsの収率を増加させる。ｂ)コエンザイムＱ１０は、希釈時にＣＴＸ-infromsの安定性を改善する。ｃ)ＣＴＸ・ss-infromsは、臨床製剤と比較して高いモル比を示した。ｄ)ＣＴＸ含有サーファクタント除去ミセルは、２回の静脈注射(０日目と４日目に30 mg/kg：矢印で記す)によって、ヌードマウスの皮下MIA Paca-2腫瘍を効率的に治癒した。
［図２３］非交換性F127-ナフタロシアニン凍結ミセルの形成。ａ)10％(w/v)F127の水溶液に添加され、その後２４時間、20 mMのコール酸塩に対して透析された、疎水性の異なる色素の保持率。ＭＢ＝メチレンブルー, ＱＲ＝キナルジンレッド, ６Ｇ＝ローダミン６Ｇ, ＩＲ７８０＝ＩＲ７８０ヨウ素。
ｂ)使用したナフタロシアニンの化学構造。ＢＮｃ：X1＝2H；X2＝t-Bu；X3,X4＝H. ＶＢＮｃ：X1＝V＝O；X2＝t-Bu；X3,X4＝H. ＺｎＢＮｃ：X1＝Zn；X2＝t-Bu；X3, X4＝H；ＯＮｃ：X1＝2H；X2＝H；X3,X4＝O-(CH2)3CH3
フタロシアニンは外側のベンゼンを欠く：ＢＰｃ：X1＝2H；X2＝t-Bu；X3,X4＝H. ＶＢＰｃ：X1＝V＝O；X2＝t-Bu；X3＝N(CH3)2, X4＝H
［図２４］サーファクタント-フリー・ナノナップを産生するための温度媒介性ＣＭＣスイッチング。ａ)精製ナノナップの産生。F127のPEOブロックとPPOブロックは、ストランドとして示され、 Ｎｃ色素は塗りつぶされた閉鎖構造で示される。ｂ)４℃(黒)及び２５℃(赤)での遠心ろ過洗浄の関数としてのF127保持率。ｎ＝３での平均値±標準偏差。ｃ)Ｎｃ(黒)及びメチレンブルー(赤)についての、４℃での遠心ろ過洗浄の関数としてのF127-可溶化色素保持率。ｎ＝３での平均値±標準偏差。ｄ)水中での動的光散乱によるナノナップのサイズ分布。ｅ)乾燥ナノナップのネガティブ染色・透過型電子顕微鏡写真。スケールバー：50 nm。ｆ)2 mgのＯＮｃとともに形成されたナノ粒子の凍結乾燥後、濃縮され、再構築されたナノナップ(黒)又はリポソーム(赤、モル比１：１９のＮｃ：脂質)の等価吸光度。挿入図は、拡大したリポソームの吸光度を示す。
［図２５］超高光学密度でのピーク波長シフトのない、マルチスペクトル・ナノナップ。ａ)ＢＰｃ(青)、ＺｎＢＮｃ(ダークグリーン)、ＢＮｃ(ライトグリーン)又はＯＮｃ(ブロンズ)から形成されたナノナップの正規化吸光度。ｂ)水中のナノナップの写真。左から右に、ＢＰｃ、ＺｎＢＮｃ、ＢＮｃ及びＯＮｃ。ｃ)高い光学密度での吸収ピーク波長シフト。濃縮溶液を、10μm路長のキュベットで測定し、水中1000倍希釈と比較した。示されたナノナップは、インドシアニングリーン(ＩＣＧ)及びメチレンブルー(ＭＢ)と比較される。ｎ＝３での平均値±標準偏差。
［図２６］ナノナップは経口投与後、腸を安全に通過する。ａ)３７℃での疑似胃液(赤)又は疑似腸液(黒)中で透析されたＯＮｃナノナップの保持率。ｎ＝３での平均値±標準偏差。ｂ)大便(黒)及び尿(赤)中への100光学密度のＯＮｃナノナップの排出(「ODs」1 ODは、標準1 cm路長で測定された1 mL溶液中で１の吸光度を生じるのに必要なナノ粒子の量と定義される)。ｎ＝３マウスでの平均値±標準偏差。ｃ)大便(黒)及び尿(赤)中への100 ODsのメチレンブルー(ＭＢ)の排出。ｎ＝３マウスでの平均値±標準偏差。ｄ)コントロールマウス(左)又は100 ODsのＯＮｃナノナップを経管投与して２４時間後のマウス(右)の、ヘマトキシン及びエオシン染色した腸切片。絨毛と腺窩は、炎症細胞の流入が無く無傷であった。スケールバー、100μｍ。
［図２７］ナノナップを使用した腸の非侵襲性の解剖学的・機能的ＰＡイメージング。ａ)シングル・トランスデューサーＰＡシステムを使用した、100 ODsのＺｎＢＮｃナノナップの経管投与後の、ナノナップのＰＡ最大値投影法(ＭＩＰ)。赤の矢印は、ナノナップの移行を示す。ｂ)ＺｎＢＮｃナノナップを可視化する腸の深コード化ＰＡ ＭＩＰ。ｃ)100 ODsのＯＮｃナノナップの経管投与後の、ＰＡシグナル(カラー)及び同時ＵＳ(灰色)収集による、リアルタイム・マルチモーダルなマウス腸管の横断面。ｄ)腸内のナノナップの動き。黒い矢印は流入を示し、白い矢印は流出を示す。ｅ)関心分析の腸管領域。一次導関数ゼロ交差は、最大ナノナップ流入ポイント(黒の三角)と流出ポイント(灰色の三角)の時間を示す。ｆ)時間に対してプロットされた、前記領域からの収縮運動レート。ｇ)ナノナップの解剖学的マッピングのための共登録ＵＳ。膀胱(Ｂ)と腎臓(Ｋ)は、ＵＳ(灰色)で位置を示され、他方、ナノナップＰＡシグナルはカラーで示される。ｈ)経時的なＯＮｃナノナップの腸管移行を示す横行スライスのＵＳ(灰色)/ＰＡ(カラー)ＭＩＰ。ＭＩＰは、腸の単一スライス(左下)内のＰＡシグナルを方向づけるために使用された。エリア「Ａ」(赤)内のナノナップの経時的な流出の定量化は、「Ｂ」(青)と「Ｃ」(灰色)内で安定したナノナップ含量を維持する他の２つを参照して示される。「Ａ」内の変動は、ナノナップの収縮性の流入と流出に起因する。ｉ)腸閉塞のＵＳ/ＰＡ検出。マウスは、十二指腸結紮又は偽手術にかけられた。3.4 mg(100 OD860に相当)のＯＮｃナノナップが投与され、マウスは１時間後に画像化された。上部は、膀胱の上の2.4 cmの横行スライスであり、閉塞マウスにおける膨張した胃を示している。下部は、ＵＳ/ＰＡ ＭＩＰを示す。ナノナップの非閉塞流は、偽グループで明確である。破線は、ほぼ外科的切開部を示し、イメージの幅は、2.4 cmに対応する。ｎ＝３／グループの代表的イメージ。実線のスケールバーは、5 mmを示す。
［図２８］消化管の全身ＰＥＴ画像法のための、64Cuを用いたシームレス・ナノナップの標識化。ａ)64Cuを使用するナノナップ標識化。F127 PEOブロックを青で、PPOブロックを黒で、Ｎｃ色素を赤で示し、64Cuを放射性の黄色い円で示す。ｂ)３７℃でインキュベートされた疑似胃液(赤)、疑似腸液(青)、水(黒)中の放射標識ナノナップにおける、64Cuキレート化の保持安定性。ｎ＝３での平均値±標準偏差。ｃ)100 ODsのＯＮｃナノナップの経管投与２４時間後の、マウスでのＯＮｃナノナップとキレート化64Cuの糞便クリアランス。64Cuはガンマ計数を使用して、ナノナップは吸収を使用して評価した。ｎ＝３〜４マウスでの平均値±標準偏差。ｄ)経管投与後２４時間の、64Cuとナノナップの体内分布。測定されなかったため、いくつかの器官については、データー無し(N.D)となった。ｎ＝３〜４マウスでの平均値±標準偏差。ｅ)ナノナップの代表的なＰＥＴ画像。100 ODsの64Cu-標識ＯＮｃナノナップを経管投与し、表示されている時点でマウスを画像処理した。スケールバーは1 cm。ｆ)経管投与後、３時間における、マウスの代表的な0.8 mm厚の冠状スライス。
［図２９］初期のF127濃度の関数としてのナノナップの収率。プルロニックF127の濃度を変えた溶液中でのナノナップ形成後のナノナップ収率。この濃度を超えると溶液粘度が増加したため、10％(w/v)プルロニックF127を、ナノナップ形成のために選択した。ｎ＝３での平均値±標準偏差。
［図３０］遠心性洗浄の間の遊離F127濃度を決定するために使用した検量線。プルロニックF127とチオシアン酸コバルトは、ダークブルーの複合体を形成した(吸光度：623 nm)。示されるデータは希釈ファクターを説明する。ｎ＝３での平均値±標準偏差。
［図３１］洗浄サイクルの接触角解析。接触角解析(図に示す角度)に基づく、遊離F127を除去するのに必要な洗浄回数の決定。ナノナップは、F127サンプルの10％(w/v)溶液中で形成され(洗浄前)、遊離F127は、ＣＭＣスイッチングに続いて、遠心性洗浄工程を使用して取り除かれた。
［図３２］ジクロロメタン中、及び水性ナノナップ型中でのＮｃ色素の正規化吸光度スペクトル。ＢＰｃ、ＺｎＢＮｃ、ＢＮｃ、ＶＢＰｃ、ＶＢＮｃ、ＯＮｃ、ＮｉＯＮｃはそれぞれ、青、ダークグリーン、黄緑、紫、ピンク、アンバー及び黄色で示される。ジクロロメタンのスペクトルと比べて、順調に形成されたナノナップの、シフトした吸光度スペクトルは、ナノナップ中のＮｃ色素の密な配置が、いくつかの電子特性を改変したことを示した。
［図３３］ＺｎＢＮｃナノナップの自己消光型蛍光発光。吸収をマッチさせた、水中のＺｎＢＮｃナノナップとジクロロメタン(DCM)中の遊離ＺｎＢＮｃの蛍光。
［図３４］凍結乾燥ＺｎＢＮｃナノナップと純粋なＺｎＢＮｃのＸ線回析スペクトル。ＺｎＢＮｃ(灰色の線)は、プルロニックF127と比較して弱い結晶化特性を示すが、小さいピークは、いくらかの結晶化配向を示す(７℃で)。しかしながら、これらはナノナップ形成後に消滅した(黒の線)。ナノナップで観察される２つの大きなピークは、PEO結晶化度に基づく、特徴的なプルロニックF127の結晶パターンに起因している。
［図３５］ＺｎＢＮｃ、ＢＮｃ、及びＯＮｃナノナップの光音響スペクトル。表示のナノナップの最大吸光度は10に調節され、ＰＡスペクトルスキャンは、Vevo LAZRでPE20管中で行われた。
［図３６］ナノナップは、広いｐＨ範囲にわたってほぼ中性のゼータ電位を維持する。ナノナップはｐＨ調節リン酸緩衝液中で希釈され、ゼータ電位が記録された。ｎ＝３での平均値±標準偏差。
［図３７］濃度をマッチさせたナノナップと金ナノロッドの光音響スペクトル。ＯＮｃナノナップと金は、1.2 mg/mL濃度に正規化され、光音響スペクトルが、Vevo LAZRで記録された。ナノロッドの質量は、金単独に基づいている。３つの別々の試験の代表例。
［図３８］ナノナップ又はメチレンブルーとのインキュベーション後のCaco-2細胞生存率。濃縮ＯＮｃナノナップとメチレンブルー溶液は、Caco-2細胞培地中で希釈され、表示した最終ＮＩＲ吸光度を有する。細胞は、20％血清を含むDMEM培地中で、３７℃にて２４時間、色素と共にインキュベートされ、その後生存率を、XTTアッセイを使用して評価した。ｎ＝６での平均値±標準偏差。コントロールと、ナノナップ処理群の間で、一元配置ANOVAに基づく統計的有意差は観察されなかった。メチレンブルーについて、アスタリスクは、一元配置ANOVAとチューキー事後分析(p＜0.001)に基づく、未処理コントロールに対する統計的有意群を記す。
［図３９］50,000 OD860/kgのナノナップは、安全な経口投与ナノナップ用量である。ａ)1000 OD用量を経管投与した後のマウス質量。２週間の期間内に、マウスは苦痛又は異常行動の徴候を示さなかった。オスの群(＋/−ナノナップ)とメスの群(＋/−ナノナップ)それぞれについて、ｎ＝５マウスでの平均値±標準偏差。研究完了後、処理マウスとコントロールマウスの質量間に統計的有意差は観察されなかった(両側スチューデントｔ検定に基づく、P＞0.05)。ｂ)処理マウス又はコントロールマウスの、Ｈ＆Ｅ染色肝臓、脾臓、腎臓、肺及び心臓の組織像。全身毒性の徴候は観察されなかった。ｃ)食道、胃、小腸及び大腸を含む消化管器官の組織像は、Ｈ＆Ｅ染色に基づいて、明白な損傷がないことを明らかにした。全てのスケールバーは、200μmを表す。
［図４０］鶏の胸のファントムにおける、ＺｎＢＮｃとＯＮｃナノナップのシグナル-対-ノイズ比。吸光度をマッチさせた(〜400の吸光度)ＺｎＢＮｃとＯＮｃナノナップは、鶏のファントム内に置かれ、光音響シグナルを、鶏の胸組織の累進的添加とともにモニターした。エネルギーパルス密度は、710 nmと860 nmでそれぞれ2 mJ/cm2と1.5 mJ/cm2であった。
［図４１］銅による標識化は、ナノナップのゼータ電位又はサイズに影響しない。ＯＮｃナノナップ(100 ODs)を、0、0.01、0.1、1、10 mMの冷CuCl2中で、３７℃で３０分間、持続的に振盪しながらインキュベートした。標識化ナノナップを、過剰の銅を除去するために遠心ろ過で４回洗浄し、ゼータ電位を測定した。ｎ＝３での平均値±標準偏差。サイズは、10 mM標識化コンディションに関して示される。
［図４２］代表的な疎水性物質を用いて形成されたss-infromsの特性を示す表。ＬｏｇＰは、ALogPsアルゴリズムにより予測される物質の疎水性特性を指す。最終製剤のサイズとPDI(多分散インデックス)は、動的光散乱で評価した。
［図４３］ナノナップの光学パラメータを示す表。
［図４４］64Cuによるナノナップの標識化を示す表。64CuのmCiあたり、異なる量のナノナップを使用した放射標識収率。データは、最も大きい用量(これは単一実験)を除いて、三つ組実験の平均値±ＳＤを表す。
本開示は、生体系に疎水性物質の分子を輸送するための組成物及び方法を提供する。前記組成物は、疎水性物質-含有ミセル(本明細書中でナノ粒子とも称する)を含む。前記ナノ粒子は、サーファクタント分子(ポロクサマー等)からなり、その中に取り込まれた疎水性物質を有する。前記ナノ粒子は水性キャリア等のキャリア中に存在してもよい。本明細書中で使用される「取り込まれる」という用語は、前記疎水性物質が、ミセルの疎水性領域中に存在することを意味する。
一実施形態では、本開示は疎水性薬物を送達するための組成物及び方法を提供する。本明細書中で使用される「薬物」という用語は、治療、診断又は生理的機能のモニタリングの目的のために送達される物質を意味する。一実施形態では、本開示は疎水性造影剤を輸送するための組成物及び方法を提供する。
一実施形態では、本開示は、複数の疎水性物質-含有ミセルを粉末形態で含む組成物を提供する。前記ミセルは、凍結乾燥されていてもよい。前記組成物は、非会合サーファクタントを実質的に又は完全に含まない。例えば、前記組成物は非会合ポロクサマーを実質的に又は完全に含まない。
一実施形態では、ミセルを作るサーファクタント(例えば、ポロクサマー)の出発量の８５％以上が、前記組成物から取り除かれている。残りのポロクサマーはミセル(疎水性物質を積み込んだ)を形成する。様々な実施形態において、ポロクサマーの出発量の最大で９０％、９５％、９９％、９９．９％が組成物から除去される。
一実施形態では、本開示は、一種以上のポロクサマーと一種以上の疎水性物質(例えば、薬物又は造影剤)の分子を含むミセルを提供する。ミセルは凍結乾燥形態であってもよい。前記凍結乾燥組成物は、非会合サーファクタント(すなわち、ユニマーの、又は低温処理によりユニマーとなり得るサーファクタント、例えば空のミセル、ユニマー形態のポロクサマー、又はユニマーが互いにゆるく会合しているが、その中に薬物分子が取り込まれていないもの)を実質的に含まない。
前記ミセルは、密に充填されていてもよいが、結晶化していない疎水性物質を含む。低サーファクタント含量によって、前記ミセルは容易に、さらに濃縮されることができる(例えば、膜ろ過などのろ過によって)。疎水性物質-含有ミセル組成物の残りのサーファクタントは、分散剤ではなく、むしろミセルを形成している。
一実施形態では、前記組成物は、クエン酸塩、リン酸塩、ヒスチジン又はグルタミン酸塩のようなｐＨ緩衝剤を含む又は含まない糖液、又は生理食塩水のような適切なバッファー中にミセルを含み、実質的に非会合ポロクサマー分子を含まない。
本開示のサーファクタント分子は、疎水性薬物を可溶化でき、薬物-サーファクタント複合体はミセルを形成できる。一実施形態では、本開示にとって有用なサーファクタントは、少なくとも１つの疎水性ブロックと少なくとも１つの親水性ブロックを含むブロック共重合体である。一実施形態では、前記サーファクタントは、ポロクサマー(poloxamer)のようなトリ-ブロック共重合体である。ポロクサマーは、様々な分子量を有する、ポリエチレンオキシド(ＰＥＯ)-ポリプロピレンオキシド(ＰＰＯ)-ポリエチレンオキシド-トリブロック共重合体である。例えば、ポロクサマーは、ポリオキシエチレン(ポリ(エチレンオキシド))からなる２つの親水性鎖を両側に有する、ポリプロピレン(ポリ(プロピレンオキシド))からなる中央の疎水性鎖とから構成される。ポロクサマーは市販されている-例えば、商品名プルロニック[登録商標]として。多くのポロクサマーが当該分野で知られており、これにはポロクサマーF87、F88、F98、F108、F127などが含まれる。
一実施形態では、本組成物は、ポロクサマーF127、F68、F108及びそれらの組み合わせから選択されるサーファクタントと、一以上の疎水性物質とを含むミセルを含有する。一実施形態では、ミセル中に存在する唯一のサーファクタントはポロクサマーである。一実施形態では、ミセル中の唯一のサーファクタントはF127、F68及び／又はF108である。一実施形態では、ポロクサマー・サーファクタントを含む、又は本質的にポロクサマー・サーファクタントからなる、又はポロクサマー・サーファクタントからなり、且つ、その中に取り込まれた疎水性カーゴ分子を有するミセルを含む前記組成物中に、他のサーファクタントは存在しない。
本開示の薬物は、生理的機能を診断する又はモニターする目的、又は病的状態を改善する、治療する、予防する、診断する又はモニターする目的のために個体に投与することが望まれる、いかなる疎水性分子であってもよい。このように、治療的及び非治療的な疎水性物質の両方が、この方法によって送達できる。
本開示において有用な薬物又は造影剤は、一般的に疎水性である。一実施形態では、オクタノール-水分配係数(例えば、ALOGPSアルゴリズムによって予測されるＬｏｇＰ値)は少なくとも２である。一実施形態では、オクタノール-水分配係数は２〜１１である。一実施形態では、オクタノール-水分配係数は３〜１１である。様々な実施形態において、それは３、４、５、６、７、８、９、１０及び１１である。
ある実施形態では、疎水性薬物は、α-トコフェロール、アバフンギン(Abafungin)、アミオダロン、アジスロマイシン二水和物、ベプリジル、β-カロテン、ブデソニド、カバジタキセル、カルバマゼピン、カルシフェロール、カルベジロール、クロロキン、クロルプロマジン、コレカルシフェロール、クロトリマゾール、コエンザイムＱ１０、コチニン、シクリジン、シクロスポリンＡ、ジアゼパム、ドセタキセル、エコナゾール、エルゴカルシフェロール、エトポシド、フェンタニル、フェノフィブラート、フィナステリド、フルベストラント、ハロペリドール、デカン酸ハロペリドール、イトラコナゾール、イベルメクチン、ラベタロール、ラタノプロスト、メロキシカム、ミコナゾール、ミフェプリストン、ミコフェノール酸モフェチル、ニモジピン、フェニトイン、ピロキシカム、プレグネノロン、酢酸プレグネノロン、プロゲステロン、プロポフォール、レセルピン、レチノール、パルミチン酸レチノール、セルタコナゾール、シブトラミン、シンバスチン(Simvastin)、シロリムス、スクアレン、タクロリムス、タモキシフェン、テムシロリムス、テストステロン、シピオン酸テストステロン、プロピオン酸テストステロン、ウンデカン酸テストステロン、チプラナビル、トラボプロスト、トリアムシノロン、ビタミンＫ１、パクリタキセル及びそれらの組み合わせである。
ある実施形態では、疎水性物質は、発色団(クロモフォア)などの造影剤である。本開示のために有用な発色団は、イメージングに適切ないかなる疎水性造影剤であってもよい。適切な発色団の例には、テトラピロール及びその類似体及び誘導体が含まれ、それらにはポルフィリン及びその誘導体、クロリン及びその誘導体(クロロフィルＡ、フェオフィチンＡ及び関連化合物を含む)、フタロシアニン及びその誘導体、ナフタロシアニン及びその誘導体、バクテリオクロリン及びその誘導体、バクテリオクロロフィル及びその誘導体が含まれる。適切な発色団の特性は以下の通りである：生物の生体内撮像に好適なスペクトルのエリアにおける高い光吸収。これは通常、600-1000 nmの範囲の近赤外吸収からなる。一実施形態では、前記色素はフタロシアニン又はナフタロシアニン誘導体である。適切な色素には、2,11,20,29-テトラ-tert-ブチル-2,3-ナフタロシアニン(ＢＮｃ)、亜鉛- 2,11,20,29-テトラ-tert-ブチル-2,3-ナフタロシアニン(ＺｎＢＮｃ)、5,9,14,18,23,27,32,36-オクタブトキシ-2,3-ナフタロシアニン(ＯＮｃ)、ニッケル-5,9,14,18,23,27,32,36-オクタブトキシ-2,3-ナフタロシアニン(ＮｉＯＮｃ)、バナジル 2,11,20,29-テトラ-tert-ブチル-2,3-ナフタロシアニン(ＶＢＮｃ)、2,9,16,23-テトラ-tert-ブチル-29H,31H-フタロシアニン(ＢＰｃ)、バナジル 3,10,17,24-テトラ-tert-ブチル-1,8,15,22-テトラキス(ジメチルアミノ)-29H,31H-フタロシアニン(ＶＢＰｃ)が含まれるが、これらに限定されない。前記色素の誘導体及び類似体には、テトラピロール構造及びオクタノール-水分配係数(測定によって決定される又はALOGPSアルゴリズムによって予測される)が少なくとも２となるような疎水性によって特徴付けられるものも含まれる。
疎水性物質：ポロクサマーの出発時のモル比は、０．０２：１〜３：１にわたることができ、本明細書に記載するミセル組成物の調製プロセス後、疎水性物質：ポロクサマーの比は５５：１に高まり得る。一実施形態では、疎水性物質は薬物であり、出発時の薬物：ポロクサマーのモル比は、０．１：１〜３：１であり、最終のモル比は７：１〜５５：１である。一実施形態では、疎水性物質は光学的造影剤であり、出発時の色素：ポロクサマーのモル比は、０．０２：１〜１：１であり、最終のモル比は３：１〜１０：１である。
一実施形態では、前記組成物は薬物とサーファクタント分子を含むミセルを含み、非会合(非関与)サーファクタント分子を実質的に含まない。一実施形態では、全て(又は実質的に全て)の疎水性物質分子はポロクサマーミセル中に取り込まれて存在しており、ミセル内に取り込まれていない疎水性物質分子は存在しない(又は１％未満)。様々な実施形態において、ミセル中に取り込まれていない疎水性物質分子は０．５％未満又は０．１％未満である(及びその間の少数第１０位までの全てのパーセント値)。このように、前記組成物は、その中に疎水性物質分子が取り込まれているミセルを含むが、空のミセル、すなわちその中に疎水性物質分子が取り込まれていないもの、又はユニマーのあるいはゆるく会合したサーファクタント分子を実質的に含まない。一実施形態では、本開示の組成物では、全てのサーファクタント分子の少なくとも９０％がミセル(当該ミセルは、その中に取り込まれている疎水性物質分子を有する)に存在する。様々な実施形態において、前記組成物は、ミセル(当該ミセルは、その中に取り込まれている疎水性物質分子を有する)中にサーファクタント分子の少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％を含む。一実施形態では、前記組成物は、ミセル(当該ミセルは、その中に取り込まれている疎水性物質分子を有する)中にサーファクタント分子を１００％含み、検出可能な非会合サーファクタント分子は存在していない。このように、様々な実施形態において、全サーファクタント分子の１０％以下が、疎水性物質-含有ミセルに関与せずに存在している組成物が提供される。様々な実施形態において、前記組成物では、全サーファクタント分子の９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、4％以下、３％以下、２％以下、１％以下、又は１％未満が、疎水性物質-含有ミセルに関与していない。
本組成物は、塩(ＮａＣｌ、ＫＣｌ、又は他の塩)、糖類、ｐＨ緩衝剤、及び同様のもの(個体に投与するための製剤中で使用される任意の他の成分を含む)などの他の成分も適切な量で含むことができる。例えば、前記塩の濃度は４Ｍ以下とすることができる。
本ミセル組成物は、十分に分散され、ミセルの認識できる凝集は存在しない。一実施形態では、サブミクロンろ過技術及び／又は動的光散乱技術によって、及び／又は目視による外観検査(濁った外観から明らか)によって検出される検出可能な凝集は存在しない。一実施形態では、前記組成物は、高度に均一で単分散のナノ粒子(動的光散乱に基づく動的光散乱・多分散指数が０．５未満)を含む。一実施形態では、前記多分散指数は０．０５〜０．５である。様々な実施形態において、前記ナノ粒子は、０．４以下、０．３５以下、０．３以下、０．２以下、０．１以下又は０．０５以下の多分散指数を有する。様々な実施形態において、前記ナノ粒子は、０．４〜０．０５、０．３５〜０．０５、０．３〜０．０５、０．２〜０．０５、又は０．１〜０．０５の多分散指数を有する。
本開示の組成物は、高い疎水性物質：サーファクタント・モル比を有する。一実施形態では、前記の比は０．５：１〜５０：１(及びその間の全ての比と範囲)である。一実施形態では、前記の比は１：１〜５５：１である。例えば、前記比は、１：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、又は５５：１である。一実施形態では、前記の比は３：１〜１０：１、１０：１〜５０：１、１０：１〜５５：１、１０：１〜６０：１(及びその間の全ての比)である。一実施形態では、前記疎水性物質は薬物であり、組成物中の薬物：ポロクサマーのモル比は少なくとも１０：１であり、最大で５０：１、最大で５５：１、又は最大で６０：１(及びその間の全ての比)となりうる。例えば、複数の実施形態において、薬物：ポロクサマーの比は、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、又は６０：１である。一実施形態では、前記疎水性物質は造影剤(色素)であり、組成物中の色素：ポロクサマーのモル比は、少なくとも３：１であり、最大で１０：１(及びその間の全ての比)となりうる。例えば、色素：ポロクサマーの比は、３：１、３.５：１、４：１、４.５：１、５：１、５.５：１、６：１、６.５：１、７：１、７.５：１、８：１、８.５：１、９：１、９.５：１又は１０：１である。
前記ミセルは、１０〜２５０ｎｍの間のサイズ(直径)を有する。一実施形態では、前記ミセルは１５〜２５０ｎｍ(及びその間の全ての整数のナノメーター)のサイズを有する。一実施形態では、前記ミセルの少なくとも９０％が、１５〜２５０又は１５〜１００ｎｍの範囲内である。一実施形態では、平均サイズは直径２０〜１００ｎｍである。一実施形態では、平均サイズは２０〜１２０ｎｍである。様々な実施形態において、それは、２０、３０、４０、及び５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、又は１２０ｎｍである。一実施形態では、前記ミセルの少なくとも８０〜９０％(及びその間の全ての整数のパーセント値)は、２０〜１００ｎｍ(及びその間の全ての整数のナノメーター値)の範囲内である。一実施形態では、前記ミセルの少なくとも８０〜９０％(及びその間の全ての整数のパーセント値)は、２０〜１２０ｎｍ(及びその間の全ての整数のナノメーター値)の範囲内である。一実施形態では、前記ミセルの９０％より多くが、２０〜１００ｎｍの範囲内又は２０〜１２０ｎｍの範囲内である。一実施形態では、前記ミセルの９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％が、２０〜１００ｎｍの範囲内又は２０〜１２０ｎｍの範囲内である。
一実施形態では、本開示の組成物は、イメージング用途のために使用され、１５〜４０ｎｍ(及びその間の全ての整数ナノメートル)の平均サイズを有する複数の凍結ミセルを含む。一実施形態では、平均サイズは２０〜３０ｎｍ(直径)である。様々な実施形態では、それは２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ｎｍである。一実施形態では、前記ミセルの少なくとも８０〜９０％(及びその間の全ての整数のパーセント値)は、２０〜３０ｎｍ(及びその間の全ての整数のナノメーター値)の範囲内である。一実施形態では、前記ミセルの９０％より多くが、２０〜３０ｎｍの範囲内である。一実施形態では、前記ミセルの９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％が、２０〜３０ｎｍの範囲内である。別の実施形態では、前記ミセルの少なくとも９０％が、１５〜４０ｎｍの範囲内である。
前記組成物は以下のようにして調製してもよい。疎水性物質を有機溶媒中に溶解し(例えば、物質濃度１０ｍｇ/ｍＬ〜２００ｍｇ/Ｌで)、水性ポロクサマー溶液(例えば、５、１０又は１５％ｗ/ｖのポロクサマー)に添加し、有機溶媒を蒸発させる(能動的又は受動的手段で)。もし、大きい凝集体があれば、ろ過又は遠心分離で除去する。非取込み型ポロクサマー(すなわち、疎水性物質分子と会合していないポロクサマー)を除去する。一実施形態では、前記除去は、空のミセルを形成しているサーファクタント、又はミセルにゆるく会合あるいは周辺に会合しているサーファクタントがモノマー(ユニマー形態)に変わるようにコンディションを変えることによって、促進される。これを行うと、空のミセル又はゆるく会合しているサーファクタントは、ユニマーになり、除去するのがより容易になる。一実施形態では、これは臨界ミセル濃度(ＣＭＣ)スイッチングにより−すなわち、ミセルがユニマー形態に変化するように、温度をＣＭＴに又はＣＭＴ未満に低下させることによって達成される。一実施形態では、ユニマー形態が形成される温度は、３０℃〜０℃(及び小数第１０位までのその間の全ての温度の値)の任意の値となりうる。一実施形態では、低下後の温度は、室温(２５℃)〜０℃である。一実施形態では、低下後の温度は、２５℃〜１℃又は２２℃〜１℃である。一実施形態では、低下後の温度は、２０℃〜１℃(及び小数第１０位までのその間の全ての温度の値)である。一実施形態では、低下後の温度は、１０℃〜−２０℃(及び小数第１０位までのその間の全ての温度の値)である。一実施形態では、温度を低下させる必要はなく、空のミセルからモノマーへの変換は、他の手段によって(例えば他の溶媒又は塩コンディションの使用によって)達成されてもよい。一実施形態では、低下後の温度は、０℃〜−２０℃(及び小数第１０位までのその間の全ての温度の値)である。
一実施形態では、例えば、澄まし溶液(疎水性物質(溶媒中の)を水性ポロクサマーに添加し、溶媒を蒸発させた後に得られる)は、氷上で冷却され、遠心ろ過(相当量の溶液(例えば、１００〜１０００ｕＬ)が保持されるまで、４℃で、典型的には１０〜１００分の時間、５００〜５０００ｇをもたらす速度を使用する)にかけられる。前記ろ過のために使用する遠心力は２０００ｇ以上であってもよい。例えば、前記遠心力は２０００ｇ〜４０００ｇであってもよい。前記遠心分離は、１℃〜室温、又は１℃〜１０℃又は４℃〜１０℃で行われてもよい。一実施形態では、それは１〜１０℃で、３５００ｇで２５分間行われる。水を濃縮物に添加して(戻して)もよい。残余分は、一回以上の洗浄と遠心ろ過にかけられる。このように、洗浄とろ過は所望の回数繰り返すことができる。一実施形態では、洗浄とろ過手順は２〜８回(及びその間の全ての整数)繰り返される。一実施形態では、それは３回繰り返される。別の実施形態では、洗浄は別々の工程の代わりに、透析ろ過を使用する連続的な方法で行われる。一実施形態では、洗浄とろ過手順は、製剤を作るために最初に使用されたサーファクタントの少なくとも６０％が、洗浄によって取り除かれるように行われる。様々な実施形態において、非会合サーファクタントの少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、及び全てが除去される。所望量のサーファクタントが除去されたか否かは、洗浄液中に流出したサーファクタントを測定することによって調べることができる。一実施形態では、前記組成物は、洗浄液(又はろ液)中に検出可能なサーファクタントが見つからなくなるまで、洗浄にかけられる。例えば、我々は、通常、３回又は４回の洗浄後に、さらなる洗浄液中に検出可能なサーファクタントが存在しなくなることを観察した。サーファクタントは、比色分析チオシアン酸コバルト法のような標準的な方法を使用して検出できる。
組成物の物理的及び光学的特性は、標準的な技術によって測定できる。粒子サイズ測定及び均一性は、透過型電子顕微鏡などのような標準技術によっても測定できる。安定性は、関連する液体に対する透析によって評価できる。
一実施形態では、一以上の共負荷物質(例えば、ビタミンＥ及び／又はコエンザイムＱのような疎水性分子)が、ミセルを調製するために、薬物と共に使用される。薬物と共負荷するためにビタミンＥを使用すると、ミセル中への薬物の負荷(積込)が相乗的に増大することが観察された。一実施形態では、パクリタキセルが、ミセルを形成するためにビタミンＥ又はコエンザイムＱとともに使用された。一実施形態では、ドセタキセルが、ミセルを形成するためにビタミンＥとともに使用された。共負荷物質-対-関心のある薬物のモル比は、０.１：１〜１０：１の範囲にわたってもよい。
本組成物は、調製後すぐ使用されてもよく、冷蔵して又は室温で、あるいはそれらの間の任意の温度(例えば、２５℃〜０℃)で、水溶液として保存されてもよい。前記組成物は、凍結乾燥されてもよく、乾燥状態で保存されてもよい。このように、前記組成物は貯蔵され、その後、先の組成物で得られるものより濃縮された形態で再構成されてもよい。
疎水性のフタロシアニン又はナフタロシアニンが、疎水性物質として使用される場合、得られた溶液は、少なくとも５００吸光度単位と同程度に高い近赤外吸光度を有するように、濃縮されてもよい。一実施形態では、前記ナノ粒子は検出可能に標識されてもよい。例えば、ナノ粒子は、疎水性物質(例えば、色素の大環状構造内)と金属錯体を形成することによって、放射標識又は磁気標識される。一実施形態では、前記ナノ粒子は64Ｃｕで標識される。それらは、ＭＲＩ検出のために、Ｍｎで標識されてもよい。
本組成物を使用するために、任意の適切な投与ルートで投与を行うことができる。例えば、前記組成物は、経口、静脈内、皮内、筋肉内、粘膜、腫瘍内、局所、又は他の任意の投与方法で、投与されることができる。
前記組成物は、光学イメージング(光音響イメージング及び蛍光イメージングを含む)などの画像処理技術のために、及び、陽電子放出断層撮影(ＰＥＴ)イメージング、磁気共鳴イメージング(ＭＲＩ)などのような全身技術のために、使用することができる。我々は、色素含有ミセルをイメージングに使用した際、ミセルが、胃や腸の環境における厳しい状況に耐え、全身性の吸収を回避し、光音響イメージングに良好な光学コントラストを生じさせることを観察した。イメージング用途のための色素-含有(負荷)ミセルは、本明細書においてナノナップと称される。
一実施形態では、前記ミセルは、調節可能な及び大きな近赤外吸収値(＞１０００)を有する。例えば、前記吸光度は、同じ色素を用いて作られた従来のリポソーム製剤で見られるものより、５００〜１０００倍大きい。いくつかの実施形態では、前記ナノ粒子は、約６５０〜約１０００ｎｍのピーク発光を有する。
従来の発色団と異なり、ナノナップは、マウスへの経口投与後、極めて高い光学密度でシフトしないスペクトルを示し、消化管を安全に通過した。一実施形態では、非侵襲性、非イオン性の光音響技術は、低バックグラウンドと深度０．５ｃｍでの解像度で、ナノナップ腸管分布を可視化するために使用できる。より深いイメージングが、改良されたＰＡＴ技術で実施されてもよい。これは、超音波同時登録を用いて、リアルタイム腸管機能イメージングを可能にする。一実施形態では、他の画像処理技術、例えば陽電子放出断層撮影を使用することができる。本開示は、補完的な全身性イメージングを可能にする、放射標識ナノナップを使用したＰＥＴのためのデータを提供する。
イメージングでの使用のために、本組成物は個体に経口投与されるか、又は消化管に送達される。前記個体は、ヒトであってもヒト以外の動物であってもよい。前臨床試験において、我々は、１００ＯＤｓの用量を投与し、これは光音響イメージングによって強いシグナル検出をもたらす。高解像度のスキャンが、リアルタイムイメージングと同様、実施されてもよい。例えば、消化器系におけるナノナップの動きは、１００ＯＤｓの組成物の経管投与後、モニターされることができる。用語「ＯＤ」は「光学密度(optical density)」を表し、吸光度の容量独立測定単位である(「ＯＤｓ」-１ＯＤは、標準１ｃｍ路長で測定された１ｍＬ溶液中で１の吸光度を生じるのに必要なナノ粒子の量と定義される)。これは、ぜん動、腸閉塞などの、関心領域の評価及び分析も可能にする。さらに、ＰＥＴスキャニングのような画像処理技術は、放射標識したナノ粒子(例えば、64Ｃｕ標識ナノ粒子)を使用して実施されてもよい。その後、画像再構成を行うことが可能である。
光音響(ＰＡ)イメージングは、他の光学的方法より深い侵入を伴う非イオン化モダリティである。計装コストが低く、システムは小さくモジュール式であり、慢性及び急性の消化管状態のルーチン的な臨床調査に広く利用できる可能性を有する。ＰＡイメージングは、データが豊富であり、空間分解能を犠牲にすることになく、ぜん動や分節運動などの動的腸管処理のイメージングに適切な本質的にリアルタイムのモダリティである。さらに、ＰＡイメージングは安全な、非侵襲性且つ非イオン化モダリティであり、消化管イメージングの好ましい特性に適合する(特に小児患者の場合)。ＰＡ技術は、外因性近赤外(ＮＩＲ、６５０〜１０００ｎｍ)造影剤を使用するイメージングに特に有用である。本組成物は、体内への全身性吸収が無視できる程度なので、このモダリティにとって有用である。腸からの造影剤の続発的な損失は、シグナルの減少をもたらし、定量的測定を妨げ、毒性に関する懸念を生じさせるため、このことは重要である。本組成物のナノ粒子は、分解して、刺激の強い化学物質や刺激の強い胃腸の消化環境をもたらすこともない。
本組成物は、他のルート(静脈内、筋肉内、皮内、又は関心のあるエリアに到達するための他の任意のルートを含む)によって投与されてもよい。本組成物は、他の器官や系のイメージングのために使用されてもよい。例えば、前記組成物は、リンパ系のイメージングのため(局所エリア又はより広いエリアのいずれかで)、及び静脈内投与後の血液脈管構造のイメージングのために使用することができる。リンパ節のイメージングのため、それはリンパ系内に注射されてもよい。これらの系のイメージングは、消化管のイメージングのために記載した説明と類似の方法で行うことができる。
以下の実施例は、本発明を説明するために提示される。それらはいかなる方法による限定も意図していない。
この実施例は、ミセルの調製とそれらの特性について記載する。材料は別段の記載がない限り、Sigma社から入手した。
材料と方法
プルロニックF127(sigma、P2443)、プルロニックF68(sigma、412325)、クレモフォールEL(sigma、C5135)、クレモフォールRH40(Sigma、07076)、塩化メチレン(Fisher)、フィロキノン(ビタミンＫ１、VWR、AAAL10575-03)、シクロスポリンＡ(VWR、89156-334)、2,6-ジイソプロピルフェノール(プロポフォール、VWR、AAAL06841-14)、フルベストラント(Biorbyt、orb62178)、塩酸アミオダロン(VWR、AAJ60456-03)、イベルメクチン(VWR、AAJ62777-03)、ウンデカン酸テストステロン(Matrix、099258)、コレカルシフェロール(VWR、TCC0314)、パルミチン酸レチノール(VWR、IC15652125)、テムシロリムス(LC labs、T-8040)、ミフェプリストン(VWR、TCM1732)、レチノール(Kracker、45-T3634)、コエンザイムＱ１０(Kracker、45-C9538)、ドセタキセル(LC labs、D-1000)、パクリタキセル(LC labs、P-9600)、カバジタキセル(Proactive Molecular Research)、スクアレン(Sigma)、及び、5,9,14,18,23,27,32,36-オクタブトキシ-2,3-ナフタロシアニン(ONc、Sigma)、2,11,20,29-テトラ-tert-ブチル-2,3-ナフタロシアニン(BNc、Sigma)；2,9,16,23-テトラ-tert-ブチル-29H,31H-フタロシアニン、亜鉛 2,11,20,29-テトラ-tert-ブチル-2,3-ナフタロシアニン(Zn-BNc、Sigma)。
サーファクタント保持率実験(図１)は、4 mLの10％(w/v)プルロニック又はクレモフォール水溶液を回転し、その後遠心ろ過管(Fisher ＃UFC810024)内にこの溶液を入れ、４℃又は２５℃で、２５分間3,500 gで回転することによって行った。残余分に水を添加して(戻して)4 mLとした後、この溶液を、１０分間3,500 gで二回目の遠心分離にかけた。蒸留水を最終の残余分に添加して4 mLとし、プルロニック及びクレモフォールの濃度をそれぞれ、比色分析と1,6-ジフェニル-1,3,5-ヘキサトリエン(DPH)プローブ法によって、測定した。具体的には、プルロニックの濃度は、チオシアン酸コバルト試薬(3 mLの水に、0.3 gの硝酸コバルト六水和物と1.2 gのチオシアン酸アンモニウムを溶解することによって、最初に調製した)によって測定した。その後、100μL チオシアン酸コバルト溶液、0〜7.5 wt％の濃度範囲の40μLのF127溶液(より濃いF127溶液は、この範囲になるように希釈した)、200μLの酢酸エチル及び80μLのエタノールを併せた。この混合物を穏やかにボルテックスし、１分間14,000 xgで遠心分離した。青色の上清を取り除き、上清が無色になるまで、青色の沈殿物をエチルエーテルを使用して数回(〜５回)洗浄した。前記沈殿物をその後1 mLのアセトン中に溶解し、623 nmで吸光度を測定した。DPHプローブ法で、メタノール原液中の0.4 mM DPH 50μLを、0〜1％(wt)の濃度のクレモフォール溶液1 mLに添加した。平衡にするために、少なくとも３時間暗所に静置した後、356 nmの紫外・可視吸収強度を記録した。
薬物の吸光度保持実験(図２)は、ONc薬物を溶解したサーファクタント溶液製剤で始めた。手短に説明すると、2 mLのONc溶解DCM溶液(濃度：0.4 mg ONc／mL DCM)を、6 mLの10％プルロニック又はクレモフォール水溶液中に滴下した。DCMを蒸発させるために、少なくとも４時間の撹拌した後、得られた溶液を１０分間3,500 gで回転させ、その後1 mLの上清を3,500 gで１５分間、低温遠心分離にかけた(三つ組)：各遠心分離前に、蒸留水を出発溶液又は濃縮液に添加し、体積を4 mLにした。紫外・可視吸収を〜863 nmで測定した。
F127溶液中への疎水性薬物の可溶化で始める薬物infroms形成。100 uLの原液(50 mg薬物／mL DCM)(タキサン薬物共負荷実験用、表示量のビタミンＥ又はコエンザイムＱ１０を、タキサン薬物とともに原液中に溶解した)を、1 mLの10％(w/v)F127溶液(シクロスポリンＡについては、0.5、1、2、3 MのNaCl又はKClを含む10％ F127溶液、プロポフォールとアミオダロンについては、水又は0.15、0.5、1M NaClを含む10％ F127)中に、３時間撹拌しながら滴下した。その後、得られた溶液を複数回、低温遠心分離洗浄にかけた。ラージスケールのinfroms形成のために、30 mgの薬物を150 mLのDCMに溶解し、得られた溶液を、750 mLの10％(w/v)F127/F68溶液中に滴下した。代わりに、過剰なF127/F68を、シングルモジュールViva flow 200(Sartorius)を使用する透析ろ過法によって除去した。吸光度を、路長1 cmのQuatzキュベットを使用するPerkin Elmer XLSで測定した。サイズは、Nano Brook 90 Plus PALS機器で測定した。共負荷実験で保持されたO.D.の定量化のために、ビタミンＥ及びコエンザイムＱ１０単独(薬物無し)infromsコントロールを平行して作り、薬物の特性ピークにおける吸光度を差し引いた。モル比の決定のために、濃縮infromsを凍結乾燥した。その後、infroms粉末の質量を測定し、その粉末をジクロロメタン中に溶解して、薬物の質量を測定した。F127又はF68の質量は、全凍結乾燥質量との差に基づいて決定した。
まず、我々は、いくつかのプルロニック・サーファクタントとクレモフォールEL及びRH40の10％(w/v)溶液の保持率を、４℃及び２５℃両方での遠心ろ過の間に試験した。ミセル形状になっている場合、サーファクタントは、ろ過膜中の孔を容易に通り抜けない。図１に示すように、プルロニックF127は、その温度感受性臨界ミセル濃度(CMC)に起因して、より高い温度では保持されたが、低温(４℃)では除去された。しかしながら、F68及びF108(両方ともより高いCMCを有する)は、２５℃及び４℃の両方で、遠心ろ過を使用して除去できた。我々が試験したクレモフォールは、遠心ろ過で除去できなかった。我々は次に、前記サーファクタントが、疎水性ナフタロシアニン(より大きなサイズを有し、それゆえ遠心ろ過中に保持される)と凍結ミセルを形成できるかどうか試験した、ナフタロシアニンは、塩化メチレン溶液から添加され、サーファクタントの撹拌溶液中に滴下された。有機溶媒が蒸発させられ、その後薬物を４℃で遠心ろ過にかけた。全てのプルロニックが除去されるコンディションにおいて、相当量のナフタロシアニン薬物が凍結ミセルによって可溶化されて残存した(図２)。別の実施例では、サーファクタントの拡張したセットを使用して(プルロニック F127、プルロニック F108、プルロニック F68、ポリソルベート 20、ポリソルベート 40、ポリソルベート 80. クレモフォール EL、クレモフォール RH40. タージトール(Tergitol) NP 9、タージトール NP 10、タージトール NP 40、Brij 97、Brij 35、Brij L23、Brij O20を水中に10％w/w含む)この洗浄手順が繰り返され、４℃洗浄が三度繰り返された。図１７に示すように、プルロニックのみが、洗浄プロセスにおいて高い吸光度を産生できた。
ビタミンＫ１を、誘発凍結ミセルを形成する適合性について評価した。ビタミンＫ１は、時に静脈内に投与される、血液凝固に関与する疎水性分子である。図３ａに示すように、プルロニックF127中での可溶化に続いて、ビタミンＫ１誘発凍結ミセルが形成され、遠心ろ過は、ほとんどのサーファクタントを除去することができ、精製されたビタミンＫ１-infroms(図３ｂに示す特性吸収スペクトルを有する)を後に残した。これらのss-infromsは、100 nmのサイズを有した(図３ｃ)。F68とともに形成した場合、20：1という高い薬物：サーファクタントを有することが見出され、これは臨床製剤より２桁以上高い(図３ｄ)。ビタミンＫ１は、グリココール酸サーファクタントを用いた混合ミセル形態中で、現在排他的に利用できるようになる前に、すでにクレモフォール・サーファクタントを用いて臨床的に処方されていた。この添加剤は、ビリルビンと置換する可能性があり、進行した肝疾患を有する患者に常に勧められるわけではない。
ビタミンＫ１の別の実施例で、透析ろ過法を使用した。150 mgのビタミンＫ１を、1.5 mLの塩化メチレン(DCM)に溶解し、15 mLの10％(w/v)F127中に添加し、有機溶媒が蒸発するまで撹拌した。前記溶液は、水で体積75 mLに希釈され、非取込み型F127を除去するために４℃で膜ろ過(Sartorius vivaflow, 1501008VS)にかけ、５画分(それぞれ200 mL)のろ液を収集した。ビタミンＫ１の保持率は、吸光度測定により定量化し、他方、F127はチオシアン酸コバルト法によって定量化した。図１８ａに示すように、ビタミンＫ１は、洗浄プロセス中に保持され、他方、F127は除去された。図１８ｂに示すように、これは透過型電子顕微鏡写真に基づいて、サイズ100 nm未満のナノ粒子を生じさせた。図４２に示すように、薬物：F127のモル比は、39.5：1；代表的な濃縮溶液は、150 mg/mLのビタミンＫ１濃度に達し、サイズは74 nm、及び、多分散指数は0.25であった。出発時のF127溶液を探索するために、示差走査熱量測定を使用した場合、2 J/gを上回るミセル形成エンタルピーが、20 C付近のピークと共に観察された(図１８ｃ)。ビタミンＫ１の添加後、エンタルピーのピークは約50％少なくなり、これは大部分の遊離F127が溶液中に残っていることを示す。しかしながら、洗浄プロセス後、検出可能なミセル形成エンタルピーは、ss-infroms中で観察できなかった。図１８ｄに示すように、ビタミンＫ１-infromsは、1％の2,9,16,23-テトラ-tert-ブチル-29H, 31H,フタロシアニン(BPc)、(亜鉛,2,22,20,20-テトラ-tert-ブチル-2,3-ナフタロシアニン)ZnBPcのためのFRETドナーでドープされた。ドナーDCM溶液は、0.5 mgのBPc、49.5 mgのビタミンＫ１を500μLの塩化メチレン中に溶解することによって作成した。アクセプター・塩化メチレン溶液は、5 mgのZnBNc及び45 mgのビタミンＫ１を500μLの塩化メチレン中に溶解することによって作成した。予混合されたドナー及びアクセプター・塩化メチレン溶液は、0.5 mgのBPc、5 mgのZnBNc及び44.5 mgのビタミンＫ１を500μLの塩化メチレン中に溶解することによって作成した。上記三種類の塩化メチレン溶液を、３つの別々の5 mL 10％(w/v)F127にそれぞれ添加し、続いて有機溶媒が蒸発するまで撹拌した。後混合のドナーとアクセプターは、撹拌後にドナー溶液とアクセプター溶液(1：1、v/v)を併せることによって作成した。その後蛍光を、蛍光光度計で測定した。infromsがFRETドナー及びアクセプターから別々に形成され、その後併せられた場合、洗浄プロセス後でさえ、認識できるエネルギー移動は生じなかった。FRETドナー及びアクセプターが、有機溶媒中で併せられて、infromsを形成する場合、多量のFRETが観察された。これらの観察は、ss-infromsの動力学的に凍結された性質を確認する。透析ろ過法を使用すると、高いサーファクタント-対-薬物のモル比が観察され、標準的なビタミンＫ１・ss-infromsでは、NMR分析に基づいて40：1を超え、これは既存の製剤より数桁大きい(図１８ｅ)。図１８ｆに示すように、マウスに静脈内投与した場合、ビタミンＫ１のss-infromsは、ワルファリン投与の効果に効率的に対抗することができた。６週齢のメスのICRマウス(Harlan)に、ビタミンＫ１-infromsの静脈内注射の前、ワルファリンナトリウム溶液を２４時間与えた。マウス(n＝6)に、ビタミンＫ・ss-infromsを0、1、2、5 mg/kgの用量で静脈注射した。残りのグループは、ワルファリンを与えることなく、又は注射なしでコントロールとして使用された。２４時間後、マウスの血液をサンプリングし、マウス血液のINR値をCoagucheck XS system(Roche)で測定した。
ビタミンＫ１-infromsについて、非会合及び取り除かれたF127の量を、洗浄ろ液中で測定した場合、十分な洗浄後、さらなるF127は検出できなかった(図１９)。これは、ss-infromsが、非会合プルロニックから除去されたことを実証する。
シクロスポリンＡを、誘発凍結ミセルを形成する適合性について評価した。シクロスポリンＡは、クレモフォール溶液中で、時に静脈内に投与される免疫抑制薬である。プルロニック溶液への塩の添加によって、infrom製剤のシクロスポリンを増加させることができる(図４ａ)。我々は、塩が溶液をよりイオン性且つ親水性にし、その結果、凍結ミセルコア内への疎水性カーゴのより安定な分配をもたらすことがその理由であると仮定する。過剰のプルロニックは、infromsから洗い流すことができた(図４ｂ)。サイズは100 nm付近であり、溶液は特性吸収ピークを有した(図４ｃ、ｄ)
シクロスポリンＡの別の実施例では、10 mgのシクロスポリンＡを1 mLの塩化メチレンに溶解し、0、1、2、3 MのNaClを含む10 mLの10％(w/v)F127溶液に添加した。３時間の撹拌後、溶液を、〜200μLの溶液が保たれるまで又は残余分の体積が変わらなくなるまで、０℃(0 M及び1 M)又は−１０℃(2 M及び3 M)で遠心ろ過にかけ、対応する塩溶液を濃縮物に添加し(戻し)、洗浄手順を３回行った。残余分は、0.45μmのフィルターを通過させ、その後、シクロスポリンＡの濃度を定量化するために、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を使用した。異なる温度における塩濃度の関数としてのプルロニックF127の除去率を数量化するために、ろ液を保存し、チオシアン酸コバルト法を使用した。図４２に示すように、薬物：F127のモル比は、15：1；代表的な濃縮溶液は、7 mg/mLのシクロスポリンＡ濃度に達し、サイズは165 nm、及び、多分散指数は0.34であった。ss-infroms中でのシクロスポリンＡの収率に対する塩の効果を、図２０ａに示すように評価した。高張食塩水は収率を増大させた。図２０ｂは、遊離のプルロニックが、低温洗浄(−１０℃)によって、高張食塩水中で効率的に除去できることを示す。図２０ｃに示すように、ss-infroms中のシクロスポリンＡのモル比は、既存の臨床製剤より数桁高かった。シクロスポリンＡのss-infromsを、ヒツジ赤血球を注射する前にマウスに投与した場合、免疫抑制薬について予期されるように、免疫系応答を効率的に阻害した(図２０ｄ)。
100 mgの薬物を1 mLの塩化メチレン(DCM)に溶解し、これを10 mLの10％(w/v)F127溶液(NaClを含む又は含まない)に添加し、有機溶媒が蒸発するまで撹拌することによって、疎水性薬物の多数の他のss-infromsを作製した。非取込み型F127の除去は、その後、以下のいずれかで行った；１)遠心ろ過F127除去法：〜200μLの溶液が保たれるまで(又は残余分の体積が変わらなくなるまで)、溶液を、低温(０℃、４℃又は−１０℃)で遠心ろ過(fisher #UCF9-100-24)にかけた。水(又はNaCl溶液)を濃縮物に添加し(戻し)、洗浄手順を３回繰り返した。２)透析ろ過法：ラージスケール(＞15 mL)又は高塩(＞2又は3 M)溶液について、除去プロセスを、ぜん動ポンプ(Masterflex L/S)及びチューブ(masterflex 6434-16)とともに構築された膜ろ過(Sartorius vivaflow、1501008VS)によって、低温(2 Mについては−７℃、3 Mについては−１２℃、4 Mについては−１６℃)で行った。低温にするため、及びF127の除去率を最大にするために、膜モジュール、チューブ、及び洗浄される溶液を、エチレングリコールとエタノール(vol/vol＝9：1)の混合物に浸漬し、ドライアイスを冷却剤として使用した。フルベストラントを、誘発凍結ミセルを形成する適合性について評価した。フルベストラントは、注射可能なホルモン化学療法薬である。図５ａに示すように、プルロニックへの添加後に形成されたフルベストラントミセルは、その後過剰のプルロニックを洗い流せたが、フルベストラントはフルベストラント-infroms中に保持された。この溶液は、特性吸収スペクトルを有した(図５ｂ)。
アミオダロンを、誘発凍結ミセルを形成する適合性について評価した。アミオダロンは注射可能な心臓病薬である。図６ａに示すように、塩化ナトリウムはアミオダロンinfrom形成を大きく増大させた。過剰のプルロニックは洗い流せたが、アミオダロンは保持された(図６ｂ)。このinfromは特性吸収スペクトル、及び、30 nm付近に狭いサイズ分布を有した(図６ｃ、ｄ)。
イベルメクチンを、誘発凍結ミセルを形成する適合性について評価した。イベルメクチンは抗寄生虫薬であり、主に家畜を治療するのに注射用の形態で使用されるが、ヒトでも同様に使用される。図７ａに示すように、イベルメクチン-infromsを形成することができ、過剰のプルロニックは洗い流せたが、イベルメクチンは保持された。イベルメクチン-infromsは、240 nmに特性吸収ピークを有し、40 nm付近のサイズを有した(図７ｂ、ｃ)。100 mgのイベルメクチンを1 mLの塩化メチレンに溶解し、これを10 mLの10％(w/v)溶液に添加し、続いて、有機溶媒が蒸発するまで撹拌した。非取込み型F127を除去するために、〜200μLの溶液が保たれるまで、溶液を０℃で遠心ろ過(fisher #UCF9-100-24)にかけた。水を濃縮物に添加し(戻し)、洗浄手順を３回繰り返した。図４２に示すように、薬物：F127のモル比は、45：1；代表的な濃縮溶液は、79 mg/mLのイベルメクチン濃度に達し、サイズは39 nm、及び、多分散指数は0.03であった。
ウンデカン酸テストステロンを、誘発凍結ミセルを形成する適合性について評価した。ウンデカン酸テストステロンは、テストステロンのエステル形であり、主要な男性ホルモンであって、ホルモン補充のために使用され、及び男性の避妊のために研究されている。それは通常、植物油中で、筋肉内注射として投与される。図８ａに示すように、ウンデカン酸テストステロン-infromsを形成することができ、過剰のプルロニックは洗い流せたが、ウンデカン酸テストステロンは保持された。ウンデカン酸テストステロン-infromsは、235 nmに特性吸収ピークを有した(図８ｂ)。ウンデカン酸テストステロン-infromsは、40：1の薬物：プルロニック比を有した。別の実施例では、ウンデカン酸テストステロンを、スモールスケールで撹拌し、10 mgの薬物を100μLのDCM中に溶解し、0、1、2、3、4 MのNaClを含む1 mLの10％(w/v)F127水溶液に添加し、その後DCMが完全に蒸発するまで３時間撹拌した。その後、その溶液を１０分間、5,000xgの回転にかけた。上清を廃棄し、沈殿物を1 mLのエタノール中に溶解し、240 nm(ウンデカン酸テストステロンについて)及び230 nm(カバジタキセルについて)の吸光度を測定して、非取込み型の薬物を定量化した。100 mgのウンデカン酸テストステロンを、1 mLの塩化メチレン(DCM)に溶解し、4 M NaClを含む10 mLの10％(w/v)F127中に添加し、有機溶媒が蒸発するまで撹拌した。非取込み型F127の除去プロセスを、ぜん動ポンプ(Masterflex L/S)及びチューブ(masterflex 6434-16)とともに構築された膜ろ過(Sartorius vivaflow、1501008VS)によって、行った。除去プロセスを−１６℃で行い、4 M NaCl溶液を透析ろ過溶液のために使用した。F127の除去率を最大にするために、膜モジュール、チューブ、及び洗浄される溶液を、エチレングリコールとエタノール(v/v＝9：1)の混合物に浸漬し、ドライアイスを冷却剤として使用した。図４２に示すように、薬物：F127のモル比は9：1；代表的な濃縮溶液は、16 mg/mLのウンデカン酸テストステロン濃度に達し、サイズは112 nm、及び、多分散指数は0.19であった。図２１ａに示すように、4 Mの高張食塩水は、ウンデカン酸テストステロンの凝集を大きく妨げた。オイル中に溶解された既存の製剤と比較して、ss-infromsは、薬物-対-可溶化剤のモル比がはるかに高かった(図２１ｂ)。
コレカルシフェロールを、誘発凍結ミセルを形成する適合性について評価した。コレカルシフェロールは、ビタミンＤの一形態である。図９ａに示すように、コレカルシフェロール-infromsを形成することができ、過剰のプルロニックは洗い流せたが、コレカルシフェロールは保持された。コレカルシフェロール-infromsは、270 nmに特性吸収ピークを有した(図９ｂ)。100 mgのコレカルシフェロールを1 mLの塩化メチレン(DCM)中に溶解し、2 MのNaClを含む10 mLの10％(w/v)F127に添加し、有機溶媒が蒸発するまで撹拌した。非取込み型F127の除去プロセスを、ぜん動ポンプ(Masterflex L/S)及びチューブ(masterflex 6434-16)とともに構築された膜ろ過(Sartorius vivaflow、1501008VS)によって、行った。除去プロセスを−７℃で行い、2 M NaCl溶液を透析ろ過溶液のために使用した。F127の除去率を最大にするために、膜モジュール、チューブ、及び洗浄される溶液を、エチレングリコールとエタノール(v/v＝9：1)の混合物に浸漬し、ドライアイスを冷却剤として使用した。図４２に示すように、形成と洗浄に高張食塩水を使用した場合、薬物：F127のモル比は9：1；代表的な濃縮溶液は、75 mg/mLのコレカルシフェロール濃度に達し、サイズは44 nm、及び、多分散指数は0.16であった。
パルミチン酸レチノールを、誘発凍結ミセルを形成する適合性について評価した。パルミチン酸レチノールは、エステル化ビタミンＡ前駆物質である。図１０ａに示すように、パルミチン酸レチノール-infromsを形成することができ、過剰のプルロニックは洗い流せたが、パルミチン酸レチノールは保持された。パルミチン酸レチノール-infromsは、320 nmに特性吸収ピークを有した(図１０ｂ)。100 mgのパルミチン酸レチナールを1 mLの塩化メチレン(DCM)中に溶解し、2 MのNaClを含む10 mLの10％(w/v)F127に添加し、有機溶媒が蒸発するまで撹拌した。非取込み型F127の除去プロセスを、ぜん動ポンプ(Masterflex L/S)及びチューブ(masterflex 6434-16)とともに構築された膜ろ過(Sartorius vivaflow、1501008VS)によって、行った。除去プロセスを−７℃で行い、2 M NaCl溶液を透析ろ過溶液のために使用した。F127の除去率を最大にするために、膜モジュール、チューブ、及び洗浄される溶液を、エチレングリコールとエタノール(v/v＝9：1)の混合物に浸漬し、ドライアイスを冷却剤として使用した。図４２に示すように、形成と洗浄に高張食塩水を使用した場合、薬物：F127のモル比は54：1；代表的な濃縮溶液は、38 mg/mLのパルミチン酸レチノール濃度に達し、サイズは114 nm、及び、多分散指数は0.1625であった。
テムシロリムスを、誘発凍結ミセルを形成する適合性について評価した。テムシロリムスは、ある状況で静脈内に投与される免疫抑制薬である。図１１ａに示すように、テムシロリムス-infromsを形成することができ、過剰のプルロニックは洗い流せたが、テムシロリムスは保持された。テムシロリムス-infromsは、275 nmに特性吸収ピークを有した(図１１ｂ)。
ミフェプリストンを、誘発凍結ミセルを形成する適合性について評価した。ミフェプリストンは、堕胎薬として一般的に使用されているステロイド化合物である。それは注射ではあまり投与されない。図１２ａに示すように、ミフェプリストン-infromsを形成することができ、過剰のプルロニックは完全に洗い流せたが、ミフェプリストンは保持された。ミフェプリストン-infromsは、310 nmに特性吸収ピークを有した(図１２ｂ)。
レチノールを、誘発凍結ミセルを形成する適合性について評価した。レチノールは、ビタミンＡの一形態である。図１３ａに示すように、レチノール-infromsを形成することができ、過剰のプルロニックは完全に洗い流せたが、レチノールは保持された。レチノール-infromsは、300 nm付近に特性吸収ピークを有した(図１３ｂ)。
次に、コエンザイムＱ１０を、誘発凍結ミセルを形成する適合性について評価した。コエンザイムＱ１０は、必須ビタミンである。図１４ａに示すように、コエンザイムＱ１０-infromsを形成することができ、過剰のプルロニックは完全に洗い流せたが、コエンザイムＱ１０は保持された。コエンザイムＱ-infromsは、290 nm付近に特性吸収ピークを有した(図１４ｂ)。100 mgのコエンザイムＱ１０を1 mLの塩化メチレン(DCM)中に溶解し、4 MのNaClを含む10 mLの10％(w/v)F127に添加し、有機溶媒が蒸発するまで撹拌した。非取込み型F127の除去プロセスを、ぜん動ポンプ(Masterflex L/S)及びチューブ(masterflex 6434-16)とともに構築された膜ろ過(Sartorius vivaflow、1501008VS)によって、行った。除去プロセスを−１６℃で行い、4 M NaCl溶液を透析ろ過溶液のために使用した。F127の除去率を最大にするために、膜モジュール、チューブ、及び洗浄される溶液を、エチレングリコールとエタノール(v/v＝9：1)の混合物に浸漬し、ドライアイスを冷却剤として使用した。図４２に示すように、薬物：F127のモル比は30：1；代表的な濃縮溶液は、42 mg/mLのコエンザイムＱ濃度に達し、サイズは115 nm、及び、多分散指数は0.28であった。
次に、我々はタキサン-infrom製剤を試験した。タキサンは、一般的に使用されている化学療法薬であり、癌細胞中の微小管に作用する。ドセタキセル及びパクリタキセルは、最も一般的な２種類のタキサンである。3 M NaCl中でさえ、infromの形成は無効であった(図１５)。しかしながら、等モル比でのビタミンＥの添加により、ドセタキセル及びパクリタキセル両方のinfrom形成は大幅に増加した。同様に、コエンザイムＱの添加は、ドセタキセル及びパクリタキセルのinfrom形成能を劇的に増加する同じ効果を有した(図１６)。F127 ss-infromsに形成されるカバジタキセル(CTX)の溶解度改善に対する、高張食塩水の効果を、新しい図６ａに示す。3又は4 MのNaClの使用は、凝集を実質的に妨げる。
別の実施例において、10 mgのカバジタキセル(CTX)を、異なる質量比のコエンザイムＱ１０(CTX：CoQ＝10：0；10：0.5；１0：1；10：2)とともに、100μLのDCM中に溶解し、3.5 MのNaClを含む1 mLの10％(w/v)F127水溶液に添加し、５時間撹拌した(溶媒が蒸発し、溶液が透明になるまで)。高張食塩水が、ミセル形成中の凝集を妨げることが観察された(図２２ａ)。その後、溶液を水中で１５分の1に希釈し、室温で撹拌した。異なる時点で(1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h)、溶液を5,000xgの回転に５分間かけた；図２２ｂ)のデータは、６時間目に収集した。清澄な黄色の上清を廃棄し、1 mLの水を白い沈殿物をすすぐために添加し、回転プロセスを繰り返した。上清を廃棄した後、CTX沈殿物を1 mLのエタノール中に溶解し、薬物の量を定量するために吸光度を測定した。結果を図２２ｂに示す。質量比10：1又は10：2のCTX：CoQの添加は、水中での希釈後、凝集を妨げる。図２２ｃに示すように、CTX ss-infromsは、現在の臨床製剤と比較して、薬物-対-可溶化剤のモル比がはるかに高かった。図４２に示すように、薬物：F127のモル比は8：1付近；代表的な濃縮溶液は、41 mg/mLのCTX濃度に達し、サイズは62 nm、及び、多分散指数は0.1であった。図２２ｄに示すように、直径4〜5 mmの皮下Mia PACA-2腫瘍を有する胸腺欠損ヌードマウスに、30 mg/kgのカバジタキセル用量で、ss-infromsを、０日目及び４日目に静脈内投与することにより腫瘍を根絶できた。
100 mgのαトコフェロールを1 mLの塩化メチレン(DCM)中に溶解し、2 MのNaClを含む10 mLの10％(w/v)F127に添加し、有機溶媒が蒸発するまで撹拌した。非取込み型F127の除去プロセスを、ぜん動ポンプ(Masterflex L/S)及びチューブ(masterflex 6434-16)とともに構築された膜ろ過(Sartorius vivaflow、1501008VS)によって、行った。除去プロセスを−７℃で行い、2 M NaCl溶液を透析ろ過溶液のために使用した。F127の除去率を最大にするために、膜モジュール、チューブ、及び洗浄される溶液を、エチレングリコールとエタノール(v/v＝9：1)の混合物に浸漬し、ドライアイスを冷却剤として使用した。図４２に示すように、薬物：F127のモル比は21：1；代表的な濃縮溶液は、58 mg/mLのαトコフェロール濃度に達し、サイズは86 nm、及び、多分散指数は0.26であった。
100 mgのエルゴカルシフェロールを1 mLの塩化メチレン(DCM)中に溶解し、2 MのNaClを含む10 mLの10％(w/v)F127に添加し、有機溶媒が蒸発するまで撹拌した。非取込み型F127の除去プロセスを、ぜん動ポンプ(Masterflex L/S)及びチューブ(masterflex 6434-16)とともに構築された膜ろ過(Sartorius vivaflow、1501008VS)によって、行った。除去プロセスを−７℃で行い、2 M NaCl溶液を透析ろ過溶液のために使用した。F127の除去率を最大にするために、膜モジュール、チューブ、及び洗浄される溶液を、エチレングリコールとエタノール(v/v＝9：1)の混合物に浸漬し、ドライアイスを冷却剤として使用した。図４２に示すように、薬物：F127のモル比は9：1；代表的な濃縮溶液は、64 mg/mLのエルゴカルシフェロール濃度に達し、サイズは112 nm、及び、多分散指数は0.31であった。
100 mgのスクアレンを1 mLの塩化メチレン(DCM)中に溶解し、3 MのNaClを含む10 mLの10％(w/v)F127に添加し、有機溶媒が蒸発するまで撹拌した。非取込み型F127の除去プロセスを、ぜん動ポンプ(Masterflex L/S)及びチューブ(masterflex 6434-16)とともに構築された膜ろ過(Sartorius vivaflow、1501008VS)によって、行った。除去プロセスを−１２℃で行い、3 M NaCl溶液を透析ろ過溶液のために使用した。F127の除去率を最大にするために、膜モジュール、チューブ、及び洗浄される溶液を、エチレングリコールとエタノール(v/v＝9：1)の混合物に浸漬し、ドライアイスを冷却剤として使用した。図４２に示すように、薬物：F127のモル比は43：1；代表的な濃縮溶液は、80 mg/mLのスクアレン濃度に達し、サイズは81 nm、及び、多分散指数は0.28であった。
2 mgの2,9,16,23-テトラ-tert-ブチル-29H,31H-フタロシアニンを1 mLの塩化メチレン中に溶解し、10 mLの10％(w/v)に添加し、有機溶媒が蒸発するまで撹拌した。非取込み型F127を除去するために、〜200μLの溶液が保たれるまで、溶液を４℃で遠心ろ過(fisher #UCF9-100-24)にかけた。水を濃縮物に添加し、洗浄手順を３回繰り返した。図４２に示すように、薬物：F127のモル比は、5：1；代表的な濃縮溶液は、19 mg/mLの濃度に達し、サイズは18 nm、及び、多分散指数は0.15であった。
2 mgの亜鉛 2,11,20,29-テトラ-tert-ブチル-2,3-ナフタロシアニンを1 mLの塩化メチレン中に溶解し、10 mLの10％(w/v)に添加し、有機溶媒が蒸発するまで撹拌した。非取込み型F127を除去するために、〜200μLの溶液が保たれるまで、溶液を４℃で遠心ろ過(fisher #UCF9-100-24)にかけた。水を濃縮物に添加し、洗浄手順を３回繰り返した。図４２に示すように、薬物：F127のモル比は、4：1；代表的な濃縮溶液は、30 mg/mLの濃度に達し、サイズは20 nm、及び、多分散指数は0.16であった。
2 mgの5,9,14,18,23,27,32,36-オクタブトキシ-2,3-ナフタロシアニンを1 mLの塩化メチレン中に溶解し、10 mLの10％(w/v)に添加し、有機溶媒が蒸発するまで撹拌した。非取込み型F127を除去するために、〜200μLの溶液が保たれるまで、溶液を４℃で遠心ろ過(fisher #UCF9-100-24)にかけた。図４２に示すように、薬物：F127のモル比は、3：1；代表的な濃縮溶液は、13 mg/mLの濃度に達し、サイズは20 nm、及び、多分散指数は0.16であった。
この実施例は、方法及び結果を含み、ナノナップの調製、及び、消化管イメージングのためのナノナップの使用について記載する。材料は別段の記載がない限り、Sigma社から入手した。
方法
様々な疎水性を有する色素の可溶化及び保持率：vcclab.org.がホストのALOGPS 2.1プログラムを使用して、LogP値を評価した。2 mgのメチレンブルー、キナルジン・レッド、ローダミン6G、IR780、2,11,20,29-テトラ-tert-ブチル-2,3-ナフタロシアニン(BNc)、亜鉛- 2,11,20,29-テトラ-tert-ブチル-2,3-ナフタロシアニン(ZnBNc)、5,9,14,18,23,27,32,36-オクタブトキシ-2,3-ナフタロシアニン(ONc)、ニッケル-5,9,14,18,23,27,32,36-オクタブトキシ-2,3-ナフタロシアニン(NiONc)、バナジル 2,11,20,29-テトラ-tert-ブチル-2,3-ナフタロシアニン(VBNc)、2,9,16,23-テトラ-tert-ブチル-29H,31H-フタロシアニン(BPc)、バナジル 3,10,17,24-テトラ-tert-ブチル-1,8,15,22-テトラキス(ジメチルアミノ)-29H,31H-フタロシアニン(VBPc)を、1 mLのジクロロメタン中に(MBについてはメタノール中に)溶解し、10％ w/vのプルロニックF127(Sigma #P2443)溶液に滴下した。この溶液を、有機溶媒を蒸発させるために、室温(MBについては８０℃)で４時間、ドラフト中で撹拌した。大きな凝集体を除去するために、4000xg・５分間の遠心分離を行った後、100μLの上清を、3 mLの20 mMコール酸ナトリウム溶液で希釈した。吸光度を記録した後、この溶液を透析管(Fisher、#21-152-16；名目分子量カットオフは12,000-14,000ダルトン)中に置き、室温で500 mLの20 mMコール酸ナトリウム・バッファーに対して透析した。４時間後にバッファーを交換した。２４時間後、色素保持率を測定するために、透析管中の溶液の吸光度を再度測定した。
ミセルを以下のようにして調製した。手短に説明すると、2 mgのNc又はPc色素を1 mLのジクロロメタン中に溶解し、10 mLのF127水溶液(10％、w/v)に滴下した。ジクロロメタンは、前記色素が全て可溶性(＞10 mg/mL)であるために選択され、他方、メタノール溶解度は0.1 mg/mL未満であった。ジクロロメタンを蒸発させるため、懸濁液を室温で４時間、ドラフト中で撹拌した。凝集体を除去するために５分間4000xgで遠心分離した後、上清をCMCスイッチング精製のために使用した。非取込み型F127を除去するために、上清を氷上で冷却し、その後、200μLの溶液がろ過装置内で保持されるまで、100,000 MWCO(Fisher #UFC9-100-24)を備えたAmicon Ultra-15遠心ろ過装置中で、４℃で遠心分離した。ろ液を、F127及び色素濃度の測定のために貯蔵した。水をろ過装置に添加し、洗浄プロセスを少なくとも３回繰り返した。
取込み型F127を定量化するために、集めたろ液をまとめ、F127濃度を、既報の比色分析法(若干の変更有り)によって測定した。手短に説明すると、3 mLの水に、0.3 gの硝酸コバルト六水和物と1.2 gのチオシアン酸アンモニウムを溶解することによって、チオシアン酸コバルト試薬を最初に調製した。その後、100μLのチオシアン酸コバルト溶液、0〜7.5 wt％濃度範囲の40μLのF127溶液(より濃いF127溶液は、この範囲になるように希釈された)、200μLの酢酸エチル及び80μLのエタノールを併せた。この混合物を穏やかにボルテックスし、１分間14000xgで遠心分離した。青色の上清を取り除き、上清が無色になるまで、青色の沈殿物をエチルエーテルを使用して数回(〜５回)洗浄した。前記沈殿物をその後1 mLのアセトン中に溶解し、623 nmで吸光度を測定した(図３０は、チオシアン酸コバルト-F127複合体とF127濃度の検量線を示す)。各洗浄後のF127保持率を、質量の重量測定及び比色分析アッセイによる質量百分率の測定によって計算した。色素の濃度は、吸光度の測定によって決定した。
再構成研究のために、2 mgのONc色素を使用する同じ手順によって、ナノナップを調製した。DMPCリポソームは、少量のクロロホルム中に、2 mgのONc及び19.9 mgのDMPC(95モル％のDMPCに相当)を溶解することによって作成した。窒素パージによる溶媒の蒸発後、フィルムを真空下に１時間置き、その後1.5 mLの蒸留水で再水和し、３０分間超音波処理した。ONcナノナップ及びリポソームはその後一晩凍結乾燥した(Labconco Freezone)。その後、粉末を最小容量の水(50μL)中に再懸濁し、吸光度を記録した。吸収ベースラインに干渉する大きな不溶性の凝集体を除去するために、サンプルを短時間、遠心分離した。
Nanonapの物理的及び光学的特性の特性評価：サイズ及びゼータ電位測定は、Nano ZS90 Zetasizer(Malvern Instruments)を用いる動的光散乱を使用して行った。透過型電子顕微法は、JEM-2010電子顕微鏡を用いて実施し、1％の酢酸ウラニルでネガティブ染色したナノナップ水性分散液の形態を測定した。吸光度は、Lambda35紫外・可視分光光度計(Perkin Elmer)によって、室温で、1 cm路長のキュベットを用いて測定した(例外として、高濃縮スペクトルシフト分析は10μm路長のキュベットを使用)。
Ｘ線回析粉末パターンは、凍結乾燥サンプルを用いて、Rigaku Ultima IVで、操作条件40 KV、44 mA、及び1.76 kWによって実施した。使用した回析計のソースは、モノクロメーター・フィルターを用いた、1.54Å波長、Cu Kα線であり、室温でθ/２θモードで分析した。２θスキャンデータは、0.030間隔で収集し、スキャン速度は、0.5 deg/分とした。強度を測定するために使用した技術は、集束ビーム法であった。
散乱及び蛍光特性は、蛍光光度計(Photon Technology International)を使用して評価した。ナノナップ(707 nmにピーク吸収を有するZnBNcナノナップ)の散乱特性を試験するために、700 nmのピーク吸収を有する金ナノロッド(NanoPartz # A12-10-700)を使用し、減衰は水中で700 nmで、0.05に正規化した。共鳴散乱を、同時励起及び600〜800 nm間の放射スキャンで、2 nmのスリット幅を有する蛍光光度計で記録した。バッファー散乱バックグラウンド・ブランクを記録し、ナノ粒子測定値から差し引いた。正規化蛍光測定は、ナノナップの形態で又はジクロロメタン中に直接溶解したものどちらかで、4 nmの励起及び発光スリット幅を用いて、吸光度をマッチさせた希釈ZnBNcの300 nm励起での発光スペクトルを測定することによって行った。
光学パラメータを決定するために、既知の吸光度を有する濃縮ナノナップを凍結乾燥した。ナノナップ粉末の質量を測定し、その後粉末の一部をジクロロメタン中に溶解し、色素の濃度及び質量を決定した。その後、F127の質量を、全凍結乾燥質量中の差に基づいて決定した。疎水性色素が水中で浮遊／懸濁でき、F127の密度は1.05 g/cm3とみなされるため、ナノ粒子の光学特性を算出するために、色素の密度を1 g/cm3であると仮定した。一様な球状であるナノナップの直径を動的光散乱を使用して測定したところ、BPc、ZnBNc、BNc及びONcについてそれぞれ、17 nm、20 nm、26 nm、及び20 nmであることが分かった。ナノナップの体積は、その内部から水を除外したものと見なされる。ナノナップの平均密度と体積に基づいて、粒子当たりの質量及びそれに続いて粒子当たりの色素の数を推定することができた。
疑似胃液(SGF)及び疑似腸液(SIF)中でのナノナップの安定性を評価するために、ペプシンを添加した200 mLのSGF(Ricca、#7108-32)、及びパンクレアチン-含有SIF(Ricca、#7109-32)に対して、ナノナップを透析した。濃縮ナノナップを、吸光度が１に近くなるように、SGFとSIFで希釈し、その後３７℃で透析した。
ナノナップのクリアランス研究：動物実験は、大学バッファロー校の動物実験委員会に従って実施された。6-8週齢のメスのBALB/cマウス(Harlan labs)を、水を自由に飲める状態で、一晩絶食させた。食物は経管投与後に導入した。100 ODsのONcナノナップ(3.42 mg)又はメチレンブルーの経管投与後、マウスを代謝ケージに移し、大便と尿を別々に集めた。大便と尿は、０、２、４、８、及び２４時間目に集め、重量を測定し、分析前まで４℃に保った。回収率を決定するために、尿と血清サンプルの吸光度を直接測定した。組織又は大便(〜50 mg)を2 mLのクロロホルム(メチレンブルーの回収率についてはメタノール)中に溶解し、Tissue Tearorホモジナイザー(Model 985-370)を使用して３０秒間又は色素が完全に溶解するまで、破壊した。細片を除去するために溶液を３分間3000xgで遠心分離し、色素を含有するクロロホルムの吸光度を測定して回収率を決定した。ナノナップ形態中の及びクロロホルム中の色素の吸光度の差を較正するために、ナノナップを一晩凍結乾燥し、同じ体積のクロロホルム中に溶解し、吸光度を測定した。
ナノナップの毒性：インビトロ研究のために、2x104のCaco-2細胞(ATCC)を、ダルベッコ変法イーグル培地中の20％ウシ胎児血清中で、９６ウェルプレートに播いた。翌日、細胞を表示濃度のONcナノナップ又はメチレンブルーで処理した。２４時間後、培地を除去し、XTTを添加して、450 nmの吸光度を測定して、生存率を決定した。インビボ研究のために、マウス(Harlan Labs、6週齢のBALB/cマウス)は、経管投与により(２４時間の期間内に３投与)、20 gのONcナノナップあたり1000 OD860を投与されるか、又はコントロールとして保たれた(オスの経管投与、メスの経管投与、オスのコントロール、メスのコントロールの各群あたり、n＝5)。行動を１日おきにモニターし、質量は毎週測定した。２週間後、マウスを屠殺し、器官を回収した。血液や細片をすすぐため、PBSを使用した。器官を10％の中性緩衝ホルマリン(VWR #16004-114)中に浸漬し、２４時間にわたって固定した。固定した器官を、アルコールのグレード増加によって処理し、キシレン中で透明処理し、パラフィン(TBS)で浸潤させた。それらをその後、包埋し、カットし、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。最終的に、スライドはシングルスライド・スキャナー(Aperio)でスキャンされた。
光音響実験：単一元素超音波トランスデューサーを使用する特注の容積測定反射-モードPATシステムを使用した。手短に説明すると、ポンプレーザー(SLII-10；Continuum；Q-switched Nd：YAG；532 nm)で励起されたOPOレーザー(Surelite OPO PLUS；Continuum；波長同調範囲、680〜2500 nm；パルス幅、5 ns；及び、パルス繰り返し数、10Hz)から、調節可能なレーザーパルスを合成した。ZnBNc又はONcナノナップのそれぞれの吸収ピークにマッチさせた710又は860 nmどちらかの光学波長を、PAイメージング実験のために使用した。生成された光は、ホームメイドの球状円錐体レンズと光学集光装置に、〜5 mJ/cm2のパルスエネルギー(安全性限界よりはるかに小さい)で通過させた。容積測定イメージングのためのラスター走査の間、音響カップリングを、特注の水トレイを用いて改善した。マウス(6-8週齢のメスのBALB/cマウス)を、水トレイの下方に置いた。誘導PAシグナルを、集束超音波トランスデューサー(V308；Olympus NDT；5-MHz 中心周波数)によって捕捉した。Vevo LAZR US/PAイメージングシステムを、21 MHzトランスデューサー周波数を用いたリアルタイム画像処理のために使用した。メスのBALB/cマウスに、100 ODsのナノナップを経管投与した後、消化器系におけるナノナップの動きを、光音響的にモニターした。これは、3.4 mgのONcナノナップ及び13.2 mgのZnBNcナノナップに相当する。関心領域の分析は、システム・ソフトウェアを用いて行った。１分当たりのぜん動速度の計算は、関心領域の強度(0.2秒のレゾリューション)の一次導関数を利用し、平均１０秒ウィンドウにおけるゼロ交差数(収縮に対応)を数量化することによって決定した。光音響スペクトル応答を、Vevo LAZR(VisualSonics)を使用して記録し、ナノナップ及び860 nmにピーク吸収を有する濃度をマッチさせた金ナノロッドについては、水中に浸したPE20管にサンプルを置いた。ナノロッド濃度は、金単独をベースとし、製造業者(Nanorods LLC)によって提供されたものである。鶏の組織中の深度-応答は、ホームメイドの光音響システムを使用して測定し、吸収を400.2にマッチさせたZnBNcとONcナノナップを含有する管の頂部に、鶏組織の断片を層状に重ね、1.5 mJ/cm2パルスエネルギーを、ZnBNcとONcナノナップをそれぞれ励起するのに使用した710 nm及び860 nmの波長で記録した。腸閉塞研究のために、12〜14gのメスのCD-1マウス(Harlan)を、水を飲める状態で一晩絶食させた。腹部をその後、胃の近くで1 cmの横切開で開腹し、十二指腸をナイロン縫合糸(VWR #89219-096)で結紮した。偽処置マウスには、十二指腸結紮を行わなかったが、その他についての手順は同一とした。腹部の皮膚を再び縫合して閉じ、数時間内に、マウスに経管投与で100 OD860用量のONcナノナップを投与した。一時間後、マウスを麻酔し、Vevo LAZRシステムで撮像した。
ナノナップ放射標識実験：64Cuを、ウィスコンシン大学マディソン校でCTI RDS 112サイクロトロンを使用して、64Ni(p,n)64Cu反応により製造した。ナノナップの量を増加させたパイロット研究は、良好な放射標識率(＞65％、図４４)が、37 MBqの64Cu当たり、わずか1μgナノナップで達成できることを明らかにした。PETがインビボ検出についてPATより鋭敏でも、２つの研究の間で比較可能な体内分布パターンを保証するために、マウスあたり同程度の量のナノナップを使用した。
標識化のために、37 MBqの64CuCl2を、300μLの0.1 M酢酸ナトリウムバッファー(pH 5.5)中で希釈し、400 ODナノナップに添加した。反応混合物を、持続的な撹拌下で、３７℃で３０分間インキュベートした。64Cu-ナノナップを、移動相としてリン酸緩衝食塩水(PBS)を使用するAmicon Ultra-4遠心ろ過ユニット(Millipore)によって精製した。最終的な精製64Cu-ナノナップを500μLのPBS中に再懸濁し、インビボ安定性、経口経管投与、PET画像法、及び体内分布研究のために使用した。
インビトロキレート化安定性研究のために、37 MBqの64CuCl2を、３０分間、1 ODのナノナップとともにインキュベートし、非抱合型64Cuを、100 kDaカットオフAmiconフィルター(Millipore、ビルリカ、マサチューセッツ州)を使用して分離した。その後、1 ODの64Cu-ナノナップを、1 mLのSGF又はSIF中に再懸濁し、撹拌しながら３７℃でインキュベートした。混合物の一部(50μL)を、様々な時点(インキュベーション後、０．５、１、２、４、８、及び２４時間)でサンプリングし、100 kDaカットオフフィルターを通してろ過した。ろ液を集め、放射活性をWizard2自動ガンマ・カウンター(Perkin-Elmer、ウォルサム、マサチューセッツ州)によって測定した。ナノナップ上に保持された64Cuのパーセンテージを、以下の式を使用して計算した：(全放射活性−ろ液中の放射活性)／全放射活性
全ての実験は三つ組で実施した。
PETスキャンは、Inveon microPET/microCTげっ歯類モデルスキャナー(Siemens Medical Solutions USA, Inc.)を用いて実施した。一晩の絶食後、各BALB/cマウスに、経口経管投与により、〜7.4 MBqの64Cu-ナノナップ(125μL PBS中100 ODs)を投与した。５〜１０分間の静的PETスキャンを、注入後の様々な時点で行った。画像は、散乱補正なしで、最大事後(MAP)アルゴリズムを使用して再構成した。各PETスキャンの関心領域分析は、減衰補正全身画像上で、メーカー・ソフトウェア(Inveon Research Workplace)を使用して実施し、腸について組織のグラム当たりの注入量パーセンテージ(％ID/g)を計算した。
注入後２４時間目の最後のPETスキャンの後、全てのマウスを安楽死させ、体内分布研究を行い、PET画像法に基づく量的トレーサー取込み値が、マウスにおける放射活性分布を忠実に表すかを確認した。血液及び主要な器官/組織を採取し、湿重量を測定した。組織中の放射活性を、ガンマカウンター(Perkin Elmer)を使用して測定し、％ID/gとして表示した。
結果：
凍結ナフタロシアニンミセルの形成
様々な疎水性を有する発色団について、それらが生体適合性サーファクタント中への希釈後、安定なナノ粒子を自発的に構築するかどうかを決定するために、試験を行った。経口による消費のため米国食品医薬局(FDA)によって承認されているため、プルロニック(ポリ(オキシエチレン)-ポリ(オキシプロピレン)-ポリ(オキシエチレン)；PEO-PPO-PEO)F127を選択した。発色団-F127複合体の安定性を試験するために、溶液をその後、胆汁サーファクタント・コール酸ナトリウム(その小さいミセルサイズのため、透析管を通過できる)に対して透析した。図２３ａに示すように、オクタノール-水分配係数(ALOGPSアルゴリズム(Tetko, I. V. & Tanchuk, V. Y., J. Chem. Inf. Comput. Sci. 42, 1136-1145(2002)によって予測されるLogP値)に基づく疎水性の高い色素は、大過剰のコール酸ミセルで容易に交換されずに、透析後も高い保持率を示した。評価した色素のうち、そのテトラピロール構造と極度の疎水性を特徴とする、フタロシアニン(Pc)及びナフタロシアニン(Nc)誘導体(図２３ｂ)は、ほぼ完全に保持された。凝集体を除去するために遠心分離した後の、非常にカラフルな上清の存在は、可溶性のナノ製剤化ナフタロシアニン(ナノナップ)の形成を示唆した。ナノナップの収率は、F127濃度が増加するにつれて増加した(図２９)。ナノナップ収率のシャープな増加は、F127の臨界ミセル濃度(CMC)(室温で〜1％)より上で観察されず、これはナノナップ形成メカニズムがユニマー-ミセル平衡と無関係であることを暗に示す。
F127が温度感受性CMCを有するため、我々は、ミセルからF127ユニマーへの変換に、溶液の温度の低下が与える影響を試験した。４℃への温度の低下は、凍結ミセルの形成によって説明できる、Nc凝集をもたらさなかった。これは、全ての余剰なF127の除去に対する新規な戦略を可能にする(図２４ａ)。既報の比色分析(図３０)を使用して検出したところ、図２４ｂに示すように、遠心ろ過は４℃で全ての遊離F127を除去したが、このプロセスは２５℃では無効であった。CMCスイッチングは、ナノナップの自己集合に影響を与えず、これらは４℃の洗浄プロセスの間、量的に保持された(図２４ｃ)。遊離のサーファクタントは全て、３回の低温洗浄サイクルにより、ナノナップから除去され、接触角のさらなる変化は、さらなる洗浄によって観察されなかった(図３１)。PA用途に採用されている色素であるメチレンブルー(MB)は、ナノナップとは異なり、３回の遠心ろ過洗浄後、残余分から完全に除去された。
ナノ粒子は20 nmの球形物を形成した(図２４ｄ、２４ｅ)。CMCスイッチング・プロセスが全ての過剰なF127を除去したので、十分に分散されたナノナップを、高い色素-対-F127のモル比(＞３：１ 色素：F127、図４３参照)に濃縮することができた。我々は、19：1の 脂質：色素モル比にてジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)を使用して、ナノナップ又はリポソーム製剤中のどちらかで、2 mgのNc色素を調製した。最初の可溶化後、溶液を凍結乾燥し、最小容量の水(50μL)中で再構成した。図２４ｆにて、約1000の最も高いNc NIR吸収によって証明されるように、濃縮ナノナップは水中で溶解した。しかしながら、凍結乾燥リポソームを再構成した後、いくらかのNc-再可溶化が観察されたが、ナノナップ形成より桁が低かった。CMCスイッチングは、F127サーファクタントの存在の総量を劇的に減らすため、はるかに高い濃度でナノナップを再構成できた。Nc可溶化のために必要なリン脂質の量は、CMCスイッチングによって同程度まで減少できず、凍結乾燥及び再構成中のさらなる濃縮後に、リン脂質濃度は溶解限度を超えた。封入の困難性は、溶媒除去中のNcの非晶質沈殿によって、さらに影響を受けた可能性がある。
ナノナップを、疎水性Pc及びNc発色団の範囲から産生できたので(図２３ａ)、我々は、NIRウィンドウにわたるスペクトル特性を有するサブセットの同定に着手した。異なる市販のPc及びNc色素を、純粋なナノナップを産生するためにCMCスイッチング法を使用してスクリーンした(補充の図４)。色素減衰係数は、有機溶媒中で、1.0〜2.2×105 M-1 cm-1に渡り、他方、ナノナップ形態中では、これらは0.4〜1.5×105 M-1 cm-1に減少した(図４３)。これは、ナノナップ中のNcの密な配置が、変化した電子特性及び分子間相互作用をもたらしたことを示唆し、そのことは、水性ナノナップの完全な蛍光自己消光によってさらにサポートされた(図３３)。凍結乾燥サンプルの粉末回析分析は、ナノナップ内の結晶性Ncの存在を明らかにせず、色素が組織的スタッキング無しで、おそらくF127とともに埋め込まれていることを示す(図３４)。ナノナップの内側は、色素と疎水性F127 PPOブロックの非晶質ブレンドであると想定される。しかしながら、構造研究は、F127 PPOブロックの回転半径が、わずか1.6 nmであることを示しているので、PEO-PPO-PEOブロックの隣接性を考えると、ナノナップの内側は、ごく一部の親水性PEOも含むかもしれず、これはより疎水性のNc及びPPOから離れるであろう。ナノナップの水に面するシェルは、PEOのみからなると推定される。
１つのPc及び３つのNc色素が、600、707、793及び863 nm(図２５ａ、ｂ)にピークを有するナノナップを生じることが特定された。ナノナップは、適度に狭い半値全幅(50〜100 nm)を維持する一方、NIRスペクトルにわたる吸収を生成した。PAイメージングは多重吸収波長を解像できるので、多重波長クラスのナノ粒子が望まれる。ナノナップのPAスペクトル応答は、それらの吸収スペクトルで並んだ(図３５)。ナノ粒子は、1000より大きい吸収を有する完全な可溶性溶液へと濃縮できた。遊離色素と比べたナノナップの一つの利点は、濃縮により、吸収ピーク位置が無視できる程度のシフトを示すことであった(図２５ｃ)。これは、10μmの路長で濃縮溶液(〜1000光学密度(OD)/mL)の吸収を測定し、その後、同じ溶液の1000倍希釈を1 cmの路長で測定することによって評価された。共通に使用されたPA色素、MB及びインドシアニングリーンは、高濃度で遭遇する自己相互作用によって誘発される調節電子特性の結果として、濃縮溶液中で大きな吸収シフトを示した。他方、ナノナップマトリクス中でF127と共会合したNcは、改変ピーク吸収シフトを示さず、ナノナップが濃度依存性-色素相互作用を妨げることを実証した(そうでなければ、高濃度で吸収に影響があるであろう)。濃度依存性の吸収シフトは、PAイメージングで有用となりうるが、濃度非依存性の光学パラメータは、GI-光音響断層撮影(PAT)の場合にそうであるようにように、コントラスト・移動の単純化分析をもたらす。ゼータ電位の測定に基くと、ナノナップは、幅広いｐＨ値にわたってほぼ中性の表面電荷を維持した(図３６)。
分光光度計で測定した吸光度は、吸収と散乱の両方の影響を含む。しかしながら、吸収のみが光音響効果に寄与する。共鳴光散乱を、散乱を推定するために使用した。減衰-マッチド金ナノロッドと比較して、ナノナップは無視できる散乱を示した。ナノナップは、散乱成分を持たないと考えられる。精製ナノナップ中のNcとF127のモル比と幾何学的計算に基づいて、我々は、各5,9,14,18,23,27,32,36-オクタブトキシ-2,3-ナフタロシアニン(ONc)ナノナップが、501分子のNcと、155分子のF127を含むと推定した(光学断面2.9×10-17 m2)。さらなる光学パラメータを図４３に示す。この断面は、ナノロッドより２桁小さいが、ナノナップ特有の分散性は、溶解度を維持しながら、それらを桁違いに高い粒子密度に濃縮することを可能にする。結果として、安定なナノ粒子溶液は、1000より高い全吸収で達成可能である。
光音響腸イメージング
経口投与PA剤としての使用に対するナノナップの適合性を評価するために、我々は、しばしばナノ粒子に障害を提示する胃や腸の厳しい状況に、ナノナップが耐え得るかどうかを確認した。ナノナップを３７℃で疑似胃液(SGF)又は疑似腸液(SIF)中で透析すると、認識できる吸収の損失は観察されず、厳しい透析コンディションにおける安定性が実証された(図２６ａ)。水中で、1.2 mg/mLのONcナノナップは、濃度をマッチさせ且つ波長をマッチさせた金ナノロッドより、100倍を超える光音響シグナルを生成した(図３７)。
ONcナノナップの細胞毒性を、Caco-2細胞を使用して評価した。MBは細胞培地中でインキュベートした際、１より大きい吸光度で毒性を誘発したが、ナノナップは、試験した最も高い値である、吸光度100まで、毒性を示さなかった(図３８)。これらの結果に後押しされ、我々は経管投与により、マウスに100 ODsのONcナノナップを投与した。ナノナップは、大便中に完全に排出された(図２６ｂ)。腸管吸収の欠如は、膜を通じた受動拡散を妨げる20 nmサイズのナノナップ、及び生体吸収を妨げるF127のPEO特性の両方に起因すると思われる。比較のため、100 ODsのMBを同じ方法で投与した。MBは全身的に吸収され、尿中で検出可能であり、MBの大半は生体に残るか、又は代謝された(図２６ｃ)。
腸管組織へのナノナップの効果を、組織像を使用して試験した(図２６ｄ)。目立った炎症応答又は損傷効果は誘発されず、腸管絨毛及び腺窩は健康に見えた。それらの量的な排出と全身性吸収の欠如によって予測されるナノナップの安全性を前提として、我々は次に、50,000 OD860/kgの経口用量を使用して、ナノナップの急性毒性を評価した。これは、イメージング用途のために使用される機能的なナノナップ用量の１０倍過剰である。２週間の研究の間、オス又はメスのマウスで、有害な行動の変化又は体重の変化は生じなかった(図３９ａ)。組織像は、全身性(図３９ｂ)又は消化管(図３９ｃ)の毒性がないことを明らかにした。
我々は、次にインビボでの腸の非侵襲性PATのためのナノナップの有用性を試験した。図２７ａに示されるように、特注の単一元素スキャンシステムを使用するPAイメージングは、消化管におけるナノナップの体内分布を100μmの距離分解能で明らかにした。腸を通じた亜鉛-2,11,20,29-テトラ-tert-ブチル-2,3-ナフタロシアニン(ZnBNc)ナノナップの進行が明確に観察された。無視できる程度のバックグラウンドが検出され、それは腸の特徴の明確な解像度を可能にし、個々の小腸憩室が識別可能になった。深度コード化分析は、5 mmへの深度マッピングにより腸管分布のさらなる空間的な詳細を明らかにした(図２７ｂ)。
動的撮像のために、Vevo LAZRトランスデューサー・アレイ・システムを使用した。100 ODsのONcナノナップを、経管投与により投与した。図２７ｃ中の横行スライスに示すように、最小のバックグラウンドで、胃の表面下の腸内のナノナップ分布を明らかにするために、PA(カラー)をUS(灰色)と完全に重ね合わせた。１秒当たり５フレーム数のスキャン速度は、腸内のナノナップの動きの詳細な追跡を可能にした。ナノナップ流の急速な変化が、容易に分かり(図２７ｄ)、詳細なぜん動の動きは明確であった。起伏のあるナノナップ含量を示す関心領域の選択によって、分節運動又はぜん動の流れが定量化された。代表的な関心領域内へのナノナップ流は、明確な流入・流出の動きを伴って、周期的に発生した(図２７ｅ)。図２７ｆに示すぜん動腸管流の速度の計算は、１分当たり３０に近い収縮を実証した。
US同時登録を試験することにより、解剖学的な特徴のために、腸管ナノナップ分布をマップした。図２７ｇに示すように、膀胱と腎臓はUSで特定され、隣接する腸管のナノナップの相対的位置は、経時的に変化した。２つのUS/PA最大値投影法(MIP)は、３０分間にわたる、腸を通過するナノナップの動きをトレースする大量のスキャンから作成された(図２７ｈ)。MIPは、任意の個々の横行スライスで腸管配向を提示するのに有用である。表示される関心領域は、リアルタイムで、腸の横行スライスを通るナノナップの面外通過を示した。比較的一定なナノナップ容積を有する、コントロール領域「Ｂ」と「Ｃ」に比べて、ナノナップは領域「Ａ」から１分間にわたって定量的に流出し、当該プロセスにおけるぜん動収縮を示した。
小腸閉塞により、米国では年間300,000件の手術が行われる。US/PAイメージングが、腸閉塞の検出に有用であるかどうか決定するために、我々は外科的誘導-十二指腸結紮マウスモデルを使用した。十二指腸の結紮又は偽処置(開腹するが、結紮は省略)後、腹部を縫合して閉じた。マウスにその後100 OD860用量のONcナノナップを投与し、経管投与後１時間撮像した。閉塞したマウスの胃は、明らかに大容量に膨張した。US横行スライスは、顕著な空隙胃容積を、結紮マウスで示したが、偽処置のものでは示さなかった(図２７ｉ、上部)。USは閉塞マウスの膨張した胃を識別できたが、PAシグナルはほとんど検出できなかった。閉塞マウスの拡張した胃は、大きなエア・ポケットを含み、これがPA減衰を引き起こした可能性があり、この現象に対するさらなる調査が必要である。閉塞マウスでは、全腸管エリアにわたって、PAシグナルはほとんど検出されなかった(図２７ｉ、下部)。しかしながら、偽処置マウスは強いPAシグナルを示し、ナノナップが腸を通じて阻害されず進行したことを実証する。それゆえ、ナノナップは小腸閉塞の検出の診断ツールとして有用である可能性がある。
それらの高吸収により、ZnBNc(707 nm)及びONcナノナップ(860 nm)はどちらも、低バックグラウンドGI PAイメージングのために好適であった。最適なナノナップの波長の選択は、ケースによって異なる。例えば、現在光音響計測手段で使用されている多くの波長可変レーザーは、707 nmでより高いレーザー出力を生じ、他方、860 nmは、より低い内因性の生物学的バックグラウンドと散乱を有する可能性がある。鶏の胸組織において、吸光度-マッチドONc及びZnBNcナノナップは、両方とも、同様の光音響シグナル-対-ノイズ比を伴い(図４０)、深度2.5 cmまで容易に検出できた。使用されたパルスエネルギーは、わずか2及び1.5 mJ/cm2であり、これらはそれぞれ、ZnBNc及びONcナノナップ波長のためのレーザー安全限度のわずか〜1/10及び1/30に対応する。
陽電子放出断層撮影
PAテクノロジーは急速に向上しているが、深部組織(＞5 cm)PAイメージングはまだ、ヒトにおいて報告されていない。陽電子放出断層撮影(PET)は、非侵襲性全身イメージングのために臨床的に使用されているので、我々は補完的技術として、ナノナップに基づくPET画像法を試験した。Nc大環状分子内の４つのピロール窒素は、銅に配位でき、キレート剤として役立ち、且つ、陽電子放射体64Cuは、無傷のテトラピロールをベースとするナノ粒子を、うまく標識するのに使用できることが示された。ナノナップがNcsそれら自体から形成されるため、キレート剤抱合の追加工程は必要ない。
ナノナップを水溶液中で64Cuとともにインキュベートすると、標識化が単に３０分で達成され、65％を超える放射標識率が得られる(図２８ａ及び図４４)。サイズ及びゼータ電子は、影響を受けなかった(図４１)。遊離銅の除去後、64Cu-ナノナップを、３７℃でSIF及びSGF中でインキュベートした場合、キレート化はインビトロで安定であった(図２８ｂ)。100 OD860用量の放射標識ONcナノナップをその後経管投与した(マウス当たり7.4 MBq)。64Cu放射標識の85％に対して、 99％のナノナップが大便中に排泄された(図２８ｃ)。この矛盾は、厳しいGI環境中のNcキレートからいくらかの銅が移動したことに起因すると思われる。わずかな放射活性は、マウスのどの部分でも残り、全ての器官は1.5％ID/g未満の64Cuを保持していた(図２８ｄ)。それらが大便中に除去されたので、ナノナップそれ自体は、腸に残っているごく微量を除き、どの器官でも検出されなかった。
消化管を通じたナノナップの動きを追跡するためにPETを使用した。０．５時間のPETイメージングから視認できるように(図２８ｅ)、経口経管投与後、胃及び腸上部に放射活性が存在した。腸内の64Cu-ナノナップの明確な分布パターンは、投与後３時間で観察された。PETは組織侵入限度の無い断層撮影法であるため、マウスの一連の全身連続的冠状スライスを得ることができた(図２８ｆ)。トモグラフィー解析は、バックグラウンド・フリーの、三次元の腸管可視化を示した。
高いNc疎水性のおかげで、動力学的-凍結ナノナップは、腸内で安定となるように形成されることができ、全身性吸収を回避し、NIRにおいて非常に高く且つ調節可能な光吸収を生じる。それらは有機物であり、FDAが承認したサーファクタントから構築され、毒性が観察されることなく大便中に完全に排泄される。ナノナップを使用するリアルタイムUS/PA腸イメージングは、高解像度、低バックグラウンド、腸管の解剖学、病理学及び機能のリアルタイム原理証明マッピングを提供した。さらに、PETのためのナノナップの直接的な使用は、全身イメージングのための完全な組織透過性を伴う、定量的で、鋭敏で、臨床的に確立されたイメージング法を可能にする。PETの空間分解能の限界(数mm)は、単一の剤を使用する局在性PET技術で相殺できる。それらの多様な性質、安定性、及び、腎クリアランス閾値を超える小サイズに基づき、GIイメージングを超えて、ナノナップは、静脈内に投与される造影剤としての使用への可能性も有する。研究の今後の方向性は、標的化検出のためのナノナップ表面特性の改質、及び、腸疾患の診断のための多色PAイメージングの試験を含む可能性がある。
本開示を、特定の実施形態を通じて説明してきたが、通常の変更は当業者に明らかであり、そのような変更は本開示の範囲内に包まれる。

Claims (17)

  1. ミセルを含有する水性組成物であって、前記ミセルはポロクサマーを含み、且つ、一以上の疎水性物質を封入することにより、疎水性物質-含有ポロクサマーミセルを形成しており、
    前記疎水性物質は、少なくとも２のオクタノール-水分配係数を有するものであり、
    当該組成物中の疎水性物質：ポロクサマーのモル比は、少なくとも３：１であり、且つ、当該組成物中のポロクサマーの少なくとも９５％が疎水性物質-含有ミセルを形成している、組成物。
  2. 製剤中のポロクサマー分子の少なくとも９６、９７、９８又は９９％が、疎水性物質-含有ミセル中に存在している、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記疎水性物質が薬物であり、薬物：ポロクサマーのモル比が７：１〜６０：１である、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 前記疎水性物質が光学的造影剤(色素)であり、色素：ポロクサマーのモル比が３：１〜１０：１である、請求項１または２に記載の組成物。
  5. 前記ポロクサマーが、プルロニックＦ１２７、Ｆ６８、Ｆ１０８、又はそれらの混合物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
  6. 前記疎水性物質が、少なくとも３のオクタノール-水分配係数を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
  7. 前記疎水性物質が、α-トコフェロール、アバフンギン、アミオダロン、アジスロマイシン二水和物、ベプリジル、β-カロテン、ブデソニド、カバジタキセル、カルバマゼピン、カルシフェロール、カルベジロール、クロロキン、クロルプロマジン、コレカルシフェロール、クロトリマゾール、コエンザイムＱ１０、コチニン、シクリジン、シクロスポリンＡ、ジアゼパム、ドセタキセル、エコナゾール、エルゴカルシフェロール、エトポシド、フェンタニル、フェノフィブラート、フィナステリド、フルベストラント、ハロペリドール、デカン酸ハロペリドール、イトラコナゾール、イベルメクチン、ラベタロール、ラタノプロスト、メロキシカム、ミコナゾール、ミフェプリストン、ミコフェノール酸モフェチル、ニモジピン、パクリタキセル、フェニトイン、ピロキシカム、プレグネノロン、酢酸プレグネノロン、プロゲステロン、プロポフォール、レセルピン、レチノール、パルミチン酸レチノール、セルタコナゾール、シブトラミン、シンバスチン、シロリムス、スクアレン、タクロリムス、タモキシフェン、テムシロリムス、テストステロン、シピオン酸テストステロン、プロピオン酸テストステロン、ウンデカン酸テストステロン、チプラナビル、トラボプロスト、トリアムシノロン、ビタミンＫ１及びこれらの組み合わせからなる群より選択される薬物である、請求項１〜３、５又は６のいずれか１項に記載の組成物。
  8. 前記疎水性物質が、フタロシアニン(Ｐｃ)、ナフタロシアニン(Ｎｃ)、クロリン、ポルフィリン、及び、バクテリオクロリンのカテゴリーから選択される光学的造影剤である、請求項１，２，４，５，６のいずれか１項に記載の組成物。
  9. 疎水性物質の輸送に適切なミセルを含む組成物を作る方法であって、
    ａ）有機溶媒中に溶解した疎水性物質を、ポロクサマーの水溶液と接触させ、それにより疎水性物質-含有ポロクサマーミセルを形成すること、ここで、前記疎水性物質は、少なくとも２のオクタノール-水分配係数を有するのである；
    ｂ）−２０℃〜１０℃の温度にさらすことによって、疎水性物質-含有ミセルを形成していないポロクサマー分子を、単一のポロクサマー単位にすること；
    ｃ）単一のポロクサマー単位を除去して、疎水性物質-含有ミセルを得ること、この際、ポロクサマー分子の少なくとも８５％が除去され、疎水性物質：ポロクサマーのモル比は３：１〜６０：１であり、且つ、組成物中の９５％以上のポロクサマーは、疎水性物質-含有ミセル中に存在している
    ことを含む、方法。
  10. ａ）における前記有機溶媒が、１０〜２００ｍｇ/ｍＬの濃度であり、ポロクサマー水溶液が、５〜１５％(ｗ/ｖ)の濃度である、請求項９に記載の方法。
  11. 前記疎水性物質が薬物であり、ｃ）における疎水性物質：ポロクサマーのモル比が１０：１〜６０：１である、請求項９または１０に記載の方法。
  12. 前記疎水性物質が画像用造影剤(色素)であり、ｃ）における疎水性物質：ポロクサマーのモル比が３：１〜１０：１である、請求項９または１０に記載の方法。
  13. さらに、ｃ）で得られた組成物を、凍結乾燥することを含む、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 治療及び／又は予防の目的で個体に投与される組成物である、請求項３に記載の組成物。
  15. 個体の胃腸(ＧＩ)管の少なくとも一部をイメージングするために個体に投与される組成物である、請求項４に記載の組成物。
  16. 個体の胃腸(ＧＩ)管の少なくとも一部をイメージングする方法であって、
    ａ）請求項４に記載の疎水性色素-含有ミセル組成物を得ること、ここで、前記色素はイメージングに適切な色素であり、少なくとも２のオクタノール-水分配係数を有している；
    ｂ）個体に経口ルートにより、前記の色素含有ミセル組成物を投与すること；及び、
    ｃ）投与から適切な時間後に、光音響又は陽電子放出断層撮影イメージングを使用して、胃腸管のイメージを一以上得ること；
    を含む方法。
  17. 前記色素が、2,11,20,29-テトラ-tert-ブチル-2,3-ナフタロシアニン(BNc)、亜鉛- 2,11,20,29-テトラ-tert-ブチル-2,3-ナフタロシアニン(ZnBNc)、5,9,14,18,23,27,32,36-オクタブトキシ-2,3-ナフタロシアニン(ONc)、ニッケル-5,9,14,18,23,27,32,36-オクタブトキシ-2,3-ナフタロシアニン(NiONc)、バナジル 2,11,20,29-テトラ-tert-ブチル-2,3-ナフタロシアニン(VBNc)、2,9,16,23-テトラ-tert-ブチル-29H,31H-フタロシアニン(BPc)、バナジル 3,10,17,24-テトラ-tert-ブチル-1,8,15,22-テトラキス(ジメチルアミノ)-29H,31H-フタロシアニン(VBPc)、又はそれらの組み合わせである、請求項１６に記載の方法。
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