CN103446040A

CN103446040A - 一种包载多西紫杉醇的聚合物胶束及其制备方法

Info

Publication number: CN103446040A
Application number: CN2012101814101A
Authority: CN
Inventors: 方晓玲; 陈亮岑; 沙先谊
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2012-06-04
Filing date: 2012-06-04
Publication date: 2013-12-18

Abstract

本发明属生物医药技术领域，涉及一种包载多西紫杉醇的聚合物胶束及其制备方法。本发明采用薄膜分散法制备多西紫杉醇Pluronic F127/P105混合胶束，以Pluronic为载体，将多西紫杉醇包载在Pluronic的疏水内核PPO中。本发明制备的混合胶束能有效地增加多西紫杉醇的溶解度，并且F127的PEO长链可起到长循环的作用，避免体内网状内皮细胞系统的吞噬，从而延长血液中的半衰期，其中的P105能最大程度的抑制P-gp外排，可起到高效逆转肿瘤的多药耐药以提高对肿瘤的治疗作用。本发明的混合胶束不含吐温80和乙醇，与市售的多西紫杉醇注射液比较，能明显降低药物的毒副作用，增加临床应用的安全性。

Description

一种包载多西紫杉醇的聚合物胶束及其制备方法

技术领域

本发明属生物医药技术领域，具体涉及一种包载多西紫杉醇的聚合物胶束及其制备方法。

技术背景

多药耐药性(multidrug resistance，MDR)是指肿瘤细胞能对多种化学结构、功能和作用机制均不同的抗癌药物产生交叉抗药性。肿瘤细胞对抗癌药物产生多药耐药性是肿瘤化疗失败的主要原因，也是化学疗法介入肿瘤治疗以来一直悬而未决的重要问题。研究表明，引起MDR的机制比较复杂，但其中MDR1的过度表达产生的P-gp等外排泵可将细胞内药物“泵”出，从而导致细胞内药物浓度降低是MDR的主要产生机制。

多西紫杉醇（Docetaxel，DTX）是由浆果紫杉的针叶中提取的前体物，再经半合成所得的一种紫杉烷类抗肿瘤药物。其作用机制是通过与构成细胞骨架主要成分的β微管蛋白N末端的31个氨基酸残基及中段的217～231氨基酸残基结合，增加微管微丝间的相互作用，显著稳定微管蛋白构象，致使细胞不能通过有丝分裂检查点，停止在有丝分裂G2/M期结合点，形成稳定的非功能性微管束，达到破坏肿瘤细胞的有丝分裂和增殖它通过促进纺锤体微管蛋白的聚合而促进微管的装配，抑制解聚，保持微管蛋白稳定，抑制细胞有丝分裂。目前多西紫杉醇被广泛应用于治疗转移性乳腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、软组织肉瘤、头颈癌、和胃癌等多种肿瘤的治疗。

多西紫杉醇结构式为C43H53NO14，分子量：807.88，结构式如下：

虽然多西紫杉醇较紫杉醇其溶解度有所提高，但水溶性仍然较差（常温下溶解度为2.903mg/L）。目前多西紫杉醇上市剂型仅为注射液，以吐温-80为溶剂溶解后分装，临床使用前，用13％的乙醇水溶液稀释，给药时加入到5％葡萄糖注射液或0.9％氯化钠注射液中静脉滴注。另有文献报道将多西紫杉醇溶解于吐温80-乙醇(50:50)混合系统中配制使用。由于吐温80具有溶血性且黏性大，临床Ⅰ期实验中大多数患者产生了明显的过敏反应。因此，在使用多西紫杉醇注射液治疗的同时,需要使用皮质激素和H1、H2受体拮抗剂，以消除不良反应的发生。另外，由于紫杉烷类药物对P-gp等外排蛋白的敏感性，MDR已逐渐成为限制多西紫杉醇临床应用的主要原因。因此开发多西紫杉醇新剂型同时考虑逆转MDR以提高肿瘤治疗效果是目前亟待解决的问题。

近年来的研究表明Pluronic是一种多功能药用辅料，它由聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯(PEO-PPO-PEO)三嵌段构成。Kabanov等研究发现Ⅱ类Pluronic能最大程度的抑制P-gp外排，原因在于Pluronic能够有效降低膜微观粘度，干扰ATP酶的活力，减少ATP的生成。另外，Pluronic系列的分子量均小于15000Da，其单体可由经肾脏排泄，具有良好的生物相容性。当Pluronic的浓度大于CMC时，其PPO链可形成疏水内核用于包载难溶性抗肿瘤药物，增加溶解度、提高体内外稳定性；PEO链可形成亲水外壳，具有空间稳定作用和EPR效应，避免RES系统的吞噬，延长体循环时间，增强被动靶向能力。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术所存在的缺陷与不足，提供一种多西紫杉醇的新剂型，涉及一种包载多西紫杉醇的聚合物胶束，具体涉及一种多西紫杉醇PluronicF127/P105混合胶束，该混合胶束能有效地增加多西紫杉醇的溶解度，并且可以避免体内网状内皮细胞系统的吞噬，从而提高其在血液中的循环时间，同时Pluronic载体可以发挥逆转肿瘤MDR作用，提高多西紫杉醇的抗肿瘤效果。

本发明的多西紫杉醇Pluronic F127/P105混合胶束，以Pluronic为载体，将多西紫杉醇包载在Pluronic的疏水内核PPO中，制成包载多西紫杉醇的聚合物胶束。

本发明所述的Pluronic F127，即泊洛沙姆407（Poloxamer 407），由两端PEO与中间PPO形成的三嵌段共聚物，其中每段PEO约为100个重复单位，PPO约为65个重复单位，分子量为12600。

本发明所述的Pluronic P105，即泊洛沙姆335（Poloxamer 335），由两端PEO与中间PPO形成的三嵌段共聚物，其中每段PEO约为37个重复单位，PPO约为56个重复单位，分子量为6500。

所述Pluronic F127与Pluronic P105的质量比为100:1~1:100。

所述Pluronic与多西紫杉醇的质量比为（10：1）~（1000：1）。

本发明的另一目的是提供制备所述包载多西紫杉醇的聚合物胶束的方法。

具体的，本发明的包载多西紫杉醇的聚合物胶束的制备方法，其特征在于，采用薄膜分散法，以Pluronic为载体，将多西紫杉醇包载在Pluronic的疏水内核PPO中，制得载有多西紫杉醇的Pluronic F127/P105混合胶束；

其包括步骤：

⑴将Pluronic F127、Pluronic P105、多西紫杉醇溶于有机溶剂中，使Pluronic F127、PluronicP105与多西紫杉醇形成均匀的溶液Ⅰ；

⑵将溶液Ⅰ旋转蒸发出去有机溶剂，制得以Pluronic为载体的多西紫杉醇薄膜；

⑶将薄膜置于一定温度下溶胀后水化，制得以Pluronic为载体的多西紫杉醇胶束溶液；

⑷向多西紫杉醇多西紫杉醇胶束溶液中加入冻干保护剂，过滤除菌；

⑸冷冻干燥除去水分，制得干燥的多西紫杉醇Pluronic混合胶束冻干剂。

本发明方法中，所述的Pluronic F127，即泊洛沙姆407（Poloxamer 407），由两端PEO与中间PPO形成的三嵌段共聚物，其中每段PEO约为100个重复单位，PPO约为65个重复单位，分子量为12600。

所述的Pluronic P105，即泊洛沙姆335（Poloxamer 335），由两端PEO与中间PPO形成的三嵌段共聚物，其中每段PEO约为37个重复单位，PPO约为56个重复单位，分子量为6500。

所述Pluronic F127与Pluronic P105的质量比在（100:1）~（1:100）。

本发明方法中，有机溶剂为甲醇、二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、乙腈、乙醚、丙酮的任意一种，优选二氯甲烷或乙腈。

本发明方法中，所述使Puronic和多西紫杉醇充分溶解，其采用搅拌，超声或者加热的方法促进溶解。

本发明方法中，步骤⑵中旋转蒸发温度为25~60℃。

所述步骤⑶中溶胀的温度为25~80℃，水化体积为2-20ml。

本发明方法中，步骤⑷中冻干保护剂为甘露醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、麦芽糖、葡聚糖、氨基酸或聚乙二醇中的任一种，或者它们的混合物。

本发明方法中，经过过滤除菌，是指经过0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。

本发明利用生物相容性良好的Pluronic F127与P105构建混合胶束，包载多西紫杉醇在形成的疏水性内核PPO中，制成包载多西紫杉醇逆转MDR递释系统；将该混合胶束滴于铜网上，用2%磷钨酸负染，自然干燥后于透射电镜（TEM）下观察，粒径在20nm左右（如图1、图2所示）。

本发明的制备方法还可以采用透析法、乳化法或冻干法。

本发明采用LC-MS-MS测定多西紫杉醇制剂的药动学行为，结果显示，载有多西紫杉醇的Pluronic F127/P105混合胶束在体内具有明显的长循环作用；采用CCK-8试剂盒考察包载多西紫杉醇的Pluronic F127/P105混合胶束载体对A549肿瘤细胞生长抑制情况，结果表明：包载多西紫杉醇Pluronic F127/P105混合胶束对A549肿瘤细胞显示出与Taxotere相当的抑制作用，但是空白胶束材料比Taxotere的基质吐温80具有更好的生物相容性；采用CCK-8试剂盒考察包载多西紫杉醇Pluronic F127/P105混合胶束对A549/Taxol多药耐药肿瘤细胞生长抑制实验，结果表明：包载多西紫杉醇PluronicF127/P105混合胶束对A549/Taxol多药耐药肿瘤细胞的抑制作用显著高于Taxotere，说明混合胶束具有很强的逆转肿瘤MDR效果；以P-gp经典底物罗丹明123（R123）为探针考察Pluronic F127/P105对细胞摄取药物的影响，结果显示，Pluronic F127/P105的存在显著提高了R123和药物DTX的蓄积，说明混合胶束体系体外具有较好的逆转MDR效果。

本发明的有益效果在于，本发明的包载多西紫杉醇的聚合物胶束的优点有：

与市售的多西紫杉醇注射剂不同，不需要吐温80和乙醇增溶，仅以生物相容性良好的Pluronic F127与P105为载体，与市售的多西紫杉醇注射液相比，该聚合物胶束不仅可以降低药物的毒性，减少药物的不良反应，还可以发挥逆转肿瘤MDR的效果以提高肿瘤的治疗效果；聚合物胶束能有效的增加多西紫杉醇的溶解度，并且载体材料中含有PEO链可起到“隐形”的作用，避免体内网状内皮细胞系统的吞噬，具有一定的长循环效果，从而延长血液中的半衰期。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的包载多西紫杉醇的聚合物胶束进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

附图说明

图1为多西紫杉醇Pluronic F127/P105混合胶束的透射电镜照片（×100000），制备的多西紫杉醇Pluronic F127/P105混合胶束分散均匀，且无团聚现象。

图2为多西紫杉醇Pluronic F127/P105混合胶束的粒径分布图。

图3为多西紫杉醇Pluronic F127/P105混合胶束、多西紫杉醇以及空白胶束的差示扫描热分析图，多西紫杉醇载入胶束后，其熔点峰消失，说明多西紫杉醇以分子形式或者固态溶液的形式分布在胶束中。

图4为包载多西紫杉醇Pluronic F127/P105混合胶束以及Taxotere在SD大鼠的体内血药浓度-时间图。

图5为空白胶束材料与吐温80的生物相容性比较。

图6为包载多西紫杉醇Pluronic F127/P105混合胶束对A549肿瘤细胞以及A549/Taxol的生长抑制趋势图，结果表明：载有多西紫杉醇Pluronic F127/P105混合胶束能有效地促进A549以及A549/Taxol肿瘤细胞的凋亡，尤其是对于耐药细胞株，混合胶束具有良好的逆转MDR效果。

图7为Pluronic F127/P105对DTX以及R123在A549/Taxol细胞中的摄取影响，结果表明：Pluronic F127/P105的存在显著提高了R123和药物DTX的蓄积。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做详细说明，但本发明的保护范围不局限于下述实施例。

实施例1：

称取300mgP105、3mgF127、8mg多西紫杉醇，加入3ml乙腈，超声使载体材料和药物充分溶解。将该溶液置于旋转蒸发仪37℃旋蒸30min，真空干燥过夜。将薄膜置于40℃溶胀10min，加入15ml 40℃水搅拌30min，过滤后即得多西紫杉醇PluronicF127/P105混合胶束制剂。

实施例2：

称取270mgP105、30mgF127、6mg多西紫杉醇，加入3ml二氯甲烷，超声使载体材料和药物充分溶解。将该溶液置于旋转蒸发仪37℃旋蒸30min，真空干燥过夜。将薄膜置于40℃溶胀30min，加入10ml 40℃水搅拌30min，过滤后即得多西紫杉醇PluronicF127/P105混合胶束制剂。

实施例3：

称取225mgP105、75mgF127、5mg多西紫杉醇，加入4ml二氯甲烷，超声使载体材料和药物充分溶解。将该溶液置于旋转蒸发仪37℃旋蒸30min，真空干燥过夜。将薄膜置于50℃溶胀5min，加入5ml 50℃水搅拌30min，过滤后即得多西紫杉醇PluronicF127/P105混合胶束制剂。

实施例4：

称取170mgP105、130mgF127、3mg多西紫杉醇，加入3ml乙腈，超声使载体材料和药物充分溶解。将该溶液置于旋转蒸发仪37℃旋蒸30min，真空干燥过夜。将薄膜置于50℃溶胀10min，加入5ml 50℃水搅拌20min，过滤后即得多西紫杉醇PluronicF127/P105混合胶束制剂。

实施例5：

称取90mgP105、210mgF127、5mg多西紫杉醇，加入3ml甲醇，超声使载体材料和药物充分溶解。将该溶液置于旋转蒸发仪40℃旋蒸1h，真空干燥过夜。将薄膜置于55℃溶胀5min，加入10ml 55℃水搅拌20min，过滤后即得多西紫杉醇Pluronic F127/P105混合胶束制剂。

实施例6：

称取50mgP105、250mgF127、6mg多西紫杉醇，加入3ml甲醇，超声使载体材料和药物充分溶解。将该溶液置于旋转蒸发仪40℃旋蒸1h，真空干燥过夜。将薄膜置于40℃溶胀5min，加入8ml 40℃水搅拌20min，过滤后即得多西紫杉醇Pluronic F127/P105混合胶束制剂。

实施例7：

称取3mgP105、300mgF127、2mg多西紫杉醇，加入3ml甲醇，超声使载体材料和药物充分溶解。将该溶液置于旋转蒸发仪40℃旋蒸1h，真空干燥过夜。将薄膜置于40℃溶胀5min，加入8ml 40℃水搅拌20min，过滤后即得多西紫杉醇Pluronic F127/P105混合胶束制剂。

实施例8：

称取300mgP105、3mgF127、10mg多西紫杉醇，加入3ml甲醇，超声使载体材料和药物充分溶解。将该溶液置于旋转蒸发仪37℃旋蒸30min，真空干燥过夜。将薄膜置于50℃溶胀30min，加入5ml 50℃水搅拌30min，加入3%甘露醇，过滤除菌，装于西林瓶中，置冰箱-80℃预冻过夜，然后放入冷冻干燥机中冻干36h，得到白色的无塌陷的多西紫杉醇Pluronic混合胶束冻干剂，该冻干制剂加入适量去离子水后可在30s内完全复溶。

实施例9：

称取240mgP105、60mgF127、8mg多西紫杉醇，加入3ml乙腈，超声使载体材料和药物充分溶解。将该溶液置于旋转蒸发仪40℃旋蒸30min，真空干燥过夜。将薄膜置于50℃溶胀30min，加入5ml 50℃水搅拌30min，过滤后过滤后加入5%葡萄糖，过滤除菌，装于西林瓶中，置冰箱-80℃预冻过夜，然后放入冷冻干燥机中冻干36h，得到白色的无塌陷的多西紫杉醇Pluronic混合胶束冻干剂，该冻干制剂加入适量去离子水后可在30s内完全复溶。

实施例10：

称取225mgP105、75mgF127、6mg多西紫杉醇，加入3ml乙腈，超声使载体材料和药物充分溶解。将该溶液置于旋转蒸发仪40℃旋蒸30min，真空干燥过夜。将薄膜置于50℃溶胀30min，加入5ml 50℃水搅拌30min，加入3%乳糖，过滤除菌，装于西林瓶中，置冰箱-80℃预冻过夜，然后放入冷冻干燥机中冻干36h，得到白色的无塌陷的多西紫杉醇Pluronic混合胶束冻干剂，该冻干制剂加入适量去离子水后可在30s内完全复溶。

实施例11：

称取100mgP105、200mgF127、6mg多西紫杉醇，加入3ml乙腈，超声使载体材料和药物充分溶解。将该溶液置于旋转蒸发仪40℃旋蒸30min，真空干燥过夜。将薄膜置于50℃溶胀30min，加入5ml 50℃水搅拌30min，加入1%蔗糖，过滤除菌，装于西林瓶中，置冰箱-80℃预冻过夜，然后放入冷冻干燥机中冻干36h，得到白色的无塌陷的多西紫杉醇Pluronic混合胶束冻干剂，该冻干制剂加入适量去离子水后可在30s内完全复溶。

实施例12：

称取20mgP105、280mgF127、6mg多西紫杉醇，加入3ml乙腈，超声使载体材料和药物充分溶解。将该溶液置于旋转蒸发仪40℃旋蒸30min，真空干燥过夜。将薄膜置于50℃溶胀30min，加入5ml 50℃水搅拌30min，加入5%海藻糖，过滤除菌，装于西林瓶中，置冰箱-80℃预冻过夜，然后放入冷冻干燥机中冻干36h，得到白色的无塌陷的多西紫杉醇Pluronic混合胶束冻干剂，该冻干制剂加入适量去离子水后可在30s内完全复溶。

实施例13：

称取3mgP105、300mgF127、4mg多西紫杉醇，加入3ml乙腈，超声使载体材料和药物充分溶解。将该溶液置于旋转蒸发仪40℃旋蒸30min，真空干燥过夜。将薄膜置于50℃溶胀30min，加入5ml 50℃水搅拌30min，加入5%海藻糖，过滤除菌，装于西林瓶中，置冰箱-80℃预冻过夜，然后放入冷冻干燥机中冻干36h，得到白色的无塌陷的多西紫杉醇Pluronic混合胶束冻干剂，该冻干制剂加入适量去离子水后可在30s内完全复溶。

实施例14采用LC-MS-MS测定多西紫杉醇制剂的药动学行为试验

取雄性SD大鼠12只，随机分为2组，每组6只，分别给予对照组制剂Taxotere注射液(0.9%生理盐水稀释至适当浓度)以及同浓度的多西紫杉醇Pluronic F127/P105混合胶束溶液，以10mg/kg的剂量尾静脉注射给药，分别于给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、12和24h取血，血浆处理后测定多西紫杉醇血药浓度，结果显示，载有多西紫杉醇的Pluronic F127/P105混合胶束在体内具有明显的长循环作用（如图4所示）。

实施例15采用CCK-8试剂盒考察包载多西紫杉醇的Pluronic F127/P105混合胶束载体对A549肿瘤细胞生长抑制试验

将A549细胞以0.25%的胰蛋白酶消化，5000/孔细胞数接种于96孔培养板。37℃下，5%CO2条件下培养24h；然后弃去培养液，加入一定浓度的多西紫杉醇市售制剂（Taxotere注射液）、包载多西紫杉醇Pluronic F127/P105混合胶束，继续孵育72h。待孵育结束，弃去培养液，加入10ulCCK-8试剂，37℃下继续孵育4h，待孵育结束，以酶联免疫仪在460nm测定OD值，计算细胞抑制率，结果表明：包载多西紫杉醇PluronicF127/P105混合胶束对A549肿瘤细胞显示出与Taxotere相当的抑制作用，但是空白胶束材料比Taxotere的基质吐温80具有更好的生物相容性。

实施例16采用CCK-8试剂盒考察包载多西紫杉醇Pluronic F127/P105混合胶束对A549/Taxol多药耐药肿瘤细胞生长抑制实验

将A549/Taxol细胞以0.25%的胰蛋白酶消化，5000/孔细胞数接种于96孔培养板。37℃下，5%CO2条件下培养24h；然后弃去培养液，加入一定浓度的多西紫杉醇市售制剂（Taxotere注射液）、包载多西紫杉醇Pluronic F127/P105混合胶束，继续孵育72h。待孵育结束，弃去培养液，加入10ulCCK8试剂，37℃下继续孵育4h。待孵育结束，以酶联免疫仪在460nm测定OD值，计算细胞抑制率，结果表明：包载多西紫杉醇PluronicF127/P105混合胶束对A549/Taxol多药耐药肿瘤细胞的抑制作用显著高于Taxotere，说明混合胶束具有很强的逆转肿瘤MDR效果（如图5、图6所示）。

实施例17

以P-gp经典底物罗丹明123（R123）为探针考察Pluronic F127/P105对细胞摄取药物的影响，结果显示，Pluronic F127/P105的存在显著提高了R123和药物DTX的蓄积。说明混合胶束体系体外具有较好的逆转MDR效果（如图7所示）。

Claims

1.一种包载多西紫杉醇的聚合物胶束，其特征在于，以Pluronic为载体，将多西紫杉醇包载在Pluronic的疏水内核PPO中，制成包载多西紫杉醇PluronicF127/P105混合胶束；

所述的Pluronic F127为泊洛沙姆407；Pluronic P105为泊洛沙姆335；

所述Pluronic F127与Pluronic P105的质量比为100:1~1:100；

所述Pluronic与多西紫杉醇的质量比为10：1~1000：1。

2.一种包载多西紫杉醇的聚合物胶束的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

⑴将Pluronic F127、P105、多西紫杉醇溶于有机溶剂中，使Pluronic和多西紫杉醇形成均匀的溶液Ⅰ；

⑶将薄膜置于一定温度下溶胀后水化，制得以Pluronic为载体的多西紫杉醇胶束溶液Ⅱ；

⑷向多西紫杉醇多西紫杉醇胶束溶液Ⅱ中加入冻干保护剂，过滤除菌；

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述Pluronic F127与PluronicP105的质量比为100:1~1:100。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的Pluronic与多西紫杉醇的质量比为10：1~1000：1。

5.据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、乙腈、乙醚、丙酮或甲醇的中的一种。

6.据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤⑵中旋转蒸发温度为25~60℃。

7.据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤⑶中溶胀的温度为25~80℃，水化体积为2-20ml。

8.据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤⑷中冻干保护剂为甘露醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、麦芽糖、葡聚糖、氨基酸或聚乙二醇中的一种或者它们的混合物；所述过滤除菌是经过0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。