JP6205104B2 - 抗老化剤 - Google Patents
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エラスチンはコラーゲン線維間を繋ぐバネのような役割をしている。エラスターゼがエラスチンを分解することにより、皮膚の弾力性が失われ、シワやタルミの原因になると考えられている。MMP−1の産生の結果、コラーゲンの減少・変性が起こり、そして皮膚のシワ形成及び皮膚の弾力性の低下等が起こると考えられている。
そこで、皮膚老化を防止及び/又は改善する為に、細胞外マトリックス分解酵素を阻害することが求められている。そして、これら酵素を阻害することにより、皮膚の老化を防ぐことが求められている。
甘蔗を処理して得られるエキスが、消臭効果(特開2006−231080号公報)、放射線障害抑制効果(特開2005−075750号公報)、免疫機能増強効果(特開2004−075612号公報)、抗ストレス効果(特開2001−335505号公報)を有することは知られている。しかし、甘蔗を処理して得られるエキスが抗老化効果を有することは、本発明者らによって初めて見いだされた。
なお、異物除去のために、カラムで処理する前に、上記原料を濾過することが望ましい。濾過の手法は特に限定されず、食品工業で広く使用されているスクリーン濾過、ケイソウ土濾過、精密濾過、限外濾過等の手段を好ましく使用できる。
宮古島産糖蜜25kgをBx.50に希釈した。希釈液を、連続型遠心分離にて2,000×gで110秒遠心処理をし、遠心後、上清を回収した。アクリル製カラム(径15mm×1000、約18L容)に合成吸着剤(SP-850、三菱化学株式会社)を1L充填した。上記の上清を当該カラムにSV=5hr-1で通液した(室温)。その後、カラムを水で洗浄して糖液を洗い流し、洗浄水がBx. 0.5以下になるまで水洗した。次に55%エタノールをカラムにSV=2hr-1で1時間通液した(室温)。55%エタノールを通液し始めてから約20分後、着色物質が脱離し始めると同時に溶出液の回収を開始した。エタノール通液後、水をSV=2hr-1で1時間通液し、溶出液が約2.5Lになるまで回収を行った。この操作を5サイクル行い、溶出液12.5Lを回収した。この溶出液のうち2Lについて凍結乾燥処理を行い、15.2gの乾燥粉末(製造例1のエキス)を得た。
製造例1で得られた溶出液48Lのうち、300mlをとり、UF膜脱色処理に付した。UF膜として、分画分子量2,500のDESAL GHタイプ膜、及び分画分子量1,000のDESAL GEタイプ膜(いずれもGEウォーター&プロセステクノロジー製)を用いた。UF膜脱色処理は、圧力1.0MPaで行われた。GH膜では、透過液150ml及び濃縮液150mlが得られた。また、GE膜では、透過液100ml及び濃縮液200mlが得られた。それぞれの透過液を、エバポレーターにより濃縮後、凍結乾燥した。GH膜処理では1.25gの乾燥粉末(製造例2のエキスGH)、GE膜処理では0.95gの茶褐色乾燥粉末(製造例2のエキスGE)が得られた。
糖蜜(沖縄製糖株式会社宮古工場)180kgをBx.50に希釈し、当該希釈液をスクリューデカンター型連続遠心分離機(株式会社関西遠心分離機製作所 型番:AD-150)により、回転数6,000rpm(3,200G)、供給流量80L/hで、50℃で遠心分離して、沈殿物を除去した。
得られた清澄液を以下の条件で合成吸着剤に吸着・溶出した。
樹脂通液:SP850樹脂(三菱化学株式会社)25Lを充填したカラム(径250mm×高さ1000mm、50L容SUS304製)に、SV=2h-1(50L/hr)で、当該清澄液を通液した。
水洗:当該清澄液を通液した後、カラムに水道水を通液することにより、内に残存する糖液を水洗した。カラム出液がBx.0.5程度になった時点で水道水の通液を終了した。
次いで、圧縮空気をカラム底部から投入して樹脂をバブリング洗浄し、その後さらにカラム上部から水を通液することで、樹脂内に残存する懸濁物を除去した。
溶出:水洗後、55%(vol%)エタノール水溶液50LをSV=2h-1(50L/hr)でカラムに通液し、吸着した黒色成分を溶出液(約60L)として回収した。
UF膜処理:得られた溶出液について、以下のUF膜処理を行うことにより高分子成分を除去した。UF膜として、GE WaterTechnologies社の4インチ膜モジュールGH4040F1020(膜面積9m2)を用いた。UF膜処理の条件は下記の通りである;原液量:46L(上記溶出液)、入口圧力:5.0MPa、透過流量:18L/h、Feed流量:約180L/h、Flux:2L/m2・hr。UF膜処理のフローを図1に示す。膜処理により原液が濃縮されて、原液量が14Lとなったところで、40%エタノール32Lを原液に加えた。エタノール添加後さらに膜処理を継続し、原液量が再度14Lになるまで膜処理を行った。14Lになった原液について、上記エタノール添加及び膜処理を繰り返し、再度原液が14Lになったところで膜処理を終了した。膜処理の結果得られた透過液は96Lであった。このうち1.5Lを、エバポレーターにより濃縮し、そして凍結乾燥して、淡黄色〜褐色の粉末1.7g(製造例3のエキス)を得た。
原糖製造工場の製造工程にて得られた甘蔗の圧搾汁(固形分18.8%)650リットルを、ジュースヒーターで80℃に加温し、管型限外ろ過(MH−25型、有効膜面積2m2×3本、分画分子量10万、ダイセル化学工業株式会社製)でろ過処理して、約600リットルの処理液を得た。
原糖製造工場の製造工程にて得られた清浄汁(固形分11.7%)600リットルをそのまま限外ろ過処理せずに使用した以外は製造例1と同様にして、カラム処理を行った。このときの溶出パターンを図3に示す(a:圧搾汁ろ過処理液の通液開始時点、b:イオン交換水での洗浄開始時点、c:55%エタノール−水混合溶媒での溶出開始時点)。図3において、Bの画分を分取し、減圧濃縮した後、1晩凍結乾燥して、225gの茶褐色の粉末(製造例5のエキス)を得た。
製造例2のエキスGHのエラスターゼ活性阻害効果を、正常ヒト線維芽細胞由来エラスターゼ活性阻害作用を評価することより調べた。
(1)材料
2×106cells/mlのヒト正常線維芽細胞(倉敷紡績株式会社)に0.5(W/V)% Triton X-100含有トリス緩衝液(1 mM PMSF、100 mM Tris-HCl、pH8.0) を100μl添加して細胞を溶解し、当該溶解液を線維芽細胞由来エラスターゼの粗酵素液として用いた。エラスターゼに対する基質としてスクシニル-L-アラニル-L-アラニル-L-アラニン p-ニトロアニリド (Suc-Ala-Ala-Ala-pNA)(BACHEM AG社製)を用いた。製造例2のエキス(凍結乾燥粉末)を上記トリス緩衝液に溶解し、下記表1に記載の濃度の試験サンプルを調製した。陽性対照としてEDTAを用いた。
(2)方法
試験サンプル又は0.5(w/v)% Triton X-100含有トリス緩衝液を、96 穴マイクロプレートのウェルに50μLずつ添加した。さらに、5 mMのSuc-Ala-Ala-Ala-pNA(BACHEM AG社製)の0.2Mリン酸緩衝溶液を調製し、夫々のウェルに100μLずつ添加した。次に、夫々のウェルにエラスターゼ粗酵素液を50μL添加し、添加直後の405 nmにおける吸光度を蛍光発光吸光測定装置(パワースキャン4、DSファーマバイオメディカル株式会社)で測定した。当該吸光度を、反応前の吸光度とした(ブランク吸光度)。次いで、37 ℃にて2 時間反応後の405 nmにおける吸光度を測定した。反応後の吸光度よりブランク吸光度を差し引いた値(以下、差引吸光度)を、上記試験サンプルを添加した場合及び添加しない場合(上記緩衝液を添加した場合)のそれぞれについて求めた。試験サンプルを添加しない場合における差引吸光度をC’、 試験サンプルを添加した場合における差引吸光度をS’とし、エラスターゼ活性阻害率 (%)を次の式より求めた。
結果を以下の表1に示す。
また、その他の製造例のエキスについても、同様の効果が認められた。
製造例2のエキスGHのMMP−1活性阻害効果を、正常ヒト線維芽細胞に対するMMP−1活性の阻害作用を評価することより調べた。
(1)材料
正常ヒト線維芽細胞の培地として、5 %仔牛血清含有ダルベッコ変法MEM培地 (5 % FBS-DMEM、倉敷紡績株式会社)を用いた。下記表2記載の濃度で製造例2のエキスを含むDMEM培地(倉敷紡績株式会社)を調製し、試験サンプル含有培地として用いた。陽性対照としてアジ化ナトリウムを用いた。
(2)方法
正常ヒト線維芽細胞(倉敷紡績株式会社)を5 % FBS-DMEM培地と一緒に96 穴マイクロプレートに、2.0×104 cells/wellの密度にて播種した。上記播種後24 時間で、当該マイクロプレート中の上記5 % FBS-DMEM培地を当該試験サンプル含有培地に交換した。培地交換後さらに24 時間培養し、再度、新鮮な試験サンプル含有培地に交換し、そしてさらに24時間培養した。培養後、培養上清中のMMP-1活性を測定した。 培養上清中のMMP-1は酵素活性を有しない不活性型酵素として培養上清中に分泌されるため、トリプシン(シグマ-アルドリッチ ジャパン株式会社)処理により活性部位の修飾ペプチドを切断することにより酵素を活性化した。MMP-1を活性化した後、培養上清100μlに0.5 mg/mLのFITC標識I型コラーゲン(株式会社ヤガイ)を50μl加えた。当該コラーゲン添加後、37 ℃にて2 時間酵素反応をさせた。当該反応後、分解されたコラーゲンの蛍光強度 (Ex=495nm, Em=520 nm) を、蛍光発光吸光測定装置(パワースキャン4、DSファーマ)により、測定した。酵素活性は1 分間に1 μgのコラーゲンを分解する酵素活性を1unitとして定義した。
同時に細胞のタンパク質量をBCA Protein Assay Reagent (PIERCE) を用いて定量した。培養上清中のMMP-1活性をタンパク質量で除することにより、単位タンパク質量あたりのMMP-1活性を算出し、これをMMP-1活性とした。
結果を以下の表2に示す。
また、その他の製造例のエキスについても、同様の効果が認められた。
下記の組成の美容液を定法により製造した。以下実施例3〜5において、%は重量%を意味する。
製造例2のエキスGH 0.5%
塩酸グルコサミン 0.25%
ソルビトール 1.20%
ジプロピレングリコール 8.0%
濃グリセリン(日本薬局方) 5.0%
ジグリセリン 5.0%
ホホバ油 0.50%
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 0.50%
キサンタンガム 0.05%
カルボキシビニルポリマー 0.5%
アルギニン 0.35%
ハイドロプロリン 0.25%
フェノキシエタノール 0.20%
メチルパラベン 0.08%
プロピルパラベン 0.02%
精製水 残部(全量を100%とする)
また、製造例2のエキスの代わりに製造例1及び3〜5のエキスを用いて、同様に美容液を製造した。
下記組成の乳液を定法により製造した。
製造例2のエキスGH 0.5%
ホホバ油 4.0%
オリーブオイル 2.0%
スクワラン 2.0%
セタノール 2.0%
モノステアリン酸グリセリル 2.0%
ポリオキシエチレンセチルエーテル(20E.O.) 2.5%
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン(20E.O.) 2.0%
1,3―ブチレングリコール 3.0%
パラオキシ安息香酸メチル 0.15%
香料 0.05%
精製水 残部(全量を100%とする)
また、製造例2のエキスの代わりに製造例1及び3〜5のエキスを用いて、同様に乳液を製造した。
下記組成の化粧水を定法により製造した。
製造例2のエキスGH 1.0%
グリセリン 3.0%
1,3―ブチレングリコール 3.0%
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン(20E.O.) 0.5%
パラオキシ安息香酸メチル 0.15%
クエン酸 0.1%
クエン酸ナトリウム 0.1%
香料 0.05%
精製水 残部(全量を100%とする)
また、製造例2のエキスの代わりに製造例1及び3〜5のエキスを用いて、同様に化粧水を製造した。
Claims (2)
- 甘蔗汁及び/又は甘蔗由来の糖蜜を、芳香族系樹脂、アクリル酸系メタクリル樹脂及びアクリロニトリル脂肪族系樹脂からなる群より選ばれる少なくとも1種を含む合成吸着剤を充填したカラムに通液し、
該合成吸着剤に吸着された成分を、水、メタノール、エタノール及びこれらの混合物から選ばれる溶媒で溶出し、
得られた画分を、分画分子量が1000〜4000である限界濾過膜を用いて限外濾過処理して得られた透過液である甘蔗由来のエキスを含む、エラスターゼ活性阻害剤。 - 甘蔗汁及び/又は甘蔗由来の糖蜜を、芳香族系樹脂、アクリル酸系メタクリル樹脂、アクリロニトリル脂肪族系樹脂からなる群より選ばれる少なくとも1種を含む合成吸着剤を充填したカラムに通液し、
該合成吸着剤に吸着された成分を、水、メタノール、エタノール及びこれらの混合物から選ばれる溶媒で溶出し、
得られた画分を、分画分子量が1000〜4000である限界濾過膜を用いて限外濾過処理して得られた透過液である甘蔗由来のエキスを含む、エラスターゼ活性阻害剤(ただし、化粧品に用いられる剤を除く)。
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