JP7080589B2 - 抗糖化剤 - Google Patents
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Description
(製造例1)
原料である甘蔗汁(原料糖製造工場の製糖工程にて得られた石灰清浄後の清浄汁、沖縄産、固形分14%)7,500リットルを、カートリッジフィルター(アドバンテック株式会社製、コットンワインドカートリッジフィルター、TCW-10-CSD型)で濾過処理し、清浄汁濾過処理物を得た。合成吸着剤(三菱化学株式会社製、SP-207)500リットルを樹脂塔(内径800mm、高さ2,000mm)に充填し、これに上記の清浄汁濾過処理物を、流速2,500リットル/時間(SV=5.0(時間-1))で通液した。溶出パターンを図1に示す。図1の(A)が通液開始点である。なお、清浄汁通過中は、ウォータージャケットには、80℃の水を常に循環させた。
次に、1,200リットルの水道水を、流速2,500リットル/時間(SV=5.0(時間-1))で樹脂塔に通液して洗浄した。図1の(B)が通液開始点である。水道水で洗浄後、樹脂塔から溶出した画分について塔の検出を行ったところ、ハンドレフブリックス(Bx)計(株式会社アタゴ製、PAL-J型)において、Bxが約0になっているのを確認した。その後、1,500リットルの水道水を、流速4,500リットル/時間(SV=9.0(時間-1))で樹脂塔の下から通液し、逆洗を行った。
次に、溶出溶媒として55%エタノール水溶液(エタノール/水=55/45(体積/体積))1,000リットルを、流速1,000リットル/時間(SV=2.0(時間-1))で樹脂塔に通液した。図1の(C)が通液開始点である。続けて、760リットルの水道水を流速1,000リットル/時間(SV=2.0(時間-1))で樹脂塔に通液し、合成吸着剤に吸着した成分を溶出された。なお、55%エタノール水溶液及び水道水は、プレート式熱交換器(株式会社日立製作所、RX-025A-KNHJR-36型)にて50℃に加温して、樹脂塔に通液した。
樹脂塔から溶出した画分のうち後半の1,460リットル(図1においてaの部分)を、遠心式薄膜真空蒸発装置(株式会社大川原製作所、エバポールCEP-5S)にて約50倍の濃度に減圧濃縮したのち、1晩凍結乾燥して、甘蔗由来の抽出物として、茶褐色の粉末(I)(抽出物aに相当する)8.4kgを得た。これを、SCE1とした。粉末(I)の糖類を定量したところ、5.0%であった。
原料糖工場で得られた2番蜜処理液を原料として、単塔式回分分離法によるイオン交換カラムクロマトグラフィー処理を行った。原料は、2番蜜処理液を使用した。
試験例1:ヒト血清アルブミンモデルにおける抗糖化活性の評価
グルコース-ヒト血清アルブミン(HSA)の反応により生成されるAGEsに対する甘蔗由来の抽出物(SCE1)の抗糖化活性(AGEs生成抑制作用)を調べた。
甘蔗由来抽出物であるSCE1を約0.5gとり、乳鉢を用いて粉砕し、粉末化した。当該粉末を蒸留水で希釈して0.1~100mg/mLの溶液を調製した。これを試験用のサンプルとした。
0.05mol/Lリン酸緩衝液(pH7.4)、8mg/mLヒト血清アルブミン(HSA)(Sigma-Aldrich社製)及び0.2mol/Lグルコースの組成の反応液中に調製した各濃度のサンプルを1/10濃度(反応終濃度)になるように添加し、60℃で40時間インキュベーションした。陰性対照としてサンプルの代わりに蒸留水を添加したものを用いた。陽性対照としてアミノグアニジンを用いた。なお、陽性対照に対するブランクとしてグルコースの代わりに蒸留水を添加したものを用いた。
糖化反応終了後、反応液に生成した蛍光性AGEsをマイクロプレートリーダー(SpectraMax i3、モレキュラーデバイス社)で測定した(励起波長370nm、蛍光波長440nm)。AGEsの生成阻害率(以下、単に「阻害率」ともいう)は、糖化反応においてサンプルを添加した反応液の蛍光強度をF1とし、グルコース水溶液の代わりに蒸留水を添加してインキュベーションした反応液の蛍光強度をF2とし、サンプルの代わりに甘蔗由来の抽出物又はアミノグアニジンを含まない溶液を添加してインキュベーションした反応液の蛍光強度をF3とし、ブランクとして、グルコース水溶液の代わりに蒸留水を添加してインキュベーションした反応液の蛍光強度をF4として、下記の式に従って算出した。生成阻害率の測定結果を図3に示す。
蛍光性AGEs阻害率(%)=(1-(F1-F2)/(F3-F4))×100
(サンプル調製)
サンプル調製は、試験例1と同様にして行った。
0.05mol/Lリン酸緩衝液(pH7.4)、1.2mg/mLコラーゲンタイプIウシ真皮由来(COL)(株式会社ニッピ製)及び0.4mol/Lグルコースの組成の反応液中に調製した各濃度のサンプルを1/10濃度(反応終濃度)になるように添加し、60℃で240時間インキュベー卜した。陰性対照としてはサンプルの代わりに蒸留水を添加したものを用いた。陽性対照としてはアミノグアニジンを用いた。
蛍光性AGEsの測定及び生成阻害率の算出は試験例1と同様にして行った。生成阻害率の結果を図4に示す。
(サンプル調製)
サンプル調製は、試験例1と同様にして行った。
0.05mol/Lリン酸緩衝液(pH7.4)、1.2mg/mLコラーゲンタイプIウシ真皮由来(COL)(株式会社ニッピ製)、0.4mol/Lグルコースの組成の反応液中にサンプル調製した各濃度のサンプルを1/10濃度(反応終濃度)になるように添加し、60℃で240時間インキュベー卜した。陰性対照としてはサンプルの代わりに蒸留水を添加したものを用いた。陽性対照として、ペントシジン以外はアミノグアニジンを用い、ペントシジンはアミノグアニジンによるAGEs生成阻害活性を示さないため、エピガロカテキン(糖化反応阻害剤)を用いた。
抗3DG、グリオキサール(GO)及びメチルグリオキサール(MGO)活性(COL)の測定は、以下の方法により測定した。すなわち、サンプル反応液中に生成した3DG、グリオキサール、メチルグリオキサールは、HPLC法により絶対検量線法にて定量した。抗3DG、グリオキサール、メチルグリオキサール活性はIC50(50%生成阻害濃度)を算出し、有効数字3桁で表示した。抗3DG、グリオキサール(GO)、メチルグリオキサール(MGO)活性(COL)の測定結果は、それぞれ図5、6及び7に示す。各濃度におけるサンプルの阻害率から算出したIC50を表4に示す。
SCE1の各濃度(0.3mg/mL、1mg/mL又は3mg/mL)における3DG(COL)の阻害率を図5(a)に示す。図5(a)に示すとおり、SCE1は濃度依存的に阻害率が増加し、抗糖化活性(3DG(COL)生成抑制作用)を示した。
SCE1の各濃度(3mg/mL又は10mg/mL)におけるGO(COL)の阻害率を図6(a)に示す。SCE1は濃度依存的に阻害率が増加し、抗糖化活性(GO(COL)生成抑制作用)を示した。
SCE1の各濃度(0.3mg/mL、1mg/mL又は10mg/mL)におけるMGO(COL)の阻害率を図7(a)に示す。SCE1は濃度依存的に阻害率が増加し、抗糖化活性(MGO(COL)生成抑制作用)を示した。
SCE1の各濃度(0.03mg/mL、0.1mg/mL又は0.3mg/mL)におけるCML(COL)阻害率を図8(a)に示す。SCE1は濃度依存的に阻害率が増加し、抗糖化活性(CML(COL)生成抑制作用)を示した。
SCE1の各濃度(1mg/mL)におけるペントシジン(COL)の阻害率を図9(a)に示す。SCE1は、抗糖化活性(ペントシジン(COL)生成抑制作用)を示した。
(サンプル調製)
サンプルの調製は、試験例1と同様にして行った。
0.01mol/Lリン酸緩衝液(pH7.4)、6mg/mL P-エラスチン豚由来(ELA)(日本ハム製)、0.2mol/Lグルコースの組成の反応液中にサンプル調製した各濃度のサンプルを1/10濃度(反応終濃度)になるように添加し、60℃で240時間インキュベートした。陰性対照としてはサンプルの代わりに蒸留水を添加したものを用いた。陽性対照としてはアミノグアニジンを用いた。
蛍光性AGEsの生成阻害率(%)は、試験例1と同様にして算出した。結果を図10に示す。各サンプルの阻害濃度から算出したIC50を表5に示す。
次に、AGEs架橋切断試験により、甘蔗由来抽出物(SCE1)のAGEs分解活性を評価した。AGEs分解活性(AGEs架橋切断作用)は、公知の方法(例えば、Glycative Stress Research 2015年,2巻(2号),pp.58-66)である、αジケトン構造を有する1-フェニルー1,2-プロパンジオン(l-phenyl-1,2-propanedione:PPD)をモデル基質とした反応系を使用した方法で評価した。
サンプル調製は、試験例1と同様にして行った。
0.1mol/Lのリン酸緩衝液(pH7.4)、1mmol/mLのPPD、0.2mol/LのLグルコースの組成の反応液中に、上記で調製・適宜希釈した各濃度のサンプルを1/2濃度(反応終濃度)になるように添加し、37℃で8時間インキュベーションした。陰性対照としてはサンプルの代わりに蒸留水を添加したものを用いた。陽性対照としてPTB(N-phenacylthiazoliumbromide)を用いた。HPLC法にて安息香酸量を測定することによりPTBと比較した架橋構造の切断率(架橋切断率)を算出した。
サンプルの各濃度及びPTB溶液(5mmol/L)における架橋切断率と、PTB(5mmol/L)を100%としたときの各濃度における架橋切断率の値(切断率相対値)を表6に示す。図11にSCE1の各濃度における切断率相対値を示す。
試験例6:ヒト血清アルブミンモデルにおける抗糖化活性の評価
甘蔗由来の抽出物として上述のSCE4を用いたこと以外は、試験例1と同様にして、抗糖化活性を調べた。陽性対照としては、アミノグアニジンの水溶液(濃度0.3~3mg/mL)を用いた。測定結果を図12に示す。また、各濃度におけるサンプルの阻害率から算出したIC50(50%生成阻害濃度)を表7に示す。表7に記載のとおり、SCE4は、抗糖化活性を有していることが示された。
(サンプル調製)
試験用のサンプルは、測定試料(SCE1)0.255gを秤量後、全量を蒸留し2.55mLに溶解し、100mg/mL溶液を調製した。この溶液を蒸留水で段階希釈して、試験溶液とした。陽性対照としては、10mmol/LのPTB(N-phenacylthiazoliumbromide)溶液を用いた。
試験溶液又はPTB溶液(10mmol/L)と、10mmol/LのPPD溶液と、0.2mol/Lリン酸緩衝液(pH7.4)と、を5:l:4の割合で混合し、37℃で8時間反応させた(n=3)。反応終了後、塩酸を加えて反応停止させた。その後、反応液は20℃で3,000×gで10分間遠心分離し、上清中の安息香酸量を逆相HPLCで分析した。反応液中の安息香酸量は、別途測定したサンプル中の安息香酸量を差し引いて求めた。1molのPPDは1molの安息香酸を生成することから、以下の式で架橋切断率を算出した。架橋切断の相対値(切断率相対値)はPTBの架橋切断率を100としたときの、各濃度の架橋切断率の値(%)である。結果を図13及び表8に示した。なお、測定装置としては、島津超高速液体クロマトグラフNexeraシステム(株式会社島津製作所製)を用いた。
架橋切断率(%)={(A-B)/C}×100
A:反応液中の安息香酸量
B:サンプル中の安息香酸量
C:反応に供したPPD量(基質量)
(試験動物)
5週齢のラット(Slc:SD(SPF))雄性50匹(日本エスエルシー株式会社)を準備(入荷)した。入荷翌日に、下記試験方法に従い、個体識別番号の若い10匹を除く全例にSTZ処置を施した。検疫・馴化期間中は一般状態の観察を毎日行い、体重をパーソナル電子天秤(EW-12Ki、株式会社エー・アンド・デイ)を使用して、入荷1(入荷翌日)、3及び7日に測定した。
動物の個体識別番号は入荷日に施した耳パンチ法により行い、収容した各ケージには群分け前は、試験番号、性別及び個体識別番号(耳パンチ番号)を記入したカードをつけ、群分け後は、群及び動物番号を追記した。
試験動物は、温度22±3℃、湿度50±20%、換気回数13~17回/時間、照明時間8:00~20:00(明12時間、暗12時間)の環境下で、ステンレス製可動ラック(1790W×470D×1650Hmm)に装着したステンレス製金網2連ケージの1区画(255W×185D×200Hmm)に個別に収容した。
STZ誘発糖尿病ラット作成
(1)クエン酸緩衝液の調製
クエン酸(Sigma-Aldrich製)及びクエン酸三ナトリウム(和光純薬工業株式会社製)を所定量秤量し、0.01M(pH4.5)となるように蒸留水を用いてクエン酸緩衝液を調製した。
(2)STZ溶液の調製
ストレプトゾシン(STZ、Sigma-Aldrich製)を所定量秤量し、チューブに入れ投与直前まで氷冷した。投与直前に氷冷した0.01Mクエン酸緩衝液(pH4.5)を加え、溶解させた。なお、STZ溶液は用時調製とした。
(3)STZ溶液の投与
動物入荷翌日に個体識別番号の若い10匹を除くすべての動物にSTZ溶液を腹腔内投与した(投与量:60mg/kg、液量:10mL/kg)。
(4)動物の選択及び群分け
検疫を兼ねた馴化期間終了後(STZ処置1週間後)に体重測定を実施した。体重測定終了後、保定器にて動物を拘束した後、メス刃を用いて尾静脈を切皮し、得られた全血より簡易血統測定器(自己検査用グルコース測定器、ライフチェック)を用いて血糖値を測定した。各群の試験動物を、得られた血糖値を指標として層別連続無作為化法により、群分けした。
投与開始前、4、8、12週間目に、保定器にて動物を拘束した後、メス刃を用いて尾静脈を切皮し、得られた全血より簡易血統測定器を用いて血糖値を測定した。得られた数値(血糖値)は、各群で平均値及び標準誤差を算出した。
GO及びCMLの測定には、それぞれ上述のA~D群のラットの8週後及び12週後の凍結血漿の検体を試験材料とした(A群及びC~D群は8検体、B群は、GO測定において7検体、CML測定において6検体)。血漿は、血糖値測定の際に、採血を行い、得られた血液より血漿150μLを分取したものを用いた。なお、血漿を得るために使用したヘマトクリット毛細管(HIRSCHMANNεLABORGERATE)は、ヘパリン処理済みのものを使用した。
Claims (3)
- 甘蔗由来の抽出物を有効成分として含み、
前記甘蔗由来の抽出物が、甘蔗汁、甘蔗の溶媒抽出液及び甘蔗由来の糖蜜からなる群より選ばれる原料を、カラムクロマトグラフィーで処理したものであり、
前記甘蔗由来の抽出物が、合成吸着剤を充填したカラムに前記原料を通液して、前記合成吸着剤に吸着させた吸着成分を、水、メタノール、エタノール及びこれらの混合物からなる群より選ばれる少なくとも1つの溶出溶媒で溶出させた第1の溶出成分を含有し、
前記合成吸着剤が疎水性置換基を有する芳香族系樹脂である、抗糖化剤。 - 甘蔗由来の抽出物を有効成分として含み、
前記甘蔗由来の抽出物が、甘蔗汁、甘蔗の溶媒抽出液及び甘蔗由来の糖蜜からなる群より選ばれる原料を、カラムクロマトグラフィーで処理したものであり、
前記甘蔗由来の抽出物が、イオン交換樹脂を充填したカラムに前記原料を通液して、溶出させた溶出成分のうち、波長420nmの光を吸収する、第2の溶出成分を含有し、
前記イオン交換樹脂がナトリウムイオン型の強酸性陽イオン交換樹脂である、抗糖化剤。 - 請求項1又は2に記載の抗糖化剤を含有する、抗糖化用飲食品。
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