JP6194377B2 - センサ及びセンサシステム - Google Patents
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Description
前記電子受容体が9,10−フェナントレンキノン−2−スルホン産又はその酸である。
(第二の要件)
前記複素環式化合物がイミダゾール及びヒスチジンを含まず、
一般式(I)中のA1〜A5のうちの2個が窒素原子であるときは、R1〜R5のうち、少なくとも1個の基が水素原子以外の置換基である。
[2]前記複素環式化合物が窒素原子を3個以上有する、[1]に記載のセンサ。
[3]前記一般式(I)において、R1〜R5の少なくとも1つの基が、CnHm−(a+b+c)(R6)a(R7)b(R8)cで表される鎖式炭化水素基であり、nは2以下の自然数を表し、mはn+1以上2n+1以下の自然数を表し、a、b及びcはそれぞれ独立してn以下の自然数を表し、R6〜R8は、それぞれ独立して、ヒドロキシル基、カルボキシル基及びアミノ基からなる群から選択される置換基を表す、[1]に記載のセンサ。
[4]前記R1〜R5の少なくとも1つは、アミノ基を有する置換基である、[1]に記載のセンサ。
[5]前記複素環式化合物の五員複素環がトリアゾールである、[1]に記載のセンサ。
[6]前記複素環式化合物として、ヒスタミン、2−アミノーイミダゾール、4,5−ビス(ヒドロキシメチル)イミダゾール、2−メチルイミダゾール、1,2−ジメチルイミダゾール、1,2,4−トリアゾール、3−アミノ−1,2,4−トリアゾール、4−アミノ−1,2,4−トリアゾール及び3,5−ジアミノ−1,2,4−トリアゾールからなる群より選択される少なくとも一種の化合物を含有する、[1]に記載のセンサ。
[7]前記酸化還元酵素として、グルコース脱水素酵素を含有する、[1]に記載のセンサ。
[8]前記酸化還元酵素に合う補酵素をさらに含有する、[7]に記載のセンサ。
[9]前記酸化還元酵素は、PQQ依存性又はFAD依存性を有する、[8]に記載のセンサ。
[10]前記試薬層は、固体である、[1]に記載のセンサ。
[11]前記試薬層は、少なくとも前記一対の電極の両方に接するように配置された、[1]に記載のセンサ。
[12][1]に記載のセンサと、前記少なくとも一対の電極間の電流値を測定する測定部と、前記測定部による測定結果に基づいて、前記液体試料中の対象物質の濃度を算出する算出部と、を有するセンサシステム。
試薬組成物は、複素環式化合物と、電子受容体と、酸化還元酵素と、を含有する。
試薬組成物は、複素環式化合物として、以下に説明される化合物から選択される少なくとも一種の化合物を含有することができる。複素環式化合物は、下記式(I)で表される。式(I)で表される複素環式化合物は、酸化還元酵素の存在下における電子受容体の酸化電位の正側へのシフトを抑制することができる。
R1〜R5は、複素環の水溶性を保持できる置換基であることが好ましく、付加基(後述のアミノ基、ヒドロキシル基及びカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも一種の置換基)を有しない炭化水素であれば炭素数1〜4であることが好ましく、付加基を有する炭化水素であれば炭素数1〜12であることが好ましい。
炭化水素基は、鎖式、環式のいずれであってもよい。鎖式炭化水素基は、分岐していても、直鎖であってもよい。鎖式炭化水素基は、飽和炭化水素基、不飽和炭化水素基のいずれであってもよい。
電子受容体は、電子伝達物質またはメディエータと言い換えられてもよい。電子受容体は、可逆的に酸化体及び還元体となることができる。電子受容体は、直接、または別の電子受容体と協働して、物質間における電子の移動を媒介することができる。電子受容体は一種でも二種以上でもよい。
また、キノン誘導体における付加官能基(置換基)の一例として、親水性官能基が挙げられる。親水性官能基としては、スルホ基(−SO3H)、カルボキシル基(−COOH)、リン酸基(−PO4H2)等が挙げられる。なお、スルホ基、カルボキシル基、及びリン酸基には、これらの塩(ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等)も含まれる。
キノンは従来、医薬、農薬、工業の分野で使用されている。キノンは、例えば芳香族炭化水素から製造可能である。具体的には、アントラキノンはアントラセンの酸化により容易に製造される。
また、親水性官能基を有するキノン類化合物の製造方法は、キノンに親水性官能基を導入する工程を含んでもよい。例えば、キノンに親水性官能基としてスルホ基を付加する方法としては、キノンと発煙硫酸とを反応させる方法などがある。
試薬組成物は、一種類以上の酵素を含有していてもよい。酵素としては、酸化還元酵素が用いられる。酸化還元酵素は、酸化酵素及び脱水素酵素を包含する。酸化還元酵素の例として、
−グルコースを基質とする酵素としては、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼが好ましく;
−乳酸を基質とする酵素としては、乳酸オキシダーゼ、又は乳酸デヒドロゲナーゼが好ましく、;
−コレステロールを基質とする酵素としては、コレステロールエステラーゼ、又はコレステロールオキシダーゼが好ましく;
−アルコールを基質とする酵素としては、アルコールオキシダーゼが好ましく;
−ビリルビンを基質とする酵素としては、ビリルビンオキシダーゼが好ましく;
挙げられる。
酵素は、その補酵素依存性について、特に限定されるものではない。例えば、酵素は、NAD(nicotinamide adenine dinucleotide)、NADP(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)、PQQ(Pyrroloquinoline quinone)、又はFAD(flavin adenine dinucleotide)等の補酵素に対して依存性を有してもよい。
なお、前述した全ての複素環式化合物はそれぞれ、前述した電子受容体のそれぞれと組み合わせることによって、少なくとも前述の電子受容体のシフト抑制効果を得ることが可能である。本発明は、これらの組み合わせのうち、以下の第一及び第二の要件のいずれかの要件を満足する。第一の要件では、酸化還元酵素と式(1)の化合物は特に限定されない。第二の要件では、酸化還元酵素と電子受容体は特に限定されない。
(第一の要件)
前記電子受容体が、ナフトキノン、アントラキノン、フェナントレンキノン、フェナントロリンキノン並びにこれらのキノン誘導体からなるキノン類化合物の群から選択される一以上である。
(第二の要件)
前記複素環式化合物がヒスチジンを含まず、
式(I)中のA1〜A5のうちの2個が窒素原子であるときは、R1〜R5のうち、少なくとも1個の基が水素原子以外の置換基である。
試薬組成物は、本発明の効果が得られる範囲において、複素環式化合物、酸化還元酵素、及び電子受容体以外の他の成分を含んでいてもよい。このような他の成分としては、例えば試薬組成物がセンサに適用されたときに、
−酵素又は電子受容体の保存性を高める、
−酵素と標的物質との反応性を高める、
−標的物質に対する応答性を高める、又は
−標的物質の濃度に対する応答電流値の直線性を高める、
といった効果を示す物質が好ましく用いられる。
試薬組成物は、液体であってもよいし、固体であってもよい。液体である場合、試薬組成物が含有する媒体としては、例えば、水(緩衝液を含む)、アルコール(エタノール、メタノール、プロパノール等を含む)、有機溶媒(ベンゼン、トルエン、キシレン等を含む)等が挙げられる。液状の試薬組成物を、「試薬液」と称することがある。前記媒体は水であることが、生体試料への適合性の観点から好ましい。
試薬液における複素環式化合物の濃度は、0.001mM以上であることが好ましく、0.01mM以上であることがより好ましく、0.1mM以上であることがさらに好ましく、1mM以上であることがさらに好ましい。また、試薬液における複素環式化合物の濃度は、10mM以下、5mM以下、又は4mM以下に設定可能である。
本発明のセンサは、液体試料が入るように形成された試料室と、前記試料室内に配置された少なくとも一対の電極と、前記試料室内において、少なくとも前記一対の電極の両方に接するように配置された試薬層と、を有する。前記試薬層は、前述した本発明の試薬組成物から形成される。本発明のセンサは、前記試薬層を本発明の試薬組成物で形成する以外は、液体試料中の標的物質を電気化学的に検出する公知のセンサと同様に構成することができる。
(a)基板上に、少なくとも一対の電極を設けること、
(b)基板上に、前述した本発明の試薬組成物を、前記一対の電極の両方に接触するように塗布すること、及び
(c)前記(b)で塗布された試薬組成物を乾燥させること、を含む方法によって製造することができる。
図1に示すセンサ1は、液体試料中の標的物質を検出すること及び/又は定量するセンサの一例である。センサ1は、図1に示すように、基板2、導電層3、試薬層4、スペーサ5、カバー6を有する。
図1に示すように、基板2は板状の部材である。基板2は絶縁性を有する。基板2を構成する材料としては、例えば、
−ポリエチレンテレフタレート、ビニルポリマー、ポリイミド、ポリエステル、及びスチレニクス等の樹脂;
−ガラス;並びに
−セラミックス;
等が挙げられる。
図1に示すように、導電層3は、基板2上に略均一な厚みに形成されている。導電層3は、3つの電極31〜33を含む。電極31は作用電極、電極32は対電極、電極33は検知電極と称されることがある。なお、検知電極33は省略可能である。
また、導電層3は、上記3電極の他に、ヘマトクリット値を測定するためのHct電極(図示せず)を設けた4つの電極から構成される場合もある。
−導電性材料を用いた印刷等;又は
−基板2を導電性材料で覆った後、レーザアブレーション等で非導電トラックを形成すること;
で形成されてもよい。例えば、基板2にパラジウムをスパッタリングすることによって導電層3を形成し、レーザアブレーションにより、非導電トラックを形成することができる。非導電トラックは、好ましくは0.01〜0.5mm、より好ましくは0.05mm〜0.3mmの幅を有する。
−金属、金属混合物、合金、金属酸化物、及び金属化合物に代表される無機導電性物質等;
−炭化水素系導電性ポリマー及びヘテロ原子含有系導電性ポリマー等の有機導電性物質;又は
−これらの物質の組み合わせ;
が挙げられる。導電層3の構成材料としては、パラジウム、金、白金、炭素などが好ましく、パラジウムが特に好ましい。
図1に示すように、試薬層4は、電極31〜33に接するように配されている。試薬層4は、電極31及び32と共に、センサ1の活性部として機能する。活性部とは、電気化学的に活性な領域であって、液体試料中の特定の物質に反応し、電気信号を生じる部分である。具体的には、試薬層4は、酵素及び電子受容体を含む。
図1に示すように、スペーサ5は、カバー6と基板2上に形成された導電層3との間に空隙を設けるための部材である。
図1に示すように、カバー6はスペーサ5全体を覆う板状の部材である。カバー6は、表面から裏面まで貫通する孔を備える。この孔は、キャピラリ51から外部に通じる通気口61として機能する。通気口61は、液体試料がキャピラリ51に吸引されるとき、キャピラリ51内の空気をキャピラリ外へ排出するための排気孔である。このように空気が排出されることで、液体試料がキャピラリ51内に容易に吸引されやすい。
本発明のセンサシステムは、前述した本発明のセンサと、前記少なくとも一対の電極間の電流値を測定する測定部と、前記測定部による測定結果に基づいて、前記液体試料中の対象物質の濃度を算出する算出部と、を有する。本発明のセンサシステムは、本発明のセンサを用いる以外は、液体試料中の標的物質を電気化学的に検出する公知のセンサシステムと同様に構成することができる。
以下、本発明のセンサシステムを、前述したセンサ1を含む一例に基づいて説明する。
A/D変換回路110は、電流/電圧変換回路109からの出力である電圧値(アナログ値)をデジタル値に変換する。
本発明のセンサシステムは、標的物質の濃度測定方法に好適に用いることができる。この濃度測定方法は、(a)少なくとも電子受容体及び酵素を含む試薬組成物と、液体試料と、を接触させること、(b)上記(a)によって生じた電流を検出すること、及び、(c)上記(b)の検出結果に基づいて、液体試料中の標的物質の濃度を測定すること、を含む。そして前記試薬組成物には、前述した本発明の試薬組成物を用いる。
(a)液体試料と、電子受容体と、酵素と、を接触させること、
(b)上記(a)によって生じた電流を検出すること、及び
(c)上記(b)の検出結果に基づいて、標的物質の濃度を測定すること、
を含む濃度測定方法が実行される。
(i)上記液体試料に、上記標的物質を基質とし、電子受容体と、上記電子受容体に電子を供与する酵素と、を溶解させること、
(ii)上記(i)により得られた溶液において生じた電流を検出すること、及び
(iii)上記(ii)の検出結果に基づいて、上記標的物質の濃度を測定すること、
を含む濃度測定方法が実行される。
親水性官能基を有するキノン類化合物は、試薬組成物が、水を媒体とする試料(例えば血液)を検知対象とするセンサに適用される場合に、特に好ましく用いられる。
電子受容体が親水性官能基を有するキノン類化合物である場合、電子受容体の分子と酵素分子とが、試料中で衝突する機会が増大する。その結果、反応の速度が増大し、標的物質に由来する電流量が増大すると共に、測定に要する時間も短縮され得る。
センサ1による標的物質の検出では、センサ1による標的物質の正確な検出を妨害する妨害物質が試料中に含有されることがある。妨害物質は干渉物質と称されることもある。妨害物質としては、アスコルビン酸、尿酸、及びアセトアミノフェン等が挙げられる。測定の対象が非生体試料(血液及び尿等の生体試料以外の試料)である場合、妨害物質とは、その非生体試料に含まれる易酸化性物質である。
補酵素の具体的な酸化還元電位は以下の通りである。補酵素であるFAD及びPQQは、酵素タンパク質に結合した状態で、酵素タンパク質と協働して典型的に機能する。これらの補酵素の酸化還元電位は、それぞれ約−300及び約−200mVである。また、NADは、酵素蛋白に結合せずに機能する。NADの酸化還元電位は、約−520mVである。
電子受容体の例である、9,10−フェナントレンキノン、9,10−フェナントレンキノン−2−スルホン酸、1,2−ナフトキノン−4−スルホン酸、2,5−ジメチル−1,4−ベンゾキノンの酸化還元電位は、それぞれ順に、−180mV、−140mV、−16mV、−5mVである。これら酸化還元電位は0mVよりも負であり、NADの電位よりも正、さらにはFAD及びPQQの電位よりも正である。特に、9,10−フェナントレンキノン、9,10−フェナントレンキノン−2−スルホン酸の酸化還元電位は、アスコルビン酸の酸化電位(約−140mV)よりも負である。すなわち、これらの電子受容体は、PQQ依存性又はFAD依存性酵素を有するセンサに適用可能である。また、これらの電子受容体は、妨害物質が検出結果に与える影響を低減することもできる。
以下に示すように、複素環式化合物は、保存期間の前後での電子受容体の酸化電位の変動を抑制すると共に、電子受容体の電位を負側にシフトさせるという効果を示す。以下では特に、電子受容体としてキノン類化合物を例に挙げて実験を行った結果を示す。
下記式(i)で表される9,10−フェナントレンキノン−2−スルホン酸ナトリウム(PQSA)を、次の操作によって得た。
下記組成を有する試薬液A及びBを調製した。
添加剤:イミダゾール(下記式に示す) 7.5mM
電子受容体:PQSA 7.5mM
酵素:FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ(FAD−GDH) 3.5MU/L(リットル)
緩衝液:100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)
イミダゾールを含まない以外は組成Aと同様の組成である。
試薬液A及びBの特性を測定するためのセンサ電極を作製した。この電極は、試薬層4が含まれていないこと以外は図1に示す構成と同様である。詳細は次の通りである。
得られた試薬液について、上記センサ電極を用いてサイクリックボルタンメトリーを行った。参照電極として、銀/塩化銀(飽和塩化カリウム)電極(以下Ag|AgClと記載する)を用いた。参照電極は、塩橋を介してセンサ電極の通気口61に連結された。測定にはポテンショスタットを用いた。各種電極及びポテンショスタットは、電気化学で一般的に用いられるものを使用した。これらの設備は、例えばビー・エー・エス社などから入手することが可能である。
図1に示す構成を有するセンサを作製した。詳細は次の通りである。
まず、長さが30mm、幅が7mm、厚みが0.2mmのポリエチレンテレフタレートを主成分として含む基板2に、パラジウムをスパッタリングすることにより、厚みが8nmの導電層3を形成した。その後、レーザアブレーションにより、幅が0.1mmの非導電トラックを形成することで、電極31〜33を形成した。電極31は作用電極、電極32は対電極、電極33は検知電極として機能するよう設計した。
添加剤:イミダゾール 7.5mM
酵素:FAD−GDH 4U/センサ
電子受容体:PQSA 0.46wt%(15mM)
高分子:カルボキシメチルセルロース 0.25wt%
緩衝液:リン酸バッファー(濃度:0.2wt%,pH 6.5)
NaH2PO4 0.11wt%(9mM)
KH2PO4 0.04t%(3mM)
K2HPO4 0.05wt%(3mM)
イミダゾールを含有しない以外は組成Cと同様の組成である。
−調製した直後の試薬液を用いた場合、及び
−調製してから25℃、湿度5%の環境下で21時間経過した後の試薬液を用いた場合
の2種類のセンサを作製した。
所定の濃度を有するグルコース溶液を用いて、各センサの応答電流値を測定した。
調製直後の試薬液Cを用いて作製されたセンサの応答電流値からの、21時間後の試薬液Cを用いて作製されたセンサの応答電流値の乖離度を、図6に示す。
調製直後の試薬液Dを用いて作製されたセンサの応答電流値からの、21時間後の試薬液Dを用いて作製されたセンサの応答電流値の乖離度を、図7に示す。乖離度は、調製直後の試薬液を用いて作製されたセンサの応答電流値を基準に(つまり0%としたときの)、21時間後の試薬液を用いて作製されたセンサの応答電流値の変化率(%)で示している。
[サイクリックボルタンメトリー]
図5に示すように、試薬液B(イミダゾールを含まない)において、PQSAの酸化電位は、初期測定時から21時間経過したときには、正側にシフトした。このような電位の変化は、電子受容体と酵素とが水溶液中で共存することによって生じると考えられる。
他の複数種類の複素環式化合物についても同様の効果が得られることを、発明者らは確認した。
図6と図7とを比較すると、試薬液が複素環化合物を含有することで、初期の応答電流値からの、21時間経過後の応答電流値の乖離が抑制され、複素環化合物を含まない場合と比較して、改善していることが分かる。
[2−1]試薬液の調製
添加剤として、イミダゾール、ヒスタミン、ヒスチジン、2−アミノイミダゾール、4,5−ビス(ヒドロキシメチル)イミダゾール、1,2,4−トリアゾール、3−アミノ−1,2,4−トリアゾール、4−アミノ−1,2,4−トリアゾール、3,5−ジアミノ−1,2,4−トリアゾール、2−メチルイミダゾール、又は1,2−ジメチルイミダゾールを添加することで、添加剤の種類及び濃度以外は試薬液Cと同様の組成を有する試薬液をそれぞれ調製した。各添加剤の濃度は、後述の図及び表に示すとおりである。
調製された試薬液を用いて、[1−5]と同様の操作により、センサを作製した。また、調製後に25℃、湿度5%で24時間保存した試薬液を用いてセンサを作製した。
調製された直後の試薬液を用いて、[1−5]と同様の操作により、センサを作製した。作製されたセンサを、高温多湿環境下(30℃80%RH,24時間)で暴露放置した。
暴露前のセンサと暴露後のセンサとを用いて、所定の濃度を有するグルコース溶液に対する応答電流値を測定した。
表3に示すように、他の複素環式化合物も、電子受容体の酸化電位の正側へのシフトを防止する効果、すなわち試薬液の安定性を高める効果、を示した。また、いくつかのジアミン系化合物は、試薬液の安定性を高める効果を示した。
異なる濃度(0.01〜6mM)の3−アミノ−1,2,4−トリアゾールを含有する試薬液をそれぞれ調製した。また3−アミノ−1,2,4−トリアゾールを含有しない以外は同じ組成の試薬液も調製した。調製直後の各試薬液を用いてセンサを作製し、一方で、調製後25℃、湿度5%で24時間保存した試薬液でセンサを作製した。それぞれのセンサを用いて、所定の濃度のグルコース溶液についての応答電流値を測定した。
下記組成を有する試薬液E、Fについて、サイクリックボルタンメトリーを行った。用いた電極は以下の通りであった。
−作用極:グラッシーカーボン電極、
−対極:白金ワイヤー、
−参照電極:Ag|AgCl
添加剤:3−アミノ−1,2,4−トリアゾール 5mM
電子受容体:PQSA 2mM
緩衝液:100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)
電子受容体として2,6−ジメチルベンゾキノンを用いた以外は試薬液Eと同様の組成である。
<試薬液G>
電子受容体として、フェリシアン化カリウムを用いた以外は試薬液Eと同様の組である。
2 基板
3 導電層
31 作用電極
32 対電極
33 検知電極
4 試薬層
5 スペーサ
51 キャピラリ
52 導入口
6 カバー
61 通気口
100 センサシステム
101 測定器
102 表示部
103 装着部
104〜106 コネクタ
107 切替回路
108 基準電圧源
109 電流/電圧変換回路
110 A/D変換回路
111 演算部
112 電源部
113 操作部
Claims (12)
- 液体試料が入るように形成された、開口部を備える試料室と、
前記試料室内に配置された少なくとも一対の電極と、
前記試料室内に形成された試薬層と、
を有し、
前記試薬層は、酸化還元酵素と
電子受容体と、
下記一般式(I)で表される複素環式化合物と、を含有し、下記第一の要件及び第二の要件を満足する、センサ。
前記炭化水素基は、アミノ基、ヒドロキシル基及びカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも一種の置換基を有していてもよく、
A1〜A5のうちの2個又は3個が窒素原子であって、他は炭素原子であり、
一般式(I)中のA1〜A5のうちの2個が窒素原子であるときは、A1が窒素原子であり、A2及びA5が炭素原子である。)
(第一の要件)
前記電子受容体が9,10−フェナントレンキノン−2−スルホン酸又はその塩である。
(第二の要件)
前記複素環式化合物がイミダゾール及びヒスチジンを含まず、
一般式(I)中のA1〜A5のうちの2個が窒素原子であるときは、R1〜R5のうち、少なくとも1個の基が水素原子以外の置換基である。 - 前記複素環式化合物が窒素原子を3個以上有する、
請求項1に記載のセンサ。 - 前記一般式(I)において、R1〜R5の少なくとも1つの基が、
CnHm−(a+b+c)(R6)a(R7)b(R8)cで表される鎖式炭化水素基であり、
nは2以下の自然数を表し、
mはn+1以上2n+1以下の自然数を表し、
a、b及びcはそれぞれ独立してn以下の自然数を表し、
R6〜R8は、それぞれ独立して、ヒドロキシル基、カルボキシル基及びアミノ基からなる群から選択される置換基を表す、
請求項1に記載のセンサ。 - 前記R1〜R5の少なくとも1つは、アミノ基を有する置換基である、
請求項1に記載のセンサ。 - 前記複素環式化合物の五員複素環がトリアゾールである、
請求項1に記載のセンサ。 - 前記複素環式化合物として、ヒスタミン、2−アミノーイミダゾール、4,5−ビス(ヒドロキシメチル)イミダゾール、2−メチルイミダゾール、1,2−ジメチルイミダゾール、1,2,4−トリアゾール、3−アミノ−1,2,4−トリアゾール、4−アミノ−1,2,4−トリアゾール及び3,5−ジアミノ−1,2,4−トリアゾールからなる群より選択される少なくとも一種の化合物を含有する、
請求項1に記載のセンサ。 - 前記酸化還元酵素として、グルコース脱水素酵素を含有する、
請求項1に記載のセンサ。 - 前記酸化還元酵素に合う補酵素をさらに含有する、
請求項7に記載のセンサ。 - 前記酸化還元酵素は、PQQ依存性又はFAD依存性を有する、
請求項8に記載のセンサ。 - 前記試薬層は、固体である、
請求項1に記載のセンサ。 - 前記試薬層は、少なくとも前記一対の電極の両方に接するように配置された、
請求項1に記載のセンサ。 - 請求項1に記載のセンサと、
前記少なくとも一対の電極間の電流値を測定する測定部と、
前記測定部による測定結果に基づいて、前記液体試料中の対象物質の濃度を算出する算出部と、
を有するセンサシステム。
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