JP6193237B2 - 強められたms信号を有するグリカンおよび他の生体分子の迅速蛍光タグ付け - Google Patents
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Description
なし。
なし。
なし。
R2は、−H、−C1−C8アルキル、−C1−C8シクロアルキル、ハロ、ジアルキルアミノ、CH2−ジアルキルアミノ、アミノカルボニル、アルコキシカルボニルまたはアルコキシから独立に選択され、ただしClまたはO=C=N−ではなく;
R3およびR4は、−H、アルキル、アルキルアミノ、アルキルスルホン酸、アルキルホスホン酸から独立に選択され、ここで、R3またはR4は、アルキルアミノ、アルキルホスホン酸、またはアルキルスルホン酸であり、ここで、R3およびR4は、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されていてもよい飽和または部分的に不飽和の5から8員環を形成してもよく、ただしR1がO=C=N−である場合を除く)。
R2は、メチレン、置換された窒素、酸素、カルボニル、アミド、エステル、硫黄、スルホキシドまたはスルホンから独立に選択され;
R3およびR4は、−H、アルキル、アルキルアミノ、アルキルスルホン酸、アルキルホスホン酸から独立に選択され、ここで、R3またはR4は、アルキルアミノ、アルキルホスホン酸またはアルキルスルホン酸であり、ここで、R3およびR4は、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されていてもよい飽和または部分的に不飽和の5から8員環を形成してもよく、
R5は、−H、−C1−C8アルキル、−C1−C8シクロアルキル、ハロ、ジアルキルアミノ、CH2−ジアルキルアミノ、アミノカルボニル、アルコキシカルボニルまたはアルコキシから独立に選択され、ただしClまたはO=C=N−ではなく、R1がS=C=Nである場合を除く)。
x=0または1;
m=0−9;
n=0−9;
Arは、置換されていてもよいフェニル基、ナフチル基、アントリル基、ピリジル基、ピラジル基、キノリル基、アクリドリ(acridly)基およびクマアリール基から選択され、カルボニル基と組み合わせて蛍光部分を生じ、;
R2は、N−スクシンイミジルカルバメート、イソシアネートおよびイソチオシアネートからなる群から選択される反応性基であり;
R3およびR4は、−H、アルキル、アルキルアミノ、アルキルスルホン酸およびアルキルホスホン酸、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、低級アルカノイル、低級ヘテロアルキル、低級ヘテロシクロアルキル、低級ハロアルキル、低級ハロアルケニル、低級ハロアルキニル、低級パーハロアルキル、低級パーハロアルコキシ、低級シクロアルキル、フェニル、アリール、アリールオキシ、低級アルコキシ、低級ハロアルコキシ、オキソ、低級アシルオキシ、カルボニル、カルボキシル、低級アルキルカルボニル、低級カルボキシエステル、低級カルボキシアミド、シアノ、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、低級アルキルアミノ、アリールアミノ、アミド、ニトロ、チオール、低級アルキルチオ、アリールチオ、低級アルキルスルフィニル、低級アルキルスルホニル、アリールスルフィニル、アリールスルホニル、アリールチオ、スルホネート、スルホン酸、トリ置換シリル、N3、SH、SCH3、C(O)CH3、CO2CH3、CO2H、ピリジニル、チオフェン、フラニル、低級カルバメート、および低級尿素からなる群から独立に選択され、ここで、2つの置換基は、一緒に結合して、0から3個のヘテロ原子からなる縮合5員、6員または7員炭素環式環またはヘテロ環式環を形成することができ、置換されていてもよい基は、非置換、完全置換、モノ置換または完全置換とモノ置換の間の任意のレベルで置換でもよく、R3およびR4は、単独または組み合わせで、MS活性であり得;
R5は、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、低級アルカノイル、低級ヘテロアルキル、低級ヘテロシクロアルキル、低級ハロアルキル、低級ハロアルケニル、低級ハロアルキニル、低級パーハロアルキル、低級パーハロアルコキシ、低級シクロアルキル、フェニル、アリール、アリールオキシ、低級アルコキシ、低級ハロアルコキシ、オキソ、低級アシルオキシ、カルボニル、カルボキシル、低級アルキルカルボニル、低級カルボキシエステル、低級カルボキシアミド、シアノ、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、低級アルキルアミノ、アリールアミノ、アミド、ニトロ、チオール、低級アルキルチオ、アリールチオ、低級アルキルスルフィニル、低級アルキルスルホニル、アリールスルフィニル、アリールスルホニル、アリールチオ、スルホネート、スルホン酸、トリ置換シリル、N3、SH、SCH3、C(O)CH3、CO2CH3、CO2H、ピリジニル、チオフェン、フラニル、低級カルバメートおよび低級尿素であり、ここで、2つの置換基は、一緒に結合して、0から3個のヘテロ原子からなる縮合5員、6員または7員炭素環式環またはヘテロ環式環を形成することができ、ここで、置換されていてもよい基は、非置換、完全置換、モノ置換または完全置換とモノ置換の間の任意のレベルで置換でもよく、R5は、MS活性であり得、ただし、R5がMS活性である場合、R3およびR4はHであり;
R6は、メチレン、置換窒素、酸素、カルボニル、アミド、エステル、硫黄、スルホキシドまたはスルホンから独立に選択され、MS活性であり得る)
である。
大部分のアミノ酸および/またはグリカンは、強い発色団もしくは発蛍光団またはMS活性部分がないため、容易に検出することができない。吸光度および蛍光の応答は非常に弱い。アッセイの感度を最大にする一般に使用される作戦は、目的の化合物を、利用する特定の検出方法のためにより良い応答を示す誘導体に変換することである。誘導体化剤の選択は、分析手順の開発において重要な選択である。誘導体化剤は、誘導体化分子の感度、収率および安定性を最大化することにより、分析の最大感度および正確さに影響を及ぼす。
本分子は、分子と素早く反応し、安定、高蛍光MS誘導体を形成するので、グリカン、また、アミノ酸およびタンパク質を誘導体化するのに特に有用であり得る。対象特許の化合物を使用するグリカンまたはアミノ酸の分析のための一般方法は、3つの密接に関係するプロセスからなる:(1)試料中の誘導体の形成;(2)誘導体の分離;および(3)分離した誘導体の検出。第一のステップは、一般に、混合物を本試薬の1つと反応させて、異なる化合物を生成することにより実施される。これらの誘導体は、分析の検出段階で検出することができる蛍光信号を出す。
吸光度検出は、一般にタンパク質マッピングワーク(mapping work)で使用される。本目的のためにしばしば使用される2つの異なる検出プロセスは、: a)単一波長検出器を使用する210−215nmでの検出;およびb)フォトダイオードアレイ(PDA)検出器を使用するブロードバンドスペクトル検出である。第一の方法では、すべてのペプチドは、その波長で吸収し、したがって、ユーザーは、カラムから溶出されるすべてのペプチドが検出されることを保証できる。この技法に伴う1つの難点は、多種多様な化合物が、スペクトルのこの領域で吸収することおよび、観察される信号がペプチドからのみ生じていることを保証するため、すべての試薬、溶離液、ガラス器具などが十分にきれいであることを確実にするよう細心の注意を払わなければならないことである。第二の方法では、PDA検出器は、特定の時間間隔で溶離液のスペクトルを収集する(例えば、200nmと350nm間のスペクトルは、1秒ごとに収集される)。このことにより、単一波長より多くの情報が得られ、したがって、類似の保持時間で溶出し得るペプチドを区別する手助けとなり得る。
誘導体化方法を利用する上で重要な基準がいくつかある。分析手順は、複雑な混合物中に存在する各成分を正確に定量しなければならない。このことを実施するために、目的の成分を、他の成分からだけでなく、誘導体化手順により生じた成分からも分離することが必要である。第二級アミノ酸を含めたすべての非誘導体化グリカンおよびアミノ酸の単一製品への定量的変換が、特に望まれ、良好な定量を容易にする。
(1)o−フタルアルデヒド(OPA)/メルカプタン方法。OPA手順は、通常の検出可能濃度が約100フェムトモル(fmol)程度のアミノ酸を検出できる。誘導体の形成は迅速である。この方法の大きな難点は、付加物が非常に不安定であり、検出ステップの直前に調製しなければならないことである。さらなる問題は、この試薬が、第二級アミノ酸を有する誘導体を形成しないようになることである。
(2)9−フルオレニルメチルクロロギ酸(FMOC方法)。FMOC手順は、最小検出可能濃度が200から300fmol程度の安定な誘導体を提供する。FMOC手順にはいくつかのデメリットがある。遊離トリプトファンおよびシスチンは、容易に定量することができない。誘導体化試薬は、それ自体が蛍光であるので、抽出ステップにより反応混合物から除去されなければならない。試薬は、ヒスチジンを有する多様な誘導体を形成することが報告された。試薬は、腐食性で催涙剤であるので、取り扱いが危険でもある。
(3)フェニルイソチオシアネート方法(PITC)。PITC手順では、素早く形成される安定な誘導体が生じる。それは、第一級アミノ酸と第二級アミノ酸の両方、ならびにシスチンのために使用することができる。方法は、検出手順として吸光度を使用し、1pmolの最小検出限界が可能である。しかし、誘導体は蛍光ではなく、良好な検出選択性を考慮しない254nmで検出を実施しなければならない。
(4)ダンシルクロリド法。ダンシルクロリド法は、約1.5pmol程度の最小検出感度を有する安定な誘導体を提供する。それは二級アミンおよびシステインを検出することができるが、多数の誘導体をもたらす。
(5)蛍光スクシンイミドカルバメートは、アミン、アミノ酸、ペプチド、フォスフェートおよび他のクラスの化合物のための誘導体化剤として使用されてきた。スクシンイミドカルバメート試薬が、蛍光基を有する化合物をタグ付けするのに使用される場合は、約1pmolの検出限界を達成することができる。これらの試薬は、高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動分析などの当今の分離技法に関連して使用される。Nimuraら、58 ANAL. CHEM. 2372 (1986)。スクシンイミジル活性化カルバメートは、炭素環式芳香族アミンをジ−(N−スクシンイミジル)カルボネートと反応させることにより調製した。Takedaら、24 TETRAHEDRON LETT.、4569(1983)。
クマリン4(7−ヒドロキシ−4−メチルクマリン);
クマリン120(7−アミノ−4−メチルクマリン);
クマリン2(7−アミノ−4−メチルクマリン);
クマリン466(7−ジエチルアミノクマリン);
クマリン47(7−ジエチルアミノ−4−メチルクマリン);
クマリン102(2,3,5,6−1H,4H−テトラヒドロ−8−メチルキノリジノ−[9,9a,1−gh]−クマリン);
クマリン152A(7−ジエチルアミノ−4−トリフルオロメチルクマリン);
クマリン152(7−ジメチルアミノ−4−トリフルオロメチルクマリン);
クマリン151(7−アミノ−4−トリフルオロメチルクマリン);
クマリン6H(2,3,5,6−1H,4H−テトラヒドロキノリジノ−[9,9a,1−gh]クマリン);
クマリン307(7−エチルアミノ−6−メチル−4−トリフルオロメチルクマリン);
クマリン500(7−エチルアミノ−4−トリフルオロメチルクマリン);
クマリン314(2,3,5,6−1H,4H−テトラヒドロ−9−carboエトキ シキノリジノ−[9,9a,1−gh]クマリン);
クマリン510(2,3,5,6−1J−4H−テトラヒドロ−9−(3−ピリジル)−キノリジノ−[9,9a,1−gh]クマリン);
クマリン30(3−2’−N−メチルベンズイミダゾリル)−7−N,N−ジエチルアミノクマリン);
クマリン552(N−メチル4−トリフルオロメチルピペリジノ−[3,2−g]−クマリン);
クマリン6(3−(2’−ベンゾチアゾリル)−7−ジエチルアミノクマリン);および
クマリン153(2,3,5,6−1H,4H−テトラヒドロ−8−トリフルオロメチルキノリジノ−9,9a,1−gh]クマリン)
が含まれる。
ローダミン110(o−(6−アミノ−3−イミノ−3H−キサンテン−9−イル)−安息香酸);
ローダミン19(安息香酸、2−[6−(エチルアミノ)−3−(エチルイミノ)−2,7−ジメチル3H−キサンテン−9−イル]パークロレート);
ローダミン6G(安息香酸、2−[6−(エチルアミノ)−3−(エチルイミノ)−2,7−ジメチル3H−キサンテン−9−イル]−エチルエステル、一塩酸塩);
ローダミンB(2−[6−(ジエチルアミノ)−3−(ジエチルイミノ)−3H−キサンテン−9−イル]安息香酸);
ローダミン101(8−(2−カルボキシフェニル)−2,3,5,6,11,12,14,15−オクタヒドロ−1Η,4Η,10H,13H−ジキノリジノ[9,9a,1−bc:9’,9a’,1−hi]キサンチリウムパークロレート)。
ブチルPBD(2−(4−ビフェニルイル)−5−(4−t−ブチルフェニル)−1,3,4−オキサジアゾール);
PBD(2−(4−ビフェニルイル)−5−フェニル−1,3,4−オキサジアゾール);および
BBD(2,5−ビス−(4−ビフェニルイル−1,3,4−オキサジアゾール)
が含まれる。
PPO(2,5−ジフェニルオキサゾール);
α−NPO(2−(1−ナフチル)−5−フェニルオキサゾール);
BBO(2,5−ビス−(4−ビフェニルイル)−オキサゾール);および
POPOP(1,4−ジ[2−(5−フェニルオキサゾールイル)]ベンゼン)
が含まれる。
TMQ(3,3’,2’’,3’’’−テトラメチル−p−クォーターフェニル);
BMQ(2,2’’’−ジメチル−p−クォーターフェニル);
DMQ(2−メチル−5−t−ブチル−p−クォーターフェニル);
PQP(p−クォーターフェニル);
ポリフェニル1(p−クォーターフェニル−4−4’’’−ジスルホン酸二ナトリウム塩);
ポリフェニル2(p−クォーターフェニル−4−4’’’−ジスルホン酸二カリウム塩;
BiBuQ(4,4’’’−ビス−(2−ブチルオクチルオキシ)−p−クォーターフェニル);
BM−ターフェニル(2,2’’−ジメチル−p−ターフェニル);および
PTP(p−ターフェニル)
が含まれる。
カルボスチリル7(7−アミノ−4−メチルカルボスチリル);
カルボスチリル3(7−ジメチルアミノ−4−メチルキノロン−2);および
キノロン390(7−ジメチルアミノ−1−メチル−4−メトキシ−8−アザキノロン−2)
が含まれる。
DASBTI(2−(p−ジメチルアミノスチリル)−ベンゾチアゾールイルエチルヨウ化物);
クマリン6(3−(2’−ベンゾチアゾールイル)−7−ジメチルアミノクマリン);
スチリル9M(2−(6−(4−ジメチルアミノフェニル)−2,4−ネオペンチレン−1,3,5−ヘキサトリエニル)−3−メチル−ベンゾチアゾリウムパークロレート);
スチリル15(2−(6−(9−(2,3,6,7−テトラヒドロ−1H,5H−ベンゾ(i,j)−チノリジニウム))−2,4−ネオペンチレン−1,3,5−ヘキサトリエニル)−3−メチルベンゾチアゾリウムパークロレート);
スチリル14(2−(8−(4−p−ジメチルアミノフェニル)−2,4−ネオペンチレン−1,3,5,7−オクタテトラエニル)−3−メチルベンゾチアゾリウムパークロレート);
スチリル20(2−(8−(9−(2,3,6,7−テトラヒドロ−1H,5H−ベンゾ(i,j)−チノリジニウム))−2,4−ネオペンチレン−1,3,5,7−オクタトラエニル(traenyl))−3−メチルベンゾチアゾリウムパークロレート);
フラン1(ベンゾフラン,2,2’−[1,1’−ビフェニル]−4,4’−ジイル−ビス−テトラスルホン酸(四ナトリウム塩));および
PBBO(2−(4−ビフェニルイル)−6−フェニルベンゾオキサゾール−1,3)
が含まれる。
DPS(4,4’−ジフェニルスチルベン);
スチルベン1([1,1’−ビフェニル]−4−スルホン酸,4’,4’’−1,2−エテン−ジイルビス−,二カリウム塩);および
スチルベン3(2,2’−([1,1’−ビフェニル]−4,4’−ジイルジ−2,1−エテンジイル)−ビス−ベンゼンスルホン酸二ナトリウム塩)
が含まれる。
この場合、例には、:
スルホローダミンB(エタンアミニウム,N−[(6−ジエチルアミノ)−9−(2,4−ジスルホフェニル)−3H−キサンテン−3−イルイデン]−N−エチルヒドロオキシド,不活性塩,ナトリウム塩);および
スルホローダミン101(8−(2,4−ジスルホフェニル)−2,3,5,6,11,12,14,15−オクタヒドロ−1Η,4Η,10H,13H−ジキノリジノ[9,9a,1−bc:9’,9a’,1−hi]キサンテン)
が含まれる。
ピロメテン546(1,3,5,7,8−ペンタメチルピロメテンジフルオロボレート錯体);
ピロメテン556(ジソジウム−1,3,5,7,8−ペンタメチルピロメテン−2,6−ジスルホネート−ジフルオロボレート錯体);
ピロメテン567(2,6−ジエチル−1,3,5,7,8−ペンタメチルピロメテンジフルオロボレート錯体);
ピロメテン580(2,6−ジ−n−ブチル−1,3,5,7,8−ペンタメチルピロメテンジフルオロボレート錯体);
ピロメテン597(2,6−ジ−t−ブチル−1,3,5,7,8−ペンタメチルピロメテンジフルオロボレート錯体);および
ピロメテン650(8−シアノ−1,2,3,5,6,7−ヘキサメチルピロメテンジフルオロボレート錯体)
が含まれる。
Cresyl Violet(5,9−ジアミノベンゾ[a]フェノキサアゾニウムパークロレート);
Nile Blue (5−アミノ−9−ジエチルイミノベンゾ[a]フェノキサアゾニウムパークロレート);
Oxazine170(9−エチルアミン−5−エチルイミノ−10−メチル−5H−ベンゾ(a)フェノキサアゾニウムパークロレート);および
Oxazine1(3−ジエチルアミノ−7−ジエチルイミノフェノキサアゾニウムパークロレート)
が含まれる。
本明細書で提供される分子は、適切な試料調製の問題の克服を提供するわけではない。高品質マススペクトルを得るために、試料の条件は非常に重要である。被検体以外の化合物は、一般にイオン収率に悪影響を及ぼすことになり、除去されなければならない。実際は、少量のナトリウムは、MALDIによるイオン化に不可欠であるが、炭水化物は、塩の影響を特に受けやすい。さらに、多くの炭水化物は、混合物として存在する。したがって、分離および精製の技法が、定量的情報の損失と共に試料の分別を引き起こさないことを確実にすることは重要である。pHが低すぎるまたは試料温度が高すぎる場合に糖タンパク質からしばしば失われるシアル酸は、例示的なものである。
2,5−ジオキソピロリジン−1−イル(4−((2−(ジエチルアミノ)エチル)カルバモイル)フェニル)カルバメートの調製
撹拌子を装備した乾燥した100mLErlenmeyerフラスコ中の乾燥アセトニトリル47gにプロカインアミド2.6gを添加し、溶解させた。滴下ロートおよび撹拌子を装備した1Lセパラブルフラスコ中で、N,N−ジスクシンイミジルカルボネート(DSC)3.2gを乾燥アセトニトリル417gに溶解し、系をN2でパージした。次いで、プロカインアミドの溶液を滴下ロートに移し、1時間かけてDSC溶液に1滴ずつ添加した。次いで、溶液を4時間撹拌した。この時点で、溶媒を除去し、生成物を室温、高真空下で乾燥した。
2,5−ジオキソピロリジン−1−イル(4−((2−(ジエチルアミノ)エチル)カルバモイル)フェニル)カルバメートの調製
撹拌子を装備した乾燥した100mL Erlenmeyerフラスコ中の乾燥ジクロロメタン50mLにプロカインアミド8.2gを添加し、溶解させた。滴下ロートおよび撹拌子を装備した1Lセパラブルフラスコ中で、N,N−ジスクシンイミジルカルボネート(DSC)10.1gを乾燥ジクロロメタン400mLと混合し、系をN2でパージした。次いで、プロカインアミドの溶液を滴下ロートに移し、1時間かけてDSC溶液に1滴ずつ添加した。次いで、溶液を4時間撹拌した。この時点で、ろ過により所望の生成物を母液から除去し、次いで、室温、高真空下で乾燥した。
Herceptinから放出されるN−結合性グリカンのタグ付け
N−結合性グリカンを、2,5−ジオキソピロリジン−1−イル(4−((2−(ジエチルアミノ)エチル)カルバモイル)フェニル)カルバメートで標識化する前に、標準PNGase Fプロトコールを使用してHerceptin0.8μgから放出した。2,5−ジオキソピロリジン−1−イル(4−((2−(ジエチルアミノ)エチル)カルバモイル)フェニル)カルバメートを、最終濃度45μg/μlになるまで乾燥(水を含まない。)アセトニトリルに溶解した。次いで、この溶液10μlを、放出されたグリカン試料に添加した。この混合物を室温で5分間放置した。次いで、標識化試料を、急速な真空を使用して凍結乾燥し、HILIC LC法を使用するクロマトグラフ分離ならびに図1、図2に示す蛍光およびMS検出による分析の前に、60%アセトニトリル/水溶液中で再構成した。
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合成II
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