ES2337704T3 - Estrategia automatizada de identificacion del perfil de glucosilacion. - Google Patents
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Abstract
Un método in vitro para determinar uno o más marcadores de glucosilación de una enfermedad que comprende las etapas de: - proporcionar una muestra de enfermo y una muestra de control, donde la muestra de enfermo es una muestra de un sujeto al que se le ha diagnosticado la enfermedad y la muestra de control es una muestra de un control sano; - inmovilizar las glucoproteínas totales de la muestra de enfermo y de la muestra de control sobre una membrana de unión a proteínas o en un gel sin separar el gel en bandas; - liberar una combinación de glucanos de las glucoproteínas totales inmovilizadas de la muestra de enfermo y liberar una combinación de glucanos de las glucoproteínas totales inmovilizadas de la muestra de control del gel o la membrana de unión a proteínas sin haber purificado una glucoproteína específica y sin exponer la muestra de enfermo y la muestra de control a hidrazinolisis; - medir un perfil de glucosilación de la combinación de glucanos de la muestra de enfermo y medir un perfil de glucosilación de la combinación de glucanos de la muestra de control usando cromatografía, espectrometría de masas o una combinación de las mismas; y - comparar el perfil de glucosilación de la muestra de enfermo con el perfil de glucosilación de la muestra de control para determinar uno o más marcadores de glucosilación de la enfermedad.
Description
Estrategia automatizada de identificación del
perfil de glucosilación.
Esta invención se refiere generalmente a métodos
de diagnóstico y control de enfermedades y, en particular, a
métodos automáticos de diagnóstico y control de enfermedades basados
en un análisis detallado de glucanos.
Los cambios en la glucosilación relacionados con
enfermedades específicas para glucanos liberados a partir de IgG de
suero purificada se describieron por primera vez para la artritis
reumatoide, véase Parekh et. al. "Association of
Rheumatoid Arthritis and Primary Osteoarthritis with Changes in the
Glycosylation Pattern of Total Serum IgG", Nature, 316, págs.
452-457, 1985. Trabajos posteriores demostraron que
estos cambios no sólo eran diagnósticos de artritis reumatoide
(RA), sino que también podían usarse como indicadores de
pronóstico, así como para el control de la actividad de la
enfermedad RA, véase, por ejemplo, "Galactosylation of IgG
associated oligosaccharides: Reduction in patients with adult and
juvenile onset rheumatoid arthritis and relation to disease
activity", R. B. Parekh, D. A. Isenberg, B. M. Ansell, I. M.
Roitt, R. A. Dwek y T. W. Rademacher (1988) Lancet, 1 (8592),
966-969; "A comparative analysis of
disease-associated changes in the galactosylation
of serum IgG" R. B. Parekh, D. Isenberg, G. Rook, I. Roitt, R. A.
Dwek y T. W. Rademacher (1989) J. Autoimmunity, 2,
101-114; 3rd Jenner International Immunoglycobiology
Meeting Abstract R. B. Parekh, Isenberg, D., Dwek, R. A. y
Rademacher, T. W. Glycoconjugate Journal (1994) 1,
3195-227. Posteriormente, se demostró que los
cambios de glucosilación específicos en la glucosilación en suero
total también pueden ser biomarcadores de otras enfermedades. Por
ejemplo, Block et. al. determinaron cambios en la
glucosilación específicos en el suero total de marmotas infectadas
con el virus de la hepatitis B que desarrollaron carcinoma
hepatocelular por realización de un análisis de glucosilación en
glucanos liberados enzimáticamente a partir de una solución de
suero total, véase Block, T. M., Comunale, M. A., Lowman, M., Steel,
L. F., Romano, P. R., Fimmel, C., Tennant, B. C., London, W, T.,
Evans, A. A., Blumberg, B. S., Dwek, R. A., Mattu, T. S. y Mehta, A.
S. (2005). "Use of targeted glycoproteomics to identify serum
glycoproteins that correlate with liver cancer in woodchucks and
humans". Proc Natl Acad Sci U S A 102: 779-84. El
análisis de glucosilación de glucoproteínas en suero completo de
pacientes y controles sanos usando una combinación de cromatografía
líquida de alto rendimiento (HPLC) (véase Guile, G. R., et.
al., "A rapid high-resolution
high-performance liquid chromatographic method for
separating glycan mixtures and analyzing oligosaccharide
profiles". Anal. Biochem. 240: 210-26, 1996;
Royle, L., et. al. "An analytical and structural database
provides a strategy for sequencing O-glycans from
microgram quantities of glycoproteins". Anal. Biochem. 304:
70-90, 2002) y la tecnología de Espectrometría de
Masas (MS) se usó por primera vez para confirmar el diagnóstico de
un paciente con trastornos congénitos de la glucosilación (CDG)
tipo II y para establecer la etapa de procesamiento de glucosilación
defectuosa en un paciente sin diagnosticar, véase Butler, M.,
et. al. "Detailed glycan analysis of serum glycoproteins
of patients with congenital disorders of glycosylation indicates the
specific defective glycan processing step and provides an insight
into pathogenesis". Glycobiology 13: 601-22,
2003. El perfil y el análisis de glucanos eran erróneos debido a
que se usó hidrazinolisis para liberar los glucanos. El uso de
hidrazinolisis da como resultado la desialilación de una proporción
significativa de los azúcares y la introducción de varios
artefactos tales como pérdida de grupos N-acetilo y
N-glicolilo de los restos de aminoazúcares (que
posteriormente se vuelven a N-acetilar y esto puede dar como
resultado tanto una sub-como una
sobre-acetilación), así como pérdida de
sustituciones O-acetilo en ácidos siálicos.
Callewaert et al. usaron la liberación enzimática en el
análisis de glucosilación se suero completo por electroforesis
capilar en una plataforma microfluídica, véase, Callewaert, N.,
Contreras, R., Mitnik-Gankin, L., Carey, L.,
Matsudaira, P. y Ehrlich, D. (2004). "Total serum protein
N-glycome profiling on a capillary
electrophoresis-microfluidics platform".
Electrophoresis 25: 3128-31 y Callewaert, N.,
Schollen, E., Vanhecke, A., Jaeken, J., Matthijs, G., y Contreras,
R. (2003). "Increased fucosylation and reduced branching of serum
glycoprotein N-glycans in all known subtypes of
congenital disorder of glycosylation I". Glycobiology 13:
367-375. Aunque la liberación enzimática de
Callewaert et. al. es compatible con un formato de alto
rendimiento, sus análisis determinaron solamente las estructuras
desialiladas principales. Por lo tanto, todavía existe la necesidad
de desarrollar un método totalmente automatizado de alto
rendimiento para determinar marcadores de glucosilación robustos de
enfermedades basadas en un análisis de glucosilación detallado de
glucoproteínas totales en muestras de fluido corporal o tejido
corporal.
La Publicación de Patente Internacional Nº WO
2004/019040 describe un método de identificación de marcadores de
patologías usando espectrometría de masas en muestras que contienen
glucanos parcialmente purificadas.
La Publicación de Patente de Estados Unidos Nº
US 2004/0253651 describe un método de diagnóstico del cáncer en una
muestra biológica por determinación de la presencia de secuencias de
oligosacáridos específicas de cáncer en la muestra.
Una realización de la invención es un método
in vitro de terminación de uno o más marcadores de
glucosilación de una enfermedad que comprende las etapas de:
- -
- proporcionar una muestra de enfermo y una muestra de control, donde la muestra de enfermo es una muestra de un sujeto al que se le ha diagnosticado la enfermedad y la muestra de control es una muestra de un control sano;
- -
- inmovilizar las glucoproteínas totales de la muestra de enfermo y de la muestra de control en una membrana de unión a proteínas o en un gel sin separar el gel en bandas;
- -
- liberar una combinación de glucanos de las glucoproteínas totales inmovilizadas de la muestra de enfermo y liberar una combinación de glucanos de las glucoproteínas totales inmovilizadas de la muestra de control del gel o la membrana de unión a proteínas sin haber purificado un glucoproteína específica y sin exponer la muestra de enfermo y la muestra de control a hidrazinolisis;
- -
- medir un perfil de glucosilación de la combinación de glucanos de la muestra de enfermo y medir un perfil de glucosilación de la combinación de glucanos de la muestra de control usando cromatografía, espectrometría de masas o una combinación de las mismas; y
- -
- comparar el perfil de glucosilación de la muestra de enfermo con el perfil de glucosilación de la muestra de control para determinar uno o más marcadores de glucosilación de la enfermedad.
La muestra puede ser una muestra de un fluido
corporal, por ejemplo, suero completo o un tejido corporal. Los
glucanos pueden ser glucanos unidos a N o glucanos unidos a
O.
El método puede incluir una etapa adicional de
marcaje de los glucanos de la combinación de glucanos con un
marcador radiactivo o fluorescente antes de medir el perfil de
glucosilación.
El método puede comprender además seleccionar un
mejor marcador de glucosilación de entre los marcadores de
glucosilación, donde el mejor marcador de glucosilación tiene una
mayor correlación con uno o más parámetros de la enfermedad.
El método puede comprender además una etapa de
segregación y/o amplificación del uno o más marcadores de
glucosilación por digestión de los glucanos con una o más
exoglucosidasas. Dicha digestión puede realizarse de forma
secuencial o con una serie que comprende la una o más
exoglucosidasas.
El método puede incluir una etapa de uso de una
base de datos para realizar asignaciones preliminares y finales de
las estructuras de los glucanos.
El método puede comprender además una etapa de
uso del uno o más marcadores de glucosilación de la enfermedad para
diagnosticar, pronosticar y/o controlar la enfermedad.
Otra realización de la invención es un método
in vitro para diagnosticar y controlar una enfermedad en un
sujeto que comprende las etapas de:
- -
- proporcionar una muestra de fluido corporal o un tejido corporal del sujeto;
- -
- inmovilizar las glucoproteínas totales de la muestra en una membrana de unión a proteínas o en un gel sin separar el gel en bandas;
- -
- liberar una combinación de glucanos de las glucoproteínas totales inmovilizadas de la muestra del gel o la membrana de unión a proteínas sin haber purificado una glucoproteína específica y sin exponer la muestra a hidrazinolisis;
- -
- medir un perfil de glucosilación de la combinación de glucanos; y
- -
- determinar un estado clínico del sujeto a partir de uno o más marcadores de glucosilación de la enfermedad en el perfil de glucosilación.
La enfermedad puede ser cáncer, una enfermedad
autoinmune o un trastorno congénito de la glucosilación. La
enfermedad autoinmune puede ser artritis reumatoide.
El fluido corporal puede ser suero completo.
En ciertas realizaciones en las que la
enfermedad autoinmune es artritis reumatoide y el fluido corporal es
suero completo, el marcador de glucosilación es una relación entre
glucanos G0 y glucanos triple-G1.
El método puede comprender además una etapa de
segregación y/o amplificación del uno o más marcadores de
glucosilación por digestión de los glucanos con una o más
exoglucosidasas.
La Figuras 1 ilustra una estrategia para el
análisis estructural de glucanos multidimensional.
La Figura 2 ilustra el análisis de alto
rendimiento de glucanos a partir de glucoproteínas del suero.
La Figura 3 muestra perfiles de cromatografía
líquida de alto rendimiento de fase normal (NP-HPLC)
de N-glucanos marcados con 2-AB liberados
del suero completo después de la digestión con una serie de
exoglucosidasas.
La Figura 4 demuestra un perfil de glucosilación
de glucanos marcados con 2-AB liberados del suero
completo analizados mediante NP-HPLC. El perfil de
glucosilación se presenta como un cromatograma usando escalas tanto
de tiempos de elución como de unidades de glucosa.
La Figura 5 demuestra el porcentaje de glucanos
fucosilados de núcleo en suero completo de pacientes con HCV.
La Figura 6 muestra una electroforesis en gel de
poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE)
y perfiles de NP-HPLC de glucanos liberados de
inmunoglobulina G (IgG) purificada de las muestras GBRA 1 y GBRA
13.
La Figura 7 muestra los perfiles de
NP-HPLC de glucanos liberados de IgG purificada de
la muestra GBRA 15.
La Figura 8 muestra los perfiles de
NP-HPLC de control y de la muestra GBRA 15.
La Figura 9 muestra la correlación entre un
marcador de glucosilación de artritis reumatoide determinado en
glucanos liberados de suero total (relación G0/triple G1) y el
diagnóstico de artritis reumatoide (determinado como porcentaje de
glucanos G0 en los glucanos totales liberados de IgG
purificada).
Las Figuras 10a-g ilustran una
base de datos de glucanos en el Instituto de Glicobiología de la
Universidad de Oxford: (a) y (b) muestran la nomenclatura usada
para dibujar las estructuras de glucanos y explicar las digestiones
con exoglicosidasa; (c) muestra algunas de las estructuras con
valores de GU enumerados en la base de datos; (d) a (g) siguen la
estructura de A2G2S2 (d) a través de una serie de digestiones,
proporcionándose en cada caso el valor de GU de consenso (que se
calcula a partir de los valores de GU determinados experimentalmente
enumerados) junto con las digestiones y productos posibles.
La Figura 11 ilustra un algoritmo para asignar
estructuras de glucanos en perfiles de glucosilación usando bases de
datos de glucanos.
Esta invención se refiere en general a métodos
de diagnóstico y control de enfermedades y, en particular, a
métodos automáticos de diagnóstico y control de enfermedades basados
en un análisis de glucanos detallado.
A menos que se especifique otra cosa, los
términos "un" o "uno/a" significan "uno o más".
Las expresiones "glucoperfil" o "perfil
de glucosilación" se refieren a una presentación de estructuras
de glucanos (oligosacáridos) presentes en una combinación de
glucanos. Puede presentarse un perfil de glucosilación, por
ejemplo, como una pluralidad de picos que se corresponden con
estructuras de glucanos presentes en una combinación de
glucanos.
La expresión "marcador de glucosilación" se
refiere a una diferencia particular en la glucosilación entre una
muestra de un paciente al que se le diagnosticado una enfermedad y
una muestra de un control sano.
La presente invención se refiere al desarrollo
de un sistema totalmente automatizado basado en un análisis
detallado de la glucosilación. La metodología general del análisis
de glucosilación detallado se ilustra en la Figura 1. Una
combinación de glucanos (de glucanos unidos a N y/o glucanos unidos
a O) de glucoproteínas totales, es decir, de todas o
sustancialmente todas las glucoproteínas, puede liberarse de una
muestra de un fluido corporal o tejido corporal obtenido de un
sujeto. La liberación de la combinación de glucanos se realiza sin
exponer la muestra a hidrazinolisis y sin haber purificado una
glucoproteína específica. El análisis detallado de la combinación
de glucanos puede realizarse por cromatografía líquida de alto
rendimiento, espectrometría de masas o una combinación de las
mismas. Los glucanos liberados pueden marcarse fluorescentemente
antes del análisis. El análisis detallado puede incluir la
separación de la combinación de glucanos en varias alícuotas
basándose en la carga de los glucanos en cada alícuota por
cromatografía de intercambio aniónico débil (WAX) o una técnica
relacionada. El análisis de NP-HPLC puede realizarse
en cada alícuota. El análisis de NP-HPLC realizado
en la combinación de glucanos total o en alícuotas de WAX de la
combinación de glucanos puede dar como resultado un perfil de
glucosilación que puede comprender una pluralidad de picos. Cada
pico en el perfil de glucosilación puede asignarse de forma
preliminar a una estructura de glucano particular usando una base
de datos de estructuras de glucanos conocidas. La base de datos
puede recomendar un tratamiento con exoglicosidasa particular para
establecer una asignación final de cada pico en el perfil de
glucosilación.
La Figura 2 ilustra una realización posible de
un sistema de alto rendimiento totalmente automático basado en el
análisis cuantitativo de glucanos detallado. El sistema de alto
rendimiento totalmente automatizado debería usar, por ejemplo,
métodos de liberación de glucanos totalmente compatibles con un
formato de alto rendimiento y debería incluir un análisis de datos
asistido por ordenador adecuado para la exploración clínica. Por
consiguiente, la presente invención proporciona métodos de
liberación de glucanos compatibles con un formato de alto
rendimiento, bases de datos y métodos de uso de bases de datos en un
análisis automático de glucanos. La presente invención también
proporciona métodos de determinación de marcardores de glucosilación
de enfermedad basados en el análisis detallado de la glucosilación
y métodos relacionados para el uso de los marcadores de
glucosilación de enfermedad para el diagnóstico y el control de la
enfermedad.
Una realización de la invención es un método
in vitro de determinación de uno o más marcadores de
glucosilación de enfermedad que comprende obtener una muestra de
enfermo y una muestra de control, en el que la muestra de enfermo
es una muestra de un paciente al que se ha diagnosticado la
enfermedad y la muestra de control es una muestra de un control
sano; inmovilizar las glucoproteínas totales de la muestra de
enfermo y de la muestra de control sobre una membrana de unión a
proteínas o en un gel sin separar el gel en bandas; liberar una
combinación de glucanos de la muestra de enfermo de las
glucoproteínas inmovilizadas totales de la muestra de enfermo y una
combinación de glucanos de control de las glucoproteínas
inmovilizadas totales de la muestra de control del gel o la
membrana de unión a proteínas sin haber purificado una glucoproteína
específica y sin exponer la muestra de enfermo y la muestra de
control a hidrazinolisis; medir un perfil de glucosilación de
muestra de enfermo de la combinación de glucanos de la muestra de
enfermo y un perfil de glucosilación de control de la combinación
de glucanos de control usando cromatografía, espectrometría de masas
o una combinación de las mismas; comparar el perfil de
glucosilación de la muestra de enfermo y los perfiles de
glucosilación de control para determinar dicho uno o más marcadores
de glucosilación de enfermedad. En algunas realizaciones, la
comparación del perfil de glucosilación de enfermo y el perfil de
glucosilación de control puede comprender comparar las proporciones
de picos en el perfil de glucosilación de enfermo y en el perfil de
glucosilación de control. En algunas realizaciones, el método de
determinación de uno o más marcadores de glucosilación de cáncer
puede comprender además seleccionar un mejor marcador de
glucosilación de enfermedad de entre los uno o más marcadores de
glucosilación de enfermedad, en el que el mejor marcador de
glucosilación tiene la mayor correlación con uno o más parámetros
del paciente al que se le ha diagnosticado un cáncer. Los parámetros
del paciente al que se le ha diagnoticado la enfermedad pueden ser,
por ejemplo, diagnóstico, edad, sexo, fase del cáncer, respuesta a
terapia, historia médica o cualquier combinación de los mismos. En
algunas realizaciones, la comparación del perfil de glucosilación
de enfermo y el perfil de glucosilación de control puede realizarse
después de la digestión de la combinación de glucanos de la muestra
de enfermo y la combinación de glucanos de la muestra de control
con una o más enzimas exoglucosidasas en cualquier combinación. Por
ejemplo, la digestión de la combinación de glucanos de la muestra
de enfermo y la combinación de glucanos de la muestra de control
puede ser una digestión secuencial, la digestión de la combinación
de glucanos de la muestra de enfermo y de la combinación de
glucanos de la muestra de control puede ser una digestión con una
serie que comprende una o más enzimas exoglucosidasas. En algunas
realizaciones, la digestión de la combinación de glucanos de la
muestra de enfermo y de la combinación de glucanos de la muestra de
control con una o más glucosidasas en cualquier combinación puede
usarse para amplificar y/o segregar los marcadores de glucosilación
de enfermedad. El marcador de glucosilación determinado puede
usarse para diagnosticar, controlar y/o pronosticar la enfermedad
en un sujeto basándose en un análisis detallado de la glucosilación
usando HPLC, espectrometría de masas o una combinación de las
mismas. El marcador de glucosilación determinado también puede
usarse para aislar en el fluido corporal o el tejido corporal una o
más glucoproteínas con una glucosilación alterada, es decir, para
aislar una o más glucoproteínas que sean biomarcadores específicos
de la enfermedad. El marcador de glucosilación determinado también
puede usarse para diagnosticar, controlar y/o pronosticar una
enfermedad usando técnicas analíticas distintas de las técnicas
usadas para determinar el marcador de glucosilación. Estas otras
técnicas analíticas pueden ser, por ejemplo, electroforesis capilar
o cromatografía con lectina.
Otra realización de la invención es un método
in vitro para diagnosticar y controlar una enfermedad en un
sujeto que comprende obtener una muestra de fluido corporal o un
tejido corporal del sujeto inmovilizando las glucoproteínas totales
de la muestra sobre una membrana de unión a proteínas o en un gel
sin separar el gel en bandas; liberar una combinación de glucanos de
las glucoproteínas totales inmovilizadas de la muestra a partir del
gel o de la membrana de unión a proteínas sin haber purificado una
glucoproteína específica y sin exponer la muestra a hidrazinolisis;
medir un perfil de glucosilación de la combinación de glucanos; y
determinar un estado clínico del sujeto a partir de un nivel de un
marcador de glucosilación de enfermedad en el perfil de
glucosilación. En algunas realizaciones, el marcador de
glucosilación puede ser, por ejemplo, un marcador de glucosilación
determinado por el método para determinar uno o más marcadores de
glucosilación para una enfermedad. La medición del perfil de
glucosilación puede realizarse por cualquier técnica adecuada, es
decir, no necesariamente mediante la técnica usada para determinar
el uno o más marcadores de glucosilación de la enfermedad. Por
ejemplo, la medición del perfil de glucosilación puede realizarse
mediante electroforesis capilar o cromatografía con lectina.
Los métodos de la presente invención pueden
dirigirse a cualquier enfermedad asociada con cambios de
glucosilación, tales como enfermedades autoinmunes, trastornos
congénitos de la glucosilación o cánceres. La enfermedad autoinmune
puede ser, por ejemplo, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis
crónica juvenil, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjogren,
espondilitis anquilosante, artritis psoriásica, esclerosis múltiple,
enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de injerto frente
a huésped y esclerodermia. El cáncer puede ser, por ejemplo, cáncer
de próstata, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer de vejiga,
cáncer renal, cáncer de colon, cáncer de ovario, carcinoma
hepatocelular, cáncer de estómago o cáncer pulmonar. La metodología
de la presente invención en lo que se refiere a la artritis
reumatoide y otras enfermedades autoinmunes se describe en la
solicitud de patente provisional de Estados Unidos "High
throughput glycan analysis for diagnosing and monitoring rheumatoid
arthritis and other autoimmune diseases" para Dwek et al.
La metodología de la presente invención en lo que se refiere al
cáncer se describe en la solicitud provisional de los Estados Unidos
para Dwek et. al., "Glycosilation markers for cancer
diagnostics and monitoring".
El "sujeto" de las realizaciones anteriores
es un animal, más preferiblemente un mamífero y, más preferiblemente
un ser humano.
Pueden liberarse glucanos a partir de una
muestra de un fluido corporal o un tejido corporal, tal como una
muestra de suero completo, plasma sanguíneo, orina, líquido seminal,
plasma seminal, heces o saliva. Los glucanos liberados pueden ser
N-glucanos u O-glucanos. La
liberación de una combinación de glucanos de glucoproteínas de una
muestra de un fluido corporal o un tejido corporal se realiza sin
haber purificado las glucoproteínas. En otras palabras, los
glucanos liberados son glucanos de todas o sustancialmente todas las
glucoproteínas presentes en la muestra de un fluido corporal o un
tejido corporal más que de una o más glucoproteínas purificadas y
aisladas. En algunas realizaciones, sustancialmente todas las
glucoproteínas puede significar que se recuperan todas las
glucoproteínas, aunque en algunas realizaciones sustancialmente
todas las glucoproteínas puede significar todas las glucoproteínas
excepto las que se eliminan específicamente. La liberación de
glucanos puede realizarse sin exponer una muestra de un fluido
corporal o un tejido corporal a hidrazinolisis. En algunas
realizaciones, la liberación de glucanos puede realizarse a partir
de una muestra muy pequeña de un fluido corporal. En algunas
realizaciones, las muestras de un fluido corporal pueden ser menores
de 100 microlitros, más preferiblemente menores de 50 microlitros,
aún más preferiblemente menores de 20 microlitros, aún más
preferibemente menores de 10 microlitros, aún más preferiblemente
menores de 5 microlitros. Los presentes métodos de liberación pueden
optimizarse para trabajar con muestras de fluido corporal de menos
de 1 microlitro.
La liberación de glucanos comprende inmovilizar
las glucoproteínas totales de un fluido corporal o un tejido
corporal sobre una membrana de unión a proteínas o en un gel sin
separar el gel en bandas. La membrana de unión a proteínas puede
ser cualquier membrana de unión a proteínas, por ejemplo, una
membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF), membrana de nylon o
membrana de politetrafluoroetileno (PTFE). La liberación de
glucanos comprende además liberar glucanos de las glucoproteínas
totales inmovilizadas en la membrana de unión a proteínas o en el
gel. Cuando los glucanos liberados son glucanos unidos a N,
la liberación de glucanos de las glucoproteínas inmovilizadas puede
realizarse usando liberación enzimática con, por ejemplo, péptido N
glicosidasa F. La liberación de glucanos del gel se realiza a partir
del gel total, es decir, sin separar el gel en las bandas. En
algunas realizaciones, la liberación de glucanos se realiza por
métodos de liberación química, tales como
\beta-eliminación o
\beta-eliminación basada en amoniaco, que pueden
usarse para liberar glucanos unidos a N o unidos a O
de glucoproteínas inmovilizadas sobre una membrana de unión a
proteínas. Para usar los métodos de esta invención en un formato de
alto rendimiento, una combinación de glucanos se libera de las
glucoproteínas totales inmovilizadas en un gel en una membrana de
unión a proteínas ya que puede permitir el uso de muestras más
pequeñas de fluido corporal o tejido corporal.
Los detalles de algunos de los métodos de
liberación y su aplicabilidad tanto a glucanos unidos a N como a
glucanos unidos a O se analizan a continuación, sin embargo, debería
entenderse que la presente invención no se limita a los métodos de
liberación analizados a continuación.
En bloque de gel: Para evitar los
problemas con la limpieza de muestras después de la liberación
enzimática de glucanos en fase de solución puede usarse una
liberación en bloque de gel a partir de mezclas de proteínas. En
resumen, la mezcla de proteínas completa (por ejemplo, suero o
plasma) puede reducirse y alquilarse por adición de 4 \mul de
tampón de muestras 5X (tampón de muestras 5X: 0,625 ml de Tris 0,5 M
(6 g para 100 ml) ajustado a pH 6,6 con HCl, 1 ml de SDS al 10%,
0,5 ml de glicerol en 2,875 ml de agua), 2 \mul de ditiotreitol
0,5 M (DTT) y agua hasta completar 20 \mul en total, incubarse a
70ºC durante 10 min, después alquilarse por adición de 2 \mul de
yodoacetamida 100 mM e incubarse durante 30 min en la oscuridad a
temperatura ambiente, y después ponerse en una mezcla de
SDS-gel al 15%. Puede usarse un volumen total de gel
de 185 \mul (inicialmente colocado en una placa de 48 pocillos,
después retirado para cortarlo) con 300 \mul de 100 U/ml de
PNGasaF.
Este gel puede lavarse como alternativa con 1 ml
de acetonitrilo, después con 1ml de tampón de digestión (NaHCO_{3}
20 mM, pH 7), que puede repetirse dos veces antes de que pueda
secarse entonces el tapón de gel.
La PNGasaF y los fragmentos de gel pueden
incubarse durante una noche a 37ºC. El sobrenadante puede
recuperarse junto con 3 x lavados de agua de 200 \mul (con
sonicación de los fragmentos de gel durante 30 min cada uno)
seguidos de un lavado con acetonitrilo (para extraer el gel), otro
lavado con agua y un lavado final con acetonitrilo. Las muestras
pueden desalinizarse usando, por ejemplo, 50 \mul de
AG-50(H^{+}) activado, filtrarse a través
de un filtro de LH Millipore de 0,45 \mum y secarse para marcaje
fluorescente. Este procedimiento puede ser más adecuado para la
liberación automática de glucanos que la liberación con PNGasaF en
solución y puede ser el método preferido para el análisis de
glucanos de alto rendimiento. Este sistema puede modificarse además
fácilmente para trabajar con cantidades más pequeñas de gel
colocadas en una placa de 96 pocillos.
Las glucoproteínas en muestras de suero
reducidas y desnaturalizadas pueden unirse a una membrana de PVDF
hidrófoba en una placa de 96 pocillos por filtración simple.
Después, las muestras pueden lavarse para eliminar contaminantes,
incubarse con PNGasaF para liberar los glucanos basándose en los
métodos descritos en Papac, D. I., et. al. Glycobiology 8:
445-54, 1998, y en Callewaert, N., et. al.
Electrophoresis 25: 3128-31, 2004.
Después, los N-glucanos pueden eliminarse
por lavado de la proteína unida, recogerse y secarse, listos para
el marcaje fluorescente. Los N-glucanos pueden
liberarse in situ de las glucoproteínas por incubación con
PNGasaF y por medios químicos.
A diferencia de las ventajas que proporciona la
liberación enzimática de N-glucanos al análisis de
N-glucanos, actualmente existe una metodología no
enzimática para la liberación de O-glucanos
estructuralmente intactos. La liberación química por
\beta-eliminación reductora puede requerir la
reducción concomitante de los oligosacáridos liberados a sus
derivados alditol (Amano, J. et. al. Methods Enzymol 179:
261-70, 1989) para evitar la degradación
(desprendimiento). Esta destrucción impide el uso de cualquier
marcaje post-liberación de modo que la detección se
limita a espectrometría de masas, detección amperométrica pulsada
y/o radiactividad.
Puede usarse la
\beta-eliminación basada en amoniaco para
liberar tanto N- como O-glucanos mediante una
modificación de la \beta-eliminación clásica
(Huang, Y. et. al. Analytical Chemistry 73:
6063-6069, 2001) que puede aplicarse a
glucoproteínas en membranas de PVDF. Puede realizarse la
\beta-eliminación basada en amoniaco a partir de
membranas de PVDF. Esta estrategia puede optimizarse para alto
rendimiento y puede proporcionar una estrategia poderosa para
liberar tanto N- como O-glucanos en sus proporciones
molares correctas y en una forma de anillo abierto adecuada para el
marcaje post-liberación.
Muestras de glucoproteína, mezclas de
glucoproteínas, suero completo u otros fluidos corporales se reducen
y alquilan por adición de 4 \mul de tampón de muestras 5X (tampón
de muestras 5X: 0,625 ml de Tris 0,5M (6g para 100 ml) ajustado a
pH 6,6 con HCl, 1 ml de SDS al 10%, 0,5 ml de glicerol, en 2,875 ml
de agua), 2 \mul de ditiotreitol 0,5 M (DTT) y agua hasta
completar 20 \mul en total, se incuban a 70ºC durante 10 min,
después se alquilan por adición de 2 \mul de yodoacetamida 100 mM
y se incuban durante 30 min en la oscuridad a temperatura ambiente.
Membranas de PVDF de unión a proteínas (Durapore 13 mm x 0,45 \mum
HVHP, Millipore) en portafiltros Swinnex (Millipore) se lavan
previamente con 2 x 2,5 ml de agua usando una jeringa de 2,5 ml
enteramente de polipropileno (Sigma), seguida de una jeringa llena
de aire para eliminar la mayor parte del líquido de la membrana. La
muestra reducida y alquilada se aplica después directamente a la
membrana y se deja que se una durante 5 min antes de lavar por
introducción de 2 x 2,5 ml de agua lentamente con una jeringa,
seguido de una jeringa llena de airea para eliminar la mayor parte
del líquido de la membrana. El filtro con las muestras de
glucoproteína unidas se retira cuidadosamente del portafiltros y se
coloca en un tubo de polipropileno con tampón de rosca de 1,5 ml
con un tapón de PTFE moldeado. Se añade al tubo 1 ml de hidróxido
de amonio acuoso al 29,2% saturado con carbonato de amonio más 100
mg de carbonato de amonio. Esto se incuba durante 40 horas a 60ºC,
después se enfría en el frigorífico. Después se transfiere el
líquido a un tubo limpio y se evapora hasta sequedad. Los glucanos
liberados se vuelven a disolver en agua y se vuelven a secar hasta
que se eliminan la mayoría de las sales. Se añaden 100 \mul de
ácido bórico 0,5 M a los glucanos y se incuban a 37ºC durante 30
min. Después, los glucanos se secan al vacío, se añade 1 ml de
metanol, se vuelven a secar, se añade 1 ml adicional de metanol y
se vuelven a secar para eliminar el ácido bórico.
En algunas realizaciones, tras la liberación,
los glucanos pueden marcarse, por ejemplo, con un marcador
fluorescente o un marcador radiactivo. El marcador fluorescente
puede ser, por ejemplo, 2-aminopiridina
(2-AP), 2-aminobenzamida
(2-AB), ácido 2-aminoantranílico
(2-AA), 2-aminoacridona (AMAC) o
ácido
8-aminonaftaleno-1,3,6-trisulfónico
(ANTS). Se describe el marcaje de glucanos con marcadores
fluorescentes, por ejemplo, por Bigge, J. C., et. al.
"Nonselective and efficient fluorescent labeling of glycans using
2-amino benzamide and anthranilic acid". Anal
Biochem 230: 229-38, 1995, y Anumula, K. R. (2000).
High-sensitivity and high-resolution
methods for glycoprotein analysis. Analytical Biochemistry 283:
17-26. Los marcadores fluorescentes pueden marcar
todos los glucanos eficazmente y de forma no selectiva y pueden
permitir la detección y cuantificación de glucanos en el intervalo
sub-picomolar. La elección de marcador fluorescente
depende de la técnica de separación usada. Por ejemplo, se requiere
específicamente un marcador cargado para la electroforesis capilar.
En particular, puede preferirse un marcador 2-AB
para procesos y análisis cromatográficos, enzimáticos y de
espectroscopía de masas, mientras que pueden preferirse un marcador
2-AA para análisis electroforéticos. También pueden
detectarse glucanos sin marcar, por ejemplo, mediante
espectrometría de masas, sin embargo el marcaje fluorescente puede
ayudar a la ionización de glucanos, véase, por ejemplo, Harvey, D.
J. (1999). "Matrix-assisted laser
desorption/ionization mass spectrometry of carbohydrates". Mass
Spectrom Rev 18: 349-450; Harvey, D. J. (2000).
Electrospray mass spectrometry and fragmentation of
N-linked carbohydrates derivatized at the reducing
terminus. J Am Soc Mass Spectrom 11: 900-915.
El perfil de glucosilación de los glucanos se
refiere a una presentación de estructuras de glucanos particulares
en la combinación de glucanos. Por ejemplo, cuando se mide por HPLC,
un perfil de glucosilación puede ser un cromatograma que comprenda
una pluralidad de picos que se corresponden con estructuras de
glucanos en la combinación de glucanos. Cuando se mide por
espectrometría de masas, un perfil de glucosilación puede ser un
espectro de masas que comprende una pluralidad de patrones de
fragmentación que se corresponden con estructuras de glucanos en la
combinación de glucanos. La medición del perfil de glucosilación de
los glucanos se puede realizarse mediante una técnica analítica
cuantitativa, tal como cromatografía, espectrometría de masas,
electroforesis o una combinación de las mismas. En particular, la
técnica cromatográfica puede ser cromatografía de intercambio
aniónico de alto rendimiento (HPAEC), cromatografía de intercambio
iónico débil (WAX), cromatografía de exlusión molecular (GPC),
cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), cromatografía
líquida de alto rendimiento de fase normal
(NP-HPLC), HPLC de fase inversa
(RP-HPLC) o HPLC de carbono de grafito poroso
(PGC-HPLC). La técnica de espectrometría de masas
puede ser, por ejemplo, espectrometría de masas de
desorción/ionización mediante láser asistida por matriz en tiempo
de vuelo (MALDI-TOF-MS),
espectrometría de masas de ionización por electropulverización en
tiempo de vuelo (ESI-TOF-MS),
espectrometría de masas iónica positiva o negativa o cromatografía
líquida-espectrometría de masas
(LC-MS). La técnica electroforética puede ser, por
ejemplo, electroforesis en gel o electroforesis capilar. El uso de
estas técnicas analíticas cuantitativas para el análisis de
glucanos se describe, por ejemplo, en las siguientes
publicaciones:
- 1)
- Guile, G. R., Wong, S. Y. y Dwek, R. A. (1994). "Analytical and preparative separation of anionic oligo-saccharides by weak anion-exchange high-performance liquid chromatography on an inert polymer column". Analytical Biochemistry 222: 231-5 para HPLC;
- 2)
- Butler, M., Quelhas, D., Critchley, A. J., Carchon, H., Hebestreit, H. F., Hibbert, R. G., Vilarinho, L., Teles, E., Matthijs, G., Schollen, E., Argibay, P., Harvey, D. J., Dwek, R. A., Jaeken, J. y Rudd, P. M. (2003). "Detailed glycan analysis of serum glycoproteins of patients with congenital disorders of glycosylation indicates the specific defective glycan processing step and provides an insight into pathogenesis". Glycobiology 13: 601-22, para MALDI-MS, NP-HPLC y ESI-cromatografía líquida/MS;
- 3)
- Jackson, P., Pluskal, M. G. y Skea, W. (1994). "The use of polyacrylamide gel electrophoresis for the analysis of acidic glycans labeled with the fluorophore 2-aminoacridone". Electrophoresis 15: 896-902, para electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE);
- 4)
- Hardy, M. R. y Townsend, R. R. (1994). "High-pH anion-exchange chromatography of glycoprotein-derived carbohydrates". Methods Enzymol 230: 208-25., para HPAEC usando detección amperométrica pulsada (PAD);
- 5)
- Callewaert, N., Contreras, R., Mitnik-Gankin, L., Carey, L., Matsudaira, P. y Ehrlich, D. (2004). "Total serum protein N-glycome profiling on a capillary electrophoresis-microfluidics platform". Electro- phoresis 25: 3128-31 para electroforesis capilar;
- 6)
- Guile, G. R., Rudd, P. M., Wing, D. R., Prime, S. B. y Dwek, R. A. (1996). "A rapid high-resolution high-performance liquid chromatographic method for separating glycan mixtures and analyzing oligosaccharide profiles". Anal Biochem 240: 210-26, para HPLC;
- 7)
- Caesar, J. P., Jr., Sheeley, D. M. and Reinhold, V. N. (1990). "Femtomole oligosaccharide detection using a reducing-end derivative and chemical ionization mass spectrometry". Anal Biochem 191: 247-52, para LC-MS;
- 8)
- Mattu, T. S., Royle, L., Langridge, J., Wormald, M. R., Van den Steen, P.E., Van Damme, J., Opdenakker, G., Harvey, D. J., Dwek, R. A. y Rudd, P. M. (2000). "O-glycan analysis of natural human neutrophil gelatinase B using a combination of normal phase-HPLC and online tandem mass spectrometry: implications for the domain organization of the enzyme". Biochemistry 39: 15695-704, para NP-HPLC y MS;
- 9)
- Royle, L., Mattu, T. S., Hart, E., Langridge, J. I., Merry, A. H., Murphy, N., Harvey, D. J., Dwek, R. A. y Rudd, P. M. (2002). "An analytical and structural database provides a strategy for sequencing O-glycans from microgram quantities of glycoproteins". Anal Biochem 304: 70-90, para NP-HPLC y MS;
- 10)
- Anumula, K. R. y Du, P. (1999). "Characterization of carbohydrates using highly fluorescent 2-aminobenzoic acid tag following gel electrophoresis of glycoproteins". Anal Biochem 275: 236-42, para electroforesis en gel;
- 11)
- Huang, Y. y Mechref, Y. (2001). "Microscale nonreductive release of O-linked glycans for subsequent analysis through MALDI mass spectrometry and capillary electrophoresis". Analytical Chemistry 73: 6063-6069, para una combinación de MALDI-MS y electroforesis capilar;
- 12)
- Burlingame, A. L. (1996). "Characterization of protein glycosylation by mass spectrometry". Curr Opin Biotechnol 7: 4-10, para espectrometría de masas;
- 13)
- Costello, C. E. (1999). "Bioanalytic applications of mass spectrometry". Curr Opin Biotechnol 10: 22-8, para espectrometría de masas;
- 14)
- Davies, M. J. y Hounsell, E. F. (1996). "Comparison of separation modes of high-performance liquid chromatography for the analysis of glycoprotein- and proteoglycan-derived oligosaccharides". J Chromatogr A 720: 227-33, para HPLC;
- 15)
- El Rassi, Z. (1999). "Recent developments in capillary electrophoresis and capillary electrochromatography of carbohydrate species". Electrophoresis 20: 3134-44, para electroforesis capilar y electrocromatografía capilar;
- 16)
- Kuster, B., Wheeler, S. F., Hunter, A. P., Dwek, R. A. y Harvey, D. J. (1997). "Sequencing of N-linked oligosaccharides directly from protein gels: in-gel deglycosylation followed by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and normal-phase high-performance liquid chromatography". Anal-Biochem 250: 82-101, para NP-HPLC y MALDI-MS;
- 17)
- Reinhold, V. N., Reinhold, B. B. y Chan, S. (1996). "Carbohydrate sequence analysis by electrospray ionization-mass spectrometry". Methods Enzymol 271: 377-402, para ESI-MS;
- 18)
- Mattu, T. S., Pleass, R. J., Willis, A. C., Kilian, M., Wormald, M. R., Lellouch, A. C., Rudd, P. M., Woof, J. M. y Dwek, R. A. (1998). "The glycosylation and structure of human serum IgA1, Fab, and Fc regions and the role of N-glycosylation on Fc alpha receptor interactions". Journal of Biological Chemistry 273: 2260-72, para WAX y NP-HPLC;
- 19)
- Callewaert, N., Schollen, E., Vanhecke, A., Jaeken, J., Matthijs, G., y Contreras, R. (2003). Increased fucosylation and reduced branching of serum glycoprotein N-glycans in all known subtypes of congenital disorder of glycosylation I. Glycobiology 13: 367-375;
- 20)
- Block, T. M. Comunale, M. A., Lowman, M., Steel, L. F., Romano, P. R. Fimmel, C., Tennant, B. C. London, A. A. Evans, B. S. Blumberg, R. A. Dwek, T. S. Mattu y A. S. Mehta, "Use of targeted glycoproteomics to identify serum glycoproteins that correlate with liver cancer in woodchucks and humans". PNAS USA (2005) 102, 779-784;
- 21)
- D. J. Harvey, Fragmentation of negative ions from carbohydrates: Part 1; Use of nitrate and other anionic adducts for the production of negative ion electrospray spectra from N-linked carbohydrates, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2005, 16, 622-630;
- 22)
- D. J. Harvey, Fragmentation of negative ions from carbohydrates: Part 2, Fragmentation of high-mannose N-linked glycans, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2005, 16, 631-646;
- 23)
- D. J. Harvey, Fragmentation of negative ions from carbohydrates: Part 3, Fragmentation of hybrid and complex N-linked glycans, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2005, 16, 647-659.
Aunque pueden usarse muchas técnicas para medir
el perfil de glucosilación, en el método de determinación de uno o
más marcadores de glucosilación de enfermedad puede preferirse medir
los perfiles de glucosilación mediante cromatografía líquida de
alto rendimiento (HPLC) en solitario o en combinación con
espectrometría de masas. Por ejemplo, puede realizarse la medición
de los perfiles de glucosilación por electroforesis en gel (véase
Jackson, P., Pluskal, M. G. y Skea, W. (1994). "The use of
polyacrylamide gel electrophoresis for the analysis of acidic
glycans labeled with the fluorophore
2-aminoacridone". Electrophoresis 15:
896-902); HPAEC usando detección amperométrica
pulsada (PAD) (Townsend, R. R., Hardy, M. R., Hindsgaul, O. y Lee,
Y. C. (1988). "High- performance anion-exchange
chromatography of oligosaccharides using pellicular resins and
pulsed amperometric detection". Anal Biochem 174:
459-70; y Hardy, M. R. y Townsend, R. R. (1994).
"High-pH anion-exchange
chromatography of glycoprotein-derived
carbohydrates". Methods Enzymol 230: 208-25); o
electroforesis capilar (véase El Rassi, Z. (1999). "Recent
developments in capillary electrophoresis and capillary
electrochromatography of carbohydrate species". Electrophoresis
20: 3134-44), sin embargo, estas técnicas no están
idealmente adaptadas a la automatización a gran escala ni
proporcionan un análisis estructural cuantitativo completo. En
general, tienen escasos límites de detección, baja reproducibilidad
y están limitadas por la dificultad intrínseca de obtener una
caracterización estructural completa de los oligosacáridos y la
ausencia de predictibilidad que es necesaria para permitir que se
realicen asignaciones preliminares a las nuevas estructuras.
La medición de perfiles de glucosilación de
glucanos marcados fluorescentemente (por ejemplo, glucanos marcados
con 2AB) mediante HPLC puede permitir una cuantificación y una
asignación estructural precisas de las estructuras de glucanos en
la combinación de glucanos por integración de los picos en el
cromatograma. Para un perfil de glucosilación medido por HPLC, las
estructuras de glucanos presentes en la combinación de glucanos
analizada se separan basándose en su tiempo de elución. Para la
NP-HPLC, los tiempos de elución pueden convertirse
en unidades de glucosa por comparación con un marcador de
hidrolizado de dextrano patrón. El perfil de glucosilación medido
por HPLC puede localizar todas las estructuras de glucanos presentes
en una combinación de glucanos en proporciones molares correctas.
Los grupos funcionales polares de la fase estacionaria de la HPLC
pueden interaccionar con los grupos hidroxilo de los glucanos de
una forma que sea reproducible para un monosacárido particular
unido de una forma específica. Por ejemplo, la contribución de la
adición de fucosa en la ramificación externa es mucho mayor que la
adición de un resto de fucosa de núcleo; un resto de fucosa de
núcleo siempre contribuye en 0,5 unidades de glucosa (gu) a la
posición de elución global. Los valores graduales característicos
con diferentes adiciones de monosacáridos pueden permitir la
asignación preliminar de una estructura predicha para un pico
particular presente en el perfil de glucosilación. Esta estructura
puede confirmarse después por digestión con series de
exoglucosidasas y/o espectrometría de masas. Otras técnicas, tales
como la electroforesis capilar no son tan predecibles como la
NP-HPLC. Aunque los tiempos de migración de la CE
pueden calibrarse con patrones, los tiempos de migración de
estructuras desconocidas no pueden predecirse fácilmente. También
puede preferirse la medición de perfiles de glucosilación mediante
NP-HPLC por la siguiente razón. La digestión de una
combinación de glucanos con una o más exoglucosidasas elimina restos
monosacáridos y, por lo tanto, disminuye los tiempos de retención o
valores de gu asociados en el perfil de glucosilación medido por
NP-HPLC. En algunas realizaciones esto puede
permitir la segregación de los picos que estén asociados con uno o
más marcadores de glucosilación por desplazamiento de los picos que
no están relacionados con los cambios de glucosilación fuera de la
región medida del perfil de glucosilación.
En algunas realizaciones, la medición de
perfiles de glucosilación puede realizarse usando cromatografía
líquida de alto rendimiento de fase inversa. Para perfiles de
glucosilación medidos por RP-HPLC, los tiempos de
elución pueden convertirse en unidades de arabinosa usando un
marcador de arabinosa patrón. El uso de RP-HPLC para
medir perfiles de glucosilación se describe, por ejemplo, en Guile,
G. R., Harvey, D. J., O'Donnell, N., Powell, A. K., Hunter, A. P.,
Zamze, S., Fernandes, D. L., Dwek, R. A., y Wing, D. R. (1998).
"Identification of highly fucosylated N-linked
oligosaccharides from the human parotid gland. European Journal of
Biochemistry" 258: 623-656; Royle, L., Mattu, T.
S., Hart, E., Langridge, J. I., Merry, A. H., Murphy, N., Harvey, D.
J., Dwek, R. A., y Rudd, P. M. (2002). An analytical and structural
database provides a strategy for sequencing
o-glycans from microgram quantities of
glycoproteins. Analytical Biochemistry 304: 70-90.
Pueden usarse perfiles de glucosilación medidos por
RP-HPLC para complementar los perfiles de
glucosilación medidos por NP-HPLC. Por ejemplo, la
RP-HPLC puede separar estructuras de glucanos
bisecados de estructuras de glucanos que no comprenden un resto
N-acetilglucosamina de bisección. En perfiles de
glucosilación medidos por NP-HPLC estas estructuras
pueden estar demasiado próximas para resolverse. En algunas
realizaciones, la medición de perfiles de glucosilación por
RP-HPLC puede comprender el uso de uno o más
tampones. La fase móvil puede ser, por ejemplo, para mejorar la
reproducibilidad de la medición. El tampón puede ser, por ejemplo,
disolvente A: 50 mM de formiato de amonio ajustado a pH 5 con
trietilamina y disolvente B: disolvente A y acetonitrilo mezclados
50/50.
En algunas realizaciones, puede usarse HPLC como
un método preparativo para recoger glucanos, es decir, puede usarse
HPLC para aislar glucanos poco habituales para un análisis
adicional, por ejemplo, mediante espectrometría de masas, así como
para obtener parámetros para una base de datos de glucanos.
En algunas realizaciones, cada uno de los
perfiles de glucosilación puede presentarse como una pluralidad de
picos que se corresponden con estructuras de glucanos en los
glucanos. En el método de determinación de uno o más marcadores de
glucosilación, una proporción de picos se refiere a una proporción
entre uno cualquiera o más picos y cualquier otro o más picos
dentro del mismo perfil de glucosilación. En el método de
determinación de un marcador de glucosilación, la comparación de
proporciones de picos puede significar comparar las intensidades de
picos o comparar las áreas integradas bajo los picos. En algunas
realizaciones del método de determinación de un marcador de
glucosilación, la comparación de proporciones de picos puede
realizarse para glucanos de las muestras de enfermo y de control
que no se digirieron con una o más exoglucosidasas. En algunas
realizaciones, la comparación de proporciones de picos puede
realizarse en los glucanos que se digirieron con una o más
exoglucosidasas. En algunas realizaciones, la comparación de
proporciones de picos puede realizarse para los glucanos que no se
digirieron con exoglucosidasa y para los glucanos digeridos con una
o más exoglucosidasas.
En algunas realizaciones, la medición de
perfiles de glucosilación con HPLC puede complementarse con una
medición de espectrometría de masas. Los datos de espectrometría de
masas complementarios, tales como MALDI, ESI o LC/MS, pueden
servir, por ejemplo, para la validación de perfiles de glucosilación
medidos por HPLC como una técnica ortogonal separada capaz de
resolver las estructuras de glucanos más complejos cuando está
disponible una cantidad suficiente de muestra de un fluido corporal
o tejido corporal. La espectrometría de masas usada en combinación
con HPLC puede ser una herramienta poderosa para el análisis
estructural de glucoproteínas. La espectrometría de masas en
solitario puede usarse para el análisis estructural de glucanos
proporcionando la composición de monosacáridos de glucanos. Sin
embargo, la espectrometría de masas usada por sí misma no distingue
monosacáridos isobáricos (y por lo tanto oligosacáridos o glucanos)
y no proporciona la información sobre enlaces de monosacáridos en
glucanos. Las técnicas de LC-MS/(MS) pueden
proporcionar los datos más informativos de la técnica de
espectrometría de masas, veáse Caesar, J. P., Jr., Sheeley, D. M. y
Reinhold, V. N. (1990). "Femtomole oligosaccharide detection
using a reducing-end derivative and chemical
ionization mass spectrometry". Anal Biochem 191:
247-52; Mattu, T. S., Pleass, R. J., Willis, A. C.,
Kilian, M., Wormald, M. R., Lellouch, A. C., Rudd, P. M., Woof, J.
M. and Dwek, R. A. (1998). "The glycosylation and structure of
human serum IgA1, Fab, and Fc regions and the role of
N-glycosylation on Fc alpha receptor
interactions". Journal of Biological Chemistry 273:
2260-72; y Royle, L., Mattu, T. S., Hart, E.,
Langridge, J. I., Merry, A. H., Murphy, N., Harvey, D. J., Dwek, R.
A. and Rudd, P. M. (2002). "An analytical and structural database
provides a strategy for sequencing O-glycans from
microgram quantities of glycoproteins". Anal Biochem 304:
70-90. En algunas realizaciones, la medición de
perfiles de glucosilación por LC/MS puede comprender el uso de la
fase de LC de la LC/MS no sólo para la limpieza y separación
preliminar de glucanos antes de que entren en la fase MS de la
LC/MS, sino para obtener una asignación preliminar de estructuras
de glucanos en los glucanos. Esto puede conseguirse, por ejemplo,
mediante el uso de una matriz de NP-HPLC, por
ejemplo NP-HPLC con matriz de TSK gel amide 80 en
la columna de LC de la LC/MS. En la NP-HPLC con
matriz de TSK gel amide 80, los grupos hidroxilo de glucanos
interaccionan con la funcionalidad amida, por lo tanto el orden de
elución se determina por el número de grupos hidroxilo en un
glucano particular, su confirmación molecular y su solubilidad
relativa en la fase móvil. Como estrategia de primera línea,
especialmente cuando las cantidades de fluido corporal o tejido
corporal son limitadas, la espectrometría de masas puede no ser
suficiente por sí misma para una caracterización cuantitativa
precisa y la asignación estructural completa incluyendo enlaces y
secuencia de monosacáridos de estructuras de glucano en la
combinación de glucanos.
En algunas realizaciones de la invención, cuando
la combinación de glucanos comprende glucanos cargados, la
combinación de glucanos puede fraccionarse en varias alícuotas
basándose en la carga. El fraccionamiento de la combinación de
glucanos puede realizarse, por ejemplo, mediante cromatografía de
intercambio iónico débil (WAX). Cada alícuota de WAX puede
analizarse después de forma independiente mediante
NP-HPLC combinada con digestiones con
exoglucosidasa. La medición de perfiles de glucosilación por WAX
HPLC se describe, por ejemplo, en Guile, G. R., Wong, S. Y. y Dwek,
R. A. (1994). "Analytical and preparative separation of anionic
oligosaccharides by weak anion-exchange
high-performance liquid chromatography on an inert
polymer column". Analytical Biochemistry 222:
231-5.
La medición del perfil de glucosilación de los
glucanos con los métodos descritos anteriormente puede permitir
detectar una estructura de glucano particular presente en los
glucanos a niveles de sub-picomoles. Por
consiguiente, en algunas de las realizaciones, la medición de los
perfiles de glucosilación de los glucanos se realiza usando una
técnica capaz de detectar una estructura de glucano presente en los
glucanos en una cantidad de 1 picomol, preferiblemente de 0,1
picomol, o más preferiblemente de 0,01 picomol.
En algunas realizaciones, los glucanos liberados
pueden someterse a digestión enzimática adicional con una o más
enzimas. La digestión enzimática puede realizarse usando cualquier
enzima adecuada, tal como glucosidasas. Los ejemplos de
glucosidasas adecuadas incluyen, pero sin limitación,
N-glucosidasa F (PNGase F), sialidasa,
\beta-galactosidasa, fucosidasa
\alpha1-6,2>>3,4,
\alpha1-3,4, \alpha1-2
fucosidasa, alfa-amilasa,
beta-amilasa, glucano
1,4-alfa-glucosidasa, celulasa,
endo-1,3(4)-beta-glucanasa,
inulinasa,
endo-1,4-beta-xilanasa,
oligosacárido alfa-1,6-glucosidasa,
dextranasa, quitinasa, poligalacturonasa, lisozima,
exo-alfa-sialidasa,
alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa,
alfa-galactosidasa,
beta-galactosidasa, alfa-manosidasa,
beta-manosidasa,
beta-fructofuranosidasa,
alfa,alfa-trehalasa,
beta-glucuronidasa, xilano
endo-1,3-beta-xilosidasa,
amilo-alfa-1,6-glucosidasa,
hialuronoglucosaminidasa, hialuronoglucuronidasa, xilano
1,4-beta-xilosidasa,
beta-D-fucosidasa, glucano
endo-1,3-beta-D-glucosidasa,
alfa-L-ramnosidasa, pululanasa,
GDP-glucosidasa,
beta-L-ramnosidasa, fucoidanasa,
glucosilceramidasa, galactosilceramidasa,
galactosilgalactosilglucosilceramidasa, sacarosa
alfa-glucosidasa,
alfa-N-acetilgalactosaminidasa,
alfa-N-acetilglucosaminidasa,
alfa-L-fucosidasa,
beta-N-acetilhexosaminidasa,
beta-N-acetilgalactosaminidasa,
ciclomaltodextrinasa,
alfa-L-arabinofuranosidasa,
glucuronosil-disulfoglucosamina glucuronidasa,
isopululanasa, glucano
1,3-beta-glucosidasa, glucano
endo-1,3-alfa-glucosidasa,
glucano
1,4-alfa-maltotetrahidrolasa,
micodextranasa, glucosilceramidasa,
1,2-alfa-L-fucosidasa,
2,6-beta-fructano
6-levanbiohidrolasa, levanasa, quercitrinasa,
galacturano
1,4-alfa-galacturonidasa,
isoamilasa, glucano
1,6-alfa-glucosidasa, glucano
endo-1,beta-glucosidasa, xilano
1,3-beta-xilosidasa, liqueninasa,
glucano 1,4-beta-glucosidasa,
glucano
endo-1,6-beta-glucosidasa,
L-iduronidasa, manano
1,2-(1,3)-alfa-manosidasa, manano
endo-1,4-beta-manosidasa,
fructano beta-fructosidasa, agarasa,
exo-poli-alfa-galacturonosidasa,
kappa-carragenasa, glucano
1,3-alfa-glucosidasa,
6-fosfo-beta-galactosidasa,
6-fosfo-beta-glucosidasa,
endo-1,3-alfa- galactosidasa de
polisacárido capsular,
beta-L-arabinosidasa,
arabinogalactano
endo-1,4-beta-galactosidasa,
celulosa 1,4-beta-celobiosidasa,
peptidoglucano
beta-N-acetilmuramidasa,
alfa,alfa-fosfotrehalasa, glucano
1,6-alfa-isomaltosidasa, dextrano
1,6-alfa-isomaltotriosidasa,
manosil-glucoproteína
endo-beta-N-acetilglucosamidasa,
glucopéptido
alfa-N-acetilgalactosaminidasa,
glucano 1,4-alfa-maltohexaosidasa,
arabinano
endo-1,5-alfa-L-arabinosidasa,
manano 1,4-beta-manobiosidasa,
manano
endo-1,6-beta-manosidasa,
endo-1,4-beta-galactosidasa
de sustancia de grupo sanguíneo, queratán-sulfato
endo-1,4-beta-galactosidasa,
esteril-beta-glucosidasa,
estrictosidina beta-glucosidasa,
manosil-oligosacárido glucosidasa, proteína
glucosilgalactosilhidroxilisina-glucosidasa,
lactasa, endogalactosaminidasa, mucinaminilserina mucinaminidasa,
1,3-alfa-L-fucosidasa,
2-desoxiglucosidasa,
manosil-oligosacárido
1,2-alfa-manosidasa,
manosil-oligosacárido
1,3-1,6-alfa-manosidasa,
exo-1,2-alfa-glucosidasa
de dextrano ramificado, glucano
1,4-alfa-maltotriohidrolasa,
amigdalina beta-glucosidasa, prunasina
beta-glucosidasa, vicianina
beta-glucosidasa, oligoxiloglucano
beta-glucosidasa, polimanuronato hidrolasa,
maltosa-6'-fosfato glucosidasa,
endoglucosilceramidasa,
3-desoxi-2-octulosonidasa,
raucafricina beta-glucosidasa, coniferina
beta-glucosidasa,
1,6-alfa-L-fucosidasa,
glucirricinato beta-glucuronidasa,
endo-alfa-sialidasa, glucoproteína
endo-alfa-1,2-manosidasa,
xilano alfa-1,2-glucuronosidasa,
quitosanasa, glucano
1,4-alfa-maltohidrolasa,
difructosa-anhídrido sintasa, neopululanasa,
glucuronoarabinoxilano
endo-1,4-beta-xilanasa,
manano
exo-1,2-1,6-alfa-manosidasa,
anhidrosialidasa, alfa-glucosiduronasa,
lacto-N-biosidasa,
4-alfa-D-{(1\rightarrow4)-alfa-D-glucano}trehalosa
trehalohidrolasa, dextrinasa límite,
poli(ADP-ribosa)glucohidrolasa,
3-desoxioctulosonasa, galactano
1,3-beta-galactosidasa,
beta-galactofuranosidasa, tioglucosidasa,
ribosilhomocisteinasa, beta-primeverosidasa.
\newpage
Más preferiblemente, en la digestión enzimática
se realiza con una o más exoglucosidasas enumeradas en la Tabla
1.
Por ejemplo, la figura 3 ilustra perfiles de
glucosilación medidos por NP-HPLC de glucanos unidos
a N marcados con 2-AB liberados de suero
completo después de la siguiente digestión con una serie de
exoglucosidasas. Sólo se anotaron los picos principales en la
Figura 3, correspondiéndose las abreviaturas usadas con las de la
Tabla 2.
En algunas realizaciones, la digestión
enzimática puede ser secuencial, de modo que no se eliminen todos
los monosacáridos a la vez. Los glucanos digeridos pueden analizarse
después de cada etapa de digestión para obtener un perfil de
glucosilación. En algunas realizaciones, la digestión enzimática
puede ser una digestión con una serie que comprende una o más
exoglucosidasas. La digestión con una serie significa el uso de un
panel de exoglucosidasas en diversas combinaciones para proporcionar
varios perfiles de digestión en alícuotas de una combinación de
glucanos. Cada enzima exoglucosidasa elimina monosacáridos
terminales específicos unidos en enlaces definidos. En una serie,
las enzimas exoglucosidasas actúan de forma secuencial dependiendo
de su especificidad.
En algunas realizaciones de la invención, la
digestión con una o más exoglucosidasas en cualquier combinación
puede usarse para segregar el marcador o marcadores de glucosilación
por desplazamiento de las estructuras de glucanos que no contengan
el marcador de la región medida del perfil de glucosilación. En
algunas realizaciones de la invención, la digestión con una o más
exoglucosidasas en cualquier combinación puede usarse para
amplificar el marcador o marcadores de glucosilación
eliminando por digestión los monosacáridos que estén unidos a
algunos de los oligosacáridos marcadores pero que no sean
características esenciales de los marcadores. En algunas
realizaciones de la invención, puede usarse la digestión con una o
más exoglucosidasas tanto para amplificar como para segregar el
marcador o marcadores de glucosilación. El uso de la digestión con
una o más exoglucosidasas para segregar y/o amplificar los
marcadores de glucosilación se ilustra, por ejemplo, en la solicitud
provisional de los Estados Unidos "Glycosy- lation Markers
for Cancer Diagnostics and Monitoring" para Dwek et. al.
incorporada por la presente como referencia.
En algunas realizaciones, la medición de
perfiles de glucosilación puede poner de manifiesto uno o más picos
que no pueden asignarse a estructuras de glucanos descritas
anteriormente o estructuras que no están completamente digeridas
por los paneles de series de enzimas. En este caso, la digestión con
una o más exoglucosidasas puede usarse para segregar estos uno o
más picos para un análisis adicional. La tecnología basada en HPLC
permite que se recuperen dichos glucanos del eluido de HPLC para un
análisis adicional.
La medición del perfil de glucosilación de los
glucanos puede comprender la construcción de una base de datos de
estructuras de glucanos de los glucanos. Los parámetros de esta base
de datos pueden ser, por ejemplo, la estructura del glucano junto
con: tiempos de elución (de datos de HPLC); masa y composición (de
datos de MS); estructuras, masa y composición de glucanos
determinadas experimentalmente y/o predichas, tiempos de elución,
después del tratamiento con enzimas exoglucosidasas; estructuras,
masa y composición de glucanos determinadas experimentalmente y/o
predichas después de la fragmentación con MS. La base de datos puede
realizar, por ejemplo, asignaciones preliminares y finales de las
estructuras de glucanos, así como recomendar las series de
exoglucosidasas apropiadas para confirmar las asignaciones
preliminares. El uso de bases de datos en la medición de perfiles
de glucosilación se describe, por ejemplo, en las siguientes
referencias:
- 1)
- Mattu, T. S., Royle, L., Langridge, J., Wormald, M. R., Van den Steen, P. E., Van Damme, J., Opdenakker, G., Harvey, D. H., Dwek, R. A. y Rudd, P. M. (2000). "The O-glycan analysis of natural human neutrophil gelatinase B using a novel strategy combining normal phase-HPLC and on-line tandem mass spectrometry: implications for the domain organization of the enzyme". Biochemistry 39: 15695-704.
- 2)
- Royle, L., Mattu, T. S., Hart, E., Langridge, J. I., Merry, A. H., Murphy, N., Harvey, D. J., Dwek, R. A. y Rudd, P. M. (2002). "An analytical and structural database provides a strategy for sequencing O-glycans from microgram quantities of glycoproteins". Anal Biochem 304: 70-90,
- 3)
- Butler, M., Quelhas, D., Critchley, A. J., Carchon, H., Hebestreit, H. F., Hibbert, R. G., Vilarinho, L., Teles, E., Matthijs, G., Schollen, E., Argibay, P., Harvey, D. J., Dwek, R. A., Jaeken, J. y Rudd, P. M. (2003). "Detailed glycan analysis of serum glycoproteins of patients with congenital disorders of glycosylation indicates the specific defective glycan processing step and provides an insight into pathogenesis". Glycobiology 13: 601-22,
- 4)
- Peracaula, R., Royle, L., Tabares, G., Mallorqui-Fernandez, G., Barrabes, S., Harvey, D. J., Dwek, R. A., Rudd, P. M. y de Llorens, R. (2003). "Glycosylation of human pancreatic ribonuclease: differences between normal and tumor states". Glycobiology 13: 227-44,
- 5)
- Peracaula, R., Tabares, G., Royle, L., Harvey, D. J., Dwek, R. A., Rudd, P. M. y de Llorens, R. (2003). "Altered glycosylation pattern allows the distinction between prostate-specific antigen (PSA) from normal and tumor origins". Glycobiology 13: 457-70.
Un ejemplo de la base de datos de glucanos puede
ser una base de datos que comprenda estructuras de glucanos
determinadas por espectrometría de masas iónica negativa en el
Instituto de Glicobiología de la Universidad de Oxford. El uso de
espectrometría de masas iónica negativa para el análisis de glucanos
se describe, por ejemplo, en
- 1)
- D. J. Harvey, Fragmentation of negative ions from carbohydrates: Part 1; Use of nitrate and other anionic adducts for the production of negative ion electrospray spectra from N-linked carbohydrates, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2005, 16, 622-630,
- 2)
- D. J. Harvey, Fragmentation of negative ions from carbohydrates: Part 2, Fragmentation of high-mannose N-linked glycans, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2005, 16, 631-646,
- 3)
- D. J. Harvey, Fragmentation of negative ions from carbohydrates: Part 3, Fragmentation of hybrid and complex N-linked glycans, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2005, 16, 647-659.
La base de datos incluye actualmente patrones de
fragmentación de 60 estructuras de glucanos a partir de los
perfiles espectrométricos de masas de oligosacáridos individuales y
de mezclas de oligosacáridos. Los patrones de esta base de datos
pueden emparejarse con perfiles de MS experimentales por
emparejamiento de patrones usando programas informáticos
disponibles en el mercado.
El ejemplo de la base de datos de glucanos puede
ser Glycobase, una base de datos de glucanos del Instituto de
Glicobiología de la Universidad de Oxford (OGBI) que se ilustra en
la Figura 10. La Glycobase contiene datos analíticos para más de
290 estructuras de glucanos y puede usarse para asignar estructuras
tanto preliminares como finales, así como para recomendar las
series de exoglucosidasas apropiadas para confirmar las asignaciones
preliminares como se ilustra en la Figura 10. Los paneles (a) y (b)
de la Figura 10 muestran la nomenclatura que puede usarse para
dibujar las estructuras de glucanos y explicar las digestiones con
exoglucosidasas. El panel (c) muestra algunas de las estructuras
con los valores de GU enumerados en la Glycobase; los paneles (d) a
(g) siguen la estructura del glucano A2G2S2 (las abreviaturas usadas
se explican en la Tabla 2) a través de una serie de digestiones con
exoglucosidasas, proporcionándose en cada caso el valor de GU de
consenso (que se calcula a partir de los valores de GU determinados
experimentalmente enumerados) junto con las digestiones y productos
posibles.
Los valores de GU para picos individuales pueden
generarse, por ejemplo, usando el paquete de programas informáticos
añadido PeakTime. El programa informático PeakTime puede calcular
automáticamente, por ejemplo, el valor de GU para cada pico de
muestra basándose en la comparación con un patrón de marcador de
dextrano y puede enumerar las asignaciones preliminares para cada
pico usando datos de la base de datos patrón. Un programa
informático adicional, como PeakShift en el OGBI puede usarse para
asignar estructuras a los productos de digestiones enzimáticas y
confirmar cuál de las asignaciones iniciales, realizada por el
programa PeakTime es correcta. El programa informático PeakShift
usa una combinación de áreas de picos y los valores graduales para
restos monosacáridos individuales.
Puede aplicarse un algoritmo (figura 11) basado
en un modelo de transformaciones generalizadas en un conjunto de
picos de cromatograma con una varianza dada para analizar
adicionalmente los perfiles de glucosilación. En el campo de la
glicobiología, estas transformaciones pueden representar la acción
de enzimas, por ejemplo, exoglucosidasas; sin embargo la
generalidad del algoritmo le concede aplicabilidad fuera del campo a
cualquier área de la química o bioquímica en la que se usen métodos
similares. El algoritmo puede resolverse en componentes. En primer
lugar, cada cromatograma puede calibrarse en una serie de picos
patrón usando una técnica de ajuste de curvas polinomial. Después
puede determinarse una primera lista de asignaciones posibles para
cada pico mediante la consulta de tablas frente a una base de datos
de valores patrón. Puede usarse un procedimiento estadísticamente
válido en la comparación, empleando la varianza conocida de tanto
valores desconocidos como patrones. La etapa final puede ser una
comparación con la huellas de digestión enzimática de los patrones
almacenadas.
La base de datos actualmente en uso en el OGBI
se actualiza continuamente según se adquieren nuevos datos. La base
de datos puede presentar la abreviatura estructural, el diagrama
esquemático, el valor de GU de consenso (habiendo calculado un
promedio a partir de los datos introducidos para la estructura) y
los productos de digestión (que se introducen para una variedad de
digestiones con exoglucosidasas). Las subsecciones de la base de
datos pueden ser animales unidos a N; vegetales unidos a N; ricos en
manosa unidos a N; 1 y 2 de núcleo unidos a O; 3 y/o 4 de núcleo
unidos a O; otros unidos a O; GSL; y misceláneo. Modificaciones
adicionales de la base de datos pueden permitir que se seleccione
una mayor variedad de subsecciones. Las bases de datos pueden
permitir potencialmente al usuario seleccionar qué glucanos ver por
selecciones tales como: qué azúcar contienen (por ejemplo, fucosa)
o todas las estructuras biantenarias de N-glucano
solamente.
Pueden construirse bases de datos separadas para
glucanos liberados para suero completo sin purificar las
glucoproteínas. Por ejemplo, puede construirse una base de datos
específica que contenga perfiles de glucanos de suero por
NP-HPLC para glucanos tanto sialilados como neutros,
con actualmente 38 glucanos identificados en la Figura 4 y en la
Tabla 2.
La siguiente funcionalidad se ha completado,
ensayado totalmente y está actualmente en uso en el laboratorio en
el Instituto de Glicobiología de la Universidad de Oxford:
- 1)
- Una base de datos que contiene las especificidades de enzimas y los valores de GU y varianzas patrones. La estructura de la base de datos es una flexible que permite que se almacenen diferentes valores para diferentes columnas y métodos y que permite que el almacenamiento se divida fácilmente en áreas para diferentes grupos químicos, o diferentes usuarios o proyectos.
- 2)
- Presentación gráfica. La última versión de PeakTime es capaz de presentar múltiples representaciones una encima de la otra a la misma escala y de mostrar las transformaciones debidas a enzimas como uniones entre sus picos.
- 3)
- El cromatograma puede dibujarse con el eje de tiempo recalculado a la escala calibrada. Esto permite que se realicen comparaciones directas entre múltiples representaciones, especialmente ya que los valores de la base de datos pueden presentarse como gráficas de barras en la misma escala.
- 4)
- Las funciones gráficas proporcionadas incluyen la ampliación, presentación como una gráfica de barras o la curva sin procesar, cambio entre áreas y alturas de picos y anotación con información tal como el nombre de la especie química determinado a partir de la secuenciación.
- 5)
- Presentación tabular. La mayor parte de lo que se muestra gráficamente también puede presentarse en forma de tabla. Las tablas pueden ajustarse en la anchura y altura de las celdas y pueden ocultarse columnas individuales de una forma que será familiar para los usuarios de hojas de cálculo.
- 6)
- Se proporciona un sistema de seguridad de nombres de entrada y contraseñas, permitiendo que los datos de patrones estén protegidos frente a una alteración no autorizada y, para usuarios individuales, restringir el acceso a sus datos privados.
- 7)
- Una función de calibración de columna con un mapeo polinomial. La variedad de tipos de calibración diferentes realizadas incluye las escalas tanto de unidades de glucosa (GU) como de unidades de arabinosa (AU).
- 8)
- Operaciones en cromatogramas. Se proporciona una función de suma y de resta. Dichas representaciones serían difíciles de interpretar sin la calibración que realiza el PeakTime.
- 9)
- Un mecanismo de introducción de datos rápido por el que pueden añadirse datos experimentales a la base de datos arrastrándolos y soltándolos directamente con el ratón desde un cromatograma. Esto está diseñado para fomentar el uso de las bases de datos para valores efímeros del día a día y así reducir la dependencia del mantenimiento de notas de papel.
- 10)
- Bloqueo. Una vez calibrado el cromatograma puede bloquearse de modo que puedan evitarse alteraciones involuntarias.
- 11)
- Exportación. Las gráficas pueden exportarse a archivos en formato de mapa de bits o vector o como mapas de bits en el portapapeles de Windows. Todas las tablas pueden exportarse a archivos en formatos convencionales para transferirse a herramientas tales como Microsoft Access o Excel.
- 12)
- Impresión. Tanto las presentaciones gráficas como tabulares pueden imprimirse desde el PeakTime y en algunos casos se proporciona una función de vista previa de impresión. Se proporcionan diversas selecciones de visualización tales como fuentes, grosor de línea y anchuras de columna.
\vskip1.000000\baselineskip
En algunas realizaciones, el marcador de
glucosilación determinado de enfermedad puede usarse para
identificar y aislar una o más biomarcadores de glucoproteínas, es
decir, glucoproteínas que sean específicas para la enfermedad. El
biomarcador de glucoproteína de la enfermedad lleva el marcador de
glucosilación de la enfermedad. El aislamiento de los biomarcadores
de glucoproteínas de la enfermedad puede realizarse usando lectinas
o anticuerpos monoclonales. Por ejemplo, se usaron lectinas para
aislar gp73, un marcador de glucoproteína de hepatitis B asociado
con cáncer de hígado en "Use of targeted glycoproteomics to
identify serum glycoproteins that correlate with liver cancer in
woodchucks and humans". T. M. Block, M. A. Comunale, M. Lowman,
L. F. Steel, P. R. Romano, C. Fimmel, B. C. Tennant, W. T. London,
A. A. Evans, B. S. Blumberg, R. A. Dwek, T. S. Mattu y A. S. Mehta
(2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102,
779-784.
Los siguientes ejemplos ilustran la metodología
para determinar los marcadores de glucosilación de enfermedad y el
uso de bases de datos en el análisis detallado de glucanos para
carcinoma hepatocelular y para artritis reumatoide. Sin embargo,
debería entenderse que la presente invención no se limita a los
mismos.
La invención se ilustra además mediante, aunque
de ningún modo limitada a, los siguientes ejemplos.
Se compararon los perfiles de glucosilación de
glucanos liberados de suero completo de controles y pacientes
infectados con virus de la hepatitis C (HCV) con carcinoma
hepatocelular para detectar un marcador de glucosilación potencial
que diferencie los dos grupos. Se analizaron muestras de suero de
control sano de dos individuos y una muestra combinada. Se
construyó una base de datos específica que contenía perfiles de
glucanos en suero por NP-HPLC para glucanos tanto
sialilados como neutros y se identificaron 38 glucanos (Figura 4,
Tabla 2). El mismo procedimiento se aplicó a sueros de pacientes y
el marcador de glucosilación del carcinoma hepatocelular en
pacientes con HCV se identificó por comparación de la base de datos
de glucanos liberados de suero completo de pacientes infectados con
HCV con la base de datos de glucanos liberados de suero completo de
controles sanos.
Abreviaturas usadas: M5-9:
GlcNAc_{2}Man_{x}, donde x es el número de manosas; Ax: número
de antenas, es decir, A2 es biantenario; Gx: número de galactosas,
[3] y [6] indica a qué ramificación (unido a 3 ó 6) de la galactosa
está unido; Sx: el número de ácidos siálicos; B: un GlcNAc de
bisección; Fc: fucosa de núcleo \alpha1-6. Por
ejemplo, el pico 5 con una GU de 6,17 es Man5, que también puede
escribirse como GlcNAc_{2}Man_{5}; el pico 33 es Man9, que
también puede escribirse como GlcNAc_{2}Man_{9}
Se obtuvieron muestras de suero de pacientes
infectados con HCV con carcinoma hepatocelular a partir de pacientes
infectados con HCV con fibrosis/cirrosis moderada o grave. Se
obtuvieron muestras de suero de control sano como material clínico
desechado de individuos que se estaban sometiendo a un examen médico
de rutina.
Las glucoproteínas en muestras de suero
reducidas y desnaturalizadas se unieron a una membrana de PVDF
hidrófoba en una placa de 96 pocillos (Multiscreen_IP, membranas de
fluoruro de polivinilideno (PVDF) de alta unión a proteína
hidrófobas de 0,45 \mum, Millipore, Bedford, MA, Estados Unidos)
por filtración simple. Después, las muestras se lavaron para
eliminar los contaminantes, se incubaron con PNGasaF para liberar
los glucanos basándose en los métodos descritos en Papac, D. I.,
et. al. Glycobiology 8: 445-54, 1998, y en
Callewaert, N., et. al. Electrophoresis 25:
3128-31, 2004. Después, los N-glucanos se
retiraron por lavado de la proteína unida, se recogieron y se
secaron, listos para el marcaje fluorescente.
Se marcaron los glucanos liberados con marcador
fluorescente 2-aminobenzamida (2-AB)
con o sin un kit comercial (de, por ejemplo, Ludger Ltd, Oxford,
Reino Unido) como se describe en Bigge, J. C, Patel, T. P., Bruce,
J. A., Goulding, P. N., Charles, S. M., y Parekh, R. B. (1995).
Nonselective and efficient fluorescent labeling of glycans using
2-amino benzamide and anthranilic acid. Analytical
Biochemistry 230: 229-238, y se procesaron mediante
cromatografía líquida de alto rendimiento de fase normal
(NP-HPLC) en una columna TSK
Amide-80 de 4,6 x 250 mm (Anachem, Luton, Reino
Unido) usando un módulo de separación Waters 2695 equipado con un
detector de fluorescencia Waters 2475 (Waters, Milford, MA, Estados
Unidos), como se describe en Guile, G. R, Rudd, P. M., Wing, D. R.,
Prime, S. B., y Dwek, R. A. (1996). A rapid
high-resolution high-performance
liquid chromatographic method for separating glycan mixtures and
analyzing oligosaccharide profiles. Analytical Biochemistry 240:
210-226. Antes del análisis por
NP-HPLC, los glucanos se digirieron de forma
secuencial con una serie de exoglucosidasas.
La Figura 5 presenta perfiles de
NP-HPLC de glucanos liberados de la muestra de
control Con_9 y de la muestra de paciente infectado con HCV con
carcinoma hepatocelular HCV_42. En la Figura 5, el panel (A) se
corresponde con perfiles de glucosilación de glucanos en suero
completo no expuestos a ninguna digestión con exoglucosidasa, el
panel (B) a perfiles de glucosilación después de la digestión con
una serie de
\alpha2-3,6,8-sialidasa,
\beta1-4 galactosidasa y
\beta-N-acetilglucosaminidasa. El panel (C) de la figura 5
demuestra que el marcador que se correlacionaba con el diagnóstico
de carcinoma hepatocelular en pacientes con HCV es el porcentaje de
glucanos fucosilados de núcleo medido después de la digestión con
\alpha2-3,6,8-sialidasa,
\beta1-4 galactosidasa y
\beta-N-acetilglucosaminidasa. Los sueros de control sanos
contienen entre el 15 y el 17% de estos glucanos, mientras que los
sueros de pacientes infectados con HCV con carcinoma hepatocelular
contenían más del 19% de estos glucanos. La correlación también se
observó entre la fase de la enfermedad y el porcentaje de glucanos
fucosilados de núcleo medido después de la digestión con
\alpha2-3,6,8-sialidasa,
\beta1-4 galactosidasa y
\beta-N-acetilglucosaminidasa. Los pacientes infectados con
HCV en fase moderada de carcinoma hepatocelular tenían el
porcentaje de glucanos fucosilados de núcleo medido después de
digestión con
\alpha2-3,6,8-sialidasa,
\beta1-4 galactosidasa y
\beta-N-acetilglucosaminidasa del 20-22%,
mientras que los pacientes en fases graves de enfermedad, tales
como fibrosis/cirrosis grave, tenían este marcador de glucano por
encima del 25% de media.
Conclusión: se identificó un marcador de
glucosilación de carcinoma hepatocelular en pacientes con HCV por
comparación de los perfiles de glucosilación de glucanos liberados
de suero completo de pacientes con HCV con carcinoma hepatocelular
y de glucanos liberados de suero completo de controles sanos. El
marcador de glucosilación de carcinoma hepatocelular en pacientes
con HCV es el porcentaje de glucanos fucosilados de núcleo medido
después de la digestión con
\alpha2-3,6,8-sialidasa,
\beta1-4 galactosidasa y
B-N-acetilglucosaminidasa. El marcador se correlaciona con
el diagnóstico de enfermedad y la gravedad de la enfermedad. La
digestión de los glucanos con exoglucosidasas amplifica/segrega el
marcador de glucosilación de carcinoma hepatocelular en pacientes
con HCV.
\vskip1.000000\baselineskip
La medición de la relación
G0/triple-G1 directamente a partir de glucanos sin
digerir liberados de suero completo se comparó con la medición
"clásica" de la cantidad de glucanos G0 como porcentaje de los
glucanos totales liberados a partir de IgG purificada después de la
digestión con sialidasa y fucosidasa. Se ha demostrado que el G0
liberado de IgG purificada es un marcador específico de enfermedad
(RA) que se correlaciona con la progresión de la enfermedad y que
puede usarse como un indicador de pronóstico de la enfermedad,
véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 4.659.659
"Diagnostic Method for Diseases Having an Arthritic Component"
para Dwek et. al, expedida el 21 de abril de 1987; Parekh
et al., véase "Association of Rheumatoid Arthritis and
Primary Osteoarthritis with Changes in the Glycosylation Pattern of
Total Serum IgG, "Nature, 316, págs. 452-457,
1985; y Parekh et. al. "Galactosylation of IgG Associated
Oligosaccharides Is Reduced in Patients with Adult and Juvenile
Onset Rheumatoid Arthritis and Is Related to Disease Activity",
Lancet, Nº 8592, vol. 1, págs. 966-969, 1988. Este
estudio se usó para demostrar que puede usarse una medición directa
de los glucanos liberados de suero completo como marcador para
artritis reumatoide sin purificación de IgG por correlación de la
relación de G0/triple-G1 a partir de glucanos sin
digerir liberados de suero completo con la cantidad de glucanos G0
como porcentaje de los glucanos totales liberados de IgG
purificada.
Se combinó suero de paciente de control de
material clínico desechado de individuos que se estaban sometiendo
a un examen médico de empleados de rutina. Se seleccionaron los
pacientes con RA basándose en una combinación de puntuación de
actividad global del médico, seropositividad a factor reumatoide y
recuento articular activo.
Se aisló IgG de suero completo por cromatografía
de afinidad empleando proteína G-Sepharose como se
describe en "Antibodies: A laboratory manual", Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988, y P.L. Ey et.
al. "Isolation of pure IgG1, IgG2a and IgG2b immunoglobulins
from mouse serum using protein A-Sepharose",
Molecular Immunology, vol. 15, págs. 429, 1978. En resumen, se
diluyeron 100 \mul de suero completo con 300 \mul de Tris 100
mM pH 8,0 y se dejó que pasaran sobre una columna de 1 ml de perlas
de proteína G-Sepharose (Amersham Biosciences). Se
lavó el material unido con 15 volúmenes de columna de Tris 100 mM pH
8,0. La IgG se eluyó usando tampón de glicina 100 mM a pH 2,6
directamente en 1/10 volumen de Tris 1 M pH 8,0 y se recogió en
fracciones de 1 ml. Se determinó el contenido de proteína de las
fracciones eluidas mediante absorbancia a 280 nm (UV)
(espectrofotómetro Beckman Coulter Modelo DU640). Las fracciones
eluidas que contenían proteína se combinaron y se dializaron en
solución salina tamponada con fosfato. Se confirmó la presencia de
IgG en las fracciones eluidas mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida al 10% (PAGE) en condiciones reductoras (como se
describe, por ejemplo, en Laemmli, "Cleavage of structural
proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4",
Nature: 227, 680-685, 1970) y mediante transferencia
de Western (Current Protocols in Immunology. John Wiley and Sons,
1994) utilizando IgG de burro anti-humana conjugada
con peroxidasa de rábano picante (Jackson Immunochemicals) y se
visualizaron con Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus
(Perkin Elmer). Se confirmó la reducción cuantitativa de IgG en
suero en el material de flujo a través de la columna mediante
análisis de transferencia de Western.
Se liberaron los glucanos de la IgG purificada
procesando la muestra reducida y alquilada sobre una electroforesis
en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico
(SDS-PAGE), cortando la cadena pesada y digiriéndola
con péptido N-glucosidasa F (PNOasaF) como se
describe en Küster, B., Wheeler, S. F., Hunter, A. P., Dwek, R. A.,
y Harvey, D. J. (1997). Sequencing of N-linked
oligosaccharides directly from protein gels: in-gel
deglycosilation followed by matrix-assisted lasser
desorption/ionization mass spectometry and
normal-phase high-performance
liquid chromatography. Analytical Biochemistry 250:
82-101. Se liberaron los glucanos con PNGasaF a
partir de 5 \mul de sueros completos después de la unión del
suero reducido y alquilado a membranas de fluoruro de
polivinilideno (PVDF) de alta unión a proteína hidrófobas de 0,45
\mum MultiScreen_IP en un formato de placa de 96 pocillos
(Millipore, Bedford, MA, Estado Unidos). Se marcaron los glucanos
liberados con marcador fluorescente 2AB (Ludger Ltd, Oxford, Reino
Unido) como se describe en Bigge, J. C., Patel, T. P., Bruce, J.
A., Goulding, P. N., Charles, S. M., y Parekh, R. B. (1995).
Nonselective and efficient fluorescent labeling of glycans using
2-amino benzamide and anthranilic acid. Analytical
Biochemistry 230: 229-238, y se procesaron mediante
cromatografía líquida de alto rendimiento de fase normal
(NP-HPLC) en una columna TSK
Amide-80 de 4,6 x 250 mm (Anachem, Luton, Reino
Unido) usando un módulo de separación Waters 2695 equipado con un
detector de fluorescencia Waters 2475 (Waters, Milford, MA, Estados
Unidos) como se describe en Guile, G. R, Rudd, P. M., Wing, D. R,
Prime, S. B., y Dwek, R. A. (1996). A rapid
high-resolution high-performance
liquid chromatographic method for separating glycan mixtures and
analyzing oligosaccharide profiles. Analytical Biochemistry 240:
210-226. También se digirieron los glucanos de
cadena pesada de IgG marcados con 2AB purificados con sialidasa y
fucosidasa para reducir todas las estructuras a G0, G1 o G2 +/-
bisección, después se procesaron una NP-HPLC.
[G_{0} significa sin galactosa; G1 una galactosa; y G2 dos
galactosas, todas en N-glucanos complejos
biantenarios].
Todos los datos para proporciones de glucanos se
enumeran en la Tabla 3. Los paneles superior izquierdo, inferior
izquierdo y superior derecho de la figura 9 son representaciones
que muestran correlaciones entre estos datos. Los valores de R^{2}
se obtuvieron por análisis de regresión lineal usando Microsoft
Excel.
La figura 6 muestra perfiles de
SDS-PAGE NP-HPLC de las muestras
GBRA13 y GBRA1. En particular, los recuadros (a) y (b) de la figura
6 proporcionan fotografías de gel de SDS-PAGE de las
IgG purificadas de las muestras respectivas separadas en bandas de
cadena pesada (H) y ligera (L). Los recuadros (c) y (d) de la figura
6 proporcionan perfiles de NP-HPLC para glucanos de
cadena pesada y ligera liberados de las bandas de gel que se
muestran en (a) y (b) y no sometidos a digestión con sialidasa y
fucosidasa. Puesto que no se detectaron glucanos en la cadena
ligera, sólo era necesaria la cadena pesada para análisis.
La figura 7 ilustra los detalles de (a) la
medición de la relación G0/triple-G1 directamente a
partir de glucanos sin digerir liberados de IgG purificada y (b) la
medición "clásica" de la relación de glucanos G0 respecto a
los glucanos totales liberados de IgG purificada y digerida con
sialidasa y fucosidasa. En particular, la figura 7 muestra perfiles
de NP-HPLC de la muestra GBRA15. Cada pico se
corresponde con ciertos glucanos. Los picos en cada perfil se
integran para dar el área bajo la curva para cada pico. En la
medición de la relación de G0/triple-G1 el área
bajo los picos correspondiente a los glucanos G0 (bloque izquierdo
del recuadro (a) de la figura 7) se divide por el área bajo el
triplete de picos correspondientes a los glucanos G1 (bloque
derecho del recuadro (a) de la figura 7). Como la gran mayoría de
los glucanos que se encuentran en estos experimentos eran
fucosilados de núcleo, sólo los glucanos fucosilados de núcleo se
incluyeron en estas mediciones, es decir, la relación
G0/triple-G1 es realmente el área de picos de FcA2G0
dividida por el área de picos de FcA2G1[6] +
FcA2G1[3] + FcA2BG1[6] + FcA2BG1 [3] (que se eluye
como un triplete).
En la medición "clásica", el área bajo los
picos correspondiente a los picos G0 se divide por el área total
bajo todos los picos en el perfil y se expresa como porcentaje.
La figura 8 ilustra los perfiles de
NP-HPLC de una muestra de control y de la muestra
GBRA15. Particularmente, los recuadros (a) y (d) muestran los
glucanos liberados de sueros completos de las muestras respectivas,
los recuadros (b) y (e) muestran glucanos de cadena pesada sin
digerir liberados de las IgG purificadas respectivas, los recuadros
(c) y (f) muestran glucanos de cadena pesada liberados de las IgG
purificadas respectivas y digeridos con sialidasa y fucosidasa.
La Tabla 3 enumera las relaciones de los picos
G0 respecto a triple-G1 de suero completo e IgG
purificada a partir de las mismas muestras de suero de 15 pacientes
con RA y un control combinado. La medición "clásica" de la
cantidad de glucanos G0 como porcentaje de los glucanos totales (G0
+ G1 + G2) de IgG purificada se muestra también. Comparando los
resultados de las dos mediciones diferentes tomadas a partir de IgG
purificada, se encuentra una alta correlación (R^{2 }= 0,9649)
que indica que la relación de G0/triple-G1 es tan
buena medición como la medición "clásica" del porcentaje de
glucanos G0 en la combinación de glucanos total (Figura 9, panel
superior izquierdo). La comparación de la relación de
G0/triple-G1 entre glucanos de IgG purificada y
suero completo proporciona una correlación de R^{2} = 0,8785
(Figura 9, panel superior derecho), mientras que la comparación de
la relación de G0/triple-G1 de glucanos de suero
completo con el porcentaje de glucanos G0 de IgG purificada
proporciona una correlación de R^{2} = 0,8174 (Figura 9, panel
inferior izquierdo). La Figura 9, panel inferior derecho es un
histograma que muestra las relaciones de
G0/triple-G1 para todas las muestras de suero e
IgG.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha demostrado el uso del formato en placa de
96 pocillos de membrana de PVDF de alto rendimiento, usándose
solamente 5 \mul de suero completo para obtener glucanos para una
medición directa de la relación de G0/triple-G1 en
lugar del procedimiento más prolongado de la medición del porcentaje
de glucanos G0 en los glucanos liberados a partir de IgG purificada
determinado después del tratamiento con exoglucosidasa como un
indicador de patología de RA. Por lo tanto, para controlar la
patología de AR se pueden reducir eficazmente las horas de trabajo
desde la preparación de muestras hasta los resultados usando el
método de membrana de PVDF con suero completo así como reduciendo
la cantidad de material (suero) usado.
Aunque lo anterior se refiere a realizaciones
preferidas particulares se entenderá que la presente invención no
está tan limitada. Los expertos en la materia se encontrarán con que
pueden realizarse diversas modificaciones en las realizaciones
descritas y que dichas modificaciones pretenden incluirse en la
presente invención.
Claims (18)
1. Un método in vitro para determinar uno
o más marcadores de glucosilación de una enfermedad que comprende
las etapas de:
- -
- proporcionar una muestra de enfermo y una muestra de control, donde la muestra de enfermo es una muestra de un sujeto al que se le ha diagnosticado la enfermedad y la muestra de control es una muestra de un control sano;
- -
- inmovilizar las glucoproteínas totales de la muestra de enfermo y de la muestra de control sobre una membrana de unión a proteínas o en un gel sin separar el gel en bandas;
- -
- liberar una combinación de glucanos de las glucoproteínas totales inmovilizadas de la muestra de enfermo y liberar una combinación de glucanos de las glucoproteínas totales inmovilizadas de la muestra de control del gel o la membrana de unión a proteínas sin haber purificado una glucoproteína específica y sin exponer la muestra de enfermo y la muestra de control a hidrazinolisis;
- -
- medir un perfil de glucosilación de la combinación de glucanos de la muestra de enfermo y medir un perfil de glucosilación de la combinación de glucanos de la muestra de control usando cromatografía, espectrometría de masas o una combinación de las mismas; y
- -
- comparar el perfil de glucosilación de la muestra de enfermo con el perfil de glucosilación de la muestra de control para determinar uno o más marcadores de glucosilación de la enfermedad.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que la muestra es una muestra de un fluido corporal o un
tejido corporal.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2,
en el que el fluido corporal es suero completo.
4. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en el que los glucanos son glucanos
unidos a N.
5. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en el que los glucanos son glucanos
unidos a O.
6. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, en el que el método incluye una etapa
adicional de marcaje de los glucanos de la combinación de glucanos
con un marcador radiactivo fluorescente antes de medir el perfil de
glucosilación.
7. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además seleccionar un
mejor marcador de glucosilación de entre los marcadores de
glucosilación, donde el mejor marcador de glucosilación tiene una
mayor correlación con uno o más parámetros de la enfermedad.
8. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7, que comprende además una etapa de
segregar y/o amplificar el uno o más marcadores de glucosilación por
digestión de los glucanos con una o más exoglucosidasas.
9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8,
en el que dicha digestión se realiza de forma secuencial.
10. Un método de acuerdo con la reivindicación
8, en el que dicha digestión es una digestión con una serie que
comprende la una o más exoglucosidasas.
11. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 10, que comprende además el uso de una
base de datos para realizar asignaciones preliminares y finales de
estructuras de los glucanos.
12. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 11, que comprende además el uso de uno o
más marcadores de glucosilación de la enfermedad para diagnosticar,
pronosticar y/o controlar la enfermedad.
13. Un método in vitro para diagnosticar
y controlar una enfermedad en un sujeto que comprende las etapas
de:
- -
- proporcionar una muestra de fluido corporal o un tejido corporal del sujeto;
- -
- inmovilizar las glucoproteínas totales de la muestra sobre una membrana de unión a proteínas o en un gel sin separar el gel en bandas;
\newpage
- -
- liberar una combinación de glucanos de las glucoproteínas totales inmovilizadas de la muestra del gel o la membrana de unión a proteínas sin haber purificado una glucoproteína específica y sin exponer la muestra a hidrazinolisis;
- -
- medir un perfil de glucosilación de la combinación de glucanos; y
- -
- determinar un estado clínico del sujeto a partir de uno o más marcadores de glucosilación de la enfermedad en el perfil de glucosilación.
14. Un método de acuerdo con la reivindicación
13, en el que la enfermedad es cáncer, una enfermedad autoinmune o
un trastorno congénito de la glucosilación.
15. Un método de acuerdo con la reivindicación
14, en el que la enfermedad autoinmune es artritis reumatoide.
16. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 13 a 15, en el que el fluido corporal es suero
completo.
17. Un método de acuerdo con la reivindicación
16, cuando depende de la reivindicación 15, en el que el marcador
de glucosilación es una relación entre glucanos G0 y glucanos
triple-G1.
18. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 13 a 16, que comprende además una etapa de
segregar y/o amplificar el uno o más marcadores de glucosilación por
digestión de los glucanos con una o más exoglucosidasas.
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