JP6181254B1 - 乳酸菌含有チョコレートおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】生きた状態の乳酸菌を含有する乳酸菌含有チョコレート及びその製造方法を提供すること。【解決手段】乳酸菌を、固体粒子の粒子径が小さいチョコレートに添加することにより、乳酸菌の生存率の高い、乳酸菌含有チョコレートを製造することに成功した。【選択図】図１

Description

本発明は生きた状態の乳酸菌を安定化した状態で含有する乳酸菌含有チョコレートおよびその製造方法に関する。

乳酸菌は糖から乳酸を生産する細菌である。糖を乳酸発酵させる細菌として、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）などの属が知られる。また、糖を分解して乳酸と酢酸をつくる細菌として、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）が知られている。ビフィドバクテリウム属の細菌はビフィズス菌として乳酸菌と別に分類される場合もあるが、本明細書中では、ビフィドバクテリウム属の細菌も乳酸菌に含むものとする。
ヒトの腸内には多種の微生物が生息し、ほぼすべてのヒトの腸内からは、ラクトバチルス属やビフィドバクテリウム属の乳酸菌が検出される。

プロバイオティクスは、英国の微生物学者Ｆｕｌｌｅｒにより「腸内フローラのバランスを改善することにより人に有益な効果をもたらす生きた微生物」と定義されており、生きて腸まで届き、腸内環境で増殖可能となる必要がある。乳酸菌は、腸内の菌叢を整える他、免疫系、内分泌系、神経系などを調節するものもあり、プロバイオティクスとして注目されている。

健康増進、維持のために、乳酸菌を摂取することが望ましく、乳酸菌を含有する食品としては、ヨーグルト、乳酸菌飲料などが一般的である。しかし、これらに加え、より、手軽で、嗜好性の高いプロバイオティクスとしての乳酸菌含有食品は、健康、利便性、嗜好性の全てを求める現代人のニーズに合致するものである。
特許文献１は、生菌状態のビフィズス菌を含む乳酸菌を含有するチョコレートを開示し、製造時からの安定性改善についての技術を開示するものであるが、乳酸菌含有チョコレートに含まれる固体粒子の粒子径に関する検討は行っていない。

本願発明者らは、乳酸菌を生きて腸に届ける事を特徴とした乳酸菌含有チョコレート及びその製造方法について特許文献２を出願している。ただし、ここでも、乳酸菌含有チョコレートに含まれる固体粒子の粒子径に関する検討は行っていない。

健康増進効果の期待できる乳酸菌として、ラクトバチルス属、エンテロコッカス属、ビフィドバクテリウム属、ロイコノストック属の乳酸菌が知られ、それらの例として、ラクトバチルス ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、エンテロコッカス フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ビフィドバクテリウム ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）あるいはロイコノストック メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）などが知られる。

ラクトバチルス ブレビスとしては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ（通称「ラブレ菌」）等が知られている。また、ラクトバチルス ブレビスは、免疫賦活作用や、抗インフルエンザウイルス活性を有し、体重増加の抑制、肝脂肪重量増加の抑制、血中コレステロール増加の抑制などにも効果があると言われ、様々な健康効果を期待することのできる乳酸菌である。ロイコノストック メセンテロイデスは免疫賦活作用を有し、健康効果を期待することのできる乳酸菌である。ラクトバチルス アシドフィルス、ラクトバチルス ガッセリ、エンテロコッカス フェカリスあるいはビフィドバクテリウム ロンガムは、いずれもヨーグルトなどの乳製品の製造に用いられており、健康増進効果が期待されるものである。

特開平０８−１２６４７３号公報 特願２０１６−５４３７４８号

Ｎｉｐｐｏｎ Ｓｈｏｋｕｈｉｎ Ｋａｇａｋｕ Ｋｏｇａｋｕ Ｋａｉｓｈｉ ４８（９） ｐｐ．６５６−６６３ （２００１）

本発明の課題は長期間生きた状態の乳酸菌を含有する乳酸菌含有チョコレート及びその製造方法を提供することである。

乳酸菌を、固体粒子の粒子径が小さいチョコレートに添加することにより、乳酸菌の生存率の高い、乳酸菌含有チョコレートを製造することに成功した。

本発明の乳酸菌含有チョコレートは、長期間、乳酸菌を生きた状態で含有することができる。

さらに、本発明の乳酸菌含有チョコレートは、保存、輸送、店舗の陳列といった物流において有利であり、年間を通じて乳酸菌含有チョコレートを安定して提供することを可能とする。
また、おどろくべきことに、チョコレートの粒子径を小さくし、粒度の分布をそろえることにより、水分活性が高いチョコレートであっても長期間生きた状態の乳酸菌を含有する乳酸菌含有チョコレートが製造できることを見出し、長期間生きた状態の乳酸菌を含有する乳酸菌含有チョコレートの提供に至った。

実施例１の乳酸菌含有チョコレート１の固体粒子の粒子径分布である。 チョコレート生地１〜４の固体粒子の粒子径分布である。 チョコレート生地１〜４の経時的なＥＲＨ変化量（％）である。 乳酸菌含有チョコレートの製法を説明する図である。 乳酸菌含有アーモンドチョコレートの製法を説明する図である。 乳酸菌含有油脂組成物の製法を説明する図である。 （ａ）（ｂ）（ｃ）のいずれも乳酸菌含有チョコレートの人工胃液耐性試験の結果を示す図である。 乳酸菌含有チョコレートと乳酸菌末の人工胃液耐性の試験結果を示す図である。

本発明の一実施形態は、生きた状態の乳酸菌を含有する乳酸菌含有チョコレートであり、チョコレート中の固体粒子の平均粒子径が９μｍ未満である乳酸菌含有チョコレートである。さらに好ましくは、チョコレート中の固体粒子の平均粒子径は７μｍ未満である。
また、チョコレート中の固体粒子の平均粒子径の下限は、好ましくは１μｍより大きく、より好ましくは５μｍより大きい。
チョコレート中の固体粒子の平均粒子径の好ましい範囲は、１μｍより大きく９μｍ未満、より好ましくは５μｍより大きく７μｍ未満である。

さらに乳酸菌を長期間生きて安定に保つためには、チョコレート生地に含まれる固体粒子の粒子径をそろえることが好ましく、乳酸菌含有チョコレートの固体粒子の粒子径は、単一の分布ピークを有することが好ましい。

本明細書中でチョコレートとは、規約（チョコレート類の表示に関する公正競争規約）または法規上の規定に限定するものではなく、主にカカオ由来の原料からなり、必要により糖類、乳製品、他の食用油脂、香料、乳化剤等を加えたものをいう。

チョコレート中の固体粒子とは、５０℃で溶かしたチョコレートを目開き１５０μｍ（ＪＩＳ試験篩の１００メッシュ）の篩に通し、これを通過した固体粒子をいう。当該固体粒子には、通常カカオ、ミルク、糖類等の粒子が含まれている。なお、乳酸菌含有チョコレートにおいては、乳酸菌も固体粒子に含まれるが、本願発明においては、乳酸菌が乳酸菌含有チョコレート占める割合は小さいため、乳酸菌含有チョコレートの粒子径分布には、ほとんど（実質的に）影響を及ぼさない。

本願明細書中では、チョコレート中、あるいは乳酸菌含有チョコレート中に分散している固体粒子を単に粒子と呼ぶことがあり、また、これらの固体粒子の粒子径のことを指して、単に粒子径と呼ぶ場合がある。

本明細書のチョコレートとしては、ダークチョコレート、ミルクチョコレート、ホワイトチョコレート、さらにホワイトチョコレートをベースに所望の色をつけたカラーチョコレート等も含まれる。

例えば、ミルクチョコレートは、カカオマス：０〜７０重量％、全粉乳：０〜２０重量％、ココアバター：０〜２５重量％、植物油脂：０〜２０重量％、砂糖：０〜４５重量％を配合して調製することができる。乳化剤、香料、乳酸菌末も適宜配合することができる。更に、食物繊維：０〜１５重量％、オリゴ糖０〜１０重量％も配合することができる。

また本発明のチョコレートは、シュガーレスチョコレートとすることもできる。その場合の配合は、乳酸菌末に加えて、糖アルコール：０〜５０重量％、カカオマス：０〜７０重量％、乳等を主原料とする食品：０〜２５重量％、植物油脂：０〜２５重量％、ココアバター：０〜２５重量％の範囲内で適宜変更できる。また、高甘味度甘味料、乳化剤、香料などの副原料も適宜追加することができ、それらの配合量も適宜調整することができる。さらに、食物繊維：０〜１５重量％、オリゴ糖０〜１０重量％を配合することができる。なお、使用できるオリゴ糖は、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、大豆オリゴ糖などがあるが、これらに限られない。

チョコレートは、原料であるカカオ豆を、選別、分離、焙炒、磨砕してカカオマスとし、カカオマスと、砂糖、粉乳、植物油脂、ココアバターおよび乳化剤の一部を原料混合機で混合し、リファイナーにより粒子が所定の大きさになる様に均一に微粒化し、精練（コンチング）し、精練の後半の段階で、香料と、残りの油脂類および乳化剤を添加してチョコレート生地を調製する。調製されたチョコレート生地には、乳酸菌を適宜加えることができる。

乳酸菌の例として、ラクトバチルス ブレビス、ラクトバチルス カゼイ シロタ、ラクトバチルス アシドフィルス Ｌ-９２、ラクトバチルス クレモリス、ラクトバチルス ヘルベティカス、ラクトバチルス サリバリウス、ラクトバチルス ガッセリ ＯＬＬ２７１６、ラクトバチルス ガッセリ ＰＡ-３、ラクトバチルス ガッセリ ＳＢＴ２０５５、ラクトバチルス ブルガリカス ＯＬＬ１０７３Ｒ-１、ラクトバチルス ファーメンタム、ラクトバチルス ロイテリ、ラクトバチルス クリスパータス、ラクトバチルス ユーグルティ、ラクトバチルス デルブルッキー サブスピーシーズ ブルガリカス ２０３８、ラクトバチルス デルブルッキー サブスピーシーズ デルブルッキー、ラクトバチルス ジョンソニー、ラクトバチルス プランタラム、などのラクトバチルス属菌、ストレプトコッカス サーモフィルス １１３１などのストレプトコッカス属菌、ビフィドバクテリウム ロンガム ＢＢ５３６、ビフィドバクテリウム ロンガム ＳＢＴ２９２８、ビフィドバクテリウム ラクティス ＧＣＬ２５０５、ビフィドバクテリウム ブレーベ、ビフィドバクテリウム インファンティス、ビフィドバクテリウム アドレスセンティス、ビフィドバクテリウム ビフィダム、ビフィドバクテリウム カテヌラータム、ビフィドバクテリウム シュードカテヌラータム、ビフィドバクテリウム アングラータム、ビフィドバクテリウム ガリカム、ビフィドバクテリウム アニマリス、などのビフィドバクテリウム属菌、エンテロコッカス フェカリス、エンテロコッカス フェシウム、エンテロコッカス ヒラエ、などのエンテロコッカス属菌、ラクトコッカス ラクチス サブスピーシーズ ラクチス、ラクトコッカス ラクチス サブスピーシーズ クレモリス、ラクトコッカス プランタラム、ラクトコッカス ラフィノラクチス、などのラクトコッカス属菌、ペディオコッカス ペントサセウス、ペディオコッカス ダムノサス、などのペディオコッカス属菌、ロイコノストック デキストラニウム、ロイコノストック シトロボラム、ロイコノストック メセンテロイデス、ロイコノストック ラクティスなどのロイコノストック属菌、などを挙げることができる。

中でも、本発明における乳酸菌として好ましくは、ラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属、エンテロコッカス属、ロイコノストック属であり、さらに好ましくは、ラクトバチルス ブレビス、ラクトバチルス アシドフィルス、ラクトバチルス ガッセリ、エンテロコッカス フェカリス、ビフィドバクテリウム ロンガム、ロイコノストック メセンテロイデスであるが、乳酸を生産する細菌であればこれに限定されない。

本実施形態の乳酸菌含有チョコレートは、好ましくは、生きた状態の乳酸菌を１×１０^４個／グラム以上含有し、さらに好ましくは、１×１０^４個／グラム以上１×１０^１２個／グラム以下で含有し、さらに好ましくは、１×１０^６個／グラム以上１×１０^１２個／グラム以下、さらには１×１０⁷個／グラム以上１×１０^１２個／グラム以下含有することが好ましい。

本実施形態の乳酸菌含有チョコレートは、２８℃で２ヶ月間保存後の乳酸菌の生菌率が５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上である。

本実施形態の乳酸菌含有チョコレートは、２５℃、相対湿度７５％で９８時間保存後のＥＲＨの変化率が５％以下、好ましくは３％以下、より好ましくは１％以下である。

また、本発明の一実施形態は、乳酸菌含有チョコレートの製造方法であって、原料の微粒化の際に平均粒子径を９μｍ未満、より好ましくは７μｍ未満まで微粒化することを特徴とする乳酸菌含有チョコレートの製造方法である。この際、固体粒子の平均粒子径の下限は特に限定されないが、好ましくは１μｍより大きく、より好ましくは５μｍより大きい。通常平均粒子径は、ロールリファイナーの制御や原料中の油脂量の調製により制御される。
本発明においては、目的の粒子径にできるのであれば、微粒化行程は特に限定されないが、リファイナー等の装置を使用した微粒化工程が挙げられる。

乳酸菌含有チョコレートにおいて、乳酸菌を加える工程は限定されない。たとえば、テンパリングの後であって、成型前のチョコレート生地に、乳酸菌末を加えることができる。また、乳酸菌末を高濃度でチョコレートと混合した乳酸菌高濃度含有チョコレートを製造し、乳酸菌高濃度含有チョコレートを、テンパリングの後であって、成型前のチョコレート生地に加えることができる。センター材を被覆する乳酸菌含有チョコレートの製造では、調温されたチョコレート生地に乳酸菌末を加え、これでセンター材を被覆することができる。

また、本発明の一実施形態は、本発明の乳酸菌含有チョコレートを含む食品である。その例として、フルーツ、ナッツ、穀類、グミ、キャンディなどを加えた乳酸菌含有チョコレート菓子、乳酸菌含有チョコレートを含む焼き菓子、スナック菓子、クッキー、ケーキ、アイスクリーム、飲料などを挙げることができる。

また本発明の乳酸菌含有チョコレートは、例えば、それ自体、又はそれに適当な風味を加えてドリンク剤、例えば清涼飲料、粉末飲料とすることもできる。具体的には、ジュース、牛乳、菓子、ゼリー等に混ぜて飲食することができる。また、このような食品を保健機能食品として提供することも可能である。この保健機能食品には、ビフィズス菌増殖や腸内フローラ改善等の用途に用いるものであるという表示を付した飲食品、特に、特定保健用食品、栄養機能食品等も含まれる。

［実施例１］
１．乳酸菌末の調製
乳酸菌末はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ（ラブレ菌）を使用することとした。通常の乳酸菌培養培地（ＭＲＳ培地等）を用いてラブレ菌を培養し、遠心分離等により集菌したものを凍結乾燥し粉砕する等して粉末にしたものにデンプンを加え、ラブレ乳酸菌末とした。

２．乳酸菌含有チョコレートの製造
砂糖、カカオマス、ココアバター、全粉乳又は牛乳、乳化剤、香料等を含むチョコレート生地１〜４を用意した。各チョコレート生地を４０℃で溶解して、乳酸菌末を高濃度に加えた、乳酸菌高濃度含有チョコレート１〜４を製造した。テンパリングが終了した各チョコレート生地１〜４に、対応する乳酸菌高濃度含有チョコレート１〜４を加えて混合し、冷却・固化し、それぞれ乳酸菌の数量が５×１０^７個〜５×１０^８個／グラムとなるように乳酸菌含有チョコレート１〜４を製造した。

４種類の乳酸菌含有チョコレート１〜４について、平均粒子径及び水分活性を表１に示す。なお、平均粒子径は島津製作所製レーザ回折式粒子径分布測定装置を用いて測定を行い、水分活性はロトロニック社製水分活性測定システムＡＷ−ラボを用いて測定を行った。

水分活性として示されるＥＲＨ（Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ Ｒｅｒａｔｉｖｅ Ｈｕｍｉｄｉｔｙ：平衡相対湿度）は測定対象物を入れた密閉容器内にて対象物と環境間で平衡に達した時の水蒸気圧とその温度における飽和水蒸気圧の比であり、食品の保存性の指標とされる水分活性（ＡＷ）の１００倍の値となる。

平均粒子径の具体的な測定方法は乳酸菌含有チョコレート０．５ｇをイソプロパノール１０ｍＬに入れ、５０℃の湯煎で１０分間撹拌しながら溶かし、測定波長６８０ｎｍの吸光度が０．１〜０．２になるようにイソプロパノールで希釈したサンプルを、レーザ回折式粒子径分布測定装置にて測定する。なお、ラブレ菌は乳酸菌含有チョコレート中において、粒子径約２〜４μｍの棍棒状の形状をとっているが、チョコレート１ｇあたりに配合する菌数では粒子径分布にほとんど影響を及ぼさない（図１及び２参照）。

乳酸菌含有チョコレート１〜４について、２８℃の恒温室に保管し、製造時から２ヶ月間の安定性試験を実施した。製造時、１ヶ月時、２ヵ月時の乳酸菌の生菌数試験を実施した結果を表２に示す。また、製造時の生菌数を１００％とした生菌残存率を表３に示す。

この結果より、チョコレートが含有する固体粒子の平均粒子径が、比較的小さい乳酸菌含有チョコレート１〜３は、粒子径の大きい乳酸菌含有チョコレート４に比べ、格段に乳酸菌の残存率が高くなっていることがわかる。

乳酸菌の安定性はその食品に含まれる水分の影響が大きく、通常、水分活性が高い食品中では乳酸菌を生きた状態で長期間保つことは困難である。乳酸菌含有チョコレート１及び３については、水分活性ＥＲＨが約４０％と高い状態にもかかわらず、乳酸菌の残存率は高かった。チョコレートの水分活性は原料や製法によってはコントロールすることが難しいことが知られている。

本実施例により、チョコレートの粒子径を小さくすることにより、水分活性が比較的高いチョコレートであっても長期間生きた状態の乳酸菌を含有する乳酸菌含有チョコレートを製造できるといえる。

［実施例２］
乳酸菌チョコレートの固体粒子の粒子径分布の検討
実施例１で作成した乳酸菌含有チョコレート１の固体粒子の粒子径分布を図１に示す。図１の粒子径分布は、単一のピークになっている。

チョコレート生地の固体粒子の粒子径分布と、水分活性の相関について検討を行った。粒子径分布が異なるチョコレート生地を４種類用意した（チョコレート生地１〜４）。それぞれの生地中の固体粒子の粒子径分布は図２のとおりであった。これらのチョコレート生地を２５℃７５％ＲＨ（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｈｕｍｉｄｉｔｙ：相対湿度）の条件で９８時間保管した際の経時的な水分活性の上昇を観察した。経時的なＥＲＨ変化量（％）の結果を図３に示す。チョコレート生地１、２は粒子径分布が単一の分布ピークを示し、一方、３、４は２つのピークを示した。また、チョコレート生地３、４はチョコレート生地１、２と比較して、ＥＲＨ変化量が大きかった。

この結果から、チョコレート生地に含まれる固体粒子の粒子径分布が１つのピークになっているチョコレート生地はＥＲＨの上昇スピードが遅いことがわかる。乳酸菌の安定性はＥＲＨが高くなるにつれて悪くなり、チョコレート生地自体のＥＲＨ上昇を抑えることは、生きた状態の乳酸菌を保つ上で重要である。本実施例から、チョコレートに含まれる固体粒子の粒子径分布を単一の分布ピークにすることで、より安定した乳酸菌含有チョコレートとなることが示された。

以降は、乳酸菌含有チョコレートの製造の例と、その有用性について示す参考例であって、本発明の一部を構成するものではない。

［参考例１］乳酸菌含有チョコレート（ラブレ菌）
１．乳酸菌末の調製
乳酸菌末はラクトバチルス属 ブレビス種のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ（ラブレ菌）を使用した。一般的な乳酸菌培養培地（ＭＲＳ培地等）を用いてラブレ菌を培養し、遠心分離等により集菌したものを凍結乾燥し粉砕する等して粉末にしたものにデンプンを加え、乳酸菌末とした。なお、この乳酸菌末は、生きた状態の乳酸菌を、１×１０^５個／グラム以上１×１０^１３個／グラム以下で含有することが望ましく、さらには、１×１０^７個／グラム以上1×１０^１３個／グラム以下、さらには１×１０^８個／グラム以上1×１０^１３個／グラム以下含有することが好ましい。

２．乳酸菌含有チョコレートの製造
一般的にチョコレートは、原料であるカカオ豆を、選別、分離、焙炒、磨砕してカカオマスとし、カカオマスと、砂糖、粉乳、植物油脂、ココアバターおよび乳化剤の一部を原料混合機で混合し、リファイナーにより粒子が所定の大きさになる様に均一に微細化し、精練（コンチング）し、精練の後半の段階で、香料、乳酸菌末と、残りのココアバターおよび乳化剤を添加してチョコレート生地を調製する。このチョコレート生地は場合により、４５〜５０℃程度で、平均４日程度タンクに貯蔵される。この貯蔵は、製造ラインの稼動の都合により生じる、いわば待ち時間である。その後、２８〜３０℃程度に調温しテンパリングされ、その後に、成型用の型に充填し、冷却・固化させ、型抜し、得られたチョコレートを包装・検査し、熟成を経て出荷される。

この製造方法を元に、従来製法（香料などの添加と同じタイミングで乳酸菌末を添加する）、製法１、製法２により、乳酸菌末を添加して、乳酸菌含有チョコレートを製造した。それぞれの製法について、図４Ａに概略を示す。

従来製法
精練ののち４５〜５０℃になったチョコレート生地に乳酸菌末を加え、その後、４日間の貯蔵を経て、テンパリング、成型などを行った。

製法１
テンパリングが終了したチョコレート生地（２７〜３１℃）に、乳酸菌末を加えた。なお、この乳酸菌含有チョコレート中には、生きた状態の乳酸菌を、１×１０^５個／グラム以上１×１０^１２個／グラム以下含有させることが好ましく、さらには１×１０^７個／グラム以上１×１０^１２個／グラム以下、さらには１×１０^８個／グラム以上１×１０^１２個／グラム以下含有させることが好ましい。

製法２
あらかじめ、チョコレート生地を４０℃で溶解して、乳酸菌末を高濃度に加えた、乳酸菌高濃度含有チョコレートを製造した。なお、この乳酸菌高濃度含有チョコレート中には、生きた状態の乳酸菌を、１×１０^５個／グラム以上１×１０^１２個／グラム以下含有させることが好ましく、さらには１×１０^７個／グラム以上１×１０^１２個／グラム以下、さらには１×１０^８個／グラム以上１×１０^１２個／グラム以下含有させることが好ましい。テンパリングが終了したチョコレート生地を２７〜３１℃にし、乳酸菌高濃度含有チョコレートを加えて混合した。

上記のいずれの製法においても、表４のミルクチョコレートの配合に従って製造を行った。

上記いずれの製法でも、乳酸菌含有チョコレートを製造することができた。なお、製法２を用いた場合、製造ラインにおいて乳酸菌が飛散し汚染されてしまうのを防ぐことができるため、製造管理の観点からは製法２はより好ましい。また、製法２の方法によれば、乳酸菌をより短時間で均一にチョコレート生地に混合することができる。

なお、乳酸菌含有チョコレートの配合は、乳酸菌末に加え、カカオマス：０〜７０重量％、全粉乳：０〜２０重量％、ココアバター：０〜２５重量％、植物油脂：０〜２０重量％、砂糖：０〜４５重量％の範囲内で適宜変更することができる。また、乳化剤、香料などの副原料も適宜追加することができ、それらの配合量も適宜調整することができる。さらに、食物繊維：０〜１５重量％、オリゴ糖０〜１０重量％を配合することもできる。

３．乳酸菌含有チョコレートの人工胃液耐性試験
製法２に基づいて乳酸菌末が０．２５重量％となるように乳酸菌含有チョコレートを作製した。すなわち、配合は表４に従い、乳酸菌末の含有割合のみ変更した。これを試料として、以下の手順に基づいて人工胃液耐性試験を行った。

（１）所定のｐＨに調整し、０．０４％ペプシンを添加したＭＲＳ培地を人工胃液とした（非特許文献１に従った）。培地は３００ｍｌとした。上記の人工胃液を希塩酸でｐＨ２．５に調整した。胃酸の主成分は塩酸のため、それ以外の酸は使用していない。

（２）チョコレート１粒（２グラム）を３７℃に保温した人工胃液に浸し、液面が軽くゆれる程度に振盪し、３０分、１時間、２時間後に、人工胃液１ｍｌを取り、含まれる生菌数を測定した。生菌数の測定方法は、乳酸菌生菌数の経時試験と同様である。なお、最大で２時間としたのは、通常、胃内の消化物が完全に十二指腸に移送されるのにかかる時間が約２時間であるためである。また、対照として、ラブレ菌を含有する乳酸菌含有飲料についても、人工胃液内添加時の生菌数が乳酸菌含有チョコレートと同程度になるように添加量を適宜調整し、同様に実験を行った。

（３）結果
異なる日時に、３回同様の実験を行ったので、それらの結果を表５に示す。これらをグラフで示した結果を図５に示す。なお、第３回目の実験においては、ラブレ菌を含有する乳酸菌含有飲料を２種類用いて比較対照とした。

乳酸菌含有チョコレートの人工胃液耐性試験の結果から、おどろくべきことに、製法２により作製した乳酸菌含有チョコレートは、人工胃液中での乳酸菌の生存率が非常に高く、その生存率は、対照としている乳酸菌飲料よりもはるかに高いことが分かった。

４．乳酸菌含有チョコレートと乳酸菌末の人工胃液耐性の比較試験
乳酸菌含有チョコレートの人工胃液耐性試験と同様に、製法２に基づいて乳酸菌末が０．２５重量％となるように作製された乳酸菌含有チョコレートと、乳酸菌末そのものを用いて、乳酸菌含有チョコレートの人工胃液耐性試験と同様に、人工胃液耐性試験を行った。
ただし、対照として、乳酸菌末を用い、人工胃液内添加時の生菌数が乳酸菌含有チョコレートと同程度になるように適宜調整し、同様に実験を行った。
結果を表６に示す。グラフで示した結果を図６に示す。

本参考例の人工胃液耐性試験においては、本発明の乳酸菌含有チョコレートにおける、３０分、１時間、２時間経過時の乳酸菌の生存率、すなわち人工胃液耐性が、乳酸菌末よりも、はるかに高いことが分かった。

５．乳酸菌含有チョコレート中の乳酸菌生菌数の経時試験
乳酸菌含有チョコレートの人工胃液耐性試験と同様に、製法２に基づいて、チョコレート中に乳酸菌末が０．２５重量％となるような乳酸菌含有チョコレートを作製した。

この乳酸菌含有チョコレートの製造直後、あるいは、室温（約１８℃）で１ヶ月から１４ヶ月保存した試料中の乳酸菌生菌の数を以下の方法により調べた。対照として、乳酸菌を含有したソフトキャンディについても同様の実験を行った。

（１）試料を１欠片もしくは約１ｇをとり、質量を精密に量り、希釈液１００ｍｌに入れて強く振り混ぜ、均一に懸濁したものを試料原液とした。試料原液１ｍｌを別に分注した希釈液９ｍｌ中に加えて１０倍希釈した。同様の操作を繰り返し、試料溶液とした。
（２）試料溶液１ｍｌ以下の適量を２枚のペトリ皿に分注し、５０℃に保ったＭＲＳ寒天培地を加えて混和し、固化させた。
（３）固化後、３５〜３７℃で４８〜７２時間嫌気培養して、出現した集落数を数え、平均集落数を求めた。
（４）試料１ｇ中の生菌数（ＣＦＵ）を下記の計算式より求めた。
生菌数（ＣＦＵ／ｇ）＝平均集落数（ＣＦＵ）×希釈倍率×試料原液（ｍｌ）／試料溶液添加量（ｍｌ）／試料採取量（ｇ）
（５）結果
実験は室温（約１８℃）で行われた。結果を表７に示す。

なお、乳酸菌含有ソフトキャンディについて、同様に乳酸菌数の経時試験を行ったところ、表８の通りであった。

ソフトキャンディでは、製造後１ヶ月後で大部分の乳酸菌が死滅しており、２ヵ月後には生菌がほとんどいなかった。残存率は製造から１ヶ月、２ヵ月後いずれも、ほぼ０％といえる。それと比較し、乳酸菌を含有するチョコレートでは、極めて安定的に乳酸菌の生菌状態を維持することができた。また、室温（約１８℃）下で製造１４ヶ月後のサンプルの結果を見ると、乳酸菌の安定性が良好なことから、室温下にて、１年間は、乳酸菌の生菌状態を保証できる。

６．各製法で作製された乳酸菌含有チョコレートに含まれる乳酸菌数の比較
従来製法、製法１、製法２でそれぞれ製造された、乳酸菌含有チョコレートの１グラム当たりの乳酸菌数を測定した。添加した乳酸菌末に含まれる乳酸菌数から算出される乳酸菌理論値と、実測値を表９に示す。

従来製法の菌数は製造工程による菌の失活により乳酸菌数が低下した。製法１および製法２では、工程における失活を防ぐことができ、従来製法と比較すると約５倍の乳酸菌数の差が出ることから、生きて腸に届く菌数を増加させる優れた製法であると言える。なお、製法２の製造過程で製造された、乳酸菌末を約１．４×１０^９個／グラム含有する乳酸菌高濃度含有チョコレートについて、４５℃下で２日間放置した後の乳酸菌の生菌数を、同様の方法にて測定した結果、約１．３×１０^９個／グラム、とほとんど変化していなかった。このことから、従来製法における乳酸菌数の減少は、単に熱によるものとは言えず、貯蔵時における長時間の撹拌や、テンパリング操作などが菌数の減少に影響していることが考えられる。

７．各製法で作製された乳酸菌含有チョコレートの人工胃液耐性試験
従来製法、製法１、製法２に基づき作製した乳酸菌含有チョコレートを用いて、乳酸菌含有チョコレートの人工胃液耐性試験と同じ手順で人工胃液耐性試験を行った。

結果
各製法により、製造時菌数が異なることから、各製法の製造時菌数を１００％とし、残存率として表した結果を表１０に示す。

以上の結果より、おどろくべきことに、製法１、製法２で作られた乳酸菌含有チョコレートは人工胃液耐性試験において、従来製法よりも乳酸菌の残存率が高い結果が得られた。従って、製法１、製法２は胃酸に対する耐性においても、優れた製造方法であることが分かった。

以上、本参考例における結果から、おどろくべきことに、本発明による乳酸菌含有チョコレートの製造方法は、簡便な方法でありながらも製造時における菌数を高く維持することに非常に優位な方法であり、乳酸菌飲料等よりも胃酸に対する耐性が高く、さらに従来の製法により製造される乳酸菌含有チョコレートよりも耐酸性が高い非常に優れた製造方法であることが分かった。また、その製造方法によりつくられる乳酸菌含有チョコレートは、プロバイオティクスの効果をより高めたチョコレートであり、嗜好性が高く、かつ健康を維持する有用性の高い食品になることが分かった。

［参考例２］ 乳酸菌含有チョコレート（ラブレ菌以外の乳酸菌）
１．乳酸菌含有チョコレートの製造
表４の配合で製法２に基づいて、ラブレ菌を、その他の乳酸菌、すなわち、ラクトバチルス アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス ガッセリ （Lactobacillus gasseri）、エンテロコッカス フェカリス（Enterococcus faecalis）、ビフィドバクテリウム ロンガム（Bifidobacterium longum）あるいはロイコノストック メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）に変えて、乳酸菌末がロイコノストック メセンロイデスは０．５重量％、その他の４種の菌は０．２５重量％となるように乳酸菌含有チョコレートを製造した。

２．乳酸菌含有チョコレート中の乳酸菌生菌数の経時試験
製造された乳酸菌含有チョコレートについて、参考例１の乳酸菌含有チョコレート中の乳酸菌生菌数の経時試験と同様に、乳酸菌含有チョコレートの製造直後、あるいは、室温約１８℃〜約２５℃で１ヶ月から３ヶ月保存した試料中の乳酸菌生菌の数を調べた。結果は次の表１１のとおりであった。各種菌を含有するチョコレートにおける製造後３ヶ月後の各種菌について、極めて安定的に生菌状態を維持できることが分かった。

３．乳酸菌含有チョコレートの人工胃液耐性試験
製造された乳酸菌含有チョコレートについて、参考例１と同様に乳酸菌含有チョコレートの人工胃液耐性試験を行った。また、対照として、それぞれの菌末についても、同様に実験を行った。結果は次の表１２のとおりであった。乳酸菌末と比較して、各種菌含有チョコレートにおける乳酸菌の人工胃液耐性がはるかに高いことが分かった。

［参考例３］ 乳酸菌含有アーモンドチョコレート
１．乳酸菌含有アーモンドチョコレートの製造
乳酸菌としてラブレ菌を使用し、ラブレ菌末は参考例１と同様に調製した。配合割合は以下の表１３のとおりである。製法の概略は図４Ｂに示すとおり、４２℃から４３℃で貯蔵されたチョコレート生地を３７℃から３８℃に調温したところに、乳酸菌末を加え、アーモンドのチョコ掛けに用いた。なお、乳酸菌含有アーモンドチョコレートの配合は、乳酸菌末に加え、砂糖：０〜４５重量％、全粉乳：０〜２０重量％、カカオマス：０〜７０重量％、ココアバター：０〜２５重量％、植物油脂：０〜２０重量％の範囲内で適宜変更することができる。また、乳化剤、香料などの副原料も適宜追加することができ、それらの配合量も適宜調整することができる。さらに、食物繊維：０〜１５重量％、オリゴ糖０〜１０重量％を配合することもできる。センター材の種類はアーモンドに限られず適宜変更でき、またセンター材の配合量も適宜調整することができる。
ョコレートにおける乳酸菌の人工胃液耐性がはるかに高いことが分かった。

２．乳酸菌含有アーモンドチョコレート中の乳酸菌生菌数の経時試験
製造された乳酸菌含有アーモンドチョコレートについて、参考例１の乳酸菌含有チョコレート中の乳酸菌生菌数の経時試験と同様に、乳酸菌含有アーモンドチョコレートの製造直後、あるいは、室温（約１８℃）で３ヶ月から７ヶ月保存した試料中の乳酸菌生菌の数を調べた。結果は次の表１４のとおりであり、極めて安定的に生菌状態を維持できることが分かった。

３．乳酸菌含有アーモンドチョコレートの人工胃液耐性試験
製造された乳酸菌含有アーモンドチョコレートについて、参考例１と同様に乳酸菌含有アーモンドチョコレートの人工胃液耐性試験を行った。結果は次の表１５のとおりである。対照として、乳酸菌末についても、同様に実験を行った。乳酸菌末と比較して、乳酸菌含有アーモンドチョコレートにおける乳酸菌の人工胃液耐性がはるかに高いことが分かった。

［参考例４］ 乳酸菌含有シュガーレスチョコレート
本参考例では、製法２に基づいて、次の表１６の配合で、乳酸菌含有シュガーレスチョコレートを製造した。

乳酸菌含有シュガーレスチョコレートにおいても、乳酸菌の経時変化試験、人工胃液耐性試験において、参考例１とほぼ同様の経時安定性および人工胃液耐性を示した。
なお、乳酸菌含有シュガーレスチョコレートの配合は、乳酸菌末に加え、糖アルコール：０〜５０重量％、カカオマス：０〜７０重量％、乳等を主原料とする食品：０〜２５重量％、植物油脂：０〜２５重量％、ココアバター：０〜２５重量％の範囲内で適宜変更できる。また、高甘味度甘味料、乳化剤、香料などの副原料も適宜追加することができ、それらの配合量も適宜調整することができる。さらに、食物繊維：０〜１５重量％、オリゴ糖：０〜１０重量％を配合することができる。なお、使用できるオリゴ糖は、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、大豆オリゴ糖などがあるが、これらに限られない。

［参考例５］ 乳酸菌含有油脂組成物
１．乳酸菌含有油脂組成物の製造
参考例１と同様に調製されたラブレ菌末を用い、乳酸菌含有油脂組成物を製造した。配合量は以下の表１７のとおりである。製法の概略は図４Ｃに示す。この乳酸菌含有油脂組成物は、常温（２５℃）付近では固体であるが、ヒトの体温付近（３５℃〜４０℃）では液状になり、ハンドクリームのような物性をもつ。
なお、乳酸菌含有油脂組成物の配合は、乳酸菌末に加え、砂糖：０〜８０重量％、植物油脂：２０〜９９重量％、全粉乳：０〜４０重量％、乳糖：０〜２０重量％の範囲内で適宜変更できる。また、高甘味度甘味料、乳化剤、香料などの副原料も適宜追加することができ、それらの配合量も適宜調整することができる。さらに、食物繊維：０〜１５重量％、オリゴ糖：０〜１０重量％を配合することができる。なお、この乳酸菌含有油脂組成物は、ホワイトチョコレート、もしくはホワイトチョコレートに類似した組成物であり、焼き菓子やチョコレートなどの食品へのコーティングやトッピング、デコレーション用材料などとして使用することができるが、これに限らない。

２．乳酸菌含有油脂組成物中の乳酸菌生菌数の経時試験
製造された乳酸菌含有油脂組成物について、参考例１の乳酸菌含有チョコレート中の乳酸菌生菌数の経時試験と同様に、乳酸菌含有油脂組成物の製造直後、あるいは、室温（約２５℃）で１ヶ月から２ヶ月保存した試料中の乳酸菌生菌の数を調べた。結果は次の表１８のとおりであり、極めて安定的に生菌状態を維持できることが分かった。

３．乳酸菌含有油脂組成物の人工胃液耐性試験
製造された乳酸菌含有油脂組成物について、参考例１と同様に乳酸菌含有油脂組成物の人工胃液耐性試験を行った。結果は次の表１９のとおりであった。対照として、乳酸菌末についても、同様に実験を行った。乳酸菌末と比較して、乳酸菌含有油脂組成物における乳酸菌の人工胃液耐性がはるかに高いことが分かった。

Claims (7)

1. 生きた状態の乳酸菌を含有する乳酸菌含有チョコレートであって、該乳酸菌含有チョコレート中の固体粒子の平均粒子径が５μｍより大きく７μｍ未満であり、かつ、粒子径が単一の分布ピークを有することを特徴とする、乳酸菌含有チョコレート。
2. 乳酸菌が、ラクトバチルス属、エンテロコッカス属、ビフィドバクテリウム属、あるいはロイコノストック属からなる群から選ばれるいずれか１種以上である、請求項１に記載の乳酸菌含有チョコレート。
3. 乳酸菌がラクトバチルス属ブレビス種である請求項１に記載の乳酸菌含有チョコレート。
4. 乳酸菌を１×１０^４個／グラム以上１×１０^１２個／グラム以下で含有することを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の乳酸菌含有チョコレート。
5. 乳酸菌を１×１０^６個／グラム以上１×１０^１２個／グラム以下で含有することを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の乳酸菌含有チョコレート。
6. 請求項１から５のいずれか１項に記載の乳酸菌含有チョコレートを含む食品。
7. 原料の微粒化の際に、平均粒子径が５μｍより大きく７μｍ未満となるように、かつ、粒子径が単一の分布ピークを有するように微粒化することを特徴とする乳酸菌含有チョコレートの製造方法。