CN116529366A - 脂肪包封的微生物培养物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物培养物的包封，以提高储存时的稳健性和稳定性。特别地，本发明涉及微生物培养物如乳酸菌(LAB)的干制剂，其包被有脂肪基质，该脂肪基质增加在环境温度下储存延长的时间时的存活率并减轻后酸化。

Description

脂肪包封的微生物培养物
技术领域
本发明涉及微生物培养物的包封，以提高储存时的稳健性和稳定性。特别地，本发明涉及微生物培养物如乳酸菌(LAB)的干制剂，其包被有脂肪基质，该脂肪基质增加在环境温度下储存延长时间的存活率并减轻后酸化。
背景技术
大多数旨在用于消费的商品的重要特征是储存时的稳定性。保质期短或储存条件苛刻的商品难以处理，因此从商业或消费者的角度来看，不如更耐用的商品有吸引力。影响预期保质期和消费产品安全性的单个最重要的因素是不需要的微生物的存在。因此，冷冻储存是许多产品防止污染和相关健康风险的要求。
与不需要的微生物相比，微生物培养物如乳酸菌(LAB)，也可以在发酵乳制品和饮料中发挥有益的作用，因为它们可以帮助改善营养和感官特征，以及延长保质期。据报道，LAB的一些菌株表现出对人类和动物的健康益处，因此可以被称为益生菌菌株。这些益生菌通常作为粉组合物单独提供，例如作为冻干(FD)粉，并与另外的成分混合以产生最终产品。微生物培养物的添加通常在巴氏杀菌之后完成，以保持有益微生物培养物的活力。
巴氏杀菌旨在破坏或灭活导致腐坏或疾病风险的生物体和酶。然而，由于巴氏杀菌不是灭菌，它不会杀死细菌孢子，这就是为什么冷藏是必要的，以避免不需要的微生物的萌发。然而，冷藏非常昂贵、耗能，并且在一些情况下在发展中国家或无法进行冷运输的偏远地区是不可行的。此外，最终产品可能是在冷藏条件下不易储存的物品。
为了避免冷藏，可以进行第二步巴氏杀菌，以通过使从初始巴氏杀菌阶段到产品成型阶段可能在产品中萌发的任何微生物惰性，来延长产品的预期保质期。因此，许多消费产品，如乳制品，可以通过在酸化(发酵)结束时进行第二步巴氏杀菌来延长其保质期。这些产品被称为后巴氏杀菌产品，包括例如后巴氏杀菌酸奶(PPY)。不幸的是，没有多少微生物培养物(如乳酸菌)能够在后巴氏杀菌步骤中存活，这使得通过添加益生菌以及发酵剂在无显著损失细胞计数的情况下来递送足够数量的活益生菌非常具有挑战性。
从健康的角度，后巴氏杀菌产品中的活益生菌是需要的，实现这一点的技术方案是在后巴氏杀菌的步骤之后通过无菌在线混合来添加益生菌。然而，这种技术方案需要大量投资，涉及对现有生产线的改造，这使得在许多情况下是不可行的。
维持益生菌活力的另一个挑战涉及乳制品的后酸化。发酵剂在储存过程中倾向于由乳糖中产生乳酸。这种情况即使在冷藏温度下也会发生，并导致所谓的后酸化现象。益生菌也是如此，尽管比例较低。酸性环境对益生菌的活力具有负面影响，而且损害消费者体验。
因此，通过将微生物培养物直接引入现有生产线中，使得在后巴氏杀菌的产品中能够利用微生物培养物的方案将是有利的。具体地，提供一种微生物培养物，其能够(i)在后巴氏杀菌步骤中保持活力以及(ii)在环境条件下货架储存期间不显示显著的后酸化。
发明内容
本发明涉及将微生物培养物包封在脂肪基质中。特别地，本发明公开了用于制备具有脂肪保护包衣的干微生物培养物的方法，该脂肪保护包衣使微生物培养物在后巴氏杀菌步骤期间以及随后在环境温度下的整个储存过程中保持活力。针对必须在巴氏杀菌步骤之前添加微生物培养物的应用，脂肪包封的微生物培养物构成了改善的生物相容性选择。
因此，本发明的目的涉及提供用于制备微生物培养物的方法，该微生物培养物可以直接用于需要后巴氏杀菌的现有生产线中。
特别地，本发明的目的是提供一种改善的干微生物培养物，其在后巴氏杀菌和在环境温度下储存时保持细胞活力。
因此，本发明的方面涉及一种脂肪包封的微生物培养物，其包含：
i)包含微生物培养物的制剂，以及
ii)包含一种或多种脂肪组分的包封基质，脂肪组分中的每一种具有熔点为至少25℃。
本发明的另一方面涉及一种包含本文所述的脂肪包封的微生物培养物的组合物。
本发明的又一方面涉及一种包含本文所述的脂肪包封的微生物培养物或组合物的乳制品。
本发明的再一方面涉及一种用于制备本文所述的脂肪包封的微生物培养物或组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
i)提供包含微生物培养物的制剂，
ii)提供包封基质，以及
iii)将包封基质与制剂混合以形成微囊化微生物培养物，
其中包封基质包含一种或多种脂肪组分，脂肪组分中的每一种具有熔点为至少25℃。
本发明的进一步的方面涉及一种可通过本文所述方法获得的本文所述的脂肪包封的微生物培养物或组合物。
本发明的更进一步的方面涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物或组合物在选自由以下组成的组的产品中的用途：饲料、植物保健品、食品、饮料和/或药物产品。
本发明的再进一步的方面涉及一种用于制备后巴氏杀菌酸奶(PPY)的方法，所述方法包括以下步骤：
i)提供pH在4.0-4.6范围内的酸奶，
ii)向酸奶中添加本文所述的脂肪包封的微生物培养物或组合物，以及
iii)后巴氏杀菌步骤ii)的酸奶。
附图说明
图1显示了在5℃或25℃下储存56天期间，在pH 4.5后巴氏杀菌酸奶模型中“游离”和“微囊化(ME)”冻干LGG的细胞活力(CFU/g)的Log10损失。
图2显示了在5℃或25℃下储存56天期间，在pH 4.5后巴氏杀菌酸奶模型中“游离”和“微囊化(ME)”冻干LGG的pH测量。
下面将更详细地描述本发明。
具体实施方式
定义
在更详细地概述本发明之前，首先定义一组术语和惯例：
微生物培养物
在本上下文中，术语“微生物培养物”是指微生物种群。微生物包括所有单细胞生物，如古细菌和细菌，但也包括许多多细胞生物，如真菌和藻类。本文所指的微生物培养物不包括导致腐坏或疾病风险的不需要的微生物。
益生菌培养物
在本上下文中，术语“益生菌”或“益生菌培养物”是指当以活细胞的形式由人类或动物摄取时，例如通过抑制胃肠道中的有害微生物、增强免疫系统或促成营养物的消化，赋予改善的健康状况的微生物培养物。益生菌还可以施用于植物。益生菌培养物可以包含细菌和/或真菌。
乳酸菌(LAB)
在本上下文中，术语“乳酸菌(LAB)”是指一组革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、非运动性、微需氧或厌氧细菌，其发酵糖以及产生酸，包括乳酸(作为主要产生的酸)、乙酸、甲酸和丙酸。工业上最有用的乳酸菌包括但不限于乳杆菌属物种(Lactobacillus speciesspp.)、乳球菌属(Lactococcus spp.)、链球菌属(Streptococcus spp.)、明串珠菌属(Leuconostoc spp)、片球菌属(Pediococcus spp.)、短杆菌属(Brevibacterium spp)、肠球菌属(Enterococcus spp.)和丙酸杆菌属(Propionibacterium spp.)。此外，属于严格厌氧菌组的产乳酸细菌，双歧杆菌(Bifidobacteria)，即，双歧杆菌属(Bifidobacteriumspp.)，经常单独使用或与乳酸菌组合用作食品发酵剂，通常包括在乳酸菌组中。甚至葡萄球菌属(Staphylococcus)的某些细菌(例如，肉葡萄球菌(S.carnosus)、马胃葡萄球菌(S.equorum)、鼠葡萄球菌(S.sciuri)、小牛葡萄球菌(S.vitulinus)和木糖葡萄球菌(S.xylosus))被称为LAB(Seifer和Mogensen(2002))。
脂肪包封
在本上下文中，术语“脂肪包封的”是指含有包衣或层的实体，其将其与周围环境隔离开来。因此，脂肪包封的微生物培养物是被划分为彼此分离的不同实体的微生物培养物以及它们分散到其中的培养基。
包封基质
在本上下文中，术语“包封基质”是指包围微生物培养物的包衣或层。包衣或层包含至少一种脂肪组分，但也可以包含选自其他类别的组分，如乳化剂。优选地，包封基质的所有组分都是食品级的，如公认安全(GRAS)成分。
脂肪组分
在本上下文中，术语“脂肪组分”是指可溶于非极性溶剂并在室温下处于固态或半固态的化合物或化合物的混合物。脂肪组分可以是单甘油酯、甘油二酯和甘油三酯、磷脂、甾醇、蜡或游离脂肪酸，或其混合物。具体地，甘油酯是由甘油和脂肪酸形成的酯。优选地，脂肪组分包含大量熔点高于室温的脂肪酸。
重要的是，本文所指的脂肪组分不同于大多数在室温下为流体的油。
脂肪酸
在本上下文中，术语“脂肪酸”是指包含长脂肪族碳链的羧酸。链可以具有不同的长度，并且是饱和的或不饱和的。脂肪酸可以是不同程度的饱和，这意味着它们按饱和度递减的顺序包含例如，1、2、3、4、5或6个双键。通常，更长的链长和增加的饱和度提高了脂肪酸及其衍生物的熔点。
因此，优选的脂肪组分包含具有高度饱和度和/或长碳链长度的脂肪酸。这些包括但不限于癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、二十四烷酸、蜡酸、反油酸、异油酸、芥酸和羟基硬脂酸。
互酯化油
在本上下文中，术语“互酯化油”是指其中脂肪酸通过断裂和重组连接脂肪酸与甘油的酯键而已经重排的脂肪组分。这通常是通过使用催化剂来完成的。互酯化可以通过将液态油与固体脂肪结合用于提高液态油的熔点。
术语“互酯化油”可以与术语“互酯化脂肪”互换使用。
熔点
在本上下文中，术语“熔点”是指物质(如脂肪组分)将其状态从固体变为液体的温度。本文熔点规定为1个大气压的标准压力。
本文所指的熔点为滑动熔点。脂肪组分的滑动熔点可以通过AOCS Cc3-25中所述的标准方法测量。
乳化剂
在本上下文中，术语“乳化剂”是指通过帮助两种液体混合来稳定乳液的物质。乳化剂是通常具有极性或亲水部分和非极性或疏水部分的化合物。乳化剂的实例包括但不限于单甘油酯、甘油二酯、甘油三酯、卵磷脂、乳蛋白、树胶及其组合。
活力
在本上下文中，术语“活力”是指培养物中的活细胞。因此，可以通过测量菌落形成单位(CFU)的数量来测定细胞培养物的活力。CFU是指在培养基的板上生长的任何微生物的单个菌落的数量。该值反过来表示在板上具有成形的菌落时能够复制的细菌或真菌的数量。
简言之，CFU/g可以测定如下：使用拍打式均质器(stomacher)，用特定体积的稀释剂(1:100)将已知量的样本(例如，冻干的样本)均质化，然后通过使用涡旋混合器重悬溶液，并在蛋白胨盐水稀释剂(也称为“最大复壮稀释液(MRD)”)中进行十进制稀释。MRD包含蛋白胨、NaCl和去矿物质水。将稀释液倒在板上，与MRS琼脂(Hi-media，M641)混合并在37℃下孵育直至可见菌落生长。孵育后，人工计数菌落。对于脂肪包被的样本，样本通常在包含MRD与聚山梨酸酯80(也可以称为吐温80)的稀释剂中在40℃下孵育30分钟，以确保细胞从基质中完全释放。
水活度
在本上下文中，术语“水活度”是指物质中水的部分蒸汽压除以水的标准状态部分蒸汽压。水活度表示为Aw。具体地，食品的Aw是当与周围空气介质处于完全不受干扰的平衡时，脂肪包封的微生物培养物本身的蒸汽压与相同条件下蒸馏水的蒸汽压之间的比例。
一般来说，水从高Aw区域迁移到低Aw区域。食品的储存稳定性通常可以通过配制低Aw的产品来延长。
使用带有HC2-AW探头的Rotronics水活度分析仪测量水活度。该探头配备有WA-1/Pt-100、1/3DIN B类湿度传感器，并且湿度计算通过露点或霜点法完成。
简言之，将样本放入样本杯中，并填充至边缘3mm以内，同时确保容器中的空气尽可能少，以确保更快的平衡时间。接下来，将测量头放置在样本架上，确保紧密密封。使用Rotronic水活度分析仪的预测模型测量水活度。
使用以下公式计算水活度：Aw＝p/ps和％ERH＝100X Aw，其中，p＝产品表面水蒸汽分压；ps＝产品温度下饱和蒸汽/高于纯水的水蒸汽分压；ERH＝平衡相对湿度。
储存稳定性
在本上下文中，术语“储存稳定性”是指产品部分在25℃的温度下延长时间至少2周，如至少4周，优选至少6周，更优选至少8周时，脂肪包封的微生物培养物保持活力的能力。
储存稳定性可以通过分析活微生物细胞的计数如何随时间发展来确定。如本文所述，通过测定CFU/g来测量微生物培养物的活力。因此，产品中脂肪包封的微生物培养物的储存稳定性的测量可以通过评估在时间点0(恰好在后巴氏杀菌之后)以及随后在加速储存条件下储存的任何时间点，如2周、4周、6周或8周后，产品中脂肪包封的微生物培养物的CFU/g来确定。
疏水包衣
在本上下文中，术语“疏水包衣”是指位于脂肪包封的微生物培养物表面的疏水层或壳。此种疏水层或壳可以包含一种或多种疏水化合物或分子，这些疏水化合物或分子包含增加脂肪包封的微生物培养物的外表面的疏水性的疏水部分。
饲料
在本上下文中，术语“饲料”是指给予家畜的食物。家养动物包括但不限于宠物，如狗、猫、兔子、仓鼠等，牲畜，如牛、绵羊、猪、山羊等，以及役畜，如马、骆驼、驴等。
饲料可以由各种原料和添加剂混合而成，并根据受体动物的要求专门配制。饲料可以例如，以粉碎饲料、碎粒饲料或颗粒饲料的形式提供。
术语“饲料”还包括预混料，其由维生素、矿物质、化学防腐剂、抗生素、发酵产物及其组合等成分组成。预混料通常作为营养补充剂添加到给予家畜的饲料中。
后巴氏杀菌产品
在本上下文中，术语“后巴氏杀菌产品”是指经过两个巴氏杀菌步骤以增加产品保质期的产品。通常，巴氏杀菌的第一步在产品的初始加工中进行，第二步作为最后的加工步骤进行。
后巴氏杀菌产品包括最终产品以及旨在与其他成分混合以形成最终产品的添加剂。
后巴氏杀菌酸奶(PPY)
在本上下文中，术语“后巴氏杀菌酸奶(PPY)”是指在加工开始时进行初始巴氏杀菌步骤以及在酸化(发酵)结束时进行第二步巴氏杀菌的一类酸奶。
PPY的特征在于非冷藏条件下(如25℃)延长的保质期。因此，PPY也可以称为常温稳定酸奶。
脂肪包封的微生物培养物
非常希望经由可摄取的产品(如各种乳制品)向消费者递送有益的微生物培养物。微生物培养物可以本质上是益生菌，因此增加了营养价值并有助于消费者的健康。此类微生物培养物通常以粉组合物的形式单独获得，并与另外的成分混合以产生最终产品。然而，对于应用第二个巴氏杀菌步骤以提高环境温度下的储存稳定性的后巴氏杀菌产品，问题是二次热处理显著减少了活的有益微生物的数量。此外，由于后酸化对活力有负面影响，因此在储存时在乳制品中保持活的微生物培养物库是一项挑战。
为了有效地向消费者提供后巴氏杀菌产品(如乳制品)和活的微生物培养物，有必要设计新的配制剂和方法，使得其能够直接用于现有生产线。因此，微生物培养物应能够在二次巴氏杀菌步骤中存活，并且随后在环境温度下储存时不会显示出显著的后酸化。
本文阐述了用于将微生物培养物包封在包含一种或多种脂肪组分的基质中的方法。不受理论的束缚，包封基质有助于从环境中吸收热量，并在加热的时间尺度上保护细胞。此外，发现脂肪包封有效地减轻了微生物培养物在环境条件下储存延长的时间时的任何显著的后酸化。
因此，本发明的方面涉及一种脂肪包封的微生物培养物，其包含：
i)包含微生物培养物的制剂，以及
ii)包含一种或多种脂肪组分的包封基质，脂肪组分中的每一种具有熔点为至少25℃。
本发明的实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该一种或多种脂肪组分具有熔点为至少30℃，如至少31℃、如至少32℃、如至少33℃。
包封基质的脂肪组分的特征在于它们的高熔点，使得它们在室温下呈固态或半固态。这将脂肪组分与大多数油(如在室温下是流体的橄榄油)区分开。包封基质可以包含几种脂肪组分，其均具有高熔点，包封基质的一些变体具有一种特别高熔点的脂肪组分。此种脂肪组分可以是氢化油或互酯化油。
本发明的另一个实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中脂肪组分中的至少一种具有熔点为至少40℃，如至少45℃、如至少50℃、如至少55℃。
替代地，包封基质可以由表示包封基质的所有脂肪组分的平均熔点的公共熔点进行限定。在脂肪组分的选择使得脂肪组分之间发生显著的自发互酯化导致单个脂肪组分的熔点变化的情况下，此种定义可能是优选的。因此，本发明的实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中脂肪组分的平均熔点为至少25℃，如至少30℃、如至少31℃、如至少32℃、如至少33℃。
影响脂肪组分的熔点的两个主要参数：脂肪酸的饱和度和碳链长度。双键在脂肪酸的堆积中引入无序，其导致链间相互作用变弱，最终导致不饱和脂肪酸组分的熔融温度变低。类似地，较短的碳链比较长的碳链允许更少的相互作用，导致链长度增加的脂肪组分具有增加的熔点。因此，倾向于用于包埋微生物培养物的包封基质是具有高度饱和度和/或长碳链长度的脂肪酸。
因此，本发明的实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中相对于所述一种或多种脂肪组分的脂肪酸的总含量，该一种或多种脂肪组分包含至少50重量％的饱和脂肪酸。
本发明的另一个实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中相对于所述一种或多种脂肪组分的脂肪酸的总含量，该一种或多种脂肪组分包含至少60重量％的饱和脂肪酸。
本发明的又一个实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中相对于一种或多种脂肪组分的脂肪酸的总含量，该一种或多种脂肪组分包含至少50重量％的最大碳链长度量为16个碳原子的脂肪酸。
在大多数情况下，脂肪组分将包含脂肪酸的混合物。这些脂肪酸优选地选自高度饱和度和/或长碳链长度的脂肪酸。因此，本发明的实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该一种或多种脂肪组分包含至少50重量％，如至少60重量％、如至少70重量％的脂肪酸，该脂肪酸选自由以下组成的组：癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、二十四烷酸、蜡酸、反油酸、异油酸、芥酸及其组合。
本发明的另一个实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该一种或多种脂肪组分选自由以下组成的组：乳脂、可可脂、椰子脂、乳木果油、芒果仁油、棕榈油、棕榈仁油、猪油、氢化油、互酯化油及其组合。
特别关注的是乳脂(也称为奶脂肪)，因为它与多种产品(如乳制品)具有高度的生物相容性。因此，本发明的实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该一种或多种脂肪组分包含乳脂。本发明的另一个实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该一种或多种脂肪组分包含乳脂和至少一种另外的脂肪组分。本发明的又一个实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中相对于一种或多种脂肪组分的脂肪酸的总含量，该一种或多种脂肪组分包含多于60重量％的碳链长度为18个碳原子的脂肪酸。
另一组关注的脂肪组分是互酯化油和氢化油，因为它们的熔点高。互酯化油和氢化油可以作为天然产品提供，也可以作为合成产品提供，这些合成产物是通过选定脂肪酸的氢化和/或使用酶(如脂肪酶)的互酯化进行生产。因此，本发明的实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该一种或多种脂肪组分包括互酯化油和/或氢化油。本发明的另一个实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该一种或多种脂肪组分选自互酯化油和/或氢化油。
适合作为包封基质的脂肪组分的氢化油包括但不限于氢化菜籽油和氢化椰油甘油酯。因此，本发明的实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该一种或多种脂肪组分包含氢化菜籽油和/或氢化椰油甘油酯。
对于许多实际目的，将两种或多种脂肪组分组合以配制具有针对特定类型产品的预定特性的包封基质可能是有益的。因此，本发明的实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中包封基质包含至少两种脂肪组分。
本发明的另一个实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该至少两种脂肪组分分别包含氢化椰油甘油酯和氢化菜籽油。
乳化剂可以包括在包封基质中，以降低脂肪组分的粘度和/或增强其混合。因此，本发明的实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中包封基质进一步包含至少一种乳化剂。
乳化剂可以是与包封基质的脂肪组分相容的任何传统的食品级乳化剂。因此，本发明的实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中至少一种乳化剂选自由以下组成的组：单甘油酯、甘油二酯、甘油三酯、卵磷脂、乳蛋白、树胶及其组合。
本发明的另一个实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中乳化剂是聚甘油蓖麻醇酯(PGPR)。
脂肪组分与乳化剂的相对量可以变化，以优化包封基质的流动性和混合性。因此，本发明的实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中总脂肪组分与乳化剂的比例(wt％/wt％)在200:1至5:1的范围内，如在100:1至5:1的范围内，如在40:1至5:1的范围内，如在30:1至10:1的范围内，优选在25:1至15:1的范围内。
微生物培养物与包封基质的比例(wt％/wt％)可以定制以适应特定的应用。可以设想，增加包封基质的量可以改善对微生物培养物免受环境影响的保护。然而，增加包封基质的含量将稀释最终产品中微生物培养物的含量。因此，微生物培养和包封基质之间的最佳平衡还取决于以下因素：如储存时间和储存条件，这些因素可以根据预期的应用而变化。本发明的实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中微生物培养物与包封基质的比例(wt％/wt％)在1:100至1:4的范围内，如在1:50至1:4的范围内，如在1:20至1:4的范围内，如在1:15至1:6的范围内，优选在1:12至1:8的范围内。
微生物培养物通常以干粉形式提供，其使在最终应用中使用之前将微生物培养物储存延长的时间。保持干制剂的低水活度将有助于干制剂不随时间的推移而变质。通常，低于0.6的水活度应避免任何不需要的微生物增殖。包含微生物培养物的干粉制剂可以使用任何不显著降低微生物培养物活力的合适的方法获得。因此，本发明的实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该制剂是干制剂。
本发明的另一个实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该制剂具有水活度为小于0.6Aw，优选小于0.4Aw，更优选小于0.3Aw，最优选小于0.2Aw。本发明的又一个实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该制剂具有水活度为小于0.2Aw，优选小于0.15Aw。
本发明的进一步的实施方案涉及本文所述的包封微生物培养物，其中该制剂选自由以下组成的组：冻干制剂、喷雾干燥制剂、真空干燥制剂和风干制剂。本发明的更进一步的实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该制剂是冻干制剂。
包含微生物培养物的制剂可以和一种或多种添加剂提供，这些添加剂有利于在包封基质中包埋前和/或后保存微生物培养物。添加剂包括但不限于用作冷冻保护剂和抗氧化剂的试剂。因此，本发明的实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该制剂包含一种或多种添加剂。
本发明的另一个实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该一种或多种添加剂选自由以下组成的组：抗氧化剂、碳水化合物、蛋白质及其组合。
氧化是原子或离子的电子损失。在本上下文中，氧化是指分子氧的氧化，意味着氧被代谢为不稳定的自由基，其可以从其他分子中撬走电子。因此，氧化可能导致细胞膜和其他细胞组分(如蛋白质、脂质和DNA)受损。为了避免对脂肪包封的微生物培养物的损害，可以在包含微生物培养物的制剂中包括一种或多种抗氧化剂以防止氧化。抗氧化剂可以是天然的或合成来源的。
本发明的实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中抗氧化剂选自由以下组成的组：柠檬酸盐、抗坏血酸盐、生育酚、抗坏血酸棕榈酸酯、槲皮素、没食子酸、生育三烯、生育三烯酚、谷胱甘肽及其组合。
本发明的另一个实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中抗氧化剂选自维生素C和/或维生素E。应当理解，本文使用的抗氧化剂包括维生素C的矿物盐，如抗坏血酸钠。此外，维生素E应理解为包括生育酚和生育三烯酚(α、β、γ、δ)的所有变体。
本发明的又一个实施方案涉及本文所述的包封的脂肪包封的微生物培养物，其中抗氧化剂选自柠檬酸三钠和/或抗坏血酸钠。
本发明的进一步实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中抗氧化剂是水溶性的或脂溶性的。
冷冻保护剂用于提高微生物培养物浓缩物在抵抗冷冻、冷冻储存和冻干的有害影响中存活的能力。优选地，这些冷冻保护剂不应被微生物菌株代谢产生酸，因为它可能由于ATP酶膜结合酶、β-半乳糖苷酶和细胞膜流动性的破坏而导致活力丧失。通常，不产生酸的冷冻保护剂在提高冻干微生物培养物的存活率方面更有效。冷冻保护剂的一个优选类别是碳水化合物及其相关的亚组。
因此，本发明的实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中碳水化合物选自由以下组成的组：单糖、二糖、低聚糖、多糖及其组合。
本发明的另一个实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中单糖选自由以下组成的组：葡萄糖、果糖、半乳糖、岩藻糖、木糖、赤藓糖及其组合。
本发明的又一个实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中二糖选自由以下组成的组：乳糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖及其组合。
因此，本发明的进一步实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中低聚糖选自低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、甘露聚糖(MOS)及其组合。
本发明的更进一步的实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中多糖选自由以下组成的组：麦芽糖糊精、纤维糊精、树胶、藻酸盐、淀粉、糖原、纤维素、几丁质、果胶、菊粉、葡聚糖、角叉菜胶、壳聚糖及其组合。
本发明的再进一步实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中树胶选自由以下组成的组：阿拉伯树胶、琼脂、藻酸盐、肉桂、达玛脂、果胶、β-葡聚糖、葡甘露聚糖、乳香、树胶(chicle)、洋车前子、云杉、结冷胶、瓜尔豆、刺槐豆、黄原胶及其组合。本发明的实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该树胶是阿拉伯树胶。
蛋白质还可以用作冷冻保护剂。因此，本发明的实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中蛋白质选自由以下组成的组：酪蛋白酸盐、乳清蛋白、明胶、植物蛋白如豌豆蛋白、马铃薯蛋白和米蛋白及其组合。
待包封在脂肪包封基质中的制剂可以主要包含任何类型的微生物培养物。因此，本文提出的脂肪包封技术不限于特定类型的微生物培养物，而是一般的脂肪包封概念。因此，可以设想，任何类型的微生物培养物都可以有利地如本文所述被脂肪包封。
在许多消费品中非常重要的两种类型微生物是细菌和酵母。这些微生物包括例如，在发酵食品、饲料混合物和营养补充剂中，其中它们的健康益处是有据可查的。
因此，本发明的实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中微生物培养物是细菌或酵母菌。
本发明的另一个实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中微生物培养物属于选自由以下组成的组的属：乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)和酵母菌(Saccharomyces)。
益生菌培养物是活微生物的培养物，其在被受试者摄取时为受试者提供健康益处。包含益生菌培养物的产品包括但不限于乳制品、饲料和饮料。因此，应当理解，本文所述的脂肪包封的微生物培养物不仅可以施用于人，还可以施用于动物，甚至施用于植物。
因此，本发明的实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中微生物培养物是益生菌培养物。
本发明的另一个实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中益生菌培养物属于选自由以下组成的组的属：乳杆菌(Lactobacillus)或双歧杆菌(Bifidobacterium)。
本发明的又一个实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中益生菌培养物选自由以下组成的组：鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)、动物双歧杆菌(Ligilactobacillus animalis)和动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalissubsp.Lactis)。
特别关注的是乳酸菌(LAB)，其是革兰氏阳性菌的一个目，具有共同的代谢和生理特征。LAB产生乳酸作为碳水化合物发酵的主要代谢产物。自从发现通过食品发酵酸化可以通过抑制腐坏剂的生长来保存食品，LAB已被有目的地用于食品发酵。虽然后酸化在微生物培养物的活力方面提出了挑战，但本文提供的脂肪包封克服了这个问题。不受理论的束缚，可以设想包封基质充当乳糖从含乳糖产品(如酸奶)扩散到脂肪微胶囊内部的屏障。因此，由于底物可用性的限制，包封微生物的代谢活性较低。此外，脂肪包封还降低了微生物培养物的失活率，导致即使在环境储存条件下活力的维持。因此，本文所述的脂肪包封的微生物培养物既可以耐受后巴氏杀菌，以及随后在环境温度下的储存，因此可以向更广泛的产品开发者开放含有微生物培养物的后巴氏杀菌产品(如LAB)的开发，而不需要对现有生产线进行另外的投资，如无菌在线混合的安装。
因此，本发明的实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中微生物培养物是乳酸菌(LAB)。
本发明的另一个实施方案涉及本文所述的微囊化微生物培养物，其中微生物培养物是或包含属于选自由以下组成的组的属的乳酸菌(LAB)：乳杆菌属(Lactobacillus)、霍尔扎普菲尔氏菌属(Holzapfelia)、淀粉乳杆菌属(Amylolactobacillus)、蜂乳杆菌属(Bombilactobacillus)、伴生乳杆菌属(Companilactobacillus)、石墙乳杆菌属(Lapidilactobacillus)、农田乳杆菌属(Agrilactobacillus)、施莱弗乳杆菌属(Schleiferilactobacillus)、罗伊氏乳杆菌属(Loigolactobacilus)、乳酪杆菌属(Lacticaseibacillus)、广布乳杆菌(Latilactobacillus)、德拉格里奥氏菌(Dellaglioa)、液体乳杆菌属(Liquorilactobacillus)、联合乳杆菌属(Ligilactobacillus)、乳植物杆菌属(Lactiplantibacillus)、糠乳杆菌属(Furfurilactobacillus)、寡食乳杆菌属(Paucilactobacillus)、粘液乳杆菌属(Limosilactobacillus)、果实乳杆菌属(Fructilactobacillus)、醋乳杆菌属(Acetilactobacillus)、蜜蜂乳杆菌(Apilactobacillus)、促生乳杆菌属(Levilactobacillus)、次乳杆菌属(Secundilactobacillus)以及迟缓乳杆菌属(Lentilactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)和葡萄球菌属(Staphylococcus)。
需要明白的是，乳杆菌属(Lactobacillus)分类法在2020年进行了更新。新的分类法公开于Zheng等人,2020年并且如无特别说明，将与此一致。为了本发明的目的，表1提出了与本发明相关的一些乳杆菌(Lactobacillus)物种的新旧名称列表。
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表1与本发明相关的一些乳杆菌(Lactobacillus)物种的新旧名称。
长期以来，已知乳杆菌(Lactobacillus)属的细菌以及相关的新近更新的属构成了人体中微生物群的重要组成部分，如消化系统、泌尿系统和生殖系统中。为此，这些细菌已被大量用于旨在帮助、维持或恢复人体中微生物群的自然平衡的健康和/或营养产品中。乳杆菌(Lactobacillus)的应用实例包括治疗或改善腹泻、阴道感染和皮肤疾病，如湿疹。
因此，本发明的实施方案涉及本文所述的微囊化微生物培养物，其中微生物培养物是或包含属于选自由以下组成的组的属的乳酸菌(LAB)：乳杆菌属(Lactobacillus)、粘液乳杆菌属(Limosilactobacillus)、乳酪杆菌属(Lacticaseibacillus)、联合乳杆菌属(Ligilactobacillus)、乳酪杆菌属(Lacticaseibacillus)、乳酪杆菌属(Lacticaseibacillus)、乳植物杆菌属(Lactiplantibacillus)、粘液乳杆菌属(Limosilactobacillus)、联合乳杆菌属(Ligilactobacillus)、迟缓乳杆菌属(Lentilactobacillus)、广布乳杆菌(Latilactobacillus)和乳植杆菌鼠(Lactiplantibacillus)。本发明的另一个实施方案涉及本文所述的微囊化微生物培养物，其中微生物培养物属于以下物种：罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)、鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)、唾液联合乳杆菌(Ligilactobacillussalivarius)、干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)、副干酪乳酪杆菌副干酪亚种(Lacticaseibacillus paracasei subsp.paracasei)、植物乳植杆菌植物亚种(Lactiplantibacillus plantarum subsp.plantarum)、发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)、动物乳杆菌(Ligilactobacillus animalis)、布氏迟缓乳杆菌(Lentilactobacillus buchneri)、弯曲广布乳杆菌(Latilactobacilluscurvatus)、福菜伴生乳杆菌(Companilactobacillus futsaii)、清酒广布乳杆菌清酒亚种(Latilactobacillus sakei subsp.)、戊糖乳植杆菌(Lactiplantibacillus pentosus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophillus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)和德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)。
本发明的进一步的实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该制剂包含两种或两种以上的微生物培养物，优选两种微生物培养物。
在将包含微生物培养物的制剂包埋在包封基质中时，形成小微胶囊。不受理论的束缚，微胶囊可以表征为具有内部和外部部分的球形。对于某些应用，可能需要在微胶囊的外部部分的顶部施加另外的包衣。因此，本发明的实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中微生物培养物包含在内部部分中并且包封基质包含在外部部分中。
本发明的另一个实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中脂肪包封的微生物培养物进一步包含一种或多种包衣。
本发明的又一个实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其进一步包含疏水包衣。
为了显著影响营养价值并有助于消费者的健康，优选最初以足够的量提供微生物培养物。因此，本发明的实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该制剂包含在1.0E+07至5.0E+11CFU/g的范围内的微生物培养物，优选在1.0E+09至1.0E+11CFU/g的范围内的微生物培养物，更优选在1.0E+10至5.0E+10CFU/g的范围内的微生物培养物。
本发明的另一个实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该制剂包含一种或多种选自由以下组成的组的一种或多种增产剂：嘌呤碱基、嘧啶碱基、核苷、核苷酸及其衍生物。
对于最实际的目的，本文所述的脂肪包封的微生物培养物将包括在包含进一步的成分的组合物中，该成分作为最终产品的最终加工的一部分。该最终产品可以是通过包括微生物培养物(如益生菌培养物)向接受者提供有益效果的任何产品。
因此，本发明的实施方案涉及包含本文所述的脂肪包封的微生物培养物的组合物。
本发明的另一个方面涉及本文所述的组合物，其中该组合物选自由以下组成的组：饲料、植物保健品、食品、饮料和药物产品组成的组。
本发明的另一个方面涉及一种包含本文所述的脂肪包封的微生物培养物或组合物的产品，其中所述产品选自由以下组成的组：饲料、植物保健品、食品、饮料和药物产品。
应当理解，术语“食品”还包括“挤压食品”和“棒”，并且“食品”或“饲料”可以是预混物的形式，其旨在与另外的成分进一步混合以获得最终产品。因此，本发明的实施方案涉及本文所述的产品或组合物，其中该产品或组合物是预混物。本发明的另一个实施方案涉及本文所述的产品或组合物，其中该产品或组合物是挤出的食品或棒。棒是通过挤压制成的质地化产品，其中不同的食品组分用可食用的粘合剂，例如但不限于糖维持在一起。
优选的食品类型是乳制品，其在全球范围内广泛消费，并被认为是用于递送有益微生物培养物如益生菌的载体或来源。因此，本发明的方面涉及一种包含本文所述的脂肪包封的微生物培养物或组合物的乳制品。
本发明的另一个实施方案涉及本文所述的乳制品，其中所述乳制品选自由以下组成的组：酸奶、奶酪、黄油、接种的甜奶和液体发酵奶产品。
奶基产品如酸奶是表征良好的载体，适用于保护和递送肠道中的微生物培养物，如益生菌。原因之一是酸奶富含营养物、蛋白质、脂肪酸、碳水化合物、维生素、矿物质和钙，其提高了益生菌菌株结合上皮细胞的能力。另一个原因是消费者认为酸奶是营养的、健康的和天然的活细菌载体，因此优选每天食用。
酸奶是由经过热处理的标准化奶制成的半固体发酵产品。通常，主要的发酵剂或酸奶培养物用于制作酸奶，益生菌作为辅助培养物添加。对于后巴氏杀菌酸奶(PPY)，这些微生物培养物面临承受环境应力，如高温和后酸化的挑战。
随着发酵结束，酸奶往往具有pH值在大约4.0至4.6的范围内，但任何进一步的后酸化都可能导致活细胞计数下降并损害消费者体验。
此外，后巴氏杀菌酸奶中掺入的微生物培养物(如益生菌)要经过非常高的加热步骤，这挑战了它们的生存能力。后巴氏杀菌装置的典型热处理时间为72℃持续20秒(低巴氏杀菌时大约63℃持续30分钟)。
本文提供的脂肪包封的微生物培养物即使在环境温度下也能承受与热应力和后酸化相关的挑战。这可能会为PPY市场带来新产品，在该PPY市场后巴氏杀菌之后需要活的微生物细胞，如益生菌细胞。重要的是，微生物细胞可以在后巴氏杀菌之前添加到奶中。这意味着PPY制造商不必投资任何新技术，用于在后巴氏杀菌之后无菌添加微生物培养物。
因此，本发明的实施方案涉及本文所述的乳制品，其中所述乳制品是后巴氏杀菌酸奶(PPY)。
应当理解，本文使用的术语“酸奶”除了包括常规酸奶之外还包括酸奶的特殊变体，如通过特殊加工制备的本地/地区性酸奶、增甜和/或调味酸奶、过滤酸奶、酸奶基饮料和植物基酸奶(也称为植物乳酸奶)。植物基酸奶包括但不限于基于豆浆、米浆和坚果奶的酸奶，如用酸奶培养物发酵的杏仁奶和椰奶。植物基酸奶可能适合素食主义者、对牛奶不耐受的人和/或出于政治或环境原因而喜欢植物基产品的人。因此，本发明的实施方案涉及本文所述的乳制品，其中所述乳制品是酸奶，如后巴氏杀菌的酸奶，选自由以下组成的组：通过特殊加工制备的酸奶、增甜酸奶、调味酸奶、过滤酸奶、酸奶基饮料和植物基酸奶。本发明的另一个实施方案涉及本文所述的乳制品，其中所述乳制品是植物基酸奶。
本文所述的组合物或乳制品可以包含一种或多种食品级成分，这些成分是无毒、食用安全并符合食品化学法典(FCC)的化合物。食品级成分包括但不限于可以改变如香气、风味、酸度、颜色、粘度和质地属性的化合物，以及防腐剂、营养素、增稠剂、甜味剂和乳化剂。因此，本发明的实施方案涉及本文所述的组合物或乳制品，进一步包含一种或多种食品级成分。
本发明的另一个实施方案涉及本文所述的组合物或乳制品，其中该一种或多种食品级成分选自由以下组成的组：可以改变如香气、风味、酸度、颜色、粘度和质地属性的化合物，以及防腐剂、营养素、增稠剂、甜味剂、乳化剂及其组合。
优选的食品级成分包括但不限于乳糖、麦芽糖糊精、乳清蛋白、酪蛋白、玉米淀粉、膳食纤维、树胶和明胶。因此，本发明的实施方案涉及本文所述的组合物或乳制品，其中该一种或多种食品级成分选自由以下组成的组：乳糖、麦芽糖糊精、乳清蛋白、酪蛋白、玉米淀粉、膳食纤维、树胶、明胶及其组合。
为了有益于消费者的健康，重要的是最终产品包含大量活的微生物细胞。这些将有助于消费者体内(如在肠道中)存活的微生物的自然种群调节的功能。由于后巴氏杀菌的乳制品特别适合分销到不能冷却的地区，因此还要求含在此种产品中的微生物培养物能够在环境应力(如升高的(非冷藏)温度)下存活。不受理论的束缚，脂肪包衣似乎降低了包埋的微生物培养物的失活率，最终导致即使在环境储存条件下其活力的维持。因此，本发明的实施方案涉及本文所述的乳制品，其中所述PPY包含1.0E+05至5.0E+09CFU/g微生物培养物，优选在1.0E+07至1.0E+09CFU/g的范围内的微生物培养物，更优选在1.0E+08至5.0E+08CFU/g的范围内的微生物培养物。
本发明的另一个实施方案涉及本文所述的乳制品，其中通过CFU/g测量的微生物培养物的活力损失在25℃下储存2个月后小于2个对数单位，优选在25℃下储存2个月后小于1个对数单位，更优选在25℃下储存2个月后小于0.5个对数单位。
本文所述的脂肪包封的微生物培养物有效避免在产品有意发酵之后的任何后酸化。这通过延长的储存期间的低活力损失以及模型酸奶中pH的直接测量显示出随时间稳定的pH值得以证实。不受理论的束缚，脂肪包封的微生物培养物的低后酸化表明脂肪包封减慢了菌株产生乳酸的能力。可以预期这可能是由于脂肪涂层充当乳糖从酸奶扩散到微胶囊内部的屏障。因此，由于底物可用性的限制，包封的微生物培养物的代谢活性较低。
因此，本发明的实施方案涉及本文所述的乳制品，其中乳制品的pH在25℃下储存2个月后维持在pH 3.8至pH 5.0的范围内，如在25℃下储存2个月后在pH 4.1至pH 4.7的范围内，如在pH 4.2至pH 4.6的范围内，优选在pH 4.3至pH 4.5的范围内。
微生物培养物通过将包含一种或多种脂肪组分的包封基质应用于包含微生物培养物的制剂进行包封。因此，本发明的方面涉及一种用于制备本文所述的脂肪包封的微生物培养物或组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
i)提供包含微生物培养物的制剂，
ii)提供包封基质，以及
iii)将包封基质与制剂混合以形成微囊化微生物培养物，
其中包封基质包含一种或多种脂肪组分，脂肪组分中的每一种具有熔点为至少25℃。
通常，包封基质以流体状态提供，以促进微生物培养物的均匀包被。因此，混合过程的温度可以根据包封基质中脂肪组分的熔点进行调节。因此，本发明的实施方案涉及本文所述的方法，其中步骤ii)的包封基质是在高于脂肪组分中的每一种的熔融温度的温度下提供的，以提供熔融的包封基质。
本发明的另一个实施方案涉及本文所述的方法，其中步骤ii)的温度为至少40℃，如至少50℃、如至少60℃、优选至少70℃。
本发明的用于微生物培养物的脂肪包封的方法不限于任何特定类型的微生物培养物，也不限于微生物培养物的任何特定物理状态。然而，许多微生物培养物在加工过程中便于干燥，例如作为微生物培养之后的最后一步。微生物培养物的干燥可以简化下游处理并延长微生物培养物的保质期。
因此，本发明的实施方案涉及本文所述的方法，其中步骤i)的制剂为干制剂。
本发明的另一个实施方案涉及本文所述的方法，其中该干制剂选自由以下组成的组：冻干制剂、喷雾干燥制剂、真空干燥制剂和风干制剂。
本发明的又一个实施方案涉及本文所述的方法，其中该干制剂是冻干制剂。
可以调整工艺参数以优化微生物培养物在脂肪包衣中的包埋，而不会损害细胞的活力。
因此，本发明的实施方案涉及本文所述的方法，其中干制剂在步骤iii)之前维持在至少20℃的温度下，如在20℃至30℃的范围内，持续至少20分钟，如30分钟。
本发明的另一个实施方案涉及本文所述的方法，其中步骤iii)中的混合进行至少10秒。
包含微生物培养物的制剂还可以通过使用流化床包衣机(如Mini Glatt)包被脂肪混合物。在这种情况下，熔融的脂肪混合物以与本文实施例2中描述的相同方式制备。接下来，将包含微生物培养物(例如作为冻干粉)的制剂填充在Mini Glatt中的筛子的顶部，该筛子配备有双流体喷嘴、Wurster装置和用于处理小型粉样本的微型插件。然后将包含微生物培养物的制剂流化。进行流化床包衣工艺，直到达到所需的脂肪包衣水平，例如35％w/w。微粒可以如本文实施例2所述进行收集并进一步使用。
流化床包衣机中的流化可以20m3/h的气体流速、入口温度50℃并且出口温度35℃下进行。其他合适的参数包括但不限于，整个板的压降为大约10-15mBar，喷嘴压力设置为大约2巴，并且材料以5-10g/min的速度喷涂。过滤器清洁压力可以设置为3巴。
作为液氮造粒的替代，可以通过喷雾冷却的方法获得最终微粒。在该情况下，预备步骤与本文实施例2中所述相同。主要区别在于，熔融的脂肪混合物中的微生物培养物悬浮液不是在液氮中造粒，而是使用双流体喷嘴(例如直径为0.7mm)雾化到冷室(温度为大约10℃-15℃)中雾化。雾化空气压力可以是大约1kPa。微粒可以如实施例2所述进行收集并进一步使用。
制备酸奶时，将发酵剂添加到奶中以开始将乳糖转化为乳酸。酸性环境导致奶的酪蛋白凝结并使奶浓稠，形成众所周知的酸奶质地。除乳酸外，酸奶还包含乙醛、乙酸和二乙酰酸，所有这些共同赋予酸奶酸味、味道和风味的特征，并有助于发展强大的免疫系统。因此，酸性环境在酸奶的制备中起着重要作用，也对提供活的微生物培养物(如益生菌)提出了挑战，因为如果pH下降得太低，微生物的生长通常会受到阻碍。
因此，本文特别关注的是用于生产包含大量活的有益微生物(如益生菌培养物)的后巴氏杀菌酸奶(PPY)的方法。因此，本发明的方面涉及一种用于制备后巴氏杀菌酸奶(PPY)的方法，所述方法包括以下步骤：
i)提供pH在4.0-4.6范围内的酸奶，
ii)向酸奶中添加本文所述的脂肪包封的微生物培养物或组合物，以及
iii)后巴氏杀菌步骤ii)的酸奶。
可以选择酸奶的pH，以优化质量、一致性和味道，并增加保质期。因此，本发明的实施方案涉及本文所述的方法，其中步骤i)的酸奶具有pH在4.3-4.5范围内。
本发明的另一个实施方案涉及本文所述的方法，其中步骤i)的酸奶是巴氏杀菌酸奶。
第一个(初始)巴氏杀菌和第二个(后)巴氏杀菌步骤可以作为批量巴氏杀菌或连续巴氏杀菌进行。批量巴氏杀菌是在特定温度下在容器中有限体积的流体(如奶)进行的长时间处理。在整个保持期间，在搅拌下加热奶。保持时间完成时，奶可以在容器中冷却或趁热取出。另一方面，连续巴氏杀菌使用例如高温短时(HTST)巴氏杀菌器处理流体(如牛奶)流。奶的加热在由垫圈限定的通道中进行，并由加热介质(如真空蒸汽或热水)介导。
因此，本发明的实施方案涉及本文所述的方法，其中步骤iii)的后巴氏杀菌通过批量巴氏杀菌或连续巴氏杀菌进行。
本发明的另一个实施方案涉及本文所述的方法，其中步骤iii)的后巴氏杀菌在至少60℃的温度下进行。
本发明的又一个实施方案涉及本文所述的方法，其中步骤iii)的后巴氏杀菌进行至少20分钟，如30分钟。
本发明的进一步的实施方案涉及本文所述的方法，其中步骤iii)的后巴氏杀菌在65℃-75℃范围内的温度下、持续时间在2-10分钟的范围内进行。
本发明的更进一步的实施方案涉及本文所述的方法，其中步骤iii)的后巴氏杀菌在70℃的温度下进行5分钟。
应当理解，较高的巴氏杀菌温度将允许更短的时间，反之亦然。因此，本领域技术人员将知道如何调节巴氏杀菌的温度和时间以适合本文所述的方法。
重要的是，最终PPY中微生物培养物的含量应足够高，以提供有益的健康和营养效果。实现这一目标的主要挑战是提供一种能够在后巴氏杀菌步骤中存活的微生物培养物，并避免随后储存时的后酸化。这些挑战通过本文所述的方法通过微生物培养物的脂肪包封进行解决。
因此，本发明的实施方案涉及本文所述的方法，其中PPY中微生物培养物的含量在1.0E+05至5.0E+09CFU/g的范围内，优选在1.0E+06至5.0E+08CFU/g的范围内。
本发明的另一个实施方案涉及本文所述的方法，其中通过CFU/g测量的PPY中的微生物培养物的活力损失在25℃下储存2个月后小于2个对数单位，优选在25℃下储存2个月后小于1个对数单位，更优选在25℃下储存2个月后小于0.5个对数单位。
本发明的进一步的实施方案涉及本文所述的方法，其中PPY的pH在25℃下储存2个月后维持在pH 3.8至pH 5.0的范围内，如在25℃下储存2个月后在pH 4.1至pH 4.7的范围内，如在pH 4.2至pH 4.6的范围内，优选在pH 4.3至pH 4.5的范围内。
本文所述的方法适用于获得包埋在脂肪包衣内的微生物培养物。这些改善的微生物培养物可以用作添加剂或用作各种产品中更复杂的组合物的一部分，其中它们为消费者提供健康和营养益处，如改善的免疫系统和增强的消化。消费者不仅限于人类，也可以是动物，如驯养动物。
因此，本发明的方面涉及可以通过本文所述方法获得的本文所述的脂肪包封的微生物培养物或组合物。
本发明的另一个方面涉及一种包含本文所述的脂肪包封的微生物培养物或组合物的产品，其中所述产品选自由以下组成的组：饲料、植物保健品、食品、饮料和药物产品。
其中适合于包括作为添加剂的脂肪包封的微生物培养物的优选产品包括一系列不同的乳制品。因此，本发明的方面涉及一种包含本文所述的脂肪包封的微生物培养物或组合物的乳制品，其中所述乳制品选自由以下组成的组：酸奶、奶酪、黄油、接种的甜乳和液体发酵乳产品。
本发明的实施方案涉及本文所述的乳制品，其中所述乳制品是后巴氏杀菌酸奶(PPY)。
脂肪包封的微生物培养物可以用作独立的添加剂或用作包含另外成分的组合物中的组分。因此，本发明的方面涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物或组合物在选自由以下组成的组中的产品的用途：饲料、植物保健品、食品、饮料和/或药物产品。
本发明的实施方案涉及本文所述的脂肪包封的微生物培养物或组合物在用于选自由以下组成的组的乳制品中的用途，其中该乳制品选自由以下组成的组：酸奶、奶酪、黄油、接种的甜乳和液体发酵乳产品。
本发明的另一个实施方案涉及本文所述的用途，其中所述乳制品是后巴氏杀菌酸奶(PPY)。
本说明书中列出或讨论明显先前公开的文献不应该被认为是承认该文献是现有技术的一部分或者是公知常识。
除非上下文另有说明，否则对于本发明的给定方面、特征或参数的偏好、选项和实施方案应被视为已经结合针对本发明的所有其他方面、特征和参数的任何和所有偏好、选项和实施方案进行了公开。这对于脂肪包封的微生物培养物及其所有特征的描述尤其如此，其可以容易地成为通过本文所述方法获得的最终组合物或产品的一部分。本发明的实施方案和特征也在以下条款中进行概述。
条款
X1.一种脂肪包封的微生物培养物，其包含:
i)包含微生物培养物的制剂，以及
ii)包含一种或多种脂肪组分的包封基质，脂肪组分中的每一种具有熔点为至少25℃。
X2.根据条款X1所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该一种或多种脂肪组分具有熔点为至少30℃，如至少31℃、如至少32℃、如至少33℃。
X3.根据条款X1或条款X2所述的脂肪包封的微生物培养物，其中脂肪组分中的至少一种具有熔点为至少40℃，如至少45℃、如至少50℃、如至少55℃。
X4.根据前述条款中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物，其中相对于所述一种或多种脂肪组分的脂肪酸的总含量，该一种或多种脂肪组分包含至少50重量％的饱和脂肪酸。
X5.根据前述条款中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物，其中相对于所述一种或多种脂肪组分的脂肪酸的总含量，该一种或多种脂肪组分包含至少60重量％的饱和脂肪酸。
X6.根据前述条款中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物，其中相对于一种或多种脂肪组分的脂肪酸的总含量，该一种或多种脂肪组分包含至少50重量％的最大碳链长度量为16个碳原子的脂肪酸。
X7.根据前述条款中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该一种或多种脂肪组分选自由以下组成的组：乳脂、可可脂、椰子脂、乳木果油、芒果仁油、棕榈油、棕榈仁油、猪油、氢化油、互酯化油及其组合。
X8.根据前述条款中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物，其中包封基质包含至少两种脂肪组分。
X9.根据条款X8所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该至少两种脂肪组分分别包含氢化椰油甘油酯和氢化菜籽油。
X10.根据前述条款中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该包封基质还包含至少一种乳化剂。
X11.根据条款X10所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该至少一种乳化剂选自由以下组成的组：单甘油酯、甘油二酯、甘油三酯、卵磷脂、奶蛋白、树胶及其组合。
X12.根据条款X10或X11中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该乳化剂是聚甘油蓖麻醇酯(PGPR)。
X13.根据条款X10至X12中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物，其中总脂肪组分与乳化剂的比例(wt％/wt％)在200:1至5:1的范围内，如在100:1至5:1的范围内，如在40:1至5:1的范围内，如在30:1至10:1的范围内，优选在25:1至15:1的范围内。
X14.根据前述条款中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物，其中微生物培养物与包封基质的比例(wt％/wt％)在1:100至1:4的范围内，如在1:50至1:4的范围内，如在1:20至1:4的范围内，如在1:15至1:6的范围内，优选在1:12至1:8的范围内。
X15.根据前述条款中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该制剂是干制剂。
X16.根据前述条款中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该制剂具有的水活度小于0.2Aw，优选小于0.15Aw。
X17.根据前述条款中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该制剂选自由以下组成的组：冻干制剂、喷雾干燥制剂、真空干燥制剂和风干制剂。
X18.根据前述条款中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该制剂是冻干制剂。
X19.根据前述条款中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该制剂包含一种或多种添加剂。
X20.根据条款X19所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该一种或多种添加剂选自由以下组成的组：抗氧化剂、碳水化合物、蛋白质及其组合。
X21.根据条款X20所述的脂肪包封的微生物培养物，其中抗氧化剂选自由以下组成的组：柠檬酸盐、抗坏血酸盐、生育酚、抗坏血酸棕榈酸酯、槲皮素、没食子酸、生育三烯、生育三烯酚、谷胱甘肽及其组合。
X22.根据条款X20或条款X21所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该碳水化合物选自由以下组成的组：单糖、二糖、低聚糖、多糖及其组合。
X23.根据条款X22所述的脂肪包封的微生物培养物，其中单糖选自由以下组成的组：葡萄糖、果糖、半乳糖、岩藻糖、木糖、赤藓糖及其组合。
X24.根据条款X22或条款X23中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该二糖选自由以下组成的组：乳糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖及其组合。
X25.根据条款X22至X24中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物，其中低聚糖选自低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、甘露聚糖(MOS)及其组合。
X26.根据条款X22至X25中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物，其中多糖选自由以下组成的组：麦芽糖糊精、纤维糊精、树胶、藻酸盐、淀粉、糖原、纤维素、几丁质、果胶、菊粉、葡聚糖、角叉菜胶、壳聚糖及其组合。
X27.根据条款X26所述的脂肪包封的微生物培养物，其中树胶选自由以下组成的组：阿拉伯树胶、琼脂、藻酸盐、肉桂、达玛脂、果胶、β-葡聚糖、葡甘露聚糖、乳香、树胶、洋车前子、云杉、结冷胶、瓜尔豆、刺槐豆、黄原胶及其组合。
X28.根据条款X27所述的脂肪包封的微生物培养物，其中树胶是阿拉伯树胶。
X29.根据条款X20至X28中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物，其中蛋白质选自由以下组成的组：酪蛋白酸盐、乳清蛋白、明胶、植物蛋白如豌豆蛋白、马铃薯蛋白和米蛋白及其组合。
X30.根据前述条款中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物，其中微生物培养物属于选自由以下组成的组的属：乳杆菌(Lactobacillus)、明串珠菌(Leuconostoc)、片球菌(Pediococcus)、乳球菌(Lactococcus)、链球菌(Streptococcus)、肠球菌(Enterococcus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、丙酸杆菌(Propionibacterium)、芽孢杆菌(Bacillus)和酵母菌(Saccharomyces)。
X31.根据前述条款中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该微生物培养物是益生菌培养物。
X32.根据条款X31所述的脂肪包封的微生物培养物，其中益生菌培养物属于选自由以下组成的组的属：乳杆菌(Lactobacillus)或双歧杆菌(Bifidobacterium)。
X33.根据条款X31或条款X32中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物，其中益生菌培养物选自由以下组成的组：鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)、动物唾液联合乳杆菌(Ligilactobacillus animalis)和动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.Lactis)。
X34.根据前述条款中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该微生物培养物是乳酸菌(LAB)。
X35.根据前述条款中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物，其中微生物培养物包含在内部部分中并且包封基质包含在外部部分中。
X36.根据前述条款中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该脂肪包封的微生物培养物进一步包含一种或多种包衣。
X37.根据前述条款中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物，进一步包含疏水包衣。
X38.根据前述条款中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该制剂包含在1.0E+07至5.0E+11CFU/g的范围内的微生物培养物，优选在1.0E+09至1.0E+11CFU/g的范围内的微生物培养物，更优选在1.0E+10至5.0E+10CFU/g的范围内的微生物培养物。
X39.根据前述条款中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物，其中该制剂包含一种或多种选自由以下组成的组的一种或多种增产剂：嘌呤碱基、嘧啶碱基、核苷、核苷酸及其衍生物。
X40.一种包含根据前述条款中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物的组合物。
X41.根据条款X40所述的组合物，其中该组合物选自由以下组成的组：饲料、植物保健品、食品、饮料和药物产品。
X42.一种包含根据条款X1至X39中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物或根据条款X40或X41中任一项所述的组合物的乳制品。
X43.根据条款X42所述的乳制品，其中所述乳制品选自由以下组成的组：酸奶、奶酪、黄油、接种的甜奶和液体发酵乳产品。
X44.根据条款X42或X43中任一项所述的乳制品，其中所述乳制品是后巴氏杀菌酸奶(PPY)。
X45.根据条款X44所述的乳制品，其中所述PPY包含1.0E+05至5.0E+09CFU/g微生物培养物，优选在1.0E+07至1.0E+09CFU/g的范围内的微生物培养物，更优选在1.0E+08至5.0E+08CFU/g的范围内的微生物培养物。
X46.根据条款X42至X45中任一项所述的乳制品，其中通过CFU/g测量的微生物培养物的活力损失在25℃下储存2个月后小于2个对数单位，优选在25℃下储存2个月后小于1个对数单位，更优选在25℃下储存2个月后小于0.5个对数单位。
X47.根据条款X42至X46中任一项所述的乳制品，其中乳制品的pH在25℃下储存2个月后维持在pH 3.8至pH 5.0的范围内，如在25℃下储存2个月后在pH 4.1至pH 4.7的范围内，如在pH 4.2至pH 4.6的范围内，优选在pH 4.3至pH 4.5的范围内。
Y1.一种用于制备根据条款X1至X39中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物或根据条款X40或X41中任一项所述的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
i)提供包含微生物培养物的制剂，
ii)提供包封基质，以及
iii)将包封基质与制剂混合以形成微囊化微生物培养物，
其中包封基质包含一种或多种脂肪组分，脂肪组分中的每一种具有熔点为至少25℃。
Y2.根据条款Y1所述的方法，其中步骤ii)的包封基质是在高于脂肪组分中的每一种的熔融温度的温度下提供的，以提供熔融的包封基质。
Y3.根据条款Y2所述的方法，其中步骤ii)的温度为至少40℃，如至少50℃、如至少60℃、优选至少70℃。
Y4.根据条款Y1至Y3中任一项所述的方法，其中步骤i)的制剂作为干制剂提供。
Y5.根据条款Y4所述的方法，其中该干制剂选自由以下组成的组：冻干制剂、喷雾干燥制剂、真空干燥制剂和风干制剂。
Y6.根据条款Y4或Y5中任一项所述的方法，其中该干制剂是冻干制剂。
Y7.根据条款Y4至Y6中任一项所述的方法，其中该干制剂在步骤iii)之前维持在至少20℃的温度下，如在20℃至30℃的范围内，持续至少20分钟，如30分钟。
Y8.根据条款Y1至Y7中任一项所述的方法，其中步骤iii)中的混合进行至少10秒。
W1.一种用于制备后巴氏杀菌酸奶(PPY)的方法，所述方法包括以下步骤：
i)提供pH在4.0-4.6范围内的酸奶，
ii)向酸奶中添加根据条款X1至X39中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物或根据条款X40或X41中任一项所述的组合物，以及
iii)后巴氏杀菌步骤ii)的酸奶。
W2.根据条款W1所述的方法，其中步骤i)的酸奶具有pH在4.3-4.5范围内。
W3.根据条款W1或W2所述的方法，其中步骤i)的酸奶是后巴氏杀菌酸奶。
W4.根据条款W1至W3所述的方法，其中步骤iii)的后巴氏杀菌在至少60℃的温度下进行。
W5.根据条款W1至W4中任一项所述的方法，其中步骤iii)中的后巴氏杀菌进行至少20分钟，如30分钟。
W6.根据条款W1至W4中任一项所述的方法，其中步骤iii)的后巴氏杀菌在65℃-75℃范围内的温度下进行，持续时间在2-10分钟的范围内。
W7.根据条款W1至W4或W6中任一项所述的方法，其中步骤iii)的后巴氏杀菌在70℃的温度下进行5分钟。
W8.根据条款W1至W7中任一项所述的方法，其中PPY中微生物培养物的含量在1.0E+05至5.0E+09CFU/g的范围内，优选在1.0E+06至5.0E+08CFU/g的范围内。
Z1.一种根据条款X1至X39中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物或一种根据条款X40或X41中任一项所述的组合物，其可通过根据条款Y1至Y8中任一项所述的方法获得。
Z2.一种包含根据条款Z1所述的脂肪包封的微生物培养物或组合物的产品，其中所述产品选自由以下组成的组：饲料、植物保健品、食品、饮料和药物产品。
Z3.一种包含根据条款Z1所述的脂肪包封的微生物培养物或组合物的乳制品，其中所述乳制品选自由以下组成的组：酸奶、奶酪、黄油、接种的甜奶和液体发酵乳产品。
Z4.根据条款Z3所述的乳制品，其中所述乳制品是后巴氏杀菌酸奶(PPY)。
Q1.根据条款X1至X39和Z1中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物或根据条款X40、X41或Z1中任一项所述的组合物在产品中的用途，该产品选自由以下组成的组：饲料、植物保健品、食品、饮料和/或药物产品。
Q2.根据条款X1至X39和Z1中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物或根据条款X40、X41或Z1中任一项所述的组合物在乳制品中的用途，该乳制品选自由以下组成的组：酸奶、奶酪、黄油、接种的甜奶和液体发酵乳产品。
Q3.根据条款Q2所述的用途，其中所述乳制品是后巴氏杀菌酸奶(PPY)。
现在将在以下非限制性实施例中进一步详细描述本发明。
实施例
实施例1：冻干益生菌配制剂的制备和CFU/g测量
方法：
鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)GG(LGG，ATCC 53103)在40℃的温度和pH 5.5下发酵。将所得发酵液离心，然后添加冷冻保护剂以提高细胞在冻干过程中的存活力。冷冻保护剂由抗坏血酸钠、蔗糖和麦芽糊精DE12组成。
立即将样本在液氮(-196℃)中冷冻成颗粒，并将预冻干材料(PFD)储存在-50℃直至冻干。冻干在32℃和0.3mBar的Hetosicc冻干器中进行。将冻干材料(FD)储存在-50℃直至进一步分析。
通过测定冷冻和冻干(FD)前后能够生长和分裂的细胞数量来评估LGG在冷冻和冻干过程中的存活力和稳定性。
将每种FD制剂在stomacher袋中稀释100倍，然后重悬于无菌蛋白胨水中。在Stomacher中以正常速度混合2×120秒。然后通过将1mL转移到装有9mL蛋白胨水的稀释杯中来进一步稀释样本，并且在准备下一次稀释之前，在稀释摇床中混合每次的稀释液。
将1mL适当稀释液转移到培养皿中，倒入46℃温热的MRS(pH6.5)琼脂进行铺板。通过顺时针和逆时针方向旋转将板充分混合，以确保均匀稀释。每次稀释一式两份进行，并将板在厌氧条件37℃下使用Anaerogen(Oxoid，赛默飞世尔科技)孵育3天。
孵育后，人工计数菌落，结果表示为CFU/g。
结果：
如上所述获得的冻干LGG制剂产生的制剂具有6.4E+11CFU/g的活性。
结论：
本实施例表明，冻干(FD)的LGG可以在最小的活力损失的情况下进行制备。
实施例2：益生菌冻干粉的脂肪基质包封
方法：
在包封之前，将10g FD颗粒在咖啡研磨机中研磨3×10秒，同时在研磨步骤之间静止10秒钟，以避免咖啡研磨机产生额外热量。研磨后立即将FD粉密封在铝袋中并储存在-55±5℃。将FD粉从–55±5℃取出，并在包封之前在室温下保持30分钟。
对于包封，使用两种具有高熔点温度的脂肪(Akosoft 36和Akofine R，均来自AAK)和一种乳化剂(聚甘油蓖麻醇酯(PGPR)，Plasgaard)。称取130g Akosoft 36、300gAkofine R和20g PGPR。将脂肪混合物在75℃下通过带有连接到IKAEurostar强力控制型电子搅拌器的10个角桨的ruston型涡轮机连续搅拌进行混合，直到所有成分完全溶解为熔融的脂肪混合物。将10g FD粉(维持在22±5℃下30分钟)添加到大约75±3℃下的90g熔融的脂肪混合物中，并用IKA T25 digital ultra turrax搅拌10-20秒。
混合后，将悬浮液在液氮中造粒并储存在-55±5℃。将微囊化颗粒再次在咖啡研磨机中研磨10秒，并将微囊化冻干粉(ME-FD粉)储存在-55±5℃直至进一步实验。
用于制备脂肪包封的FD益生菌的示例性和非限制性方法可以总结如下：
FD颗粒研磨(FD粉)→混合两种脂肪混合物和一种乳化剂(熔融的脂肪混合物)→FD粉在熔融的脂肪混合物中分散→氮造粒(ME-FD颗粒)→ME-FD颗粒研磨(ME-FD粉)
结果：
与实施例1中描述的非包封冻干LGG配制剂相比，其活力为6.4E+11CFU/g，脂肪包封的FD LGG在微胶囊化后显示出6.3E+10CFU/g的活力。由于脂肪涂层的添加将LGG的浓度稀释10倍，CFU/g降低大约一个数量级是预期的。
结论：
因此，从本实施例可以得出结论，冻干LGG的脂肪包封不会导致活微生物的损失(方法差异为±0.3CFU/g)。因此，大量的活微生物可以用于对脂肪包封的冻干微生物进行进一步的后处理。
实施例3：游离或脂肪包封的FD益生菌在批次巴氏杀菌时的存活力方法：
为了评估pH 4.5的模型酸奶中游离的(未包封的)和脂肪包封的FD LGG制剂在批量巴氏灭菌时的存活力，在pH 4.5的脱脂奶基质中，在63℃加热30分钟前和后进行细胞计数。
简言之，通过在5℃下添加2％的葡萄糖δ内酯(GDL)SG-E575(Roquette)过夜，脱脂牛奶的pH降至4.5。第二天，在50mL无菌管中称取40g酸化奶，并添加5.0E+07CFU/g游离或脂肪包封的培养物。游离的FD颗粒通过连续手动混合10秒进行混合。通过用无菌铲子手动搅拌将脂肪包封的FD粉样本进行第一次混合，然后以最大速度涡旋30秒。之后，将这些样本在5℃的血液旋转器上以40rpm混合30分钟。
混合之后，将游离的FD颗粒和脂肪包封的FD粉样本在63℃水浴中热处理30分钟。热处理之后，将样本通过stomacher以正常速度均质化120秒。
在热处理前后对样本进行细胞计数。
对于游离的(未包封的)LGG FD制剂，细胞计数如下进行。将10倍的第一稀释液用9mL无菌蛋白胨水制成稀释杯。通过将1mL转移到装有9mL蛋白胨水的下一个稀释杯中，以相同的方式进行进一步稀释。在制备下一次稀释液之前，将每次的稀释液在稀释摇床中混合，然后将1mL适当稀释液转移到培养皿中。通过添加46℃温热的MRS(pH 6.5)琼脂进行铺板。通过顺时针和逆时针方向旋转将板充分混合，以确保均匀稀释。使用Anaerogen将板在37℃厌氧条件下孵育3天。孵育之后，人工计数菌落，结果表示为CFU/g。
对于脂肪包封的LGG FD制剂，使用无菌蛋白胨水和吐温80在40℃下进行细胞计数。简言之，将10倍的第一次稀释液用9mL无菌蛋白胨水以及1％吐温80(默克)在40℃下制成稀释杯。通过称量1g脂肪包封的FD粉于99g无菌蛋白胨水中，然后以正常速度混合2×120秒，在stomacher袋中制成100倍的第一次稀释液。然后将样本在40℃下孵育30分钟，并以正常速度再次混合120秒。最后，按照上述针对游离的LGG FD制剂的描述进行稀释系列、铺板、孵育和CFU/g测定。吐温80和聚山梨酯80在本文可互换使用。
结果：
后巴氏杀菌的细胞存活以log10损失(CFU/g)的结果如表2所示。游离的(未包封的)FD LGG和脂肪包封的FD LGG均表现出良好的存活力，分别具有1.99和2.03的log10损失(CFU/g)。
表2显示了游离的LGG(“LGG”)和脂肪包封的LGG(“ME-LGG”)的冻干样本在63℃下在pH 4.5脱脂牛奶基质中批量巴氏杀菌30分钟后的细胞存活力(细胞计数以CFU/g为单位)。
结论：
本实施例表明，游离和脂肪包封形式的冻干LGG均可以在后巴氏杀菌步骤中存活。
实施例4：脂肪包封对冷冻配制益生菌在储存过程中的存活力和后酸化的影响
方法：
在延长的储存时，测量了pH 4.5模型酸奶中游离的FD LGG颗粒和脂肪包封的冻干LGG粉的稳定性和后酸化。
如实施例3所述进行批量巴氏杀菌之后，将样本保持在5℃或25℃，以测定游离和脂肪包封的LGG在8周储存期间的保质期。通过进行细胞计数和测量pH，在五个时间点(T1天、T14天、T28天、T42天和T56天)测量温度和后酸化对培养物保质期的影响。对于细胞计数，将这些样本在5℃的血液旋转器上以40rpm混合30分钟。如实施例3所述测定细胞计数。
结果：
在5℃和25℃下储存56天期间，后巴氏杀菌模型酸奶中游离-LGG和ME-LGG存活细胞的空白校正细胞计数如图1所示。结果显示，在5℃和25℃储存超过56天的游离FD LGG样本中的细胞数量显著损失。同时，在25℃的游离FD LGG样本中注意到pH降低(图2)，这表明储存期间发生了后酸化。相比之下，脂肪包封的FD LGG在25℃下储存56天时保持活力，后酸化低。
结论：
该实施例表明，脂肪包封有效增强了益生菌在环境温度下长时间储存时保持活力和抵抗后酸化的能力。
参考文献
·Seifert&Mogensen(2002),Bulletin of the IDF,377,10-19
·Zheng等人,(2020),Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,70,2782–2858

Claims (15)

1.一种脂肪包封的微生物培养物，所述微生物培养物包含:
i)包含微生物培养物的制剂，以及
ii)包含一种或多种脂肪组分的包封基质，脂肪组分中的每一种具有至少25℃的熔点。
2.根据权利要求1所述的脂肪包封的微生物培养物，其中所述一种或多种脂肪组分具有至少30℃，如至少31℃、如至少32℃、如至少33°C的熔点。
3.根据前述权利要求中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物，其中所述一种或多种脂肪组分选自由以下组成的组：乳脂、可可脂、椰子脂、乳木果油、芒果仁油、棕榈油、棕榈仁油、猪油、氢化油、互酯化油及其组合。
4.根据前述权利要求中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物，其中所述包封基质进一步包含至少一种乳化剂。
5.根据前述权利要求中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物，其中所述制剂是干制剂。
6.根据前述权利要求中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物，其中所述微生物培养物是益生菌培养物。
7.根据权利要求6所述的脂肪包封的微生物培养物，其中所述益生菌培养物属于选自由以下组成的组的属：乳杆菌属(Lactobacillus)或双歧杆菌属(Bifidobacterium)。
8.根据前述权利要求中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物，其中所述微生物培养物是乳酸菌(LAB)。
9.一种包含根据前述权利要求中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物的组合物。
10.一种包含根据权利要求1至8中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物或根据权利要求9所述的组合物的乳制品。
11.根据权利要求10所述的乳制品，其中所述乳制品是后巴氏杀菌酸奶(PPY)。
12.一种用于制备根据权利要求1至8中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物或根据权利要求9所述的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
i)提供包含微生物培养物的制剂，
ii)提供包封基质，以及
iii)将所述包封基质与所述制剂混合以形成微囊化微生物培养物，
其中所述包封基质包含一种或多种脂肪组分，所述脂肪组分中的每一种具有至少25℃的熔点。
13.一种根据权利要求1至8中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物或一种根据权利要求9所述的组合物，其能够通过根据权利要求12所述的方法获得。
14.根据权利要求1至8或13中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物或根据权利要求9或13中任一项所述的组合物在选自由以下组成的组的产品中的应用：饲料、植物保健品、食品、饮料和/或药物产品。
15.一种用于制备后巴氏杀菌酸奶(PPY)的方法，所述方法包括以下步骤：
i)提供pH在4.0-4.6范围内的酸奶，
ii)向所述酸奶中添加根据权利要求1至8中任一项所述的脂肪包封的微生物培养物或根据权利要求9所述的组合物，以及
iii)对步骤ii)的酸奶进行后巴氏杀菌。
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