JP6181152B2 - アペリン阻害剤としてのポリペプチドおよびその使用 - Google Patents
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Description
本発明は、アペリン阻害剤としてのポリペプチドおよびそれらの使用に関する。
オーファンレセプターAPJ(アンギオテンシンIIタイプ1レセプターまたはAT1に関係する推定上のレセプタータンパク質)は、7個の膜貫通ドメインを有するアミノ酸380個から構成されるGタンパク質共役レセプターである。オーファンレセプターAPJの内因性リガンドを探索して、アペリン(APJ内因性リガンド)と呼ばれるペプチドがウシ胃抽出物から最初に単離され、対応するヒトタンパク質がこの発見から推定された。
本発明は、配列番号:1に示される配列[アペリン−36]の18、19、22または23位の少なくとも1個のアルギニン残基が置換または欠失されている配列を含むポリペプチドに関する。
本発明は、配列番号:1に示される配列[アペリン−36]の18、19、22または23位の少なくとも1個のアルギニン残基が置換または欠失されている配列を含むポリペプチドに関する。
− 神経原性糖尿病(例えば糖尿病性腎症、糖尿病性ニューロパチー、糖尿病性網膜症などの糖尿病合併症)、肺ガン、敗血症性ショック、口渇障害のような病状を含めたバソプレシン不適合分泌(SIADH);
− 心血管疾患:心不全、腎臓病(例えば腎不全、腎炎など)、高血圧、肝硬変、動脈硬化症、肺気腫、肺水腫;
− 代謝性疾患:肥満、食欲低下、過食、多食、高コレステロール血症、高グリセリド血症、高脂血症;
− 老年認知症、脳血管性認知症、家系性変性疾患(genealogical denaturation degenerative disease)による認知症(例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、ピック病、ハンチントン病など)、感染症に起因する認知症(例えばクロイツフェルト・ヤコブ病などの遅延ウイルス感染)、内分泌疾患、代謝性疾患、または中毒に関連する認知症(例えば甲状腺機能低下症、ビタミンB12欠乏症、アルコール中毒症、様々な薬物、金属、または有機化合物によって起こる中毒)、腫瘍によって起こる認知症(例えば脳腫瘍)、および外傷性疾患による認知症(例えば慢性硬膜下血腫)、うつ、多動児症候群(小脳障害(microencephalopathy))、意識障害、不安障害、統合失調症、恐怖症などの様々な種類の認知症;
− 成長ホルモン分泌障害(例えば巨人症、先端巨大症など)、高プロラクチン血症、乳汁漏出症
− ガン(例えば乳ガン、リンパ性白血病、膀胱ガン、卵巣ガン、前立腺ガンなど);
− ならびに膵炎、ターナー症候群、神経症、関節リウマチ、脊髄損傷、一過性脳虚血、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、骨折、創傷、アトピー性皮膚炎、骨粗鬆症、喘息、てんかん、不妊症
である。
非プロセシング型突然変異アペリン(アペリン−DM)ペプチドの合成:アペリンの非プロセシング型突然変異体(アペリン−DM)をEurogentecが合成した。ペプチド合成の間に、プロアペリンの2個の切断部位(18RRKFRR)を18SSKFSSアミノ酸配列により置換し、アペリン−DM突然変異ペプチド:LVQPRGSRNGPGPWQGGSSKFSSQRPRLSHKGPMPF(配列番号:8)を生成させた。
ヒト血小板
健康ドナーから10%(v/v)クエン酸三ナトリウム(3.8%)上に静脈血を採集した。全てのドナーから書面のインフォームドコンセントを得た。遠心分離(120g;15分;20℃)により多血小板血漿(PRP)を入手し、以前に記載されたように分画遠心法により血小板を単離した15。CaCl2を有さない改変タイロード−HEPES緩衝液(137mM NaCl、2mM KCl、0.3mM NaH2PO4、5.5mMグルコース、5mM Hepes、12mM NaHCO3、pH7.3)中に血小板のペレットを再懸濁した。
ペントバルビタールナトリウム(60mg/kg)の腹腔内注射によってマウスを麻酔した。Xylocain(登録商標)(0.5%v/v)を局所麻酔薬として使用した。心臓穿刺によって全血を採集し、80μM PPACKおよび10%(v/v)ACD−C緩衝液(124mMクエン酸ナトリウム、130mMクエン酸、110mMデキストロース、pH6.5)と混合して凝集を防止した。全血を160gで7分間遠心分離することによって多血小板血漿(PRP)を得た。670gで10分間遠心分離することによってPRPから血小板を入手し、アピラーゼ(100mU/mL)およびPGE1(1μM)の存在下で洗浄して血小板活性化を最小化し、次にCaCl2を有さない改変タイロード−HEPES緩衝液中に再懸濁した16。
遍在性発現Gタンパク質共役レセプターであるAPJの内因性リガンドとして同定されて、アペリンは、心血管系、体液ホメオスタシス、および脂肪インスリン系に複数の生理学的作用を発揮する。アペリンの発現および/または活性の脱調節は、心不全、アテローム性動脈硬化症、2型糖尿病、および肥満などの様々な疾患に連結していた。しかし、成熟アペリンペプチド、すなわちアペリン−36、アペリン−17およびアペリン−13へのアペリン前駆体(プロアペリン)の変換のメカニズムおよび機能は十分には分かっていない(図1)。シグナルペプチドの除去後、プロアペリンのタンパク質分解的切断が塩基性モチーフ内で起こり、この過程におけるプロタンパク質コンバターゼ(PC)ファミリーのメンバーの関与を示唆している。細胞トランスフェクション実験を用いて、プロアペリンのプロセシングがフューリン阻害剤であるセルピン、すなわちα1−アンチトリプシン(α1−PDX)およびプロセグメント、すなわちプロフューリン(ppフューリン)およびプロPC5(ppPC5)によって阻害されることが見いだされた。部位特異的突然変異誘発分析から、RR(60)KFおよびKFRR(64)QRのプレアペリン切断部位が確認された(図1A)。同時に、PC活性欠損細胞系LoVoから見いだされたプロアペリンプロセシングの欠如は、対塩基性アミノ酸切断酵素4(PACE4)であるPC5またはPC7によってではなく、フューリンの発現によって回復した(図2)。
本出願にわたり、様々な参考文献が、本発明が属する技術の現状を説明している。これらの参考分館の開示は、これによって参照により本開示に組み入れられる。
Claims (10)
- 配列番号:1に示される配列の18、19、22および23位の各アルギニン残基がセリン残基に置換された配列を含むポリペプチド。
- 配列番号:2に示される配列の59、60、63および64位の各アルギニン残基がセリン残基に置換された配列を含む、請求項1記載のポリペプチド。
- 薬物としての使用のための、請求項1または2記載のポリペプチド。
- 血管新生疾患の処置における使用のための、請求項1−3のいずれか記載のポリペプチド。
- ガンの処置における使用のための、請求項1−3のいずれか記載のポリペプチド。
- 請求項1または2記載のポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
- 請求項6記載の核酸を含むベクター。
- 請求項6記載の核酸または請求項7記載のベクターによってトランスフェクション、感染または形質転換された細胞。
- 請求項1または2記載のポリペプチドを産生するための、請求項8記載の細胞の使用。
- (i)請求項8記載の形質転換されたホスト細胞を、ポリペプチドを発現させるために適した条件で培養すること;および、(ii)発現されたポリペプチドを回収することからなるステップを含む、請求項1または2記載のポリペプチドを産生する方法。
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