KR20100100824A - 산화제 내성 아포지단백질 ａ-1 및 모방체 펩티드 - Google Patents

Abstract

본 발명의 정제된 폴리펩티드는 산화제 내성의 ApoA1 모방체 또는 이의 단편을 포함한다.

Description

산화제 내성 아포지단백질 Ａ-1 및 모방체 펩티드{OXIDANT RESISTANT APOLIPOPROTEIN A-1 AND MIMETIC PEPTIDES}

관련 출원

본 출원은 2007년 10월 23일 출원된 미국 가출원 제60/981,887호를 우선권으로 주장하며, 이의 주제를 참조하여 본 발명에 포함시킨다.

기술 분야

본 발명은 산화제 내성 아포지단백질 Ａ-1 및 모방체 펩티드에 관한 것이다.

순환하는 콜레스테롤은 혈장 지단백질에 의해 운반된다. 지단백질은 혈액에서 지질을 수송하는 단백질과 지질의 입자이다. 저밀도 지단백질(LDL) 및 고밀도 지단백질(HDL)이 주요한 콜레스테롤 운반체이다. LDL은 체내에서 간으로부터 간외부 조직으로 콜레스테롤의 전달을 담당하는 것으로 알려져 있다.

용어 "콜레스테롤 역수송(reverse cholesterol transport)(RCT)"은 간외부 조직으로부터, 콜레스테롤이 이화되고 제거되는 간으로 콜레스테롤을 수송하는 것을 의미한다. 혈장 HDL 입자는 조직 콜레스테롤의 스캐빈저로서 작용하는, 역수송 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. RCT는 주로 하기의 3 단계로 구성된다: (a) 콜레스테롤 유출 단계로서, 다양한 말초 세포 풀에서 콜레스테롤의 초기제거 단계; (b) 레시틴:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(LCAT) 작용에 의해 콜레스테롤 에스테르화하여, 유출된 콜레스테롤이 세포로 재유입되는 것을 방지하는 단계; 및 (c) 간 세포로 HDL 콜레스테릴 에스테르의 흡수/전달 단계.

고농도의 HDL 및 주요 HDL 단백질인 아포지단백질 A-1(ApoA1)은 오랜 동안 심혈관 질환에 대한 위험성 저하와 연관되어 왔다. ApoA1은 공지된 1차 아미노산 서열의 243 아미노산 잔기를 갖는 단일 폴리펩티드 사슬이다(Brewer et al., (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 623-630). ApoA1은 세포로부터의 콜레스테롤 유출을 매개함으로써 콜레스테롤 역수송에서 세포 콜레스테롤의 억셉터로서 작용한다.

각각의 HDL 입자는 ApoA1의 1 이상의 카피(일반적으로 2 내지 4 카피)를 함유한다. 인간에서 ApoA1은 간 및 소장에서 267잔기의 프리프로아포지단백질 형태로 합성되어 프로단백질로 분비되며, 이는 칼슘 의존적 프로테아제의 작용에 의해 신속하게 절단되어 성숙한 243 아미노산 폴리펩티드가 생성된 후 혈장으로 분비된다. ApoA1은 8개 직렬 반복 22량체 서열과 2개의 11량체 서열을 보유하는 것으로 알려져 있으며, 서열 대부분은 클래스 A 양극성 나선 구조를 형성할 수 있는 가능성을 갖는다(Segrest et al. (1974) FEBS Lett. 38: :247-253). 클래스 A 양극성 나선 구조의 특징은 극성-비극성 계면에 양으로 하전된 잔기가 존재하고, 극성면의 중심부에 음으로 하전된 잔기가 존재한다는 점을 포함한다(Segrest et al. (1974) FEBS Lett. 38: 247-253; Segrest et al. (1990) Proteins: Structure, Function, and Genetics 8: 103-117).

ApoA1은 하기 3 유형의 지질과의 안정한 복합체를 형성한다: 프리-베타-1 HDL이라 명명된 소형, 지질-결핍 복합체; 프리-베타-2 HDL이라 명명된 극성 지질(인지질 및 콜레스테롤)을 함유하는 평평한 원반형 입자; 및 구형 또는 성숙한 HDL(HDL₃ 및 HDL₂)라 명명된 극성과 비극성 지질 둘 모두를 함유하는 구형 입자. 순환 개체군에서 대부분의 HDL은 ApoA1 및 ApoAII(제2의 주요 HDL 단백질) 둘 모두를 함유하며 HDL의 A1/AII-HDL 분획이라고 한다. 그러나, ApoA1만을 함유하는 HDL 분획(A1-HDL 분획이라 함)이 RCT에서 보다 효과적인 것으로 나타났다. 어떠한 유행병학 연구는 A1-HDL 분획이 항-아테롬발생성이라는 가설을 뒷받침한다(Parra et al., 1992, Arterioscler. Thromb. 12:701-707; Decossin et al., 1997, Eur. J. Clin. Invest. 27:299-307).

높은 혈청 콜레스테롤이 관상동맥 심장 질환과 연관된다는 증거는 압도적으로 많다. 예를 들어, 죽상 동맥경화증은 동맥벽 내에 콜레스테롤이 축적되는 것을 특징으로 하는 지연 진행성 질환이다. 흥미로운 증거가 죽상 동맥경화 병변에 침착된 지질이 주로 혈장 LDL에서 유래된 것이라는 개념을 시사하였고, 그에 따라 LDL은 일반적으로 "유해 콜레스테롤"로 알려지게 되었다. 대조적으로, HDL 혈청 농도는 관상동맥 심장 질환과 역으로 상호관련되어, 네거티브 위험 인자로 간주되었다. 고농도의 혈장 HDL은 관상동맥 질환에 대해 예방적일뿐만 아니라, 실제로 죽상 동맥경화 반의 감쇠를 유도할 수 있다는 가설이 세워졌다(Badimon et al., 1992, Circulation 86(Suppl. III):86-94). 따라서, HDL은 일반적으로 "유익한 콜레스테롤"로 알려지게 되었다.

발명의 개요

본 발명은 지질이 적재된 세포로부터 콜레스테롤 유출을 촉진할 수 있는 신규한 ApoA1 모방체에 관한 것이다. 신규한 ApoA1 모방체는 지질 적재된 세포로부터 콜레스테롤 유출을 촉진할 수 있고 1 이상의 트립토판을 함유하는 이전의 ApoA1 모방체 또는 천연 ApoA1의 아미노산 서열 중 적어도 일부와 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 신규한 ApoA1 모방체는, 천연 ApoA1 또는 이전의 ApoA1 모방체와 달리, 아미노산 서열 내 1 이상의 트립토판이 산화제 내성 아미노산으로 치환된다. 신규한 ApoA1 모방체는, 예를 들어, 트립토판 함유 ApoA1 단편, 천연 ApoA1, ApoA1 융합 단백질, ApoA1 키메라 단백질, 절단형 ApoA1 단백질 또는 이전의 ApoA1 폴리펩티드 모방체의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 신규한 ApoA1 모방체의 아미노산 서열 중 1 이상의 트립토판은 산화제 내성 아미노산으로 치환된다.

본 발명은 또한 지질 적재된 세포로부터 콜레스테롤 유출을 촉진할 수 있는 신규한 ApoA1 모방체를 포함하는 약학 제제를 피험체에게 투여하여, 심혈관 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 신규한 ApoA1 모방체는 1 이상의 트립토판을 함유하고, 지질 적재된 세포로부터 콜레스테롤 유출을 촉진할 수 있는 이전 ApoA1 모방체 또는 ApoA1의 아미노산 서열 중 적어도 일부를 포함한다. 이전의 신규한 ApoA1 모방체의 아미노산 서열 중 1 이상의 트립토판은 산화제 내성 아미노산으로 치환된다. 신규한 ApoA1 모방체는 예를 들어, 트립토판 함유 ApoA1 단편, 천연 ApoA1, ApoA1 융합 단백질, ApoA1 키메라 단백질, 절단형 ApoA1 단백질 또는 ApoA1 폴리펩티드의 모방체의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 신규한 ApoA1 모방체의 아미노산 서열 중 1 이상의 트립토판은 산화제 내성 아미노산으로 치환된다.

본 발명은 또한 지질 적재된 세포로부터 콜레스테롤 유출을 촉진하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 지질 적재된 세포에 정제 폴리펩티드의 생물학적 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 상기 폴리펩티드는 서열 번호 1의 콜레스테롤 유출 억셉터 부분을 포함하는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 X는 트립토판 또는 페닐알라닌으로 이루어진 군에서 선택되고 1 이상의 X는 페닐알라닌이다.

본 발명은 또한 피험체에서 염증성 병태의 1 이상의 증상을 완화시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 지질 적재된 세포로부터 콜레스테롤 유출을 촉진할 수 있는 신규한 ApoA1 모방체를 피험체에게 투여하는 것을 포함한다. 신규한 ApoA1 모방체는 1 이상의 트립토판을 함유하고, 지질 적재된 세포로부터 콜레스테롤 유출을 촉진할 수 있는 이전의 ApoA1 모방체 또는 ApoA1의 아미노산 서열 중 적어도 일부를 포함한다. 신규한 ApoA1 모방체의 아미노산 서열 중 1 이상의 트립토판은 산화제 내성 아미노산으로 치환된다. 신규한 ApoA1 모방체는 예를 들어, 트립토판 함유 ApoA1 단편, 천연 ApoA1 융합 단백질, ApoA1 키메라 단백질, 절단형 ApoA1 단백질 또는 ApoA1 폴리펩티드의 모방체의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 신규한 ApoA1 모방체의 아미노산 서열 중 1 이상의 트립토판은 산화제 내성 아미노산으로 치환된다.

본 발명의 다른 측면은 1 이상의 트립토판 잔기를 함유하는 ApoA1, 이의 단편, 또는 이의 모방체의 콜레스테롤 유출 억셉터 기능의 MPO 산화제에 의한 손실을 경감시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 ApoA1, 이의 단편 또는 ApoA1 모방체의 1 이상의 트립토판 잔기를 산화제 내성 아미노산으로 치환시키는 것을 포함한다.

이하 첨부된 도면을 참조하여 상세한 설명을 검토하는 본 발명이 속하는 분야의 숙련가는 본 발명의 상기 및 다른 특징과 장점을 분명하게 이해할 것이다.
도 1(a-f)는 인간 아테롬 조직에서 단리한 ApoA1의 단백질 변형부의 탠덤 질량 분광분석결과를 도시한 도면이다. 인간 아테롬에서 유래된 면역친화성 정제된 ApoA1의 직접 또는 겔 트립신 분해 후에 충돌 유도된 해리 스펙트럼을 획득하였다. LC-탠덤 질량 분광분석 실험에서 이중 하전된 이온을 검출하고 세분화하였다. a. 잔기 8에 모노히드록시트립토판을 함유하는 펩티드 D1-R10(서열 번호 70). b. 잔기 50에 모노히드록시트립토판을 함유하는 펩티드 L46-K59(서열 번호 71). c. 잔기 72에 모노히드록시트립토판을 함유하는 펩티드 E62-K77(서열 번호 72). d. 잔기 108에 모노히드록시트립토판 및 잔기 112에 메티오닌 설폭시드를 함유하는 펩티드 W108-R116(서열 번호 73). e. 잔기 108의 트립토판을 디히드록시트립토판으로 전환시킨 것을 제외하고는 D와 동일한 펩티드(서열 번호 74). f. 잔기 48에 메티오닌 설폭시드를 함유하는 펩티드 L41-R49(서열 번호 75).
도 2는 인간 혈장 및 인간 아테롬 조직에서 단리한 ApoA1 상의 리신 변형을 도시한 그래프이다. ApoA1은 건강한 6 피험체의 혈장 및 6 아테롬 샘플로부터 면역친화성 크로마토그래피를 통해 단리하였다. 리신 변형의 최종 산물인 2-아미노아디프산 농도를 산가수분해 이후 질량 분광분석법을 통해 정량하고, ApoA1 리신 함량에 대해 정규화하였다. 데이타는 각 샘플에 대해 2중 측정한 값의 평균으로 나타내었다(양측 t 검증에 따라 p=0.005).
도 3은 환원성 메틸화에 의한 리신 잔기의 보호가 완전한 MPO/H₂O₂/Cl^- 시스템에 의한 불활성화로부터 보호되지 않음을 보여주는 그래프이다. ApoAl(채워진원, 실선) 및 환원성 메틸화된 ApoA1(개방원, 점선)에 대해 다양한 H₂O₂:ApoA1 몰비율에서 MPO에 의한 변형을 수행하였다. 다음으로, 이들 단백질에 대해서 ABCA1을 유도하기 위해 0.3 mM 8Br-cAMP로 처리한, 콜레스테롤 표지된 RAW264,7 세포와 5 ㎍/㎖에서 4시간 항온반응시키는 동안 ABCA1 의존적 세포 콜레스테롤 억셉터 활성을 분석하였다. 결과는 3중 측정값의 평균 ± S.D.이고, 막대가 보이지 않는 경우, S.D.는 부호 내이다.
도 4(a-b)는 메티오닌에서 발린으로 치환된 ApoA1이 MPO 매개 기능 손실에 대한 감응도가 증가된 것을 보여주는 막대 그래프(a) 및 선그래프(b)이다. a. 15:1의 H₂O₂:ApoA1 몰 비율에서, 고 용량 MPO 변형을 재조합 인간 ApoA1(rh-ApoAl), rh-ApoA1 3MV(3개 내부 Met가 Val으로 치환), 및 재조합 단백질에서 개시 Met 및 6-His 태그가 결실된, 포름산 처리된 rh-ApoAl 3MV (rh-ApoAl 3MV F.A.)에 대해 수행하였다. 세포 콜레스테롤 유출 활성을 도 1에서 기술한 바와 같이 측정하였다. 데이타는 2중 측정값의 평균 ± S.D.로 나타냈다. b. rh-ApoAl(채워진 원, 실선) 및 rh-ApoAl 3MV(개방 원, 점선)에 대해 다양한 H₂O₂:ApoA1 몰비율에서 MPO에 의한 변형을 실시하였다. 다음으로 이들 단백질에 대해 도 3에 기술한 바와 같이 ABCA1 의존적 세포 콜레스테롤 억셉터 활성을 분석하였다. 데이타는 3중 측정값의 평균 ±S.D.로 나타냈다. *, 양측 t 검정에 의해, 동일 H₂O₂:ApoA1 몰비율에서 rh-ApoAl 3MV에 대해 p<0.01.
도 5(a 및 b)는 rh-ApoA1 기능에 미치는 트립토판의 페닐알라닌 또는 루신으로의 치환의 영향 및 MPO에 의한 불활성화에 대한 페닐알라닌 치환의 내성을 보여주는 플롯을 예시한다. a. 다양한 농도의 rh-ApoA1(●, 실선), rh-ApoA1 4WF(4개의 트립토판이 페닐알라닌으로 전환됨, ○, 점선) 및 rh-ApoA1 4WL(4개의 트리토판이 루신으로 전환됨, □, 점선)을 도 3에 도시된 바와 같은 세포내 콜레스테롤 수용체 활성에 대해 분석하였다. 4WF 변이체는 대체로 이 활성을 유지한 반면, 4WL 변이체는 이 활성을 상실하였다. 데이터는 3중 측정의 평균±S.D.이다. b. rh-ApoA1(●, 실선) 및 rh-ApoA1 4WF(○, 점선)를 다양한 H₂O₂:ApoA1 몰비로 MPO에 의한 변형에 가하였다. 그 후, 이들 단백질을 도 3에 도시된 바와 같은 ABCA1 의존적 세포내 콜레스테롤 수용체 활성에 대해 분석하였다. 데이터는 3중 측정의 평균±S.D.이다. 양측 t 검정에 의한, 각각 동일한 H₂O₂:ApoA1 몰비에서의 rh-ApoA1에 대한 *, p<0.05; 및 **, p<0.0001.
도 6은 트립토판에서 페닐알라닌으로 치환된 ApoA1이 HOCl 매개성 기능 상실에 내성이 있음을 보여주는 플롯을 예시한다. rh-ApoA1(●, 실선) 및 rh- ApoA1 4WF(○, 점선)를 다양한 HOCl:ApoA1 몰비로 MPO에 의한 변형에 가하였다. 그 후, 이들 단백질을 도 3에 도시된 바와 같은 ABCA1 의존적 세포내 콜레스테롤 수용체 활성에 대해 분석하였다. 데이터는 3중 측정의 평균±S.D.이다. 양측 t 검정에 의한, 각각 동일한 HOCl:ApoA1 몰비에서의 rh-ApoA1에 대한 **, p<0.0001.
도 7(a 및 b)은 rh-ApoA1 4WF가 지질뿐만 아니라 rh-ApoA1에도 결합하고 그 지질 결합 활성이 MPO 매개성 산화에 내성이 있음을 보여주는 플롯을 예시한다. a. 디미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC) 에멀션(125 ㎍)을 제조하여 25 ㎍의 rh-ApoA1(가는 실선) 또는 rh-ApoA1 4WF(점선)을 첨가하거나 첨가하지 않고(굵은 실선) 항온처리하였다. 지질 결합 및 가용화는 24℃에서 경시적으로 325 nm에서의 흡광도를 판독함으로써 혼탁도 상실에 의해 모니터링하였다(조건당 n=3, 평균±S.D.). 4WF 변이체는 야생형 rh-ApoA1과 비교할 때 유사한 DMPC 제거율을 나타내었다. b. rh-ApoA1(●, 실선) 및 rh-ApoA1 4WF(○, 점선)를 다양한 H₂O₂:ApoA1 몰비로 MPO에 의한 변형에 가하였다. 그 후, 이들 단백질을 포스포리파제 C 의존적 LDL 응집의 방지에 의해 지질 결합 활성에 대해 분석하였다. 데이터를 H₂O₂ 부재 하에 처리한 rh-ApoA1의 지질 결합 활성으로 정규화한다. 데이터는 3중 측정의 평균±S.D.이다. 양측 t 검정에 의한, 각각 동일한 H₂O₂:ApoA1 몰비에서의 rh-ApoA1 4WF에 대한 *, p<0.05; 및 **, p<0.001. 이 데이터는 rh-ApoA1 4WF가 야생형 rh-ApoA1의 지질 결합 활성을 감소시킨 MPO 변형 용량에서 그 지질 결합 활성을 상실하지 않았음을 보여준다.
도 8은 트립토판에서 페닐알라닌으로 치환된 ApoA1이 MPO에 의한 가교결합에 여전히 감수성이 있음을 보여주는 면역블롯을 예시한다. rh-ApoA1 및 rh-ApoA1 4WF를 하기 H₂O₂:ApoA1 몰비, 즉, O, 1, 2, 3, 5 및 12.5(왼쪽에서 오른쪽으로)로 MPO에 의한 변형에 가하였다. ApoA1 가교결합은 웨스턴 블로팅으로 정성적으로 평가하였다. 분자량 표준의 이동은 왼쪽에 표시되어 있다.
도 9는 지질이 없는 rh-ApoA1의 이동을 보여주는 구배 겔을 예시한다. a. rHDL을 팔미토일 올레일 포스파티딜콜린(POPC) 및 야생형 또는 4WF rh-ApoA1(100:1 몰비의 POPC:ApoA1)을 사용한 콜레이트 투석에 의해 제조하여, 4-20% 비변성 구배 폴리아크릴아미드 겔에서 러닝하였다. 레인 1, 왼쪽에 기재된 직경을 갖는 크기 표준; 레인 2, 야생형 rh-ApoA1 rHDL 10 ㎍, 레인 3, 4WF rh-ApoA1 rHDL 10 ㎍. 두 ApoA1 변이체 모두 비변성 구배 겔 상에서 약 9.8, 12 및 17 nm의 원반을 형성하였다. 지질이 없는 rh-ApoA1의 이동은 오른쪽에 화살표로 표시되어 있다.
도 10은 0.3 mM 8Br-cAMP를 사용한 전처리에 의한 ABCA1 유도의 존재(■) 또는 부재(□) 하에 [³H]콜레스테롤 표지 RAW264.7 세포로부터의 rHDL 조제물의 콜레스테롤 유출 활성(4 시간 항온처리)을 보여주는 그래프를 예시한다. rh-ApoA1(10 ㎍/ml)은 ABCA1 의존적 콜레스테롤 수용체 활성을 나타내었으나; 야생형(WT) 및 4WF ApoA1 rHDL 조제물(10 ㎍/ml ApoA1)은 둘 다 ABCA1 의존적 콜레스테롤 수용체 활성만을 나타내었다. 막대는 평균±S.D.를 나타낸다(n=3).
도 11은 트립토판 치환을 갖는 합성 펩티드의 ABCA1 의존적 콜레스테롤 수용체 활성을 보여주는 그래프를 예시한다. 모 펩티드 p18(Ac-DWFKAFYDKVAEKFKEAF-NH₂)(서열 번호 76)을 트립토판의 페닐알라닌(p18 WF) 또는 루신(p18 WL)으로의 치환을 갖거나 갖지 않도록 합성하였다. 3종의 펩티드의 콜레스테롤 수용체 활성을, ABCA1을 유도하기 위해 0.3 mM 8Br-cAMP로 전처리한 [³H]콜레스테롤 표지 RAW264.7 세포와 4 시간 동안 항온처리하여 측정하였다. 펩티드의 농도는 컬럼 라벨에 ㎍/ml로 표시되어 있다. 막대는 평균±S.D.이다(n=3).

본 발명은 피험체에 투여될 때 산화에 대한 내성이 있고 지질 함유 세포로부터 세포내 콜레스테롤 유출을 증가시킬 수 있는 아포지단백질 A-1(ApoA1) 폴리펩티드 모방체에 관한 것이다. 본 명세서 및 특허청구범위에서 사용될 때 "산화에 대한 내성" 또는 "산화제 내성"이란 ApoA1 모방체 폴리펩티드가 ApoA1 폴리펩티드 콜레스테롤 수용 및 지질 결합 활성을 손상 또는 감소시키는 산화에 대해 적어도 부분적으로 내성을 나타낼 수 있음을 의미한다. 산화는, 예를 들어 마이엘로퍼옥시다제(MPO), MPO 생성 산화제, MPO 생성 반응성 염소화 종, MPO/H₂O₂/Cl^- 시스템, HOCl/OCl^-, MPO 생성 반응성 질소종, MPO/H₂O₂/Cl^- 시스템, 이산화질소, 퍼옥시니트라이트(ONOO^-), 퍼옥시카복시니트라이트(ONOOCO₂ ^-), 및 CO₂(또는 완충액 중의 HCO₃ ^-) 존재 하에 ONOO^-가 작용할 때 형성되는 생성물 중 하나 이상을 포함하는 산화 경로로부터의 산화와 잠재적으로 관련이 있거나 이에 의해 유발될 수 있다.

ApoA1 단백질의 트립토판 잔기는, 예를 들어, 마이엘로퍼옥시다제(MPO), 차아염소산, 또는 잠재적으로 다른 산화제에 의해 쉽게 산화되는 것으로 확인되었다. ApoA1의 트립토판 잔기의 산화는 콜레스테롤 수용 및 지질 결합 활성의 상실을 초래한다. 게다가, 천연 Apo1의 MPO 매개성 산화는 역콜레스테롤 수송의 일부로서의 세포내 콜레스테롤의 수용을 잠재적으로 불활성화시킬 수 있다.

본 발명에 따른 ApoA1 산화제 내성 모방체(또는 산화 내성 모방체)는 ApoA1, ApoA1 단편, 또는 하나 이상의 트립토판을 포함하고 여기서 하나 이상의 트립토판 잔기가 산화제 내성 펩티드 잔기와 같은 산화제 내성 잔기로 치환된(ApoA1 지질 결합 및 유출 활성을 유지하기 위해) ApoA1의 공지된 모방체의 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 일례로서, 상기 산화제 내성 잔기는 페닐알라닌과 같은 방향족 펩티드 잔기를 포함할 수 있다.

본 명세서 및 특허청구범위에서 사용될 때 "ApoA1의 모방체" 또는 "ApoA1의 종래의 모방체" 또는 "ApoA1의 공지된 모방체"란 임의의 참고문헌으로부터 확인하거나 얻을 수 있고 ApoA1 거동을 갖는 ApoA1의 모방체를 의미한다. 이들은 미국 및 외국의 특허문헌 및 간행물에서 확인되는 ApoA1의 모방체를 포함한다. 용어 "ApoA1의 모방체" 또는 "ApoA1의 종래의 모방체" 또는 "ApoA1의 공지된 모방체"는, 산화에 대해 내성이 있거나 산화제 내성인 본 발명의 ApoA1 모방체를 포함하는 의미인, 본 명세서 및 특허청구범위에서 사용되는 용어 "ApoA1 모방체" 또는 "신규한 ApoA1 모방체" 또는 "신규한 ApoA1 모방체"와 구별된다.

용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 의미하는 것으로 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 아미노산뿐만 아니라 천연 아미노산 중합체의 인공 화학적 유사체인 아미노산 중합체에도 적용된다. 본원에서 사용될 때 "방향족 아미노산"이란 하나 이상의 방향족 또는 헤테로방향족 고리를 가진 측쇄를 갖는 소수성 아미노산을 의미한다. 상기 방향족 또는 헤테로방향족 고리는 -OH, -SH, -CN, -F, -Cl, - Br, -I, -NO₂, -NO, -NH₂, -NHR, -NRR, -C(O)R, -C(O)OH, -C(O)OR, -C(O)NH₂, -C(O)NHR, -C(O)NRR 등(여기서, 각각의 R은 독립적으로 (C1-C6) 알킬, 치환된 (C1-C6) 알킬, (C1-C6) 알케닐, 치환된 (C1-C6) 알케닐, (C1-C6) 알키닐, 치환된 (C1-C6) 알키닐, (C5-C20) , 치환된 (C5-C20) 아릴, (C6-C26) 알카릴, 치환된 (C6-C26) 알카릴, 5-20원 헤테로아릴, 치환된 5-20원 헤테로아릴, 6-26원 알크헤테로아릴 또는 치환된 6-26원 알크헤테로아릴임)과 같은 하나 이상의 치환기를 포함할 수 있다. 유전자 코딩 방향족 아미노산은 페닐알라닌(F), 타이로신(Y) 및 트립토판(W)을 포함한다. 한 특정 예에서, 본 발명의 산화 내성 아미노산은 페닐알라닌일 수 있다.

산화에 대해 내성이 있는 ApoA1 모방체는, 지질 함유 세포로부터의 콜레스테롤 유출을 촉진하는 데 있어서 우수하며, 관상 혈관 질환(예를 들어, 심혈관 질환)(기존의 플라크를 감소시키고 플라크 발생을 억제하는 것 둘 다를 포함함), 아테롬성동맥경화증, 혈관 염증, 상처 치유 및 고지질혈증을 치료, 개선 및/또는 예방하기 위한 치료제로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 치료적 유효량의 본 발명에 따른 ApoA1 모방체를 피험체에 투여함으로써 피험체의 관상 혈관 질환, 혈관 염증, 상처 치유 및/또는 고지질혈증을 치료, 예방 및/또는 개선하는 방법을 포함한다.

본 발명의 한 측면에서, 상기 ApoA1 모방체는 천연 ApoA1의 하나 이상의 트립토판 함유 콜레스테롤 유출 수용체 부분을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일례로서, 상기 ApoA1 모방체는 하기 아미노산 서열을 가질 수 있다:

(여기서, X는 트립토판 잔기 또는 산화제 내성 잔기(예를 들어, 페닐알라닌)이고, 4개의 X 중 하나 이상은 산화제 내성 잔기임). 다른 예로서, 서열 번호 1의 X 중 2개 이상이 산화제 내성 잔기이거나, 서열 번호 1의 X 중 3개 이상이 산화제 내성 잔기이거나, 또는 4개의 X 모두가 산화제 내성 잔기이다.

ApoA1의 트립토판 치환된 야생형 또는 천연형을 포함하는 것 이외에 ApoA1 모방체는 또한 당업계에 알려진 ApoA1의 트립토판 치환된 천연 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, Weisgraber 등은 돌연변이 ApoA1라 일컬어지는 ApoA1-Milano의 173번 위치에서 아르기닌에 대해 시스테인이 치환될 수 있다는 것을 나타내었다(Weisgraber et al. (1983) J. Biol. Chem. 258: 2508-2513). 따라서, ApoA1-Milano를 기반으로 하는 ApoA1 모방체는 서열 번호 2의 아미노 서열을 포함할 수 있다.

여기서, X는 트립토판 또는 산화제 내성 잔기(예를 들어, 페닐알라닌)이며, 1 이상의 X가 산화제 내성 잔기에 대해 치환된다.

본 발명에 따른 ApoA1 모방체의 또다른 예는 성숙 ApoA1의 15번 위치(서열 번호 3의 서열에서 175번에 해당함)에서 시스테인 잔기를 프로세싱하는 인간 ApoA1 펩티드의 공지된 전체 모방체를 기반으로 한다. 상기 예에 따른 ApoA1 모방체는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

여기서, X는 트립토판 또는 산화제 내성 잔기(예를 들어, 페닐알라닌)이며, 1 이상의 X가 산화제 내성 잔기(예를 들어, 페닐알라닌)에 대해 치환된다.

따라서, 본 발명에서 고려되는 ApoA1 폴리펩티드 모방체는 ApoA1 형태로부터의 변성된 폴리펩티드, 및 아포지단백질 A-1(Brewer et al., (1978)), 아포지단백질 A-1 Milano(Weisgraber (1983)), 아포지단백질 A-1 Marburg(Utermann et al., (1982)J. Biol. Chem. 257: 501-507), 아포지단백질 A-1 Paris(Bielicki and Oda (2002) Biochemistry 41, 2089-2096), 프로아포지단백질 A-1을 비롯한 변이체, 또는 합성으로 형성되거나 자연적으로 발생되는 당업계에 공지된 ApoA1의 임의의 또다른 돌연변이형을 포함할 수 있다.

대안적으로, 본 발명의 ApoA1 모방체는 인간 또는 마우스 ApoA1 펩티드의 A형의 양친매성 헬릭스를 상세히 모방하는 양친매성 나선형 펩티드(즉, ApoA1의 모방체)를 포함하며, 여기서, X에 의해 의미되는 잔기는 트립토판 잔기 또는 산화제 내성 아미노산 잔기를 포함할 수 있으며, 1 이상의 X가 산화제 내성 잔기이다. 용어 '양친매성 나선형 펩티드'는 1 이상의 양친매성 헬릭스(양친매성 나선형 도메인)를 포함하는 펩티드를 의미한다. 본 발명의 특정 양친매성 나선형 펩티드는 2 이상(예를 들어, 3, 4, 5 등)의 양친매성 헬릭스를 포함할 수 있다.

용어 'A형 양친매성 헬릭스'는 극성-비극성 계면에 잔류하는 양으로 하전된 잔기 및 극성 면 중심에 잔류하는 음으로 하전된 잔기에 의한 극성 및 비극성 면들의 분리를 생성하는 a-헬릭스를 형성하는 단백질 구조를 의미한다(예를 들어, 문헌[Segrest et al. (1990) Proteins: Structure, Function, and Genetics 8: 103-117] 참조). 특히 바람직한 펩티드는 인간 또는 마우스 ApoA1의 A형 양친매성 헬릭스를 인코딩하는 엑손에 의해 인코딩되는 폴리펩티드와의 아미노산 서열 일치도가 약 50% 초과일 수 있다. 상기 펩티드는 약리학적으로 허용가능한 부형제(예를 들어, 포유류의 경구 투여에 적합한 부형제)와 조합할 수 있다.

특정 실시양태에서, ApoA1 모방체는 Apoa1의 단편 또는 모방체이며, 이는 콜레스테롤 유출을 촉진할 수 있으며, 하기 아미노산 서열 중 1 이상을 포함한다:

여기서, X는 트립토판 또는 산화제 내성 잔기(예를 들어, 페닐알라닌)이며, 각각의 서열에서 1 이상의 X가 산화제 내성 잔기에 대해 치환된다.

상기 기준 서열(서열 번호 4 ∼ 서열 번호 69)은 Fogelman 등의 미국 특허 7,144,862 B2호(이후, '862 특허)에 기술되어 있으며, 이는 그 전체로 참조 인용된다. 상기 '862호 특허는 아테롬성 동맥경화증의 1 이상의 증상을 개선하는 데 사용되는 펩티드에 관한 것이다. '862호 특허에 기술된 펩티드는 여기서 X라 명명되는 각각의 잔기에서의 트립토판 잔기를 포함한다. '862호 특허의 합성 펩티드는 A형 양친매성 나선형 모티프를 모방하도록 고안되었으며(Segrest et al. (1990) Proteins: Structure, Function and Genetics 8:103-117)) 인지질과 연관되고 인간 ApoA1과 유사한 많은 생물학적 특성을 나타낼 수 있다.

또한, ApoA1 모방체 펩티드의 상기 목록은 완전히 포괄적인 것이 아니라는 것이 주지된다. 제시된 교시를 이용하여 상기 서열의 절두(truncation), 상기 서열의 다중결합 조합(예를 들어, 이량체에서 삼량체, 사량체, 오량체 또는 팔량체 십량체의 범위), 상기 서열의 보존적 치환 및/또는 아미노산 동족체를 포함하는 상기 서열이 또한 고려된다.

ApoA1 모방체 폴리펩티드의 생물학적으로 작용하는 동등체 또는 발달체가 일반적으로 출발점으로서 ApoA1을 이용하여 제조될 수 있는 것으로 이해되게 된다. 이러한 단백질의 구조에서 수정예 및 변경예가 있을 수 있으며, 여전히 유사하거나 달리 바람직한 특성을 갖는 분자를 가진다. 예를 들어, 특정 아미노산이 콜레스테롤 유출 수용체 활성의 상당한 손실 없이 단백질 구조 내 다른 아미노산에 대해 치환될 수 있다.

당업자는 1 이상의 아미노산의 치환, 삭제 또는 첨가에 의해 본 발명의 ApoA1 아미노산 서열을 추가로 변경할 수 있으며, 이들 추가 변성예는 산화제 내성 ApoA1 폴리펩티드에 대한 생물학적 작용성 동등체를 생성할 수 있다는 것이 또한 고려되어야 한다. 상기 치환은 적재된 지질 세포로부터의 콜레스테롤 유출을 촉진하는 ApoA1의 변성능을 실질적으로 억제하기 않는다. 본 원에서 사용되는 바와 같이, '실질적으로 억제한다' 또는 '억제'는 적재된 지질 세포로부터의 콜레스테롤 유출을 촉진시키는 변성된 ApoA1 폴리펩티드의 능력에서의 임의의 측정가능한 재생성 감소를 포함한다.

또한 숙련가는 "생물학적으로 기능이 대등한" 단백질 또는 폴리펩티드의 정의에서 분자의 확정 부분 내에서 일어나고 허용 가능한 수준의 대등한 생물학적 활성을 가진 분자를 더 생성할 수 있는 변화의 수에 대한 한계가 존재한다는 개념이 내재한다는 사실을 잘 이해하고 있다. 본 발명에서 생물학적으로 기능이 대등한 단백질 및 펩티드는 이와 같이 아미노산들 중 일부, 대부분은 아니거나 또는 모두가 치환될 수 있는 이들 단백질과 펩티드로서 정의된다. 물론, 다른 치환기를 가진 복수의 별도 단백질/펩티드가 본 발명에 따라 쉽게 제조되고 사용될 수 있다.

아미노산 치환기는 일반적으로 아미노산 측쇄 치환기의 상대 유사성, 예를 들어 이들의 소수성, 친수성, 전하, 크기, 등을 기준으로 한다. 아미노산 측쇄 치환기의 크기, 모양 및 유형에 대한 분석에서 아르기닌, 리신 및 히스티딘은 모두 양하전된 잔기이고; 알라닌, 글리신 및 세린은 모두 유사한 크기임을 밝히고 있다. 따라서, 이들 고려사항을 기초로, 본 발명에서 아르기닌, 리신 및 히스티딘; 알라닌, 글리신 및 세린은 생물학적으로 기능이 있는 대등물로서 정의된다.

알톤(Alton) 외 그의 공동 출원인의 공개 출원(WO83/04053)에서 알려진 방법에 따라, 하나 이상의 잔기의 동정 또는 위치에 관해 본 발명에서 규정된 일차 입체 형태와 다른 일차 입체 형태(예, 치환, 말단 및 중간 부가 및 결손)를 가진 폴리펩티드의 미생물 발현을 위해 코딩하는 유전자를 쉽게 설계하고 제조할 수 있다. 별도로, cDNA와 게놈 유전자의 변형은 잘 알려진 부위 특이적 돌연변이 기술에 의해 쉽게 완성되고 ApoA1의 유사체와 유도체를 생성하도록 이용될 수 있다. 이러한 생성물은 산화제 내성 변형 ApoA1의 생물학적 특성 중 하나 이상을 공유하지만 다른 특성이 다를 수 있다.

본 발명의 또 다른 유형에 따라, ApoA1 모방체 폴리펩티드는 전장 인간 ApoA1 펩티드의 단편일 수 있다. 본 발명의 ApoA1 단편은 콜레스테롤 유출 촉진 및 염증성 병태의 하나 이상의 증상을 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 양상에서 상기한 ApoA1 폴리펩티드에 대해 생물학적으로 기능이 있는 대등물이다. ApoA1 단편은 약 5 내지 약 50개의 아미노산으로 구성될 수 있으며 하나 이상의 트립토판 잔기를 포함할 수 있고, 여기서 트립토판 잔기는 산화제 내성 아미노산으로 치환된다.

ApoA1 모방체 폴리펩티드와 마찬가지로, ApoA1 단편의 구조와 아미노 서열에 변형과 변화가 이루어질 수 있으며 유사하거나 그렇지 않은 경우 바람직한 기능 특성을 가진 분자를 더 얻을 수 있다는 사실이 이해될 수 있다. 예를 들어, 일부 아미노산은 콜레스테롤 유출 촉진이 감지할 수 있을 정도의 상실 없이 단백질 구조에서 다른 아미노산에 대해 치환될 수 있다.

본 발명의 ApoA1 모방체 폴리펩티드는 또한 폴리펩티드의 아미노 말단 및/또는 카르복실 말단에 커플링된 보호기를 포함할 수 있다. "보호기"란 용어는 아미노산의 작용기(예, 측쇄, 알파 아미노기, 알파 카르복실기, 등)에 부착될 때, 이 작용기의 특성을 차단하거나 차폐하는 화학 기를 의미한다. 아미노 말단 보호기의 예는 아세틸, 또는 아미노기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 구체예에서, 본 발명에서 기재한 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단에서 첫 번째 1 내지 4개 아미노산 잔기는 α-2차 나선구조의 영역["엔드 캡"(end-cap) 또는 "보호기" 잔기 또는 분절]에 안정성을 부여한다고 알려져 있는 하나 이상의 아미노산 잔기, 또는 하나 이상의 펩티드 분절에 의해 치환될 수 있다. 이러한 엔드 캡 잔기 및 분절은 본 기술에 잘 알려져 있다(참조 예, Richardson and Richardson, 1988, Science 240:1648-1652; Harper et al., 1993, Biochemistry 32(30):7605-7609; Dasgupta and Bell, 1993, Int. J. Peptide Protein Res. 41 :499-511; Seale et al., 1994, Protein Science 3:1741-1745; Doig et al., 1994, Biochemistry 33:3396-3403; Zhou et al., 1994, Proteins 18:1-7; Doig and Baldwin, 1995, Protein Science 4:1325-1336; Odaert et al., 1995, Biochemistry 34: 12820-12829; Petrukhov et al., 1996, Biochemistry 35:387-397; Doig et al., 1997, Protein Science 6: 147-155). 별도로, 본 발명에서 기재한 폴리펩티드의 첫 번째 1 내지 4개 N-말단 및/또는 C-말단 아미노산 잔기는 엔드 캡(end-cap) 잔기 또는 분절의 구조 및/또는 특성을 모방하는 펩티드 유사 부분에 의해 대체될 수 있다. 엔드 캡 모방체의 일예는 본 기술에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌(Richardson and Richardson, 1988, Science 240:1648-1652; Harper et al., 1993, Biochemistry 32(30):7605-7609; Dasgupta and Bell, 1993, Int. J. Peptide Protein Res. 41:499-511; Seale et al., 1994, Protein Science 3:1741-1745; Doig et al., 1994, Biochemistry 33:3396-3403; Zhou et al., 1994, Proteins 18:1-7; Doig and Baldwin, 1995, Protein Science 4:1325-1336; Odaert et al., 1995, Biochemistry 34:12820-12829; Petrukhov et al., 1996, Biochemistry 35:387-397; Doig et al., 1997, Protein Science 6:147-155)에 기재되어 있다.

본 발명의 ApoA1 모방체 폴리펩티드는 정제되어 분리될 수 있다. 본 발명에서 "정제되어 분리된"이란 용어는 변형된 ApoA1 모방체 또는 그의 단편 중에서 본 발명의 폴리펩티드가 지질 적재 세포로부터 콜레스테롤 유출을 촉진하는데 유용하도록 실재적으로 원치 않는 물질이 없다는 것을 의미한다. 예를 들어, 다른 인간 단백질 또는 병리학적 제제가 실재적으로 없는 변형된 재조합 인간 ApoA1 모방체 폴리펩티드를 가질 수 있다. 이들 폴리펩티드는 또한 포유동물 세포의 생성물, 또는 화학적 합성 과정의 생성물 또는 게놈 또는 cDNA 클로닝에 의해 또는 유전자 합성에 의해 얻어진 외생 DNA 서열의 원핵 또는 진핵 숙주 발현 생성물(예, 배양에서 박테리아, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포에 의해)임을 특징으로 한다. 전형적인 효모[예, 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)] 또는 원핵(예, 대장균) 숙주 세포 중 발현 생성물은 임의의 포유동물 단백질과 관련하여 포함하고 있지 않다. 척추동물(예, 인간이 아닌 포유동물(예, COS 또는 CHO) 및 조류) 중 발현 생성물은 임의의 인간 단백질과 관련하여 포함하고 있지 않다. 이용된 숙주, 및 기타 요인에 따라, 본 발명의 폴리펩티드는 포유동물 또는 다른 진핵 탄수화물로 글리코실화될 수 있거나 또는 비글리코실화될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 처음 메티오닌 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(폴리펩티드의 제1 아미노산 잔기에 관해 위치 1에서).

본 발명의 폴리펩티드는 역상 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화 크로마토그래피 등과 같은 공지된 기술에 의해 정제될 수 있다. 특정 펩티드를 정제하는데 사용된 실재 조건은 부분적으로 합성 전략에 따라 좌우될 것이며, 요인, 이를테면 순 전하, 소수성, 친수성, 등에 따라 좌우될 것이고, 당업자에게 명백할 것이다. 다량체 측쇄 펩티드는 예를 들어 이온 교환 또는 사이즈 배제 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.

친화 크로마토그래피 정제에 대해, 펩티드에 특이적으로 결합하는 임의의 항체가 사용될 수 있다. 항체의 제조를 위해, 토끼, 새앙쥐, 쥐, 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 숙주 동물이 펩티드 주사에 의해 면역화될 수 있다. 펩티드는 적합한 캐리어, 이를테면 BSA에 측쇄 작용기 또는 측쇄 작용기에 부착된 링커에 의해 부착될 수 있다. 프로인트(완전 및 불완전), 수산화 알루미늄과 같은 미네랄 겔, 리소레시틴, 플루로닌 폴리올, 폴리아니온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀과 같은 계면활성 물질, 및 BCG(bacilli Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)과 같은 잠재적으로 유용한 인간 항원보강제를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 항원보강제가 숙주종에 따라, 면역 반응을 증가시키는데 사용될 수 있다.

펩티드에 대한 단일클론성 항체는 배양 중의 연속 계대 세포주에 의해 항체 분자의 생성을 위해 제공하는 임의 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 이들은 쾰러와 밀스타인(Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495-497), 또는 카프로스키의 미국특허 제4,376,119호(본 발명에서 원용된다)에 의해 최초 기재된 하이브리도마 기술; 인간 B-세포 하이브리도마 기술(Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72; Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026- 2030); 및 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985))을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가로, 적합한 생물학적 활성의 인간 항체 분자 유래의 유전자와 함께 적합한 항원 특이성의 새앙쥐 항체 분자 유래의 유전자를 스플라이싱함으로써 "키메라 항체"의 생성을 위해 개발된 기술(Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454, Boss, U.S. Pat. No.4,816,397; Cabilly, U.S. Pat. No. 4,816,567; 이들은 본 발명에서 원용된다)이 이용될 수 있다. 또는 "인간화" 항체가 제조될 수 있다(참조 예, 퀸(Queen)의 미국특허 제5,585,089호; 본 발명에서 원용된다)). 별도로, 단일쇄 항체의 제조를 위해 기재된 기술(미국특허 제4,946,778호)은 펩티드 특이 단일쇄 항체를 제조하는데 적합할 수 있다.

특이 결합 부위의 결손을 함유하는 항체 단편은 공지 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 이러한 단편은 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생성될 수 있는, F(ab')₂, 및 F(ab')₂ 단편의 이황화 가교를 환원함으로써 생성될 수 있는, Fab 단편을 포함하나 이에한정되지 않는다. 별도로, Fab 발현 라이브러리가 관심 대상의 펩티드에 대한 원하는 특이성이 있는 단일클론성 Fab 단편의 신속하고 용이한 동정을 가능하게 하도록 구성될 수 있다(Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281).

원하는 펩티드에 특이한 항체 또는 항체 단편은 예를 들어, 아가로스에 부착될 수 있으며, 항체-아가로스 복합체는 본 발명의 펩티드를 정제하는 이뮤노크로마토그래피에 사용된다(참조, Scopes, 1984, Protein Purification: Principles and Practice, Springer- Verlag New York, Inc., NY, Livingstone, 1974, Methods In Enzymology: Immunoaffinity Chromatography of Proteins 34:723-731).

본 발명은 또한 폴리히스티딘-tag를 포함하는 ApoA1 모방체 폴리펩티드를 예상한다. 폴리히스티딘-tag는 6개 이상의 히스티딘(His) 잔기로 구성되는 단백질에서, 때로 단백질의 N- 또는 C-말단에서 아미노산 모티브(motif)이다. 또한 헥사 히스티딘-tag, 6xHis-tag로서 알려져 있으며, 상표명 His-tag^®(EMD Biosciences)으로 알려져 있다. 폴리히스티딘-tag는 대장균 또는 다른 원핵 발현 시스템에서 발현되는 폴리히스티딘-tag가 있는 재조합 단백질의 친화력 정제에 사용될 수 있다. 박테리아 세포를 원심분리에 의해 수확하고 생성된 세포 펠릿을 물리적 수단 또는 계면활성제 또는 효소, 이를테면 리소자임에 의해 용해할 수 있다. 생 용해물은 이 단계에서 박테리아로부터 유래된 몇몇 다른 단백질 중에서 재조합 단백질을 함유하며 NTA-아가로스, HisPur 수지 또는 Talon 수지와 같은 친화 배지와 함께 배양된다. 이들 친화 배지는 폴리히스티딘-tag가 마이크로몰 친화력으로 결합하는 결합 금속 이온, 니켈 또는 코발트를 함유한다. 그 후 수지를 인산염 완충액으로 세척하여 코발트 또는 니켈 이온과 특이적으로 상호작용하지 않는 단백질을 제거한다. 세척 효율은 20 mM 이미다졸의 첨가에 의해 개선될 수 있으며 그 후 통상적으로 단백질을 150-300 mM 이미다졸로 용리하지만, 더 높은 농도가 또한 사용된다. 단백질의 순도와 양은 SDS-PAGE와 웨스턴 블로팅으로 평가할 수 있다.

폴리히스티딘-tag를 이용한 친화력 정제는 통상적으로 재조합 단백질이 원핵 숙주 생물에서 발현될 때 비교적 순수한 단백질을 얻는다. 변형된 ApoA1 폴리펩티드 상호작용을 연구하기 위해 단백질 복합체의 정제와 같이 특수한 경우에서 또는 특수 목적을 위해, 효모, 곤충 세포 또는 다른 진핵 세포와 같은 고등 생물로부터 정제는 더 높은 순도를 얻도록 2개의 태그를 사용한 직렬 친화력 정제를 필요로 할 수 있다. 별도로, 니켈 이온이 아닌 고정화 코발트 이온을 사용한 단일 단계 정제는 일반적으로 순도가 실질적 증가하며 his-tag가 있는 단백질의 용출을 위해 더 낮은 농도의 이미다졸을 필요로 한다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 정의된 변형 ApoA1 모방체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명의 핵산은 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)일 수 있다. DNA 중에서, ApoA1 상보성 DNA(cDNA)(예를 들면, 인간 ApoA1에 대해 cDNA 클론을 단리하고 이를 규명한 Breslow 등이 1982년에 저술한 문헌[Proc. Nat. Acad. ScL 79: 6861-686S] 참조), 게놈 DNA (gDNA), 하이브리드 서열 또는 합성 또는 반합성 서열을 사용할 수 있다. 또한, 상기 핵산은 예를 들면 뉴클레아제에 대한 이의 내성, 이의 세포 침투 또는 세포 표적화, 이의 치료학적 효능 등의 증가 목적을 위한, 화학 변형 핵산일 수 있다. 상기 핵산은 인간, 동물, 식물, 박테리아, 바이러스, 합성 및 기타 등등 유래의 핵산일 수 있다. 상기 핵산은 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 얻을 수 있고, 특히 라이브러리 선별에 의해, 화학 합성에 의해 또는 대안적으로 라이브러리 선별에 의해 얻은 서열의 화학 또는 효소 변형을 수반하는 혼합 방법에 의해 얻을 수 있다.

본 발명의 추가의 양태는 ApoA1 모방체의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질의 원핵생물 또는 진행생물 숙주 세포에서 발현을 촉진하는 데 유용한 핵산 서열에 관한 것이다. 본 발명에 따른 재조합 ApoA1 모방체의 생성을 위해, 상기 핵산은 바이러스 또는 플라스미드 벡터에 도입시킬 수 있고, 이 벡터는 자동 복제 또는 통합 벡터일 수 있다. 이후, 선택된 세포 개체를 형질감염 또는 감염시키는 데 상기 벡터를 사용한다. 이렇게 얻은 형질감염 또는 감염된 세포를 핵산 발현을 허용하는 조건하에 배양하고, 본 발명에 따른 재조합 ApoA1 모방체를 단리한다. 재조합 수단에 의해 본 발명의 변이체 생산에 사용될 수 있는 상기 세포 숙주는 진핵생물 또는 원핵생물 숙주 중 어느 하나이다. 진핵생물 숙주의 예로는 동물 세포, 효모 또는 균류를 들 수 있다. 특히, 효모와 관련하여, 사카로미세스(Saccharomyces), 클루이베르마이세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 슈와니오마이세스(Schwanniomyces) 또는 한세누라(Hansenula) 속의 효모를 사용할 수 있다. 동물 세포, COS, CHO, CI27, N1H-3T3 등과 관련하여, 세포를 사용할 수 있다. 균류 중에서, 아스퍼질러스 종(Aspergillus ssp.) 또는 트리코더마 종(Trichoderma ssp.)을 사용할 수 있다. 원핵생물 숙주와 관련하여, 예를 들면 이. 콜라이(E. coli), 바실러스(Bacillus) 또는 스트렙토마이세스(Streptomyces)의 박테리아를 사용할 수 있다. 이후, 이렇게 단리된 변이체는 이의 치료학적 용도 관점으로 제시될 수 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태에 따라, 본 발명은 지질 축적 세포로부터 콜레스테롤 유출을 촉진할 수 있는 ApoA1 모방체의 변형 아미노산 서열 또는 이의 단편을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 제공한다. 산화제 내성 아미노산에 대해 아미노산 서열의 하나 이상의 트립토판을 치환함으로써 상기 아미노산 서열을 변형시킨다.

펩티드가 전부 유전자 코딩 아미노산으로 구성되거나, 이의 일부로 구성되는 경우, 폴리펩티드 또는 관련 부분을 또한 종래 재조합 유전자 조작 기술을 이용하여 합성할 수 있다. 재조합 생성을 위해, 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 적절한 발현 비히클, 즉 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역에 필요한 구성요소, 또는 RNA 바이러스 벡터의 경우, 복제 및 번역에 필요한 구성요소를 함유하는 벡터 내로 삽입한다. 이후, 발현 비히클을 적합한 표적 세포 내로 형질감염시키고, 그 세포는 펩티드를 발현할 것이다. 이용되는 발현 시스템에 따라, 발현된 펩티드를 이후 당해 분야에 확고히 확립된 절차에 의해 단리한다. 재조합 단백질 및 펩티드 생산에 대한 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들면, 문헌[Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y.]; 및 [Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y.] 참조, 이들 각각은 본원에 이의 전문이 참조문헌으로 포함됨).

생산 효율을 증가시키기 위해, 폴리뉴클레오티드를 효소 절단 부위에 의해 분리된 펩티드의 복수 단위를 코딩하도록 설계할 수 있고, 단독중합체(반복 펩티드 단위) 또는 이질중합체(상이한 펩티드로 함께 구성됨) 중 어느 하나를 이러한 방식으로 조작할 수 있다. 펩티드 단위를 회수하기 위해 생성되는 (예를 들면, 적절한 효소에 의한 처리에 의해) 폴리펩티드를 절단할 수 있다. 이는 단일 프로모터에 의해 구동되는 펩티드의 수율을 증가시킬 수 있다. 일 예로, 다시스트론성 폴리뉴클레오티드는 단일 mRNA가 전사되도록 설계되고, 이 단일 mRNA는 cap 비의존성 번역 조절 서열에 작동적으로 연결된 구역을 각각 코딩하는 복수 펩티드(즉, 단독중합체 또는 이질중합체)를 코딩한다. 예를 들면 내부 리보솜 진입 부위(IRES). 적절한 바이러스 발현 시스템을 사용할 때, mRNA에 의해 코딩되는 각각의 펩티드의 번역은 예를 들면 IRES에 의해 전사에서 내부 지시된다. 따라서, 다시스트론성 구성체는 단일의 대형 다시스트론성 mRNA의 전사를 지시하고, 결국 복수의 개별 펩티드의 번역을 지시한다. 이러한 접근법은 다단백질의 생산 및 효소 가공을 제거하고 단일 프로모터에 의해 구동되는 펩티드의 수율을 현저히 증가시킬 수 있다.

본원에 기재된 펩티드를 발현시키기 위해 각종 숙주 발현 벡터 시스템을 이용할 수 있다. 이러한 시스템으로는 미생물, 예컨대 적절한 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA 또는 플라스미드 DNA 발현 벡터에 의해 변형된 박테리아; 적절한 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 또는 균주 발현 벡터에 의해 변형된 효모 또는 사상균; 적절한 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들면, 바쿨로바이러스)에 의해 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들면 오이 모자이크 바이러스 또는 담배 모자이크 바이러스)에 의해 감염된 식물 세포 시스템 또는 적절한 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들면, Ti 플라스미드)에 의해 변형된 식물 세포 시스템; 또는 동물 세포 시스템을 들 수 있으나, 이들로 제한되지는 않는다.

발현 시스템의 발현 구성요소는 이의 농도 및 특이성에서 다르다. 사용되는 숙주/벡터 시스템에 따라, 구성적 및 유도성 프로모터를 비롯한 많은 전사 및 번역 구성요소 중 임의의 구성요소를 발현 벡터에서 사용할 수 있다. 예를 들면, 박테리아 시스템에서 클로닝할 때, 유도성 프로모터, 예컨대 박테리오파지 λ의 pL, plac, ptrp, ptac (ptrp-lac 하이브리드 프로모터) 등을 사용할 수 있다. 곤충 세포 시스템에서 클로닝할 때, 프로모터, 예컨대 바쿨로바이러스 다면체 프로모터를 사용할 수 있다. 식물 세포 시스템에서 클로닝할 때, 식물 세포의 게놈으로부터 유래하는 프로모터(예를 들면, 열 충격 프로모터; RUBISCO의 작은 서브유닛에 대한 프로모터; 클로로필 a/b 결합 단백질에 대한 프로모터) 또는 식물 바이러스로부터 유래하는 프로모터(예를 들면, CaMV의 35S RNA 프로모터; TMV의 코트 단백질 프로모터)를 사용할 수 있다. 포유동물 세포 시스템에서 클로닝할 때, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래하는 프로모터(예를 들면, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래하는 프로모터(예를 들면, 아데노바이러스 후기 프로모터; 우두 바이러스 7.5 K 프로모터)를 사용할 수 있다. 발현 생성물의 복수 카피를 함유하는 세포주를 생성시킬 때, SV40, BPV 및 EBV 기반 벡터를 적절한 선별 가능한 마커와 함께 사용할 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 또는 키메라 혼합물 또는 유도체 또는 이의 변형 형태, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 예를 들면 분자의 안정성, 하이브리드화 등을 개선시키기 위해 염기 잔기, 당 잔기 또는 포스페이트 주쇄에서 변형될 수 있다. 본 발명 내에 올리코뉴클레오티드는 다른 부착 기, 예컨대 펩티드(예를 들면 생체내 숙주 세포 수용체를 표적화하기 위한 펩티드) 또는 세포막을 통한 수송을 수월하게 하는 제제(예를 들면, 문헌[Letsinger et al. (1989); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556; Lemaitre et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652]; PCT 공보 번호 제WO 88/09810호(1988년 12월 15일 공개) 참조), 하이브리드화 유발 절단제(예를 들면, 문헌[Krol et al. (1988) BioTechniques 6:958-976] 참조) 또는 삽입제(intercalating agent)(예를 들면, 문헌[Zon (1988) Pharm. Res. 5:539-549] 참조)를 더 포함할 수 있다. 이를 위해, 올리고뉴클레오티드를 또 다른 분자, 예를 들면 펩티드, 하이브리드화 유발 가교제, 수송제, 하이브리드화 유발 절단제 등에 접합시킬 수 있다.

포유동물 숙주 세포에서, 많은 바이러스 기반 발현 시스템을 이용할 수 있다. 아데노바이러스를 발현 벡터로서 사용하는 경우, 코딩 서열을 아데노바이러스 전사/번역 조절 복합체, 예를 들면 후기 프로모터 및 3부(tripartite) 리더 서열에 결찰할 수 있다. 이후, 상기 키메라 유전자는 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 유전자에서 삽입할 수 있다. 바이러스 게놈의 비필수 구역(예를 들면 El 구역 또는 E3 구역)에서의 삽입에 의해 감염된 숙주에서 생육 가능하고 펩티드를 발현할 수 있는 재조합 바이러스가 생길 것이다(예를 들면, 문헌[Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81:3655-3659] 참조). 대안적으로, 우두 7.5 K 프로모터를 사용할 수 있다(예를 들면, 문헌[Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79:7415-7419; Mackett et al, 1984, J. Virol. 49:857-864; Panicali et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. 79:4927-4931] 참조).

본 발명의 폴리펩티드를 생산하기 위한 다른 발현 시스템은 당업자에게 명확할 것이다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 변형 ApoA1 폴리펩티드를 코딩하는 본원에 기재된 DNA 서열은 지금까지 이용가능하지 않던 포유동물 단백질의 아미노산 서열과 관련하여 제공하는 정보에 대해 중요하다. 다른 방식을 고려하면, 본 발명에 의해 제공되는 DNA 서열은 새롭고 유용한 바이러스 및 원형 플라스미드 DNA 벡터, 새롭고 유용한 변형된 그리고 형질감염된 원핵생물 및 진핵생물 숙주 세포(배양액에서 성장하는 박테리아 및 효모 세포 및 포유동물 세포 포함) 및 변형 산화제 내성 ApoA1 폴리펩티드 및 이의 관련 생성물을 발현할 수 있는 숙주 세포의 배양 성장에 새롭고 유용한 방법을 만드는 데 유용하다.

대안적으로, 숙주에서 비교적 안정한 존재를 조성하기 위해 벡터를 사용하지 않을 수 있다. 예를 들면, 상동성 재조합은 숙주 게놈으로의 통합을 촉진할 수 있다. 세포 유입을 촉진하는 약학적으로 허용가능한 담체, 예컨대 지질 용액 담체(예를 들면, 하전 지질), 리포솜, 또는 폴리펩티드 담체(예를 들면, 폴리리신) 내에 핵산을 배치할 수 있다. 유전자 요법에 대한 검토 논문은 문헌[Verma, Scientific American, November 1990, 68-84 페이지]이고, 이는 본원에 참조문헌으로 포함된다.

원하는 핵산을 우선 세포 내에 배치하고, 그 세포를 환자(예컨대 이식된 조직)에게 투여할 수 있거나, 또는 원하는 핵산을 생체내 유입을 위해 환자에게 직접 투여할 수 있다. 피험자에게 이식되는 세포는 예를 들면 SCF로서 상기 세포의 성장 또는 증식에 영향을 미치는 하나 이상의 인자를 사용하여 배양할 수 있다.

변형 산화제 내성 ApoA1 모방체 접합체를 코딩하는 핵산 분자, 예컨대 융합 단백질을 또한 본 발명에서 사용할 수 있다. 적합한 숙주 내로 도입될 때 ApoA1 모방체 융합 단백질을 발현하는 구성체(예를 들면, 발현 벡터)를 제조함으로써 상기 핵산을 제조할 수 있다. 예를 들면, 적합한 발현 시스템에서 구성체의 발현으로 융합 단백질을 생성시키도록, 프레임에서 또 다른 단백질을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드와 융합되는, 지질 축적 세포로부터 콜레스테롤 유출을 촉진할 수 있는 변형 산화제 내성 ApoA1 모방체 단백질을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 결찰함으로써 상기 구성체를 제조할 수 있다.

ApoA1 모방체 융합 단백질은 분자 생물학적 기법을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 임의의 융합 단백질은 본원에 개시된 치료제 및 해당 기술 분야에 공지된 것 중 어느 것이든 사용하여 설계 및 제조할 수 있다. 그 융합 단백질 기술은 2개의 부분이 선택적 분해가능한 펩티드 서열에 의해 접합되어 있는 융합 단백질을 제조하도록 용이하게 변형된다. 그러한 목적을 달성하는 데 재조합 DNA 기법의 이용은 해당 기술 분야의 당업자에게는 현재 표준적인 실시이다. 이러한 방법으로는 예를 들면 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 재조합/유전자 재조합이 포함된다. DNA 및 RNA 합성은 부가적으로 자동화 합성기를 사용하여 수행할 수 있다.

그러한 융합 단백질의 제조는 일반적으로 제1 및 제2 DNA 코딩 영역의 제조 및 원하는 융합 단백질을 코딩하는 신호 코딩 영역을 제조하기 위한 프레임 내의 그러한 영역의 기능적 결찰 또는 접합을 수반한다. 일반적으로, 구성체의 일부가 N-말단 영역으로서 또는 C-말단 영역으로서 제조되는 것은 매우 관련성이 있는 것으로 생각된다.

본 발명은 또한 약학 조성물 및/또는 제제 및 과지방혈증, 콜레스테롤과잉혈증, 관상동맥 심장 질환 및 죽상동맥경화증의 치료에서의 그러한 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 약학 조성물은 활성 성분으로서 ApoA1 모방체 폴리펩티드 또는 이의 단편 및 생체내 투여 및 전달에 적합한 약학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있다. 약학 조성물은 일반적으로 약학적으로 허용되는 담체 또는 수성 매질 중에 용해 또는 분산된 유효량의 변형 ApoA1 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함한다. 조합된 치료제가 또한 고려되며, 동일한 유형의 하기 약학 조성물이 단독 약제 또는 조합된 약제 둘 다에 사용될 수 있다.

어구 "약학적으로 또는 약리학적으로 허용되는"은 동물, 또는 인간에게 적절히 투여될 때 유해 반응, 알러지 반응 또는 적절하지 못한 다른 반응을 생성하지 않는 분자 실체 및 조성물을 의미한다. 수의학적 용도가 본 발명의 내에서 동등하게 포함되며, "약학적으로 허용되는" 제제는 임상적 및/또는 수의학적 용도 둘 다를 위한 제제를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용되는 담체"는 임의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항바이러스제, 등장제, 흡수 지연제 등을 포함한다. 그러한 매질 및 약학 활성 물질 약물은 해당 기술 분야에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 약물이 활성 성분과 비적합성인 범위를 예외로 하고, 그 사용은 치료적 조성물에서 고려된다. 인간 투여의 경우, 제제는 생물학적 기준에 관하여 식약청(FDA)이 요구하고 있는 살균성, 발열성, 전신 안전성 및 순도 기준을 충족해야 한다. 보조 활성 성분이 또한 조성물 내로 혼입될 수 있다.

담체의 예로는 예를 들면 물, 에탄올, 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및 식물성 오일을 함유하는 분산 매질 및 용매가 포함된다. 수 많은 경우에서, 등장화제, 예를 들면 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직하다. 적당한 유동성이 예를 들면 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및/또는 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.

본 발명은 다양한 경로에 의한 설명된 약학 조성물의 투여를 고려한다. 본 발명의 ApoA 모방체 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하는 약학 조성물은 순환에서 생체이용효율을 보장하는 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다. 이러한 경로로는 경구 투여, 비강 투여, 직장 투여, 복강내 주입, 혈관내 주입, 피하 주입, 경피 투여, 흡입 투여 및 근육내 주입(이들에 국한되는 것은 아님)을 비롯한 임의의 수단이 포함될 수 있다.

주입가능한 제제로는 수성 또는 유성 비히클 중의 활성 성분의 살균 현탁액, 용액 또는 에멀션을 포함한다. 이 조성물은 또한 제제화제, 예컨대 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산화제를 함유할 수 있다. 주입을 위한 제제는 단위 제형으로, 예를들면 앰플로 또는 다중 용량 용기로 제공될 수 있으며, 첨가된 보존제를 함유할 수 있다.

대안으로, 주입가능한 제제는 사용하기 전에, 발열원 무함유 물, 버퍼, 덱스트로스 용액 등(이들에 국한되는 것은 아님)을 비롯한 비히클과 재구성하기 위한 분말 형태로 제공될 수 있다. 이를 위해서, 본 발명의 ApoAl 모방체 폴리펩티드가 동결 건조될 수 있거나, 또는 동시 동결 건조된 펩티드-지질 복합체가 제조될 수 있다. 저장된 제제는 단일 제형으로 공급될 수 있고 생체내에서 사용하기 전에 재구성될 수 있다.

장시간 전달의 경우, 활성 성분은 이식 투여, 예를 들면 피하, 피내 또는 근육내 주입을 위한 데포(depot) 제제로서 제제화될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 활성 성분은 중합체 물질 또는 소수성 물질과 제제화될 수 있거나(예를, 허용되는 오일 중의 에멀션), 이온 교환 수지와 제제화될 수 있거나, 또는 난용성 유도체로서, 예를 들면 변형 ApoA1 폴리펩티드 또는 이의 단편의 난용성 염 형태로서 제제화될 수 있다.

대안으로, 피부 흡수를 위한 활성 성분을 느리게 방출시키는 접착성 디스크 또는 패치로서 제조된 경피 전달 시스템이 이용될 수 있다. 이를 위해서, 투과 증진제가 사용되어 활성 성분의 경피 투과를 용이하게 할 수 있다. 구체적인 이점은, 허혈성 심장 질환 및 콜레스테롤과잉혈증을 지닌 환자에 사용하기 위한, 본 발명의 변형 ApoA1 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 펩티드-지질 복합체를 니트로글리세린 패치 내로 혼입함으로써, 달성될 수 있다.

경구 투여의 경우, 약학 조성물은 예를 들면 약학적으로 허용되는 부형제, 예컨대 결합제(예, 전겔라틴화 메이즈(maize) 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로즈), 충전제(예, 락토스, 미세결정질 셀룰로스 또는 인산수소칼슘), 활택제(예, 스테아르산마그네슘, 탈크 또는 실리카), 붕해제(예, 감자 전분 또는 나트륨 전분 글리콜레이트) 또는 습윤화제(예, 나트륨 라우릴 설페이트)와 함께 통상적인 수단에 의해 제조된 정제 또는 캡슐의 형태를 취할 수 있다. 정제는 해당 기술 분야에 잘 알려진 방법에 의해 코팅될 수 있다. 경구 투여를 위한 액체 제제는 예를 들면 용액, 시럽 또는 현탁액의 형태를 취할 수 있거나, 또는 사하기 전에 물 또는 다른 비히클과 구성하기 위한 건조 생성물로서 제공될 수 있다. 그러한 액체 제제는 약학적으로 허용되는 첨가제, 예컨대 현탁화제(예, 소르비탈 시럽, 셀룰로스 유도체 또는 수소화 식용성 지방), 유화제(예, 레시틴 또는 아카시아), 비수성 비히클(예, 아몬드 오일, 유성 에스테르, 에틸 알콜 또는 분별된 식물성 오일), 및 보존제(예, 메틸 또는 프로필 p-히드록시벤조에이트 또는 소르브산)를 사용하여 통상적인 수단으로 제조할 수 있다. 그 제제는 또한 필요한 경우 버퍼 염, 항미제, 착색제 또는 감미제를 함유할 수 있다. 경구 투여용 제제는 활성 성분의 방출 제어를 생성하도록 적절히 제제화할 수 있다.

협측 투여의 경우, 조성물은 통상적인 방식으로 제제화딘 정제 또는 로젠지의 형태를 취할 수 있다. 직장 및 질 투여 경로의 경우, 활성 성분은 용액(보유 관장을 위한 것), 좌제 또는 연고로서 제제화할 수 있다.

흡입에 의한 투여를 위하여, 활성 성분은 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 기타 기체와 같은 추진제를 사용하여 가압팩 또는 네뷸라이저로부터 에어로졸 분무 제제의 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 용량 단위는 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 예컨대 흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는 락토오스 또는 전분과 같은 적당한 분말 베이스 및 화합물의 분말 믹스를 함유하도록 제조될 수 있다.

활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 제형을 함유할 수 있는 조성물은 필요에 따라 팩 또는 분배 장치로 제공될 수 있다. 팩은 예컨대 블리스터 팩과 같은 금속 또는 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 팩 또는 분배 장치에는 투여 지침서가 첨부될 수 있다.

"단위 제형"은 특별히 적시 전달을 위해 조정된 투여 성분의 용량 또는 하위 용량을 함유하는 것이다. 예컨대, 예시적인 "단위 제형"은 일단위 용량 또는 단위 또는 일단위 하위 용량 또는 주단위 용량 또는 단위 또는 주단위 하위 용량 등을 함유하는 것이다.

보통의 저장 및 사용 조건 하에서, 이러한 모든 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제를 함유하여야 한다. 미생물의 작용은 예컨대 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등과 같은 각종 항세균제 및 항진균제에 의하여 방지될 수 있다. 주입 가능한 조성물은 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수 지연 제제를 조성물에 사용함으로써 장기적으로 흡수시킬 수 있다.

제조전 또는 제조시, 변형된 ApoAl 폴리펩티드 또는 이의 단편은 원치 않는 저분자량 분자를 제거하기 위하여 철저히 정용 여과되어야 하고 및/또는 적절할 경우 바람직한 부형제 내로 더 용이하게 제조되도록 동결건조되어야 한다. 주입 가능한 살균 용액은 상기 열거된 각종 기타 성분을 포함하는 적절한 용매 중에 필요량의 활성 제제를 혼입하고, 필요에 따라, 살균 여과함으로써 제조된다. 일반적으로, 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것들 중에서 필요한 기타 성분들을 함유하는 살균 부형제에 살균된 각종 활성 성분을 혼입함으로써 분산액을 제조한다.

주입 가능한 살균 용액의 제조를 위한 살균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 미리 살균 여과된 용액으로부터 활성 성분 분말 및 임의의 추가의 소정 성분을 얻는 진공-건조 및 동결-건조 기술이다.

약학적 "서방" 캡슐 또는 "지속 방출" 조성물 또는 제제가 사용될 수 있고 일반적으로 적용가능하다. 서방 제제는 일반적으로 장기간에 걸쳐 일정한 약물 수준을 제공하도록 설계되며 본 발명에 따라 ApoAl 모방체 폴리펩티드 또는 이의 단편을 전달하도록 사용될 수 있다.

특정 실시양태에서, 리포솜 및/또는 나노입자는 또한 ApoAl 모방체 폴리펩티드 또는 이의 단편과 함께 사용될 수 있다. 리포솜의 형성 및 용도는 이하 요약되는 바와 같이 일반적으로 당업자에게 공지이다. 리포솜은 수성 매질 중에 분산된 인지질로부터 형성되며 자발적으로 다판 중심 겹층 소포(다판 소포(MLV)라고도 함)를 형성한다. MLV는 일반적으로 직경이 25 nm 내지 4 μm이다. MLV의 음파 처리 결과, 코어 내에 수용액을 함유하는 직경 범위가 200∼500Å인 작은 단판 소포(SUV)가 형성된다. ApoAl 모방체 폴리펩티드 또는 이의 단편은 또한 인지질 리포솜과의 자발적 반응을 통하여 또는 콜레이트 정용 여과 절차를 통하여 8∼20 nm의 인지질 원반으로 제조될 수 있다.

나노캡슐은 일반적으로 안정하고 재현 가능한 방식으로 화합물을 포획할 수 있다. 세포간 중합체 과부하로 인한 부작용을 회피하기 위하여, 이러한 초미립자(크기 약 0.1 ㎛)는 생체내에서 분해될 수 있는 중합체를 사용하도록 설계되어야 한다. 이들 요건에 부합하는 생분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자는 본 발명에서의 사용이 고려되며, 이러한 입자는 용이하게 제조될 수 있다.

추가의 약리학적으로 활성인 제제는 본 발명의 1차 활성 제제, 예컨대 펩티드와 함께 전달될 수 있다. 요법은 관련 약물의 동시 투여 또는 순차 투여를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 일 실시양태에서, 이러한 제제는 아테롬성 동맥경화증 및/또는 이의 합병증의 위험을 감소시키는 제제를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 이러한 제제는 베타 차단제, 베타 차단제와 티아지드 이노제 복합제, 스타틴, 아스피린, ACE 억제제, ACE 수용체 억제제(ARB) 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

베타 차단제의 예는 심혈관계(선택적 베타 1 차단제), 예컨대, 아세부톨롤(Sectral), 아테놀롤(Tenormin), 베탁솔롤(Kerlone), 비소프롤롤(Zebeta), 메토프롤롤 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 비선택적 차단제(동일하게 블록 베타 1 및 베타 2)의 예는 카테올롤(Cattrol), 나돌롤(Corgard), 펜부톨롤(Levatol), 핀돌롤(Visken), 프로프라놀롤(Inderal), 티몰롤(Blockadren), 라베탈롤(Normodyne, Trandate) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

베타 차단제 티아지드 이뇨제 복합제의 예는 로프레소르 HCT, ZIAC, 테노레틱, 코르지드, 티몰리드, 인데랄 LA 40/25, 인데리드, 노르모지드 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

스타틴의 예는 프로바스타틴(Pravachol/Bristol-Myers Squibb), 심바스타틴(Zocor/Merck), 로바스타틴(Mevacor/Merck), 리피토르(Pfizer) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

ACE 억제제의 예는 캅토프릴(예컨대 Squibb사의 Capoten), 베나제프릴(예컨대, Novartis사의 Lotensin), 에날라프릴(예컨대, Merck사의 Vasotec), 포시노프릴(예컨대, Bristol-Myers사의 Monopril), 리시노프릴(예컨대 Merck사의 Prinivil 또는 Astra-Zeneca사의 Zestril), 퀴나프릴(예컨대, Parke-Davis사의 Accupril), 라미프릴(예컨대, Hoechst Marion Roussel사, King Pharmaceuticals사의 Altace), 이미다프릴, 페린도프릴 에르부민(예컨대, Rhone-Polenc Rorer사의 Aceon), 트란돌라프릴(예컨대, Knoll Pharmaceutical사의 Mavik) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 적당한 ARBS(ACE 수용체 차단제)는 로사르탄(예컨대 Merck사의 Cozaar), 이르베사르탄(예컨대, Sanofi사의 Avapro), 칸데사르탄(예컨대, Astra Merck사의 Atacand), 발사르탄(예컨대, Novartis사의 Diovan) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또다른 측면은 심혈관 질환의 치료 방법에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "심혈관 질환"은 심장 또는 혈관(동맥 및 정맥)과 관련된 질환 부류를 의미한다. "심혈관 질환"은 또한 심혈관계에 영향을 주는 임의의 질환을 의미하며, 아테롬성 동맥경화증(동맥 질환)에 관련된 질환을 의미하는 것으로 사용될 수 있다. 심혈관 질환은 동맥류, 협심증, 부정맥, 아테롬성 동맥경화증, 심근증, 뇌혈관 질환, 선천성 심장 질환, 울혈성 심부전, 심근염, 판막 질환, 관상 동맥 질환, 확장성 심근병증, 심장 확장기 부전, 심장 내막염, 고혈압, 비후성 심근병증, 승모판 탈출증, 심장 발작, 혈관 협착 및 심부정맥 혈전증을 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

본원에서 사용될 때 "동맥경화증"은 중동맥 또는 대동맥의 임의의 경화(및 탄력성 손실)를 의미하고(그리스어로, "Arterio"는 동맥을 의미하고 "sclerosis"는 경화를 의미함), 소동맥경화증은 주로 소동맥에 영향을 주는 아테롬성 동맥경화증이다. 본원에서 사용될 때 "아테롬성 동맥경화증"은 특히 성숙한 죽상판으로 인한 동맥의 경화를 의미한다. 따라서, 아테롬성 동맥경화증은 동맥경화증의 일 형태이다. 아테롬성 동맥경화는 대부분 지단백질(콜레스테롤 및 트리글리세리드를 함유하는 혈장 단백질)의 침착으로 인한 동맥벽에서의 만성 염증 반응이다. 이것은 보통 동맥의 "경화" 또는 "경직"이라고도 불린다. 이것은 동맥내 다중 동맥반의 형성으로 인한 것이다.

본원에 개시된 방법은 지질이 로딩된 세포로부터 콜레스테롤 방출을 촉진할 수 있는 ApoAl 모방체 또는 이의 단편을 포함하는 약학 조성물의 치료 유효량 또는 생물학적 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. ApoAl 모방체 또는 단편 아미노산 서열은 아미노산 서열의 1 이상의 트립토판을 산화제 내성 아미노산으로 치환함으로써 상기 개시된 바와 같이 변형될 수 있다.

따라서, 상기 치료 방법 각각에서 "생물학적 유효량" 또는 "치료 유효량"은 항염증 효과, 세포의 콜레스테롤 방출 촉진 또는 심혈관 질환의 증상 개선을 발현시키는 데 효과적인 1 이상의 변형 ApoAl 폴리펩티드 또는 이의 단편의 양이다.

본원에서 사용될 때 "투여"는 항염증 효과, 세포의 콜레스테롤 방출 촉진 또는 심혈관 질환의 증상 개선을 발현시키는 데 효과적인 시간 동안 효과적인 양으로 1 이상의 ApoAl 모방체 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하는 조성물을 제공 또는 전달하는 것을 의미한다. 부분적으로 간단하고 재현가능하다는 이유에서 단백질 요법제의 수동적 투여가 일반적으로 바람직하다.

본 발명의 폴리펩티드의 산화 내성으로 인하여, 본원에 개시된 ApoAl 모방체 폴리펩티드 및 이의 단편은 또한 세포로부터 간으로의 콜레스테롤 유출을 촉진하는 방법에 사용될 수 있다. 상기 방법은 서열 번호 1의 부분에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 생물학적 유효량의 정제된 폴리펩티드를 세포에 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 X는 트립토판 또는 페닐알라닌으로 구성된 군에서 선택되고 1 이상의 X는 페닐알라닌이다.

본 발명은 피험자에게서 염증 병태의 하나 이상의 징후를 개선시키는 방법에 관한 것이다. "염증 병태의 하나 이상의 징후를 개선시키는"과 관련하여 사용되는 경우, 용어 "개선시키는(ameliorating)"은 염증 병태 및/또는 관련 병인 특유의 하나 이상의 징후의 개선, 예방 또는 제거를 의미한다. 그러한 감소는, 한정하는 것은 아니지만, 염증 단백질 생합성 감소, 혈장 콜레스테롤 감소 등을 포함한다. 상기 방법은 피험자에게 ApoA1 모방체 또는 이의 단편을 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 만성 및 급성 염증 병태의 치료는 본 발명에 의해 고려된다.

본 발명의 또 다른 양태는 상처 치유 및/또는 내피 손상, 예컨대 혈관 손상(예를 들면, 풍선 혈관 성형술) 후 일어날 수 있는 동맥 내피 세포의 치료 또는 개선을 촉진하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 ApoA1 모방체 또는 이의 단편을 포함하는 약학 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함한다. ApoA1 모방체 또는 이의 단편은 내피 세포 이동을 촉진하고, 내피 세포 손상을 치료하는 데 효과적인 양으로 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 치료 방법 및 용도는 AopA1 모방체 폴리펩티드(들) 또는 이의 단편(들)을 포함하는 하나 이상의 치료제를 코딩하는 핵산을, 표적 징후, 병태 또는 질환 부근에서 발현을 유발하는 데 효과적인 방식으로 제공하는 것까지 포괄한다. 나출(naked) DNA 전달, 재조합 유전자 및 벡터, 환자 세포의 체외 조작 등을 비롯한 세포 기반 전달과 같은 임의의 유전자 치료 기법이 사용될 수 있다.

또한, ApoA1 폴리펩티드 또는 이의 단편의 투여량 및 병용 요법이 소정의 치료 범위의 하단에 가까운 상황에서도 특정 질환 또는 환자에 대하여 다른 모든 공지된 요법과 여전히 동일하거나, 또는 심지어 더욱 효과적일 수 있음을 이해해야 한다. 불행히도, 특정한 장애 및 병태는 중장기 동안 효과적으로 치료할 수 없지만, 특히 적어도 대략 일반적으로 제시되는 다른 전략만큼 효과적인 경우에 본 발명의 요법의 유용성을 부인할 수 없다는 것은 임상의에게 분명하다.

일반적으로, 본 발명의 치료 섭생 의도는, 상당한 항염증 효과 또는 콜레스테롤 유출 촉진을 산출하면서, 여전히 투여량을 허용될 수 없는 독성과 연관된 레벨 아래로 유지시키는 것이다. 투여량 자체의 변경 이외에도, 투여 섭생은 또한 치료 전략을 최적화하도록 맞출 수 있다.

또한, 본 발명의 활성제는 여러 상황에 유용하다. 예를 들면, 심혈관 장애(예컨대, 죽상 경화증, 뇌졸중 등)는 흔히 급성기 염증 반응, 예를 들면 재발성 염증 질환, 바이러스성 감염(예컨대, 독감), 박테리아 감염, 진균류 감염, 장기 이식, 상처 또는 다른 외상 등과 연관된 급성기 염증 반응의 개시를 수반하거나 이것이 뒤따른다.

따라서, 특정 구체예에서, 본 발명은 급성 염증 반응의 위험 또는 발생 중인 피험자 및/또는 죽상 경화증 및/또는 관련 병리(예컨대, 뇌졸중)의 징후의 위험 또는 발생 중인 피험자에게 본 명세서에 기재된 하나 이상의 활성제를 투여하는 것을 고려한다.

따라서, 예를 들면 관상 동맥 질환을 갖거나 그러한 위험이 있는 사람은 독감 계절 중에 본 발명의 하나 이상의 약학 조성물을 예방 차원에서 투여받을 수 있다. 재발성 염증 병태, 예컨대 류마티스 관절염, 다양한 자가면역 질환 등을 가진 사람(또는 동물) 피험자는 죽상 경화증 또는 뇌졸중의 발생을 경감 또는 예방하기 위하여 본 명세서에 기재된 하나 이상의 제제로 치료받을 수 있다. 다른 특정예에서, 피험자는 플라크 크기를 감소시키고, 플라크를 안정화시켜서 파열 또는 미란을 방지하도록 심근 경색 후 정맥내 주사를 통하여 치료될 수 있다.

하기 실시예는 본 발명의 바람직한 구체예를 설명하기 위하여 포함시키는 것이다. 당업자라면, 하기 실시예에 개시된 기법이 본 발명자들이 발견한, 본 발명의 실시에서 잘 기능하는 기법을 나타내는 것이며, 따라서 그 실시의 바람직한 방식을 구성하는 것으로 고려될 수 있음을 이해해야 한다. 그러나, 당업자라면, 본 개시 내용에 비추어, 개시된 특정 구체예에서 많은 변경이 이루어질 수 있고, 본 발명의 사상 및 범주에서 벗어나지 않으면서 동일하거나 유사한 결과를 여전히 얻을 수 있음을 인식하고 있을 것이다.

실시예

하기 실시예에서, 본 발명자들은 ApoA1 내 MPO 민감성 잔기인 리신, 메티오닌 및 티롭토판을 변형시킨 효과를 결정하려 하였다. 4 개의 ApoA1 티롭토판 잔기를 루신으로 치환하면, 기능 손실이 초래되는 반면에, 티롭토판을 페닐알라닌으로 치환하면, ApoA1 기능을 보존할 뿐만 아니라, MPO에 의한 산화성 비활성화에 대한 내성이 부여된다는 것을 발견하였다.

방법

질량 분광계

사람 죽종 유도 ApoA1을 전술한 바와 같은 면역친화성 크로마토그래피에 의해 분리하였다. ApoA1을 글리신 완충액(pH 2.5)에 용리시키고, 직접 트립신 분해시키거나, 먼저 SDS-PAGE에 의해 분리하고, 트립신 분해하였다. 전술한 바와 같이, 질량 분광계를 실행하고, 충돌 유발 분해(collision-induced dissociation; CID) 스펙트럼을 얻었다. 클로로티로신 및 2-아미노 아디프산 분석은, 면역친화성 크로마토그래피에 의해 분리된 사람 죽종 또는 건강한 지원자의 혈장으로부터의 ApoA1의 2벌 분석을 사용하여 전술한 바와 같은 중동위원소 내부 표준을 사용하여 산 가수분해 후 수행하였다.

부위 지정 돌연변이 유발 및 재조합 ApoA1 생성

티롭토판(8, 50, 72, 108) 및 메티오닌(86, 112, 148) 잔기에 대한 점 돌연변이는 Stratagene 사제의 QuickChange Mutagenesis Kit를 사용하여 행하였으며, DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다. 플라스미드로 대장균 균주 BL21(DE-3) pLysS를 형질전환시키고, InJ ApoA1 발현 및 정제를 전술한 바와 같이 행하였다. rh-ApoA1을 PBS 또는 MPO 반응 완충액(60 mmol/L 인산나트륨, 1000 mmol/L 염화나트륨, 100 μmol/L 디에틸렌트리아민 펜타아세트산, pH 7.0)에 대하여 대량으로 투석하여 미량의 이미다졸을 제거하고, SDS-PAGE에 의해 분석하여 순도가 >95%인 것으로 나타났다. Trp 및 Met 치환으로 단백질 OD280과 BCA 또는 로리 단백질 분석에 대한 반응성이 변경되었기 때문에, 단백질 농도는 전술한 바와 같이 사람 혈장 유도 ApoA1(Biodesign) 표준으로 o-프탈디알데히드(OPA) 분석을 사용하여 유리 아민을 기준으로 하여 결정하였다. rh-ApoA1의 초기 Met 및 Hig 태그의 개열은 포름산 처리에의해 수행하였으며, 이어서 급속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC) 정제를 행하였다.

ApoA1 리신 변형

사람 혈장 유도 ApoA1을 PBS에 대하여 투석하고, 0.5 mg/mL로 희석하였다. 리신 환원 메틸화를 전술한 바와 같이 수행하였다. 리신 변형의 정도는 OPA 분석에 의해 결정하였다. 그 다음, ApoA1을 MPO 반응 완충액에 대하여 투석하고, BCA 시약을 사용하여 리신 변형 ApoA1의 단백질 농도를 결정하였다.

ApoA1 MPO 및 차아염소산 변형

전술한 바와 같이 제조한, 최종 농도 57 nmol/L의 MPO를, MPO 반응 완충액에 대하여 대량으로 투석시킨 100 ㎍/mL(3.5 μmol/L)의 ApoA1에 가하였다. 37℃에서 15 분 간격으로 4 분액의 ApoA1에 과산화수소를 다양한 몰비로 가하고, 90 분 동안 항온 처리를 계속함으로써 반응을 개시하였는데, 그 시점에서 2 mmol/L L-메티오닌을 가하여 반응을 켄칭하였다. ApoA1의 화학 변형 동안, 차아염소산나트륨(NaOCl)을 37℃에서 15 분 간격으로 4 분액 중의 다양한 농도로 MPO 완충액 중 100 ㎍/mL ApoA1에 가하였다. 60 분의 총 항온 처리 시간 후, 2 mmol/L L-메티오닌을 가하여 반응을 켄칭하였다.

ABCA-I 의존성 콜레스테롤 유출 분석

RAW 264.7 쥐과 대식 세포를 [3H] 콜레스테롤로 표지하고, 전술한 바와 같이 0.3 mmol/L 8Br-cAMP로 처리하여 ACCA1 활성을 유도하였다. 세포를 세척하고, 0.3 mmol/L 8Br-cAMP의 존재 및 다양한 ApoA1 제제의 존재 또는 부재 하에 무혈청 배지 중에서 4 시간 동안 체이스하였다. 계수 전에 신틸레이션 바이알 내에서 용매를 증발시키면서 헥산:이소프로판올(3:2) 중에서 추출함으로써 체이스 배지 중의 방사능을 측정하였다. 콜레스테롤 유출 백분율을 100X(배지 dpm)/(배지 dpm + 세포 dpm)로서 계산하였다.

지질 결합 활성 분석

ApoA1의 지질 결합 활성은, 전술한 바와 같이 수행한 사람 저밀도 지단백질의 포스포리파제 C(PLC) 매개 응집의 억제에 의하여 평가하였다. 본 발명자들은 이 분석이 DMPC 분산액 제거율 분석에 의해 관찰된 것과 유사한 결과를 제공하지만, 이는 보다 더 민감성이고, ApoA1을 덜 요한다는 것을 이미 설명하였다. 이 분석에서 사용된 ApoA1의 최종 농도는 12.5 ㎍/mL였으며, 초기 속도 LDL 응집을 대략 75% 감소시키기에 충분하였다.

AopA1 교차 결합의 검출

레인당 250 ng의 ApoA1을 SDS 샘플 완충액에서 변성시키고, SDS의 존재 하에 10% 트리스 글리신 겔에서 실행하였으며, 단백질을 폴리플루오르화비닐리덴(PVDF) 멤브레인으로 옮겼다. 멤브레인을 염소 항사람 ApoA1 1차 항체(1:1,000 희석. DiaSorin)와 토끼 항염소 HRP 콘쥬게이트 항체(1:1,000 희석)로 연속적으로 프로빙하고, ApoA1을 증강된 화학 발광 기질로 시각화하였다.

결론

인간 죽종에서의 ApoA1 변형

본 발명자들은 인간 죽종 세포로부터 단리된 ApoA1이 변형된 트립토판, 메티오닌 및 리신 잔기를 포함하였는지 여부를 측정하였다. 탠덤 질량 분석법을 이용하여, 본 발명자들은 ApoA1 내에서 8, 50, 72 및 108의 4개의 모든 트립토판 위치에서 모노히드록시트립토판 잔기, 그리고 위치 108에서 디히드록시트립토판을 검출할 수 있었다(도 1 A-F). 본 발명자들은 앞서 시험관내 MPO 변형된 ApoA1에서 잔기 W72에서 모노- 및 디-히드록시트립토판을 동정하였다(Peng, D.Q., Wu, Z., Brubaker, G., Zheng, L., Settle, M., Gross, E., Kinter, M., Hazen, S.L. and Smith, J.D. (2005) J Biol Chem 280, 33775-33784). 또한, 본 발명자들은 잔기 48 및 112에서 메티오닌 설폭시드를 검출하였다(도 1 D, E). MPO-발생된 HOCl에 의한 리신 변형을 찾기 위해, 온라인 탠덤 질량 분석으로 안정한 동위원소 희석 HPLC를 사용하여 2-아미노아디프산, 즉 MPO 발생된 산화제에 의한 리신 산화의 최종 생성물을 정량하였다. 2-아미노아디프산의 농도는 6명의 건강한 지원자의 플라즈마로부터 단리된 ApoA1에서 낮지만 검출가능한 반면, 6개의 인간 죽종 샘플로부터 단리된 ApoA1에서는 평균 농도가 현저하게 16배 상승하였다(도 2, 양측 t-테스트에 의해 p=0.005). 따라서, ApoA1의 트립토판, 메티오닌 및 리신 산화는 인간 죽종 내에서 생리학적으로 발생한다. 따라서, 본 발명자들은 이러한 변형 중 어느 것이 세포 콜레스테롤을 허용하는 능력이 감소된 기능장애성 ApoA1의 생성의 원인이 되는지를 확인하였다.

ApoA1 리신 변형

ApoA1의 양친매성 구조에서, 21개의 리신 잔기는 소수성 면의 양 면과 소수성 면에 인접한 면 상에 압도적으로 존재한다. MPO에 의한 리신 변형은 ApoA1 기능의 MPO 유도 손실의 원인이 되는 유인성 후보자이며, 본 발명자들은 앞서 ApoA1 리신 잔기가 MPO에 의한 변형이 진행될 수 있다는 것과, 양 전하를 변경시키는 ApoA1 리신 잔기의 폭넓은 화학적 변형은 ApoA1 콜레스테롤 수용체 활성의 손실을 초래한다는 것을 입증하였다. 하지만, 본 발명자들은 또한 리신 양 전하를 유지하는 환원성 메틸화에 의한 리신 변형이 ApoA1 기능의 크지 않은(modest) 감소만을 초래한다는 것을 발견하였다. ApoA1에는 92% 리신 변형을 유도하는 환원성 메틸화 또는 대조군 항온처리를 실시하고 MPO 반응 완충제에 대해 광범위하게 투석되었다. 변형 반응은 MPO의 촉매량을 이용하여 수행하고 H₂O₂:ApoA1의 몰비가 증가하였다. 반응 생성물은 cAMP 유사체로 선처리하여 ABCA1을 유도하는 콜레스테롤 표지된 RAW264 대식세포를 사용하여 콜레스테롤 수용체 활성에 대하여 검정하였다. 변형 반응에서 H₂O₂의 부재 하에, 메틸화 및 비메틸화된 대조군 ApoA1은 강하고 동등한 ABCA1 의존성 콜레스테롤 수용체 활성을 가졌다. H₂O₂의 용량을 증가시킬수록, 메틸화 및 대조군 ApoA1 샘플의 콜레스테롤 수용체 활성은 유사한 방식으로 기울어졌다(도 3). 또한, 이러한 제제의 알파 나선 함량은 CD에 의해 추정되고, 메틸화 및 대조군 ApoA1 제제는 유사하게 알파 나선 함량에서 MPO/H₂O₂ 용량 의존적 감소에 민감하였다. 리신의 1차 아민의 3차 아민으로의 환원성 메틸화가 이의 화학적 반응성을 감소시키긴 하지만 ApoA1의 기능을 보호하지는 못하기 때문에, MPO에 의한 ApoA1 리신 변형은 ApoA1의 기능 상실에 대한 원인이 되지 않았다.

메티오닌 변형은 MPO에 의해 유도되는 ApoA1 기능의 상실을 보호하지 못한다.

그리고나서 본 발명자들은 앞서 ApoA1 기능의 MPO 유도 손실과 연관되는 3개의 ApoA1 메티오닌 잔기로 관심을 돌렸다. 모든 3개의 메티오닌 대신 발린으로 치환시키기 위해, 추가의 메티오닌 개시 코돈 및 6-his 태그를 N-말단에 첨가하여 재조합 인간 ApoA1(rh-ApoA1)을 사용하였다. 본 발명자들은 앞서 콜레스테롤 수용체 활성에서의 콜레스테롤 활성, 지질 결합 활성, 및 MPO 매개된 기능 손실에 대한 민감성에서 플라즈마 유도된 ApoA1과 유사한 양상을 보였음을 입증하였다. 부위 지정 돌연변이유발을 이용하여, 발린으로 전환되는 3개의 내부 메티오닌을 갖는 단백질을 코딩하는 ApoA1 발현 구조를 생성하였고, 이를 rh-ApoA1 3MV(3 메티오닌 내지 발린)로서 지칭하였다. 하나는 개시 메티오닌을 치환할 수 없다. 하지만, 이러한 메티오닌 및 his 태그는, 2 위치에서 아스파테이트로의 글루타메이트의 치환으로 인해, 종래에 기술(Ryan, R. O., Forte, T. M., and Oda, M. N. (2003) Protein Expr. Purif. 27, 98-103)된 바와 같이 포름산 항온처리에 의해 화학 분해될 수 있고, his 태그에 인접한 Asp-Pro 디펩티드에 감수성인 독특한 포름산을 생성한다. 본 발명자들은 rh-ApoA1 3MV, 개시 Met 및 his 태그가 비손상되거나 제거되는지 여부와 관계없이, 야생형 rh-ApoA1과 비교시 ABCA1-의존성 콜레스테롤 수용체 활성과 유사하였음을 측정하였다. 또한, N-말단 메티오닌을 포함 또는 불포함하는 rh-ApoA1 3MV 및 야생형 rh-ApoA1은 높은 용량(H₂O₂: apoAI = 15:1)의 콜레스테롤 수용체 활성의 MPO 매개 손실에 동등하게 민감할 수 있었다(도 4A). rh-ApoA1 및 3MV 변이체의 MPO 변형은 H₂O₂:ApoA1의 다양하고 크지 않은 몰비에서 수행되고, 3MV 변이체는 낮은 몰비에서 콜레스테롤 수용체 활성의 손실에 더욱 민감하였다(도4B). 예를 들어, 1.4의 H₂O₂:ApoA1 비에서, 야생형 ApoA1은 콜레스테롤 수용체 활성에 경미한 손실을 가지는 반면, 3MV 변이체는 이의 콜레스테롤 수용체 활성의 대략 절반을 손실하였다. 따라서, 본 발명자들은 ApoA1 내 3개의 메티오닌 잔기가, ApoA1 기능을 산화 손상시키는 역할 대신에, 실질적으로는 무해한 흡수성 산화제에 의해 보호 역할을 한다는 것을 발견하였다.

ApoA1 트립토판 잔기는 ApoA1 기능에서의 역할이 있다

다음으로 본 발명자들은 4개의 트립토판 잔기의 각각을 류신(rh-ApoA1 4WL) 또는 페닐알라닌(rh-ApoA1 4WF)으로 변경시킴으로써 ApoA1 트립토판 잔기의 역할을 조사하였다. 트립토판 잔기의 방향족 성질은 ApoA1의 콜레스테롤 수용체 활성에 중요한 것으로 여겨지는데, 그 이유는 광범위한 ApoA1 용량 상에서 수행된 콜레스테롤 유출 연구에서 4WL 변이체는 이러한 활성의 대부분을 손실한 반면, 4WF 변이체는 이러한 활성을 유지하였기 때문이다(도 5A). 본 발명자는 K2d 알고리즘을 이용한 CD로 상기 단백질의 예측된 알파 나선 함량을 조사하였고, 야생형 단백질이 57%의 알파 나선을 가진 반면, 4WL 및 4WF 변이체는 둘다 각각 79% 및 77%의 증가된 알파 나선 함량을 가진 것을 발견하였다. 따라서, 4WL 변이체의 유출 손실 및 지질 결합 활성은 나선 함량의 손실에서 기인할 수 없다.

rh-ApoA1 및 4WF 변이체는 모두 H₂O₂의 증가 용량에서 MPO/Cl^-/H₂O₂ 산화 시스템으로 실시하였다. 도 5B는 각 단백질의 2개의 독립 제제를 이용한 4개의 상이한 실험의 연구 대표예의 결과를 도시한다. 앞서 관찰된 바와 같이, 야생형 ApoA1의 ABCA1-의존성 콜레스테롤 수용체 활성은 MPO 유도 산화를 증가시킴으로써 억제되지만; 4WF 변이체는 심지어 15의 H₂O₂:ApoA1 비에서도 이러한 활성을 유지하였다.

MPO/Cl^-/H₂O₂ 산화 시스템은 HOCl, 즉 활성 표백 시약을 발생시키고, 본 발명자들 등은 앞서 ApoA1의 HOCl 처리가 콜레스테롤 수용체 및 지질 결합 활성의 손실을 초래한다는 것을 입증한 바 있다. 따라서, 본 발명자들은 증가된 용량의 HOCl으로 야생형 ApoA1 및 4WF 변이체를 처리하였다. MPO 변형 시스템에서의 발견과 유사하게, 4WF 변이체의 콜레스테롤 수용체 활성은 이러한 처리에 내성을 가졌지만 야생형 rh-ApoA1의 유출 활성은 증가된 용량의 HOCl에 의해 저하되었다(도 6).

rh-ApoA1 및 4WF 변이체의 지질 결합 활성은 DMPC 유화액 제거 검정(clearance)에 의해 평가되었고, 양 단백질은 동등한 활성을 제시하였다(도 7A). rh-ApoA1 4WF의 세포 무함유 지질 결합 활성은 또한 PLC 매개된 LDL 응집 검정(도 7B)을 이용하는 rh-ApoA1(도 4B)과 비교시 MPO 매개된 억제에 대한 내성을 가졌다.

ApoA1의 MPO 변형은 이량체, 다량체, 및 아마도 또한 분자내 가교 결합을 유도하는 확장된 가교 결합을 유도한다. 본 발명자들은 앞서 MPO 매개된 ApoA1 가교 결합 패턴이 모든 7개의 티로신 잔기가 페닐알라닌으로 전환된 변이체에서 변경되지 않았음을 확인한 바 있다. 증가된 용량의 H₂O₂에서 rh-ApoA1 및 4WF 변이체에 MPO/Cl^-/H₂O₂ 산화를 실시시(도 5B에서 유출에 사용된 동일한 단백질 생성물을 이용함), 분자간 가교 결합과 일치하는 변성된 겔에서 모든 단백질의 변경된 이동이 관찰되었다. 하지만, 이동 패턴은 상이하였는데, 4WF 변이체는 약 70 kD에서 뚜렷한 우세 밴드를 형성한 반면, 야생형 단백질은 55∼65 kD의 덜 뚜렷한 우세 구역을 형성하였다(도 8). 단량체의 이동은 양 단백질을 변경시키며, 이는 분자내 가교 결합 또는 아미노산 변형을 가리킬 수 있다. 4WF 변이체가 콜레스테롤 수용체 활성의 MPO 매개 손실에 대한 내성을 가짐에도 불구하고, 이러한 변이체는 MPO 유도된 가교 결합에 더욱 민감하였고, 특히 낮은 용량의 H₂O₂에서 더욱 민감하였다. 본 발명자들은 또한 이러한 변형된 단백질에 CD에 의한 구조 분석을 실시하였으며, 4WF 변이체는 보다 높은 값을 가지고 시작하였음에도 불구하고 둘 다 알파 나선 함량의 손실에 민감하다는 것을 발견하였다.

본 발명자들은 또한 POCP 및 야생형 또는 4WF ApoA1을 이용한 담즙산염 투석에 의해 rHDL을 제조하였다. 둘 다 잔류하는 임의의 지질 무함유 ApoA1을 불포함하는 ∼9.8, 12 및 17 nm에서 비변성된 겔에 의해 추정된 유사한 패턴의 rHDL 디스크를 형성하였다(도 9). 본 발명자들은 야생형 및 4WF rHDL을 테스트하였고, 둘 다 완전히 지질화된 ApoA1에서 예상된 바와 같이, ABCA1 의존성 수용체 활성이 없는 RAW264.7 세포로부터 ABCA1-독립성 콜레스테롤 유출을 매개하는 동등한 능력을 지니고 있었다(도 10).

본 발명자들은 2 위치에 트립토판 잔기를 함유하는, 앞서 기술된 나선형 양친매성 펩티드 p18을 합성하였다. 본 발명자들은 또한 트립토판을 페닐알라닌(P18 WF) 또는 류신(P18 LF)으로 치환하는 유사체를 합성하였다. 본 발명자들은 이러한 트립토판-무함유 펩티드가 용량 의존성 ABCA1-매개된 콜레스테롤 수용체 활성을 갖는다는 것을 입증하였다(도 11).

당업자라면 본 발명의 상기 설명으로부터의 개선, 변화 및 변형을 이해할 것이다. 당업계의 기술 내에서의 이러한 개선, 변화 및 변형은 첨부된 청구 범위에 의해 포괄되는 것으로 간주된다. 본 출원에 인용된 모든 참고 문헌, 공보 및 특허는 그 전문이 본원에 참고 인용된다.

SEQUENCE LISTING <110> The Cleveland Clinic Foundation <120> OXIDANT RESISTANT APOLIPOPROTEIN A-I AND MIMETIC PEPTIDES <130> CCF-8808WO ORD <160> 76 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 243 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is tryptophan or an oxidant resistant amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> Xaa is tryptophan or an oxidant resistant amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (72)..(72) <223> Xaa is tryptophan or an oxidant resistant amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (108)..(108) <223> Xaa is tryptophan or an oxidant resistant amino acid <400> 1 Asp Glu Pro Pro Gln Ser Gln Xaa Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr 1 5 10 15 Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln 20 25 30 Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp 35 40 45 Asn Xaa Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu 50 55 60 Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Xaa Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu 65 70 75 80 Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys 85 90 95 Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Xaa Gln Glu Glu Met 100 105 110 Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu 115 120 125 Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu 130 135 140 Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg 145 150 155 160 Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala 165 170 175 Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr 180 185 190 His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys 195 200 205 Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser 210 215 220 Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu 225 230 235 240 Asn Thr Gln <210> 2 <211> 243 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa is tryptophan or an oxidant resistant amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa is tryptophan or an oxidant resistant amino acid <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (72)..(72) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (74)..(74) <223> Xaa is tryptophan or an oxidant resistant amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (96)..(96) <223> Xaa is tryptophan or an oxidant resistant amino acid <220> <221> misc_feature <222> (108)..(108) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (132)..(132) <223> Xaa is tryptophan or an oxidant resistant amino acid <400> 2 Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Xaa Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr 1 5 10 15 Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln 20 25 30 Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp 35 40 45 Asn Xaa Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu 50 55 60 Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Xaa Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu 65 70 75 80 Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys 85 90 95 Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Xaa Gln Glu Glu Met 100 105 110 Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu 115 120 125 Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu 130 135 140 Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Cys 145 150 155 160 Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Cys Arg Leu Ala Ala 165 170 175 Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr 180 185 190 His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys 195 200 205 Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser 210 215 220 Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu 225 230 235 240 Asn Thr Gln <210> 3 <211> 243 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa is tryptophan or an oxidant resistant amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa is tryptophan or an oxidant resistant amino acid <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (72)..(72) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (74)..(74) <223> Xaa is tryptophan or an oxidant resistant amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (96)..(96) <223> Xaa is tryptophan or an oxidant resistant amino acid <220> <221> misc_feature <222> (108)..(108) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (132)..(132) <223> Xaa is tryptophan or an oxidant resistant amino acid <400> 3 Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Xaa Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr 1 5 10 15 Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln 20 25 30 Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp 35 40 45 Asn Xaa Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu 50 55 60 Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Xaa Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu 65 70 75 80 Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys 85 90 95 Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Xaa Gln Glu Glu Met 100 105 110 Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu 115 120 125 Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Cys Pro Leu 130 135 140 Gly Glu Glu Met Arg Asp Cys Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Cys 145 150 155 160 Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala 165 170 175 Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr 180 185 190 His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys 195 200 205 Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser 210 215 220 Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu 225 230 235 240 Asn Thr Gln <210> 4 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X is an oxidant resistant amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 4 Asp Xaa Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu 1 5 10 15 Ala Phe <210> 5 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 5 Asp Xaa Phe Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu 1 5 10 15 Ala Phe <210> 6 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 6 Asp Xaa Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Phe Lys Glu 1 5 10 15 Ala Phe <210> 7 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 7 Asp Xaa Phe Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Phe Lys Glu 1 5 10 15 Ala Phe <210> 8 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 8 Asp Xaa Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Phe Glu Lys Phe Lys Glu 1 5 10 15 Phe Phe <210> 9 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 9 Asp Xaa Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Phe Phe Glu Lys Phe Lys Glu 1 5 10 15 Phe Phe <210> 10 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 10 Asp Xaa Phe Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Phe Phe Glu Lys Phe Lys Glu 1 5 10 15 Phe Phe <210> 11 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 11 Asp Xaa Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Phe Glu Lys Phe Lys Glu 1 5 10 15 Ala Phe <210> 12 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant acid <400> 12 Asp Xaa Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Phe Glu Lys Phe Lys Glu 1 5 10 15 Ala Phe <210> 13 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 13 Asp Xaa Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Phe Glu Lys Leu Lys Glu 1 5 10 15 Phe Phe <210> 14 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 14 Asp Xaa Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Phe Lys Glu 1 5 10 15 Phe Phe <210> 15 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 15 Asp Xaa Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Phe Glu Lys Phe Lys Glu 1 5 10 15 Phe Phe <210> 16 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 16 Glu Xaa Leu Lys Leu Phe Tyr Glu Lys Val Leu Glu Lys Phe Lys Glu 1 5 10 15 Ala Phe <210> 17 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 17 Glu Xaa Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Phe Lys Glu 1 5 10 15 Ala Phe <210> 18 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 18 Glu Xaa Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu 1 5 10 15 Phe Phe <210> 19 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 19 Glu Xaa Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Phe Glu Lys Phe Lys Glu 1 5 10 15 Ala Phe <210> 20 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 20 Glu Xaa Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Phe Glu Lys Leu Lys Glu 1 5 10 15 Phe Phe <210> 21 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 21 Glu Xaa Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Phe Lys Glu 1 5 10 15 Phe Phe <210> 22 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 22 Glu Xaa Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Phe Glu Lys Phe Lys Glu 1 5 10 15 Phe Phe <210> 23 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 23 Asp Xaa Leu Lys Ala Leu Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu 1 5 10 15 Ala Leu <210> 24 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 24 Asp Xaa Phe Lys Ala Phe Tyr Glu Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu 1 5 10 15 Phe Phe <210> 25 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 25 Asp Xaa Phe Lys Ala Phe Tyr Glu Lys Phe Phe Glu Lys Phe Lys Glu 1 5 10 15 Phe Phe <210> 26 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 26 Glu Xaa Leu Lys Ala Leu Tyr Glu Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu 1 5 10 15 Ala Leu <210> 27 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 27 Glu Xaa Leu Lys Ala Phe Tyr Glu Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu 1 5 10 15 Ala Phe <210> 28 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 28 Glu Xaa Phe Lys Ala Phe Tyr Glu Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu 1 5 10 15 Phe Phe <210> 29 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 29 Glu Xaa Leu Lys Ala Phe Tyr Glu Lys Val Phe Glu Lys Phe Lys Glu 1 5 10 15 Phe Phe <210> 30 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 30 Glu Xaa Leu Lys Ala Phe Tyr Glu Lys Phe Phe Glu Lys Phe Lys Glu 1 5 10 15 Phe Phe <210> 31 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 31 Glu Xaa Phe Lys Ala Phe Tyr Glu Lys Phe Phe Glu Lys Phe Lys Glu 1 5 10 15 Phe Phe <210> 32 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is tryptophan or an oxidant resistant amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa is tryptophan or an oxidant resistant amino acid <400> 32 Asp Phe Leu Lys Ala Xaa Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu 1 5 10 15 Ala Xaa <210> 33 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is tryptophan or an oxidant resistant amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa is tryptophan or an oxidant resistant amino acid <400> 33 Glu Phe Leu Lys Ala Xaa Tyr Glu Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu 1 5 10 15 Ala Xaa <210> 34 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is tryptophan or an oxidant resistant amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is tryptophan or an oxidant resistant amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa is tryptophan or an oxidant resistant amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <400> 34 Asp Phe Xaa Lys Ala Xaa Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu 1 5 10 15 Xaa Xaa <210> 35 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is tryptophan or oxidant resistant amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is tryptophan or oxidant resistant amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa is tryptophan or oxidant resistant amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa is tryptophan or oxidant resistant amino acid <400> 35 Glu Phe Xaa Lys Ala Xaa Tyr Glu Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu 1 5 10 15 Xaa Xaa <210> 36 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 36 Asp Lys Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Phe Glu Xaa Ala Lys Glu 1 5 10 15 Ala Phe <210> 37 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 37 Asp Lys Xaa Lys Ala Val Tyr Asp Lys Phe Ala Glu Ala Phe Lys Glu 1 5 10 15 Phe Leu <210> 38 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 38 Glu Lys Leu Lys Ala Phe Tyr Glu Lys Val Phe Glu Xaa Ala Lys Glu 1 5 10 15 Ala Phe <210> 39 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 39 Glu Lys Xaa Lys Ala Val Tyr Glu Lys Phe Ala Glu Ala Phe Lys Glu 1 5 10 15 Phe Leu <210> 40 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 40 Asp Xaa Leu Lys Ala Phe Val Asp Lys Phe Ala Glu Lys Phe Lys Glu 1 5 10 15 Ala Tyr <210> 41 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 41 Glu Lys Xaa Lys Ala Val Tyr Glu Lys Phe Ala Glu Ala Phe Lys Glu 1 5 10 15 Phe Leu <210> 42 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 42 Asp Xaa Leu Lys Ala Phe Val Tyr Asp Lys Val Phe Lys Leu Lys Glu 1 5 10 15 Phe Phe <210> 43 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 43 Glu Xaa Leu Lys Ala Phe Val Tyr Glu Lys Val Phe Lys Leu Lys Glu 1 5 10 15 Phe Phe <210> 44 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 44 Asp Xaa Leu Arg Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu 1 5 10 15 Ala Phe <210> 45 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 45 Glu Xaa Leu Arg Ala Phe Tyr Glu Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu 1 5 10 15 Ala Phe <210> 46 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 46 Asp Xaa Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Arg Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu 1 5 10 15 Ala Phe <210> 47 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 47 Glu Xaa Leu Lys Ala Phe Tyr Glu Arg Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu 1 5 10 15 Ala Phe <210> 48 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 48 Asp Xaa Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Arg Leu Lys Glu 1 5 10 15 Ala Phe <210> 49 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 49 Glu Xaa Leu Lys Ala Phe Tyr Glu Lys Val Ala Glu Arg Leu Lys Glu 1 5 10 15 Ala Phe <210> 50 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 50 Asp Xaa Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Arg Glu 1 5 10 15 Ala Phe <210> 51 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 51 Glu Xaa Leu Lys Ala Phe Tyr Glu Lys Val Ala Glu Lys Leu Arg Glu 1 5 10 15 Ala Phe <210> 52 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 52 Asp Xaa Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Arg Val Ala Glu Arg Leu Lys Glu 1 5 10 15 Ala Phe <210> 53 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 53 Glu Xaa Leu Lys Ala Phe Tyr Glu Arg Val Ala Glu Arg Leu Lys Glu 1 5 10 15 Ala Phe <210> 54 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 54 Asp Xaa Leu Arg Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Arg Glu 1 5 10 15 Ala Phe <210> 55 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 55 Glu Xaa Leu Arg Ala Phe Tyr Glu Lys Val Ala Glu Lys Leu Arg Glu 1 5 10 15 Ala Phe <210> 56 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 56 Asp Xaa Leu Arg Ala Phe Tyr Asp Arg Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu 1 5 10 15 Ala Phe <210> 57 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 57 Xaa Leu Arg Ala Phe Tyr Glu Arg Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu Ala 1 5 10 15 Phe <210> 58 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 58 Asp Xaa Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Arg Leu Arg Glu 1 5 10 15 Ala Phe <210> 59 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 59 Glu Xaa Leu Lys Ala Phe Tyr Glu Lys Val Ala Glu Arg Leu Arg Glu 1 5 10 15 Ala Phe <210> 60 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 60 Asp Xaa Leu Arg Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Arg Leu Lys Glu 1 5 10 15 Ala Phe <210> 61 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an oxidant resistant amino acid <400> 61 Glu Xaa Leu Arg Ala Phe Tyr Glu Lys Val Ala Glu Arg Leu Lys Glu 1 5 10 15 Ala Phe <210> 62 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is tryptophan or an oxidant resistant amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa is tryptophan or an oxidant resistant amino acid <400> 62 Asp Xaa Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu 1 5 10 15 Ala Phe Pro Asp Xaa Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys 20 25 30 Leu Lys Glu Ala Phe 35 <210> 63 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is tryptophan or an oxidant resistant amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa is tryptophan or an oxidant resistant amino acid <400> 63 Asp Xaa Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu 1 5 10 15 Phe Phe Pro Asp Xaa Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys 20 25 30 Leu Lys Glu Phe Phe 35 <210> 64 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is tryptophan or an oxidant resistant amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa is tryptophan or an oxidant resistant amino acid <400> 64 Asp Xaa Phe Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu 1 5 10 15 Ala Phe Pro Asp Xaa Phe Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys 20 25 30 Leu Lys Glu Ala Phe 35 <210> 65 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is tryptophan or an oxidant resistant amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa is tryptophan or an oxidant resistant amino acid <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 65 Asp Lys Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Phe Glu Xaa Ala Lys Glu 1 5 10 15 Ala Phe Pro Asp Lys Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Phe Glu Xaa 20 25 30 Leu Lys Glu Ala Phe 35 <210> 66 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is tryptophan or an oxidant resistant amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa is tryptophan or an oxidant resistant amino acid <400> 66 Asp Lys Xaa Lys Ala Val Tyr Asp Lys Phe Ala Glu Ala Phe Lys Glu 1 5 10 15 Phe Leu Pro Asp Lys Xaa Lys Ala Val Tyr Asp Lys Phe Ala Glu Ala 20 25 30 Phe Lys Glu Phe Leu 35 <210> 67 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is tryptophan or an oxidant resistant amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa is tryptophan or an oxidant resistant amino acid <400> 67 Asp Xaa Phe Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Phe Lys Glu 1 5 10 15 Ala Phe Pro Asp Xaa Phe Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys 20 25 30 Phe Lys Glu Ala Phe 35 <210> 68 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is tryptophan or an oxidant resistant amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa is tryptophan or an oxidant resistant amino acid <400> 68 Asp Xaa Leu Lys Ala Phe Val Tyr Asp Lys Val Phe Lys Leu Lys Glu 1 5 10 15 Phe Phe Pro Asp Xaa Leu Lys Ala Phe Val Tyr Asp Lys Val Phe Lys 20 25 30 Leu Lys Glu Phe Phe 35 <210> 69 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is tryptophan or an oxidant resistant amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa is tryptophan or an oxidant resistant amino acid <400> 69 Asp Xaa Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Phe Ala Glu Lys Phe Lys Glu 1 5 10 15 Phe Phe Pro Asp Xaa Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Phe Ala Glu Lys 20 25 30 Phe Lys Glu Phe Phe 35 <210> 70 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg 1 5 10 <210> 71 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys 1 5 10 <210> 72 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys 1 5 10 15 <210> 73 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg 1 5 <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg 1 5 <210> 75 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg 1 5 <210> 76 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Asp Trp Phe Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Phe Lys Glu 1 5 10 15 Ala Phe

Claims (48)

1. 지질 적재 세포로부터의 콜레스테롤 유출을 촉진할 수 있는 ApoA1 모방체를 포함하는 정제된 폴리펩티드로서, 상기 ApoA1 모방체는 하나 이상의 트립토판을 함유하는 ApoA1 또는 ApoA1 모방체의 아미노산 서열의 적어도 일부를 포함하는 아미노산 서열을 가지고, 상기 ApoA1 또는 ApoA1 모방체의 하나 이상의 트립토판이 ApoA1 모방체의 아미노산 서열에서 산화제 내성 아미노산으로 치환된 것인 정제된 폴리펩티드.
2. 제1항에 있어서, 상기 ApoA1 모방체는 MPO MPO-생성된 산화제에 의한 산화, MPO-생성된 반응성 염화 종에 의한 산화, MPO/H₂O₂/Cl^- 시스템과 관련된 산화, HOCl/OCl^-에 의한 산화, MPO 생성된 반응성 질소 종에 의한 산화, MPO/H₂O₂/NO₂ ^- 시스템과 관련된 산화, 이산화질소에 의한 산화, 퍼옥시니트라이트(ONOO^-)에 의한 산화, 퍼옥시카르복시니트라이트(ONOOCO₂ ^-)에 의한 산화, 또는 완충액 중 CO₂ 또는 HCO₃ ^-의 존재 하에 ONOO^-가 작용할 때 형성되는 산물에 의한 산화 중 하나 이상의 산화에 대해 내성이 있는 것인 폴리펩티드.
3. 제1항에 있어서, 상기 산화제 내성 아미노산은 페닐알라닌인 폴리펩티드.
4. 제1항에 있어서, 서열 번호 1의 적어도 일부를 포함하고, 이 때 X는 트립토판 또는 페닐알라닌으로 이루어진 군에서 선택되고 하나 이상의 X는 페닐알라닌인 폴리펩티드.
5. 제1항에 있어서, 상기 ApoA1 모방체는 하나 이상의 트립토판을 포함하는 천연 ApoA1의 약 5∼약 50개의 아미노산으로 실질적으로 이루어지고, 하나 이상의 트립토판은 산화제 내성 아미노산으로 치환되는 것인 폴리펩티드.
6. 제1항에 있어서, 상기 ApoA1 모방체는 서열 번호 2 내지 69로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, 이 때 X는 트립토판 또는 산화제 내성 아미노산이며 하나 이상의 X는 산화제 내성 잔기 대신인 것인 폴리펩티드.
7. 제1항에 있어서, 하나 이상의 "D" 아미노산 잔기를 포함하는 것인 폴리펩티드.
8. 제1항에 있어서, 전부 또는 대부분의 에난티오머 아미노산이 "D" 아미노산인 폴리펩티드.
9. 제1항에 있어서, 보호기를 추가로 포함하는 것인 폴리펩티드.
10. 제1항에 있어서, 폴리히스티딘-태그를 더 포함하는 것인 폴리펩티드.
11. 제1항에 있어서, 피험체에게 투여되는 경우 마이엘로퍼옥시다제(MPO) 불활성화에 의한 산화성 불활성화에 대해 내성이 있는 것인 폴리펩티드.
12. 제1항에 있어서, 융합 단백질인 폴리펩티드.
13. 천연 아미노산 서열의 하나 이상의 트립토판 잔기의 산화제 내성 아미노산으로의 치환에 의해 변형된 천연 아포지단백질 아미노산 서열을 포함하는 정제된 아포지단백질 폴리펩티드.
14. 제1항의 폴리펩티드 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
15. 제14항에 있어서, 경구 투여, 비강 투여, 직장 투여, 복강내 주사, 혈관내 주사, 피하 주사, 경피 투여, 흡입 투여 및 근내 주사로 이루어진 군에서 선택되는 경로로 피험체에게 투여하기 위해 제형화된 약학 조성물.
16. 지질 적재 세포로부터의 콜레스테롤 유출을 촉진할 수 있는 ApoA1 모방체를 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 심혈관 질환의 치료 방법으로서, 상기 ApoA1 모방체는 하나 이상의 트립토판을 함유하는 ApoA1 또는 ApoA1 모방체의 아미노산 서열의 적어도 일부를 포함하는 아미노산 서열을 가지고, 상기 ApoA1 또는 ApoA1 모방체의 하나 이상의 트립토판이 ApoA1 모방체의 아미노산 서열에서 산화제 내성 아미노산으로 치환된 것인 치료 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 ApoA1 모방체는 MPO MPO-생성된 산화제에 의한 산화, MPO-생성된 반응성 염화 종에 의한 산화, MPO/H₂O₂/Cl^- 시스템과 관련된 산화, HOCl/OCl^-에 의한 산화, MPO 생성된 반응성 질소 종에 의한 산화, MPO/H₂O₂/NO₂ ^- 시스템과 관련된 산화, 이산화질소에 의한 산화, 퍼옥시니트라이트(ONOO^-)에 의한 산화, 퍼옥시카르복시니트라이트(ONOOCO₂ ^-)에 의한 산화, 또는 완충액 중 CO₂ 또는 HCO₃ ^-의 존재 하에 ONOO^-가 작용할 때 형성되는 산물에 의한 산화 중 하나 이상의 산화에 대해 내성이 있는 것인 치료 방법.
18. 제16항에 있어서, 상기 산화제 내성 아미노산은 페닐알라닌인 치료 방법.
19. 제16항에 있어서, 서열 번호 1의 적어도 일부를 포함하고, 이 때 X는 트립토판 또는 페닐알라닌으로 이루어진 군에서 선택되고, 하나 이상의 X는 페닐알라닌인 치료 방법.
20. 제16항에 있어서, 상기 ApoA1 모방체는 하나 이상의 트립토판을 포함하는 천연 ApoA1의 약 5∼약 50개의 아미노산으로 실질적으로 이루어지고, 하나 이상의 트립토판은 산화제 내성 아미노산으로 치환되는 것인 치료 방법.
21. 제16항에 있어서, 상기 ApoA1 모방체는 서열 번호 2 내지 69로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, 이 때 X는 트립토판 또는 산화제 내성 아미노산이며 하나 이상의 X는 산화제 내성 잔기 대신인 것인 치료 방법.
22. 제16항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 피험체에게 투여될 때 마이엘로퍼옥시다제(MPO) 불활성화에 의한 산화성 불활성화에 대해 내성이 있는 것인 치료 방법.
23. 지질 적재 세포로부터의 콜레스테롤 유출을 촉진할 수 있는 ApoA1 모방체의 생물학적 유효량을 세포에게 투여하는 단계를 포함하는 상기 세포로부터의 콜레스테롤 유출을 촉진하는 방법으로서, 상기 ApoA1 모방체는 하나 이상의 트립토판을 함유하는 ApoA1 또는 ApoA1 모방체의 아미노산 서열의 적어도 일부를 포함하는 아미노산 서열을 가지고, 상기 ApoA1 또는 ApoA1 모방체의 하나 이상의 트립토판이 ApoA1 모방체의 아미노산 서열에서 산화제 내성 아미노산으로 치환된 것인 촉진 방법.
24. 제23항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 아포지단백질 지질 결합 및 콜레스테롤 유출을 실질적으로 억제하지 않는 것인 촉진 방법.
25. 제23항에 있어서, 상기 ApoA1 모방체는 MPO MPO-생성된 산화제에 의한 산화, MPO-생성된 반응성 염화 종에 의한 산화, MPO/H₂O₂/Cl^- 시스템과 관련된 산화, HOCl/OCl^-에 의한 산화, MPO 생성된 반응성 질소 종에 의한 산화, MPO/H₂O₂/NO₂ ^- 시스템과 관련된 산화, 이산화질소에 의한 산화, 퍼옥시니트라이트(ONOO^-)에 의한 산화, 퍼옥시카르복시니트라이트(ONOOCO₂ ^-)에 의한 산화, 또는 완충액 중 CO₂ 또는 HCO₃ ^-의 존재 하에 ONOO^-가 작용할 때 형성되는 산물에 의한 산화 중 하나 이상의 산화에 대해 내성이 있는 것인 촉진 방법.
26. 제23항에 있어서, 상기 산화제 내성 아미노산이 페닐알라닌인 촉진 방법.
27. 제23항에 있어서, 서열 번호 1의 적어도 일부를 포함하고, 이 때 X는 트립토판 또는 페닐알라닌으로 이루어진 군에서 선택되고, 하나 이상의 X는 페닐알라닌인 촉진 방법.
28. 제23항에 있어서, 상기 ApoA1 모방체는 하나 이상의 트립토판을 포함하는 천연 ApoA1의 약 5∼약 50개의 아미노산으로 실질적으로 이루어지고, 하나 이상의 트립토판은 산화제 내성 아미노산으로 치환되는 것인 촉진 방법.
29. 제23항에 있어서, 상기 ApoA1 모방체는 서열 번호 2 내지 69로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, 이 때 X는 트립토판 또는 산화제 내성 아미노산이며 하나 이상의 X는 산화제 내성 잔기 대신인 것인 촉진 방법.
30. 지질 적재 세포로부터의 콜레스테롤 유출을 촉진할 수 있는 ApoA1 모방체를 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 상기 피험체의 염증성 병태의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법으로서, 상기 ApoA1 모방체는 하나 이상의 트립토판을 함유하는 ApoA1 또는 ApoA1 모방체의 아미노산 서열의 적어도 일부를 포함하는 아미노산 서열을 가지고, 상기 ApoA1 또는 ApoA1 모방체의 하나 이상의 트립토판이 ApoA1 모방체의 아미노산 서열에서 산화제 내성 아미노산으로 치환된 것인 개선 방법.
31. 제30항에 있어서, 상기 염증성 병태는 죽상경화증을 포함하는 개선 방법.
32. 제30항에 있어서, 상기 염증성 병태는 협착증을 포함하는 개선 방법.
33. 제30항에 있어서, 상기 피험체에게 스타틴을 포함하는 단계를 더 포함하는 개선 방법.
34. 제30항에 있어서, 상기 ApoA1 모방체는 MPO MPO-생성된 산화제에 의한 산화, MPO-생성된 반응성 염화 종에 의한 산화, MPO/H₂O₂/Cl^- 시스템과 관련된 산화, HOCl/OCl^-에 의한 산화, MPO 생성된 반응성 질소 종에 의한 산화, MPO/H₂O₂/NO₂ ^- 시스템과 관련된 산화, 이산화질소에 의한 산화, 퍼옥시니트라이트(ONOO^-)에 의한 산화, 퍼옥시카르복시니트라이트(ONOOCO₂ ^-)에 의한 산화, 또는 완충액 중 CO₂ 또는 HCO₃ ^-의 존재 하에 ONOO^-가 작용할 때 형성되는 산물에 의한 산화 중 하나 이상의 산화에 대해 내성이 있는 것인 개선 방법.
35. 제30항에 있어서, 상기 산화제 내성 아미노산이 페닐알라닌인 개선 방법.
36. 제30항에 있어서, 서열 번호 1의 적어도 일부를 포함하고, 이 때 X는 트립토판 또는 페닐알라닌으로 이루어진 군에서 선택되고, 하나 이상의 X는 페닐알라닌인 개선 방법.
37. 제30항에 있어서, 상기 ApoA1 모방체는 하나 이상의 트립토판을 포함하는 천연 ApoA1의 약 5∼약 50개의 아미노산으로 실질적으로 이루어지고, 하나 이상의 트립토판은 산화제 내성 아미노산으로 치환되는 것인 개선 방법.
38. 제30항에 있어서, 상기 ApoA1 모방체는 서열 번호 2 내지 69로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, 이 때 X는 트립토판 또는 산화제 내성 아미노산이며 하나 이상의 X는 산화제 내성 잔기 대신인 것인 개선 방법.
39. 산화제 내성 아미노산 잔기가 ApoA1, 이의 단편 또는 이의 모방체의 하나 이상의 트립토판 잔기로 치환된 것을 포함하는 ApoA1, 트립토판을 함유하는 이의 단편 또는 이의 모방체의 MPO 산화제에 의한 콜레스테롤 유출 기능 감소를 완화시키는 방법으로서, ApoA1, 이의 단편 또는 이의 모방체의 하나 이상의 트립토판 잔기를 산화제 내성 아미노산으로 치환하는 것을 포함하는 완화 방법.
40. 제39항에 있어서, 상기 산화제 내성 아미노산은 페닐알라닌인 완화 방법.
41. 지질 적재 세포로부터의 콜레스테롤 유출을 촉진할 수 있는 ApoA1 모방체를 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 상기 피험체의 내피 세포 손상의 치료 방법으로서, 상기 ApoA1 모방체는 하나 이상의 트립토판을 함유하는 ApoA1 또는 ApoA1 모방체의 아미노산 서열의 적어도 일부를 포함하는 아미노산 서열을 가지고, 상기 ApoA1 또는 ApoA1 모방체의 하나 이상의 트립토판이 ApoA1 모방체의 아미노산 서열에서 산화제 내성 아미노산으로 치환된 것인 치료 방법.
42. 제41항에 있어서, 상기 내피 세포 손상은 혈관 손상 후에 발생하는 것인 치료 방법.
43. 제41항에 있어서, 상기 ApoA1은 피험체의 내피 세포 이동을 촉진하는 유효량으로 투여되는 것인 치료 방법.
44. 제41항에 있어서, 상기 ApoA1 모방체는 MPO MPO-생성된 산화제에 의한 산화, MPO-생성된 반응성 염화 종에 의한 산화, MPO/H₂O₂/Cl^- 시스템과 관련된 산화, HOCl/OCl^-에 의한 산화, MPO 생성된 반응성 질소 종에 의한 산화, MPO/H₂O₂/NO₂ ^- 시스템과 관련된 산화, 이산화질소에 의한 산화, 퍼옥시니트라이트(ONOO^-)에 의한 산화, 퍼옥시카르복시니트라이트(ONOOCO₂ ^-)에 의한 산화, 또는 완충액 중 CO₂ 또는 HCO₃ ^-의 존재 하에 ONOO^-가 작용할 때 형성되는 산물에 의한 산화 중 하나 이상의 산화에 대해 내성이 있는 것인 치료 방법.
45. 제41항에 있어서, 상기 산화제 내성 아미노산이 페닐알라닌인 치료 방법.
46. 제41항에 있어서, 서열 번호 1의 적어도 일부를 포함하고, 이 때 X는 트립토판 또는 페닐알라닌으로 이루어진 군에서 선택되고, 하나 이상의 X는 페닐알라닌인 치료 방법.
47. 제41항에 있어서, 상기 ApoA1 모방체는 하나 이상의 트립토판을 포함하는 천연 ApoA1의 약 5∼약 50개의 아미노산으로 실질적으로 이루어지고, 하나 이상의 트립토판은 산화제 내성 아미노산으로 치환되는 것인 치료 방법.
48. 제41항에 있어서, 상기 ApoA1 모방체는 서열 번호 2 내지 69로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, 이 때 X는 트립토판 또는 산화제 내성 아미노산이며 하나 이상의 X는 산화제 내성 잔기 대신인 것인 치료 방법.

Images