ES2601830T3

ES2601830T3 - Apolipoproteína A-1 resistente a oxidantes y péptidos miméticos

Info

Publication number: ES2601830T3
Application number: ES12162651.9T
Authority: ES
Inventors: Jonathan D. Smith; L. Hazen Stanley
Original assignee: Cleveland Clinic Foundation
Current assignee: Cleveland Clinic Foundation
Priority date: 2007-10-23
Filing date: 2008-10-23
Publication date: 2017-02-16
Anticipated expiration: 2028-10-23
Also published as: WO2009055538A1; EP2212351B1; EP2573113A3; HK1162522A1; EP2520587B1; BRPI0818881A2; MX2010004514A; JP5600065B2; US9051393B2; EA201070517A1; EP2212351A1; IL205282A0; IL205282A; EP2573113A2; US20120264677A1; US9522950B2; US20140051624A1; US20160024182A1; EP2520587A2; US20090149390A1

Abstract

Un polipéptido de ApoA1 para su uso en un procedimiento para tratar trastornos cardiovasculares, el polipéptido de ApoA1, capaz de estimular el eflujo de colesterol en células cargadas con lípido, tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, en el que cada aminoácido X en cada secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 es fenilalanina.

Description

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D-X-L-K-A-F-Y-D-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO: 9), D-X-F-K-A-F-Y-D-K-F-F-E K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO: 10), D-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO: 11), D-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO: 12), 5 D-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO: 13), D-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO: 14), D-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO: 15), E-X-L-K-L-F-Y-E-K-V-L-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO: 16), E-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO: 17), 10 E-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO: 18), E-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO: 19), E-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO: 20), E-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO: 21), E-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO: 22), 15 D-X-L-K-A-L-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-L-(SEQ ID NO: 23), D-X-F-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO: 24), D-X-F-K-A-F-Y-E-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO: 25), E-X-L-K-A-L-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-L-(SEQ ID NO: 26), E-X-L-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO: 27), 20 E-X-F-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO: 28), E-X-L-K-A-F-Y-E-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO: 29), E-X-L-K-A-F-Y-E-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO: 30), E-X-F-K-A-F-Y-E-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO: 31), D-F-L-K-A-X-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-X-(SEQ ID NO: 32), 25 E-F-L-K-A X-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-X-(SEQ ID NO: 33), D-F-X-K-A-X-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-X-X-(SEQ ID NO: 34), E-F-X-K-A-X-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-X-X-(SEQ ID NO: 35), D-K-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-X-A-K-E-A-F-(SEQ ID NO: 36), D-K-X-K-A-V-Y-D-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L-(SEQ ID NO: 37), 30 E-K-L-K-A-F-Y-E-K-V-F-E-X-A-K-E-A-F-(SEQ ID NO: 38), E-K-X-K-A-V-Y-E-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L-(SEQ ID NO: 39), D-X-L-K-A-F-V-D-K-F-A-E-K-F-K-E-A-Y-(SEQ ID NO: 40), E-K-X-K-A-V-Y-E-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L-(SEQ ID NO: 41),

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40 D-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO: 48), E-X-L-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO: 49), D-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F-(SEQ ID NO: 50), E-X-L-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F-(SEQ ID NO: 51), D-X-L-K-A-F-Y-D-R-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO: 52),

45 E-X-L-K-A-F-Y-E-R-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO: 53), D-X-L-R-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F-(SEQ ID NO: 54), E-X-L-R-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F-(SEQ ID NO: 55), D-X-L-R-A-F-Y-D-R-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO: 56), X-L-R-A-F-Y-E-R-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO: 57),

50 D-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-R-L-R-E-A-F-(SEQ ID NO: 58), E-X-L-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-R-L-R-E-A-F-(SEQ ID NO: 59), D-X-L-R-A-F-Y-D-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO: 60), E-X-L-R-A-F-Y-E-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO: 61), D-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-P-D-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F (SEQ ID NO: 62),

55 D-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-P-D-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F (SEQ ID NO: 63), D-X-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-P-D-X-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F (SEQ ID NO: 64), D-K-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-X-A-K-E-A-F-P-D-K-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-X-L-K-E-A-F (SEQ ID NO: 65), D-K-X-K-A-V-Y-D-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L-P-D-K-X-K-A-V-Y-D-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L(SEQ ID NO: 66), D-X-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-P-D-X-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F (SEQ ID NO: 67),

60 D-X-L-K-A-F-V-Y-D-K-V-F-K-L-K-E-F-F-P-D-X-L-K-A-F-V-Y-D-K-V-F-K-L-K-E-F-F (SEQ ID NO: 68), y D-X-L-K-A-F-Y-D-K-F-A-E-K-F-K-E-F-F-P-D-X-L-K-A-F-Y-D-K-F-A-E-K-F-K-E-F-F (SEQ ID NO: 69);

en las que X es fenilalanina.

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Las secuencias mencionadas anteriormente (SEQ ID NO: 4 -SEQ ID NO: 69) se describen en el documento de patente de Estados Unidos n.º 7.144.862 B2 de Fogelman y col., (en lo sucesivo en el presente documento, la patente ’862). La patente ’862 se refiere a péptidos usados para mejorar uno o más síntomas de aterosclerosis. Los péptidos que se describen en la patente ’862 incluyen un resto de triptófano en cada resto designado en el presente documento con una X. Los péptidos sintéticos de la patente ’862 se diseñaron para imitar al motivo helicoidal anfipático de clase A (Segrest y col., (1990) Proteins: Structure, Function and Genetics 8: 103-117)) y son capaces de asociarse con fosfolípidos y presentan muchas propiedades biológicas similares a las de la ApoA1 humana.

También se indica que esta lista de péptidos miméticos de ApoA1 no es totalmente inclusiva. Los truncamientos de las secuencias mencionadas anteriormente, combinaciones multiméricas (por ejemplo, que varían de dímeros a trímeros, tetrámeros, 5 mers, 8 mers, o 10 mers) de las secuencias mencionadas anteriormente, sustituciones conservativas de las secuencias mencionadas anteriormente, y/o las secuencias mencionadas anteriormente que comprenden análogos de aminoácido también se contemplan usando las enseñanzas proporcionadas en las mismas.

Se observará que los equivalentes biológicamente funcionales, o incluso mejoras, de los polipéptidos miméticos de ApoA1, se pueden preparar, por lo general usando ApoA1 como un punto de partida. En la estructura se pueden realizar modificaciones y cambios de una proteína de este tipo y además obtener una molécula con características similares o de otro modo deseables. Por ejemplo, ciertos aminoácidos se pueden sustituir por otros aminoácidos en la estructura de la proteína sin pérdida apreciable de actividad aceptora de eflujo de colesterol.

También se debería contemplar que un experto en la materia puede modificar adicionalmente las secuencias de aminoácidos de ApoA1 de la presente invención mediante sustitución, deleción o adición de al menos un aminoácido, y que estas modificaciones adicionales crean equivalentes biológicamente funcionales para los polipéptidos de ApoA1 resistentes a oxidantes. Estas sustituciones no inhiben de forma sustancial la capacidad de la ApoA1 modificada para estimular el eflujo de colesterol a partir de células de lípido cargadas. Como se usa en el presente documento, "inhibir sustancialmente" o "inhibición" incluye cualquier reducción reproducible mensurable en la capacidad de un polipéptido de ApoA1 modificado para estimular el eflujo de colesterol, a partir de células de lípido cargadas.

El experto en la materia también entiende bien que, inherente en la definición de una proteína o polipéptido "equivalente biológicamente funcional", está el concepto de que hay un límite para el número de cambios que se pueden realizar dentro de una parte definida de la molécula y aún dar como resultado una molécula con un nivel aceptable de actividad biológica equivalente. Las proteínas y péptidos equivalentes biológicamente funcionales se definen por lo tanto en el presente documento como las proteínas y péptidos en los que ciertos, no la mayoría ni todos, de los aminoácidos se pueden sustituir. Por supuesto, una pluralidad de distintas proteínas/péptidos con diferentes sustituciones se puede preparar fácilmente y usar de acuerdo con la invención.

Las sustituciones de aminoácido por lo general se basan en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral de aminoácido, por ejemplo, y hidrofobia, hidrofilia, carga, tamaño, y similares. Un análisis del tamaño, forma y tipo de los sustituyentes de la cadena lateral del aminoácido revela que arginina, lisina y histidina son todos restos con carga positiva; que alanina, glicina y serina son todos de un tamaño similar. Por lo tanto, basándose en estas consideraciones, arginina, lisina e histidina; alanina, glicina y serina se definen en el presente documento como equivalentes biológicamente funcionales.

Siguiendo los procedimientos indicados en la solicitud publicada por Alton y col., (documento WO83/04053), se pueden diseñar y fabricar fácilmente genes que codifican expresión microbiana de polipéptidos que tienen conformaciones primarias que se diferencian de los que en el presente documento se especifican en términos de la identidad o ubicación de uno o más restos (por ejemplo, sustituciones, adiciones y deleciones terminales e intermedias). Como alternativa, las modificaciones de ADNc y genes genómicos se pueden conseguir fácilmente mediante técnicas de mutagénesis dirigida al sitio bien conocidas y usar para generar análogos y derivados de ApoA1. Tales productos podrían compartir al menos una de las propiedades biológicas de la ApoA1 modificada resistente a oxidantes pero se podrían diferenciar en otras.

Los polipéptidos miméticos de ApoA1 pueden ser fragmentos de péptidos de ApoA1 humana de longitud completa. La ApoA1 que se describe en el presente documento son equivalentes biológicamente funcionales con respecto a los polipéptidos de ApoA1 descritos anteriormente en al menos un aspecto que incluye, pero no se limita a, la presentación eflujo de colesterol y mejora de uno o más síntomas de una afección inflamatoria. Los fragmentos de ApoA1 pueden consistir en aproximadamente 5 a aproximadamente 50 aminoácidos e incluyen al menos un resto de triptófano, en los que el resto de triptófano está sustituido con un aminoácido resistente a oxidantes.

Se observará que al igual que con el polipéptido mimético de ApoA1, se pueden realizar modificaciones y cambios en la estructura y secuencia de amino de los fragmentos de ApoA1 y además obtener una molécula que tiene características similares o de otro modo de deseables. Por ejemplo, ciertos aminoácidos se pueden sustituir por otros aminoácidos en una estructura de proteínas sin pérdida apreciable de la presentación de eflujo de colesterol.

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Los polipéptidos miméticos de ApoA1 de la presente invención también pueden incluir un grupo protector acoplado al extremo amino terminal y/o the carboxilo terminal de los polipéptidos. La expresión "grupo protector" se refiere a un grupo químico que, cuando se une a un grupo funcional en un aminoácido (por ejemplo, una cadena lateral, grupo alfa amino, un grupo alfa carboxilo, etc.) bloquea o enmascara las propiedades de ese grupo funcional. Los ejemplos de grupos protectores de amino terminal incluyen, pero no se limitan a grupos acetilo, o amino. En una realización de este tipo, el primero a cuatro restos de aminoácidos en el extremo N-terminal y/o C-terminal de los polipéptidos descritos en el presente documento pueden estar sustituidos con uno o más restos de aminoácido, o uno o más segmentos de péptido, que se conocen por transmitir estabilidad a regiones de la estructura secundaria α-helicoidal (restos o segmentos de "protección terminal" o "grupos protectores"). Tales restos y segmentos de protección terminal se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Richardson y Richardson, 1988, Science 240: 16481652; Harper y col., 1993, Biochemistry 32 (30): 7605-7609; Dasgupta y Bell, 1993, Int. J. Peptide Protein Res. 41: 499-511; Seale y col., 1994, Protein Science 3: 1741-1745; Doig y col., 1994, Biochemistry 33: 3396-3403; Zhou y col., 1994, Proteins 18: 1-7; Doig y Baldwin, 1995, Protein Science 4: 1325-1336; Odaert y col., 1995, Biochemistry

34:: 12820-12829; Petrukhov y col., 1996, Biochemistry 35: 387-397; Doig y col., 1997, Protein Science 6: 147-155). Como alternativa, el primero de uno a cuatro restos de aminoácido N-terminal y/o C-terminal de los polipéptidos descritos en el presente documento se pueden sustituir con restos peptidomiméticos que imitan la estructura y/o propiedades de restos o segmentos de protección terminal. Los ejemplos de miméticos de protección terminal se conocen bien en la técnica, y se describen, por ejemplo, en Richardson y Richardson, 1988, Science 240: 16481652; Harper y col., 1993, Biochemistry 32 (30): 7605-7609; Dasgupta and Bell, 1993, Int. J. Peptide Protein Res. 41: 499-511; Seale y col., 1994, Protein Science 3: 1741-1745; Doig y col., 1994, Biochemistry 33: 3396-3403; Zhou y col., 1994, Proteins 18: 1-7; Doig y Baldwin, 1995, Protein Science 4: 1325-1336; Odaert y col., 1995, Biochemistry

34:: 12820-12829; Petrukhov y col., 1996, Biochemistry 35: 387-397; Doig y col., 1997, Protein Science 6: 147-155).

Los polipéptidos miméticos de ApoA1 de la presente invención se pueden purificar y aislar. La expresión "unificado y aislado" en el presente documento significa sustancialmente libre de sustancias no deseadas de modo que los polipéptidos presentes de miméticos de ApoA1 modificada son útiles para estimular el eflujo de colesterol desde células cargadas con lípido. Por ejemplo, se puede tener un polipéptido mimético de ApoA1 humana recombinante modificada sustancialmente libre de otras proteínas humanas o agentes patológicos. Los polipéptidos también se caracterizan por ser un producto de células de mamífero, o el producto de procedimientos de síntesis química o de expresión de hospedador procariota o eucariota (por ejemplo, mediante células bacterianas, de levadura, de plantas superiores, insecto y de mamífero en cultivo) de secuencias de ADN exógeno obtenidas mediante clonación genómica o de ADNc o mediante síntesis genética. Los productos de expresión en células hospedadoras de levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) o procariotas (por ejemplo, E. coli) habituales están libres de asociación con cualquier proteína de mamífero. Los productos de expresión en vertebrados (por ejemplo, células de mamífero no humano (por ejemplo, COS o CHO) y aviar) están libres de asociación con cualquier proteína humana. Dependiendo del hospedador empleado, y otros factores, los polipéptidos de la invención se pueden glicosilar con carbohidratos de mamífero u otros carbohidratos de eucariota o pueden no estar glicosilados. Los polipéptidos de la invención también pueden incluir un resto de aminoácido metionina inicial (en la posición -1 con respecto al primer resto de aminoácido del polipéptido).

Los péptidos de la invención se pueden purificar mediante técnicas conocidas en la técnica tales como cromatografía de fase inversa cromatografía líquida de alto rendimiento, cromatografía de intercambio iónico, electroforesis en gel, cromatografía por afinidad y similares. Las condiciones reales usadas para purificar un péptido en particular dependerán, en parte, de la estrategia de síntesis y de factores, tales como la carga neta, hidrofobia, hidrofilia, etc., y sean evidentes para las personas con experiencia en la materia. Los péptidos ramificados multiméricos se pueden purificar, por ejemplo, mediante cromatografía de intercambio iónico o de exclusión por tamaño.

Para la purificación mediante cromatografía por afinidad, se puede usar cualquier anticuerpo que se una de forma específica al péptido. Para la producción de anticuerpos, diversos animales hospedadoras, que incluyen, pero no se limitan a conejos, ratones, ratas, etc., se pueden inmunizar mediante inyección con un péptido. El péptido se puede unir a un vehículo adecuado, tal como BSA, por medio de un grupo funcional de cadena lateral o conectores unidos a un grupo funcional de cadena lateral. Se pueden usar diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie hospedadora, incluyendo, pero sin limitación, Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias de superficie activa tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de lapa californiana, dinitrofenol, y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilos de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.

Los anticuerpos monoclonales para un péptido se pueden preparar usando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo. Estas incluyen, pero no se limitará, la técnica de hibridoma descrita originalmente por Kohler y Milstein, 1975, Nature 256: 495-497, o Kaprowski, documento de Pat. de Estados Unidos n.º 4.376.110, la técnica de hibridoma de linfocitos B humanos) (Kosbor y col., 1983, Immunology Today 4: 72; Cote y col., 1983, Proc. Natl: Acad. Sci. U.S.A. 80: 2026-2030); y la técnica de hibridoma de EBV (Cole y col., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985)). Además, se pueden usar algunas técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison y col., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 6851-6855; Neuberger y col., 1984, Nature 312: 604-608; Takeda y col., 1985, Nature 314: 452-454, Boss, documento de Pat. de Estados Unidos n.º 4.816.397;

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para dirección de receptores de células hospedadoras in vivo), o agentes que facilitan el transporte a través de la membrana celular (véase, por ejemplo, Letsinger y col., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6553-6556; Lemaitre y col., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 648-652; Publicación de PCT n.º WO 88/09810, publicada el 15 de diciembre de 1988), agentes de escisión activados por hibridación. (Véase, por ejemplo, Krol y col, (1988) BioTechniques 6: 958-976) o agentes intercalantes. (Véase, por ejemplo, Zon (1988) Pharm. Res. 5: 539-549). Con este fin, los oligonucleótidos se pueden conjugar con otra molécula, por ejemplo, un péptido, agente de reticulación activado por hibridación, agente de transporte, agente de escisión activado por hibridación, etc.

En células hospedadoras de mamífero, se puede usar un número de sistemas de expresión basados en virus. En los casos en los que se usa un adenovirus como un vector de expresión, una secuencia codificante se puede ligar a un complejo de control de transcripción/traducción de adenovirus, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico a continuación se puede insertar en el genoma del adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, la región E1 o E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar el péptido en hospedador es infectados. (Por ejemplo, véase Logan y Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81: 3655-3659). Como alternativa, se puede usar el promotor de 7,5 K de vaccinia, (véase, por ejemplo, Mackett y col., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79: 74157419; Mackett y col., 1984, J. Virol. 49: 857-864; Panicali y col., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 4927-4931).

Otros sistemas de expresión para producir los polipéptidos de la invención serán evidentes para los que tengan experiencia en la materia. Las secuencias de ADN descritas en el presente documento, que codifican polipéptidos de ApoA1 modificada son valiosos por la información que proporcionan con respecto a la secuencia de aminoácidos de proteína de mamífero que hasta ahora no he estado disponibles. Dicho de otra manera, las secuencias de ADN pueden ser útiles para generar vectores de ADN de plásmido virales y circulares nuevos y útiles, células hospedadoras procariota sigue eucariotas transformadas y transfectadas nuevas y útiles (incluyendo células bacterianas y de levadura y células de mamífero desarrolladas en cultivo), y procedimientos nuevos y útiles para el crecimiento en cultivo de tales células hospedadoras capaces de expresión de polipéptidos de ApoA1 resistentes a oxidantes modificados y sus productos relacionados.

Como alternativa, puede no usarse ningún vector para facilitar la presencia relativamente estable en el hospedador. Por ejemplo, la recombinación homóloga puede facilitar la integración en un genoma hospedador. El ácido nucleico se puede colocar dentro de un vehículo farmacéuticamente aceptable para facilitar la absorción celular, tal como un vehículo de solución de lípido (por ejemplo, un lípido cargado), un liposoma, o vehículo de polipéptido (por ejemplo, polilisina). Un artículo de revisión sobre terapia genética es Verma, Scientific American, noviembre de 1990, páginas 68-84.

El ácido nucleico deseado se puede colocar primero dentro de una célula, y la célula se puede administrar a un paciente (tal como un tejido trasplantado) o el ácido nucleico deseado se puede administrar directamente al paciente para su absorción in vivo. Las células a transferir al receptor se pueden cultivar usando uno o más factores que afectan al crecimiento o la proliferación de dichas células, como por ejemplo, SCF.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican un conjugado de mimético de ApoA1 resistente a oxidantes modificado, tales como una proteína de fusión, también se pueden usar en la invención. Tales ácidos nucleicos se pueden realizar preparando una construcción (por ejemplo, un vector de expresión) que expresa una proteína fusión de mimético de ApoA1 cuando se introduce en un hospedador adecuado. Por ejemplo, una construcción de este tipo se puede por ligación de un primer polinucleótido que codifica una proteína de mimético de ApoA1 resistente a oxidantes modificada capaz de estimular el eflujo de colesterol desde células cargadas con lípido, fusionada en marco un segundo polinucleótido que codifica otra proteína de modo que la expresión de la construcción en un sistema de expresión adecuado produce una proteína de fusión.

Las proteínas de fusión de mimético de ApoA1 se pueden preparar fácilmente usando técnicas de biología molecular. Cualquier proteína de fusión se puede designar y preparar usando cualquier de los agentes terapéuticos desvelados en el presente documento y los conocidos en la técnica. La tecnología de proteína de fusión se adapta rápidamente para preparar proteínas de fusión en las que las dos partes están unidas mediante una secuencia de péptidos que se pueden escindir de forma selectiva. El uso de técnicas de ADN recombinante para conseguir tales fines es en la actualidad una práctica convencional para los expertos en la materia. Estos procedimientos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas de síntesis y recombinación in vivo/recombinación genética. Además, la síntesis de ADN y ARN se puede realizar usando un sintetizador automatizado.

La preparación de una proteína de fusión de este tipo por lo general implica la preparación de una primera y segunda región codificante de ADN y la ligación o unión funcional de tales regiones, en marco, para preparar una sola región codificante que codifica la proteína de fusión deseada. Por lo general no se cree que sea particularmente relevante cuál es la parte de la construcción que se prepara como la región N-terminal o como la región C-terminal.

La presente invención también se refiere a composiciones y/o formulaciones farmacéuticas y al uso de tales composiciones en el tratamiento de hiperlipidemia, hipercolesterolemia, enfermedad cardiaca coronaria, y aterosclerosis. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir el polipéptido mimético de ApoA1 como el principio activo y un excipiente farmacéuticamente aceptable adecuados para su administración y suministro

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in vivo. Las composiciones farmacéuticas por lo general comprenderán una cantidad eficaz de polipéptidos de ApoA1 modificada disueltos o dispersos en un vehículo o medio acuoso farmacéuticamente aceptable. También se contemplan agentes terapéuticos combinados, y se puede usar el mismo tipo de composiciones farmacéuticas subyacentes para medicamentos tanto individuales como combinados.

Las expresiones "farmacéutica o farmacológicamente aceptable" hacen referencia a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica u otra de creación no deseada cuando se administran a un animal, o un ser humano, si fuera apropiado. Los usos veterinarios están incluidos del mismo modo dentro del la invención y las formulaciones "farmacéuticamente aceptables" incluyen formulaciones para uso tanto clínico y/o veterinario.

Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de disolvente, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retardo de la absorción y similares. El uso de tales medios y agentes para sustancias activas farmacéuticas se conoce bien en la técnica. Excepto en la medida en la que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el principio activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. A la administración en seres humanos, las preparaciones deberían satisfacer los patrones de esterilidad, pirogenia, seguridad general y pureza según lo requieran los patrones de FDA Office of Biologics. En las composiciones también se pueden incorporar principios activos suplementarios.

Los ejemplos de vehículos incluyen disolventes y medios de dispersión que contienen, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas de los mismos, y aceites vegetales. En muchos casos, será preferente incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azucares o cloruro sódico. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y/o mediante el uso de tensioactivos.

La presente invención contempla la administración de las composiciones farmacéuticas descritas mediante diversas vías. Las composiciones farmacéuticas que comprenden polipéptidos miméticos de ApoA1 o fragmentos de los mismos de la invención se pueden administrar mediante cualquier vía que asegure la biodisponibilidad en la circulación. Estas vías pueden incluir, pero bajo ningún concepto se limitan a administración oral, administración nasal, administración rectal, inyección intraperitoneal, inyección intravascular, inyección subcutánea, administración transcutánea, administración mediante inhalación, e inyección intramuscular.

Las preparaciones inyectables incluyen suspensiones, soluciones o emulsiones estériles del principio activo en vehículos acuosos u oleosos. Las composiciones también pueden contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas hubo en recipientes de múltiples dosis, y pueden contener conservantes añadidos.

Como alternativa, la formación inyectable se puede proporcionar en forma de polvo para su reconstitución con un vehículo, que incluye, pero no se limita a, agua sin pirógenos estéril, tampón, solución de dextrosa, etc., antes de su uso. Con este fin, los polipéptidos miméticos de ApoA1 de la presente invención se pueden liofilizar, o se puede preparar el complejo de péptido-lípido liofilizado. Las preparaciones almacenadas se pueden suministrar en formas de dosificación unitaria y se pueden reconstituir antes de su uso in vivo.

Para administración prolongada, al principio activo se puede formular como una preparación de liberación prolongada, para su administración mediante el implante; por ejemplo, inyección subcutánea, intradérmica, o intramuscular. Por lo tanto, por ejemplo, el principio activo se puede formular con materiales poliméricos o hidrófobos (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados poco solubles; por ejemplo, como una formales al poco soluble de los polipéptidos de ApoA1 modificada o fragmentos de los mismos.

Como alternativa, se pueden usar sistemas de administración transdérmica fabricados como un disco o parche adhesivo que libera lentamente el principio activo para absorción percutánea. Con este fin, se pueden usar potenciadores de la permeación para facilitar la penetración transdérmica del principio activo. Se puede conseguir un beneficio en particular mediante la incorporación de los polipéptidos de ApoA1 modificada o fragmentos de los mismos de la invención o el complejo de péptido-lípido en un parche de nitroglicerina para su uso en pacientes con insuficiencia cardiaca isquémica e hipercolesterolemia.

Para su administración oral, las composiciones farmacéuticas pueden tomar la forma de, por ejemplo, comprimidos o cápsulas preparados por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropil metilcelulosa); cargas (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o hidrogenofosfato cálcico); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); agentes disgregantes (por ejemplo, almidón de patata o glicolato de almidón sódico); o agentes humectantes (por ejemplo, lauril sulfato sódico). Los comprimidos se pueden revestir mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para su administración oral pueden tomar la forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones, o se pueden presentar como un producto seco para la

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constitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Tales preparaciones líquidas se pueden preparar por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulgentes (por ejemplo, lecitina o goma arábiga); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, ésteres oleosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (por ejemplo, p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido sórbico). Si fuera apropiado, las preparaciones también pueden contener sales tampón, agentes saborizantes, colorantes y edulcorantes. Las preparaciones para su administración oral se pueden formular de forma adecuada para dar liberación controlada del compuesto activo.

Para administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas para chupar formulados de una manera convencional. Para vías de administración rectal y vaginal, el principio activo se puede formular como soluciones (enemas de retención), supositorios o pomadas.

Para administración por inhalación, el principio activo se puede administrar de forma conveniente en forma de una presentación de pulverización en aerosol a partir de bases presurizados o un memorizado, con el uso de un agente propulsor, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida. Se pueden formular cápsulas y cartuchos por ejemplo de gelatina para su uso en inhalador o insuflador que contienen una mezcla de polvo del compuesto y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón.

Si se desea, las composiciones se pueden presentar en un envase o dispositivo dispensador, que puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contienen el principio activo. El envase puede comprender por ejemplo lámina de metal o de plástico, tal como problemas de tipo blíster. El paquete o dispositivo dispensador puede ir acompañado con instrucciones para su administración.

Las formulaciones de "dosificación unitaria" son aquellas que contienen una dosis o subdosis del ingrediente administrado adaptadas para una administración programa en particular. Por ejemplo, las formulaciones de "dosificación unitaria" a modo de ejemplo son aquellas que contienen una dosis o unidad diaria o subdosis diaria o una dosis semanal o unidad o subdosis semanal y similares.

En las condiciones habituales de almacenamiento y uso, todas las preparaciones de este tipo deberían contener conservantes para prevenir el crecimiento de microorganismos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede prevenir con diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. La absorción prolongada de las composiciones inyectables estables se puede producir mediante el uso en las composiciones de agentes de retardo de la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Antes o después de la formulación, los polipéptidos de ApoA1 modificada se deberían dializar ampliamente para retirar moléculas de peso molecular pequeño no deseadas, y/o liofilizadas para una formulación más fácil en un vehículo deseado, cuando sea apropiado. Las soluciones inyectables estériles se preparan mediante la incorporación de los agentes activos en la cantidad necesaria en el disolvente apropiado con varios de los otros ingredientes enumerados anteriormente, si se desea, seguido de esterilización mediante filtrado. Por lo general, las dispersiones se preparan mediante la incorporación de los diversos principios activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos a partir de los enumerados anteriormente.

En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación preferentes son las técnicas de secado al vacío y liofilización que proporcionan un polvo del principio activo, más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución filtrada previamente de forma estéril del mismo.

Se pueden usar cápsulas farmacéuticas de "liberación lenta" o composiciones o preparaciones de "liberación sostenida" y por lo general se pueden aplicar. Las poblaciones de liberación lenta por lo general se diseñan para dar un nivel de fármaco constante durante un periodo de tiempo prolongado se pueden usar para suministrar los polipéptidos miméticos de ApoA1 de acuerdo con la presente invención.

En ciertas realizaciones, se pueden usar liposomas y/o nanopartículas con los polipéptidos miméticos de ApoA1. Por lo general, los expertos en la materia conocen la formación y uso de liposomas, tal como se resume a continuación. Los liposomas se forman a partir de fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso y de forma espontánea forman vesículas de bicapa concéntricas multilamelares (también denominadas vesículas multilamelares (MLV)). Por lo general, las MLV tienen diámetros de 25 nm a 4 µm. La sonicación de las MLV da como resultado la formación de vesículas unilamelares pequeñas (SUV) con diámetros en el intervalo de 200 a 500 Å, que contienen una solución acuosa en el núcleo. Los polipéptidos miméticos de ApoA1 también se pueden formular en discos de fosfolípido de un tamaño entre 8 y 20 nm, a través de reacción espontánea con liposomas fosfolipídicos, o a través del procedimiento de diálisis de colato.

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Las nanocápsulas por lo general pueden atrapar compuestos de una manera estable y reproducible. Para evitar los efectos secundarios debidos a sobrecarga polimérica intracelular, tales partículas ultra finas (con un tamaño de aproximadamente 0:1 µm) se deberían diseñar usando polímeros capaces de ser degradados in vivo. Las nanopartículas de cianoacrilato de polialquilo biodegradables que satisface estos requisitos se contemplan para su uso en la presente invención, y tales partículas se pueden preparar fácilmente.

Los agentes farmacológicamente activos adicionales se pueden suministrar junto con los agentes activos primarios, por ejemplo, los péptidos de la presente invención. Las terapias pueden incluir, pero no se limitan a, administración simultánea o secuencial de los fármacos implicados. En una realización, tales agentes incluyen, pero no se limitan a agentes que reducen el riesgo de sucesos ateroescleróticos y/o complicaciones de los mismos. Tales agentes incluyen, pero no se limitan a, beta bloqueantes, combinaciones de beta bloqueantes y diuréticos de tiazida, estatinas, aspirina, inhibidores de ace, inhibidores de receptor de ace (ARB), y similares.

Los ejemplos de beta bloqueantes incluyen, pero no se limitan a cardioselectivos (bloqueantes beta 1 selectivos), por ejemplo, acebutolol (Sectral), atenolol (Tenormin), betaxolol (Kerlone), bisoprolol (Zebeta), metoprolol (Lopressor), y similares. Los ejemplos de bloqueantes no selectivos (beta 1 y beta 2 bloqueantes igualmente) incluyen, pero no se limitan a carteolol (Cartrol), nadolol (Corgard), penbutolol (Levatol), pindolol (Visken), propranolol (Inderal), timolol (Blockadren), labetalol (Normodyne, Trandate), y similares.

Los ejemplos de combinaciones de beta bloqueante y diurético de tiazida incluyen, pero no se limitan a Lopressor HCT, ZIAC, Tenoretic, Corzide, Timolide, Inderal LA 40/25, Inderide, Normozide, y similares.

Los ejemplos de estatinas incluyen, pero no se limitan a pravastatina (Pravachol/Bristol-Myers Squibb), simvastatina (Zocor/Merck), lovastatina (Mevacor/Merck), Lipitor (Pfizer), y similares.

Los ejemplos de inhibidores de ace incluyen, pero no se limitan a captopril (por ejemplo, Capoten de Squibb), benazepril (por ejemplo, Lotensin de Novartis), enalapril (por ejemplo, Vasotec de Merck), fosinopril (por ejemplo, Monopril de Bristol-Myers), lisinopril (por ejemplo, Prinivil de Merck o Zestril de Astra-Zeneca), quinapril (por ejemplo, Accupril de Parke-Davis), ramipril (por ejemplo, Altace de Hoechst Marion Roussel, King Pharmaceuticals), imidaprilo, perindopril erbumina (por ejemplo, Aceon de Rhone-Polenc Rorer), trandolapril (por ejemplo, Mavik de Knoll Pharmaceutical), y similares. Los ARBS adecuados (Bloqueantes de Receptor de Ace) incluyen, pero no se limitan a, losartán (por ejemplo, Cozaar de Merck), irbesartán (por ejemplo, Avapro de Sanofi), candesartán (por ejemplo, Atacand de Astra Merck), valsartán (por ejemplo, Diovan de Novartis), y similares.

Los miméticos de la invención se pueden usar en un procedimiento para tratar trastornos cardiovasculares. "Trastorno cardiovascular", como se usa en el presente documento, se refiere a la clase de trastornos que implican al corazón o a los vasos sanguíneos (arterias y venas). Además "trastorno cardiovascular" se refiere adicionalmente a cualquier enfermedad que afecte al sistema cardiovascular, se puede usar para hacer referencia a los relacionados con aterosclerosis (enfermedad arterial). Los trastornos cardiovasculares pueden incluir, pero no se limitan a, Aneurismas, Angina, Arritmia, Aterosclerosis, Cardiomiopatía, Enfermedad Cerebrovascular, Enfermedad Cardiaca Congénita, Insuficiencia Cardiaca Congestiva, Miocarditis, Enfermedad de las Válvulas, Enfermedad Arterial Coronaria, Cardiomiopatía dilatada, Disfunción Diastólica, Endocarditis, Presión Arterial Elevada (Hipertensión), Cardiomiopatía Hipertrófica, Prolapso de la válvula mitral, Ataque al Corazón, Estenosis Vascular y Tromboembolismo Venoso.

"Arteriosclerosis", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier endurecimiento (y pérdida de elasticidad) de arterias medianas o grandes (en griego, "Arterio" significa arteria y "esclerosis" significa endurecimiento), arteriolosclerosis es la aterosclerosis que afecta principalmente a las arteriolas (arterias pequeñas). "Aterosclerosis", como se usa en el presente documento, se refiere a un endurecimiento de una arteria debido específicamente a una placa de ateroma. Por lo tanto, la aterosclerosis es una forma de arteriosclerosis. La aterosclerosis es una respuesta inflamatoria crónica en las paredes de las arterias, debida en gran parte a la deposición de lipoproteínas (proteínas en plasma que portan colesterol y triglicéridos). Normalmente se denomina "endurecimiento" o "incrustaciones" de las arterias. Está causada por la formación de múltiples placas dentro de las arterias.

El procedimiento puede incluir la etapa de administración a un sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz o biológicamente eficaz de una composición farmacéutica que incluye un mimético de ApoA1 o fragmento del mismo que es capaz de estimular el eflujo de colesterol desde células cargadas con lípido. El mimético de ApoA1 o un fragmento de secuencia de aminoácidos se puede modificar como se ha descrito anteriormente por sustitución de todos los triptófanos con fenilalanina.

Por lo tanto, "cantidades biológicamente eficaz" o "cantidades terapéuticamente eficaces", en términos de cada uno de los procedimientos terapéuticos mencionados anteriormente son cantidades de el al menos un polipéptido de ApoA1 modificada o un fragmento del mismo eficaz para ejercer un efecto antiinflamatorio, aumento del eflujo de colesterol celular, o mejora de síntomas de enfermedad cardiovascular.

"Administración", como se usa en el presente documento, significa provisión o administración de una composición que incluye al menos un polipéptido mimético de ApoA1 o un fragmento del mismo en una cantidad(s) y durante un

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periodo de tiempo(s) eficaz para ejercer un efecto antiinflamatorio, aumento del eflujo de colesterol celular, o mejora de síntomas de enfermedad cardiovascular. Por lo general, es preferente la administración pasiva de agentes terapéuticos proteicos, en parte, por su simplicidad y reproducibilidad.

Debido a las propiedades de los polipéptidos resistentes a la oxidación de la presente invención, los polipéptidos miméticos de ApoA1 y fragmentos de los mismos descritos en el presente documento también se pueden usar en un procedimiento para estimular el eflujo de colesterol desde una célula al hígado. El procedimiento incluye la etapa de administrar a la célula una cantidad biológicamente eficaz de polipéptido purificado que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a una parte de la SEQ ID NO: 1, en la que X es fenilalanina.

Los procedimientos y usos terapéuticos de la invención también se extienden a la provisión de ácidos nucleicos que codifican al menos un agente terapéutico que incluye polipéptido(s) mimético de ApoA1 de una manera eficaz para dar como resultado su expresión en las cercanías del síntoma, afección o enfermedad dirigidos. Se puedo usar cualquier técnica de terapia genética, tal como administración de ADN desnudo, genes y lectores recombinantes, administración basada en células, incluyendo manipulación ex vivo de células de pacientes, y similares.

También se entenderá que incluso en tales circunstancias en las que la dosis, o terapia combinada de polipéptidos de ApoA1 están en el extremo inferior del intervalo terapéutico pretendido, puede suceder que esta terapia todavía sea igualmente o incluso más eficaz que todas las otras terapias conocidas en el contexto del trastorno o paciente en particular. Desafortunadamente, es evidente para un profesional clínico que ciertos trastornos y afecciones no se pueden tratar de forma eficaz en un plazo intermedio o largo, pero esto no invalida la utilidad de la presente terapia, en particular cuando es al menos aproximadamente tan eficaz como las otras estrategias propuestas por lo general.

Por lo general, la intención de los regímenes terapéuticos de la presente invención es producir un aumento significativo del eflujo de colesterol, a la vez que la dosis aún se mantiene por debajo de los niveles asociados con una toxicidad inaceptable. Además de variar la dosis por sí misma, el régimen de administración también se puede adaptar para optimizar la estrategia de tratamiento.

Los agentes activos de la presente invención también son útiles en un número de contextos. Por ejemplo, se ha observado en los trastornos cardiovasculares (por ejemplo, aterosclerosis, apoplejía, etc.) Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la presente invención contempla la administración de uno o más de los agentes activos descritos en el presente documento a un sujeto con riesgo de, o contraer un síntoma de aterosclerosis y/o una patología asociada (por ejemplo, apoplejía).

Por lo tanto, por ejemplo, a una persona que tiene o que presenta riesgo de enfermedad coronaria se le pueden administrar de forma profiláctica una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención durante la temporada de la gripe. En otro ejemplo específico, se podría tratar el infarto post miocardio de un sujeto mediante inyecciones i.v. para reducir el tamaño de la placa y estabilizar la placa para prevenir rotura o erosión.

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones preferentes de la invención. Los expertos en la materia deberían observar que las técnicas desveladas en los ejemplos que siguen a continuación representan técnicas descubiertas por el inventor que funcionan bien en la práctica de la invención, y por lo tanto se puede considerar que constituyen modos preferentes para su práctica. Sin embargo, los expertos en la materia deberían observar, a la vista de la presente divulgación, que se pueden realizar muchos cambios en las realizaciones específicas que se desvelan y aún obtener un resultado parecido o similar.

Ejemplos

En los siguientes ejemplos, los inventores buscaban determinar los efectos de la modificación de lisina, metionina, y triptófano, que son restos sensibles a MPO en ApoA1. Se encontró que la sustitución de los cuatro restos de triptófano en ApoA1 con leucinas conduce una pérdida de función, mientras que la sustitución de triptófano con fenilalanina no solamente conserva la función de ApoA1, sino que la hace resistente a la inactivación oxidativa con MPO.

Procedimientos

Espectrometría de Masas

La ApoA1 obtenida a partir de ateroma humano se aisló mediante cromatografía de inmunoafinidad como se ha descrito anteriormente. La ApoA1 se eluyó en tampón de glicina (pH 2,5) y se sometió directamente a digestión con tripsina o se separó en primer lugar con SDS-PAGE y se sometió a una digestión con tripsina en gel. Se realizó espectrometría de masas y se obtuvieron espectros de disociación inducida por colisión (CID), como se ha descrito anteriormente. Los análisis de clorotirosina y ácido 2-amino adípico se realizaron después de hidrólisis ácida con patrones internos de isótopos pesados como se ha descrito anteriormente usando ensayos por duplicado de ApoA1 a partir de ateroma humano o a partir de plasma de voluntarios sanos aislados mediante cromatografía de inmunoafinidad.

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Mutagénesis·Dirigida al Sitio y Producción de ApoA1 Recombinantes

Se prepararon mutaciones puntuales para restos de triptófano (8, 50, 72, 108) y metionina (86, 112, 148) usando el Kit de Mutagénesis Quick-Change de Stratagene y se confirmaron mediante secuenciación de ADN. Los plásmido se transformaron en expresión de ApoA1 de las cepas BL21 (DE-3) pLysS, lnJ de Escherichia coli y la purificación se realizó como se ha descrito anteriormente. Se hizo una diálisis extensa de la rh-ApoA1 con respecto a tampón de reacción de PBS o MPO (60 mmol/l de fosfato sódico, 100 mmol/l de cloruro sódico, 100 µmol/l de ácido dietilentriamina pentaacético, pH 7,0) para retirar cualquier traza de imidazol, se analizó mediante SDS-PAGE, y se encontró que era pura en > 95 %. Dado que la sustitución de Trp y Met altera la DO280 de la proteína y la reactividad con respecto a los ensayos de proteína de BCA o Lowry, las concentraciones de proteína se determinaron basándose en aminas libres usando el ensayo de o-ftaldialdehído (OPA), con un patrón de ApoA1 derivada de plasma humano (Biodesign), como se ha descrito anteriormente. La escisión de la etiqueta inicial de Met e His de rh-ApoA1 se realizó mediante tratamiento con ácido fórmico, seguido de purificación con cromatografía líquida rápida de proteína (FPLC).

Modificaciones de Lisina de ApoA1

La ApoA1 derivada del plasma humano se dializó con respecto a PBS y se diluyó hasta 0,5 mg/ml. La metilación reductora con lisina se realizó como se ha descrito anteriormente. El alcance de la modificación de lisina se determinó mediante el ensayo de OPA. A continuación, la ApoA1 se dializó con respecto tampón de reacción de MPO, y la concentración de proteína de la ApoA1 modificada con lisina se determinó usando reactivos BCA.

Modificaciones de ApoA1 con MPO y Ácido Hipocloroso

El MPO a una concentración final de 57 nmol/l, preparado como se ha descrito anteriormente, se añadió a ApoA1 a 100 µg/ml (3,5 µmol/l) que se había dializado ampliamente con respecto a tampón de reacción de MPO. La reacción comenzó mediante la adición de peróxido de hidrógeno a proporciones molares variables con respecto a ApoA1 en 4 alícuotas a intervalos de 15 minutos a 37 ºC, y la incubación continuó durante 90 minutos, momento en el que se añadieron 2 mmol/l de L-metionina inactivar la reacción. Para la modificación química de la ApoA1, se añadió hipoclorito sódico (NaOCI) a 100 µg/ml de ApoA1 en tampón de MPO a concentraciones variables en 4 alícuotas a intervalos de 15 minutos a 37 ºC. Después de un tiempo de incubación total de 60 minutos, se añadieron 2 mmol/l de L-Metionina para interrumpir la reacción.

Ensayo de Eflujo de Colesterol Dependiente de ABCA I

Las células de macrófago de murino RAW 264.7 se etiquetaron con [3H] colesterol y se trataron con 0,3 mmol/l de 8Br-cAMP para inducir actividad de ABCA1, como se ha descrito anteriormente. Las células se lavaron y se siguieron durante 4 horas en medio sin suero en presencia de 0,3 mmol/l de 8Br-cAMP ay la presencia o ausencia de diversas preparaciones de ApoA1. La radiactividad en los medios de seguimiento se determinó después de una breve centrifugación hasta el residuo sedimentado. La radiactividad en las células de término por extracción en hexano:isopropanol (3:2) con el disolvente evaporado el mundial de centelleo antes del recuento. El porcentaje de eflujo de colesterol se calculó como 100 X (dpm en el medio)/(dpm en el medio + dpm celular).

Ensayo de Actividad de Unión a Lípido

La actividad de unión a lípido de ApoA1 se evaluó a través de la inhibición de la agregación mediada por fosfolipasa C (PLC) de lipoproteína de baja densidad humana, realizará como se ha descrito anteriormente. Los inventores han mostrado anteriormente que este ensayo da resultados similares a los observados con el ensayo de eliminación de dispersión de DMPC, pero es más sensible y requiere menos ApoA1. La concentración final de ApoA1 usada en este ensayo era de 12,5 µg/ml que era suficiente para disminuir la agregación de LDL de tasa de inicial en ≈75 %.

Detección de Reticulaciones de ApoA1

Se desnaturalizaron 250 ng de ApoA1 por calle en un tampón demuestra de SDS, desarrollado en un gel de Tris glicina al 10 % en presencia de SDS; y la proteína se transfirió a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF). La membrana se sondeó secuencialmente con anticuerpo primario de ApoA1 anti-humana de cabra (dilución la

1:1.000. DiaSorin) y anticuerpo conjugado con HRP anticabra de conejo (dilución la 1:1.000), y la ApoA1 se visualizó con un sustrato con aumento de la quimioluminiscencia.

Resultados

Modificaciones de ApoA1 en Ateroma Humano

Los inventores determinaron si la ApoA1 aislada de células de ateroma humano incluían restos de triptófano, metionina y lisina modificados Usando espectrometría de masas en tándem, los inventores fueron capaces de detectar restos de monohidroxitriptófano en las cuatro posiciones del triptófano, 8, 50, 72, y 108, y de dihidroxitriptófano en la posición 108 dentro de ApoA1 (Figs. 1A-F). Los inventores anteriormente identificaron monoy di-hidroxitriptófano en el resto W72 en ApoA1 modificada con MPO in vitro (Peng, D.Q., Wu, Z., Brubaker, G.,

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receptora de colesterol de la ApoA1, ya que la variante 4WL el día en la mayor parte de esta actividad en los estudios de eflujo de colesterol realizados con respecto a un amplio intervalo de dosis de ApoA1, mientras que la variante 4WF conservaba esta actividad (Fig. 5A). Los inventores examinaron el contenido predicho de hélice alfa de estas proteínas mediante CD usando el algoritmo K2d, y encontraron que la proteína de tipo silvestre tenía un 57 % de hélice alfa, mientras que las variantes de 4WL y 4WF ambas habían aumentado los contenidos de hélice alfa en un 79 % y un 77 %, respectivamente. Por lo tanto, la pérdida de eflujo y la actividad de unión a lípido de la variante 4WL no se pueden atribuir a la pérdida de contenido helicoidal.

Tanto la rh-ApoA1 como la variante 4WF se sometieron al sistema de oxidación MPO/CL-/H2O2 a dosis crecientes de H2O2. La Fig. 5B muestra el resultado de un estudio representativo de 4 experimentos diferentes usando dos preparaciones independientes de cada proteína. Como se ha observado anteriormente, la actividad aceptora de colesterol dependiente de ABCA1 de la ApoA1 de tipo silvestre se inhibía mediante el aumento de la oxidación inducida por MPO; sin embargo, la variante 4WF mantenía esta actividad incluso a una proporción de H2O2:ApoA1 de 15.

El sistema de oxidación MPO/Cl/H2O2 genera HOCl, el reactivo activo de la lejía, y los inventores y otros han demostrado anteriormente que el tratamiento de ApoA1 con HOCl da como resultado una pérdida de actividad aceptora de colesterol y de unión a lípido. Por lo tanto, los inventores sometieron a la ApoA1 de tipo silvestre y a la variante 4WF a dosis crecientes de HOCl. Del mismo modo que con los hallazgos del sistema de modificación de MPO, la actividad aceptora de colesterol de la variante 4WF era resistente a este tratamiento mientras que la actividad de eflujo de la rh-ApoA1 de tipo silvestre se veía alterada por el aumento de las dosis de HOCl (Fig. 6).

La actividad de unión a lípido de rh-ApoA1 y la variante 4WF se evaluaron mediante un ensayo de eliminación de emulsión de DMPC, y ambas proteínas mostraban una actividad equivalente (Fig. 7A). La actividad de unión a lípido sin células de rh-ApoA1 4WF también era resistente a la inhibición mediada por MPO, en comparación con rh-ApoAl (Fig. 4B) usando un ensayo de agregación de LDL mediado por PLC (Fig. 7B).

La modificación de ApoA1 con MPO conduce a una amplia reticulación que da como resultado dímeros, multímeros, y también supuestamente reticulaciones intramoleculares. Los inventores han mostrado previamente que el patrón de reticulación de ApoA1 mediado con MPO no se veía alterado en la variante con los 7 restos de tirosina convertidos en fenilalanina. Después de someter la rh-ApoA1 y la variante 4WF a oxidación con MPO/Cl-/H2O2 a dosis crecientes de H2O2 (usando los productos proteínicos idénticos que se usaron para el flujo en la Fig. 5B), los inventores observaron una alteración de la migración de ambas proteínas en geles desnaturalizantes coherente con la reticulación intermolecular. Sin embargo, los patrones de migración eran diferentes, con la variante 4WF dando una banda predominante aguda de aproximadamente 70 kD, mientras que la proteína de tipo silvestre proporcionaba una zona predominante menos marcada entre 55 y 65 kD (Fig. 8). La migración del monómero se veía alterada para ambas proteínas, lo que podría ser indicativo de reticulaciones intramoleculares o modificaciones de amino. Aunque la variante 4WF es resistente a la pérdida de actividad aceptora de colesterol mediada por MPO, esta variante era más susceptible a la reticulación inducida por MPO, en particular a dosis bajas de H2O2. Los inventores también sometieron estas proteínas modificadas a análisis estructural con CD, y encontraron que ambas eran susceptibles a la pérdida de contenido de hélice alfa, aunque la variante 4WF comenzaba con un valor más elevado.

Los inventores también prepararon rHDL mediante diálisis con colato usando POCP y la ApoA1 de tipo silvestre o de 4WF. Ambas proporcionaban un patrón similar de discos de rHDL calculados mediante geles no desnaturalizantes a ~ 9,8, 12, y 17 nm, sin ninguna ApoA1 sin líquido restante (Fig. 9). Los inventores sometieron a ensayo la rHDL de tipo silvestre y la de 4WF, y ambas eran igualmente competentes para mediar el eflujo de colesterol independiente de ABCA1 de las células RAW264.7 (Fig. 10), sin actividad aceptora dependiente de ABCA1, tal como se esperaba para la ApoA1 totalmente lipidada.

Los inventores sintetizaron el péptido p18 anfipático helicoidal descrito anteriormente, que contiene un resto de triptófano en la posición 2. Los inventores también sintetizaron análogos que reemplazan el triptófano con fenilalanina (P 18 WF) o leucina (P 18 LF). Los inventores demostraron que estos péptidos sin triptófano no tienen actividad lectora de colesterol mediada por ABCA1 dependiente de la dosis (Fig.11).

La presente divulgación también contempla lo siguiente:

1.: Un polipéptido purificado que comprende un mimético de ApoA1 que es capaz de estimular el eflujo de colesterol desde células cargadas con lípido, mimético de ApoA1 que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye al menos una parte de la secuencia de aminoácidos de ApoA1 o un mimético de la ApoA1 que contiene al menos un triptófano, al menos un triptófano de la ApoA1 o mimético de la ApoA1 que está siendo sustituido con un aminoácido resistente a oxidación en la secuencia de aminoácidos del mimético de ApoA1.

2.: El polipéptido de la cláusula 1, en el que el mimético de ApoA1 es resistente a al menos uno de oxidación con oxidante generado por MPO MPO, oxidación con una especie de cloración reactiva generada por MPO, oxidación asociada con el sistema MPO/H2O2/Cl-, oxidación con HOCl/OCl-, oxidación con una especie reactiva de nitrógeno generada por MPO, oxidación asociada con el sistema MPO/H2O2NO2-, oxidación con dióxido de nitrógeno, oxidación con peroxinitrito (ONOO-), oxidación con peroxicarboxinitrito (ONOOCO2-), u oxidación con

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un producto formado cuando ONOO-actúa en presencia de CO2 o HCO3-en tampón.

3.: El polipéptido de la cláusula 1, siendo fenilalanina el aminoácido resistente a oxidantes.

4.: El polipéptido de la cláusula 1 que comprende al menos una parte de la SEQ ID NO: 1, en la que X se selecciona entre el grupo que consiste en triptófano o fenilalanina y al menos un X es fenilalanina.

5.: El polipéptido de la cláusula 1, mimético de ApoA1 que consta esencialmente de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 aminoácidos de ApoA1 nativa, que incluye al menos un triptófano, y el al menos un triptófano está sustituido con un aminoácido resistente a oxidantes.

6.: El polipéptido de la cláusula 1, mimético de ApoA1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 2-69, en las que X es un triptófano o un amino resistente a oxidantes y al menos un X está sustituido por un resto resistente a oxidantes.

7.: El polipéptido de la cláusula 1, polipéptido que comprende al menos un resto de aminoácido "D".

8.: El polipéptido de la cláusula 1, en el que todos o la mayoría de los aminoácidos enantioméricos son aminoácidos "D".

9.: El polipéptido de la cláusula 1, polipéptido que comprende adicionalmente un grupo protector.

10.: El polipéptido de la cláusula 1 que comprende adicionalmente una etiqueta de polihistidina.

11.: El polipéptido de la cláusula 1, polipéptido que es resistente a la inactivación oxidativa mediante inactivación con mieloperoxidasa (MPO) cuando se administra a un sujeto.

12.: El polipéptido de la cláusula 1, polipéptido que es una proteína de fusión.

13.: Un polipéptido de apolipoproteína purificada que comprende una secuencia de aminoácidos de apolipoproteína nativa modificada mediante la sustitución de uno o más restos de triptófano de la secuencia de aminoácidos nativa con un aminoácido resistente a oxidantes.

14.: Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de la cláusula 1, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

15.: La composición farmacéutica de la cláusula 14, en la que la composición se formula para su administración a un sujeto mediante una vía seleccionada entre el grupo que consiste en administración oral, administración nasal, administración rectal, inyección intraperitoneal, inyección intravascular, inyección subcutánea, administración transcutánea, administración mediante inhalación, e inyección intramuscular.

16.: Un procedimiento para tratar trastornos cardiovasculares que comprende la etapa de:

administrar a un sujeto un mimético de ApoA1 que es capaz de estimular el eflujo de colesterol desde células cargadas con lípido, mimético de ApoA1 que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye al menos una parte de la secuencia de aminoácidos de ApoA1 o un mimético de la ApoA1 que contiene al menos un triptófano, al menos un triptófano de la ApoA1 o mimético de la ApoA1 que está siendo sustituido con un aminoácido resistente a oxidantes en la secuencia de aminoácidos del mimético de ApoA1.

17.: El procedimiento de la cláusula 16, en el que el mimético de ApoA1 es resistente a al menos uno de oxidación con oxidante generado por MPO MPO, oxidación con una especie de cloración reactiva generada por MPO, oxidación asociada con el sistema MPO/H2O2/Cl-, oxidación con HOCl/OCl-, oxidación con una especie reactiva de nitrógeno generada por MPO, oxidación asociada con el sistema MPO/H2O2/NO2-, oxidación con dióxido de nitrógeno, oxidación con peroxinitrito (ONOO-), oxidación con peroxicarboxinitrito (ONOOCO2-), u oxidación con un producto formado cuando ONOO-actúa en presencia de CO2 o HCO3-en tampón.

18.: El procedimiento de la cláusula 16, siendo fenilalanina el aminoácido resistente a oxidantes.

19.: El procedimiento de la cláusula 16 que comprende al menos una parte de la SEQ ID NO: 1, en la que X se selecciona entre el grupo que consiste en triptófano o fenilalanina y al menos un X es fenilalanina.

20.: El procedimiento de la cláusula 16, mimético de ApoA1 que consta esencialmente de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 aminoácidos de ApoA1 nativa, que incluye al menos un triptófano, y el al menos un triptófano está sustituido con un aminoácido resistente a oxidantes.

21.: El procedimiento de la cláusula 16, mimético de ApoA1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 2-69, en el que X es un triptófano o un amino resistente a oxidantes y al menos un X está sustituido por un resto resistente a oxidantes.

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22.: El procedimiento de la cláusula 16, polipéptido que es resistente a la inactivación oxidativa mediante inactivación con mieloperoxidasa (MPO) cuando se administra al sujeto.

23.: Un procedimiento para estimular el eflujo de colesterol de una célula que comprende la etapa de:

administrar a la célula una cantidad biológicamente eficaz de un mimético de ApoA1 que es capaz de estimular el eflujo de colesterol desde células cargadas con lípido, mimético de ApoA1 que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye al menos una parte de la secuencia de aminoácidos of ApoA1 o un mimético de la ApoA1 que contiene al menos un triptófano, al menos un triptófano de la ApoA1 o mimético de la ApoA1 que está siendo sustituido con un aminoácido resistente a oxidantes en la secuencia de aminoácidos del mimético de ApoA1.

24.: El procedimiento de la cláusula 23, polipéptido que no inhibe sustancialmente la unión de lípido de apolipoproteína y el eflujo de colesterol.

25.: El procedimiento de la cláusula 23, en el que el mimético de ApoA1 es resistente a al menos uno de oxidación con oxidante generado por MPO MPO, oxidación con una especie de cloración reactiva generada por MPO, oxidación asociada con el sistema MPO/H2O2/Cl-, oxidación con HOCl/OCl-, oxidación con una especie reactiva de nitrógeno generada por MPO, oxidación asociada con el sistema MPO/H2O2/NO2-, oxidación con dióxido de nitrógeno, oxidación con peroxinitrito (ONOO-), oxidación con peroxicarboxinitrito (ONOOCO2-), u oxidación con un producto formado cuando ONOO-actúa en presencia de CO2 o HCO3-en tampón.

26.: El procedimiento de la cláusula 23, siendo fenilalanina el aminoácido resistente a oxidantes.

27.: El procedimiento de la cláusula 23 que comprende al menos una parte de la SEQ ID NO: 1, en la que X se selecciona entre el grupo que consiste en triptófano o fenilalanina y al menos un X es fenilalanina.

28.: El procedimiento de la cláusula 23, mimético de ApoA1 que consta esencialmente de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 aminoácidos de ApoA1 nativa, que incluye al menos un triptófano, y el al menos un triptófano está sustituido con un aminoácido resistente a oxidantes.

29.: El procedimiento de la cláusula 23, mimético de ApoA1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 2-69, en las que X es un triptófano o un amino resistente a oxidantes y al menos un X está sustituido por un resto resistente a oxidantes.

30.: Un procedimiento para mejorar uno o más síntomas de una afección inflamatoria en un sujeto que comprende:

administrar al sujeto un mimético de ApoA1 que es capaz de estimular el eflujo de colesterol desde células cargadas con lípido, mimético de ApoA1 que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye al menos una parte de la secuencia de aminoácidos of ApoA1 o un mimético de la ApoA1 que contiene al menos un triptófano, al menos un triptófano de la ApoA1 o mimético de la ApoA1 que está siendo sustituido con un aminoácido resistente a oxidantes en la secuencia de aminoácidos del mimético de ApoA1.

31.: El procedimiento de la cláusula 30, la afección inflamatoria que comprende aterosclerosis.

32.: El procedimiento de la cláusula 30, la afección inflamatoria que comprende estenosis.

33.: El procedimiento de la cláusula 30 que comprende adicionalmente la etapa de administración de una estatina al sujeto.

34.: El procedimiento de la cláusula 30, en el que el mimético de ApoA 1 es resistente a al menos uno de oxidación con oxidante generado por MPO MPO, oxidación con una especie de cloración reactiva generada por MPO, oxidación asociada con el sistema MPO/H2O2/Cl-, oxidación con HOCl/OCl-, oxidación con una especie reactiva de nitrógeno generada por MPO, oxidación asociada con el sistema MPO/H2O2/NO2-, oxidación con dióxido de nitrógeno, oxidación con peroxinitrito (ONOO-), oxidación con peroxicarboxinitrito (ONOOCO2-), u oxidación con un producto formado cuando ONOO-actúa en presencia de CO2 o HCO3-en tampón.

35.: El procedimiento de la cláusula 30, siendo fenilalanina el aminoácido resistente a oxidantes.

36.: El procedimiento de la cláusula 30 que comprende al menos una parte de la SEQ ID NO: 1, en la que X se selecciona entre el grupo que consiste en triptófano o fenilalanina y al menos un X es fenilalanina.

37.: El procedimiento de la cláusula 30, mimético de ApoA1 que consta esencialmente de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 aminoácidos de ApoA1 nativa, que incluye al menos un triptófano, y el al menos un triptófano está sustituido con un aminoácido resistente a oxidantes.

38.: El procedimiento de la cláusula 30, mimético de ApoA1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 2-69, en las que X es un triptófano o un amino

Claims

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