JP5241790B2 - アテローム性動脈硬化症を改善する経口投与ペプチド - Google Patents
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Description
は、経口投与が可能で、1つまたは2つ以上のアテローム性硬化症の症状を改善するペプ
チド類の特定に関する。
脈管系疾患の発生においていくつかの原因因子が示唆されているが、これらには、前記疾
患に対する遺伝的素因、性別、生活様式因子(例えば喫煙および食事)、年齢、高血圧お
よび高脂血症(高コレステロール血症を含む)が含まれる。前記因子のいくつか、特に高
脂血症および高コレステロール血症(高コレステロール血中濃度)は、アテローム性硬化
症の顕著な危険因子を提供する。
テル化コレステロールとして存在する。前記リポタンパク質粒子は、一般にキロミクロン
、超低密度リポタンパク質(VLDL)、低密度リポタンパク質(LDL)および高密度
リポタンパク質(HDL)として知られている。血中の全コレステロール濃度は、(1)
消化管からのコレステロールの吸収、(2)食物成分(例えば炭水化物、タンパク質、脂
肪およびエタノール)を基にするコレステロールの合成、および(3)組織(特に肝臓)
による血液からのコレステロールの排除およびそれに続くコレステロールの胆汁酸、ステ
ロイドホルモンおよび胆汁コレステロールへの変換によって影響される。
には、コレステロール生合成の律速段階の酵素の濃度、肝臓の低密度リポタンパク質のレ
セプター濃度、コレステロール胆汁酸変換の律速段階の酵素の濃度、リポタンパク質の合
成速度および分泌速度、並びに個体の性別が含まれる。ヒトの血中コレステロール濃度の
ホメオスタシスに影響を与える環境因子には、食事の組成、喫煙の程度、運動量および種
々の薬剤の使用が含まれる。食事に関する変動性因子には脂肪の量およびタイプ(飽和脂
肪酸およびポリ不飽和脂肪酸)、コレステロールの量、線維の量およびタイプ、並びにお
そらくはビタミン(例えばビタミンCおよびD)およびミネラル(例えばカルシウム)の
量が含まれる。
)A−Iレベルはアテローム硬化の発生に関して負の相関を有することが示された(Wils
on et al.(1988)Arteriosclerosis 8:737-741)。アテローム誘発性食餌を与えられたウ
サギにHDLを注射することによってアテローム硬化病巣が抑制されることが示された(
Badimon et al.(1990)J. Clin. Invest. 85:1234-1241)。
ヒトのアポA−Iは、その抗アテローム誘発特性のために熱心に研究されてきた。相互
に取り替えることができるアポリポタンパク質(アポA−Iを含む)は、脂質付随ドメイ
ンを有する(Brouilletteand Anantharamaiah (1995) Biochem. Biophys. Acta 1256:10
3-129; Segrestet al. (1974) FEBS Lett. 38:247-253)。アポA−Iは8個のタンデム
に繰り返される22量体配列(これらの大半はクラスAの両親媒性らせん構造を形成する
能力をもつ)を有するといわれている(Segrest et al. (1974) FEBS Lett. 38:247-253
)。クラスA両親媒性らせんの特徴には、極性−非極性境界に陽性荷電残基および極性表
面の中心に陰性荷電残基が存在することである(Segrest et al. (1974) FEBS Lett. 38:
247-253;Segrest et al. (1990) Proteins: Structure, Function and Genetics 8:103-
117)。
アポA−Iはリン脂質に強く結合し、複合体を形成しコレステロールに富む細胞からコレ
ステロールの流出を促進させることが示された。アポA−Iの配送および血清レベルの維
持が、なぜ1つまたは2つ以上のアテローム性硬化症の症状を効果的に緩和するのかは、
これまで明らかではなかった。
本出願は、USSN09/896841号(2001年6月29日出願)の部分継続出願であ
り、前記はさらにUSSN09/645454号(2000年8月24日出願)の部分継続出願
である。前記両出願は参照により本明細書に含まれる。
本研究は米国公衆衛生局および米国立循環器研究所(National Heart, Lung and Blood
Institute)のグラントHL30568およびHL34343により補助を受けた。米国
政府は本発明に関して一定の権利を有する。
れる新規なペプチドを提供する。特に、本発明の発見は、“D”アミノ酸残基とともに製
剤化されるか、および/または保護アミノ末端およびカルボキシル末端を有する、クラス
A両親媒性らせんを含むペプチドは、生物に経口投与することが可能で、容易に取り込ま
れ、血清に送られて効果的に1つまたは2つ以上のアテローム性硬化症の症状を緩和する
ということであった。
ドを提供する。前記ペプチドの長さは約10から約30アミノ酸の範囲で、少なくとも1
つのクラスA両親媒性らせんを含み、少なくとも1つの“D”アミノ酸残基を含み、酸化
物質による酸化からリン脂質を保護し、さらにD−18Aペプチドではない(例えば、全
てD型アミノ酸残基を有するD−W−L−K−A−F−Y−D−K−V−A−E−K−L
−K−E−A−F(配列識別番号:1))。特に好ましい実施態様では、前記ペプチドは
さらにアミノおよびカルボキシル末端と結合した保護基を含む。好ましい保護基には以下
が含まれるが、ただしこれらに限定されない:アセチル、アミドおよび3から20個の炭
素のアルキル基、Fmoc、t−boc、9−フルオレンアセチル基、1−フルオレンカ
ルボン酸基、9−フルオレンカルボン酸基、9−フルオレノン−1−カルボン酸基、ベン
ジルオキシカルボニル、キサンチル(Xan)、トリチル(Trt)、4−メチルトリチ
ル(Mtt)、4−メトキシトリチル(Mmt)、4−メトキシ2,3,6−トリメチル
−ベンゼンスルホニル(Mtr)、メシチレン−2−スルホニル(Mts),4,4−ジ
メトキシベンゾヒドリル(Mbh)、トシル(Tos)、2,2,5,7,8−ペンタメ
チルクロマン−6−スルホニル(Pmc)、4−メチルベンジル(MeBzl)、4−メ
トキシベンジル(MeOBzl)、ベンジルオキシ(BzlO)、ベンジル(Bzl)、
ベンゾイル(Bz)、3−ニトロ−2−ピリジンスルフェニル(Npys)、1−(4,
4−ジメチル−2,6−ジアキソシクロヘキシリデン)エチル(Dde)、2,6−ジク
ロロベンジル(2,6−DiCl−Bzl)、2−クロロベンジルオキシカルボニル(2
−Cl−Z)、2−ブロモベンジルオキシカルボニル(2−Br−Z)、ベンジルオキシ
メチル(Bom)、t−ブトキシカルボニル(Boc)、シクロヘキシルオキシ(cHx
O)、t−ブトキシメチル(Bum)、t−ブトキシ(tBuO)、t−ブチル(tBu
)、アセチル(Ac)およびトリフルオロアセチル(TFA)。特に好ましいある種の実
施態様では、前記ペプチドはさらに、アミノ末端に結合された第一の保護基およびカルボ
キシル末端に結合された第二の保護基を含む。特に好ましいペプチドは、ヒトまたはマウ
スのアポA−IのクラスA両親媒性らせんに極めて類似している。ある種の実施態様では
、好ましいペプチドは、ヒトまたはマウスのアポA−IのクラスA両親媒性らせんをコー
ドするエクソンによってコードされるポリペプチドと約50%を越えるアミノ酸配列同一
性を含む。ある種の好ましい実施態様では、鏡像異性アミノ酸の少なくとも約10%、好
ましくは少なくとも20%、より好ましくは少なくとも約30%、さらに好ましくは少な
くとも約50%、さらにまた好ましくは少なくとも約75%、もっとも好ましくは少なく
とも90%および100%すらが“D”アミノ酸である。前記ペプチドは、薬学的に許容
できる賦形剤(例えば哺乳類への経口投与に適した賦形剤)と結合させてもよい。
K-E-A-F- (配列識別番号2),D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L,K-E-A-F- (配列識別番号3),
D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(配列識別番号4), D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-
F-K-E-A-F- (配列識別番号5),D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号6)
,D-W-L-K-A-F-Y-D-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号7), D-W-F-K-A-F-Y-D-K-F-F-E-
K-F-K-E-F-F- (配列識別番号8),D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F- (配列識別番号
9),D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-A-F- (配列識別番号10), D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F
-E-K-L-K-E-F-F-(配列識別番号11), D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別
番号12),D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号13), E-W-L-K-L-F-Y-E-
K-V-L-E-K-F-K-E-A-F-(配列識別番号14), E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F- (配
列識別番号15),E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F- (配列識別番号16), E-W-L-K-A-
F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-A-F-(配列識別番号17), E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-L-K-E-F-F
- (配列識別番号18),E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号19), E-W-L
-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F-(配列識別番号20), A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F- (
配列識別番号21),A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F- (配列識別番号22), A-F-Y-D-K-V-A-E-
K-F-K-E-A-F- (配列識別番号23),A-F-Y-D-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号24), A-
F-Y-D-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(配列識別番号25), A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(配列識
別番号26),A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F- (配列識別番号27), A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-
E-A-F- (配列識別番号28),A-F-Y-D-K-V-F-E-K-L-K-E-F-F- (配列識別番号29), A-F-Y-D-
K-V-A-E-K-F-K-E-F-F-(配列識別番号30), K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F- (配列識別番
号31),L-F-Y-E-K-V-L-E-K-F-K-E-A-F- (配列識別番号32), A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-
F- (配列識別番号33),A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F- (配列識別番号34), A-F-Y-D-K-V-
F-E-K-F-K-E-A-F-(配列識別番号35),A-F-Y-D-K-V-F-E-K-L-K-E-F-F- (配列識別番号36),
A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-F-F-(配列識別番号37), A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F- (配
列識別番号38),D-W-L-K-A-L-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-L- (配列識別番号39), D-W-F-K-A-
F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-(配列識別番号40),D-W-F-K-A-F-Y-E-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-
(配列識別番号41),E-W-L-K-A-L-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-L- (配列識別番号42), E-W-L-
K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(配列識別番号43), E-W-F-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E
-F-F- (配列識別番号44),E-W-L-K-A-F-Y-E-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号45), E
-W-L-K-A-F-Y-E-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(配列識別番号46), E-W-F-K-A-F-Y-E-K-F-F-E-K-
F-K-E-F-F- (配列識別番号47),D-F-L-K-A-W-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-W- (配列識別番号4
8),E-F-L-K-A-W-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-W- (配列識別番号49), D-F-W-K-A-W-Y-D-K-V-A
-E-K-L-K-E-W-W-(配列識別番号50), E-F-W-K-A-W-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-W-W- (配列識別
番号51),D-K-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-W-A-K-E-A-F-(配列識別番号52), D-K-W-K-A-V-Y-D-K
-F-A-E-A-F-K-E-F-L-(配列識別番号53), E-K-L-K-A-F-Y-E-K-V-F-E-W-A-K-E-A-F- (配列
識別番号54),E-K-W-K-A-V-Y-E-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L-(配列識別番号55), D-W-L-K-A-F-V
-D-K-F-A-E-K-F-K-E-A-Y-(配列識別番号56), E-K-W-K-A-V-Y-E-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L- (
配列識別番号57),D-W-L-K-A-F-V-Y-D-K-V-F-K-L-K-E-F-F-(配列識別番号58), E-W-L-K-A
-F-V-Y-E-K-V-F-K-L-K-E-F-F-(配列識別番号59), D-W-L-R-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-
F- (配列識別番号60),E-W-L-R-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(配列識別番号61), D-W-L
-K-A-F-Y-D-R-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(配列識別番号62), E-W-L-K-A-F-Y-E-R-V-A-E-K-L-K-
E-A-F- (配列識別番号63),D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(配列識別番号64), E
-W-L-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(配列識別番号65), D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-
L-R-E-A-F- (配列識別番号66),E-W-L-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F-(配列識別番号67
),D-W-L-K-A-F-Y-D-R-V-A-E-R-L-K-E-A-F- (配列識別番号68), E-W-L-K-A-F-Y-E-R-V-A-
E-R-L-K-E-A-F-(配列識別番号69), D-W-L-R-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F- (配列識別
番号70),E-W-L-R-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F- (配列識別番号71), D-W-L-R-A-F-Y-D-
R-V-A-E-K-I-K-E-A-F-(配列識別番号72), E-W-L-R-A-F-Y-E-R-V-A-E-K-L-K-E-A-F- (配
列識別番号73),D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-R-L-R-E-A-F- (配列識別番号74), E-W-L-K-A-
F-Y-E-K-V-A-E-R-L-R-E-A-F-(配列識別番号75), D-W-L-R-A-F-Y-D-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F
- (配列識別番号76),E-W-L-R-A-F-Y-E-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F- (配列識別番号77), D-W-L
-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-P-D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(配列識別
番号78),D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-P-D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F
-F- (配列識別番号79),D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-P-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-
A-E-K-L-K-E-A-F-(配列識別番号80),D-K-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-W-A-K-E-A-F-P-D-K-L-K-
A-F-Y-D-K-V-F-E-W-L-K-E-A-F-(配列
識別番号81),D-K-W-K-A-V-Y-D-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L-P-D-K-W-K-A-V-Y-D-K-F-A-E-A-F-K
-E-F-L- (配列識別番号82),D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-P-D-W-F-K-A-F-Y-D-
K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(配列識別番号83), D-W-L-K-A-F-V-Y-D-K-V-F-K-L-K-E-F-F-P-D-W
-L-K-A-F-V-Y-D-K-V-F-K-L-K-E-F-F-(配列識別番号84), D-W-L-K-A-F-Y-D-K-F-A-E-K-F-
K-E-F-F-P-D-W-L-K-A-F-Y-D-K-F-A-E-K-F-K-E-F-F-(配列識別番号85) から選ばれる、1
つまたは2つ以上の以下のアミノ酸配列、その切端形、その多量体(例えば好ましくは2
量体から3量体、4量体、5量体、8量体または10量体の範囲である)、その配列の保
存的置換、および/またはアミノ酸類似体を含む前記配列を含む。
ある種の好ましい実施態様では、本明細書で述べるように、前記鏡像異性アミノ酸の少な
くとも50%、より好ましくは少なくとも75%、もっとも好ましくは少なくとも90%
および100%すらが“D”アミノ酸である。前記のペプチドはまた、そのアミノ末端ま
たはカルボキシ末端に結合された保護基(例えばアミド、アセチル、プロペオニル、およ
び3から20個の炭素のアルキルなど)を含むことができる。ある種の実施態様では、前
記カルボキシル末端に結合された保護基はアミドである。ある種の実施態様では、前記ア
ミノ末端に結合された保護基は、アセチル、プロペオニルまたは3から20個の炭素のア
ルキルである。ある種のペプチドは、カルボキシル末端保護基およびアミノ末端保護基の
両方を含む。前記のような実施態様の1つでは、前記アミノ末端の保護基はアセチル、プ
ロペオニルおよび3から20炭素のアルキルから成る群から選択される保護基で、前記カ
ルボキシル末端の保護基はアミドである。
、15(S)−HPETE、HPODE、HPETE、HODEおよびHETEから成る
群から選択される酸化物質による酸化からリン脂質を保護するペプチドである。前記リン
脂質は以下から成る群から選択されるリン脂質であろう:1−パルミトイル−2−アラキ
ドノイル−sn−グリセロ−3−ホスホリルコリン(PAPC)、1−ステアロイル−2
−アラキドノイル−sn−グリセロ−3−ホスホリルコリン(SAPC)、1−ステアロ
イル−2−アラキドニル−sn−グリセロ−3−ホスホリルエタノールアミン(SAPE
)。したがって、前記ペプチドは、例えば以下の脂質の生成を防止する:酸化1−パルミ
トイル−2−アラキドノイル−sn−グリセロ−3−ホスホリルコリン(Ox−PAPC
)、1−パルミトイル−2−オキソバレロイル−sn−グリセロ−3−ホスホリルコリン
(POVPC)、1−パルミトイル−2−グルタロイル−sn−グリセロ−3−ホスホリ
ルコリン(PGPC)、1−パルミトイル−2−エポキシイソプロスタン−sn−グリセ
ロ−3−ホスホリルコリン(PEIPC)、酸化1−ステアロイル−2−アラキドノイル
−sn−グリセロ−3−ホスホリルコリン(Ox−SAPC)、1−ステアロイル−2−
オキソバレロイル−sn−グリセロ−3−ホスホリルコリン(SOVPC)、1−ステア
ロイル−2−グルタロイル−sn−グリセロ−3−ホスホリルコリン(SGPC)、1−
ステアロイル−2−エポキシイソプロスタン−sn−グリセロ−3−ホスホリルコリン(
SEIPC)、酸化1−ステアロイル−2−アラキドニル−sn−グリセロ−3−ホスホ
リルエタノールアミン(Ox−SAPE)、1−ステアロイル−2−オキソバレロイル−
sn−グリセロ−3−ホスホリルエタノールアミン(SOVPE)、1−ステアロイル−
2−グルタロイル−sn−グリセロ−3−ホスホリルエタノールアミン(SGPE)およ
び1−ステアロイル−2−エポキシイソプロスタン−sn−グリセロ−3−ホスホリルエ
タノールアミン(SEIPE)。
組成物を提供する。前記組成物は、クラスAの両親媒性らせんを含むヒトアポA−Iペプ
チドもしくはそのフラグメント、またはヒトアポA−Iペプチド類似体であるペプチドを
含み、ここで前記ペプチドは、アミノ末端に結合した第一の保護基およびカルボキシル末
端に結合した第二の保護基を有し、さらに前記ペプチドは複数のDアミノ酸残基を含む。
前記保護基には本明細書で述べる保護基が含まれるが、ただしこれらに限定されない。あ
る種の実施態様では、前記ペプチドを構成する鏡像異性アミノ酸の半分以上、より好まし
くは80%以上、もっとも好ましくは90%以上またはその全てすらがDアミノ酸である
。前記組成物は、さらに医薬的に許容できる賦形剤(例えば経口投与に適した賦形剤また
は注射に適した賦形剤)を含むことができる。
S)−HPETE、HPODE、HPETE、HODEおよびHETE)による酸化から
リン脂質[例えば1−パルミトイル−2−アラキドノイル−sn−グリセロ−3−ホスホ
リルコリン(PAPC)、1−ステアロイル−2−アラキドノイル−sn−グリセロ−3
−ホスホリルコリン(SAPC)、1−ステアロイル−2−アラキドニル−sn−グリセ
ロ−3−ホスホリルエタノールアミン(SAPE)]を保護することができる。したがっ
て、前記ペプチドは以下の生成を防ぐことができる:酸化1−パルミトイル−2−アラキ
ドノイル−sn−グリセロ−3−ホスホリルコリン(Ox−PAPC)、1−パルミトイ
ル−2−オキソバレロイル−sn−グリセロ−3−ホスホリルコリン(POVPC)、1
−パルミトイル−2−グルタロイル−sn−グリセロ−3−ホスホリルコリン(PGPC
)、1−パルミトイル−2−エポキシイソプロスタン−sn−グリセロ−3−ホスホリル
コリン(PEIPC)、酸化1−ステアロイル−2−アラキドノイル−sn−グリセロ−
3−ホスホリルコリン(Ox−SAPC)、1−ステアロイル−2−オキソバレロイル−
sn−グリセロ−3−ホスホリルコリン(SOVPC)、1−ステアロイル−2−グルタ
ロイル−sn−グリセロ−3−ホスホリルコリン(SGPC)、1−ステアロイル−2−
エポキシイソプロスタン−sn−グリセロ−3−ホスホリルコリン(SEIPC)、酸化
1−ステアロイル−2−アラキドニル−sn−グリセロ−3−ホスホリルエタノールアミ
ン(Ox−SAPE)、1−ステアロイル−2−オキソバレロイル−sn−グリセロ−3
−ホスホリルエタノールアミン(SOVPE)、1−ステアロイル−2−グルタロイル−
sn−グリセロ−3−ホスホリルエタノールアミン(SGPE)および1−ステアロイル
−2−エポキシイソプロスタン−sn−グリセロ−3−ホスホリルエタノールアミン(S
EIPE)。
例えばヒトまたはヒト以外の哺乳類)に1つまたは2つ以上の本明細書に記載するペプチ
ドを投与することを含む。特に好ましい実施態様では、前記ペプチドは複数の“D”アミ
ノ酸を含み、および/または本明細書に記載するように保護されている。前記ペプチドは
好ましくは前記生物に経口投与され、さらに前記生物は好ましくはアテローム性硬化症の
1つまたは2つ以上の症状があるまたはそのおそれがあると診断された生物である。ある
種の実施態様では、前記ペプチドは単離ペプチドとして提供されるか、または本明細書に
記載する薬理学的賦形剤と一緒に提供することができる。投与は好ましくは、アテローム
性硬化症の1つもしくは2つ以上の症状を改善させるか、及び/またはアテローム性硬化
症の1つもしくは2つ以上の症状の発生のおそれを顕著に減少させるために十分な用量で
提供される。
る。好ましいキットは、本明細書に記載する1つまたは2つ以上のペプチドを収納した容
器を含む。前記ペプチドは好ましくは、本明細書に記載するように複数の“D”アミノ酸
を含み、および/または保護されている。ある種の実施態様では、前記キットは場合によ
ってさらに医薬的に許容できる賦形剤を含み、および/または前記ペプチドは医薬的に許
容できる賦形剤と結合された状態で(例えば個別投薬形態として)提供される。好ましい
キットは経口投与用の個別投薬形態を提供する。前記キットはまた、場合によって、アテ
ローム性硬化症の1つまたは2つ以上の症状を改善するために、および/またはアテロー
ム性硬化症の1つまたは2つ以上の症状の発生のおそれを減少させるために前記ペプチド
の使用を説明する指示物を含む。
ある種の実施態様では、本発明は、米国特許第4,643,988号および/またはGarberらの
文献(Arteriosclerosisand Thrombosis, 12:886-894(1992))に開示されたいずれのペ
プチドも除外する。ある種の実施態様では、本発明は、米国特許第4,643,988号および/
またはGarberら(1992)の文献に開示されたペプチドであって、全ての鏡像異性アミノ酸
がLアミノ酸であるものから合成されたもの、またはDアミノ酸であるものから合成され
たものをいずれも除外する(ここで前記ペプチドは封鎖基である)。ある種の実施態様で
は、本発明は、式A1−B1−B2−C1−D−B3−B4−A2−C2−B5−B6−A3−C3−
B7−C4−A4−B8−B9(配列識別番号:87)を有するペプチドを除外する。前記式
中、A1、A2、A3およびA4はそれぞれ別個にアスパラギン酸もしくはグルタミン酸、ま
たはその同族体もしくは類似体であり、B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8および
B9はそれぞれ別個にトリプトファン、フェニルアラニン、アラニン、ロイシン、チロシ
ン、イソロイシン、バリンもしくはα−ナフチルアラニン、またはその同族体もしくは類
似体であり、C1、C2、C3およびC4はそれぞれ別個にリジンまたはアルギニンであり、
Dはセリン、スレオニン、アラニン、グリシン、ヒスチジンまたはその同族体もしくは類
似体であるが、ただし、A1およびA2がアスパラギン酸であるときは、A3およびA4はグ
ルタミン酸であり、B2およびB9はロイシンであり、B3およびB7はフェニルアラニンで
あり、B4はチロシンであり、B5はバリンであり、B6、B8およびDはアラニンであり、
さらにC1、C2、C3およびC4はリジンであり、B1はトリプトファンではないことを条
件とする。
“ポリペプチド”、“ペプチド”および“タンパク質”という用語は、本明細書ではア
ミノ酸残基ポリマーを指すために互換的に用いられる。前記用語は、天然に存在するアミ
ノ酸ポリマーと同様に、1つまたは2つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するア
ミノ酸の人工的化学的類似体であるアミノ酸にも適用される。
−らせんを形成し、陽性荷電残基を極性−非極性境界面に、陰性荷電残基を極性表面の中
心部に有するタンパク質構造を指す(例えば以下の文献を参照されたい:Segrest et al.
(1990)Proteins: Structure, Function, and Genetics 8:103-117)。
状を改善する”という場合に用いられるときは、アテローム性硬化症および/または付随
する病変の1つまたは2つ以上の症状の減少、防止または排除を指す。前記の減少には酸
化リン脂質の減少または排除、アテローム性硬化症プラーク形成および断裂の減少、臨床
症状(心臓発作、狭心症または卒中発作等)の減少、高血圧の低下、炎症性タンパク質の
生合成の低下、血漿コレステロールの減少などが含まれるが、ただしこれらに限定されな
い。
の形態として存在することができるアミノ酸を指す。ほとんどのアミノ酸(グリシンを除
く)は鏡像異性であり、いわゆるL型(Lアミノ酸)またはD型(Dアミノ酸)として存
在する。天然に存在するほとんどのアミノ酸は“L”アミノ酸である。“Dアミノ酸”お
よび“Lアミノ酸”という用語は、平面偏光の特定の回転方向ではなくアミノ酸の絶対配
置を指すために用いられる。本明細書での用い方は当業者の標準的な用い方と一致してい
る。
するかまたは覆い隠す化学基(例えば側鎖、アルファアミノ基、アルファカルボキシル基
など)を指す。好ましいアミノ末端保護基にはアセチルまたはアミノ基が含まれるが、た
だしこれらに限定されない。他のアミノ末端保護基には、脂肪酸の場合のようなアルキル
基、プロペオニル、フォルミルおよび他のものが含まれるが、ただしこれらに限定されな
い。好ましいカルボキシル末端保護基には、アミドまたはエステルを形成する基が含まれ
るが、ただしこれらに限定されない。
例えば、過酸化水素、13−(S)−HPODE、15−(S)−HPETE、HPOD
E、HPETE、HODE、HETEなど)と接触したとき、リン脂質の酸化速度(また
は生成される酸化リン脂質の量)を減少させることができる化合物の能力を指す。
いと一致する。一般に、LDLは、超遠心によって単離されたとき、d=1.019から
d=1.063の範囲の密度で見出される脂質−タンパク質複合体を指す。
いと一致する。一般に、“HDL”は、超遠心によって単離されたとき、d=1.063
からd=1.21の範囲の密度で見出される脂質−タンパク質複合体を指す。
おいて)、または酸化物質による酸化から酸化された脂質を保護する高密度リポタンパク
質またはその成分(例えばアポA−I、パラオキソナーゼ、血小板活性化因子アセチルヒ
ドラーゼなど)を指す。
修復(例えば還元)する活性が低いかまたは前記活性がないHDLを指す。
分子)を指す。酸化から脂質を保護するかまたは修復する(例えば酸化脂質を還元する)
HDLについてのアッセイはまた、前記の活性を示すHDLの成分(例えばアポA−I、
パラオキソナーゼ、血小板活性化因子アセチルヒドラーゼなど)についてのアッセイを含
む。
親媒性らせんを含むそのフラグメントもしくはドメインを指す。
炎症反応”に特徴的な単球の活動を指す。前記単球反応は、血管壁の細胞(例えば血管内
皮の細胞)への単球の付着、および/または内皮下腔への走化性、および/または単球の
マクロファージへの分化を特徴とする。
こと、より好ましくは統計的に有意な変化を欠くこと(例えば少なくとも85%、好まし
くは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、もっとも好ましくは少なくと
も98%または99%の信頼度)を指す。検出可能な変化がないとはまた、酸化リン脂質
レベルが変化するが、本明細書に記載するタンパク質が存在しない場合の変化より多くな
いか、または陽性もしくはネガティブコントロールに対する場合ほど多くないアッセイも
指すことができる。
ラキドノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン;POVPC=1−パルミトイル−2
−(5−オキソバレリル)−sn−グリセロ−3−ホスホコリン;PGPC=1−パルミ
トイル−2−グルタリル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン;PEIPC=1−パルミ
トイル−2−(5,6−エポキシイソプロスタンE2)−sn−グリセロ−3−ホスホコ
リン;ChC18:2=コレステリルリノレート;ChC18:2−OOH=コレステリ
ルリノレートヒドロペルオキシド;DMPC=1,2−ジテトラデカノイル−rac−グ
リセロール−3−ホスホコリン;PON=パラオキソナーゼ;HPF=標準化高倍率視野
;PAPC=L−α−1−パルミトイル−2−アラキドノイル−sn−グリセロ−3−ホ
スホコリン;POVPC=1−パルミトイル−2−(5−オキソバレリル)−sn−グリ
セロ−3−ホスホコリン;PGPC=1−パルミトイル−2−グルタリル−sn−グリセ
ロ−3−ホスホコリン;PEIPC=1−パルミトイル−2−(5,6−エポキシイソプ
ロスタンE2)−sn−グリセロ−3−ホスホコリン;PON=パラオキソナーゼ;BL
/6=C57BL/6J;C3H=C3H/HeJ。
記分子の活性(特異性(例えばリポタンパク質に対する))または結合親和性(例えば脂
質またはリポタンパク質に対する)を変化させないアミノ酸置換を意味する。典型的には
、保存的アミノ酸置換には、1つのアミノ酸を同様な化学的特性(例えば荷電または疎水
性)を有する別のアミノ酸と置換することが含まれる。以下の6群の各々は、互いに典型
的な保存置換であるアミノ酸を含む:1)アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(
T);2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);3)アスパラギン(N)、グル
タミン(Q);4)アルギニン(R)、リジン(K);5)イソロイシン(I)、ロイシ
ン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);および6)フェニルアラニン(F)、チロ
シン(Y)、トリプトファン(W)。
“同一性”という用語は、最大の重なりとなるようアラインメントを実施して比較し、以
下の配列比較アルゴリズムの1つを用いるか、または直接目視で測定したとき、同じであ
るか、または一定のパーセンテージのアミノ酸残基またはヌクレオチドが同じである2つ
以上の配列またはサブ配列を指す。本発明のペプチドについては、配列同一性はペプチド
の全長にわたって決定された。
対してテスト配列を比較する。配列比較アルゴリズムを用いるとき、テスト配列およびリ
ファレンス配列をコンピューターにインプットし、必要な場合にはサブ配列コーディネー
トを指定し、さらに配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。続いて、配列
比較アルゴリズムは、指定したプログラムパラメーターを基にして、リファレンス配列に
対するテスト配列のパーセント配列同一性を計算する。
相同性アルゴリズム(Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981))、相同性アラ
インメントアルゴリズム(Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443(1970))、類似性
検索法(Pearson& Lipman, Proc, Natl. Acad. Sci.
USA85:2444(1988))、これらアルゴリズムのコンピューターによる実行(GAP, BESTFIT,
FASTAおよびTFASTA(WisconsinGenetics Software Package, Genetics Computer Group
, 575 ScienceDr., Madison, WI))、または目視による精査(一般的には上
掲書(Ausubelet al.)を参照されたい)。
ト配列同一性を示すために、対毎に進めていく累積アラインメントを用いて一群の関連配
列から多数の配列アラインメントを作製する。PILEUPはまた、前記アラインメント
を作製するために用いられたクラスター形成(clustering)関係を示す系統樹または樹状
図を作製する。PILEUPは、漸進アラインメント法(Higgins & Sharp, CABIOS 5:15
1-153(1989))を簡易化させたものを用いる。使用される方法は上掲書(Higgins& Sharp
, (1989))に記載された方法に類似する。前記プログラムは、300配列(各々最大の長
さが5000ヌクレオチドまたはアミノ酸である)のアラインメントを実施することがで
きる。
インメントを実施することで開始し、アラインされた2つの配列で構成されるクラスター
を作製する。続いて、前記クラスターをその次に関連を有する配列またはアラインされた
配列クラスターに対してアラインメントを実施する。2つの個々の配列を対毎にアライン
したものを単純に伸張させていくことによって2つの配列クラスターのアラインメントを
実施する。最終的なアラインメントは一連の漸進的な対毎のアラインメントによって達成
される。前記プログラムは、配列比較領域について特定の配列およびそれらのアミノ酸ま
たはヌクレオチド座標を指定することにより、さらにプログラムパラメーターを指定する
ことにより実行される。例えば、以下のパラメーター、デフォルトギャップ加重値(3.
00)、デフォルトギャップ長過重値(0.10)および過重エンドギャップを用いてリ
ファレンス配列を他のテスト配列と比較し、パーセント配列同一性関係を決定できる。
LASTアルゴリズムで、前記は文献(Altschul et al. J. Mol. Biol. 215:403-410(19
90))に報告されている。BLAST分析を実行するソフトは公的施設(NationalCenter
forBiotechnology Information( HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/" http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/))を介して一般に利用可能である。前記アルゴリズムは、先ず
初めに問題の配列中に存在する、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメン
トを実施したとき、いくつかの正の値をもつ閾値スコアTと適合するか、またはこれを満
たす長さがWの短いワードを特定することによって高いスコアをもつ配列対(HSP)を
特定する。前記高スコアの配列対は、。Tは近縁ワードスコア閾値と呼ばれる(Altschul
et al. 上掲書)。前記の最初の近縁ワードヒットは検索開始の種子として機能し、前記
近縁ワードを含むより長いHSPを発見することができる。続いて前記ワードヒットを各
配列の両方向に、累積アラインメントが増加するかぎり伸長する。ヌクレオチド配列の場
合、パラメーターM(適合対に対する褒賞スコア、常に>0)およびパラメーターN(非
適合対に対する罰則スコア、常に<0)を用いて累積スコアを計算する。アミノ酸配列の
場合は、累積スコアを計算するためにスコアリングマトリックスを用いる。各方向におけ
るワードヒットの伸長は以下の時に停止させる:累積アラインメントスコアがその最大達
成値から量Xだけ減少したとき;累積スコアが、1つまたは2つ以上の負のスコアをもつ
残基のアラインメントのために0または0未満になったとき;またはいずれかの配列の末
端に達したとき。BLASTアルゴリズムパラメーターW、TおよびXは前記アルゴリズ
ムの感度および速度を決定する。ヌクレオチド配列用BLASTNプログラムは、デフォ
ルトとしてワード長(W)に11、期待値(E)に10、M=5、N=−4および両鎖の
比較を用いる。アミノ酸配列用BLASTPプログラムは、デフォルトとしてワード長(
W)に3、期待値(E)に10、およびBLOSUM62スコアリングマトリックスを用
いる(例えば以下の文献を参照されたい:Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci
. USA89:10915(1989))。
列間の類似性の統計分析も実施する(例えば以下の文献を参照されたい:Karlin & Altsc
hul, Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5787(1993))。BLASTアルゴリズムに
よって提供される測定値は、最少合計確率(P(N))であり、これは2つのヌクレオチ
ドまたはアミノ酸配列間の適合が偶然生じる確率の指標を提供する。例えば、リファレン
ス核酸とテスト核酸の比較で前記最少合計確率が約0.1未満、より好ましくは約0.0
1未満、もっとも好ましくは0.001未満ならば、核酸はリファレンス配列と類似であ
ると考えられる。
−K−A−F−Y−D−K−V−A−E−K−L−K−E−A−F(配列識別番号:1)
。前記配列で、鏡像異性アミノ酸のいずれもD型アミノ酸である。
本発明は、クラスA両親媒性らせんモチーフに類似するようにデザインした合成ペプチ
ド(Segrestet al. Proteins: Structure, Function, and Genetics 8:103-117(1990))
はリン脂質と結合し、ヒトアポA−Iと同様な多くの生物学的特性を示すことができると
いう発見に関する。特に、前記ペプチドがDアミノ酸を用いて製剤化されるとき、前記ペ
プチドは劇的な血中半減期の増加を示し、特にアミノ末端および/またはカルボキシ末端
を封鎖されたときは経口的にすら投与することができるというのが、本発明の発見である
。
うことは、本発明の驚くべき発見であった。前記D型ペプチドを用いたIn vivoでの動物
実験は、経口による効果的な薬剤送達、血中半減期の増加およびアテローム性硬化症の1
つまたは2つ以上の症状の緩和または防止/抑制能力を示した。
我々は発見した。これらの実験(同時係属中の特許出願USSN09/541,468(2000年3月31日
出願)を参照されたい)では、ヒトLDLをin vitroでアポA−IまたはアポA−I類似
ペプチド(37pA)で処理することによって、HPODEおよびHPETEを含むLD
Lからシーディング(seeding)分子が除去されることを我々は示した。これらのシーデ
ィング分子は、ヒト動脈壁細胞混合培養がLDLを酸化することを可能にするために、お
よびLDLが動脈壁細胞に単球走化性活性を産生させるために必要である。我々はまた、
アポA−Iのマウスへの注射またはヒトへの輸液の後、マウスまたは実験協力者から単離
されたアポA−I注射/輸液後単離LDLは、ヒト動脈壁細胞による酸化に対して耐性を
示し、さらに動脈壁細胞の混合培養において単球の走化性活性を誘発しないことを見出し
た。
よびDは、アポE欠損マウスにおける血液成分と14C−D−5Fの結合を示している。本
明細書ではまた、アテローム誘発性食餌を与えたマウスおよびPBSを注射したマウスの
HDLは、ヒトHDLの酸化を抑制することができず、さらにヒトの動脈壁混合培養でL
DL誘発単球走化性活性を抑制することができないことが示されている。対照的に、アテ
ローム誘発性食餌を与え、さらに本明細書に記載するペプチドを毎日注射したマウスのH
DLは、正常なヒトHDLと同じように、ヒトLDLの酸化の抑制および混合培養でのL
DL誘発単球走化性活性の防止に有効であった(図2Aおよび2B)。さらにまた、アテ
ローム誘発性食餌を与え、さらにPBSを毎日注射したマウスから採取したLDLは、同
じ食餌を与えたが日量20μgのペプチド5Fを注射したマウスから採取したLDLより
も容易に酸化され、さらに容易に単球走化性活性を誘発した。前記Dペプチドは免疫原性
を有しないようであった(図4)。
びLDLに対するヒト動脈壁細胞のin vitro反応は、前記ペプチドによって示されたin v
ivoでの保護作用と一致する。総コレステロール、LDL−コレステロール、IDL+V
LDL−コレステロールレベルが同じで、HDL−コレステロールの総コレステロールに
対するパーセントが低いにもかかわらず、アテローム誘発性食餌を与えられ、さらに前記
ペプチドを注射された動物は顕著に低い病巣スコアを有していた(図5)。したがって、
本発明のペプチドは、アテローム誘発性食餌を与えられたマウスでアテローム性硬化症病
巣の進行を防止した。
症状を改善および/または防止する方法を提供する。好ましくは前記方法は、生物(好ま
しくは哺乳類、より好ましくはヒト)に本発明の1つまたは2つ以上のペプチド(または
前記ペプチドの摸倣体)を投与することを含む。本明細書に記載するように、前記ペプチ
ドは、標準的な多数の任意の方法(注射、座薬、経鼻スプレー、経時的放出移植物、経皮
パッチなどを含むがただしこれらに限定されない)にしたがって投与することができる。
特に好ましいある実施態様では、前記ペプチドは経口的に(例えばシロップ、カプセルま
たは錠剤として)投与される。
プチドの投与を含む。前記ポリペプチドは、モノマーとしてまたはダイマー、オリゴマー
もしくはポリマー形で提供することができる。ある種の実施態様では、前記多量体形は(
例えばイオン結合または疎水性結合による)結合したモノマーを含んでいてもよいし、他
方、別の多量体は(直接結合またはリンカーを介する)共有結合したモノマーを含んでい
てもよい。
獣医学的使用にも)適している。したがって好ましい生物には、ヒト、ヒト以外の霊長類
、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、有蹄類、ウサギ類などが含まれるが、ただしこれらに限定さ
れない。
ラーク形成および断裂、臨床事象における転化(例えば心臓発作、狭心症または卒中発作
)、高レベルの血漿コレステロール、高レベルの低密度リポタンパク質、高レベルの超低
密度リポタンパク質または炎症性タンパク質など]を示すヒトまたはヒト以外の動物に限
定されず、予防的な意味でも有用である。したがって、本発明のペプチド(またはその摸
倣体)はアテローム性硬化症の1つまたは2つ以上の症状の開始/進行を防止するために
生物に投与することができる。前記の意味で特に好ましい対象は、アテローム性硬化症の
1つまたは2つ以上の危険因子(例えば家族歴、高血圧、肥満、アルコールの大量摂取、
喫煙、高血中コレステロール、高血中トリグリセリド、高血中LDL、VLDL、IDL
もしくは低HDL、糖尿病、または糖尿病、高血中脂質、心臓発作、狭心症または卒中発
作の家族歴など)を示す対象者である。
ド自体、医薬として製剤化されたペプチド(特に経口送達用)、およびアテローム性硬化
症の1つまたは2つ以上の症状の治療および/または予防のためのキットも提供する。
本発明のアテローム性硬化症抑制ペプチドはまた他の多くの場合に有用である。特に、
我々は心脈管系合併症(例えばアテローム性硬化症、卒中発作など)はしばしば急性期炎
症反応の開始を伴い、またはこれに付随することを見出した。前記のような急性炎症反応
はしばしば、再発性炎症疾患(例えば癩、結核、全身性紅斑性狼瘡および慢性関節リウマ
チ)、ウイルス感染(例えばインフルエンザ)、細菌感染、真菌感染、器官移植、創傷も
しくは他の外傷、人工器官、バイオフィルムなどに付随する。
はその後の酸化リン脂質の生成が減少または防止され、それによって前記の症状に付随す
る心脈管系合併症を緩和または排除できるということは本発明の驚くべき発見であった。
び血小板活性化アセチルヒドラーゼ活性が低下することを示した。特定の理論に拘束され
ないが、これらのHDL酵素活性の低下の結果として、さらにまた急性期反応時のプロオ
キシダントタンパク質とHDLの結合の結果として、HDLはもはやLDLの酸化を防ぐ
ことができず、もはや内皮細胞によるLDL誘発単球走化性活性の生成を防止することが
できないのだと我々は考えている。
ペプチド(例えばマウス当たり20μg)を注射された対象動物では、パラオキソナーゼ
レベルは低下せず、生物学的に活性を有する酸化リン脂質はバックグラウンド以上には生
成されないことを見出した。これは、インフルエンザ感染時または急性期炎症反応を生じ
る他の事象時に(例えばウイルス感染、細菌感染、外傷、移植、種々の自己免疫疾患など
のために)、既知の冠状動脈疾患をもつ患者にD−4F(および/または本発明の他のペ
プチド)を(例えば経口的または注射によって)投与することができ、したがってこの短
期間処置によって、前記炎症性症状を生じる病変に付随する心臓発作および卒中発作の発
生の増加を防止することができることを示唆している。
急性反応を示している対象者、またはアテローム性硬化症のおそれがあるかもしくはアテ
ローム性硬化症の症状を示している対象者に本発明の1つまたは2つ以上のペプチドを投
与することを意図する。
に本発明のポリペプチドを投与することができる。再発性炎症症状(例えば慢性関節リウ
マチ、種々の自己免疫疾患など)を有する対象者(または動物)は、本発明のポリペプチ
ドで処置してアテローム性硬化症の進行または卒中発作を緩和または防止することができ
る。外傷(例えば急性損傷、組織移植など)を受けた対象者(または動物)は、本発明の
ポリペプチドで処置してアテローム性硬化症の進行または卒中発作を緩和または防止する
ことができる。
とを含むであろう。急性炎症性反応は、典型的には代謝の変化および肝臓における遺伝子
調節を伴う。急性炎症性反応は、免疫系、心脈管系および中枢神経系に加え身体の主要な
システムの全てを巻き込む動的なホメオスタシスの過程である。通常は、急性期反応は数
日続くだけであるが、慢性炎症または再発性炎症の場合には、急性期反応のいくつかの局
面の異常な継続は前記疾患に付随する下部組織損傷の一因となり、さらにまた別の合併症
、例えば心脈管系疾患またはタンパク質沈着疾患(例えばアミロイド症)をもたらすこと
になるであろう。
下では、肝臓は固有の範囲内で一定の濃度の血漿タンパク質を生合成する。これらタンパ
ク質の多くは重要な機能を有し、これら急性期反応物質(APR)または急性期タンパク
質(APP)のより高い血中レベルが、炎症刺激に続く急性期反応の間に必要とされる。
ほとんどのAPRは肝細胞によって合成され、いくつかは他の細胞タイプ(単球、内皮細
胞、線維芽細胞および脂肪細胞を含む)によって産生される。ほとんどのAPRは、正常
レベルを越える50%から数倍の範囲で誘発される。対照的に、主要なAPRは正常レベ
ルの1000倍に増加することが可能である。いおの群には血清アミロイドA(SAA)
およびヒトのC−反応性タンパク質またはマウスホモログ、血清アミロイドP成分(SA
P)が含まれる。いわゆる陰性APRは急性期反応時に血中濃度が減少し、肝臓の誘発さ
れるAPR生合成能力を増加させる。
上のAPPを測定することによって検定される。前記のようなマーカーの測定は当業者に
は周知で、そのような測定を提供する業者が存在する(例えばカルディオテック・サービ
ス(CardiotechServices, Lousiville, KY)はAGPを測定する)。
我々はまた、冠状動脈石灰沈着および骨粗しょう症の原因として酸化脂質を特定した。
さらにまた、特定の理論に拘束されないが、我々は、石灰化大動脈狭窄の病理発生に同じ
メカニズムが存在すると考えている。
例えばリウマチ性多発性筋痛、多発性結節性動脈炎、強皮症、特発性肺線維症、慢性閉塞
性肺疾患、アルツハイマー病、エイズ、冠状動脈石灰沈着、骨粗鬆症、石灰化大動脈狭窄
などの疾患の症状を抑制または防止することを意図する。
好ましいペプチド
クラスAペプチドはアテローム性硬化症の1つまたは2つ以上の症状を緩和することが
できるということは本発明の発見であった。クラスAペプチドは、極性残基および非極性
残基の分離をもたらすα−らせんを形成し、それによって極性−非極性境界に陽性に荷電
した残基を位置し、さらに極性表面の中心に陰性に荷電した残基を位置する極性および非
極性表面を形成することを特徴とする(例えば以下を参照されたい:Anantharamaiah, Me
th. Enzymol.,128:626-668(1986))。アポA−Iの4番目のエクソンは、3.667残
基/ターンに折り畳まれるときクラスA両親媒性らせん構造を生じることは特筆されよう
。
iah)を参照されたい)を本明細書に記載するように改変し、経口投与が可能であり、さ
らにアテローム性硬化症の1つまたは2つ以上の症状の抑制または防止に極めて有効なペ
プチドを製造した。特定の理論に拘束されないが、LDLの酸化を緩和する本発明のペプ
チドは、おそらくシーディング分子を摘み取ることによってin vivoで機能すると考えら
れる。
を増すことができることがPalgunachariら(Arteriosclerosis, Thrombosis & Vascular
Biology16:328-338(1996))が記載したコンピュータ処理により分かった。理論的には、
18Aの非極性面の残基をPheによって系統的に置換することによって6つのペプチド
が得られるであろう。2、3および4つのPheが付加されたペプチドは、それぞれ13
、14および15ユニットの理論的脂質親和性(λ)値を有するであろう。しかしながら
、さらに付加Pheが4から5に増加するならば前記の値は一挙に4ユニット増加するで
あろう(19λユニットへ)。6つまたは7つのPheの増加は前記ほど劇的な増加をも
たらさない(それぞれ20および21λユニット)。したがって、我々は5つの付加Ph
eを選択した(したがってペプチドの名称は5F)。特に好ましい実施態様では、前記5
Fペプチドのアミノ末端残基をアセチル化し、カルボキシル末端残基をアミド化してブロ
ックした。
の成長を抑制した。前記新規なペプチド類似体、5Fは、Levineら(Proc. Natl. Acad.
Sci. USA90:12040-12044(1993))の実験を基にしたペプチド投与量を用いて前記マウス
で食餌誘発性アテローム性硬化症の抑制効果についてマウスのアポA−I(MoA−I)
と比較された。
は2つ以上の症状の軽減においてばらつきはあるものの、有意な程度の有効性を示した。
前記多数のペプチドは表1に示す。
端を保護するアミド基を有するが、これら保護基のいずれか一方または両方を除去しても
、および/または本明細書に記載するまた別の保護基で置換してもよい。特に好ましい実
施態様では、前記ペプチドは、本明細書に記載するように1つ以上のD型アミノ酸を含む
。ある種の実施態様では、表1の各アミノ酸(例えば各鏡像異性アミノ酸)がD型アミノ
酸である。
明を用いて、他の適切なペプチドを典型的なやり方で製造することができる[例えば保存
的または半保存的置換(例えばDをEに置換)、伸長、欠失など]。したがって例えば、
ある実施態様では、配列識別番号:2から20および39から85によって特定されるペ
プチドのいずれか1つまたは2つ以上の切端形が利用される。したがって例えば、配列識
別番号:21は、18AのC−末端から14アミノ酸を含み1つまたは2つ以上のDアミ
ノ酸を含むペプチドを示し、配列識別番号:22から38は別の切端形を示す。より長い
ペプチドもまた適している。前記のより長いペプチドは全体がクラスA両親媒性らせんを
形成してもよいし、または前記クラスA両親媒性らせんは1つまたは2つ以上のペプチド
ドメインを形成するものでもよい。さらに、本発明は前記ペプチドの多量体型も包含する
。したがって例えば、表1に示すペプチドは、[直接または1つもしくは2つ以上の介在
アミノ酸をもつリンカー(例えば炭素リンカーまたは1つもしくは2つ以上のアミノ酸)
を介して]一緒に結合させることができる。実例を挙げれば、ポリマーペプチドには18
A−Pro−18Aおよび配列識別番号:79から85のペプチドが含まれ、前記は好ま
しくは1つまたは2つ以上のDアミノ酸を含み、より好ましくは本明細書に記載するよう
に各アミノ酸はDアミノ酸で、および/または一端もしくは両端が保護されている。
記ペプチドはその活性を保持し、しかも経口的に投与できるということは、本発明の驚く
べき発見であった。さらにまた、この経口投与は、比較的効果的な取込みおよび顕著な血
中半減期をもたらし、それによってアテローム性硬化症の1つまたは2つ以上の症状を軽
減する効果的な方法を提供する。
なやり方で改変し、本発明の他の適切なクラスAペプチドを製造することができる。例え
ば典型的な保存的または半保存的置換(例えばEでDを置換)を現在存在するアミノ酸に
実施することができる。得られたペプチドの種々の置換がもつ脂質親和性に対する影響は
、Palgunachariら(Arteriosclerosis,Thrombosis & Vascular Biology, 16:328-338(19
96))が記載したコンピュータによる方法を用いて予測することができる。クラスAαら
せん構造が保存されるかぎり、前記ペプチドは長くしても短くしてもよい。さらに、得ら
れるペプチドを対象の種自身によって産生されるペプチドにいっそう類似させるために置
換を施すことができる。
プチドの“D”型を含み、より好ましくは一端または両端が保護基と結合した“D”型を
含む。そのようなペプチドには、式A1−B1−B2−C1−D−B3−B4−A2−C2−B5
−B6−A3−C3−B7−C4−A4−B8−B9(配列識別番号:86)をもつペプチドが含
まれる。式中、A1、A2、A3およびA4はそれぞれ別個にアスパラギン酸もしくはグルタ
ミン酸またはその同族体もしくは類似体であり;B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、
B8およびB9はそれぞれ別個にトリプトファン、フェニルアラニン、アラニン、ロイシン
、チロシン、イソロイシン、バリンもしくはα−ナフチルアミンまたはその同族体もしく
は類似体であり;C1、C2、C3およびC4はそれぞれ別個にリジンまたはアルギニンであ
り;さらにDはセリン、スレオニン、アラニン、グリシン、ヒスチジンまたはその同族体
もしくは類似体であり(ただし、A1およびA2がアスパラギン酸であるときは、A3およ
びA4はグルタミン酸、B2およびB9はロイシン、B3およびB7はフェニルアラニン、B4
はチロシン、B5はバリン、B6、B8およびDはアラニン、C1、C2、C3およびC4はリ
ジンであり、B1はトリプトファンではないことを条件とする)、さらに式中、少なくと
も1つの鏡像異性アミノ酸は“D”型アミノ酸である。好ましくは前記鏡像異性アミノ酸
の少なくとも50%が“D”型であり、より好ましくは前記鏡像異性アミノ酸の少なくと
も80%が“D”型であり、もっとも好ましくは前記鏡像異性アミノ酸の少なくとも90
%が“D”型アミノ酸である。
するアミノ酸のD型を利用する一方で、天然には存在しないアミノ酸(例えばメチオニン
スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム、ノルロイシン、エプシロン−アミノカプ
ロン酸、4−アミノブタン酸、テトラヒドロイソキノリン−3−カルボン酸、8−アミノ
カプリル酸、4−アミノブチル酸、Lys(N(エプシロン)−トリフルオロアセチル)
,α−アミノイソブチル酸など)の置換物もまた意図される。
れる。ペプチド類似体は、鋳型ペプチドの特性に類似する特性を有する非ペプチド薬とし
て製薬工業では一般的に用いられる。前記のタイプの非ペプチド化合物は“ペプチド摸倣
体”(peptidemimeticsまたはpeptidomimetics)(Fauchere(1986) Adv. Drug Res., 15
:29; Veber& Freidinger(1985) TINS p.392; Evans et al.(1987) J. Med. Chem., 30:1
229)と称され、通常はコンピューター支援分子モデリングによって開発される。治療的
に有用なペプチドと構造的に類似するペプチド摸倣体を用いて、同等な治療効果または予
防効果を得ることができる。
に類似するが、1つまたは2つ以上のペプチド結合を含み、前記ペプチド結合は、場合に
よって−CH2NH−、CH2S−、−CH2−CH2−、CH=CH−(シスおよびトラン
ス)、−COCH2−、−CH(OH)CH2−、−CH2SO−などから成る群から選択
される結合によって置換される。前記置換は、当業者に公知の方法および以下の文献に記
載されている方法によって実施される: Spatola (1983) p.267 "Chemistry and Biochem
istry of AminoAcids, Peptides and Proteins", B. Weinstein, eds., Marcel Dekker,
NewYork; Spatola (1983) Vega Data 1(3) Peptide Backbone Modifications(一般的
解説);Morley(1980) Trends Pharm Sci. pp.463-468(一般的解説);hudson et al.(
1979) Int. J.Pept. Prot. Res., 14:177-185(−CH2NH−,CH2CH2−);Spato
la et al.(1986)Life Sci., 38:1243-1249(−CH2−S);Hann (1982) J. Chem. Soc
. Perkin.Trans. I307-314(−CH−CH−、シスおよびトランス);Almquist et al.
(1980) J. Med.Chem. 23:1392-1398(−COCH2−);Jennings-White et al.(1982)
TetrahedronLett. 23:2533(−COCH2);M. Szelke et al.欧州特許出願EP45665(19
82)CA:97:39405(1982)(−CH(OH)CH2−);Holladayet al.(1983) Tetrahedron
Lett.24:4401-4404(−C(OH)CH2−);およびHruby (1982) Life Sci., 31:189
-199(−CH2−S−)。
ポリペプチドよりも顕著な利点を有するであろう。前記利点には、例えばより経済的な製
造、より高い化学的安定性、薬理学的特性の強化(半減期、吸収性、高い性能、有効性な
ど)、抗原性の減少などが含まれる。
ス配列もしくは実質的に同一なコンセンサス配列変種を含む構造的に拘束されたペプチド
(環状化ペプチドを含む)もまた、当分野で公知の方法(Rizo & Gierasch (1992) Ann.
Rev. Biochem.61:387)によって、例えばペプチドを環状化させる分子内ジスルフィド架
橋を形成することができる内部システイン残基の付加によって生成することができる。
本発明で用いられるペプチドは、標準的な化学的ペプチド合成技術を用いて化学的に合
成するか、または、特にペプチドが“D”アミノ酸残基を含まない場合は組換えによって
発現される。ポリペプチドが組換えによって発現される場合、1つまたは2つ以上のアミ
ノ酸がもっぱらD型で前記生物に提供される環境下で、ホスト生物(例えば細菌、植物、
真菌細胞など)を培養すると、組換えによって発現されたペプチドはしたがって前記Dア
ミノ酸を含んでいる。
成技術のいずれかによって化学的に合成される。配列のC−末端アミノ酸が不溶性支持体
に結合され、続いて前記配列の残りのアミノ酸が連続的に付加される固相合成は、本発明
のポリペプチドの化学合成のために好ましい方法である。固相合成のための技術は当業者
には周知で、例えば以下の文献に記載されている:Barany & Merrifield (1963) Solid-P
hase PeptideSynthesis; pp.3-284, "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. V
ol.2: SpecialMethods in Peptide Synthesis, Part A.;Merrifield et al.(1963) J.
Am. Chem. Soc.85:2149-2156;Stewart et al.(1984) Solid Phase Peptide Synthesis,
2nded. Pierce Chem. Co., Rockford, Ill.。
樹脂(BeckmanBioproducts, 0.59ミリモルNH2/gの樹脂)を用いて固相ペプチド
合成法によって合成される。COOH末端アミノ酸(例えばt−ブチルカルボニル−Ph
e)は、4−(オキシメチル)フェナセチル基により固相支持体に結合される。前記は、
通常のベンジルエステル結合よりも安定な結合で、しかも完成したペプチドを水素添加に
よって切断することができる。水素供与体としてギ酸を用いる水素転移添加がこの方法に
用いられる。ペプチド合成および合成されたペプチドの分析のための詳細なプロトコルは
、Anantharamaiahらの文献(J.Biol. Chem., 260(16):10248-10255(1985))に付随する
補充ミニプリントに記載されている。
に合成によって通常末端が切り縮められた多数のペプチドが生成されることは特筆されよ
う。精製過程(例えばHPLC)で、典型的には顕著な量の完全長の生成物が失われる。
その混合物を透析して使用し、それによって最後のHPLC精製を除くことができるとい
うことは本発明の発見であった。前記のような混合物は、高度に精製された生成物の性能
の約50%(例えばタンパク質生成物の重量当たり)を失うが、前記混合物は約6倍多い
ペプチドを含み、したがって総活性は高くなる。
Dアミノ酸は、化学合成でD型誘導アミノ酸残基を用いることによってペプチド内の1
つまたは2つ以上の位置に簡単に取り込まれる。固相ペプチド合成のためのD型アミノ酸
残基は多数の供給元から市販されている(例えば、Advanced Chem Tech, Louisville; No
va Biochem, SanDiego; Sigma, St Louis; Bachem California Inc., Torranceなど)。
D型アミノ酸はペプチド内の任意の位置に所望のように取り込ませることができる。した
がって例えば、ある実施態様では、ペプチドはただ1つのD−アミノ酸を含み、一方、別
の実施態様では、ペプチドは少なくとも2つ、一般的には少なくとも3つ、より一般的に
は少なくとも4つ、もっとも一般的には少なくとも5つ、好ましくは少なくとも6つ、よ
り好ましくは少なくとも7つ、さらにもっとも好ましくは少なくとも8つのDアミノ酸を
含む。特に好ましい実施態様では、実質的に(鏡像異性)アミノ酸1つおきにD型アミノ
酸が存在する。ある種の実施態様では、少なくとも90%、好ましくは少なくとも90%
、より好ましくは少なくとも95%の鏡像異性アミノ酸がD型アミノ酸である。特に好ま
しいある実施態様では、基本的に全ての鏡像異性アミノ酸がD型アミノ酸である。
ある種の実施態様では、構成アミノ酸および/または末端アミノ酸の1つまたは2つ以
上のR基は保護基で封鎖されている。特定の理論に拘束されないが、本発明のペプチドの
特にアミノ末端および/またはカルボキシル末端の封鎖は経口投与による薬剤送達を極め
て改善し、さらに血中半減期を顕著に高めるということは本発明の発見であった。
よびアルキル基が含まれるが、ただしこれらに限定されない。さらにアセチル基およびア
ルキル基がN末端の保護に特に好ましく、アミド基はカルボキシル末端の保護に好ましい
。特に好ましいある種の実施態様では、前記保護基には脂肪酸の場合のようなアルキル鎖
、プロペオニル、フォルミルおよび他のものが含まれるが、ただしこれらに限定されない
。特に好ましいカルボキシル保護基には、アミド、エステルおよびエーテル形成保護基が
含まれる。ある好ましい実施態様では、アセチル基がアミノ末端の保護に用いられ、アミ
ド基がカルボキシル末端の保護に用いられる。前記封鎖基はペプチドのらせん形成傾向を
強化する。ある種の特に好ましい封鎖基には、種々の長さのアルキル基、例えば式、CH
3−(CH2)n−CO−を有する基が含まれる。式中、nは約1から約20、好ましくは
約1から約16または18、より好ましくは約3から約13、もっとも好ましくは約3か
ら約10の範囲である。
プロペオニル基、フォルミル基および他の基が含まれるが、ただしこれらに限定されない
。特に好ましいカルボキシル保護基には、アミド、エステルおよびエーテル形成保護基が
含まれる。ある好ましい実施態様では、アセチル基がアミノ末端の保護に用いられ、アミ
ド基がカルボキシル末端の保護に用いられる。前記封鎖基はペプチドのらせん形成傾向を
強化する。ある種の特に好ましい封鎖基には、種々の長さのアルキル基、例えば式、CH
3−(CH2)n−CO−を有する基が含まれる。式中、nは約3から約20、好ましくは
約3から約16、より好ましくは約3から約13、もっとも好ましくは約3から約10の
範囲である。
t−ブトキシカルボニル(t−BOC)、9−フルオレンアセチル基、1−フルオレンカ
ルボン酸基、9−フルオレンカルボン酸基、9−フルオレノン−1−カルボン酸基、ベン
ジルオキシカルボニル、キサンチル(Xan)、トリチル(Trt)、4−メチルトリチ
ル(Mtt)、4−メトキシトリチル(Mmt)、4−メトキシ2,3,6−トリメチル
−ベンゼンスルホニル(Mtr)、メシチレン−2−スルホニル(Mts),4,4−ジ
メトキシベンズヒドリル(Mbh)、トシル(Tos)、2,2,5,7,8−ペンタメ
チルクロマン−6−スルホニル(Pmc)、4−メチルベンジル(MeBzl)、4−メ
トキシベンジル(MeOBzl)、ベンジルオキシ(BzlO)、ベンジル(Bzl)、
ベンゾイル(Bz)、3−ニトロ−2−ピリジンスルフェニル(Npys)、1−(4,
4−ジメンチル−2,6−ジアキソシクロヘキシリデン)エチル(Dde)、2,6−ジ
クロロベンジル(2,6−DiCl−Bzl)、2−クロロベンジルオキシカルボニル(
2−Cl−Z)、2−ブロモベンジルオキシカルボニル(2−Br−Z)、ベンジルオキ
シメチル(Bom)、シクロヘキシルオキシ(cHxO)、t−ブトキシメチル(Bum
)、t−ブトキシ(tBuO)、t−ブチル(tBu)、アセチル(Ac)、およびトリ
フルオロアセチル(TFA)。
せる方法と同様に当業者には周知である(例えば以下を参照されたい:Greene at al. (1
991) ProtectiveGroups in Organic Synthesis, 2nd ed., John Wiley & Sons, Inc. So
merset, NJ)。ある好ましい実施態様では、例えばアセチル化は、合成中にペプチドが樹
脂上に在るときに無水酢酸を用いて実施される。アミド保護は、そのような合成に適した
樹脂を選択することによって達成できる。本明細書の実施例で述べるペプチド合成時には
リンクアミド樹脂が用いられた。合成が終了した後、酸性二官能基アミノ酸(例えばAs
pおよびGlu)および塩基性アミノ酸Lysの半永久的保護基、Tyrのヒドロキシル
は全て同時に除去される。前記のような樹脂から酸性処理を用いて遊離させたペプチドは
、N末端がアセチルとして保護され、カルボキシル末端がNH2として保護され、さらに
全ての他の保護基が同時に除去されて得られる。
全てがLアミノ酸のペプチド(例えばその他の点では本発明のペプチドの配列を有する
もの)をD型(すなわち本発明のペプチド)と一緒に投与したとき、前記D型ペプチドの
取り込みが増加するということもまた、本発明の驚くべき発見であった。したがって、あ
る種の実施態様では、本発明は、D型およびL型ペプチドを組み合わせて本発明の方法で
用いることを含む。前記D型ペプチドおよびL型ペプチドは異なるアミノ酸配列を有する
ことができるが、好ましい実施態様では、それらはともに本明細書に記載するペプチドの
アミノ酸配列を有し、さらに好ましい実施態様では、それらは同じアミノ酸配列を有する
。
たは2つ以上の症状の緩和に有効であるということも本発明の発見であった。前記コンカ
テマーを含むモノマーを直接一緒に結合させるか、またはリンカーによって結合させても
よい。ある種の実施態様では、前記リンカーはアミノ酸リンカー(例えばプロリン)、ま
たはペプチドリンカー(例えばGly4Ser3)である。ある種の実施態様では、前記コ
ンカテマーは2量体、より好ましくは3量体、さらに好ましくは4量体、もっとも好まし
くは5量体、8量体または10量体である。
本発明の方法を実施するために、本発明の1つもしくは2つ以上のペプチドまたはペプ
チド摸倣体を、例えばアテローム性硬化症の1つまたは2つ以上の症状を有すると診断さ
れたか、またはアテローム性硬化症のおそれがあると診断された個体に投与する。前記ペ
プチドまたはペプチド摸倣体はその“元々の形態”で投与してもよいし、所望の場合には
塩、エステル、アミド、プロドラッグ、誘導体などの形態で投与してもよい。ただし、前
記塩、エステル、アミド、プロドラッグまたは誘導体は薬理学的に適切であること、すな
わち本方法で有効であることを条件とする。活性物質の塩、エステル、アミド、プロドラ
ッグ、および他の誘導体は、合成有機化学分野の業者にとって周知であり、さらに例えば
下記文献に記載されている標準的な方法を用いて製造することができる:March (1992) A
dvanced OrganicChemistry; Reactions, Mechanism and Structure, 4th Ed. NY. Wiley
-Interscience。
ら調製される。一般的には、薬剤の塩基形を極性有機溶媒、例えばメタノールまたはエタ
ノールに溶解し、それに酸が添加される。生成された塩を沈澱させるか、またはより極性
の小さい溶媒を添加して溶液から取り出すことができる。酸付加塩を製造するために適し
た酸には有機酸および無機酸の両方が含まれる。前記は、例えば酢酸、プロピオン酸、グ
リコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマ
ル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンス
ルホン酸、p−トルエンスルホン酸、サリチル酸などであり、後者は、例えば塩酸、臭化
水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などである。酸付加塩は、適切な塩基で処理することによっ
て遊離塩基に再度変換することができる。活性物質の特に好ましい酸付加塩はハロゲン化
塩、例えば塩酸または臭化水素酸で製造できるようなものである。逆に、前記ペプチドま
たは摸倣体の塩基性塩調製物は、医薬的に許容できる塩基(例えば水酸化ナトリウム、水
酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、トリメチルアミンなど)を用い
て同様な態様で製造できる。特に好ましい塩基性塩にはアルカリ金属塩(例えばナトリウ
ム塩)および銅の塩が含まれる。
ルボキシル基の機能化を必要とする。エステルは、典型的には遊離アルコール基[すなわ
ち、式RCOOH(式中Rはアルキル、好ましくは低級アルキル)のカルボン酸に由来す
る成分]のアシル置換誘導体である。エステルは、所望の場合は、通常の水素添加分解ま
たは加水分解によって遊離酸に再度変換することができる。
れている技術を用いて製造できる。例えば、アミドは適切な反応物を用いてエステルから
調製するか、またはアンモニアもしくは低級アルキルアミンとの反応によって無水物また
は酸塩化物から調製できる。プロドラッグは、典型的には、個体の代謝系によって改変さ
れるまでは治療活性をもたない化合物を生じる成分を共有結合させて調製される。
の症状の予防的および/または治療的処置のために、非経口的、局所的、経口的、経鼻的
(また別には吸入)、直腸、末梢投与(例えばエアロゾルまたは経皮的)で有用である。
本医薬組成物は、投与方法に応じて多様な個別投薬形態として投与できる。適切な個別投
薬形態には、粉薬、錠剤、ピル、カプセル、舐剤、座薬、パッチ、鼻腔スプレー、注射剤
、植え込み用徐放性製剤、脂質複合剤などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
体(賦形剤)と結合させて薬理学的組成物が生成される。医薬的に許容される担体は、1
つまたは2つ以上の生理学的に許容される化合物、例えば組成物を安定化させるか、活性
物質の吸収を増加もしくは低下させるために機能するものを含むことができる。生理学的
に許容される化合物には、例えば炭水化物(例えばグルコース、シュクロースまたはデキ
ストラン)、抗酸化物質(例えばアスコルビン酸またはグルタチオン)、キレート剤、低
分子量タンパク質、保護および取り込み増進剤(例えば脂質)、活性物質のクリアランス
および加水分解を減少させる組成物、または賦形剤もしくは他の安定化剤および/または
緩衝物質が含まれる。
殖または作用を防止するために有用な保存料が含まれる。種々の保存料が周知であり、こ
れらには例えばフェノールおよびアスコルビン酸が含まれる。医薬的に許容される担体(
生理的に許容される化合物を含む)の選択は、例えば活性物質の投与経路および活性物質
の個々の生理化学的特性に左右されることは、当業者には理解されよう。
成物は通常の周知の滅菌技術によって滅菌することができる。
以上の症状をもつか、またはアテローム性硬化症のおそれのある患者に、前記疾患および
/またはその合併症を治癒または少なくとも部分的に防止もしくは停止させるために十分
な量で投与される。前記を達成するために適切である量は“治療的に有効な投与量”と定
義される。前記の使用に有効な量は、前記疾患の重篤度および患者の一般的健康状態に左
右されるであろう。必要とされる用量および頻度並びに患者が許容できる用量および頻度
に応じて、組成物を単回または多数回投与することができる。いずれの事例でも、患者を
効果的に治療(1つまたは2つ以上の症状を改善)するために、本発明の製剤の活性物質
の十分量が組成物によって提供されねばならない。
投与態様および患者の必要性にしたがって、原則として液体容積、粘度、体重などを基準
に選択されるであろう。しかしながら、濃度は典型的には、約0.1または1mg/kg
/日から約50mg/kg/日の範囲で、さらに時にはそれよりも多い。典型的な用量は
、約3mg/kg/日から約3.5mg/kg/日、好ましくは約3.5mg/kg/日
から約7.2mg/kg/日、より好ましくは約7.2mg/kg/日から約11.0m
g/kg/日、もっとも好ましくは約11.0mg/kg/日から約15.0mg/kg
/日の範囲である。ある種の好ましい実施態様では、用量は約10mg/kg/日から約
50mg/kg/日の範囲である。前記の用量は、個々の対象者または対象群の治療計画
を最適化させるために変動しうることは理解されよう。
周知の標準的方法にしたがって経口的に(例えば錠剤により)、または注射物として投与
される。他の好ましい実施態様では、ペプチドはまた、通常の経皮的薬剤送達系を用いて
皮膚を通して送達することができる。前記はすなわち経皮“パッチ”であり、この場合活
性物質は典型的には、皮膚に貼り付ける薬剤送達装置として機能する層状構造物内に含ま
れる。前記構造物では、薬剤組成物は、典型的には層内又は上側の裏打ち層の下にある“
貯蔵部”に含まれる。この場合の“貯蔵部”という用語は、皮膚表面への送達のために最
終的に利用可能なある量の活性成分を指すことは理解されよう。したがって、例えば“貯
蔵部”はパッチの裏打ち層上の粘着物質内にまたは当業者に公知の多様な種々のマトリッ
クス構成のいずれかの内部に活性成分を含むことができる。パッチはただ1つの貯蔵部を
含んでいても、多数の貯蔵部を含んでいてもよい。
する医薬的に許容される接触粘着物質のポリマーマトリックスを含む。適切な皮膚接触粘
着物質の例には、ポリエチレン、ポリシロキサン、ポリイソブチレン、ポリアクリレート
、ポリウレタンなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない。また別には、薬剤含有
貯蔵部および皮膚接触粘着物質は分離した別個の層として存在し、貯蔵部の下に粘着物質
が存在し、この場合には前記貯蔵部は、上記で述べたようなポリマーマトリックスであっ
ても、液体もしくはヒドロゲル貯蔵部であっても、または他の何らかの形態をとってもよ
い。これらの層状物中の考案物の上側面として機能する裏打ち層は、好ましくは“パッチ
”の基本構造成分として機能し、前記考案物にその高い柔軟性を提供する。前記裏打ち層
のために選択された物質は、活性成分および含有される他のいずれの物質に対しても好ま
しくは実質的に非浸透性である。
これらに限定されない。軟膏は半固形調製物で、典型的にはワセリンまたは他の石油誘導
体をベースにする選択した活性物質を含むクリームは、典型的には粘稠な液体または半固
形乳液で、しばしば水中油または油中水である。クリームの基剤は典型的には水で洗浄可
能で、油相、乳化剤および水相を含む。前記油相はまた時に“内部相”と呼ばれ、一般に
ワセリンおよび脂肪族アルコール(例えばセチルまたはステアリルアルコール)で構成さ
れ、水相は通常は油相の容積を越え(ただし必ずしもそうではないが)、一般に湿潤剤を
含んでいる。クリーム製剤中の乳化剤は一般には非イオン性、陰イオン性、陽イオン性ま
たは両親媒性界面活性剤である。使用される個々の軟膏またはクリーム基剤は、当業者に
は理解されるように、最適な薬剤送達を提供するものである。他の担体または賦形剤の場
合のように、軟膏基剤は不活性で、安定で、非刺激性で、さらに非感作性でなければなら
ない。
さえも投与することが可能で、胃酸などによるタンパク質分解に対して防御する必要がな
い。それにもかかわらず、ある種の実施態様では、ペプチド送達は、保護的な賦形剤によ
って強化することができる。前記は、典型的には、酸加水分解および酵素加水分解に対し
て耐性を付与する組成物とポリペプチドの複合体形成によるか、または適切な抵抗性を有
する担体(例えばリポソーム)にポリペプチドを包み込むことによって達成される。経口
送達のためのポリペプチド保護手段は当分野で周知である(例えば、治療薬剤の経口送達
のための脂質組成物を開示する米国特許第5,391,377号を参照されたい)。
。前記のような徐放系は当業者には周知である。ある好ましい実施態様では、タンパク質
およびペプチドのためのプロリース(ProLease)生物分解性微小球(microsphere)送達
系が用いられる(Tracy(1998) Biotechnol. Prog. 14:108; Johnson et al.(1996) Natu
re Med. 2:795;Herbert et al.(1998) Pharmaceut. Res. 15:357)。前記は、ポリマー
マトリックス内にタンパク質を含む生物分解性ポリマー微小球で構成された乾燥粉末で、
前記ポリマーマトリックスは、他の薬剤とともにまたは他の薬剤を含まずに乾燥製剤とし
て混ぜ合わせることができる。
入効率を達成できるように特にデザインされている。前記方法は以下の工程から成る:(
i)薬剤溶液を安定化賦形剤とともに噴霧凍結乾燥させることによって、原料タンパク質
から凍結乾燥タンパク質粒子を調製する;(ii)薬剤−ポリマー懸濁物を調製し、続い
て超音波処理または均質化処理を実施して薬剤の粒子サイズを減少させる;(iii)液
体窒素中に噴霧化することによって凍結薬剤−ポリマー微小球を製造する;(iv)エタ
ノールでポリマー溶媒を抽出する;(v)ろ過および真空乾燥を実施し最終的な乾燥粉末
生成物を製造する。得られた粉末は固形のタンパク質を含み、前記タンパク質は多孔質の
ポリマー粒子内に均一に固定されて分散している。前記方法でもっとも一般的に使用され
るポリマー、ポリ(ラクチド−コ−グリコリド)(PLG)は生体適合性および生物分解
性の両方を有する。
在下で固体で維持され、したがって水によって誘発されるタンパク質のコンフォーメーシ
ョン移動度を最小にし、反応物質として水を含むタンパク質分解反応を防止し、さらにタ
ンパク質が変性を受ける有機相−水相境界面を回避できる。好ましい方法では、タンパク
質が不溶で、したがって高い封入効率(例えば95%を越える)を得ることができる溶媒
が使用される。
希釈できるように(例えば予め測定した容積で)保存容器内で、または一定の容積の水に
直ぐに添加できる可溶性カプセルとして提供することができる。
明細書に提供した開示を用いて、他の適切な製剤および投与態様が容易に考案されること
は理解されよう。
ある種の実施態様では、本発明のペプチドは1つまたは2つ以上の脂質と一緒に投与さ
れる。前記脂質は、ペプチドの保護および/または輸送/取込みの強化のための賦形剤と
して製剤化してもよいし、または前記脂質は別々に投与してもよい。
DL/LDL比を増加させることができるということは本発明の発見であった。さらに、
ある種の中等度の長さのリン脂質は、一般的脂質輸送とは異なるプロセスによって輸送さ
れると考えられる。したがって、ある種の中等度の長さのリン脂質を本発明のペプチドと
一緒に同時投与することによって多くの利点が付与される。すなわち、それらは、消化ま
たは加水分解からリン脂質を保護し、ペプチドの取込みを改善し、HDL/LDL比を改
善する。
または前記脂質は本発明のポリペプチドと単純に複合体化/混合してもよい。リポソーム
の製造方法および試薬の封入方法は当業者に周知である(例えば以下の文献を参照された
い:Martin& Papahadjopoulos (1982) J. Biol. Chem., 257:286-288; Papahadjapoulos
et al.(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:11460-11464; Huang et al.(1992) Cance
r Res.,52:6774-6781; Lasic et al.(1992) FEBS Lett., 312:255-258など)。
炭素から約24炭素の範囲の脂肪酸を有する。ある種の実施態様では、脂肪酸は飽和され
ている。他の好ましい実施態様では、脂肪酸は不飽和でもよい。種々の好ましい脂肪酸は
表2に示されている。
表2:Dポリペプチドの投与に好ましいリン脂質のsn−1および/またはsn−2位の
好ましい脂肪酸
位にホスホリルコリンを有する。
追加的な薬理学的に活性な物質は、前記主要活性物質、例えば本発明のペプチドととも
に送達することができる。ある実施態様では、そのような活性な物質にはアテローム性硬
化症および/またはその合併症発生のおそれを減少させる物質が含まれるが、ただしこれ
に限定されない。前記物質には、ベータブロッカー、ベータブロッカーとチアジド利尿剤
の組み合わせ、スタチン、アスピリン、ACEインヒビター、ACEレセプターインヒビ
ター(ARB)などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
トール(セクトラール(登録商標)(Sectral))、アテノロール(テノルミン(登録商
標)(Tenormin))、ベータキソロール(カーロン(登録商標)(Kerlone))、ビソプ
ロロール(ゼベタ(登録商標)(Zebeta))、メトプロロール(ロプレッサー(登録商標
)(Lopressor))などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。適切な非選択性ブ
ロッカー(ベータ1およびベータ2を等しく遮断する)には、カーテオロール(カルトロ
ール(登録商標)(Cartrol))、ナドロール(コルガード(登録商標)(Corgard))、
ペンブトロール(レバトール(登録商標)(Levatol))、ピンドロール(ビスケン(登
録商標)(Visken))、プロプラノロール(インデラール(登録商標)(Inderal))、
チモロール(ブロッカドレン(登録商標)(Blockadren))、ラベタロール(ノルモダイ
ン(登録商標)(Normodyne)、トランデート(登録商標)(Trandate))などが含まれ
るが、ただしこれらに限定されない。
IAC、テノレチック(Tenoretic)、コルジド(Corzide)、チモリド(Timolide)、イ
ンデラル(Inderal)LA40/25、インデリド(Inderide)、ノルモジド(Normozide
)などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
Squibb)、シムバスタチン(ゾカー(Zocor)/Merck)ロバスタチン(メバコー(Mevaco
r)/Merck)などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
n)、Squibbから)、ベナゼプリル(例えばロテンシン(登録商標)(Lotensin)、Novar
tisから)、エナラプリル(例えばバゾテック(登録商標)(Vasotec)、Merckから)、
フォシノプリル(例えばモノプリル(登録商標)(Monopril)、Bristol-Meyersから)、
リシノプリル(例えばプリニビル(登録商標)(Prinivil)、Merckから、またはゼスト
リル(登録商標)(Zestril)、Astra-Zenecaから)、キナプリル(例えばアキュプリル
(登録商標)(Accupril)、Parke-Davisから)、ラミプリル(例えばアルテース(登録
商標)(Altace)、HoechstMarion Roussel、King Pharmaceuticalsから)、イミダプリ
ル、ペリンドプリルエルブミン(例えばアセオン(登録商標)(Aceon)、Rhone-Poulenc
Rorerから)、トランドラプリル(例えばメービック(登録商標)(Mavik)、KnollPhar
maceuticalから)などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。適切なARBS(A
CEレセプターブロッカー)には、ロサルタン(例えばコザール(登録商標)(Cozaar)
、Merckから)、イルベサルタン(例えばアバプロ(登録商標)(Avapro)、Sanofiから
)、カンデサルタン(例えばアタカンド(登録商標)(Atacand)、Astra Merckから)、
バルサルタン(例えばジオバン(登録商標)(Diovan)、Novartisから)などが含まれる
が、ただしこれらに限定されない。
別の実施態様では、本発明は、アテローム性硬化症の1つまたは2つ以上の症状を改善
するか、またはアテローム性硬化症のおそれがある対象(ヒトまたは動物)を予防的に処
置するキットを提供する。前記キットは、好ましくは、本発明の1つまたは2つ以上のペ
プチドまたはペプチド摸倣体を収納した容器を含む。前記ペプチドまたはペプチド摸倣体
は個別投薬形態(例えば座薬、錠剤、カプセル、パッチなど)で提供することができ、お
よび/または場合によって1つまたは2つ以上の医薬的に許容できる賦形剤と結合させて
もよい。
で使用される1つまたは2つ以上の他の薬剤を含んでもよい。前記薬剤には、例えば上記
で述べたようなベータブロッカー、血管拡張剤、アスピリン、スタチン、ACEインヒビ
ターまたはACEレセプターインヒビター(ARB)などが含まれるが、ただしこれらに
限定されない。
、本発明の“治療薬”または“予防薬”の実施方法または使用についての説明を提供する
。好ましい指示用物質は、本発明の1つまたは2つ以上のポリペプチドを使用して、アテ
ローム性硬化症の1つまたは2つ以上の症状を緩和し、および/またはアテローム性硬化
症のおそれがある個体で前記の1つまたは2つ以上の症状の開始または進行を予防するこ
とについて説明する。前記指示用物質はまた、場合によって好ましい用量/治療計画、対
比指示などについて説明することができる。
に限定されない。前記の指示を保存し、さらに末端ユーザーにそれらを伝達することがで
きる任意の媒体が本発明に包含される。前記媒体には、電子記録媒体(例えば磁気ディス
ク、テープ、カートリッジ、チップ)、光学媒体(例えばCDROM)などが含まれるが
、ただしそれらに限定されない。前記媒体には前記指示物質を提供するインターネットの
サイトのアドレスを含むことができる。
はない。
いくつかの合成クラスAペプチド類似体が、ヒトアポA−Iの多くの特性と類似する
特性をinvitroで提示することが示された。本実施例では、両親媒性が強化された新規な
ペプチド(5F)が、アテローム性硬化症誘発飼料を与えたC57BL/6Jマウスに2
0μg/日で16週間腹腔内に注射された。マウスアポA−I(MoAI)(50μg/
日)またはリン酸緩衝食塩水(PBS)注射をコントロールとして他のマウスに実施した
。総血中コレステロールレベルおよびリポタンパク質プロフィルは前記処置群とコントロ
ール群とで顕著には相違しなかったが、ただし5FまたはMoAIを投与したマウスでは
、高密度リポタンパク質(HDL)−コレステロールは、総コレステロールのパーセント
として計算したとき低かった。
LDLを採取し、これをヒト動脈壁細胞にin vitroで与えたとき、前記LDLは、コント
ロールから採取したLDLよりも少ない脂質過酸化水素およびLDL誘発走化性活性をも
たらした。さらに、5Fを注射したマウスからHDLを採取し、これをヒトLDLと一緒
にヒト動脈壁細胞にinvitroで与えたとき、脂質ヒドロペルキシド生成は大幅に少なく、
さらにLDL誘発単球走化性活性は大幅に低かった。ペプチド5Fを投与されたマウスの
大動脈アテローム病巣面積は、PBSを投与されたマウスと比較して顕著に小さかった。
MoAIを投与されたマウスの病巣面積はPBS注射動物のそれと類似していた。我々は
、5Fはアテローム性硬化症の予防および治療に有効であると結論した。
ペプチド
ペプチド5F(Ac−18A[AspTrpLeuLysAlaPheTyrAspL
ysValPheGluLysPheLysGluPhePhe]−NH2)を固相ペプ
チド合成によって合成した(例えば以下を参照されたい:Anantharamaiah & Garber (199
6) Meth.Enzymol. 263:267-282; Palgunachari et al.(1996) Arteriosclerosis, Throm
bosis &Vascular Biology 16:328-338)。前記合成ペプチドの純度は分析用HPLCお
よびイオンスプレー質量分析法によって確定した。前記ペプチドは蒸留水に対して透析し
、使用前に凍結乾燥させた。
an Bioproductsfor Science, Indianapolis, IN)から購入した]。MoAIは、サイズ
排除クロマトグラフィーおよび逆相カラムクロマトグラフィーの組み合わせを用いて単離
した。簡単に記せば、KBrを添加して血漿密度を1.21g/mLに調節し、5000
0rpmで24時間、4℃で遠心沈澱を実施した(Ti70ローター;Beckman, Fullert
on, CA )。上部分画を採集し水に対して透析してKBrを除去し、凍結乾燥させて脱脂
した。ペレットはGn:DTT:トリス溶液(3M塩酸グアニジン、1mMジチオスレイ
トールおよび10mMトリス;pH=8.0)に溶解し、続いて同じ溶液に対して120
00MWカットオフ透析チューブを用いて透析し、サンプルからアポA−IIおよびCア
ポリポタンパク質の大半を除去した。続いて前記サンプルを水に対して透析し凍結乾燥さ
せた。ペレットは新鮮なGn:DTT:トリス溶液に溶解し、タンパク質をサイズ排除カ
ラムクロマトグラフィーによって分離した。カラムはXK26/100カラム(2.6×
100cm)を使用し、バルクフェース・スーパーロース12(Pharmacia Biotech, Pis
cataway, NJ)を充填し、Gn:DTT:トリス溶液で平衡化させた。流速は0.5mL
/分で、2.5mLで分画を採集した。アポA−Iピークに一致する分画をSDS−PA
GEで分析し、さらに調製用C−18逆相HPLCによって精製した(Anantharamaiah
& Garber(1996) Meth. Enzymol. 263:267-282)。
雌のC57BL/6Jマウス(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)を用いて全実験
を行った。マウスは6週齢で購入し、食餌実験は8週齢のマウスを用いて開始した。代謝
回転実験では体重が20から22グラムのマウスを用いた。全ての動物実験は、当該大学
(Universityof Alabama, Birmingham)の動物管理および使用委員会(Institutional A
nimal Care andUse Committee)の事前検査を受け承認された。
5Fペプチド、MoAIおよびヒトアポA−Iを文献(Bilheimer et al.(1972) Bioch
im. Biophys.Acta 260:212-221)の方法によって125Iで標識した。マウスに改変トーマ
ス・ハートロフト(Thomas-Hartroft)アテローム性硬化症誘発飼料(#TD88051;Teklad,
Madison,WI)を4週間与え、この時点で200μLのリン酸緩衝食塩水(PBS)に溶
解したペプチドまたはタンパク質の毎日の腹腔注射を開始した。MoAIまたはヒトアポ
A−I(50μg/動物)を注射した動物、5F(20μg/動物)を注射した動物は本
消長動態実験では絶食させず、血液サンプルはキシラジン:ケタミン麻酔下で後眼窩洞か
ら注射後15、30、45分後、および1、1.5、2、3、4、6、8、12および2
4時間後に採取した。
入手)、さらに別個の動物から少なくとも3つのサンプルが各時点で採集された。サンプ
ルはヘパリン添加毛細管に採集し、続いて微量遠心管に入れ、遠心により血漿を分離した
。各サンプルから10μLを2組づつ放射能活性の測定のために取り、サンプルにつき1
0分間のガンマ計測(Corba; Packard Instruments, Downers Grove, IL)に用いた。全
血漿容積を体重の4.2%として計算した。各サンプルは、全血漿中の注射されたCPM
のパーセントとして表した。遊離125Iはトリクロロ酢酸(TCA)沈澱によって決定し
た(10μLの血漿サンプルにつき10%TCAを1mL)。消長動態モデルへの当ては
めは、各時点での平均ではなく、全てのデータポイントを用いて実施した(PKアナリス
ト(PKAnalyst)、MicroMathScientific Software, Salt Lake City, UT)。
マウスは6週齢で入手し、任意に20匹の群に分け(ただし処置を与えられないネガテ
ィブコントロール群は10匹)、標準的なげっ歯類の固形飼料を与えた。8週齢で、処置
群に改変トーマス・ハートロフトアテローム性硬化症誘発飼料(#TD88051; Teklad, Madi
son, WI)を与え、注射を開始した。前記飼料は4℃で保存し、脂質の酸化を最小限にす
るために製造日より3ヶ月を過ぎないものを使用した。動物に毎日16週間腹腔内注射を
施した(週末および休日を含む)。各群の20匹のマウスに200μLのPBS(ポジテ
ィブコントロールとして)または200μLのPBS中の5F(20μg)または200
μLのPBS中のMoAI(50μg)を毎日注射した。
ドを含有していた。5FペプチドはPBS中で凍結乾燥させ、注射の日にオートクレーブ
したミリQ(Milli-Q)水(MilliporeCorp., Bedford, MA)に溶解した。全群について
注射容積を200μL/マウス/日で維持した。
って採取した。実験終了時(16週)の最後の採血で心臓および肝臓を摘出した。心臓は
血液を除去し、さらに心筋を弛緩させるため、0.9%食塩水溶液に約1時間保持した。
前記器官を続いてリン酸緩衝4%ホルムアルデヒド中で切片作製まで少なくとも1週間固
定した。肝臓は取り出し重量を測定した。
組織学的評価は文献の方法(Paigen et al.(1990) Arteriosclerosis 10:316-323)に
いくつかの改変を加えて実施した。簡単に記せば、心臓をリン酸緩衝ホルムアルデヒド溶
液中で少なくとも1週間固定した。心臓の下部2/3を除去し、残りの組織をOCT媒質
体(Tissue-Tek,Miles Inc., Elkhart, IN)中で凍結し、−20℃で低温槽中で切片を
作製した。大動脈根の開始部について20μm毎の切片をスライド上に確保し、観察した
。続いて切片をさらに600μm分採集するか、または大動脈の横断切片が円形化し弁の
尖頭がもはや明瞭でなくなるまで切片を採集した。スライドをオイルレッドOで染色し、
さらにヘマトキシリンで対比染色した。染色した病巣の横断面積を80μm離れた連続切
片で画像分析(SigmaScanPro, SPSS Scientific, Chicago, IL)で測定し、平均病巣面
積を各大動脈洞について400μm(5枚のスライド)の長さにわたって決定し、最大平
均病巣面積を示した。
化性活性
ヒト動脈壁細胞の混合培養、単球の単離、健常なヒトドナーの血漿から超遠心沈澱によ
るリポタンパク質の単離およびマウス血漿からFPLCによるリポタンパク質の単離、並
びに脂質過酸化水素および単球走化性活性の測定は、標準的な方法にしたがって実施した
。全ての参加対象者は、UCLAヒト対象保護委員会(UCLA Human Subjects Protection
Committee)によって承認されたインフォームドコンセントを示した。マウスリポタンパ
ク質を混合培養でテストするためのプロトコルはまた以下のように実施した:簡単に記せ
ば、アテローム性硬化症誘発飼料を与え、さらに賦形剤(PBS)またはペプチド5F(
20μg/マウス/日)を注射したマウスの血漿からLDLおよびHDLをFPLCによ
って単離した。混合培養は、ヒトLDL(200μg/mLのLDLタンパク質)、また
はマウスLDL(200μg/mL)、またはヒトLDL(200μg/mL)+ヒトH
DL(350μg/mLのHDLタンパク質)もしくはマウスHDL(300μg/mL
)、またはマウスHDL(300μg/mL)単独で処理した。前記混合培養を上記添加
物とともにまたは上記添加物を含まずに8時間37℃で10%のリポタンパク質欠損血清
(LPDS)の存在下でインキュベートした。上清を採集し、アウエルバッハ脂質過酸化
水素同等物について分析した。続いて混合培養を洗浄し、血清またはLPDSを含まない
新しい培養液でさらに8時間インキュベートした。この調整培養液を採集し、単球走化性
活性について分析した。
)
血漿コレステロールリポタンパク質プロフィルは、我々が最近開発したCLiP法(Ga
rber etal.(2000) J. Lipid Res. 41:1020-1026)を用いて測定した。簡単に記せば、5
から10μLの血漿を1回のスーパーローズ(Superose)6(Pharmacia, Piscataway NJ
)カラムを用いて分析した。カラムの直ぐ後でコレステロール試薬をT字型混合装置から
導入し、溶出剤:試薬混合物はポストカラム反応コイルに入れた。溶出剤混合物中のコレ
ステロール含有量は分光光度法によって500nmで検出し、検出値はコンピュータに採
集した。得られたプロフィルは成分ピークに分解し、ピークフィット(PeakFit, SPss Sc
ience, Chicago,IL)を用いて相対面積を分析した。総コレステロールに対する絶対コレ
ステロール値および各成分ピークは、既知の値をもつコントロールサンプルとの比較によ
って決定した。いくつかの事例では、分画を採集し放射能活性の分布を決定した。CLi
p法は、プールしたサンプルを使用することなく個々のマウスサンプルを分析することを
可能にした。
ペプチドを毎日注射することによって何らかの免疫反応をマウスで誘発するか否かを決
定するために、器官採集時にマウスから採取した血漿(16日間の毎日の注射の後)を用
いて間接ELISA力価測定(Engvall (1980) Meth. Enzymol. 70:419-439)を実施した
。注射に用いたペプチドまたはMoAI(10μg/mL)でプレートを被覆し、一晩イ
ンキュベートした。0.05%のTween20を含むホウ酸緩衝食塩水(pH8.2)
で完全に洗浄し、緩衝液(ホウ酸緩衝液中の0.1%ゼラチンおよび0.1%BSA)で
1時間ブロックした後、200μLの希釈マウス血漿(1:100希釈)サンプルをホウ
酸緩衝食塩水で段階的に1:1で希釈した。マウスIgGに対するビオチン付加ヤギ抗体
(0.1μg/mL)を続いてウェルに添加し、さらにSA−HRP(ストレプトアビジ
ン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ)で1時間処理し、さらにABTSおよび過酸
化物を基質として用いて反応を進行させた。抗原/抗体のそれぞれの添加後には、プレー
トを一晩室温でインキュベートし、さらに0.05%のTween20を含むホウ酸緩衝
食塩水(pH8.2)で完全に洗浄し、次の添加の前に1時間緩衝液(ホウ酸緩衝液中の
0.1%ゼラチンおよび0.1%BSA)でブロックした。
処置群を2テール(two-tailed)t−検定または変数の一方向分析(この場合データは
正常に分布していた)によって比較するか、または階層上の変数(variance on ranks)
の一方向分析(SigmaStat;SPSS Science, Chicago, IL)によって比較した。インプット
速度およびアウトプット速度が等しくないと仮定するファーストオーダー・ワンコンパー
トメント・キネティックモデル(PKAnalyst; MicroMath Scientific Software, Salt Lak
e City, UT)へのあてはめによって、ペプチドまたはタンパク質の代謝回転の消長動態を
分析した。
消長動態実験
腹腔内注射の後、マウスの血漿からペプチド5F並びにヒトおよびマウスのアポA−I
が浄化除去される動態は表3に要約されている。
ーストオーダー・ワンコンパートメント・キネティックモデル(PKAnalyst; MicroMath S
cientificSoftware, Salt Lake City, UT)に対する適合検定データの結果を示している
。略語:T1/2=血漿から浄化除去される半減期;血漿中の最大%=全血漿中に見出さ
れる注射された投与量のピークレベルのパーセント;r2=前記キネティックモデルの統
計適合度
ヒトおよびマウスアポA−Iは、5Fペプチドと比較して非常に長いクリアランスを示
した。ヒトアポA−Iおよび5Fは、マウスアポA−Iよりもピーク血漿レベルまでの時
間が長かったが、ただし達成されたピークレベルはほぼ類似していた(ヒトアポA−Iは
他の物質よりも高いピークレベルに達した)。カラムクロマトグラフィーによる血漿サン
プルの分析によって、ペプチド5FおよびアポA−I(ヒトおよびマウスの両方)は血漿
リポタンパク質(特にHDLサイズ領域の粒子)と結合することが示された(図6)。5
Fの注射後1.5時間のペプチド放射能活性のHDL:VLDL比は4.19±0.58
(n=3、p<0.05)であった。同様な結果が5Fの注射後5時間で見出された(6
.44±1.10、p<0.02)。注射されたペプチドは開始時3%未満の遊離125I
をTCA沈澱によって示した。しかしながら注射後1.5時間で、全溶出放射能活性のパ
ーセントとして表される血漿中の遊離125Iの放射能活性は5Fについて増加し26.9
±9.4%で、5時間で34.4±4.8%であった。これは、リポタンパク質およびリ
ポタンパク質結合ペプチドの予想されたクリアランスを示している。遊離ヨウ素による1
.5時間から5時間の放射能活性の増加速度は、注射から1.5時間までのそれよりも小
さく、おそらく腹腔内での開始時の顕著なペプチド分解を示唆しているのであろう。
長期間の食餌実験中に理由が不明の原因によって死亡したマウスは3匹のみであった。
前記動物のうち2匹はMoAIを与えられ、1匹は5Fペプチドを与えられた。器官採取
時には全体的な形態学的相違は群の間で認められなかった。肝臓はアテローム性硬化症誘
発飼料を与えられた全ての動物で増大したが、肝重量においても体重の百分率として表さ
れる肝重量においても群間で相違は認められなかった(表4)。アテローム性硬化症誘発
飼料を与えた全動物(PBS注射動物を含む)の体重は、固形飼料を与えたコントロール
よりも軽かった(表4)。
る。固形飼料を与えた動物には注射しなかった。他のマウスは、方法の項に記載したよう
にアテローム性硬化症誘発飼料を与えられた。PBS群は、200μLのリン酸緩衝食塩
水を毎日腹腔内に注射した。5F群は200μLのPBS中の5F(20μg)を、Mo
AI群は200μLのPBS中のMoAI(50μg)を毎日腹腔内に注射した。*5F
についてはp<0.05;2テールt検定。
前記ペプチドに対する抗体の存在について、16週の注射期間の終了時に採取した血液
サンプルを調べた。ペプチド5FまたはMoAI(データは示されていない)に対する抗
体は検出されなかった。一連の動物に注射していないペプチドでELISAプレートを被
覆した交差実験で得られた結果は、抗体の有無について前記直接的測定で示された結果と
本質的に同一であった(データは示していない)。
CLip法で決定した総コレステロール値およびリポタンパク質コレステロール値は表
3に示されている。総コレステロール値の正確さは手作業でのコレステロールアッセイ(
Cholesterol1000; Sigma, St.Louis, MO)によって確認された(データは示されていな
い)。総コレステロール値またはリポタンパク質分画コレステロール値について処置群の
間に顕著な相違は認められなかった。しかしながら、リポタンパク質分画を総コレステロ
ールのパーセントとして表した場合(表5)、HDL−コレステロールは、PBS群と比
較して5F群およびMOAI群で極めて低い百分率を構成した。
ベルおよびリポタンパク質コレステロールレベル(mg/dlおよび総コレステロールの
パーセント)
セントとして表されている。略語:VLDL=超低密度リポタンパク質;IDL=中間密
度リポタンパク質;LDL=低密度リポタンパク質;HDL=高密度リポタンパク質;T
C=総コレステロール;MoAI=マウスアポA−I;PBS=リン酸緩衝食塩水。固形
飼料を与えた動物には注射を施さなかった。他のマウスは、方法の項に記載したようにア
テローム性硬化症誘発飼料で飼育された。PBS群には200μLのPBSを毎日腹腔に
注射した。5F群には200μLのPBS中の5F(20μg)を毎日腹腔に注射した。
MoAI群には200μLのPBS中のMoAI(50μg)を毎日腹腔に注射した。動
物の数は表4に示されている。
*2テールt検定によりPBS群と比較した場合p<0.05またはそれ未満。
我々は最近、正常なHDLは穏やかに酸化されたLDLの生成で3つの工程を抑制する
ことを発見した。これらの実験(同時係属出願USSN09/541,468; 2000年3月31日出願)で
、我々は、ヒトLDLをin vitroでアポA−IまたはアポA−I摸倣ペプチド(37pA
)で処理することによって、LDLからHPODEおよびHPETEを含むシーディング
分子が除去されることを示した。これらのシーディング分子は、ヒト動脈壁細胞の混合培
養がLDLを酸化する能力をもつために、さらにLDLに動脈壁細胞の単球走化性活性の
産生を誘発させるために必要であった。我々はまた、アポA−Iのマウスへの注射後また
はヒトへの輸液後に前記マウスまたはヒト実験協力者から単離したLDLはヒト動脈壁細
胞による酸化に抵抗性を有し、さらに動脈壁細胞混合培養で単球の走化性活性を誘発しな
いことを示した。図7は、アテローム性硬化症誘発飼料を与え、さらにPBSを注射した
本実験のマウスから得たHDLは、ヒトLDLの酸化を抑制することができず(図7A)
、さらにヒト動脈壁混合培養でLDL誘発単球走化性活性を抑制できない(図7B)こと
を示している。対照的に、アテローム性硬化症誘発飼料を与え、さらにペプチド5Fを注
射したマウスのHDLは、正常なヒトHDLと同程度に、ヒトLDLの酸化の抑制および
混合培養でのLDL誘発単球走化性活性の防止に有効であった。図7はまた、アテローム
性硬化症誘発飼料を与え、さらにPBSを毎日注射したマウスから採取したLDLは、同
じ飼料を与えたが20μgのペプチド5Fを毎日注射したマウスから採取したLDLより
も容易に酸化され、より容易に単球走化性活性を誘発することを示している。いずれのリ
ポタンパク質で処理した動脈壁細胞にも細胞毒性は観察されなかった(データは示されて
いない)。同様な結果が3つの別個の実験(データは示されていない)の全てで得られた
。
平均病巣横断面面積は図8に提示されている。予想したように、通常のマウスの固形飼
料を与えた群では病巣は観察されなかった(データは示されていない)。以前に報告され
たように(Paigenet al.(1990) Arteriosclerosis 10:316-323)、病巣面積における顕
著なばらつきがアテローム性硬化症誘発飼料を与えた全ての群で観察された。しかしなが
ら、2テールt−検定(p<0.002)で解析するか、または階層上の変数(variance
on ranks)の一方向分析(p<0.001;平均病総面積の分布が正常でないために決
定した)で解析するかに関係なく、5Fを注射した動物は、PBS注射動物よりも顕著に
小さな平均病巣を有していた。MoAI注射では、PBS注射と比較して病巣面積に相違
は出現せず、病巣面積は、t−検定(p<0.002)および階層上の変数の一方向分析
(p<0.001)の両方で5F注射動物の場合よりも顕著に大きかった。
クラスA両親媒性らせんモチーフに類似するようにデザインした合成ペプチドはリン脂
質と結合することができ、ヒトアポA−Iに類似する多くの生物学的特性を示すことを以
前に我々は明らかにした(3、8、10、14、15、20)。我々はまた、前記ペプチ
ドが動物の静脈内に投与されたとき、それらは血漿リポタンパク質と結合することを示し
た(11)。本実験は、理論的脂質親和性が高められた新規なペプチド5Fは、抗アテロ
ーム性硬化症の特性を有するという仮説を立証するために考案した。
する(がヒトアポA−Iよりは低い)血漿レベルに達することを示した(表3および図6
)。腹腔内注射後の5Fの血中半減期は、マウスまたはヒトアポA−Iのいずれよりも短
かった。循環コレステロールの大半がアテローム性硬化症誘発飼料のVLDL−、IDL
−およびLDL−サイズ領域に存在するという事実にもかかわらず、注射後、大半の5F
は、HDL領域に見出された(図6)。
注射を受けた群間で顕著な相違は認められなかった(表5)。しかしながら、リポタンパ
ク質分画が総コレステロールのパーセントとして表されたとき(表5)、HDLコレステ
ロールは、PBS群と比較して5F群およびMoAI群で顕著に低いパーセンテージを構
成した。
トLDLをinvitroでアポA−IまたはアポA−I摸倣ペプチドで処理することによって
、LDLからHPODEおよびHPETEを含むシーディング分子が除去されることを示
した。これらのシーディング分子は、ヒト動脈壁細胞の混合培養がLDLを酸化する能力
をもつために、さらにLDLに動脈壁細胞の単球走化性活性の産生を誘発させるために必
要であった(同時係属出願USSN09/541,468; 2000年3月31日出願を参照されたい)。我々
はまた、アポA−Iのマウスへの注射後またはヒトへの輸液後に、前記マウスまたはヒト
実験協力者からアポA−Iの注射/輸液後に単離したLDLは、ヒト動脈壁細胞による酸
化に抵抗性を有し、さらに動脈壁細胞混合培養で単球の走化性活性を誘発しないことを示
した。本実験では、アテローム性硬化症誘発飼料を与え、さらにPBSを注射したマウス
から得たHDLは、ヒトLDLの酸化を抑制することができず(図7A)、さらにヒト動
脈壁混合培養でLDL誘発単球走化性活性を抑制できなかった(図7B)。全く対照的に
、同じアテローム性硬化症誘発飼料を与えたが、ペプチド5Fを注射したマウスのHDL
は、正常なヒトHDLと同程度に、ヒトLDLの酸化の抑制および混合培養でのLDL誘
発単球走化性活性の防止に有効であった(図7)。アテローム性硬化症誘発飼料を与え、
さらに5Fを注射したマウスから採取したLDLは、同じ飼料を与えたがPBSを注射し
たマウスから採取したLDLよりも酸化は容易ではなく、さらに単球走化性活性の誘発も
容易ではなかった(図7)。血液循環で5FはLDLと相互作用し(HDLと結合する前
または結合後に)、LDLの酸化およびLDL誘発単球走化性活性に必要なシーディング
分子を、関連するペプチド37pAについて記載されたin vitroでの態様と同様な態様で
除去するということが可能である(同時係属出願USSN09/541,468; 2000年3月31日出願を
参照されたい)。
よびLDLに対するヒト動脈壁細胞のin vitroでの反応は、5Fのin vivoでの保護作用
と一致する。総コレステロール、LDL−コレステロール、IDL+VLDL−コレステ
ロールレベルの類似性、および総コレステロールのパーセントとしてのHDL−コレステ
ロールの低さにもかかわらず、アテローム性硬化症誘発飼料を与え5Fを注射した動物は
、顕著に低い病巣スコアを示した(図8)。これらの結果は他の研究者の結果(Shah et
al.(1998)Circulation 97:780-785)といくぶん類似する。前記研究者らは、高コレステ
ロール血症が続いているにもかかわらず、アポA−IMilanoは、アポE欠損マウスでアテ
ローム性硬化症病巣の進行を防止することを見出した。
.(1988)Arteriosclerosis 8:737-741; Rubin et al.(1991) Nature 353:265-267; Pazty
etal.(1994) J. Clin. Onvest. 94:899-903; Plump et al.(1994) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA91:9607-9611; Shah et al.(1998) Circulation 97:780-785)が、前記実験で
一日50μgの用量のMoAIの注射では成功しなかった理由は明らかではない。MoA
Iは、ヒトアポA−Iのように安定なタンパク質:脂質複合体を形成しないことが示され
ている(Gonget al.(1994) Biochim. Biophys. Acta 1213:335-342)。マウスHDLは
また、ヒトHDLよりもいっそう容易に塩酸グアニジンによって変性することが示され(
Gong etal.(1994) Biochim. Biophys. Acta 1213:335-342)、両親媒性らせんペプチド
は、ヒトHDLからヒトアポA−Iを除去するよりもいっそう容易にマウスHDLからM
oAIを除去する可能性が示唆される。これらの相違は、MoAIが本実験で病巣を顕著
には減少させなかったことの説明になるかもしれない。さらにまた、我々が用いた条件下
ではさらに高用量のMoAIが必要である可能性もある。いずれの場合にも、5Fペプチ
ドはこれらの条件下で非常に有効であったが、MoAIは有効ではなかった。
生成されないことが示された。これらのペプチドはおそらく免疫反応を誘発するために必
要なエピトープの露出が妨げられた状態で脂質と結合しているため、脂質結合ペプチドは
抗体を生じないことが示されたということから考えると、このことは驚くに当たらない(
Muranishi(1997) J. Pharm. Soc. Japan 117:394-404; Fricker & Drewer (1996) J. Pe
ptide Sci.2:195-211)。
を有するクラスA両親媒性らせんペプチド(37pA)を発現する遺伝子導入マウスは、
アテローム性硬化症に対して抵抗性をもつ可能性を示唆した(Garber et al.(1997) Circ
ulation96:I-490)。これまでの実験は、ペプチド5Fは、アテローム性硬化症誘発に必
要なメカニズムを解明するために大きな可能性を有し、さらにまた治療のための潜在能力
も有することを示唆している。
Dペプチドの有効性
本実施例は本発明のDペプチドの有効性を明示する。ヒト大動脈壁混合培養を、培養液
単独(図では、LDL、無細胞または細胞有り、LDL無し)、健常対象者由来コントロ
ールLDL250μg/mL(図ではLDL)およびLDL+健常対象者由来コントロー
ルHDL350μg/mL(図では+HDL)とともにインキュベートした。他の混合培
養はコントロールLDLと、種々の量の(横座標に示したμg)のD−2FもしくはL−
2F(左から3番目の図、2F)、またはD−37pAもしくはL−37pA(右側の最
後の図、37pA)とともにインキュベートした。データは4つの混合培養から得た値の
平均±SDを示す。HDLおよびペプチド添加の値は、p<0.01のレベルでLDL単
独(左側の最初の図)の場合といずれも顕著な相違を示した。
に酸化されたLDLを生じた。続いて上清を廃棄し、混合培養を洗浄し、血清またはLP
DSを含まない培養液でさらに4時間インキュベートした。この調整培養液を集め、単球
の走化性活性について分析した。図9に示したように、LDLをDペプチドでin vitroで
処理することによって、動脈壁細胞によるそれらの酸化が防止された。
より防止されることにより酸化による現象、データは示されていない)に対して抵抗性を
もつことを示している。アテローム性硬化症病巣形成の動物モデルとして一般的に用いら
れるLDLレセプター欠損マウス群(n=3)にD−ペプチドまたは食塩水担体を経管投
与によって与えた。各動物に100μLの食塩水、100μg/100μLのペプチドD
−2FまたはD−37pAを投与した。17および48時間後に軽度の麻酔下で後眼窩洞
から血液を採集した。赤血球を遠心沈澱によって分離し、PBSで10%ヘマトクリット
まで希釈し、穏やかに攪拌しながら37℃でインキュベートした。部分標本をt=0、2
、6および18時間の時点で取り出し、細胞ペレットを遠心沈澱させ、遊離ヘモグロビン
による光学密度を測定した。
って、単球走化性バイオアッセイで測定したときLDLが動脈壁細胞酸化に抵抗性をもつ
ことを示している。
DLが単球走化性活性を誘発できなくなるが、一方2FのL−ペプチドはこの特性をもた
ないことを示した。食塩水またはDアミノ酸もしくはLアミノ酸から合成した2Fを経管
投与(管による胃への注入)によってマウスの胃に注入した。経管投与後、マウスから採
血し、LDLを単離しヒト動脈壁細胞の混合培養に添加した。経管投与によって与えたと
きD−ペプチドはLDLを保護し、これは、D−2Fペプチド(Dアミノ酸から合成され
た)を投与されたマウスから得たLDL(D2FLDL)によって誘発される単球走化性
活性は低いが、L−2F(天然のLアミノ酸から合成された)を投与されたマウスから得
たLDL(L2FLDL)は単球走化性を容易に誘発したことによって立証されたとおり
である(図12を参照されたい)。
から合成された2Fと同じ程度に有効であった(図9参照)。したがって、ペプチドがin
vivoで経管投与によって与えられる本実験の結果における相違は、Dアミノ酸から合成
された2Fは完全なままで胃から吸収され、一方、我々の仮説のとおり、天然のLアミノ
酸から合成された2Fペプチドは、消化過程において胃でおよび/または血漿中で分解さ
れたことによると思われる。別の実験で、D−2Fペプチドに対する抗体生成の証拠は認
められなかった。
Fを経管投与で与えた実験から得られた2つのグラフである。動物から1.5、3または
6時間後に採血し、そのHDL、LDL、およびVLDL/IDLを単離した。グラフに
示したように、経管投与後1.5時間で採取したHDLはコントロールLDLを改変から
保護しなかったが、経管投与の3時間後および6時間後より少し前に採取したHDLは、
コントロールHDLと同じ程度でヒト動脈壁細胞によるLDL誘発単球走化性活性の産生
に対して保護能力を示した(図13A)。別のグラフ(図13B)では、50μgのD−5
Fの経管投与後1.5、3または6時間でマウスLDLおよびVLDL/IDLを単離し
た。左の図では、コントロールLDLをヒト動脈壁細胞にコントロールHDLとともにま
たはコントロールHDLを伴わずに添加し、動脈壁細胞によって生成される単球走化性活
性を測定した。中央の図では、50μgのD−5Fの経管投与後1.5、3または6時間
で採取したマウスLDLが動脈壁細胞に添加された。結果は、3時間および6時間後のL
DLが誘発した単球走化性活性は顕著に低いことを示した。グラフの右側では、リポタン
パク質のVLDL/IDL分画(図ではV/ILDL)が添加され、図に示されているよ
うに3時間では単球走化性活性の誘発は顕著に低かった。
クラスA両親媒性らせんペプチドの物理化学的および生物学的特性に対する疎水性増加
の影響
略語リスト
Ac2O=無水酢酸;アポA−I=アポリポたんぱく質A−I;BSA=ウシ血清アル
ブミン;CAD=冠状動脈疾患;CD=円偏光二色性;DMPC=ジミリストイルホスフ
ァチジルコリン;DiPoPE=ジ(16:1)パルミトオレオイルホスファチジルエタ
ノールアミン;DSC=示差走査熱分析(Differential Scanning Calorimetry);ED
TA=エチレンジアミンテトラ酢酸;EPC=卵黄ホスファチジルコリン;FMOC=フ
ルオリニルメチルオキシカルボニル;GdnHCl=塩酸グアニジン;HAEC=ヒト大
動脈内皮細胞;HASMC=ヒト大動脈平滑筋細胞;HBTU=2−(H−ベンゾトリア
ゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェ
ート;HDL=高密度リポタンパク質;HPLC=高速液体クロマトグラフィー;LCA
T=レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ;MCP−1=単球走化性タンパ
ク質−1;M−CSF=マクロファージコロニー刺激因子;MLV=多層(multilamella
r)小胞;NMM=N−メチルモルフォリン;PBS=リン酸緩衝食塩水;PIPES=
ピペラジン−N,N’−ビス[2−エタンスルホン酸];RP−HPLC=逆相高速液体
クロマトグラフィー;TFA=トリフルオロ酢酸
要約
我々は最近、両親媒性が増強されたクラスA両親媒性ペプチド5Fは、食餌誘発性アテ
ローム性硬化症からマウスを防御することを示した。我々は、現に存在する極性アミノ酸
を系統的にフェニルアラニンで置換することによって、アテローム性硬化症抑制に関する
物理的および機能的特性に対する一連のクラスA両親媒性ペプチド同族体(5Fを含む)
の疎水性増強の影響を調査した。前記ペプチドは、配列Ac−D−W−L−K−A−F−
Y−D−K−V−A−E−K−L−K−E−A−F−NH2(配列識別番号:1、Ac−
18A−NH2または2F)を基にして以下のとおりであった:3F3(Ac−F318A
−NH2)、3F14(Ac−F1418A−NH2)、4F(Ac−F3,1418A−NH2)
、5F(Ac−F11,14,1718A−NH2)、6F(Ac−F10,11,14,1718A−NH2
)、および7F(Ac−F3,10,11,14,1718A−NH2)。水への溶解度、HPLC保持
時間、卵黄PC単層膜中への浸透に対する排除圧(exclusion pressure)、および卵黄P
C可溶化速度の測定によってペプチド4Fと5Fの間で突然疎水性が増加することが明ら
かになった。これは、リン脂質との結合能力増加を伴った。ペプチド6Fと7Fは影響が
より少なく、これらのペプチドで脂質との相互作用の促進に対する疎水性増強の限界を示
唆した。脂質親和性における前記の顕著な増強にもかかわらず、これらのペプチドは、血
漿酵素、レシチン:コレステロールアシルトランスフェラーゼ(LCAT)の活性化にお
いてアポA−Iよりも有効性は低かった。すなわち、5FがLCATをもっとも強く活性
化し、それはアポA−Iの80%であった。ペプチド4F、5Fおよび6Fは、LDL誘
発単球走化性活性の抑制に等しく有効であった。これらの実験は、ペプチド−ペプチドお
よびペプチド−脂質相互作用間の適切なバランスが、両親媒性ペプチドの最適な生物学的
活性に要求されることを示している。これらの実験は、アテローム性硬化症抑制能力が強
化された小型アポA−I摸倣体のデザインのための理論的根拠を提供する。
高密度リポタンパク質およびアポA−I(HDLの主要なタンパク質構成成分)の血漿
レベルは、冠状動脈疾患と反比例する(Sprecher et al.(1993) Arterioscler. Thromb.
13:495-504;Philips et al.(1993) Circulation 88:2762-2770)。ヒトアポA−Iは2
43残基のタンパク質で、22量体の両親媒性らせんリピートを8つ含み、前記リピート
の大半はクラスAモチーフを有することが示された(Segrest et al.(1990) Proteins 8:
103-117;Anantharamaiah et al.(1993) pp.109-142, "The Amphipathic Helix (R.M. Ep
and ed.), CRCPress, Boca Raton, FL)。クラスA両親媒性らせんは特徴的な電荷分布
を有する。すなわち、それらは、αらせんの極性/非極性境界に陽性荷電アミノ酸集団を
、さらに極性面の中心に陰性荷電残基を有する(Segrest et al.(1990) Proteins 8:103-
117;Anantharamaiah et al.(1993) pp.109-142, "The Amphipathic Helix (R.M. Epand
ed.), CRCPress, Boca Raton, FL; Segrest et al.(1992) J. Lipid Res. 33:141-166)
。前記ユニークな二次構造モチーフは、アポA−Iの脂質結合特性に寄与していると説明
されている(Segrestet al.(1990) Proteins 8:103-117)。クラスA両親媒性らせんの
合成類似体に関する多くの実験が前記の考えを支持した(Segrest er al.(1994) Adv. Pr
ot. Chem.,45:303-369; Brouillette & Anantharamaiah (1995) Biochim. Biophys. Act
a 1256:103-129)。
タンデムダイマーとして合成し、そのN−末端およびC−末端両親媒性らせんが最大の脂
質結合能をもつことを示した(Mishra et al.(1998) Biochemistry 37:10313-10324)。
アポA−Iのエクソン4(44−243残基)のX線結晶構造および分子モデリング研究
によって、全長のアポA−I分子同士の結合状態が脂質の結合に必要であることが示唆さ
れた(Borhaniet al.(1999) Proc.
Natl. Acad.Sci. USA, 94:12291-12296; Segrest et al.(2000) Current Opin. Lipidol
. 11:105-115)。このモデルでは、アポA−Iの2つの分子は頭−尾結合のダイマー形で
配列され、1つのモノマーが互いに相互作用してアポA−Iの脂質結合構造を安定化させ
る。
は、“逆コレステロール輸送”におけるそれらの役割によるものであろうということを示
唆している(Fielding& Fielding (1995) J. Lipid Res. 36:211-228; Glomset (1968)
J. Lipid Res.9:155-167)。逆コレステロール輸送は、HDL/アポA−Iを必要とす
る以下の3つの工程の合算である:a)xx細胞からのコレステロールの流出(Johnson
et al.(1991)Biochim. Biophys. Acta.1085:273-298; Oram & Yokoyama (1996) J. Lipi
d Res.37:2473-2491)、b)HDL結合コレステロールのLCATによるエステル化(F
ielding etal.(1972) Biochem. Biophys. Res. Comm. 46:1493-1498; Jonas (1991) Bio
chim. Biophys.Acta 1084:205-220)およびc)肝臓へのコレステロールエステルのレセ
プター介在輸送(Kreiger(1991) Ann. Rev. Biochem. 68:523-558)。In vivo実験によ
って、ヒトアポA−IおよびクラスA合成両親媒性らせんペプチドは、両方とも逆コレス
テロール輸送とは独立したメカニズムによって、血漿コレステロールレベルを変化させる
ことなくアテローム性硬化症を抑制することが示された(Shah et al.(1998) Circulatio
n 97:780-785)。最近我々は、動脈壁細胞内へのLDL誘発単球走化性の抑制は、アテロ
ーム性硬化症の防止においてアポA−IおよびHDLが演じるまた別の主要な役割である
ことを示唆した(Navabet al.(2000) J. Lipid Res. 41:1481-1494; Navab et al.(2000
) J. LipidsRes. 41:1495-1508)。
性化能(Anantharamaiahet al.(1990) Arteriosclerosis 10:95-105; Epand et al. (19
87) J. Biol.Chem. 262:9389-9396)およびコレステロール流出能(Davidson et al.(19
94) J. Biol.Chem. 269:22975-22982; Yancey et al.(1995) Biochemistry 34:7955-796
5)を有することが示された。18Aの末端荷電を中和して、Ac−18A−NH2を生成
することによって、その脂質親和性および生物学的活性が増強されることが示された(Ya
ncey etal.(1995) Biochemistry 34:7955-7965; Venkatachalapathi et al.(1993) Prot
eins:Structure, Function and Genetics 15:349-359)。この“親”分子、18Aのア
ミノ酸配列のいくつかの改変が、そのアポA−I類似特性を改善するために実施された(
Brouillette& Anantharamaiah (1995) Biochim Biophys. Acta 1256:103-1291; Mishra
et al.(1994) J.Biol. Chem. 269:7185-7191; Mishra et al.(1995) J. Biol. Chem. 27
0:1602-1611)。
56:103-1291;Epand et al.(1987) J. Biol. Chem. 262:9389-9396)は、このペプチドの
疎水性の増加は、その脂質親和性およびアポA−I類似特性を増加させることを示した。
合成ペプチド5F(両親媒性が増強されたAc−18A−NH2の類似体)は食餌誘発性
アテローム性硬化症をマウスで抑制することが示された(例えば実施例1および2を参照
されたい)。しかしながら、ペプチド2Fは、C57BL6マウスでは食餌誘発病巣形成
を顕著には抑制しなかった(Garber et al.(1999) Circulation 100:I538)。18Aダイ
マーペプチドの実験は、ペプチド−ペプチド結合の増加はペプチド:脂質結合を低下させ
ることを示した(Mishraet al.(1995) J. Biol. Chem. 270:1602-1611)。
加させることができる最大限度を決定するために、非極性面の疎水性アミノ酸(例えばL
euおよびAla)をPheで置換することによってPhe残基が系統的に増加する一連
の同種ペプチドをデザインした。Wimley & White(Nature Struc. Biol. 3:842-848(1996
))の実験的に決定された疎水度基準にしたがえば、TrpおよびPheは、それらが水
相から膜内への最大の分配を示すという意味でもっとも疎水性のアミノ酸である。膜活性
ペプチドにおいてPheがもっとも耐酸性疎水性アミノ酸であり、さらにPhe含有ペプ
チドはTrp含有ペプチドよりも容易に合成できるので、我々はPheをペプチドの疎水
性の増加に用いた。物理的特性および脂質結合特性、並びにアポA−Iに類似する生物学
的特性(例えばLCAT活性化およびLDL誘発走化性活性の抑制)に対する前記疎水性
増加の影響を調べた。
ペプチド合成
ペプチドは、自動固相合成装置(PS3 Protein Technologies, Woburn, MA)を用いて固
相法によって合成した。FMOC−アミノ酸をリンクアミド樹脂(0.536mEq/g
)(PeninsulaLaboratories, Inc. Belmont, CA)とHBTUおよびNMMの存在下で結
合させ、N−末端を無水酢酸でアセチル化した。アニソール(1%)、メルカプトエタノ
ール(0.1%)およびトリプトファン(ペプチド樹脂の重量の20%)の存在下で、ジ
クロロメタン中の70%のTFAを用いてペプチドを固相支持体から切断し、VYDAC
C−4(22mm×25cm、粒子サイズ10μm)逆相HPLC(RP−HPLC)カ
ラム上で、水に25%から58%の0.1%TFA含有アセトニトリルのグラディエント
(22分)を用い4.8mL/分の流速で66分かけて精製した。ペプチドの純度は、C
18カラム(VYDAC、4.6mm×25cm、5μm)およびアセトニトリル−水(0
.1%TFA含有)の25%から58%の直線グラディエントを用い33分かけて分析用
RP−HPLCによって確認し、さらに質量分析によって確認した。
CDスペクトルはAVIV・62DS分光偏光計で文献(Mishra et al.(1994) J. Bio
l. Chem.269:7185-7191)にしたがって記録した。簡単に記せば、通過窓の長さが0.1
cmのセルを用いてスペクトルを得て、測定値は、260nmから190nmまで1nm
毎に25℃で採取した。全てのCDスペクトルは4つのスキャンを合算することによって
平均化したシグナルであった。基準線は修正し凹凸を無くした。PBS(pH7.4)中
のペプチド溶液は11μMの濃度で用いた。ペプチド−DMPC複合体(1:20mo
l:mol)を用いて、これらペプチドのらせんに対するペプチド結合の影響を決定した
。これら複合体は、適切な容積のペプチド溶液をDMPC多層小胞に添加することによっ
て調製した。DMPC多層小胞は以下のようにして調製した:既知量の脂質をエタノール
に溶解し、希薄な窒素流の下でゆっくり蒸発させることによって溶媒を除去した。残留溶
媒は脂質フィルムを真空下に一晩保存することによって除去した。適切な容積のPBS(
pH7.4)を薄い脂質フィルムに添加して、要求される最終濃度のDPMCを得た。脂
質−ペプチド複合体は必要な容積のペプチド溶液を添加することによって調製し、20:
1の脂質:ペプチドモル比を得た。これらペプチドの溶解度が小さいので、11μMのペ
プチド濃度を用いた。222nmの平均残基楕円率、[θ]MRE(deg.cm2.dmol
-1)は以下の等式を用いて計算した:
[θ]MRE=MRW[θ]/10cl
式中、MRWはペプチドの平均残基重量であり、θは度で表した観察された楕円率であり
、cはg/mLで表したペプチドの濃度であり、lはセンチメートルで表したセルの観察
窓の長さである。ペプチドのパーセントらせん度は、Morrisettら(Biochemistry 12:129
0-1299(1973))が記載した以下の等式から概算した:
%αらせん度=([θ]222+3000)/(36000+3000)
式中、[θ]222は222nmでの平均残基楕円率である。
DSC実験は、マイクロカルMC−2走査熱分析計(MicroCal, Inc., Amherst, MA)
を用い、DMPCについては走査速度20℃/時間で、DiPoPEについては走査速度
37℃/時間で文献(Mishra et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:7185-7191)に記載さ
れた方法を用いて実施した。既知量のリン脂質をクロロホルムに溶解した。サンプル1組
について、ペプチドをメタノールに溶解し、クロロホルム/メタノール(2:1、v:v
)中のDiPoPEの溶液に添加した。純粋な脂質サンプルおよび脂質とペプチドの有機
溶液の両方について、溶媒をゆっくりとした窒素流の下で除去した。残留溶媒は真空下で
除去した。緩衝液(DMPC用はpH7.4、PBS、DiPoPE用はpH7.4、2
0mMPIPES,1mMEDTA,150mMNaClおよび0.002%NaN3)
単独、または固有の脂質/ペプチドモル比を提供するために緩衝溶液中の既知濃度のペプ
チドを前記乾燥フィルムに添加し、さらに室温で30分ボルテックスミキサーで水和させ
た。DMPCの場合は、スキャンの間に60分の平衡化時間を含む4つの連続スキャンを
実施した。DSCサーモグラムは、マイクロカル社(MicroCal Inc., Amherst, MA)が提
供するソフトおよびオリジン(Origin)バージョン5.0を用いて分析した。
単層排除圧(monolayerexclusion pressure)測定は、脂質−水境界面に対するペプチ
ドの親和性を提供し、PhillipsとKrebsの方法(Phillips & Krebs (1986) Methods Enzym
ol.128:387-403; Ibdah et al.(1989) Biochim. Biophys. Acta 1004:300-308)に従っ
た。卵黄ホスファチジルコリン(EPC)の不溶性単層膜をテフロン(登録商標)皿内の
空気−水境界面に室温で広げて5−45dyn/cmの最初の表面圧(πi)を提供した
。1.5Mの塩酸グアニジンを含むPBS中のペプチド溶液を下相に注意深く注入し、5
0μg/dLの最終濃度を提供した。塩酸グアニジンをサブフェース中で1mM以下の最
終濃度に希釈して、ペプチドを再生させた。サブフェースを持続的に攪拌しEPC単層膜
の表面圧の増加(Δπ)を定常値が得られるまで記録した。ペプチドがもはやEYPC単
層膜に進入しない最初の表面圧(πi),すなわち排除圧(πe)は、πi対Δπ直線回帰
適合をΔπ=0dyn/cmに外挿することによって計算した。
これらペプチドと卵黄ホスファチジルコリンとの結合は、文献(Mishra et al.(1994)
J. Biol. Chem.269:7185-7191)に記載されたように、SLM8000C光子計測スペク
トロフルオロメーターを用いて直角光散乱により、EPC多層小胞の分解を追跡すること
によって決定した。EPCMLVは、EPC(Avanti Polar, AL)の溶液を窒素下で蒸発
させ、さらに脂質フィルムをリン酸緩衝食塩水(pH7.4)で水和させることによって
調製した。105μMのEPCおよび等モル量のペプチドを含むサンプルを25℃で維持
し、持続的に攪拌した。濁り度の清澄化を30分モニターした。EPC小胞の完全な溶解
は、最終濃度1mMのTritonX−100の添加によって達成された。
LCATを新鮮な血中脂肪値正常血漿から文献(Albers et al.(1986) MethodsEnzymol
. 129:763-783)の方法にいくつかの改変を加えて単離した。血漿密度を1.21g/m
Lに調節し、175000gで24時間遠心した。LCAT含有分画をアフィ−ゲル(Af
fi-Gel)ブルークロマトグラフィーに、続いてDE−52クロマトグラフィーに付した。
トリス緩衝液(10mM、pH7.6)中の75から200mMのNaClグラディエン
トを用いてLCATをDE−52カラムから溶出させた。SDS−PAGEの結果、ヒト
アポA−Iが夾雑していない90%を越える純度の酵素であると分かった。
微量の7α−3Hコレステロールを含む卵黄PC/コレステロール(90:20モル/
モル)をブランソン250ソニケーターで12分超音波処理し、小さい単層小胞を作製し
て基質を調製した。前記基質(50μL)を5μgのペプチドまたはヒトアポA−Iおよ
び50μLのBSA(40μg/mL)とともに1時間37℃でインキュベートした。総
容積を150μLまで増やした。1時間インキュベートした後、100μLのLCATを
添加し、37℃で1時間インキュベートし、さらにシリカ片上に10μLを滴下すること
によって反応を停止させた。ヘキサン:クロロホルム(2:1v/v)混合物中でシリカ
片の薄層クロマトグラフィーによって、コレステロールとコレステリルエステルを分離さ
せた。コレステロールおよびコレステリルオレエート標準物は、3%の酢酸第二銅、8%
のリン酸緩衝液中にTLCプレートを浸漬し加熱することによって可視化した。標準物の
位置を用いて前記プレートを2つに切断し、この2つの部分をパッカードトリカーブ(Tr
i Carb)4530中でシンチレーション液で計測した。全反応を3組ずつ実施した。ペプ
チドによるLCATの活性化は、アポA−Iによる全活性化の百分率で表される。
非変性PAGEおよびSDS−PAGEはLaemmliの方法(Nature 227:680-685(1970)
)を用いて実施した。プリメードノベックス(Premade Novex)ゲルを用い、さらにゲル
はクーマシーブルーで染色してタンパク質バンドを特定した。
ヒト動脈壁細胞の混合培養、単球の単離、健常者ドナー血漿からの超遠心沈澱による、
またはマウス血漿からのFPLCによるリポタンパク質の単離、並びに脂質ペルオキシド
および単球走化性活性の測定は、文献の記載にしたがって実施した(Navab et al.(1991)
J. Clin.Invest. 88:2039-2046; Navab et al.(1977) J. Clin. Invest. 99:2005-2019
)。簡単に記せば、LDLおよびHDLをヒト血漿からHavelら(J. Clin. Invest. 43:1
345-1353(1955))の方法によって単離した。ヒト大動脈内皮細胞(HAEC)および平滑
筋細胞(HASMC)を文献(Navab et al.(1991) J. Clin. Invest. 88:2039-2046)に
記載にされたように単離した。マイクロタイタープレートを0.1%のゼラチンで37℃
で一晩処理した。HASMCを1×105細胞/cm2の密集成長した密度で添加した。細
胞を2日間培養し、このとき細胞はウェルの表面全体を覆い、かなりの量の細胞外マトリ
ックスを産生していた。続いてHAECを2×105細胞/cm2で添加して増殖させ、2
日間で密集成長したHAECの完全な単層培養が形成された。全ての実験で、HAECお
よび同一個体由来のHASMCを4代から6代の継代レベルで用いた。単球は健常なドナ
ーから文献(Fogelmanet al.(1988) J. Lipid Res. 29:1243-1247)に記載されたように
単離した。混合培養は天然のLDL(250μgタンパク質/mL)で処理するか、また
はHDL(350μgタンパク質/mL)もしくはペプチドの存在下で8時間処理した。
続いて前記混合培養を洗浄し、メディウム199でさらに8時間インキュベートした。得
られた混合培養上清を文献(Navab et al.(1997) J. Clin. Invest. 99:2005-2019)の記
載にしたがって単球走化性活性についてアッセイした。
ペプチドの分析
表6は、合成した種々の18A類似体の配列を示す。ペプチドAc−18A−NH2(
前記は2つのPhe残基を6位および18位(境界面のリジン残基の近く)に有する)は
2Fと称される。2つの3Fペプチド、3F3または3F14を合成した。前記ペプチドで
は、3位および14位のLeu(両方とも非極性面の中心に存在する)がそれぞれPhe
によって置換されている。ペプチド4Fは、非極性面の中心に2つのPheを有し、これ
は2つの中心部のLeu残基が置換された結果である。ペプチドの置換(3Fから7F)
は表6に示されている。Phe残基の数が増加するにつれて、非極性面上の残基当たりの
理論的疎水性が、ペプチド2Fに対する2.05から7Fに対する3.15に増加する。
2疎水性は非極性面上の残基当たりの疎水性として表されている。
3理論的脂質親和性は文献(Palgunachari etal.(1996) Arterioscler. Thromb. Vasc. B
iol. 16:328-338)の記載に示されているように計算した。
1%トリフルオロ酢酸含有)とアセトニトリル(0.1%トリフルオロ酢酸含有)を用い
て精製した。ペプチドの純度および保持時間は、分析用VydacC18カラムで水にアセ
トニトリル25%−58%のグラディエント(0.1%TFA含有)を用いて決定した。
前記ペプチドの純度はまた質量分析法によって確認した。前記質量は計算によって得られ
た分子量と一致した。ペプチドの保持時間は表7に示されている。3Fペプチドおよび4
Fペプチドはともに2Fと比較して付加されたPhe残基を有するが、C18カラムにおけ
るこれらペプチドの保持時間は大きくは相違しない(〜22分)。保持時間における突然
の増加は5F、6Fおよび7Fで明白である(〜26分)。Phe残基の数が増すにつれ
、これらペプチドのPBS中の溶解度は減少する。表7から明らかなように、2F、3F
3,3F14および4Fの溶解度(1.25から1.4mg/mL)は、5F、6Fおよび
7Fの溶解度(0.03から0.1mg/mL)よりも顕著に高い。
2保持時間は、水にアセトニトリル25%−58%(33分)のグラディエント(0.1
%TFA含有)を用いVydacC18カラムから溶出したペプチドについて得られた時間
である。
3溶解度はPBS中で決定された。
4これらの測定の再現性は±1dyn/cmである。
GE)で調べた。図14は、変性SDSゲル(図14A)および非変性ゲル(図14B)
の両方での2Fの移動度を示している。2Fの分子量は2242であり、もっとも小さい
分子量標準物質(3.5−2.5kDa)よりもわずかに遅く移動する単一のバンドとし
てSDSゲル(図14A)上に認められる。しかしながら、図14Bで認められるように
、前記は非変性条件下では濃度依存態様で凝集物を形成する。低濃度(100μg/mL
)では、前記は2つのサイズの凝集物を形成するが、高濃度(250μg/mL)では、
より大きな凝集物のみが形成される(図14B)。調べた他の全てのペプチドもまた非変
性条件下で凝集物を示し、これらペプチドは強い自己結合傾向を有することを示唆してい
る。
ペプチドの二次構造は円偏光二色性分光分析によって決定した。表8は、PBS中およ
びDMPC存在下でのペプチドのパーセントらせんを示している。PBS中では、同族体
2F、4F、5F、6Fおよび7Fは、3F3および3F14よりも高いらせんパーセント
を有する(表8)。5F、6Fおよび7FはPBSに難溶であるので、CD実験は11μ
Mのペプチド(それらが完全に溶解する濃度)を用いて実施した。ペプチド2Fは、溶液
中の5Fに匹敵する55%らせんを示した。6Fおよび7Fは両方ともわずかに高いらせ
ん(それぞれ67%および58%)を示し、4Fはわずかに低かった(45%)。3Fペ
プチドは両方ともはるかに低いらせんを示した(〜20%)。しかしながら、DMPCへ
の結合は、6Fを除いて全てのペプチドのらせんを顕著に増加させた(表8)。脂質環境
下では、2F、5Fおよび7Fは高いらせん含有量(68%から76%)を示した。ペプ
チド3F3および3F14はPBS中ではらせん含有量は非常に少ないが、脂質環境下では
顕著ならせんの増加があった(3F3については約22%から42%に、3F14について
は19%から55%に増加)。ペプチド6Fおよび4Fのらせんは、脂質の存在下でもそ
れほど変化しなかった。しかしながら、これらのペプチドはなお2Fおよび5Fペプチド
よりもらせん的でなかった。CDの結果は、Pheによる置換の増加に関してペプチドの
らせん形成に系統的な変化は存在しないことを示唆している。ペプチド2Fおよび5Fは
溶液中およびリン脂質の存在下で最大らせんを示した。
表8:水性環境および脂質環境下でのFペプチドのらせん形成
mol)であった。3回の測定を実施し、±10%の誤差を得た。
DMPC及びDiPoPEを用いたDSCの研究
DMPCの多層小胞の鎖溶融遷移に対するこれら18A類似体の影響をペプチド−脂質
混合物(脂質/ペプチドモル比100:1)を用いて調べた。表9は、ペプチドの存在下
および非存在下でのDMPCの鎖溶融遷移の遷移温度並びにエンタルピーを示す。純粋な
脂質は13℃で予備遷移を、23℃で主要な鎖溶融遷移を示す。DMPCへのペプチドの
添加は、ゲルから液晶への遷移の拡大、および遷移エンタルピーの低下をもたらした(表
9)。予備遷移はいずれのペプチドの存在下でも認められなかった。調べたペプチドの中
で2F、3F3、5Fおよび6Fが遷移エンタルピーを最も大きく減少させた(表9)。
いずれのペプチドも遷移温度の変化は0.2℃を越えなかった。
の濃度は1.5mMであった。TCMは鎖溶融遷移が生じる温度で、ΔHCMは遷移のエンタ
ルピーで、ΔT1/2は遷移の最大値の半値幅である。
特性に対するペプチドの影響を評価するために用いられた(Epand (1998) Biochim. Biop
hys. Acta1376:353-368)。2FはDiPoPEのTHを上昇させることが以前に示され
た(Tytleret al.(1993) J. Biol. Chem. 268:22112-22118)。これまでの実験で我々は
2つの方法でペプチド−脂質混合物を調製した。1つは、有機溶媒中のペプチドを有機溶
媒中の脂質に添加し、続いて前記物質をフィルムとして沈積させ、さらに緩衝液で水和さ
せる方法である。他の方法では、ペプチドおよび脂質を別々に水和させた後でそれらを混
合する。混合物がDSC分析の前に平衡化すれば、ペプチドと脂質が最初にどのようにし
て混合されたかは重要ではない。しかしながら、膜系はゆっくりと平衡化させることがで
き、その場合には、ペプチドが脂質フィルムに高濃度で取り込まれるときはより多くのペ
プチドが脂質中に存在することができる。一般に、両方法によるサンプル調製の結果は同
様であるが(結果は示されていない)、THのシフトは、脂質とペプチドで構成されたフ
ィルムにペプチドが取り込まれたサンプルでより大きい傾向がある。ペプチドのモル濃度
分画に関するTHのばらつきは、種々のペプチドおよびアポA−Iについて示されている
(図15)。THにおける直線状の増加が2Fおよび5Fについて観察されるが、4Fは
、より迅速な増加が低いペプチド濃度で観察されるという点においてアポA−Iに類似す
る態様を示す。他方、2つの3F類似体は、6Fおよび7Fと同様にTHに顕著な影響を
与えない。
単層の排除圧(πe)は、ペプチドがもはやEPC単層膜に侵入できない表面圧である
。πeの値はペプチドの理論的脂質親和性を反映する。Fペプチドの排除圧はPhe残基
の数が増加するにつれ増加する(表7)。ここで調べた全てのペプチドが、アポA−Iお
よび親ペプチド18Aよりも高い排除圧を有していた。πeの値は2Fから4Fへと(3
8から40dyn/cm)徐々に増加した。これは37pA(プロリンが間に入った18
Aのタンデムリピート)について観察された範囲内である。排除圧値は5F、6Fおよび
7Fについて顕著に増加した(40から45dyn/cm)。排除圧によって決定された
ように、5F、6Fおよび7F同族体は、EPC単層膜と類似の相互反応能力を有するこ
とは明白である。表7に挙げたFペプチドは、HPLC保持時間および単層膜排除圧につ
いて類似傾向を有し、4Fと5Fの間で急激な増加を示すことは興味深い。
図16で認められるように、アポA−I(EPCMLVを清澄化できない)と異なり、
全てのペプチドがEPCMLVを清澄化することができた。3Fの2つの同族体ペプチド
はEPCMLVの清澄化でもっとも有効性が低かった。同族体ペプチド2F、5F、6F
および7Fは全てEPCMLVを同程度に清澄化した。ペプチド4Fは、EPCMLVを
もっとも効果的に清澄化し、活性はTritonX−100のそれと類似していた。EP
CMLVの濁り度の50%クリアランスのための時間もまた4F同族体でもっとも短かっ
た。ペプチド7Fは50%クリアランスの達成のためにもっとも長時間を要し、これは、
最初のラグ時間(〜300秒)のためであった(図16)。前記はおそらく、EPCML
Vと相互作用する前に自己結合した7F分子が分解し、それらを可溶化させる必要性があ
るからであろう。同族体2F、5Fおよび6Fによって示されたより遅いクリアランス速
度もまた、これらペプチドの高い自己結合が原因であるかもしれない。
これらのペプチドの血漿酵素LCATを活性化する能力を、基質として卵黄PC−コレ
ステロール小胞を用いLCAT反応の最初の粘度を測定することによって決定した(図1
7)。LCAT活性化は、アポA−Iによる活性化(これを100%とする)との比較で
表される。20μg/mLのペプチドおよびアポA−IによるLCATの活性化は図4に
示されている。この濃度では、アポA−Iはいずれのペプチドよりも良好にLCATを活
性化する。ここで調べたペプチドの中では、しかしながら5Fが最良の活性化物質である
(アポA−Iの80%)。LCAT活性化に関するかぎり、3F3および3F14は同様な
活性化能力を有している。したがって、それらは1本の棒線で表した(図17)。
LDLをヒト動脈壁混合培養系とともにインキュベートしたとき、LDLは内皮下腔に
捕捉され、酸化されて生物学的に活性な脂質を生じる。これらの脂質は単球走化性を誘発
する。したがって、混合培養単球走化性は、生物学的に活性な脂質の生成についての十分
に確立されたアッセイである。走化性の抑制は “シーディング分子”の除去と正比例す
ることが示された。前記シーディング分子は、単球走化性タンパク質1(MCP−1)の
分泌(Navabet al.(2000) J. Lipid Res. 41:1481-1494; Navab et al.(2000) J. Lipid
Res.41:1495-1508)および分化因子、マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)
の分泌に必要である。図18は、ペプチドとインキュベートした後のLDLが作用の変動
を表すことを示し、LDLの走化性特性は同族体4F、5Fおよび6Fによりもっとも減
少する。ペプチド3Fは、2Fおよび7Fと比較して全く有効性がなく、2Fおよび7F
は、4F、5Fおよび6Fよりも有効性は低かった。
クラスA両親媒性らせんペプチド類似体の疎水性増加によるその物理化学的特性および
脂質結合特性に対する影響
本明細書で調べたペプチドは親ペプチド18Aの同族体である。非極性面上の残基当た
りの計算による疎水性(改変GESスケールによる(Palgunachari et al.(1996) Arteri
oscler. Thromb.Vasc. Biol. 16:328-338))は、Phe残基の数が増すにつれ増加する
。疎水性におけるこの増加(表6)は、理論的な脂質親和性、Λにおいて再現される(上
掲書)。しかしながら、Λ値は、2Fから4Fまで徐々に増加し(13.03から14.
59)、さらに突然14.59(4Fの場合)から19.07(5Fの場合)の値に増加
する。Λが徐々に増加するのが5Fの後に6Fおよび7Fに対する値で再び観察される(
表6)。これは、Ac−18A−NH2の3位および14位のLeuがPheで置換され
たことによる。Pheは、非極性面の疎水性のわずかな増加をもたらし、したがって2つ
の3F類似体および4FのΛ値にわずかな増加が生じる。同族体5F、6Fおよび7Fで
は、しかしながら、LeuからPheへの置換の他に、11位および17位のAlaもま
たPheで置換され、Λ値の顕著な増加がもたらされる(表6)。AlaはLeuよりも
疎水性が小さく、さらにLeuはPheよりも疎水性が小さいので、AlaからPheへ
の置換は、LeuからPheへの置換よりも、得られたペプチドにおいて疎水性および理
論的脂質親和性に大きな変化をひき起こす。
層膜に侵入する能力は全て、理論的な脂質親和性値で認められる傾向と同様な傾向を示し
た(表7)。ペプチド2F、3F3、3F14および4Fの保持時間はほぼ同じで(21か
ら22分)、5F、6Fおよび7F(これらは第二の群を構成する)の値(26から27
分)よりも顕著に小さい。ペプチド2Fから4Fは、同族体5Fから7F(これらは難溶
性である)よりも水への溶解度は顕著に高い。排除圧が2Fから4Fまで徐々に増加する
のが観察され、その後40dyn/cmから45dyn/cmへ急激に増加する。ペプチ
ド5F、6Fおよび7Fの場合の排除圧は互いに大きな相違をもたず、アポA−Iのそれ
よりも顕著に高い(表7)。親ペプチド18A(30dyn/cm)および18Aのダイ
マー、37pA(40dyn/cm)さえもまた、空気−水境界面に広げた卵黄PC単層
膜への侵入の効率は顕著に低かった。上記の物理的特性を基にして、Fペプチドは2つの
群に分けることができる。すなわち2F、3F3、3F14、4Fの群I並びに5F、6F
および7Fの群IIである。
増加することを示し、このことは、全てのペプチドが脂質と結合していることを示唆して
いる。DSCによって示唆されるように(表9)、これらペプチドのDMPCへの結合は
類似しているように思われる。しかしながら、DiPoPEの二重膜構造の安定化に対す
るこれらのペプチドの影響は異なっている。4Fおよび5Fは他のペプチドよりも良好な
安定化物質のようであるので、DiPoPEとより良好に相互作用するように思われる。
差はあるが清澄化することができる。水性緩衝液に容易に溶解し、38から40dyn/
cmの範囲の単層排除圧を示すI群ペプチド(2F、3F類似体および4F)の中で、4
Fはもっとも有効であるようで、調べたペプチド:脂質比では、TritonX−100
のそれと同様な動的態様を示す(図16)。ペプチド2Fおよび3Fの単層排除圧は類似
しているが、3F同族体はEPCMLVの清澄化がもっとも遅い。3F同族体のEPC清
澄化能力が低い理由は現時点では明らかではない。水性緩衝液に容易に溶解することがで
きず、表面圧値が45dyn/cmの群IIのペプチド(5F、6Fおよび7F)は比較
的ゆっくりとEPCMLVを可溶化する。これらの結果は、分解してからEPCと相互作
用する必要があるペプチド凝集物と一致する。4Fの優れた反応性は、その疎水性が最適
であり、そのため自己結合に有利な疎水性ペプチド:ペプチド相互作用がペプチド:脂質
相互作用を妨げないという事実によって説明することができる。
LCATの活性化は複雑な過程であり、脂質の親和性に左右されるだけではなく、両親
媒性らせんタンパク質と酵素LCATとの相互作用にも依存する(Jonas (2000) Biochim
. Biophys. Acta1529:245-256)。前記の記述と合致して、LCATを活性化する能力は
同族体ペプチドについて異なることが見出された。ペプチド5Fは最大のLCAT活性化
能を示し、これは、表7に示した物理的特性と一致する(表7では、卵黄PC−水境界面
での排除圧値を含む急激な増加が4Fから5Fで認められた)。ペプチド6Fおよび7F
は5Fほど効果的ではないという事実は、これらペプチドの水への低い溶解度によって反
映されるように、ペプチド:ペプチド相互作用の増加(前記増加はペプチド:脂質または
ペプチド:LCAT相互作用を許容しない)によって説明することができるであろう。こ
れらの結果は、18Aダイマーに関する我々の以前の観察と合致する。以前の観察では、
ダイマー18A−18A(36A)におけるペプチドの自己結合の強化は、18A−Pr
o−18Aペプチドと比較して脂質と相互作用する能力を低下させた(Jonas (2000) Bio
chim. Biophys.Acta 1529:245-256)。前記ペプチドによるLCATの活性化はアポA−
Iのそれと匹敵したが、アポA−Iと前記の全てのペプチドはEPCに対して異なる反応
性を有するので(図16)、それらは違った態様で基質と相互作用するということは留意
されねばならない。同様な観察がChungらによって報告された。彼らは、合成ペプチド1
8A−Pro−18AおよびアポA−Iは異なる態様でEPCと相互作用することを示し
た(Chunget al.(1985) J. Biol. Chem. 260:10256-10262)。
我々が報告したように(Navab et al.(2000) J. Lipid Res. 41:1481-1494; Navab et
al.(2000) J.Lipid Res. 41:1495-1508)、“シーディング分子”の除去はペプチドの両
親媒性度に左右されるので、我々はこれらペプチドのLDL誘発単球走化性抑制能力を調
べた。このアッセイでは、一方向変数分析を基にして、ペプチド4F、5Fおよび6F(
100μg/mLレベル)は、顕著かつ類似するLDL誘発走化性の抑制を示した。同族
体2Fはある程度の抑制活性を示し、(その理由は不明であるが)、類似体ペプチド3F
は抑制を示さずLDL単独と類似していた。これらの結果は、ペプチド3Fは脂質過酸化
水素を除去できない(データは示されていない)という事実およびEPCMLVを清澄化
する能力が低いことと一致した。ペプチド7Fは、ペプチド4F、5Fおよび6Fより顕
著に有効性が低かった(P<0.001)。7Fの能力の低下はまた前記ペプチドの自己
結合の増強によって説明できる(自己結合の増強はEPCMLVの清澄化実験で観察され
たように脂質との相互作用能力を低下させる)。これらの結果はあらためて、ペプチドの
疎水性が自己結合に与える影響間に存在する微妙なバランスがアポA−I摸倣特性に決定
的な影響を与えることを示している。
いる)のinvivo投与によって、マウスは食餌誘発アテローム性硬化症から防御される。
対照的に、2F(LCAT活性化能力は4Fと同様であるが、“シーディング分子”をL
DLから除去する能力は4Fおよび5Fよりも低い)の投与は、C57BL6マウスにお
ける食餌誘発性病巣の形成を顕著には抑制しなかった(PBSを投与したコントロールマ
ウスの平均病巣面積は14.7±1.8μm2×10-3に対して、2F投与マウスでは1
3.2±1.7μm2×10-3、n=15)。したがって、前記のマウスモデルでは、L
DL誘発単球走化性の抑制が、LCAT活性よりもアテローム性硬化症誘発に対してより
強い対抗力を示す。ペプチド2Fおよび4FはLCATの活性化においては類似し、4F
および5FはLDLから“シーディング分子”を除去する能力において類似しているので
、ペプチド4Fは、異なるアテローム性硬化症感受性マウスモデルでLCAT活性化とL
DL誘発単球走化性の抑制の重要性を識別する試薬として機能するかもしれない。LDL
誘発走化性の抑制がLCAT活性化能力よりも重要であるならば、4Fは5F、6Fおよ
び7Fよりもより可溶性であるのでアテローム性硬化症の抑制として用いることができる
より優れたペプチドであるはずである。
ペプチドD−4Fは、急性炎症性反応時にパロキシナーゼレベルを維持し、酸化リン脂
質生成を阻害する
我々は、インフルエンザAウイルスのマウス鼻腔内点滴によって惹起されるHDLの抗
炎症性特性の時間依存性低下は接種後7から9日で最大に達することを観察した。選択し
た接種量はウイルス血症をひき起こさない量で、したがって、惹起される変化はウイルス
によって直接ひき起こされるものではなく、ウイルス感染に対するホストの全身反応によ
って誘発される炎症状態によるものであった。前記の反応は生来の免疫系の一部分であり
、急性期反応として知られている。
および血小板活性化アセチルヒドロラーゼ活性の低下であった。これらHDL酵素活性の
低下の結果として、さらにまた急性期反応時のプロオキシダントタンパク質とHDLとの
結合の結果として、HDLはもはやLDLの酸化を防止することができず、さらにLDL
により誘発される内皮細胞の単球走化性活性の産生を防止することができなかった。正常
なHDLは、生物学的に活性な酸化リン脂質を破壊するために十分なパラオキソナーゼお
よび血小板活性化アセチルヒドロラーゼ活性を含むので、前記HDLは、LDLにより誘
発される内皮細胞の単球走化性活性の産生を防止することができる。
酸化されたリン脂質を生成し(図19)、後期には(感染後7から9日)これら生物学的
に活性な酸化されたリン脂質はマウスの大動脈に出現した。しかしながら、インフルエン
ザAウイルス感染後、マウスに20μgのD−4Fを毎日注射した場合、パラオキソナー
ゼレベルは低下せず(図20)、生物学的に活性な酸化リン脂質もバックグラウンド以上
には生成されなかった(図21)。
動脈疾患をもつ患者にインフルエンザ感染または他の急性期炎症反応を生じる事象(例え
ばウイルス感染、細菌感染、外傷、移植、種々の自己免疫症状などによる事象)時に経口
的または注射によって投与し、その結果この短期間の処置によって前記炎症性状態を生じ
る病変に伴う心臓発作および卒中発作の発生の増加を防止することができることを示して
いる。
D−アミノ酸から合成されたアポA−I摸倣ペプチドの経口投与はマウスのアテローム
性硬化症を劇的に減少させる
DまたはLアミノ酸から合成されたアポA−I摸倣ペプチドは、動脈壁細胞による酸化
に対して低密度リポタンパク質(LDL)を防御するためにin vitroで有効であった。し
かしながら、前記ペプチドをLDLレセプター欠損マウスに経口的に与え、そのHDLを
単離し、LDLを酸化から保護する能力をin vitroで調べたとき、D−アミノ酸から合成
されたペプチドのみが有効であった。D−アミノ酸から合成されたペプチドは血液循環中
で安定であり、高密度リポタンパク質(HDL)の分画から見出された。Lアミノ酸から
合成されたペプチドは急速に分解され尿中に排泄された。D−4Fとして知られるD−ア
ミノ酸から合成されたペプチドを1日に2回経口的に、西洋風食餌を与えたLDLレセプ
ター欠損マウスに投与したとき、病巣は79%減少した。アポE欠損マウスの飲料水に添
加したとき、D−4Fは病巣を84%以上減少させた。我々は、D−アミノ酸から合成し
たアポA−I摸倣ペプチドの経口投与は、アテローム性硬化症および酸化脂質によってひ
き起こされる他の慢性炎症性疾患の予防および治療に有用であると結論した。
HDL−コレステロール濃度はアテローム性硬化を示す冠状動脈疾患の危険性と反比例
する(Miller& Miller (1975) Lancet, 1:16-19)。アポA−I(HDLの主要なアポリ
ポタンパク質)の輸液(Badimon et al.(1990) J. Clin. Invest. 85:1234-1241)または
遺伝子導入による発現(Plump et al.(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:9607-961
1)は、動物モデルでアテローム性硬化症を防御できることが示された。アポA−Iがア
テローム性硬化症の進行を防御するメカニズムは、逆コレステロール輸送(Shah et al.(
2001)Circulation, 103:3047-3050)およびLDLの酸化に必要な低レベルの酸化脂質(
“シーディング分子”)の除去(Navab et al.(2000) J. Lipid Res. 41:1481-1494; Nav
ab et al.(2000)J. Lipid Res. 41:1495-1508; Navab et al.(2001) Arteriosclerosis
Thromb. Vasc.Biol. 21:481-488)を含むのではないかと考えられている。クラスA両親
媒性らせんペプチド類似体は、LDLの酸化に必要な“シーディング分子”の除去(Nava
b et al.(2000)J. Lipid Res. 41:1481-1494; Navab et al.(2000) J. Lipid Res. 41:1
495-1508)を含むアポA−Iのいくつかのinvitroでの特性に類似する特性を有すること
が示された。前記には、。クラスA両親媒性らせんペプチドの腹腔内投与は、血漿コレス
テロールレベルに変化を生じないで食餌誘発アテローム性硬化症からマウスを保護するこ
とが最近示された(Garberet al.(2001) J. Lipid Res. 42:545-552)。病巣の減少に、
in vitroでのLDLの酸化を抑制するHDLの能力の顕著な改善が付随していた(上掲書
)。これまで、アポA−IおよびアポA−I摸倣ペプチドを薬理的物質として用いる場合
の主要な制限は、非経口ルートによる投与の必要性であった。
パク質を認識するが、D−アミノ酸から合成されたものはほとんど認識しない。本明細書
で我々は、D−アミノ酸から合成したアポA−I摸倣ペプチドの特別な製剤は、経口的に
投与してマウスで劇的にアテローム性硬化症を抑制できることを示す。
マウス
C57BL/6J系の雌のLDLレセプター欠損マウスまたはアポE欠損マウスをジャ
クソンラボラトリー(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)から購入した。LDLレセ
プター欠損マウスは、プリナ固形飼料(Purina chow diet, Ralston Purina Co.)で4週
齢まで飼育し、その時点で西洋風食餌(Western diet, Tekland, Madison, WI, diet#881
37)に切り替え6週間用いた。アポE欠損マウスは実験を通してプリナ固形飼料で飼育し
た。LDLレセプター欠損マウスは、経管投与によって1日に2回テストペプチドまたは
担体コントロールを、図の説明文に示された期間投与された。4週齢で、アポE欠損マウ
スの幾匹かの飲料水に図の説明文に示した濃度でテストペプチドを添加し、アポE欠損マ
ウスには固形飼料を続けた。
たプロトコルにしたがって麻酔下で後眼窩静脈叢から採血した。アテローム性硬化症病巣
は以前に記載したように測定した(9)。
LDLおよびHDLは、インフォームド・コンセントを得た後で実験協力者から、およ
び上記に記したようにマウスから文献(Navab et al.(2000) J. Lipid Res. 41:1481-149
4; および本明細書実施例)の記載にしたがって単離した。
以前に述べたように(上掲書)、ヒト大動脈内皮細胞および平滑筋細胞を単離し培養し
た。HDLの存在下および非存在下でのLDLの細胞性酸化は以前に述べたように(上掲
書)決定した。ヒト血液単球はインフォームド・コンセントを得た後で単離し、単球走化
性活性は以前に記載(5)されたように決定した。
アポA−I摸倣体ペプチドは以前に記載(11)されたように合成したが、ただしいく
つかの事例では、ペプチドの各アミノ酸は該当アミノ酸のD型立体異性体であった。前記
ペプチドは、Ac−D−W−L−K−A−F−Y−D−K−V−A−E−K−L−K−E
−A−F−NH2(配列識別番号:1)(Ac−18A−NH2または2F)をベースにし
ている。2Fまたは2Fの類似体を用いてここに報告する実験に用いた。前記2F類似体
の一次アミノ酸配列は以下のとおりであった:Ac−D−W−F−K−A−F−Y−D−
K−V−A−E−K−F−K−E−A−F−NH2(配列識別番号:5、4Fとも称され
る)。L−アミノ酸から合成したペプチドはL(例えばL−4F)と称され、D−アミノ
酸から合成したペプチドはD(例えばD−4F)と称される。いくつかの事例では、前記
ペプチドはIODO−BEAD試薬(Pierce, Rockford, IL)を用い、製造元の推奨にし
たがってヨウ素化した。D−4FとともにまたはD−4Fを用いないで、L−α−1−パ
ルミトイル−2−オレイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(Avanti Polar Lipids,
Alabaster,AL)から作製したリポソームは、製造元の推奨にしたがって製造した。完全
なペプチドのマウス血漿からの抽出および検出は、逆相HPLCを用い文献(Garber et
al.(1992)Arterioscler. Thromb. 12:886-894)の記載にしたがって実施した。
リポタンパク質のタンパク質(Navab et al.(2000) J. Lipid Res. 41:1481-1494)お
よびコレステロール(Van Lenten et al.(2000) Circulation 103:2283-2288)の含有量
、並びに統計分析は、P<0.05と規定される有意差で、文献(Van Lenten et al.(20
01) Circulation103:2283-2288)の記載にしたがって実施した。
In vitroでは、L−2FおよびD−2Fは、両者とも等しくLDLの酸化およびヒト
大動脈壁細胞混合培養でのLDL誘発単球走化性活性をブロックすることができた(デー
タは示していない)。しかしながらin vivoでは図22Aに示したように、経口投与の後
、D−4Fのみが血液循環中で無傷のままであり、HDL保護能力を強化し(図22B)
、LDL誘発単球走化性活性を低下させることができた(図22C)。125I−L−4F
または125I−D−4Fの経口投与後2時間で、L−4Fを投与されたマウスの尿は、D
−4Fを与えられたマウスの場合の約15倍の放射能活性を示した(データは示されてい
ない)。
ター欠損マウスはアテローム性硬化症病巣が79%減少することを示している。総血中コ
レステロールレベルは、D−4Fを投与されたLDLレセプター欠損マウスとリポソーム
単独または食塩水単独投与マウスで顕著な違いはなかった。総コレステロールはD−4F
群で761±69mg/dlであり、リポソーム群で677±52mg/dlであり、食
塩水群で699±31mg/dlであった。平均HDL−コレステロールレベルはD−4
F群でわずかに高く73±8.7mg/dlであったが、リポソーム群の65.9±9.
2mg/dlおよび食塩水群の67.1±6.3mg/dlと比較してこれらの相違は統
計的には有意でなかった。
、2.5mg/日/マウスでの投与と5.0mg/日/マウスでの投与に顕著な相違はな
いことが示されている。ペプチドを投与されていないアポE欠損マウスと2.5mgD−
4F/マウス/日または5.0mgD−4F/マウス/日を投与されたマウスとの間に消
費された水の量(2.5mL/日/マウス)に顕著な差はなく、さらに3つの群のアポE
欠損マウスの体重、心臓重量、または肝重量にも顕著な相違はなかった(データは示され
ていない)。さらにまた、血中総コレステロール濃度についてはD−4Fを投与されたア
ポE欠損マウスで顕著な相違はなかった(ペプチドを含まない水を与えられたマウスで4
78±149mg/dL、D−4Fを2.5mg/マウス/日で投与されたマウスで53
4±12.3mg/dL、D−4Fを5.0mg/マウス/日で投与されたマウスで57
9±4.6mg/dL)。平均HDL−コレステロールは、D−4Fを投与されたマウス
で軽度に増加したが、その相違は統計的な有意差に達しなかった(ペプチドを含まない水
を投与したマウスで32.2±7mg/dL、D−4Fを2.5mg/マウス/日で投与
されたマウスで38.7±5mg/dL、D−4Fを5.0mg/マウス/日で投与され
たマウスで43.4±6mg/dL)。
これまではアポA−IおよびアポA−I摸倣体ペプチドを薬剤として使用することには
非経口的投与の必要性から制限があった。本実験でのアテローム性硬化症病巣の目ざまし
い減少は、血中総コレステロールに顕著な変化が存在しないにもかかわらず生じた。D−
4Fを投与されたマウスではHDL−コレステロールレベルはわずかに高くなったが、こ
の相違は統計的な有意差に達しなかった。本明細書に提示した実験は、D−アミノ酸で合
成したアポA−I摸倣体ペプチドの経口投与は、アテローム性硬化症および他の酸化脂質
によって惹起される慢性炎症性疾患の予防および治療に有用であろうということを示唆し
ている。
て種々の改変または変更が当業者には示唆されるであろうが、それらは本発明あるいは特
許請求の範囲の範囲内にあることは理解されるところである。本明細書に引用した全ての
刊行物、特許および特許出願は参照によりそっくり本明細書に含まれる。
Claims (18)
- アテローム性動脈硬化症の症状を改善するペプチドであって、前記ペプチドのアミノ酸配列が、配列D−W−L−K−A−F−Y−D−K−F−F−E−K−F−K−E−F−F(配列番号7)を含む、前記アテローム性動脈硬化症の症状を改善するペプチド。
- 前記ペプチドのアミノ酸配列が配列D−W−L−K−A−F−Y−D−K−F−F−E−K−F−K−E−F−F(配列番号7)からなる請求項1に記載のペプチド。
- 前記ペプチドが全て「L」アミノ酸から構成される請求項1〜2のいずれか1項に記載のペプチド。
- 前記ペプチドが全て「D」アミノ酸から構成される請求項1〜2のいずれか1項に記載のペプチド。
- 前記ペプチドがさらに少なくとも1つの保護基を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載のペプチド。
- 前記少なくとも1つの保護基がアミノ末端および/またはカルボキシル末端に結合している請求項5に記載のペプチド。
- 第一の保護基がアミノ末端に結合しており、第二の保護基がカルボキシル末端に結合している請求項6に記載のペプチド。
- 前記第一の保護基および前記第二の保護基が、存在する場合、それぞれ別個に
アセチル、アミド、3から20個の炭素のアルキル基、Fmoc、t−boc、9−フルオレンアセチル基、1−フルオレンカルボン酸基、9−フルオレンカルボン酸基、9−フルオレノン−1−カルボン酸基、ベンジルオキシカルボニル、キサンチル(Xan)、トリチル(Trt)、4−メチルトリチル(Mtt)、4−メトキシトリチル(Mmt)、4−メトキシ−2,3,6−トリメチル−ベンゼンスルホニル(Mtr)、メシチレン−2−スルホニル(Mts),4,4−ジメトキシベンズヒドリル(Mbh)、トシル(Tos)、2,2,5,7,8−ペンタメチルクロマン−6−スルホニル(Pmc)、4−メチルベンジル(MeBzl)、4−メトキシベンジル(MeOBzl)、ベンジルオキシ(BzlO)、ベンジル(Bzl)、ベンゾイル(Bz)、3−ニトロ−2−ピリジンスルフェニル(Npys)、1−(4,4−ジメンチル−2,6−ジアキソシクロヘキシリデン)エチル(Dde)、2,6−ジクロロベンジル(2,6−DiCl−Bzl)、2−クロロベンジルオキシカルボニル(2−Cl−Z)、2−ブロモベンジルオキシカルボニル(2−Br−Z)、ベンジルオキシメチル(Bom)、t−ブトキシカルボニル(Boc)、シクロヘキシルオキシ(cHxO)、t−ブトキシメチル(Bum)、t−ブトキシ(tBuO)、t−ブチル(tBu)、アセチル(Ac)、ベンゾイル基、カルボベンゾキシ基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基およびトリフルオロアセチル(TFA)
から成る群から選択される請求項7に記載のペプチド。 - 前記第一の保護基が、ベンゾイル基、アセチル、プロペオニル、カルボベンゾキシ、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシルおよび3から20個の炭素のアルキルから成る群から選択される保護基である請求項7に記載のペプチド。
- 前記第二の保護基がアミドである請求項7に記載のペプチド。
- 前記第一の保護基がアセチルであり、前記第二の保護基がアミドである請求項7に記載のペプチド。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載のペプチドを含む医薬製剤であって、前記ペプチドが薬理学的に許容できる賦形剤と混合される前記医薬製剤。
- 前記薬理学的に許容できる賦形剤が、非経口投与、局所投与、経口投与、経鼻投与、吸入投与、直腸投与、および末梢投与から成る群から選択される経路での投与に適している請求項12に記載の医薬製剤。
- 前記薬理学的に許容できる賦形剤が経口投与に適している請求項12に記載の医薬製剤。
- 前記薬理学的に許容できる賦形剤が哺乳類への非経口投与に適している請求項12に記載の医薬製剤。
- 哺乳類におけるアテローム性動脈硬化症の予防または治療のための組成物であって、前記組成物は治療的に有効な量の請求項1〜11のいずれか1項に記載のペプチドまたは請求項12〜15のいずれか1項に記載の医薬製剤を含む前記組成物。
- 前記哺乳類がヒトである請求項16に記載の組成物。
- 前記哺乳類がヒト以外の哺乳類である請求項16に記載の組成物。
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