KR20070029198A

KR20070029198A - 고콜레스테롤혈증의 치료를 위한 역 콜레스테롤 수송의매개제

Info

Publication number: KR20070029198A
Application number: KR1020067026458A
Authority: KR
Inventors: 자가디쉬 씨. 시르카; 빅터 찰리스 바사르; 이고르 니코우린; 카시나탐 알리샬라
Original assignee: 아바니르 파마슈티컬스
Priority date: 2004-06-09
Filing date: 2005-06-09
Publication date: 2007-03-13
Also published as: WO2005123770A1; CA2568543A1; AU2005255013A1; EP1753782A1; IL179302A0; AR049081A1; JP2008509228A; PE20060082A1; MXJL06000068A; TW200603795A; US20070004644A1; BRPI0511945A; NO20070140L; UY28952A1

Abstract

본 발명은 포유류의 역 콜레스테롤 수송을 증진하는데 채택되는 조성물을 제공한다. 본 조성물은 경구 투여에 적합하며, 고콜레스테롤혈증, 아테롬성 동맥경화증 및 관련 심혈관계 질환의 치료 및/또는 예방에 유용하다.

Description

고콜레스테롤혈증의 치료를 위한 역 콜레스테롤 수송의 매개제{MEDIATORS OF REVERSE CHOLESTEROL TRANSPORT FOR THE TREATMENT OF HYPERCHOLESTEROLEMIA}

관련 출원의 상호 참고

본 출원은 2005년 4월 1일에 출원된 미국 임시특허출원 60/667,368과 2004년 6월 9일에 출원된 미국 임시특허출원 60/578,226을 35 U.S.C. § 119(e)하에 우선권으로 주장하며, 참고로 이들 내용 모두 본 출원에 포함된다.

본 발명의 배경

본 발명은 고콜레스테롤혈증 (hypercholesterolemia) 및 이와 관련된 심혈관계 질환과 다른 질환을 치료하기 위한 역 콜레스테롤 수송(Reverse Cholesterol Transport; RCT)의 소분자 매개제에 관한 것이다.

혈청내 콜레스테롤치 상승 ("고콜레스테롤혈증")이, 동맥벽 내에 콜레스테롤의 진행성 축적과 관련된 질환인 아테롬성 동맥경화증 (atherosclerosis)을 발생시키는 원인이 되는 인자라는 것은 현재 널리 정립되어 있다. 고콜레스테롤혈증과 아테롬성 동맥경화증은 고혈압, 관상 동맥 질환, 심장 마비 및 발작을 포함한 심혈관계 질환의 주요 원인이다. 미국 내에서만도 매년 약 백십만명이 심장 마 비로 고통받고 있으며, 이에 소용되는 비용은 1,170억 달러를 초과하는 것으로 추정되고 있다. 혈중 콜레스테롤 수준을 낮추기 위한 수많은 약제학적 전략이 있긴 하지만, 이들 중의 상당 수가 바람직하지 못한 부작용을 유발시키고, 안전성 측면에서 우려를 야기시킨다. 더욱이, 시판중인 약물 치료법 중의 어떠한 것도, 신체로부터 콜레스테롤을 제거시키는 데 있어 중요한 대사 경로인 역 콜레스테롤 수송을 적절히 자극하지 못하였다.

순환되고 있는 콜레스테롤은, 혈중 지질을 수송하는 복합 지질 및 단백질 조성물 입자인 혈장 지단백질에 의해 운반된다. 저밀도 지단백질 (LDL)과 고밀도 지단백질 (HDL)이 주요 콜레스테롤 운반체이다. LDL은 콜레스테롤을 간 (여기서 콜레스테롤이 합성되거나 또는 식이 공급원으로부터 수득된다)으로부터 신체 내의 간외 조직으로 전달하는데 책임이 있는 것으로 여겨진다. 용어 "역 콜레스테롤 수송"은 콜레스테롤을 간외 조직으로부터 콜레스테롤이 대사되고 제거되는 간으로 수송하는 것을 의미한다. 혈장 HDL 입자가 역 수송 과정에 있어 중요한 역할을 하여, 조직 콜레스테롤의 스캐빈저로서 작용하는 것으로 여겨진다.

아테롬성 동맥경화증 병변에 침착된 지질이 주로 혈장 LDL로부터 유래된다는 개념을 뒷받침해주는 설득력있는 증거가 제시되었기 때문에, LDL이 대중적으로 "나쁜" 콜레스테롤으로서 공지되어 왔다. 이와는 달리, 혈장 HDL 수준은 관상 심장질환과 역상관 관계이므로, 실제로 혈장 HDL 수준이 높다는 것은 마이너스 (negative) 위험 요인으로서 간주되고 있다. 고수준의 혈장 HDL이 관상 동맥 질환으로부터 보호해줄 뿐만 아니라 실제적으로 아테롬성 동맥경화증 플라 크(plaque)의 퇴행을 유도시킬 수 있는 것으로 가정되었다 [참조: Badimon과 공동연구자들 1992, Circulation 86 (Suppl. III) :86-94]. 따라서, HDLs는 대중적으로 "좋은" 콜레스테롤으로서 공지되어 왔다.

LDLs로부터 방출된 세포내 콜레스테롤의 양이 세포성 콜레스테롤 대사를 제어한다. LDLs로부터 유도된 세포성 콜레스테롤의 축적이 다음 3가지 과정을 제어한다: (1) 콜레스테롤 생합성 경로에 있어 중요한 효소인 HMGCoA 리덕타제의 합성을 중지시킴으로써 세포성 콜레스테롤 합성을 저하시키고; (2) 유입되는 LDL-유도된 콜레스테롤이, 콜레스테롤을 콜레스테릴 에스테르로 전환시켜 이를 저장 비말(droplets) 내에 침착시키는 세포성 효소인 LCAT를 활성화시킴으로써 콜레스테롤의 저장을 증진시키며; 그리고 (3) 콜레스테롤을 세포 내에 축적시키는 것이, 새로운 LDL 수용체의 세포성 합성을 억제시키는 피드백 메카니즘을 구동시킨다. 따라서, 세포는 LDL 수용체의 보체를 조정함으로써, 과부하없이 상기 수용체의 대사적 필요량을 충족시키기에 충분한 콜레스테롤이 생성되도록 한다 [참조: Brown & Goldstein, In: The Pharmacological Basis Of Therapeutics, 8th Ed., Goodman & Gilman, Pergamon Press, NY, 1990, Ch. 36, pp. 874-896].

역 콜레스테롤 수송 (RCT)은 말초 세포 콜레스테롤을 간외 조직으로 재순환하기 위해 간으로 복귀시킬 수 있거나, 또는 담즙으로서 장 내로 배출시킬 수 있는 경로이다. RCT 경로는 대부분의 간외 조직으로부터 콜레스테롤을 제거시키는 유일한 수단을 나타낸다. RCT는 주로 다음 3가지 단계로 이루어진다: (1) 콜레스테롤을 말초 세포로부터 초기 제거시키는 콜레스테롤 유출 단계; (2) 유출된 콜 레스테롤이 말초 세포 내로 재유입되는 것을 방지시켜 주는, 레시틴:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 (LCAT)의 작용에 의한 콜레스테롤 에스테르화 단계; 및 (3) HDL 콜레스테릴 에스테르를 간 세포에 흡수/전달하는 단계. LCAT는 RCT 경로에 있어 중요한 효소이고, 이는 주로 간에서 생성되며, HDL 분획과 연관된 혈장에서 순환된다. LCAT는 세포 유도된 콜레스테롤을 콜레스테릴 에스테르로 전환시키는데, 이는 제거될 것으로 예정된 HDL에 격리되어 있다. 이러한 RCT 경로는 HDLs에 의해 매개된다.

HDL은 고밀도를 특징으로 하는 지단백질 입자에 대한 일반 명칭이다. HDL 복합체의 주요 지질 구성분은 각종 인지질, 콜레스테롤 (에스테르) 및 트리글리세라이드이다. 가장 두드러진 아포지단백질 (apolipoprotein) 구성분은 HDL의 기능적 특징을 결정짓는 A-I 및 A-II이다.

각 HDL 입자는 아포지단백질 A-1 (ApoA-I)의 하나 이상의 복사물 (및 통상적으로는 2 내지 4개의 복사물)을 함유한다. ApoA-I은 신속하게 절단되어 243개 아미노산 잔기를 갖는 성숙한 폴리펩티드를 생성시키는 프로단백질 (proprotein)로서 분비되는 프레프로아포지단백질 (preproapolipoprotein)로서 간과 소장에 의해 합성된다. ApoA-I은 링커 잔기 (이는 종종 프롤린이다)에 의해 떨어져 있는 6 내지 8개의 상이한 22개 아미노산 반복체로 주로 이루어지고, 몇몇 경우에는 여러 개의 잔기로 구성된 직선물(stretch)로 이루어진다. ApoA-I은 지질과 다음 3가지 유형의 안정한 복합체를 형성한다: 프레-베타-1 HDL로서 지칭된, 지질-불충분한 작은 복합체; 프레-베타(pre-beta)-2 HDL로서 지칭된, 극성 지질 (인지질 및 콜레 스테롤)을 함유하는 편평한 원반형 입자; 및 구형 또는 성숙한 HDL (HDL₃ 및 HDL₂)로서 지칭된, 극성 지질과 비극성 지질을 둘 다 함유하는 구형 입자. 순환시 대부분의 HDL이 ApoA-I과 ApoA-II를 함유하긴 하지만, ApoA-I 만을 함유하는 HDL 분획 (AI-HDL)이 RCT에 있어 보다 유효한 것으로 여겨진다. 역학 조사는 AI-HDL이 항동맥경화성 (anti-atherogenic)이라는 가설을 뒷받침해준다[참조: Parra과 공동연구자들, 1992, Arterioscler. Thromb. 12: 701-707; Decossin과 공동연구자들, 1997, Eur. J. Clin.Invest. 27: 299-307].

생체 내에서 수득된 데이터를 근거로 한 몇 가지 증거는 HDL 및 이의 주요 단백질 구성분인 ApoA-I이 아테롬성 동맥경화증 병변을 예방하고, 잠재적으로는 플라크를 퇴행시키는데 밀접한 영향을 끼치게 하여, 이들을 치료적 개재를 위해 매력있는 표적물로 만든다. 첫째, 사람에게서 아테로마생성 (atherogenesis)과 혈청 ApoA-I (HDL) 농도 간에는 역상관 관계가 존재한다 [참조: Gordon & Rifkind, 1989, N. Eng. J. Med. 321: 1311-1316; Gordon과 공동연구자들, 1989,Circulation 79: 8-15]. 실제로, 특정 아집단의 HDL이 사람에게서 아테롬성 동맥경화증에 대한 위험 감소와 연관이 있었다 [참조: Miller, 1987, Amer. Heart 113: 589-597; Cheung과 공동연구자들, 1991, Lipid Res. 32: 383-394; Fruchart & Ailhaud, 1992, Clin. Chem. 38: 79].

둘째, 동물 연구 결과는 ApoA-I (HDL)의 보호 역할을 뒷받침해준다. 콜레스테롤-공급된 토끼를 ApoA-I 또는 HDL로 처리하면, 콜레스테롤-공급된 토끼에게 서 플라크 (지방 줄무늬)의 발생과 진행이 저하되었다 [참조: Koizumi과 공동연구자들, 1988, J. Lipid Res. 29: 1405-1415; Badimon과 공동연구자들, 1989, Lab. Invest. 60: 455-461; Badimon과 공동연구자들, 1990, J. Clin. Invest. 85: 1234-1241]. 그러나, 효능은 HDL의 공급원에 따라서 다양하였다 [참조: Beitz과 공동연구자들, 1992, Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids 47: 149-152; Mezdour과 공동연구자들, 1995, Atherosclerosis 113: 237-246].

세째, ApoA-I의 역할에 대한 직접적인 증거는 형질전환성 동물이 참여한 실험으로부터 획득하였다. 유전적으로 식이-유도된 아테롬성 동맥경화증에 걸리기 쉬운 마우스에게 전이된 ApoA-I에 대한 사람 유전자의 발현은, 대동맥 병변이 발생하지 못하도록 보호해주었다 [참조: Rubin과 공동연구자들, 1991, Nature 353: 265-267]. ApoA-I 형질전환된 유전자는 ApoE-결핍성 마우스 및 Apo(a) 형질전환성 마우스에서 아테롬성 동맥경화증을 억제시키는 것으로 또한 밝혀졌다 [참조: Paszty와 공동연구자들, 1994, J. Clin. Invest. 94: 899-903; Plump와 공동연구자들, 1994, PNAS. USA 91: 9607-9611; Liu와 공동연구자들, 1994, J. Lipid Res. 35: 2263-2266]. 유사한 결과가 사람 ApoA-I을 발현하는 형질전환성 토끼에서 관찰되었고 [참조: Duverger,1996, Circulation 94: 713-717; Duverger와 공동연구자들, 1996, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16: 1424-1429], 증가된 수준의 사람 ApoA-I이 아테롬성 동맥경화증 발생으로부터 보호시켰고 발룬 혈관형성술 이후의 재발 협착증을 억제시킨 형질전환성 랫트에서 관찰되었다 [참조: Burkey와 공동연구자들, 1992, Circulation, Supplement I, 86:I-472, Abstract No.1876; Burkey와 공동연구자들, 1995, J. Lipid Res. 36: 1463-1473].

고콜레스테롤혈증 및 기타 이상지질혈증에 대한 현 치료법

과거 20여년간, 콜레스테롤혈증 화합물을 HDL 조절제와 LDL 조절제로 분리시키고 혈중 LDL 수준을 감소시키는 것이 바람직하다는 인식에 근거하여, 수 많은 약물을 개발하게 되었다. 그러나, 이들 약물 중의 상당 수는 바람직하지 못한 부작용을 나타내고/내거나 특정 환자에게는 금기시되는데, 특히 기타 약물과 조합하여 투여되는 경우에 금기된다. 이들 약물과 치료적 전략에는 다음이 포함된다:

(1) 담즙산이 장으로부터 간으로 재순환되는 것을 차단시켜 주는 담즙산-결합성 수지 [예를 들면, 콜레스티라민(QUESTRAN LIGHT, Bristol-Myers Squibb), 및 콜레스티폴 하이드로클로라이드 (COLESTID, Pharmacia & Upjohn Company)];

(2) 콜레스테롤 생합성에 관여하는 주요 효소인 HMGCoA를 차단시킴으로써 콜레스테롤 합성을 억제하는 스타틴(statin) [예를 들면, 아스퍼질루스 (Aspergillus) 균주로부터 유래된 천연 산물인 로바스타틴 (MEVACOR, Merck & Co., Inc.), 프라바스타틴 (PRAVACHOL, Bristol-Myers Squibb Co.), 및 아토르바스타틴 (LIPITOR, Warner Lambert)];

(3) 니아신(niacin)은 VLDL의 생성을 감소시키는 수용성 비타민 B-복합체이고 LDL을 저하시키는데 유효하고;

(4) 피브레이트(fibrate)는 VLDL 분획을 감소시킴으로써 혈청 트리글리세라이드를 저하시키기 위해 사용되고, 이는 몇몇 환자 집단에서 동일한 메카니즘으로 통하여 혈장 콜레스테롤을 적당한 수준으로 감소시킬 수 있으며 [예를 들면, 클로 피브레이트 (ATROMID-S, Wyeth-Ayerst Laboratories), 및 젬피브로질 (gemfibrozil) (LOPID, Parke-Davis)];

(5) 에스트로겐 대체 요법은 갱년기 후의 여성에게서 콜레스테롤 수준을 저하시킬 수 있고;

(6) 장쇄 알파,오메가-디카르복실산은 혈청 트리글리세라이드 및 콜레스테롤을 저하시키는 것으로 보고되었으며 [참조: Bisgaier와 공동연구자들, 1998, J. Lipid Res. 39: 17-30; WO 98/30530; 미국 특허 제4,689,344호; WO 99/00116; 미국 특허 제5,756,344호; 미국 특허 제3,773,946호; 미국 특허 제4,689,344호; 미국 특허 제4,689,344; 미국 특허 제4,689,344호;및 미국 특허 제3,930,024호];

(7) 에테르 [참조: 미국 특허 제4,711,896호; 미국 특허 제5,756,544호; 미국 특허 제6,506,799호], 돌리콜의 포스페이트 [참조: 미국 특허 제4,613,593호], 및 아졸리딘디온 유도체 [참조: 미국 특허 제4,287,200호]를 포함한 기타 화합물이 혈청 트리글리세라이드 및 콜레스테롤 수준을 저하시키는 것으로 개시되었다.

콜레스테롤을 저하시키기 위해 현재 이용되고 있는 약물 중 어떠한 것도 HDL 수준을 안전하게 상승시키고 RCT를 자극하지 못하였다. 실제로, 이들 현 치료 전략의 대부분은 콜레스테롤 수송 경로, 식사 흡수 조정, 재순환, 콜레스테롤 합성, 및 VLDL 집단에 대해서 작동하는 것으로 여겨진다.

고콜레스테롤혈증을 치료하기 위한 ApoA-I 효능제(Agonist)

아테롬성 동맥경화증으로부터 보호하는데 있어서의 HDL, 즉 ApoA-I 및 이와 연관된 인지질 둘 다의 잠재적 역할 측면에서 보면, 재조합적으로 생성된 ApoA-I을 활용하는 사람 임상 시도는 UCB Belgium [참조: Pharmaprojects, Oct. 27, 1995; IMS R & D Focus, Jun. 30, 1997; Drug Status Update, 1997, Atherosclerosis 2 (6): 261-265; M. Eriksson at Congress, "The Role of HDL in Disease Prevention," Nov. 7-9, 1996, Fort Worth; Lacko & Miller, 1997, J. Lip. Res. 38: 1267-1273; and WO 94/13819]에 의해 시작되었고, 중단되었으며 외견상 다시 개시되었고, Bio-Tech (Pharmaprojects, Apr. 7, 1989)에 의해 시작되고 중단되었다. 패혈성 쇽(shock)을 치료하기 위해 ApoA-I을 사용하는 시도가 또한 수행되었다 [참조: Opal,"Reconstituted HDL as a Treatment Strategy for Sepsis," IBC's 7th International Conference on Sepsis, Apr. 28-30, 1997, Washington, D.C.; Gouni 와 공동연구자들, 1993, J. Lipid Res. 94: 139-146; Levine, WO 96/04916]. 그러나, ApoA-I의 생성 및 사용과 연관된 뜻하지 않은 많은 위험이 있기 때문에, 이를 약물로서 사용하기에는 이상적이지 못하였는데: 예를 들어, ApoA-I은 생산하기가 곤란하고 비용이 많이 드는 큰 단백질이므로, 저장 동안의 안정성, 활성 생성물의 전달 및 생체내 반감기 측면에서 상당한 제작 및 재현성 문제점을 극복해야만 한다.

이러한 단점들을 고려하여, ApoA-I을 모방하는 펩티드를 제조하기 위한 시도가 수행되었다. ApoA-I의 주요 활성이 단백질 내의 독특한 이차 구조상 특징의 다중 반복체 - 부류 A 양친매성 α-나선 [참조: Segrest, 1974, FEBS Lett. 38: 247-253; Segrest와 공동연구자들, 1990, PROTEINS: Structure, Function and Genetics 8: 103-117]의 존재에 기인된 것이기 때문에, ApoA-I의 활성을 모방하는 펩티드를 고안하고자 하는 대부분의 노력들은 부류 A-유형 양친매성 α-나선을 형성하는 펩티드를 고안하는데 집중되었다 [참조: 미국 특허 제6,376,464호 및 제6,506,799호에서의 배경 기술; 이들의 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입되어 있다].

한 연구에서, 푸쿠시마 (Fukushima)등과 공동연구자들은 동등한-친수성 면과 소수성 면을 갖는 양친매성 α-나선을 형성하도록 주기적으로 배열된 Glu, Lys 및 Leu 잔기로만 전적으로 구성된 22-잔기 펩티드 ("ELK 펩티드")를 합성하였다 [참조: Fukushima와 공동연구자들, 1979, J. Amer. Chem. Soc. 101(13): 3703-3704; Fukushima와 공동연구자들, 1980, J. Biol. Chem. 255:10651-10657]. ELK 펩티드는 ApoA-I의 198-219 단편과 41% 서열 상동성을 공유한다. ELK 펩티드는 인지질과 효과적으로 회합하고, ApoA-I의 물리적 및 화학적 특성 중의 일부를 모방하는 것으로 밝혀졌다 [참조: Kaiser와 공동연구자들, 1983,PNAS USA 80: 1137-1140; Kaiser와 공동연구자들, 1984, Science 223: 249-255; Fukushima와 공동연구자들, 1980, 상기 참조;Nakagawa와 공동연구자들, 1985, J. Am. Chem. Soc. 107: 7087-7092]. 이러한 22-잔기 펩티드의 이량체가 단량체 보다 ApoA-I를 보다 근접하게 모방하는 것으로 나중에 밝혀졌으며; 이러한 결과를 근거로 하여, 나선 절단기 (Gly 또는 Pro)에 의해 중심부에서 중단된 44량체가 ApoA-I에서 최소한의 기능적 도메인을 나타내었다고 제안되었다 [Nakagawa와 공동연구자들, 1985,상기 참조].

또 다른 연구는 "LAP 펩티드"로 불리우는 모델 양친매성 펩티드를 수반하였다 [참조: Pownall과 공동연구자들, 1980, PNAS USA 77 (6):3154-3158; Sparrow와 공동연구자들, 1981, In: Peptides: Synthesis-Structure-Function, Roch and Gross, Eds., Pierce Chem. Co., Rockford, IL, 253-256]. 본래의 아포지단백질의 단편을 이용한 지질 결합성 연구를 기준으로 하여, 몇 가지 LAP 펩티드, 즉 LAP-16, LAP-20 및 LAP-24 (각각 16, 20 및 24개 아미노산 잔기를 함유함)를 고안하였다. 이들 모델 양친매성 펩티드는 아포지단백질과 서열 상동성을 전혀 공유하지 않았으며, 아포지단백질과 회합된 부류 A-유형 양친매성 나선형 도메인과는 다른 방식으로 조직된 친수성 면을 갖도록 고안되었다 [참조: Segrest와 공동연구자들, 1992, J. Lipid Res. 33: 141-166]. 이들 연구로부터, 상기 저자는 모델 양친매성 펩티드에게 지질-결합성 특성을 부여하기 위해서는, 최소 20개 잔기 길이가 필요하다고 결론지었다.

서열 내의 상이한 위치에 프롤린 잔기를 함유하는 LAP20의 돌연변이체를 이용한 연구 결과는, 지질 결합과 LCAT 활성화간에는 직접적인 관계가 존재하지만, 펩티드 단독의 나선형 전위는 LCAT 활성화를 유발시키지 못한다는 것을 지시해주었다 [참조: Ponsin와 공동연구자들, 1986, J. Biol. Chem. 261(20): 9202-9205]. 더욱이, 펩티드의 중앙에 근접한 상기 나선 절단기 (Pro)의 존재가, 인지질 표면에 대한 친화성을 저하시킬 뿐만 아니라 LCAT를 활성화시키는 능력도 저하시켰다. 특정의 LAP 펩티드가 인지질과 결합하는 것으로 밝혀지긴 하였지만 [Sparrow와 공동연구자들, 상기 참조], LAP 펩티드가 지질의 존재하에 나선형인 정도에 관해서는 논쟁의 여지가 있다 [참조: Buchko와 공동연구자들, 1996, J. Biol. Chem. 271(6): 3039-3045; Zhong과 공동연구자들, 1994, Peptide Research 7(2): 99- 106].

세그레스트 (Segrest) 등 공동연구자들은, ApoA-I의 나선과의 서열 상동성을 전혀 공유하지 않는 18 내지 24개 아미노산 잔기로 구성된 펩티드를 합성하였다 [참조: Kannelis와 공동연구자들, 1980, J. Biol. Chem. 255 (3): 11464-11472; Segrest 와 공동연구자들, 1983, J.Biol. Chem. 258: 2290-2295]. 이들 서열은 소수성 모멘트 [참조: Eisenberg와 공동연구자들, 1982, Nature 299: 371-374] 및 전하 분포도 [참조: Segrest와 공동연구자들, 1990, Proteins 8: 103-117; 미국 특허 제4,643,988호] 측면에서 부류 A 교환 가능한 아포지단백질의 양친매성 나선형 도메인을 모방하도록 특수하게 고안되었다. 하나의 18-잔기 펩티드인 "18A" 펩티드가 모델 부류-A α-나선이 되도록 고안되었다 [Segrest와 공동연구자들, 1990, 상기 참조]. 이들 펩티드, 및 "18R" 펩티드와 같이,역 전하 분포를 지닌 기타 펩티드를 이용한 연구 결과는, 전하 분포가 활성에 있어 결정적이란 사실을 일관되게 제시해 주었으며; 역 전하 분포를 지닌 펩티드가 18A 부류-A 모방체에 비해 저하된 지질 친화성을 나타내고 지질의 존재 하에서 보다 낮은 나선 함량을 나타낸다 [참조: Kanellis와 공동연구자들, 1980, J. Biol. Chem: 255: 11464-11472; Anantharamaiah와 공동연구자들, 1985, J. Biol. Chem. 260: 10248-10255; Chung과 공동연구자들, 1985, J. Biol. Chem. 260: 10256-10262; Epand와 공동연구자들, 1987, J. Biol. Chem. 262: 9389-9396; Anantharamaiah와 공동연구자들, 1991, Adv. Exp. Med. Biol. 285: 131-140].

사람 ApoA-I의 나선 서열을 기준으로 하여 22개 아미노산 잔기를 함유하는 " 컨센서스(consensus)" 펩티드가 또한 고안되었다 [참조: Anantharamaiah와 공동연구자들, 1990, Arteriosclerosis 10(1): 95-105; Venkatachalapathi와 공동연구자들, 1991, Mol. Conformation and Biol. Interactions, Indian Acad. Sci. B: 585-596]. 이 서열은 사람 ApoA-I의 가정된 나선 각 위치에서 가장 우세한 잔기를 식별함으로써 작성되었다. 상기 언급된 펩티드와 마찬가지로, 상기 펩티드에 의해 형성된 나선은 친수성-소수성 계면에 군집된 양 전하를 띤 아미노산 잔기, 친수성 면의 중앙에 군집된 음 전하를 띤 아미노산 잔기, 및 180°미만의 소수성 각을 갖는다. 이러한 펩티드의 이량체가 LCAT를 활성화시키는데 있어서 다소 유효하긴 하지만, 단량체는 불량한 지질 결합 특성을 나타내었다 [Venkatachalapathi와 공동연구자들, 1991, 상기 참조].

상기 언급된 펩티드를 이용한 시험관내 연구를 주로 근거로 하여, ApoA-I의 기능을 모방하는 펩티드를 고안하는데 있어 일종의 "법칙"이 생겨났다. 중요하게는, 친수성-소수성 계면에 군집된 양 전하를 띤 아미노산 잔기와, 친수성 면의 중앙에 군집된 음 전하를 띤 아미노산 잔기를 갖는 양친매성 α-나선이 지질 친화성과 LCAT 활성화에 요구되는 것으로 여겨진다[Venkatachalapathi와 공동연구자들, 1991, 상기 참조]. Anantharamaiah와 공동연구자들은 또한, α-나선의 소수성 면 내에 위치한, 컨센서스 22량체 펩티드의 위치 13에서의 음 전하를 띤 Glu 잔기가 LCAT 활성화에 있어 중요한 역할을 한다고 언급하였다[Anantharamaiah와 공동연구자들, 1991, 상기 참조]. 더욱이, Brasseur은 180° 미만의 소수성 각 (pho angle)이, 최적의 지질-아포지단백질 복합체 안정성을 위해 요구되고, 또한 지질 이층 가장자리 주변에 펩티드를 갖는 원반형 입자가 형성되는 것의 원인이 되기도 한다고 언급하였다 [참조: Brasseur, 1991, J. Biol. Chem. 66 (24): 16120-16127]. Rosseneu 등 공동연구자들은 또한, 180° 미만의 소수성 각이 LCAT 활성화에도 요구된다고 보고하였다 (WO 93/25581).

그러나, ApoA-I 효능제를 고안하기 위한 "법칙"을 설명하는데 있어서 진전사항에도 불구하고, 현재 가장 우수한 ApoA-I 효능제는 본래 ApoA-I 활성의 40% 미만을 보유하고 있는 것으로 보고되었다. 당해 분야의 문헌에 보고된 펩티드 효능제 중의 어떠한 것도 약물로서 유용한 것으로 입증된 것은 없었다. 따라서, ApoA-I의 활성을 모방하고 생산하기가 비교적 간단하며 비용 면에서 효과적인 안정한 분자를 개발할 필요가 있다. 바람직하게는, 후보 분자가 간접 및 직접 RCT 둘 다를 매개하는 것이다. 이러한 분자는 기존의 펩티드 효능제 보다 작고, 보다 광범위한 기능적 스펙트럼을 지닐 것이다. 그러나, 효능있는 RCT 매개제를 고안하기 위한 "법칙"은 충분히 밝혀지지 않았으며, ApoA-I의 기능을 갖는 유기 분자를 고안하기 위한 원리 역시 공지되어 있지 않다.

발명의 요약

하기 구조를 포함하는 역 콜레스테롤 수송 매개제가 기재되어 있다.

여기에서, A, B, 및 C는 임의의 순서일 수 있으며

A는 산성 기와 그의 바이오이소스테레(bioisostere)를 함유하는 아미노산과 그의 유사체를 함유하고,

B는 친지질성 기를 함유하는 아미노산과 그의 유사체를 함유하고, 그리고

C는 염기성 기와 그의 바이오이소스테레를 함유하는 아미노산과 그의 유사체를 함유하며,

상기에서 알파 아미노 또는 알파 카르복시기중의 적어도 하나는 그의 각 아미노 또는 카르복시 말단 아미노산 또는 그의 유사체로부터 제거된다.

만약 제거되지 않는다면, 상기 알파 아미노기는 바람직하게는, 아세틸, 페닐아세틸, 벤조일, 피볼릴, 9-플루오레닐메틸옥시카보닐, 2-나프틸산, 니코틴산, CH₃-(CH₂)n-CO-[여기서, n은 1 내지 20이다], 디-t-부틸-4-히드록시-페닐, 나프틸, 치환된 나프틸, FMOC, 비페닐, 치환된 페닐, 치환된 헤테로사이클, 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 사이클로알킬, 융합 사이클로알킬, 포화 헤테로아릴, 및 치환된 포화 헤테로 아릴로 이루어진 군에서 선택된 보호기로 캡핑된다.

만약 제거되지 않는다면, 상기 알파 카르복시기는 바람직하게는, 아민, 예컨대, RNH (여기서, R은 H, 디-t-부틸-4-히드록시-페닐, 나프틸, 치환된 나프틸, FMOC, 비페닐, 치환된 페닐, 치환된 헤테로사이클, 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 사이클로알킬, 융합 사이클로알킬, 포화 헤테로아릴, 및 치환된 포화 헤테로아릴이다)로 구성된 군에서 선택된 보호기로 캡핑된다.

산성 기의 바이오이소스테레는 하기로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다:

염기성 기의 바이오이소스테레는 하기로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다:

한 양태에서, 하프-디누디드 매개제(a half-denuded mediator)는 하기 구조를 가질 수 있다:

상기에서 X₁은

이고

상기에서 X₂는 F, Cl, Br, I, C_0-6 알킬, OCH₃, CF₃ 또는 OCF₃이고,

상기에서 X₃는 Cl, C_0-6알킬, OCH₃이며

상기에서 n는 1 또는 2이다.

한 양태에서, 하프-디누디드 매개제는 글루타릭(Glutaric)-BIP-R-NH₂, 글루타릭-bip-r-NH₂, Ac-E-BIP-아그마틴(Agmatine), Ac-e-bip-아그마틴, Ac-R-BIP-GABA, Ac-r-bip-GABA, 4-구아니디노부타닉(butanoic)-BIP-E-NH₂, 4-구아니디노부타닉-bip-e-NH₂, 글루타릭-BIP-K-NH₂, 및 글루타릭-bip-k-NH₂으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

다른 양태에서, 하프-디누디드 매개제는 2,2-디메틸글루타릭-f-r-NH₂, 2,2-디메틸글루타릭-F-R-NH₂, 글루타릭-F-R-NH₂, 글루타릭-f-r-NH₂, 숙시닉(Succinic)-bip-r-NH₂, 숙시닉-BIP-R-NH₂, 숙시닉-F-R-NH₂, 숙시닉-f-r-NH₂, 2,2-디메틸글루타릭-bip-r-NH₂, 2,2-디메틸글루타릭-BIP-R-NH₂, 디메틸숙시닉-bip-r-NH₂, 디메틸숙시닉 -BIP-R-NH₂, 글루타릭-F-K-NH₂, 숙시닉-F-K-NH₂, 숙시닉-f-k-NH₂, 2,2-디메틸글루타릭-F-K-NH₂, 2,2-디메틸글루타릭-f-k-NH₂, 디메틸숙시닉-f-k-NH₂, 디메틸숙시닉-F-K-NH₂, 디메틸숙시닉-Aic-r-NH₂, 2,2-디메틸글루타릭-Aic-r-NH₂, 글루타릭-Aic-r-NH₂, 숙시닉-Aic-r-NH₂, 글루타릭-Aic-R-NH₂, 테트라졸아미드글루타릭-BIP-R-NH₂, 3,3-디메틸글루타릭-Aic-R-NH₂, 디메틸숙시닉-Aic-R-NH₂, 및 2,2-디메틸글루타릭-Aic-R-NH₂로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 바람직한 양태에 따라 완전 디누디드(fully-denuded) 매개제는 하기로 구성된 군에서 선택될 수 있다:

바람직한 양태에서, 본 발명의 매개제는 글루타릭-bip-r, E-BIP-아그마틴, (4-카르바모일부틸)구아니딘-BIP-E, 글루타릭-bip-k, (4-카르바모일부틸)구아니딘-bip-GABA, (4-카르바모일부틸)구아니딘-BIP-GABA, 글루타릭-Aic-아그마틴, (4-카르바모일부틸)구아니딘-phe-GABA, 4,4-디메틸글루타릭-phe-아그마틴, Dimet.글루타릭-F-R, 글루타릭-F-R, 글루타릭-f-r, 숙시닉-bip-r, 숙시닉-BIP-R, 숙시닉-f-r, Dimet.글루타릭-bip-r, Dimet.글루타릭-BIP-R, Dimet.숙시닉-BIP-R, 숙시닉-phe-k, Dimet.숙시닉-phe-k, Dimet.숙시닉-Phe-K, 3,3-디메틸글루타릭-phe-아그마틴, Dimet.숙시닉-Aic-r, 글루타릭-f-(에타노)아그마틴, 글루타릭-Aic-r, 숙시닉-Aic-r, 글루타릭-Aic-R, (lH-테트라졸-5-5-일)글루타르아미드-BIP-R, 2,2-디메틸숙시닉-Phe-아그마틴, Dimet.숙시닉-Aic-R, 3,3-스피로시클로펜틸글루타릭-Phe-아그마틴, 3,3-디메틸글루타릭-F-아그마틴, 글루타릭-Phe-아그마틴(Bis-Boc), 글루타릭-f-시아노아그마틴, 글루타릭(테트라졸아미드)-BIP-아그마틴(피리미딘), 숙시닉-BIP-아 그마틴(피리미딘), 3,3-스피로시클로헥실글루타릭-bip-아그마틴(피리미딘), 3,3-디메틸글루타릭-bip-아그마틴(피리미딘), 3,3-스피로시클로펜틸글루타릭-Aic-아그마틴(피리미딘), 3,3-디메틸글루타릭-Aic-아그마틴(피리미딘), 3,3-스피로시클로펜틸글루타릭-Phe-3-(디메틸아미노)부탄, 4,4-디메틸글루타릭-bip-아그마틴(피리미딘), 및 3,3-스피로시클로펜틸글루타릭-bip-3-(디메틸아미노)프로판으로 구성되는 군에서 선택되며, 상기에서 임의의 미유도화된 아미노 및/또는 카르복시 말단 아미노산은 보호기로 캡핑된다.

다른 바람직한 양태에서, 상기 매개제는 Dimet.숙시닉-phe-k, Dimet.글루타릭-F-R, 또는 글루타릭-F-R로부터 선택될 수 있다.

반드시 나타나는 것은 아니지만, 바람직한 매개제의 상기 목록에서 임의의 아미노 및/또는 카르복시 말단 아미노산 잔기는 보호기로 캡핑된다. 따라서, 만약 제거되지 않는다면, 알파 아미노기는 아세틸 또는 디-t-부틸-4-히드록시-페닐과 같은 보호기로 캡핑된다. 마찬가지로 만약 제거되지 않는다면 알파 카르복시기는 아민 또는 디-t-부틸-4-히드록시-페닐과 같은 보호기로 캡핑된다. 물론 여기에 개시된 임의의 보호기가 사용될 수도 있다.

바람직한 양태의 상세한 설명

본 발명의 바람직한 양태에서 RCT의 매개제는 ApoA-I 기능과 활성을 모방한다. 광범위한 측면에서, 이러한 매개제는 3가지 영역, 즉 산성 영역, 친지질성 (예: 방향족) 영역 및 염기성 영역을 포함하는 분자이다. 이들 분자는 바람직하게는, 양전하를 띤 영역, 음전하를 띤 영역 및 전하를 띠지 않는 친지질성 영역 을 함유한다. 서로에 대한 이들 영역의 위치는 분자들 간에 다양할 수 있으므로, 따라서 바람직한 양태에서는, 상기 분자가 각 분자 내의 3가지 영역의 상대적 위치에 상관없이 RCT를 매개한다. 반면, 몇몇 바람직한 양태에서는, 분자 주형(template) 또는 모델이, RCT의 매개제를 형성하기 위해 어떠한 순서로든 연결되어 있는, 산성 아미노산-유도된 잔기, 친지질성 아미노산-유도된 잔기, 및 염기성 아미노산-유도된 잔기를 포함하고; 기타 바람직한 양태에서는, 분자 모델이 산성, 친지질성 및 염기성 영역을 갖는 단일 잔기, 예를 들면, 아미노산인 페닐알라닌에 의해 구현될 수 있다.

몇몇 바람직한 양태에서는, RCT의 분자 매개제가 천연 D- 또는 L-아미노산, 아미노산 유사체 (합성 또는 반합성) 및 아미노산 유도체의 삼량체를 포함한다. 예를 들어, 삼량체는 산성 아미노산 잔기 또는 이의 유사체, 방향족 또는 친지질성 아미노산 잔기 또는 이의 유사체, 및 염기성 아미노산 잔기 또는 이의 유사체를 포함할 수 있는데, 이들 잔기는 펩티드 또는 아미드 결합 연쇄에 의해 연결되어 있다. 예를 들어, 삼량체 서열 EFR은 산성 잔기 (글루탐산), 방향족 잔기 (페닐알라닌) 및 염기성 아미노산 잔기 (아르기닌)를 포함한다. RCT의 분자 매개제는 직접적 및/또는 간접적 RCT 경로를 증강시켜 혈청 콜레스테롤 수준을 저하시키는(즉, 콜레스테롤 유출을 증가시킴) 공통점, LCAT를 활성화시킬 수 있는 능력과 혈청 HDL 농도를 증가시킬 수 있는 능력을 공유하고 있다.

다른 바람직한 양태에서, 역 콜레스테롤 수송의 매개제는 바람직하게는 산성기, 친지질성 기 그리고 염기성 기를 함유하며, 서열 X1-X2-Y3, Y1-X2-X3 또는 Y1- X2-Y3(X1는 산성 아미노 또는 그의 유사체이고, X2는 방향족 또는 친지질성 아미노산 또는 그의 유사체이고, X3는 염기성 아미노산 또는 그의 유사체이며, Y1은 알파 아미노기를 가지지 않은 산성 아미노산 유사체이고 그리고 Y3는 알파 카르복시기를 가지지 않는 염기성 아미노산이다)을 함유한다. 아미노 말단 알파 아미노기가 존재할 경우(예컨대 X1), 제1보호기를 추가로 함유하며, 카르복시 말단 알파 카르복시기가 존재할 경우(예컨대 X3), 제2보호기를 추가적으로 함유한다. 제1(아미노말단)보호기는 바람직하게는, 아세틸, 페닐아세틸, 피볼릴, 2-나프틸산, 니코틴산, CH₃-(CH₂)n-CO- [여기서, n은 1 내지 20이다], 그리고 아세틸, 페닐아세틸, 디-t-부틸-4-히드록시-페닐, 나프틸, 치환된 나프틸, FMOC, 비페닐, 치환된 페닐, 치환된 헤테로사이클, 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 사이클로알킬, 융합 사이클로알킬, 포화 헤테로아릴, 치환된 포화 헤테로아릴 등의 아미드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 제2(카르복시 말단)보호기는 바람직하게는 아민, 예를 들면, RNH₂ (여기서, R은 디-t-부틸-4-히드록시-페닐, 나프틸, 치환된 나프틸, FMOC, 비페닐, 치환된 페닐, 치환된 헤테로사이클, 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 사이클로알킬, 융합 사이클로알킬, 포화 헤테로아릴, 치환된 포화 헤테로아릴 등이다)로 구성된 군에서 선택된다. 산성, 친지질성, 염기성 아미노산(또는 그의 유사체)는 분자 모델의 기본적인 기능을 보유하는 화합물을 제공하도록 하는 어떤 모든 가능한 방법으로 조합될 수 있다.

다른 양태에서, 매개제는 약 3 내지 10개 아미노산의 펩티드와 같은 큰 실 체 혹은 분자에 삽입될 수 있다.

여기에서 사용된 용어 "아미노산"은 또한 일반식 NH₂-CHR-COOH(R은 다수의 상이한 측쇄중의 하나이다)의 분자 또는 모 아미노산을 함유하는 펩티드내 잔기를 지칭한다. "R"은 20개의 유전적으로 암호화된 아미노산중의 하나인 것을 지칭하는 치환기일 수 있다. "R"은 또한 20개의 유전적으로 암호화된 아미노산이 아닌 치환기가 될 수 있다. 여기에서 사용된, "아미노산 잔기"는 다른 아미노산과 연결될 때 물 분자를 잃어버린 후 남아 있는 아미노산의 부분을 말한다. 여기에서 사용된, "아미노산 유사체"는 적어도 하나의 원소에 의해 아미노산 모화합물과 차이가 있는 구조적 유사체, 예컨대 산성 R기가 그의 바이오이소스테레로 치환된 알파 아미노기 또는 산성 아미노산을 말한다. 본 발명의 "하프-디누디드" 혹은 "디누디드"와 같은 양태는 이들 버전이 알파 아미노 혹은 카르복시기와 같은 적어도 하나 이상의 요소가 누락됨으로써 전통적인 아미노산 구조와 상이하기 때문에 아미노산 유사체를 함유한다. "개질된 아미노산"이란 용어는 더욱 구체적으로 20개의 유전적으로 암호화된 아미노산중의 하나에 상응하지 않는 "R" 치환기를 갖는 아미노산, 예컨대 광범위한 분류의 아미노산 유사체내에 속하는 개질된 아미노산을 말한다

여기에서 사용된 "완전 보호된"이란 아미노와 카르복시 말단 둘다가 보호기를 함유하는 바람직한 양태를 말한다

여기에서 사용된 "하프-디누디드"란 알파 아미노기 혹은 알파 카르복시기중 의 하나가 각 아미노 또는 카르복시 말단 아미노산 잔기 혹은 그의 유사체에서 누락되어 있는 바람직한 양태를 말한다. 잔류 알파 아미노 또는 알파 카르복시기는 보호기로 캡핑된다

여기에서 사용된 "디누디드" 혹은 "완전-디누디드"란 알파 아미노 및 알파 카르복시기가 각 아미노 혹은 카르복시 말단 잔기 또는 그의 유사체로부터 제거되어 있는 바람직한 양태를 말한다.

특정 화합물이 토우토머 형태로 존재할 수 있다. 거울상 이성질체와 입체 이성질체를 함유하는 모든 그러한 이성질체는 본 양태에 포함된다. 특정 화합물이 토우토머 형태 또는 그의 혼합물로 존재하는 것으로 가정된다.

RCT 매개

현재, ApoA-I 효능제를 고안하고자 하는 노력들은 22-량체 단위 구조, 예를 들면, 지질의 존재 하에 양친매성 α-나선을 형성할 수 있는 "컨센서스 22-량체(consensus 22-mer)" [참조: Anantharamaiah와 공동연구자들, 1990, Arteriosclerosis 10 (1):95-105; Venkatachalapathi와 공동연구자들, 1991, Mol. Conformation and Biol. Interactions, Indian Acad. Sci. B: 585-596]에 중점을 두었다 [참조, 미국 특허 제6,376,464호는 컨센서스 22-량체의 변형으로부터 유도된 펩티드 모방체에 관한 것이다]. 비교적 짧은 펩티드를 사용할 경우에는 보다 긴 22-량체를 사용한 경우와 비교해서 몇 가지 이점이 있다. 예를 들어, 보다 짧은 RCT 매개제는 제조하기가 보다 용이하고 비용이 덜 들며, 화학적 및 입체 형태적으로 보다 안정하며, 바람직한 입체 형태가 비교적 강건하게 유지되고, 펩티 드 쇄 내에서 세포내 상호 작용이 거의 없거나 전혀 없으며, 보다 짧은 펩티드는 경구 이용 효율이 보다 높다. 보다 짧은 이들 펩티드의 다중 복사물은 HDL 또는 LDL과 결합할 수도 있어, 보다 제한된 큰 펩티드의 동일한 효과를 가져다 준다. ApoA-I 다기능성이 이의 다중 α-나선형 도메인에 기인된 것일 수 있긴 하지만, 심지어 ApoA-I의 단일 기능, 예를 들면, LCAT 활성화 조차도, α-나선형 도메인 중의 하나 이상에 의해 반복적 방식으로 매개될 수도 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 국면에서는, ApoA-I의 다중 기능이, 단일 서브-도메인에 관해 언급된 RCT의 매개제에 의해 모방될 수 있다.

ApoA-I의 3가지 기능적 특징이 ApoA-I 효능제 고안에 대한 중요한 기준으로서 널리 허용되고 있다: (1) 인지질과 회합할 수 있는 능력; (2) LCAT를 활성화시킬 수 있는 능력; 및 (3) 세포로부터의 콜레스테롤 유출을 증진시킬 수 있는 능력. 바람직한 양태의 일부 모델에 따른 RCT의 분자 매개제는 마지막 기능적 특징, 즉 RCT를 증가시킬 수 있는 능력만을 나타낼 수 있다. 그러나, 종종 간과되기도 하는 ApoA-I의 꽤 많은 다른 특성들이 ApoA-I를 치료적 개재를 위해 특히 매력있는 표적물로 만든다. 예를 들어, ApoA-I은 콜레스테롤이 수용체-매개된 과정을 통하여 간 내로 유출되도록 지시하고, PLTP 구동된 반응을 통하여 프레-β-HDL (말초 조직으로부터 콜레스테롤의 일차 수용체) 생성을 매개한다. 그러나, 이러한 특징들은 ApoA-I 모방 분자의 잠재적 유용성을 확대시켜 준다. 이와 같이, ApoA-I 모방 기능을 바라보는 전적으로 새로운 접근법은 본원에 기재된 펩티드 또는 아미노산-유도된 소분자를 사용할 수 있게 하여, 직접적인 RCT (HDL 경로를 통함) 뿐만 아니라 간접적인 RCT (즉, 간으로의 유출을 제지함으로써, LDLs가 순환되지 못하게 방해하기 위함)을 촉진시킬 것이다. 간접적 RCT를 증강시킬 수 있도록 하기 위해, 본 발명의 분자 매개제는 바람직하게는, 인지질과 회합하고, 간과 결합할 수 있을 것이다 (즉, 간 지단백질 결합성 부위에 대한 리간드로서 제공하기 위함).

따라서, 본 발명의 바람직한 양태를 선도하는 연구 조사의 목표는 우선적인 지질 결합성 입체 형태를 나타내고, 직접적 및/또는 간접적 역콜레스테롤 수송을 촉진시킴으로써 간으로의 콜레스테롤 유출을 증가시키며, 혈장 지단백질 구배를 개선시키고, 그 결과로서 아테롬성 동맥경화증 병변의 진행을 후속 방지시키고/시키거나 이러한 병변의 퇴행을 증진시키는, RCT의 매개제를 확인, 고안 및 합성하는 것이었다.

바람직한 양태의 RCT의 매개제는 안정한 벌크 또는 단위 투여 형태, 예를 들면, 동결건조된 생성물로 제조할 수 있는데, 이는 생체 내에서 사용하기 전에 재구성하거나 또는 다시 제형화할 수 있다. 바람직한 양태에는 고지질혈증, 고콜레스테롤혈증, 관상 심장 질환, 아테롬성 동맥경화증, 당뇨병, 비만, 알쯔하이머병, 다발성 경화증, 감염과 같은 고지질혈증 및 기타 질환, 예를 들면, 패혈성 쇽을 유발시키는 내독소혈증을 치료하는데 있어서의 약제학적 제형, 및 상기 제제의 용도가 포함된다.

바람직한 양태는 RCT의 매개제가 혈장의 HDL 및 LDL 성분과 회합하고, HDL 및 프레-β-HDL 입자의 농도를 증가시켜 줄 수 있으며, LDL의 혈장 수준을 저하시 킨다는 것을 입증해 주는 작동 실시예에 의해 예시된다. 이로써, 직접적 및 간접적 RCT가 증진된다. 바람직한 양태의 RCT의 매개제는 사람 간세포 (HepG2 세포)에서 사람 LDL 매개된 콜레스테롤 축적을 증가시켜준다. RCT의 매개제는 또한, PLTP를 활성화시키는데 효율적이므로, 프레-β-HDL 입자의 형성을 증진시켜 준다. HDL 콜레스테롤의 증가는, RCT에서의 LCAT 연루성 (LCAT 활성화가 직접적으로 (시험관내에서) 제시되지는 않았다)의 간접적 증거로서 제공되었다. 동물 모델의 생체 내에서 본 발명의 RCT 매개제를 사용하면, 혈청 HDL 농도가 증가한다.

바람직한 양태들은 하프 디누디드 버전 및 디누디드 버전을 포함하는 RCT의 매개제의 조성과 구조; RCT의 매개제 구조내 사용가능한 개질 아미노산; 구조적 및 기능적 특성 확인; 벌크 및 단위 투여 제형의 제조 방법; 및 사용 방법에 관해 서술된, 하기 세부항목에서 보다 상세히 제시된다.

매개제의 구조와 기능

바람직한 양태의 RCT의 매개제는 ApoA-I의 활성을 모방하는 일반적으로 적어도 하나의 아미노산 유사체를 갖는 펩티드 또는 이의 유사체이다. 몇몇 양태에서는, 펩티드 내의 하나 이상의 아미드 결합을 치환된 아미드, 아미드의 이소스테레, 또는 아미드 모방체로 대체된다. 부가적으로, 하나 이상의 아미드 결합을, 매개제의 구조 또는 활성을 실질적으로 방해하지 않는 매개제 모방체 또는 아미드 모방 잔기로 대체시킬 수 있다. 적합한 아미드 모방 잔기는, 예를 들어, 문헌 [참조: Olson과 공동연구자들, 1993, J. Med. Chem. 36: 3039-3049]에 기재되어 있다. 다른 바람직한 양태에서, 산성 및/또는 염기성 R기는 그의 바이오이소스테 레로 대체되었다.

본원에 사용된 바와 같은, 유전적으로 암호화된 L-에난티오머성 아미노산에 대한 약어는 통상적이며 다음과 같다. D-아미노산은 소문자로 명명되는데, 예를 들면, D-알라닌 = a 등이다:

아미노산	1 문자 약호	통상 약호
알라닌	A	Ala
아르기닌	R	Arg
아스파라긴	N	Asn
아스파라트산	D	Asp
시스테인	C	Cys
글루타민	Q	Gln
글루탐산	E	Glu
글리신	G	Gly
히스티딘	H	His
이소루이신	I	Ile
루이신	L	Leu
라이신	K	Lys
페닐알라닌	F	Phe
프롤린	P	Pro
세린	S	Ser
트레오닌	T	Thr
트립토판	W	Trp
타이로신	Y	Tyr
발린	V	Val

RCT의 매개제 중의 특정의 아미노산 잔기는, 이러한 매개제의 활성에 상당히 불리한 영향을 미치지 않으면서, 많은 경우에는 심지어 이러한 활성을 증강시키면서 기타 아미노산 잔기 또는 그의 유사체로 대체시킬 수 있다. 따라서, 해당 구조 내의 하나 이상의 규정된 아미노산 잔기를 또 다른 아미노산 잔기 또는 유도체 및/또는 이의 유사체로 치환시킨, RCT의 매개제의 변형 또는 돌연변이된 형태가 또한 바람직한 양태로 고려된다. 본 발명의 바람직한 양태에서는 이러한 아미노산 치환이 보존적이라는 것, 즉 대체하는 아미노산 잔기 또는 그의 유사체가 대체되는 아미노산 잔기와 유사한 물리적 및 화학적 특성을 지니고 있다는 것을 인지해야 할 것이다.

보존적 아미노산 치환을 결정하기 위해서는, 아미노산을 주로 아미노산 측쇄의 물리적-화학적 특징에 따라서 2가지 주요 카테고리, 즉 친수성 및 소수성으로 분류하는 것이 편리할 수 있다. 이들 2가지 주요 카테고리는 아미노산 측쇄의 특징을 보다 명료하게 규정시켜 주는 서브-카테고리로 더욱더 분류될 수 있다. 예를 들어, 친수성 아미노산 부류는 산성, 염기성 및 극성 아미노산으로 추가로 재분류될 수 있다. 소수성 아미노산 부류는 비극성 및 방향족 아미노산으로 추가로 재분류될 수 있다. ApoA-I을 규정하는 아미노산의 각종 카테고리의 정의는 다음과 같다:

용어 "친수성 아미노산"은 문헌 [Eisenberg와 공동연구자들, 1984, J. Mol. Biol. 179: 125-142]의 규정화된 컨센서스 소수성 등급에 따라서 0 미만의 소수성을 나타내는 아미노산을 지칭한다. 유전적으로 암호화된 친수성 아미노산에는 Thr (T), Ser (S), His (H), Glu (E), Asn (N), Gln (Q), Asp (D), Lys(K) 및 Arg (R)이 포함된다.

용어 "소수성 아미노산"은 문헌 [참조: Eisenberg, 1984, J. Mol. Biol. 179: 125-142]의 규정화된 컨센서스 소수성 등급에 따라서 0 초과의 소수성을 나타내는 아미노산을 지칭한다. 유전적으로 암호화된 소수성 아미노산에는 Pro (P), Ile (I), Phe (F), Val(V), Leu (L), Trp (W), Met (M), Ala (A), Gly (G) 및 Tyr (Y)가 포함된다.

용어 "산성 아미노산"은 측쇄 pK 값이 7 미만인 친수성 아미노산을 지칭한다. 산성 아미노산은 전형적으로, 수소 이온의 상실로 인해 생리적 pH에서 음전하를 띤 측쇄를 갖는다. 유전적으로 암호화된 산성 아미노산에는 Glu (E) 및 Asp(D)가 포함된다.

용어 "염기성 아미노산"은 측쇄 pK 값이 7 초과인 친수성 아미노산을 지칭한다. 염기성 아미노산은 전형적으로, 하이드로늄 이온과의 회합으로 인해 생리적 pH에서 양전하를 띤 측쇄를 갖는다. 유전적으로 암호화된 염기성 아미노산에는 His (H), Arg (R) 및 Lys (K)가 포함된다.

용어 "극성 아미노산"은 생리적 pH에서는 전하를 띠지 않지만, 2개 원자에 의해 공통으로 공유된 전자 쌍이 이들 원자 중의 하나에 의해 보다 밀접하게 유지되는 하나 이상의 결합을 갖는 측쇄를 지닌 친수성 아미노산을 지칭한다. 유전적으로 암호화된 극성 아미노산에는 Asn (N), Gin (Q), Ser (S) 및 Thr (T)가 포함된다.

용어 "비극성 아미노산"은 생리적 pH에서 전하를 띠지 않고, 2개 원자에 의해 공통으로 공유된 전자 쌍이 2개 원자 각각에 의해 일반적으로 동등하게 유지되는 결합을 갖는 측쇄를 지닌 소수성 아미노산을 지칭한다 (즉, 상기 측쇄는 극성이 아니다). 유전적으로 암호화된 비극성 아미노산에는 Leu (L), Val (V), Ile (I), Met (M), Gly (G) 및 Ala (A)가 포함된다.

용어 "방향족 아미노산"은 하나 이상의 방향족 또는 헤테로방향족 환을 갖는 측쇄를 수반한 소수성 아미노산을 지칭한다. 방향족 또는 헤테로방향족 환은 하나 이상의 치환체, 예를 들면, -OH, -SH, -CN, -F, -Cl, -Br, -I, -NO₂, -NO, -NH₂, -NHR, -NRR, -C(O)R, -C(O)OH, -C(O)OR, -C(O)NH₂, -C(O)NHR, -C(O)NRR 등을 함유할 수 있고, 여기서 각 R은 독립적으로, (C_l-C₆)알킬, 치환된 (C_l-C₆)알킬, (C_l-C₆)알케닐, 치환된 (C_l-C₆)알케닐, (C_l-C₆)알키닐, 치환된 (C_l-C₆)알키닐, (C₅-C₂₀)아릴, 치환된 (C₅-C₂₀) 아릴, (C₆-C₂₆) 알카릴, 치환된 (C₆-C₂₆) 알카릴, 5 내지 20원의 헤테로아릴, 치환된 5 내지 20원의 헤테로아릴, 6 내지 26원의 알크헤테로아릴 또는 치환된 6 내지 26원의 알크헤테로아릴이다. 유전적으로 암호화된 방향족 아미노산에는 Phe (F), Tyr (Y) 및 Trp (W)가 포함된다.

용어 "지방족 아미노산"은 지방족 탄화수소 측쇄를 갖는 소수성 아미노산을 지칭한다. 유전적으로 암호화된 지방족 아미노산에는 Ala (A), Val (V), Leu (L) 및 Ile (I)가 포함된다.

아미노산 잔기 Cys (C)는 기타 Cys (C) 잔기 또는 기타 설파닐-함유 아미노산과 디설파이드 브릿지를 형성할 수 있다는 점에서 특이하다. 환원된 유리 -SH 또는 산화된 디설파이드-브릿지 형태로 펩티드 내에 존재할 수 있는 Cys (C) 잔기 (및 -SH 함유 측쇄를 수반한 기타 아미노산)의 능력은, Cys (C) 잔기가 특정 펩티드에 알짜 소수성 형질을 부여하는지 알짜친수성 형질을 부여하는지에 대해 영향을 미친다. Cys (C)가 문헌 [Eisenberg, 1984, 상기 참조]의 규정화된 컨센서스 등급에 따라서 0.29의 소수성을 나타내긴 하지만, 본 발명의 목적상 Cys (C)는 상기 규정된 일반적인 분류법에도 불구하고, 극성 친수성 아미노산으로서 분류된다는 것을 인지해야 한다.

당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 상기 규정된 카테고리는 상호 배타적이지 않다. 따라서, 2가지 이상의 물리-화학적 특성을 나타내는 측쇄를 갖는 아미노산은 다중 카테고리에 포함될 수 있다. 예를 들어, 극성 치환체, 예를 들면, Tyr (Y)에 의해 추가로 치환되는 방향족 잔기를 갖는 아미노산 측쇄는 방향족 소수성 특성과, 극성 또는 친수성 특성 둘 다를 나타낼 수 있으므로, 방향족 카테고리와 극성 카테고리 둘 다에 포함될 수 있다. 모든 아미노산의 적당한 분류화는 특히 본원에 제공된 상세한 설명을 비추어 당업자에게 명백할 것이다.

상기 규정된 카테고리가 유전적으로 암호화된 아미노산 관점에서 예시되긴 하였지만, 아미노산 치환이 반드시 이러한 유전적으로 암호화된 아미노산일 필요는 없고, 바람직한 특정 양태에서는 상기 유전적으로 암호화된 아미노산으로만 제한되지 않는다. 실제로, RCT의 바람직한 매개제의 상당 수가 유전적으로 암호화되지 않은 아미노산을 함유한다. 따라서, 천연의 유전적으로 암호화된 아미노산 이외에도, RCT의 매개제 내의 아미노산 잔기는 천연의 암호화되지 않은 아미노산 및 합성 아미노산으로 치환시킬 수 있다.

RCT의 매개제에 대해 유용한 치환을 제공해 주는, 흔히 직면하는 특정의 아미노산에는 β-알라닌 (β-Ala) 및 기타 오메가-아미노산, 예를 들면, 3-아미노프로피온산, 2,3-디아미노프로피온산(Dpr), 4-아미노부티르산 등; α-아미노이소부티르산(Aib); ε-아미노헥사노산(Aha); δ-아미노발레르산(Ava); N-메틸글리신 또는 사르코신(MeGly); 오르니틴(Orn); 시트룰린(Cit); t-부틸알라닌(t-BuA); t-부틸글리신(t-BuG); N-메틸이소루이신(MeIle); 페닐글리신(Phg); 사이클로헥실알라닌 (Cha); 노르루이신(NIe); 나프틸알라닌(Nal); 4-페닐페닐알라닌, 4-클로로페닐알라닌(Phe(4-Cl)); 2-플루오로페닐알라닌(Phe(2-F)); 3-플루오로페닐알라닌(Phe(3-F)); 4-플루오로페닐알라닌(Phe(4-F)); 페니실라민(Pen); 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-카르복실산(Tic); β-2-티에닐알라닌(Thi); 메티오닌 설폭사이드(MSO); 호모아르기닌(hArg); N-아세틸 라이신(AcLys); 2,4-디아미노부티르산(Dbu); 2,3-디아미노부티르산(Dab); p-아미노페닐알라닌(Phe(pNH₂)); N-메틸 발린(MeVal); 호모시스테인(hCys), 호모페닐알라닌(hPhe) 및 호모세린(hSer); 히드록시프롤린(Hyp), 호모프롤린(hPro), N-메틸화 아미노산 및 펩토이드 (N-치환된 글리신)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

본원에 구체적으로 언급되지 않은 기타 아미노산 잔기는 본원에 제공된 정의를 고려하여, 관찰된 물리적 및 화학적 특성을 근거로 하여 용이하게 분류할 수 있다.

상기 규정된 카테고리에 따라서 유전적으로 암호화된 아미노산과, 통상의 암호화되지 않은 아미노산으로 분류한 것이 다음 표 2에 요약되어 있다. 표 2는 단지 예시 목적이며, 본원에 기재된 RCT의 매개제를 치환시키기 위해 사용될 수있는 아미노산 잔기 및 유도체의 배타적 목록을 의미하지는 않는다.

통상 접하는 아미노산의 종류
분류	유전적으로 암호화됨	유전적으로 암호화되지 않음
친수성
방향족	F,Y,W	Phg, Nal, Thi, Tic, Phe(4-Cl), Phe(2-F), Phe(3-F), Phe(4-F), hPhe
비극성	L,V,I,M,G,A,P	t-BuA, t-BuG, MeIle, Nle, MeVal, Cha, McGly,Aib
지방족	A,V,L,I	b-Ala, Dpr, Aib, Aha, MeGly, t-BuA, t-BuG MeIle, Cha, Nle, MeVal
소수성
산성	D,E
염기성	H,K,R	Dpr, Orn, hArg, Phe(p-NH₂), Dbu, Dab
극성	C,Q,N,S,T	Cit, AcLys, MSO, bAla, hSer
나선-파단	P,G	D-Pro 및 다른 D-아미노산(L-펩티드에서)

대부분의 경우에, RCT의 매개제의 아미노산이 D-에난티오머성 아미노산으로 치환될 것이긴 하지만, 이러한 치환이 D-에난티오머성 아미노산으로 제한되지 않는다. 따라서, "돌연변이"되거나 또는 "변형된" 형태의 정의에는, D-아미노산을 동일한 L-아미노산으로 대체시키거나 (예를 들면, D-Arg→L-Arg) 또는 동일한 카테고리 또는 서브카테고리의 L-아미노산으로 대체시킨 (예를 들면, D-Arg D-Lys) 상황 및 이와 반대의 상황이 포함된다. 상기 매개제는 유리하게는, 하나 이상의 D-에난티오머성 아미노산으로 구성될 수 있다. 이러한 D-아미노산을 함유하는 매개제는 L-아미노산으로만 구성된 펩티드 보다 구강, 소화관 또는 혈청내에서의 분해에 대해 보다 안정적인 것으로 여겨진다.

링커

본 발명의 RCT의 매개제는 헤드-대-테일 방식 (즉, N-말단 대 C-말단), 헤드-대-헤드 방식 (즉, N-말단 대 N-말단), 테일-대-테일 방식 (즉, C-말단 대 C-말단), 또는 이들의 조합 방식으로 접속 또는 연결시킬 수 있다. 링커는 2개의 아미노산 또는 그의 유사체를 서로 공유적으로 연결할 수 있는 모든 이작용기성 분자일 수 있다. 따라서, 적합한 링커는 작용기가 펩티드의 N- 및/또는 C-말단에 공유적으로 부착될 수 있는 이작용기성 분자이다. 펩티드의 N- 또는 C-말단에 부착시키기에 적합한 작용기는, 이러한 공유 결합 형성에 영향을 미치기에 적합한 화학분야로서 당해 분야에 널리 공지되어 있다.

충분한 길이와 가요성의 링커에는 Pro(P), Gly(G), Cys-Cys, H₂N-(CH₂)n-COOH [여기서, n은 1 내지 12, 바람직하게는 4 내지 6이다]; H₂N-아릴-COOH 및 탄수화물이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 그러나, 일부 양태에서, 그 자체 분리된 링커가 전혀 사용되지 않는다. 대신 산성, 친지질성 및 염기성 부분이 단일 분자의 모든 부분이다.

RCT 매개제의 구조내에 사용된 개질 아미노산

바람직한 양태에서, 보호된, 하프-디누디드 및 디누디드 버전은 추가로 개질된 아미노산, 즉 20개의 유전적으로 암호화된 R기중의 하나에 상응하지 않는 R 치환체를 갖는 아미노산을 함유한다

여기에서 사용된 것과 같은 "바이오이소스테레(bioisostere)", "바이오이소스테레 치환(bioisostere replacement)", "바이오이소스테이즘(bioisosterism)"과 관련된 용어는 당 분야에 통상적으로 인식되는 동일한 의미를 가지고 있다. 바이오이소스테레는 외곽 전자층이 동일하다고 간주되는 원자, 이온, 또는 분자이다. 바이오이소스테란 용어는 전체 분자 그 자체에 반대되는 전체 분자의 일부를 의미하는데 사용된다. 바이오이소스테레 치환은 첫번째 바이오이소스테레의 생화학적인 활성을 유지하거나 약간 변형시키는 예측에 의해 하나의 바이오이소스테레를 다른 것으로 대체하는 것을 포함한다. 이 경우에는 바이오이소스테레는 따라서 유사한 크기, 형태, 및 전자밀도를 가지고 있는 원자 또는 원자의 기이다. 바이오이소스테이즘은 제안된 바이오이소스테레 치환이 유사한 생화학적 성질을 유지할 것이라는 합리적인 예측으로부터 나타난 것이다. 그러한 합리적인 예측은 구조적인 유사성만을 기초로 한 것일 수 있다. 이것은 바이오이소스테레가 결합되거나 일부 경우에 상기 바이오이소스테레에 작용하는 수용체의 특징적인 영역에 관해 알려진 경우에 특히 사실이다.

카르복실산과 구아니딘 기의 바이오이소스테레의 예는 다음과 같다:

구조 및 기능 분석

상기 언급된 다량체성 형태를 포함한, 바람직한 양태의 RCT의 매개제의 구조와 기능을 검정하여, 활성 화합물을 선별할 수 있다. 예를 들어, 펩티드 또는 펩티드 유사체를 대상으로 하여, 지질과 결합할 수 있는 능력, 지질과 복합체를 형성할 수 있는 능력, LCAT를 활성화시킬 수 있는 능력, 및 콜레스테롤 유출을 증진시킬 수 있는 능력 등에 대해 검정할 수 있다.

펩티드의 구조 및/또는 기능을 분석하는 방법 및 검정은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 바람직한 방법이 아래의 작동 실시예에 제공되어 있다. 예를 들어, 하기 핵자기 공명(NMR) 검정을 사용하여 펩티드 또는 펩티드 유사체의 구조를 분석할 수 있는데, 특히 지질의 존재 하에서의 나선도를 분석할 수 있다. 지질과 결합할 수 있는 능력은 아래에 기재된 형광 분광측정 검정을 이용하여 결정할 수 있다. LCAT를 활성화시킬 수 있는 펩티드 및/또는 펩티드 유사체의 능력은 아래에 기재된 LCAT 활성화 방법을 이용하여 용이하게 결정할 수 있다. 아래에 기재된 시험관내 및 생체내 검정을 사용하여 RCT에 대한 반감기, 분포도, 콜레스테롤 유출 및 효과를 평가할 수 있다.

바람직한 양태의 RCT의 매개제는 바람직한 양태를 통하여 추가로 규정될 수 있다.

한 가지 바람직한 양태에서는, 3가지 독립적인 영역, 즉 산성 영역, 방향족 또는 친지질성 영역, 및 염기성 영역을 갖는 아미노산-기재 조성물을 포함하는 분자가 존재한다. 서로에 대한 이들 영역의 상대적 위치는 분자 매개제들 간에 다양할 수 있으며, 이러한 분자는 각 분자 내의 3가지 영역의 위치에 상관없이 RCT를 매개한다.

또 다른 바람직한 양태에서는, 삼량체의 방향족 영역이 산성 또는 염기성 측쇄(들)를 수반한 니코틴산으로 이루어질 수 있다.

또 다른 바람직한 양태에서는, 삼량체의 방향족 영역이 4-페닐 페닐알라닌으로 이루어질 수 있다.

또 다른 바람직한 변형에서는, 아미노산-기재 삼량체성 구조를 포함하는 분자 매개제를 어느 한 말단 또는 양 말단에서 아미노 또는 카르복실 말단 상의 친지질성 기(들)에 의해 선택적으로 캡핑시켜, RCT의 분자 매개제의 물리화학적 특성을 개선시키고 지방 또는 친지질성 물질의 신체 내로의 천연적 또는 능동 수송 (흡수) 시스템을 이용할 수 있게 해준다. 캡핑기는 D 또는 L 에난티오머 또는 비-에난티오머성 분자 또는 기일 수 있다. 바람직한 양태에서는, N-말단 캡핑기는 아세틸, 페닐아세틸, 디-t-부틸-4-히드록시-페닐, 나프틸, 치환된 나프틸, FMOC, 비페닐, 치환된 페닐, 치환된 헤테로사이클, 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 사이클로알킬, 융합 사이클로알킬, 포화 헤테로아릴, 치환된 포화 헤테로아릴 등으로 이루어진 군으로부터 선택된다. C-말단은 바람직하게는, 아민, 예컨대, RNH₂ (여기서, R은 디-t-부틸-4-히드록시-페닐, 나프틸, 치환된 나프틸, FMOC, 비페닐, 치환된 페닐, 치환된 헤테로사이클, 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 사이클로알킬, 융합 사이클로알킬, 포화 헤테로아릴, 치환된 포화 헤테로아릴 등이다)로 캡핑된다.

유전적으로 암호화된 아미노산의 D-에난티오머에 대해 사용된 약어는 표 1에 제시된 1-문자 부호의 소문자 등가물이다. 예를 들어, "R"은 L-아르기닌을 지칭하고 "r"은 D-아르기닌을 지칭한다. 달리 규정되지 않는 한 (예: "OH"), N-말단은 아세틸화시키고 C-말단은 아미드화시킨다.

PhAc는 페닐아세틸화를 의미한다.

BIP는 비페닐알라닌을 의미한다.

아미노산 치환이 반드시 유전적으로 암호화된 아미노산일 필요는 없고, 바람직한 특정 양태에서는 유전적으로 암호화된 아미노산으로만 제한되지 않는다. 따라서, 천연의 유전적으로 암호화된 아미노산 이외에도, RCT의 매개제 내의 아미노산 잔기는 천연의 암호화되지 않은 아미노산 및 합성 아미노산으로 치환시킬 수 있다.

대사적으로 보호된 버전

바람직한 대사적으로 보호된 버전의 RCT 매개제의 예는 하기에 나타나 있다. 산에 치환된 알파 탄소를 가진 화합물은 제거 반응에 안정할수 있다. 치환된 구아니딘은 제거 반응을 예방하는데 도움을 줄 수 있다.

하프-디누디드 매개제

RCT 매개제의 바람직한 하프-디누디드 양태의 예는 합성 스킴과 함께 하기에 나타나 있다.

디누디드 버젼

바람직한 디누디드 버전의 RCT 매개제의 예는 다음과 같다.

더욱 바람직한 RCT 매개제의 디누디드 버전의 추가적인 예는 하기에 나타나 있다. 산 대신에 테트라졸 아미드를 가진 화합물이 제거 반응에 안정할 수 있다.

RCT 매개제의 더욱 바람직한 디누디드 버전의 예는 합성 스킴을 포함하여 하기에 나타나 있다.

RCT 매개제에 사용될 수 있는 바이오이소스테레 개질된 아미노산의 일부의 예가 하기에 나타나 있다.

바람직한 매개제

특정 바람직한 양태에 있어서, 매개제는 글루타릭-bip-r, E-BIP-아그마틴, (4-카르바모일부틸)구아니딘-BIP-E, 글루타릭-bip-k, (4-카르바모일부틸)구아니딘-bip-GABA, (4-카르바모일부틸)구아니딘-BIP-GABA, 글루타릭-Aic-아그마틴, (4-카르바모일부틸)구아니딘-phe-GABA, 4,4-디메틸글루타릭-phe-아그마틴, Dimet.글루타릭-F-R, 글루타릭-F-R, 글루타릭-f-r, 숙시닉-bip-r, 숙시닉-BIP-R, 숙시닉-f-r, Dimet.글루타릭-bip-r, Dimet.글루타릭-BIP-R, Dimet.숙시닉-BIP-R, 숙시닉-phe-k, Dimet.숙시닉-phe-k, Dimet.숙시닉-Phe-K, 3,3-디메틸글루타릭-phe-아그마틴, Dimet.숙시닉-Aic-r, 글루타릭-f-(에타노)아그마틴, 글루타릭-Aic-r, 숙시닉-Aic-r, 글루타릭-Aic-R, (lH-테트라졸-5-5-일)글루타르아미드-BIP-R, 2,2-디메틸숙시닉-Phe-아그마틴, Dimet.숙시닉-Aic-R, 3,3-스피로시클로펜틸글루타릭-Phe-아그마틴, 3,3-디메틸글루타릭-F-아그마틴, 글루타릭-Phe-아그마틴(Bis-Boc), 글루타릭-f-시아노아그마틴, 글루타릭(테트라졸아미드)-BIP-아그마틴(피리미딘), 숙시닉-BIP-아그마틴(피리미딘), 3,3-스피로시클로헥실글루타릭-bip-아그마틴(피리미딘), 3,3-디메틸글루타릭-bip-아그마틴(피리미딘), 3,3-스피로시클로펜틸글루타릭-Aic-아그마틴(피리미딘), 3,3-디메틸글루타릭-Aic-아그마틴(피리미딘), 3,3-스피로시클로펜틸글루타릭-Phe-3-(디메틸아미노)부탄, 4,4-디메틸글루타릭-bip-아그마틴(피리미딘), 및 3,3-스피로시클로펜틸글루타릭-bip-3-(디메틸아미노)프로판으로 구성되는 군에서 선택되며, 상기에서 임의의 미유도화된 아미노 및/또는 카르복시 말단 아미노산은 보호기로 캡핑된다. 다른 바람직한 양태에서, 상기 매개제는 Dimet.숙시닉-phe-k, MeO2C-페닐-f-페닐-NH₂, Dimet.글루타릭-F-R, 또는 글루타릭-F-R로부터 선택될 수 있다.

반드시 나타나 있지는 않지만, 바람직한 매개제의 상기 목록에서 임의의 미유도화된 아미노 및/또는 카르복시 말단 아미노산 잔기는 보호기로 캡핑된다. 따라서, 만약 제거되지 않는다면, 상기 알파 아미노기는 아세틸 또는 디-t-부틸-4-히드록시-페닐과 같은 보호기로 캡핑된다. 마찬가지로, 제거되지 않는다면 알파 카르복시기는 아민 또는 디-t-부틸-4-히드록시-페닐과 같은 보호기로 캡핑된다. 물론 임의의 다른 보호기가 또한 사용될 수 있다. 예컨대 아미노 말단 보호기는 바람직하게는 아세틸, 페닐아세틸, 피볼릴, 2-나프틸산, 니코틴산, CH₃-(CH₂)n-CO- [여기서, n은 1 내지 20이다], 그리고 아세틸, 페닐아세틸, 디-t-부틸-4-히드록시-페닐, 나프틸, 치환된 나프틸, FMOC, 비페닐, 치환된 페닐, 치환된 헤테로사이클, 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 사이클로알킬, 융합 사이클로알킬, 포화 헤테로아릴, 치환된 포화 헤테로아릴 등의 아미드로 이루어진 군에서 선택되며 한편 카르복시 말단 보호기는 바람직하게는 아민, 예를 들면, RNH₂ (여기서, R은 디-t-부틸-4-히드록시-페닐, 나프틸, 치환된 나프틸, FMOC, 비페닐, 치환된 페닐, 치환된 헤테로사이클, 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 사이클로알킬, 융합 사이클로알킬, 포화 헤테로아릴, 치환된 포화 헤테로아릴 등이다)로 구성된 군에서 선택된다.

합성 방법

바람직한 양태의 매개제는 펩티드를 제조하는 것으로 당해 분야에 공지된 거의 모든 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 통상적인 단계별 용액 또는 고체 상 펩티드 합성을 사용하여 제조할 수 있다.

RCT의 하프-디누디드 매개제는 통상적인 단계별 용액 또는 고체 상 펩티드 합성법을 사용하여 제조할 수 있다 [참조: Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams와 공동연구자들, Eds., 1997, CRC Press, Boca Raton Fla., 및 이에 인용된 참조문헌; Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, Atherton & Sheppard, Eds., 1989, IRL Press, Oxford, England, 및 이에 인용된 참조문헌] .

통상적인 고체-상 합성에서는, 제1 아미노산을 부착시키면, 이의 카르복실-말단 (C-말단)이 유도체화 수지와 화학적으로 반응하여 올리고펩티드의 카르복실 말단을 형성시킨다. 아미노산의 알파-아미노 말단은 전형적으로, t-부톡시-카보닐 기 (t-Boc) 또는 9-플루오레닐메틸옥시카보닐 (FMOC) 기로 차단시켜, 반응할 지도 모르는 아미노 기가 커플링 반응에 참여하지 못하게 한다. 아미노산의 측쇄기가 반응성일 경우에도, 이를 에테르, 티오에테르, 에스테르 및 카바메이트 형태의 각종 벤질-유도된 보호기에 의해 차단 (또는 보호)시킨다.

다음 단계 및 후속 반복 주기는 아미노-말단 (N-말단) 수지-결합된 아미노산 (또는 펩티드 쇄의 말단 잔기)를 탈차단시켜 알파-아미노 차단기를 제거시킨 다음, 그 다음 차단된 아미노산을 화학적으로 부가 (커플링)시키는 것을 포함한다. 그러나, 이러한 공정을 많은 주기 동안 반복하는 것이, 관심있는 전체 펩티드 쇄를 합성하는데 필요하다. 각각의 커플링 및 탈차단 단계 후, 수지-결합된 펩티드를 철저히 세척하여 모든 잔류성 반응물을 제거한 다음, 다음 단계를 진행한다. 고체 지지체 입자는 소정의 어떠한 단계에서도 시약 제거를 촉진시키는데, 이는 수지와 수지-결합된 펩티드가 다공성 개구를 갖는 칼럼 또는 장치 내에 유지되는 동안 용이하게 여과 및 세척될 수 있기 때문이다.

합성된 펩티드는, 펩티드를 수지로부터 절단시켜 이의 C-말단 아미노산 상에 아미드 또는 카르복실 기를 잔존시키는 산 촉매 작용 (전형적으로, 불화수소산 또는 트리플루오로아세트산을 이용함)에 의해 수지로부터 방출시킬 수 있다. 산분해적 절단은 또한, 합성된 펩티드 중의 아미노산의 측쇄로부터 보호기를 제거하는 역할을 한다. 이어서, 마무리된 펩티드를 각종 크로마토그래피 방법 중의 어느 한 방법에 의해 정제할 수 있다.

바람직한 양태에 따르면, RCT의 펩티드 및 펩티드 유도체 매개제는 N^a-FMOC 화학을 이용하는 고체-상 합성 방법에 의해 합성하였다. N^a-FMOC 보호된 아미노산 및 링크 (Rink) 아미드 MBHA 수지 및 왕 (Wang) 수지는 공급처[Novabiochem (San Diego, CA) 또는 Chem-Impex Intl (Wood Dale, IL)]로부터 구입하였다. 기타 화학물질 및 용매는 다음 공급처로부터 구입하였다: 트리플루오로아세트산 (TFA), 아니솔, 1,2-에탄디티올, 티오아니솔, 피페리딘, 아세트산 무수물, 2-나프토산 및 피발로산 (Aldrich, Milwaukee, WI), HOBt 및 NMP (Chem-Impex Intl, Wood Dale, IL), 디클로로메탄, 메탄올 및 HPLC 등급 용매 (Fischer Scientific, Pittsburgh, PA). 펩티드의 순도는 LC/MS에 의해 체크하였다. 펩티드의 정제는 C₁₈-결합된 실리카 칼럼 (Tosoh Biospec 분취 칼럼, ODS-80TM, Dim: 21.5 mm x 30 cm) 상에서 분취 HPLC 시스템 (Agilent technologies, 1100 Series)을 이용하여 달성하였다. 펩티드를 구배 시스템 [50% 내지 90%의 B 용매 (아세토니트릴:물 60:40; 0.1% TFA를 수반함)]으로 용출시켰다.

링크 아미드 MBHA 수지 (0.5-0.66 mmol/g) 또는 왕 수지 (1.2 mmol/g)를 사용하여, 고체 상 방법을 통하여 단계별 방식으로 모든 펩티드를 합성하였다. 측쇄의 보호기는 Arg (Pbf), Glu (OtBu) 및 Asp (OtBu)이었다. 각 FMOC-보호된 아미노산을, 1.5 내지 3배 과량의 보호된 아미노산을 사용하여 상기 수지에 커플링시켰다. 커플링 시약은 N-히드록시벤조트리아졸 (HOBt) 및 디이소프로필 카르보디이미드 (DIC)이고, 커플링 반응은 닌히드린 시험에 의해 모니터하였다. FMOC 기를 NMP 중의 20% 피페리딘을 사용하여 30 내지 60분간 처리함으로써 제거한 다음, CH₂Cl₂, CH₂Cl₂ 중의 10% TFA, 메탄올 및 CH₂Cl₂로 연속해서 세척하였다. 커플링 단계에 이어 아세틸화시키거나 또는 필요에 따라 기타 캡핑기를 사용하였다.

TFA, 티오아니솔, 에탄디티올 및 아니솔의 혼합물 (90:5:3:2, v/v)을 사용하여 (실온에서 4 내지 5시간 동안) 펩티드-수지로부터 펩티드를 절단시키고, 모든 측쇄 보호기를 제거하였다. 조 펩티드 혼합물을 소결 펀널로부터 여과시키고, 이를 TFA로 세척하였다 (2 내지 3회). 여액을 진한 시럽으로 농축시키고 찬 에테르에 부가하였다. 동결건조기 내에 밤새 유지시키고 원심분리시킨 후에, 펩티드가 백색 고체로서 침전되었다. 용액을 기울려 따르고 고체를 에테르로 철저히 세척하였다. 이로써 생성된 조 펩티드를 완충액 (아세토니트릴:물 60:40; 0.1% TFA를 수반함)에 용해시키고 건조시켰다. 조 펩티드를 40분 동안 구배 시스템 50-90% B [완충액 A: 0.1% (v/v) TFA를 함유하는 물, 완충액 B: 0.1% (v/v) TFA를 함유하는, 아세토니트릴:물 (60:40)]을 갖는 분취 C-18 칼럼 (역상)을 이용하여 HPLC함으로써 정제하였다. 순수한 분획을, 예컨대 Speedvac에서, 감압농축 또는 동결 건조시켰다. 수율은 5 내지 20%로 다양하였다.

또 다르게는, 바람직한 양태의 펩티드는 예를 들어, 다음 문헌에 기재된 바와 같은, 세그먼트 축합을 통하여, 즉 보다 큰 펩티드 쇄를 형성하기 위해 작은 구성분 펩티드 쇄를 함께 연결시킴으로써 제조할 수 있다 [참조: Liu와 공동연구자들, 1996, Tetrahedron Lett. 37(7):933-936; Baca와 공동연구자들, 1995, J. Am. Chem. Soc. 117:1881-1887; Tam과 공동연구자들, 1995, Int. J. Peptide Protein Res. 45:209-216; Schnolzer and Kent, 1992, Science 256:221-225; Liu and Tam, 1994, J.Am. Chem. Soc. 116(10):4149-4153; Liu and Tam, 1994, PNAS USA 91:6584-6588; Yamashiro and Li, 1988, Int. J. Peptide Protein Res. 31:322-334; Nakagawa와 공동연구자들, 1985, J. Am Chem. Soc. 107:7087-7083; Nokihara와 공동연구자들, 1989, Peptides 1988:166-168; Kneib-Cordonnier와 공동연구자들, 1990, Int. J. Pept. Protein Res. 35:527-538; 이들 전문이 본원에 참조문헌으로서 삽입되어 있다]. 본 발명의 펩티드를 합성하는데 유용한 기타 방법이 문헌 [참조: Nakagawa와 공동연구자들, 1985, J. Am. Chem. Soc. 107:7087-7092]에 기재되어 있다.

세그먼트 축합에 의해 생성된 펩티드의 경우에는, 이러한 축합 단계의 커플링 효율이 커플링 시간을 연장시킴으로써 상당히 증가될 수 있다. 전형적으로, 커플링 시간을 연장시키면, 생성물의 라세미화가 증가된다 [참조: Sieber와 공동연구자들, 1970, Helv. Chim. Acta 53:2135-2150]. N- 및/또는 C-말단 차단기를 함유하는 RCT의 매개제는 표준 유기 화학 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 특정 펩티드의 N-말단을 아실화하거나, 또는 C-말단을 아미드화 또는 에스테르화하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어있다. N- 및/또는 C-말단에서의 기타 변형을 수반하는 방식은 당업자에게 명백할 것이며, 이는 말단 차단기를 부착시키는데 필요할 수 있는 바와 같이 모든 측쇄 작용기를 보호하는 방식과 같을 것이다.

마찬가지로 예컨대 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에서 보호기의 탈보호 방법은 당해 분야에 널리 공지되어있다. N- 및/또는 C-말단에서의 기타 변형을 수반하는 방식은 당업자에게 명백할 것이며, 이는 말단 차단기를 부착시키는데 필요할 수 있는 바와 같이 모든 측쇄 작용기를 보호하는 방식과 같을 것이다.

약학적으로 허용되는 염 (반대 이온)은 편리하게는, 이온-교환 크로마토그래피 또는 당해 분야에 널리 공지된 바와 같은 기타 방법에 의해 제조할 수 있다.

부가의 화학적으로 합성된 아미노산-유도된 화합물이 다음 표 3에 제시되어 있다:

화합물 #	서열	분자식	분자량
85A	글루타릭-BIP-R-NH₂	C₂₆H₃₄N₆O₅	510.59
86A	글루타릭-bip-r-NH₂	C₂₆H₃₄N₆O₅	510.59
87A	Ac-E-Bip-아그마틴	C₂₇H₃₆N₆O₅	524.62
88A	Ac-e-bip-아그마틴	C₂₇H₃₆N₆O₅	524.62
89A	Ac-R-BIP-GABA	C₂₇H₃₆N₆O₅	524.62
90A	Ac-r-bip-GABA	C₂₇H₃₆N₆O₅	524.62
91A	4-구아니디노부타닉-BIP-E-NH₂	C₂₅H₃₂N₆O₅	496.56
92A	4-구아니디노부타닉-bip-e-NH₂	C₂₅H₃₂N₆O₅	496.56
95A	글루타릭-BIP-K-NH₂	C₂₆H₃₄N₄O₅	482.58
96A	글루타릭-bip-k-NH₂	C₂₆H₃₄N₄O₅	482.58

약제학적 제형 및 치료 방법

바람직한 양태의 RCT의 매개제는 동물, 특히 포유류 (사람 포함)에게서, 혈청 콜레스테롤 수치를 저하시키는 것이 이로운 모든 장애를 치료하는데 사용할 수 있는데, 이러한 장애에는 혈청 HDL 농도를 증가시키고, LCAT를 활성화시키며 콜레스테롤 유출과 RCT를 증진시키는 것이 이로운 질환이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 질환으로는 고지질혈증, 및 특히 고콜레스테롤혈증, 및 심혈관계 질환, 예를 들면, 아테롬성 동맥경화증 (아테롬성 동맥경화증의 치료 및 예방 포함) 및 관상 동맥 질환; 재발 협착증 (예: 의학적 처치, 예를 들면, 발룬 혈관형성술의 결과로서 발생하는 아테롬성 동맥경화성 플라크의 예방 또는 치료); 및 기타 장애, 예를 들면, 허혈증, 및 종종 패혈성 쇽을 야기시키는 내독소혈증이 있지만, 이에 제한되지 않는다. RCT의 매개제는 단독으로 사용하거나 또는 전술된 질환을 치료하기 위해 사용되어 온 기타 약물과의 조합 요법으로 사용될 수 있다. 이러한 치료법에는 관련 약물을 동시에 투여하거나 순차적으로 투여하는 것이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

예를 들어, 고콜레스테롤혈증 또는 아테롬성 동맥경화증을 치료하는데 있어서, 바람직한 양태의 RCT의 분자 매개제 제형을, 현재 사용되고 있는 콜레스테롤 저하 요법들, 예를 들면, 담즙산 수지, 니아신 및/또는 스타틴 중의 한 가지 이상과 함께 투여할 수 있다. 이러한 조합 치료 처방은 특히 이로운 치료 효과를 가져다줄 수 있는데, 이는 각 약물이 콜레스테롤 합성과 수송에 있어 상이한 표적에 대해 작용하기 때문이며, 즉 담즙산 수지는 콜레스테롤 재순환, 킬로미크론 (chylomicron) 및 LDL 집단에 영향을 미치고; 니아신은 VLDL 및 LDL 집단에 주로 영향을 미치며; 스타틴은 콜레스테롤 합성을 억제시켜, LDL 집단을 저하시키고 (아마도, LDL 수용체 발현은 증가시키며); 반면, RCT의 매개제는 RCT에 영향을 미치고, HDL을 증가시키며, LCAT 활성을 증가시키고 콜레스테롤 유출을 증진시킨다.

RCT의 매개제를 피브레이트와 연계해서 사용하여, 고지질혈증, 고콜레스테롤혈증 및/또는 심혈관계 질환, 예를 들면, 아테롬성 동맥경화증을 치료할 수 있다.

바람직한 양태의 RCT의 매개제를, 내독소에 의해 유발된 패혈성 쇽을 치료하기 위해 현재 사용되고 있는 항미생물제 및 소염제와 조합하여 사용할 수 있다.

바람직한 양태의 RCT의 매개제는, 각종 방식, 바람직하게는 경구 투여를 통하여 대상체에게 투여하여 RCT의 매개제를 순환 전달시킬 수 있는 펩티드-기재 조성물로서 또는 펩티드-지질 복합체로서 제형화할 수 있다. 제형 및 치료 처방의 예가 아래에 언급되어 있다.

또 다른 바람직한 양태에서는, 고콜레스테롤혈증 및/또는 아테롬성 동맥경화증의 한 가지 이상의 증상을 완화 및/또는 예방하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 바람직하게는, 유기체, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 사람에게 바람직한 양태의 하나 이상의 펩티드 (또는 이러한 펩티드의 모방체)를 투여하는 것을 포함한다. 이러한 매개제(들)는 본원에 기재된 바와 같이, 주사, 좌제, 비내 분무, 시간-방출(서방성) 이식체, 경피용 패치 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 수 많은 표준 방법에 따라서 투여할 수 있다. 한 가지 특히 바람직한 양태에서는, 매개제는 경구 투여된다 (예를 들면, 시럽, 캅셀제 또는 정제로서 투여한다).

상기 방법은 바람직한 양태의 단일 폴리펩티드를 투여하거나 2가지 이상의 상이한 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함한다. 폴리펩티드는 단량체로서, 또는 이량체성, 올리고머성 또는 중합체성 형태로 제공될 수 있다. 특정 양태에서는, 다량체성 형태가 연합된 단량체 (예: 이온적 또는 소수성으로 연결됨)를 포함할 수 있지만, 특정의 기타 다량체성 형태는 공유적으로 연결된 단량체 (직접 연결되거나 링커를 통하여 연결됨)를 포함한다.

바람직한 양태는 사람에게서의 사용과 관련하여 기재되긴 하였지만, 동물에게 사용하는 것 (예를 들면, 수의용) 역시 적합하다. 따라서, 바람직한 유기체에는 사람, 사람이 아닌 영장류, 개과, 말과, 고양이과, 돼지과, 유제류 (ungulate), 라고모르프(largomorph) 등이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

바람직한 양태의 방법은 고콜레스테롤혈증 및/또는 아테롬성 동맥경화증의 한 가지 이상의 증상 (예를 들면, 고혈압; 플라크 형성 및 파열; 심장 마비, 협심증 또는 발작과 같은 임상 사건의 저하, 고수준의 저밀도 지단백질; 고수준의 극히 저밀도 지단백질, 또는 염증성 단백질 등)을 나타내는 사람 또는 사람이 아닌 동물로 제한되지 않고, 예방 차원에서도 유용하다. 따라서, 바람직한 양태의 매개제 (또는 이의 모방체)는 고콜레스테롤혈증 및/또는 아테롬성 동맥경화증의 한 가지 이상의 증상의 발병/전개를 예방하기 위해 유기체에게 투여할 수 있다. 이와 관련하여 특히 바람직한 대상체는 아테롬성 동맥경화증에 대한 한가지 이상의 위험 인자 (예: 가족력, 고혈압, 비만, 고알코올 소모, 흡연, 고 혈중 콜레스테롤, 고 혈중 트리글리세라이드, 상승된 혈중 LDL, VLDL, IDL, 또는 낮은 HDL, 당뇨병, 또는 당뇨병 가족력, 고 혈중 지질, 심장 마비, 협심증 또는 발작 등)을 나타내는 대상체이다. 바람직한 양태는 고지질혈증, 고콜레스테롤혈증, 및 관상동맥 질환심, 아테롬성 동맥경화증, 당뇨병, 비만, 알쯔하이머병, 다발성 경화증, 감염과 같은 고지질혈증과 관련된 질환 그리고 패혈성 쇽을 야기시키는 내독소혈증의 치료에서 약학 제제와 그러한 제제의 사용을 포함한다

한 바람직한 양태에서, RCT의 매개제는 RCT의 매개제의 합성 및 정제에 관한 앞서의 섹션에 기재된 모든 기술을 사용하여 합성 또는 제작할 수 있다. 반감기가 긴 안정한 제제는 펩티드를 동결건조시킴으로써 만들 수 있는데, 재제형화하기 위한 벌크로 제조하거나, 또는 대상체에게 투여하기에 앞서 멸균수 또는 적당한 멸균 완충 용액으로 재수화시킴으로써 재구성될 수 있는 개개 분취량 또는 투여 단위로 제조할 수 있다.

또 다른 바람직한 양태에서는, RCT의 매개제를 펩티드-지질 복합체에서 제형화 및 투여할 수 있다. 이러한 접근법은 몇가지 이점을 지니는데, 이는 특히 상기 복합체가 HDL, 특히 프레-β-1 또는 프레-β-2 HDL 집단과 유사한 크기와 밀도를 갖는 경우에, 상기 복합체는 순환 동안 증가된 반감기를 가져야 하기 때문이다. 펩티드-지질 복합체는 편리하게는, 아래에 기재된 수 많은 방법들 중의 어느 것에 의해서도 제조할 수 있다. 반감기가 긴 안정한 제제는 동결건조시킴으로써 제조할 수 있는데, 아래에 기재된 공동-동결건조 과정이 바람직한 접근법이다. 이와 같이 동결건조된 펩티드-지질 복합체를 사용하여, 약제학적 재제형화를 위한 벌크로 제조하거나, 또는 대상체에게 투여하기에 앞서 멸균수 또는 적당한 완충 용액으로 재수화시킴으로써 재구성될 수 있는 개개 분취량 또는 투여 단위로 제조할 수 있다.

당업자에게 널리 공지된 각종 방법을 사용하여 펩티드-지질 소포 또는 복합체를 제조할 수 있다. 이를 위해, 리포솜 또는 프로테오리포솜을 제조하기 위해 이용 가능한 수 많은 기술을 사용할 수 있다. 예를 들어, 매개제를 적당한 지질로 공동-초음파처리하여 (욕조 또는 프로브 초음파 처리기를 사용함) 복합체를 형성시킬 수 있다. 또 다른 한편, 펩티드를 미리형성한 지질 소포와 합하면, 펩티드-지질 복합체가 자발적으로 형성될 수 있다. 또 다른 대체 방안에서는, 펩티드-지질 복합체가 세정제 투석 방법에 의해 형성될 수 있는데, 예를 들어, 매개제, 지질 및 세정제의 혼합물을 투석시켜 세정제를 제거하고, 펩티드-지질 복합체를 재구성 또는 형성시킨다 [참조: Jonas와 공동연구자들, 1986, Methods in Enzymol. 128:553-582].

전술된 접근법이 실행 가능하긴 하지만, 각 방법은 비용, 수율, 재현성 및 안전성 측면에서 자체 특유의 생산 상의 문제점을 나타낸다. 한 가지 바람직한 방법에 따르면, 매개제와 지질을 용매 시스템에서 조합하는데, 이러한 용매 시스템은 각 성분을 동시에 가용화시키고 동결건조 과정에 의해 완전히 제거될 수 있다. 이를 위해, 양친매성 펩티드와 지질 둘 다를 동시에 가용화시킬 수 있도록 용매 쌍을 조심스럽게 선택해야 한다. 한 양태에서는, 입자 내로 혼입될 단백질(들), 펩티드(들) 또는 이의 유도체/유사체를 수성 또는 유기 용매 또는 용매 혼합물 (용매 1)에 용해시킬 수 있다. (인)지질 성분은 용매 1과 혼화성인, 수성 또는 유기 용매 또는 용매 혼합물 (용매 2)에 용해시키고, 두 용액을 혼합한다. 또 다른 한편, 매개제와 지질을 공용매 시스템, 즉 혼화성 용매의 혼합물 내로 혼입시킬 수 있다. 지질에 대한 매개제(단백질)의 적합한 비율은 먼저, 생성된 복합체가 적당한 물리적 및 화학적 특성을 보유하도록, 즉 HDL과 크기면에서 통상 유사하도록 (그러나, 반드시 그렇지는 않다) 실험적으로 결정한다. 이로써 생성된 혼합물을 동결시키고 동결건조시킨다. 동결건조를 촉진시키기 위해서는 종종 부가의 용매를 상기 혼합물에 부가해야만 한다. 이와 같이 동결건조된 생성물을 장기간 동안 저장할 수 있으며, 이는 안정된 채로 유지될 것이다.

펩티드-지질 복합체의 용제 또는 현탁제를 수득하기 위해 상기 동결건조된 생성물을 재구성할 수 있다. 이를 위해, 동결건조된 분말을 수용액으로 재수화시켜 적합한 용적으로 만들 수 있다 (정맥내 주사하기 위해서는 종종 5 mgs 펩티드/ml가 편리하다). 바람직한 양태에서는, 동결건조된 분말을 인산염 완충 식염수 또는 생리 식염수로 재수화시킨다. 혼합물을 진탕 또는 와동시켜 재수화를 촉진시킬 수도 있으며, 대부분의 경우에는 재구성 단계를 복합체의 지질 성분의 상 전이 온도이상의 온도에서 수행해야 한다. 수분 내에, 재구성된 지질-단백질 복합체의 청정한 제제가 생성된다.

수득한 재구성된 제제의 분취량에 대해 특성 평가함으로써 이러한 제제 중의 복합체가 목적하는 크기 분포도, 예를 들면, HDL의 크기 분포도를 나타내는지를 확인할 수 있다. 이를 위해, 겔 여과 크로마토그래피를 사용할 수 있다. 예를 들어, 파마시아 (Pharmacia) 슈퍼로스 6 FPLC 겔 여과 크로마토그래피 시스템을 사용할 수 있다. 사용된 완충액은 50 mM 포스페이트 완충액 (pH 7.4) 중의 150 mM NaCl를 함유한다. 전형적인 샘플 용적은 5 mgs 펩티드/ml를 함유하는 20 내지 200 마이크로리터의 복합체이다. 칼럼 유속은 0.5 mls/min이다. 공지된 분자량 및 스토크스 (Stokes) 직경의 단백질 시리즈 뿐만 아니라 사람 HDL이, 칼럼을 교정하기 위한 표준물로서 바람직하게 사용된다. 단백질 및 지단백질 복합체는 파장 254 또는 280 nm의 흡광도 또는 광 산란에 의해 모니터한다.

본 RCT의 매개제는 포화, 불포화, 천연 및 합성 지질 및/또는 인지질을 포함한 각종 지질과 복합체를 형성할 수 있다. 적합한 지질에는 다음이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다: 작은 알킬 쇄 인지질, 난 (egg) 포스파티딜콜린, 대두 포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디미리스토일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 1-미리스토일-2-팔미토일포스파티딜콜린, 1-팔미토일-2-미리스토일포스파티딜콜린, 1-팔미토일-2-스테아로일포스파티딜콜린, 1-스테아로일-2-팔미토일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린, 디올레오포스파티딜에탄올아민, 디라우로일포스파티딜글리세롤 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 스핑고지질, 포스파티딜글리세롤, 디포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티딜글리세롤, 디팔미토일포스파티딜글리세롤, 디스테아로일포스파티딜글리세롤, 디올레오일포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티드산, 디팔미토일포스파티드산, 디미리스토일포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜에탄올아민, 디미리스토일 포스파티딜세린, 디팔미토일포스파티딜세린, 뇌 포스파티딜세린, 뇌 스핑고미엘린, 디팔미토일스핑고미엘린, 디스테아로일스핑고미엘린, 포스파티드산, 갈락토세레브로시드, 강글리오시드, 세레브로시드, 디라우릴포스파티딜콜린, (1,3)-D-만노실-(1,3)디글리세라이드, 아미노페닐글리코시드, 3-콜레스테릴-6'-(글리코실티오)헥실 에테르 글리코지질, 및 콜레스테롤 및 이의 유도체.

본 발명의 약제학적 제형은 생체내에서 투여 및 전달하기에 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 중에, 활성 성분으로서 RCT의 매개제 또는 펩티드-지질 복합체를 함유한다. 매개제는 산성 및/또는 염기성 말단 및/또는 측쇄를 함유할 수 있기 때문에, 이러한 매개제는 유리 산 또는 염기 형태, 또는 약제학적으로 허용되는 염 형태로 제형 내에 포함될 수 있다.

주사용 제제에는 수성 또는 오일상 비히클 중의 활성 성분의 멸균 현탁제, 용제 또는 유제가 포함된다. 이러한 조성물은 제형화제, 예를 들면, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수도 있다. 주사용 제형은 단위 투여 형태, 예를 들면, 앰풀 또는 다용량 용기로 표시할 수 있고, 부가된 방부제를 함유할 수도 있다.

또 다른 한편, 주사용 제형은, 사용하기 전에 멸균성 발열원 유리 수, 완충제, 덱스트로스 용액 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 적합한 비히클로 재구성하기 위한 분말 형태로 제공될 수 있다. 이를 위해, RCT의 매개제를 동결건조시키거나, 또는 공동-동결건조된 펩티드-지질 복합체를 제조할 수 있다. 저장된 제제는 단위 투여 형태로 공급될 수 있으며, 생체내에서 사용하기에 앞서 재구성할 수 있다.

장기간 전달하기 위해서는, 활성 성분을 체내 이식 투여용, 예를 들면, 피하, 피내 또는 근육내 주사용 데포(depot) 제제로서 제형화할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 활성 성분을 적합한 중합체성 또는 소수성 물질 (예: 허용되는 오일 중의 유제로서) 또는 이온 교환 수지와 함께 제형화하거나, 또는 거의 불용성인 유도체로서, 예를 들면, 거의 불용성인 염 형태의 RCT의 매개제로서 제형화할 수 있다.

또 다른 한편, 경피 흡수를 위해 활성 성분을 서서히 방출시키는 접착성 원반 또는 패치로서 제작된 경피 전달 시스템을 사용할 수 있다. 이를 위해, 투과 증강제를 사용하여 활성 성분의 경피 투과를 촉진시킬 수 있다. 허혈성 심장 질환 및 고콜레스테롤혈증이 있는 환자에게서 사용하기 위해 니트로글리세린 패치 내로 바람직한 양태의 RCT 매개제 또는 펩티드-지질 복합체를 혼입시킴으로써 특별한 이익을 달성할 수 있다.

경구 투여의 경우에는, 약제학적 조성물이 약제학적으로 허용되는 부형제, 예를 들면, 결합제 (예: 예비젤라틴화 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로스); 충전제 (예: 락토스, 미세결정성 셀룰로스 또는 인산수소칼슘); 윤활제 (예: 마그네슘 스테아레이트, 탈크 또는 실리카); 붕해제 (예: 감자 전분 또는 나트륨 전분 글리콜레이트); 또는 습윤제 (예: 나트륨 라우릴 설페이트)를 이용한 통상적인 방법에 의해 제조된 정제 또는 캅셀제 형태를 취할 수 있다. 정제는 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 피복시킬 수 있다. 경구 투여용 액상 제제는 예를 들어, 용제, 시럽 또는 현탁제 형태를 취할 수 있거나, 또는 이들 제제는 사용하기 전에 물 또는 기타 적합한 비히클과 구성하기 위한 무수 생성물로서 표시될 수 있다. 이러한 액상 제제는 약제학적으로 허용되는 첨가제, 예를 들면, 현탁제 (예: 솔비톨 시럽, 셀룰로스 유도체 또는 수소화 식용 지방); 유화제 (예: 레시틴 또는 아카시아); 비-수성 비히클 (예: 아몬드 오일, 오일상 에스테르, 에틸 알코올 또는 분할 식물성 오일); 및 방부제 (예: 메틸 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 소르브산)를 이용한 통상적인방법에 의해 제조할 수 있다. 상기 제제는 경우에 따라, 완충 염, 향미제, 착색제 및 감미제를 함유할 수도 있다. 경구 투여용 제제는 활성 성분을 제어 방출하도록 적합하게 제형화할 수 있다.

구강(buccal) 투여의 경우에는, 조성물이 통상적인 방식으로 제형화된 정제 또는 로젠지 형태를 취할 수 있다. 직장 및 질내투여 경로의 경우에는, 활성 성분을 용제 (정체 관장용), 좌제 또는 연고로서 제형화할 수 있다.

흡입 투여의 경우에는, 활성 성분을, 적합한 추진체, 예를 들면, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 기타 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 분무기로부터 에어로솔 분무 표시형태로 편리하게 전달할 수 있다. 가압 에어로솔의 경우에는, 계량 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 투여 단위를 결정할 수 있다. 해당 화합물과 적합한 분말 기제, 예를 들면, 락토스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하는, 흡입기에 사용하기위한, 예를 들어, 젤라틴의 카트릿지 및 캡슐을 제형화할 수 있다.

조성물은 경우에 따라, 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여 형태를 함유할 수 있는 팩 또는 투약기 내에 존재할수 있다. 이러한 팩은, 예를 들어, 금속 또는 플라스틱 박막, 예를 들면, 블리스터 팩을 포함할 수 있다. 상기 팩 또는 투약기에는 투여에 대한 지시사항이 수반될 수 있다.

바람직한 양태의 RCT의 매개제 및/또는 펩티드-지질 복합체는 순환시 생체내 이용 효율을 보장해 주는 적합한 어떠한 경로로든 투여할 수 있다. 이는 정맥내 (IV), 근육내 (IM), 피내, 피하 (SC) 및 복강내 (IP) 주사를 포함한 비경구 투여 경로에 의해 달성할 수 있다. 그러나, 기타 투여 경로를 사용할 수도 있다. 예를 들어, 위장관을 통한 흡수는 경구 투여 경로 (이에는 섭취, 구강 및 설하 경로가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다)에 의해 달성될 수 있는데, 단 예를 들어, 구강 점막, 위 및/또는 소장의 거친 환경 하에서 활성 성분의 분해를 피하거나 최소화시키는데 적당한 제형 (예: 장내 피복물)을 사용해야 한다. 경구 투여는 사용하기가 용이하므로, 치료 순응도를 증강시키는 이점을 지니고 있다. 또 다른 한편, 점막 조직을 통한 투여, 예를 들면, 질 및 직장 투여 방식을 활용하여, 위장관 내에서의 분해를 피하거나 최소화시킬 수 있다. 또 다른 대체 방안에서는, 본 발명의 제형을 경피 또는 흡입 투여할 수 있다. 바람직한 경로는 수용자의 상태, 연령 및 치료 순응도에 따라 다양할 수 있다는 것을 인지해야 할 것이다.

사용된 RCT의 매개제 또는 펩티드-지질 복합체의 실제 용량은 투여 경로에 따라 다양할 것이며, 이는 1.0 mg/l 내지 2 g/l의 혈장 농도 순환을 달성시키도록 조정되어야 한다. 본원에 언급된 동물 모델 시스템에서 수득된 데이터는, 본 발명의 ApoA-I 효능제가 HDL 성분과 회합되고, 사람에게서 약 5일의 계획된 반감기를 갖는다는 것을 나타낸다. 따라서, 한 양태에서는, RCT의 매개제를 1주에 한번씩 0.5 mg/kg 내지 100 mg/kg의 용량으로 주사 투여할 수 있다. 또 다른 양태에서는, 약 0.1 mg/kg/hr 내지 100 mg/kg/hr을 제공하는 지속적 주입 또는 간헐적 주입에 의해 목적하는 혈청 수준을 유지시킬 수 있다.

각종 RCT 매개제의 독성 및 치료학적 효능은, LD₅₀ (집단의 50%를 치사시키는 용량) 및 ED₅₀ (집단의 50%에게서 치료학적으로 유효한 용량)을 결정하기 위한 세포 배양물 또는 실험 동물에서의 표준 약제학적 과정을 이용하여 결정할 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 간의 용량 비가 치료 지수이고, 이는 LD₅₀/ED₅₀ 비로서 나타낼 수 있다. 치료 지수가 큰 ApoAI 펩티드 효능제가 바람직하다.

기타 용도

본 발명의 RCT 효능제의 매개제는, 예를 들어, 진단 목적을 위해 혈청 HDL를 측정하는 시험관내 검정에 사용할 수 있다. RCT의 매개제는 혈청의 HDL 및 LDL 성분과 회합하기 때문에, 효능제가 HDL 및 LDL 집단에 대한 "마커"로서 사용될 수 있다. 더욱이, 효능제는 RCT에 효과적인 HDL의 아집단에 대한 마커로서 사용될 수 있다. 이를 위해, 효능제를 환자 혈청 샘플에 부가하거나 이와 혼합할 수 있으며; 적당한 항온 배양 시간 후, 혼입된 RCT 매개제를 탐지함으로써 HDL 성분을 검정할 수 있다. 이는 표지된 효능제 (예를 들면, 방사성 표지물, 형광 표지물, 효소 표지물, 염료 등)를 사용하여 달성하거나, 또는 효능제에 대해 특이적인 항체 (또는 항체 단편)을 사용하여 면역검정함으로써 달성할 수 있다.

또 다른 한편, 표지된 효능제를 영상화 과정 (예를 들면, CAT 스킨, MRI 스캔)에 사용하여 순환계를 가시화하거나, RCT를 모니터하거나, 또는 지방 줄무늬, 아테롬성 동맥경화증 병변 등에서의 HDL의 축적을 가시화할 수 있다 (여기서, HDL은 콜레스테롤 유출에 있어 활성이어야 한다).

역 콜레스테롤 수송의 매개제를 분석하기 위한 검정

LCAT 활성화 검정

바람직한 양태에 따르는 RCT의 매개제는 각종 시험관내 검정, 예를 들면, 시험관 내에서 LCAT를 활성화시킬 수 있는 능력에 의해 잠재적 임상 효능에 대해 평가할 수 있다. LCAT 검정에서는, 난 포스파티딜콜린 (EPC) 또는 1-팔미토일-2-올레일-포스파티딜-콜린 (POPC) 및 방사성 표지된 콜레스테롤로 구성된 기질 소포 (작은 단층 소포 또는 "SUVs")를 등가 질량의 펩티드 또는 ApoA-I (사람 혈장으로부터 분리됨)과 함께 예비항온 배양한다. LCAT (사람 혈장으로부터 정제됨)를 부가함으로써 상기 반응을 개시한다. 양성 대조군으로서 사용된 본래의 ApoA-I은 100% 활성화 활성을 나타낸다. 분자 매개제의 "특이 활성" (즉, 활성 (LCAT 활성화) 단위/질량 단위)는 최대 LCAT 활성화를 달성시켜 주는 매개제의 농도로서 산정될 수 있다. 예를 들어, 일련의 펩티드 농도 (예를 들면, 제한 희석)를 대상으로 검정하여, 매개제에 대한 "특이 활성" - 검정 중의 특정 시점 (예를 들면, 1시간)에서 최대 LCAT 활성화를 달성시켜 주는 농도 (즉, 콜레스테롤의 콜레스테롤 에스테르로의 전환률)를 결정할 수 있다. 예를 들어, 1시간에서의 콜레스테롤의 전환률을, 사용된 펩티드의 농도에 대해 플롯팅한 경우, 이러한 "특이 활성"은 플롯팅된 곡선 상의 안정기를 달성시켜 주는 펩티드의 농도로서 확인될 수 있다.

기질 소포의 제조

LCAT 검정에 사용된 소포는 난 포스파티딜콜린 (EPC) 또는 1-팔미토일-2-올레일-포스파티딜콜린 (POPC) 및 콜레스테롤이 20:1의 몰 비로 구성된 SUVs이다. 40회 검정에 충분한 소포 원액을 제조하기 위해, 7.7 mg EPC (또는 7.6 mg POPC; 10 μmol), 78 ㎍ (0.2 μmol) 4-¹⁴C-콜레스테롤, 116 ㎍ 콜레스테롤 (0.3 μmol)을 5 ml 크실렌에 용해시키고 동결건조시킨다. 그 후, 4 ml의 검정용 완충액을 무수 분말에 가하고, 4℃의 질소 대기 하에 초음파 처리한다. 초음파 처리 조건: 브란손 (Branson) 250 초음파 처리기, 10 mm 팁, 6x5 분; 검정용 완충액: 10 mM Tris, 0.14 M NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.4. 초음파 처리된 혼합물을 매회 14,000 rpm (16,000 x g)으로 5분 동안 6회 원심분리시켜 티타늄 입자를 제거한다. 수득한 투명 용액을 효소 검정에 사용한다.

LCAT의 정제

LCAT 정제를 위해, 사람 혈장을 덱스트란 설페이트/Mg²+ 처리하여 지단백질 결핍성 혈청 (LPDS)을 수득하고, 이를 페닐세파로스, 아피겔블루 (Affigelblue), 콘카나발린 (Concanavalin) A 세파로스 및 항-ApoA-I 친화 크로마토그래피 상에서순차적으로 크로마토그래피한다.

LPDS의 제조

LPDS를 제조하기 위해, 500 ml 혈장을 50 ml 덱스트란 설페이트 (MW=500,000) 용액에 가한다. 20분 동안 교반시킨다. 4℃에서 3000 rpm (16,000 x g)로 30분 동안 원심분리시킨다. 상등액 (LPDS)을 추가로 정제하기 위해 사용한다 (약 500 ml).

페닐세파로스 크로마토그래피

다음 물질과 조건을 페닐세파로스 크로마토그래피에 사용하였다. 고체 상: 페닐세파로스 고속 유동, 고 기질 등급, 파마시아칼럼: XK26/40, 겔 상 높이: 33 cm, V = 약 175 ml 유속: 200 ml/hr (샘플) 세척: 200 ml/hr (완충액) 용출: 80 ml/hr (증류수) 완충액: 10 mM Tris, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 7.4, 0.01% 나트륨 아지드.

상기 칼럼을 Tris-완충액에서 평형시키고, 29 g NaCl을 500 ml LPDS에 가하고, 칼럼에 적용한다. 280 nm 파장에서의 흡광도가 대략 기준선에 도달할 때까지 여러 용적의 Tris 완충액으로 세척한 다음, 증류수로의 용출을 시작한다. 단백질을 함유하는 분획을 모으고 (풀 크기: 180 ml)를 아피겔블루 크로마토그래피에 사용한다.

아피겔블루 크로마토그래피

페닐세파로스 풀을 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.01% 나트륨 아지드에 대해 4℃ 하에 밤새 투석한다. 한외여과 (Amicon YM30)시킴으로써 풀 용적이 50 내지 60 ml가 되도록 감소시키고 아피겔블루 칼럼 상에 부하한다. 고체 상: 아피겔블루, 바이오래드 (Biorad), 153-7301 칼럼, XK26/20, 겔 상 높이: 대략 13 cm; 칼럼 용적: 대략 70 ml. 유속: 부하: 15 ml/h 세척: 50 ml/h. 칼럼을 Tris-완충액에서 평형시킨다. 페닐세파로스 풀을 칼럼에 적용한다. 이와 동시에 분획을 수집하기 시작한다. Tris-완충액으로 세척한다. 모은 분획 (170 ml)을 ConA 크로마토그래피에 사용하였다.

ConA 크로마토그래피

아피겔블루 풀을 Amicon (YM30)을 통하여 30 내지 40 ml가 되도록 감소시키고 ConA 출발 완충액 (1 mM Tris HC1 pH 7.4; 1 mM MgCl₂, 1 mM MnCl₂, 1 mM CaCl₂, 0.01% 나트륨 아지드)에 대해 4℃ 하에 밤새 투석하였다. 고체 상: ConA 세파로스 (Pharmacia) 칼럼: XK26/20, 겔 상 높이: 14 cm (75ml). 유속: 부하: 40ml/h 세척 (출발 완충액을 이용함): 90ml/h 용출: 50 ml/h, 1 mM Tris, pH 7.4 중의 0.2M 메틸-α-D-만노시드. 만노시드 용출의 단백질 분획을 수집하고 (110ml), 한외여과 (YM30)시킴으로써 용적이 44 ml가 되도록 감소시켰다. ConA 풀을 2 ml 분취량으로 나누고, -20℃ 하에 저장하였다.

항-ApoA-I 친화 크로마토그래프

항-ApoA-I 친화 크로마토그래피는, 항-ApoA-I abs를 공유적으로 커플링시킨 아피겔-Hz 물질 (Biorad) 상에서 수행하였다. 칼럼: XK16/20, V = 16 ml. 이 칼럼을 PBS pH 7.4로 평형시켰다. 2 ml의 ConA 풀을 2시간 동안 PBS에 대해 투석시킨 후에 칼럼 상에 부하하였다. 유속: 부하: 15 ml/hr 세척 (PBS) 40ml/hr. 모은 단백질 분획 (V=14 ml)을 LCAT 검정에 사용한다. 이 칼럼을 0.1 M 시트레이트 완충액 (pH 4.5)으로 재생시켜 결합된 A-I (100 ml)를 용출시키고, 이러한 과정 직후에 PBS로 재평형시킨다.

RCT의 매개제의 약동학

다음 실험 프로토콜을 사용하여, RCT 매개제가 순환 동안 안정적이고 혈장의 HDL 성분과 회합된다는 것을 입증할 수 있다.

펩티드 효능제의 합성 및/또는 방사성 표지화

500 내지 900 cpm/ng의 특이 활성에 대한 요오드 모노클로라이드 과정에 의해 ^l25I-표지된 LDL을 제조하였다 [참조: Goldstein and Brown 1974 J. Biol. Chem. 249:5153-5162]. 배양된 사람 섬유아세포에 의한 저밀도 지단백질의 결합 및 분해는 문헌 [참조: Goldstein and Brown 1974 J. Biol. Chem. 249:5153-5162]에 기재된 바와 같이 500 내지 900 cpm/ng의 최종 특이 활성에서 결정하였다. 모든 경우에 있어, 상기 지단백질을 4℃에서 10% (wt/vol) 트리클로로아세트산 (TCA)과 함께 항온 배양함으로써, >99% 방사능이 침전 가능하였다. Tyr 잔기를 각 매개제의 N-말단에 부착시켜 이의 방사성 요오드화를 가능케 하였다. 요오도-비드 (Pierce Chemicals)를 사용하여, 상기 매개제를 Na¹²⁵I (ICN)으로 방사성 요오드화시키고, 제조업자의 프로토콜을 수행한 후, 800 내지 1000 cpm/ng의 특이 활성이 되도록 하였다. 투석 후, 펩티드의 침전 가능한 방사능 (10% TCA)은 항상 > 97%였다.

또 다른 한편, 방사성 표지된 매개제는 N-말단 아미노산으로서 ¹⁴C-표지된 FMOC-Pro를 커플링시킴으로써 합성할 수 있었다. 특이 활성이 9.25 GBq/mmol인 L-[U-¹⁴C]X를, X를 함유하는 표지된 효능제의 합성에 사용할 수 있다. 이러한 합성은 문헌 [참조: Lapatsanis, Synthesis, 1983, 671-173]에 따라서 수행할 수 있다. 간략하게 언급하면, 250 μM (29.6 mg)의 표지되지 않은 L-X를 225 ㎕의 9% Na₂C0₃ 용액에 용해시키고, 9.25 MBq (250 μM) ¹⁴C-표지된 L-X의 용액(9% Na₂C0₃)에 가한다. 이 액체를 0℃로 냉각시키고, 0.75 ml DMF 중의 600 μM (202 mg) 9-플루오레닐메틸-N-석신이미딜카르보네이트 (FMOC-OSu)와 혼합한 다음, 실온에서 4시간 동안 진탕시킨다. 그 후, 상기 혼합물을 디에틸에테르 (2 x 5 ml) 및 클로로포름 (1 x 5 ml)으로 추출하고, 나머지 수성 상을 30% HC1로 산성화시킨 다음, 클로로포름 (5 x 8 ml)으로 추출한다. 유기 상을 Na₂S0₄ 상으로 건조시키고, 여과 제거한 다음, 질소 유동 하에 용적을 5 ml로 감소시킨다. 순도는 UV 탐지 예를 들어, 방사화학 순도: 선형 분석기 (Berthold, Germany)에 의해 TLC (CHC1₃:MeOH:Hac, 9:1:0.1 v/v/v, 정지 상 HPTLC 실리카겔 60, Merck, Germany)로 평가하였으며, 반응 수율은 대략 90% (LSC에 의해 측정된 바와 같음)일 수 있다.

¹⁴C-펩티드 X를 함유하는 클로로포름 용액을 펩티드 합성에 직접 사용한다. 아미노산 2 내지 22개를 함유하는 펩티드 수지는 상기 언급된 바와 같이 자동으로 합성할 수 있고, 이를 합성에 사용할 수 있다. 이러한 펩티드의 서열은 에드만(Edman) 분해에 의해 결정된다. TBTU 대신 HATU (0-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-l,1,3,3-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트)를 바람직하게 사용하는 것을 제외하고는, 커플링 반응을 앞서 기재된 바와 같이 수행한다. 표지되지 않은 FMOC-L-X와의 제2 커플링을 수동으로 수행한다.

마우스에서의 약동학

각 실험에서, 300 내지 500 ㎍/kg (0.3 내지 0.5 mg/kg) [또는 예를 들어, 2.5 mg/k]의 방사성 표지된 매개제를, 정상적인 마우스 음식물 또는 동맥경화성 토마스-하르크로프트 (Thomas-Harcroft) 조절 식이 (이로써 VLDL 및 IDL 콜레스테롤이 심각하게 상승됨)가 공급된 마우스에게 복강내 주사할 수 있다. 혈장 내의 방사능을 평가하기 위해 수 차례 간격으로 혈액 샘플을 채취한다.

사람 혈청에서의 안정성

100 ㎍의 표지된 매개제를 2 ml의 신선한 사람 혈장과 혼합하고 (37℃), 즉시 (대조군 샘플) 또는 37℃ 하에 항온 배양한 지 8일 후에 (시험용 샘플) 탈지시킬 수 있다. 탈지는 지질을 등용적의 2:1 (v/v) 클로로포름:메탄올로 추출시킴으로써 수행한다. 이들 샘플을 역상 C_l8 HPLC 칼럼 상에 부하하고 선형 구배 (33분에 걸쳐 25 내지 58%)의 아세토니트릴 (0.1% w TFA를 함유함)로 용출시킨다. 용출 프로필에 이어 흡광도 (220nm) 및 방사능을 측정한다.

프레-β유사 입자의 형성

사람 HDL은 밀도 d = 1.21 g/ml에서 KBr 밀도 초원심 분리시킴으로써 분리하여 상부 분획을 수득한 다음, 슈퍼로스 6 겔 여과 크로마토그래피하여 HDL를 다른 지단백질로부터 분리시킬 수 있다. 분리된 HDL은, 브래드포드 (Bradford) 단백질 검정에 의해 결정된 단백질 함량을 근거로 하여 생리 식염수를 사용하여 1.0 mg/ml의 최종 농도가 되도록 조정한다. 300 ㎕ 분취량을 상기 분리된 HDL 제제로부터 제거하고, 100 ㎕의 표지된 매개제(0.2 내지 1.0 ㎍/㎕)와 함께 37℃ 하에 2시간 동안 항온 배양한다. 100 ㎕ 생리 식염수를 함유하는 블랭크와, 표지된 매개제의 4가지 희석물을 포함한, 별개의 다중항온 배양물을 분석한다. 예를 들면: (i) 0.20 ㎍/㎕ 펩티드:HDL 비 = 1:15; (ii) 0.30 ㎍/㎕ 펩티드:HDL 비 = 1:10; (iii) 0.60 ㎍/㎕ 펩티드:HDL 비 = 1:5; 및 (iv) 1.00 ㎍/㎕ 펩티드:HDL 비 = 1:3. 2시간 동안 항온 배양한 후, 200 ㎕ 분취량의 샘플 (총 용적 = 400 ㎕)을, 지단백질 분리와 분석을 위해 슈퍼로스 6 겔 여과 칼럼 상에 부하하고, 100 ㎕를 사용하여 부하된 총 방사능을 결정하였다.

매개제와 사람 지단백질과의 회합

매개제와 사람 지단백질 분획과의 회합은 표지된 매개제를 각 지단백질 부류 (HDL, LDL 및 VLDL), 및 상이한 지단백질 부류의 혼합물과 함께 항온 배양함으로써 결정할 수 있다. HDL, LDL 및 VLDL은 d = 1.21 g/ml에서 KBr 밀도 구배 초원심분리시킴으로써 분리시키고, 슈퍼로스 6B 칼럼 크기 배제 칼럼 상에서 FPLC에 의해 정제한다 (크로마토그래피는 0.7 ml/min의 유속을 이용하고, 1 mM Tris (pH 8), 115 mM NaCl, 2 mM EDTA 및 0.0% NaN₃의 수행 완충액을 이용하여 수행한다). 표지된 펩티드를 37℃ 하에 2시간 동안 1:5 (질량 비)의 매개제:인지질 비로 HDL, LDL 및 VLDL과 함께 항온 배양한다. 요구되는 양의 지단백질 (1000 ㎍을 생성시키는데 필요한 양을 기준으로 한 용적)을 0.2 ml의 펩티드 원액 (1 mg/ml)과 혼합하고, 이 용액을 0.9% NaCl을 사용하여 2.2 ml로 만들었다.

37℃ 하에 2시간 동안 항온 배양한 후, 총 방사능을 결정하기 위해 (예를 들면, 표지 동위원소에 따라서 액상 신틸레이션 계수 또는 감마 계수에 의함) 일정 분취량 (0.1 ml)을 꺼내고, 나머지 항온 배양 혼합물의 밀도를 KBr로 1.21 g/ml가 되도록 조정한 다음, 벡크만 타블레탑 (Beckman tabletop) 초원심분리기를 사용하여 TLA 100.3 회전자 내에서 샘플을 4℃하에 24시간 동안 100,000 rpm (300,000 g)으로 원심분리시킨다. 이로써 생성된 상등액을 대상으로 하여, 총 5 분획에 대해 각 샘플의 상부로부터 0.3 ml 분취량을 꺼냄으로써 분획화하고, 각 분획 0.05 ml를 계수에 사용한다. 상부의 2개 분획은 부유 지단백질을 함유하고 있고, 다른 분획 (3-5)은 용액 중의 단백질/펩티드에 상응한다.

HDL 지질에 대한 선택적 결합

사람 혈장 (2 ml)을 37℃ 하에 2시간 동안 20, 40, 60, 80, 및 100 ㎍의 표지된 펩티드와 함께 항온 배양한다. 밀도를 1.21 g/ml로 조정하고 4℃ 하에 36시간 동안 TLA 100.3 회전자에서 100,000 rpm (300,000 g)으로 원심분리시킴으로써 지단백질을 분리시킨다. 분석을 위해 상부 900 ㎕ (300 ㎕ 분획중)를 취한다. 각 300 ㎕ 분획으로부터의 50 ㎕를 대상으로 하여, 방사능에 대해 계수하고, 각 분획으로부터의 200 ㎕을 FPLC (슈퍼로스 6/슈퍼로스 12 조합 칼럼)에 의해 분석한다.

동물 모델 시스템에서 매개제의 용도

바람직한 양태의 RCT 매개제의 효능을 토끼 또는 기타 적합한 동물 모델에서 입증할 수 있다.

인지질/펩티드 복합체의 제조

인지질 (DPPC)과 펩티드로 이루어진 작은 원반형 입자를 콜레이트 투석 방법에 따라서 제조한다. 인지질을 클로로포름에 용해시키고, 질소 기류 하에 건조시킨다. 펩티드를 1 내지 2 mg/ml의 농도로 완충액 (식염수)에 용해시킨다. 지질막을, 콜레이트를 함유하는 완충액 (43℃)에 재용해시키고, 펩티드 용액을 3:1 인지질/펩티드 중량비로 가한다. 이 혼합물을 43℃ 하에 밤새 항온 배양하고, 43℃ (24시간), 실온 (24시간) 및 4℃ (24시간) 하에 투석시키는데, 이러한 온도에서 완충액 (대용적)을 3번 변화시켰다. 상기 복합체를 주사용으로 사용하기 위해 필터 멸균시키고 (0.22 ㎛) 4℃ 하에 저장할 수 있다.

펩티드/인지질 입자의 분리 및 특성 확인

입자를 겔 여과 칼럼 (슈퍼로스 6 HR) 상에서 분리시킬 수 있다. 이러한 입자를 함유하는 피크의 위치는 각 분획 내의 인지질 농도를 측정함으로써 식별한다. 용출 용적으로부터, 스토크스 반경을 결정할 수 있다. 복합체 내의 펩티드 농도는 페닐 알라닌 함량을 측정한 다음 (HPLC에 의함) 16시간 동안 산 가수분해시킴으로써 결정한다.

토끼 내에서의 주사

뉴질랜드산 숫컷 백색 토끼 (2.5 내지 3 kg)에게, 10 내지 15 ml를 초과하지 않는 단일 거환(single bolus) 주사제로 일정용량의 인지질/펩티드 복합체 (5 또는 10 mg/체중 kg, 펩티드로서 표시됨)를 복강내 주사한다. 이 동물을 조작하기 전에 약간 진정시켰다. 주사하기 전, 및 주사한 후 5, 15, 30, 60, 240 및 1440분째에 혈액 샘플 (EDTA 상에 수집됨)을 취한다. 각 샘플에 대한 적혈구 용적율 (Hct)을 결정한다. 샘플을 등분하고, 분석하기 전에 -20℃ 하에 저장한다.

토끼 혈청의 분석

총 혈장 콜레스테롤, 혈장 트리글리세라이드 및 혈장 인지질을, 시판용 검정, 예를 들면, 제조업자의 프로토콜(Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany and Biomerieux, 69280, Marcy-L'etoile, France)에 따라서 효소적으로 결정한다. 혈장을 지단백질 분획 내로 분리시킨 후에 수득된 분획의 혈장 지단백질 구배는 슈크로스 밀도 구배로 방사함으로써 결정할 수 있다. 예를 들어, 분획을 수집하고, VLDL, ILDL, LDL 및 HDL 지단백질 밀도에 상응하는 분획에서 통상적인 효소 분석함으로써 인지질과 콜레스테롤 수준을 측정할 수 있다.

개질된 아미노산을 함유한 RCT 매개제의 합성

친지질성기 개질된 펩티드 서열의 합성:(고체 지지체상에 스즈끼 커플링)

A₁A는 글루탐산이나 아르기닌(역 서열)을 나타내며,

AA₃는 아르기닌이나 글루탐산(역 서열)를 나타내고,

R은 각종 치환기, 페닐, 치환된 페닐, 할로겐, -CH₃, -OCH₃, 피리딘 등을 나타내고,

Pd 촉매의 예로는 예컨대 Pd(PPh₃)₄/Na₂CO₃와 Pd(PPh₃)Cl₂/KOH를 포함한다.

둥근바닥 플라스크에 수지 결합 요오도 화합물(1 G), Pd(PPh₃)₂CI₂ (14 mg, 0.02 mmol) 또는 당량의 Pd(PPh₃)₄ 그리고 과량의 페닐보론산(3.0 mmol)을 첨가하였다. 무수 DMF를 첨가하기전에 고체를 아르곤으로 플러쉬하고 실온에서 수분간 교반시킨후 수성 KOH 50 μL를 첨가하였다. 교반을 하룻밤동안 80℃에서 계속하였다.

반응 완결후, 소결된 유리펀널을 통해 여과하고 CH₂Cl₂, MeOH, 물 그리고 CH₂Cl₂로 세정하여 미반응된 출발 물질을 제거하였다. 수지를 진공하에 건조시켜 최종 생성물을 얻기위해 다음단계에 사용하였다.

수지 및 측쇄 보호기의 파단 및 HPLC 정제

TFA, 티오아니솔, 에탄디티올 및 아니솔 (90:5:3:2, v/v)의 혼합물(실온에서 4-5시간)을 사용하여 펩티드-수지로부터 펩티드를 떼어내고 모든 측쇄 보호기를 제거하였다. 조 펩티드 혼합물을 소결된 펀널로부터 여과하고 TFA로 (2-3번) 세정 하였다. 여과물을 진한 시럽으로 농축하고 차가운 에테르를 첨가하였다. 펩티드는 하룻밤 냉장고에서 보관하고 원심분리시켜 백색 고체로서 침전되었다. 용액을 기울여 따르고 고체를 완충액(0.1% TFA와 아세토니트릴:물 60:40)에 용해시키고 건조시켰다. 조 펩티드를 33분(분당 12 mL)에 35 - 50%인 B의 구배〔완충액 A: 0.1% (v/v) TFA을 함유한 물, 완충액 B: 0.1% (v/v) TFA을 함유한 아세토니트릴〕로 분취 C-18 컬럼(역상)을 사용한 HPLC에서 정제하였다. 순수한 분획은 동결건조되었다.

하프-디누디드 (정규 시리즈) 화합물의 합성:

수지 결합된 디펩티드를 글루타르산 또는 숙신산 무수물(2.0 mmol)과 반응시키고, 실온에서 NMP (10 mL)중에 DMAP(0.25 mmol)을 2시간동안 서서히 혼합하였다. 수지를 여과하고 CH₂Cl₂, 메탄올 그후 CH₂Cl₂ (각 15 mL)로 연속적으로 세정하였다. TFA/티오아니솔/EDT/아니솔(90:5:3:2)을 아미노산의 측쇄 탈보호와 수지로부터 합성된 펩티드의 분리에 사용하였다. 조 펩티드에 차가운 디에틸 에테르(Et₂O)를 첨가하여 침전시켰다. 하룻밤 냉장고에서 보관하고 원심분리시킨 후 펩티드는 백색 고체로서 침전되었다. 용액을 기울려 따르고 고체를 에테르로 철저히 세정하였다. 수득한 조 펩티드를 완충액(아세토니트릴:물 60:40; 0.1% TFA수반)에 용해시킨후 건조시켰다. 조 펩티드를 30분(분당 12 mL)에 35 - 50%인 B의 구배〔완충액 A: 0.1% (v/v) TFA을 함유한 물, 완충액 B: 0.1% (v/v) TFA을 함유한 아세토니트릴〕로 분취 C-18 컬럼(역상)을 사용한 HPLC에서 정제하였다. 3분을 포스트 런으로 하였다. 순수한 분획은 동결건조된 것이다.

합성된 화합물의 예는 다음 화합물을 함유한다:

합성된 화합물의 다른 예는 하기 표 4로 나타난 하기 화합물을 포함한다.

화합물 #	서열	분자 구조식	분자량
3	2,2-디메틸글루타릭-f-r-NH₂	C₂₂H₃₄N₆O₅	492.5
4	2,2-디메틸글루타릭-F-R-NH₂	C₂₂H₃₄N₆O₅	492.5
5	글루타릭-F-R-NH₂	C₂₀H₃₀N₆O₅	434.5
6	글루타릭-f-r-NH₂	C₂₀H₃₀N₆O₅	434.5
7	숙시닉(Succinic)-bip-r-NH₂	C₂₅H₃₂N₆O₅	496.5
8	숙시닉-BIP-R-NH₂	C₂₅H₃₂N₆O₅	496.5
9	숙시닉-F-R-NH₂	C₁₉H₂₈N₆O₅	420.5
10	숙시닉-f-r-NH₂	C₁₉H₂₈N₆O₅	420.5
11	2,2-디메틸글루타릭-bip-r-NH₂	C₂₈H₃₈N₆O₅	538.6
12	2,2-디메틸글루타릭-BIP-R-NH₂	C₂₈H₃₈N₆O₅	538.6
13	디메틸숙시닉-bip-r-NH₂	C₂₇H₃₆N₆O₅	524.6
14	디메틸숙시닉-BIP-R-NH₂	C₂₇H₃₆N₆O₅	524.6
15	글루타릭-F-K-NH₂	C₂₀H₃₀N₄O₅	406.4
16	숙시닉-F-K-NH₂	C₁₉H₂₈N₄O₅	392.4
17	숙시닉-f-k-NH₂	C₁₉H₂₈N₄O₅	392.4
18	2,2-디메틸글루타릭-F-K-NH₂	C₂₂H₃₄N₄O₅	434.5
19	2,2-디메틸글루타릭-f-k-NH₂	C₂₂H₃₄N₄O₅	434.5
20	디메틸숙시닉-f-k-NH₂	C₂₁H₃₂N₄O₅	420.5
21	디메틸숙시닉-F-K-NH₂	C₂₁H₃₂N₄O₅	420.5
22	디메틸숙시닉-Aic-r-NH₂	C₂₂H₃₂N₆O₅	460.5
23	2,2-디메틸글루타릭-Aic-r-NH₂	C₂₃H₃₄N₆O₅	474.5
24	글루타릭-Aic-r-NH₂	C₂₁H₃₀N₆O₅	446.5
25	숙시닉-Aic-r-NH₂	C₂₀H₂₈N₆O₅	432.4
26	글루타릭-Aic-R-NH₂	C₂₁H₃₀N₆O₅	446.5
27	테트라졸아미드글루타릭-BIP-R-NH₂	C₂₇H₃₅N₁₁O₄	577.6
28	3,3-디메틸글루타릭-Aic-R-NH₂	C₂₃H₃₄N₆O₅	474.5
29	디메틸숙시닉-Aic-R-NH₂	C₂₂H₃₂N₆O₅	460.5
30	2,2-디메틸글루타릭-Aic-R NH₂	C₂₃H₃₄N₆O₅	474.5

화합물의 추가적인 예로는 하기 합성 스킴으로 나타난 하기 화합물을 포함한다.

하프-디누디드(정규 시리즈)화합물의 합성

수지 결합된 디펩티드〔Ac-Glu(OtBu)-bip-수지〕를 2시간 동안 CH₂C1₂ 중의 1% TFA로 처리하여 측쇄 보호된 조 디펩티드를 수득하였다. 이 디펩티드(0.5 mmol)를 0℃에서 15-20분동안 HOBt (0.5 mmol), EDCI (0.5 mmol)으로 교반하고 보호된 아그마틴(0.5 mmol)을 첨가하였다. 이 용액을 실온으로 데우고 3시간동안 교반시켰다. 이 반응물을 물(15 mL)로 급냉시켰다. 수층을 CH₂Cl₂ (2XlOmL)로 추출하였다. 결합된 유기층을 염수(15 mL)로 세정하고 Mg₂SO₄상에서 건조한후 여과농축하였다. TFA/CH₂Cl₂ (3:7)의 혼합물을 아미노산의 측쇄 탈보호에 사용하였다. 조 펩티드는 차가운 디에틸 에테르(Et₂O)를 첨가하여 침전시켰다. 상기 언급된 조건을 사용함으로써 조 펩티드를 정제하였다.

합성된 화합물의 예로는 하기 화합물을 포함한다:

화합물의 추가적인 예로는 하기 화합물을 포함한다:

하프 디누디드(역 시리즈) 화합물의 합성

WANG 수지와 링크 아미드 MBHN 수지를 사용하여 표준 SPPS 프로토콜을 사용하여 이들 화합물을 제조하였다.

합성된 화합물의 예로는 하기 화합물을 포함한다:

일반적인 분석 방법

모든 시약은 공업용 품질이다. 용매를 건조하고 표준 방법으로 정제하였다. 아미노산 유도체를 Bachem Feinchemikalien AG로부터 얻었다. 분석 TLC는 머크사 실리카겔 60 F₂₅₄의 0.2 mm층으로 코팅된 알루미늄 시트에서 수행하였고, 분취 TLC는 실리카겔 PF₂₅₄의 2 mm층으로 코팅된 20 cm X 20 cm 유리 시트에서 수행하였다. 머크사 실리카겔 60(230-400 메쉬)를 플래쉬 크로마토그래피에 사용하였다. 분취 라디얼 크로마토그래피는 머크사제 2 mm 층의 실리카겔 PF₂₅₄으로 코팅된 20 cm 직경의 유리판상에서 수행하였다. 마이크로 핫스테이지 장치에서 융점을 측정하였으며 보정하지 않았다. ¹H NMR 스펙트럼는 기준으로 TMS 또는 용매를 사용하여 400 MHz에서 작동되는 Brucker 400 분광기에서 기록하였다. ¹³C NMR 스펙트럼은 50 또는 100 MHz에서 작동되는 Brucker 400 분광기에서 기록하였다. 원소분석은 CH-O-RAPID 장치에서 실시하였다. 분석 RP HPLC는 유속 1 ml/분의 워터스 μ본드팍 C₁₈(3.9 mm X 300 mm, 4μm) 또는 노바팍 C₁₈(3.9 mm X 150 mm, 4um)에서 214 nm로 설정된 조정가능한 UV 검출기를 사용하여 수행하였다. 이동상으로 CH₃CN(용매 A)와 H₂O중의 0.05% TFA(용매 B)의 혼합물을 사용하였다. 최종 생성물의 분석 및 분취 HPLC은 유속 15 ml/분의 페노메넥스 루나 5μ C₁₈(2)(60 mm X 21.2 mm)에서 254 nm로 설정된 조정가능한 UV 검출기를 사용하여 수행하였다. CH₃CN₂과 H₂O의 혼합물을 구배모드의 이동상으로 사용하였다. ESI-MS 실험은 휴렛 패커드 1100 MSD 장치상에서 포지티브 모드로 수행하였다.

방법 A1

FMOC-D-Phe-Bis-Boc-아그마틴(A-3)

The FMOC-D-페닐알라닌(1.125 g, 2.9 mmol)과 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt, 2.9 mmol)을 디클로로메탄(15 mL)에 현탁시키고 EDAC를 첨가한후 투명한 용액으로 만들고 실온에서 30분간 교반하였다. 이 용액을 이후 캐뉼러를 통해 DCM(15 mL)중에 용해된 BisBOC-아그마틴 (0.56 g, 2.9 mmol)으로 처리하였다. 반응 혼합물을 5시간 동안 교반한후 물(50 mL)로 급냉시켰다. 수층을 DCM (3X15 mL)로 추출하였다. 결합된 유기상을 염수(50 mL)로 세정한후 MgSO₄상에서 건조시키고 감압하에서 여과농축시켰다. 조 생성물을 다음 단계에 직접 사용하였다.

NH ₂ -D-Phe-Bis-Boc-아그마틴(A-4)

아미노 아미드로 보호된 조 FMOC를 DMF (20 mL)에 용해시킨후 피페리딘(2.9 mL, 10 equiv.)으로 처리하고, 이 반응물을 실온에서 8시간동안 교반한 다음 용매를 감압하에 제거하였다. 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 15:1; CHC1₃:TFA)로 정제하여 69% 수율로 순수한 아미노 아미드(0.95 g, 1.99 mmol)를 최종 생성물로 수득하였다.

글루타르산 아미드-D- Phe - 아그마틴 (A-6)

상기 아미노 아미드(0.544 g, 1.14 mmol)를 DCM (10 mL)에 용해시킨후 글루타르산 무수물 (0.269 g, 2.36 mmol)으로 처리하고, 이 반응 혼합물을 하룻밤 교반한후 용매를 제거하였다. 조 혼합물을 DCM:TFA (10 mL)의 1:1 혼합물에 용해시킨후 2시간동안 교반시켰다. 조 생성물을 역상HPLC (MeCN:물:TFA; 35:65:0.5 내지 50:50:0.5 20분에 걸쳐 동결건조에 의해 용매제거)에 의해 정제하여 TFA 염으로 목적 생성물(206 mg)을 수득하였다.

방법 A2

4-((S)-1-(4-구아니디노부틸카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)부탄산

디클로로메탄(14 mL)중의 N-FMOC-L-페닐알라닌 A-1(0.50 g, 1.4 mmol) 용액에 1-히드록시벤조트리아졸 (0.19 g, 1.4 mmol)을 첨가한후 EDAC·HCl (0.27 g, 1.42 mmol)로 처리하였다. 이 반응 혼합물은 투명한 용액으로 되는데, 이것을 실온에서 30분간 교반하였다. 이 용액을 0 ℃로 냉각시킨후 N,N'-디-t-부톡시카르보닐아그마틴 A-2(0.47 g, 1.4 mmol)로 처리하였다. 이 반응 혼합물을 실온으로 만들어 6시간동안 교반하였다. 반응물을 물(25 mL)로 급냉한후 수층을 DCM (3X7 mL)로 추출하였다. 결합된 유기층을 염수(25 mL)로 세정한후 MgSO₄상에서 건조시키고 감압하에서 여과농축시켜 A-3를 수득하였다. 조 A-3를 직접 다음단계에 사용하였다. 중간체 A-3를 DCM (10 mL)에 용해시킨후 피페리딘(1.4 mL, 14.1 mmol)으로 처리한후 이 반응 혼합물을 실온에서 5시간동안 교반한 다음 감압하에 용매를 제거하였다. 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 20:1; CHCl₃:TFA)로 정제하여 순수한 아민 A-4(0.5 g, 1.05 mmol)을 수득하였다. 상기 아민 A-4를 DCM (10 mL)에 용해시킨후 글루타르산 무수물 (0.15 g, 1.3 mmol)로 처리하고, 이 반응 혼합물을 하룻밤 교반한후 용매를 제거하였다. 조 생성물 A-5를 DCM:TFA (5 mL:5 mL)의 1:1 혼합물에 용해시킨후 4시간동안 교반시켰다. 용매를 감압하에 제거한후 에테르를 첨가하고, 에테르 혼합물을 -20 ℃에서 하룻밤 보관한후 에테르를 기울여 따르기하여 백색 고체 A-6를 수득하였다. 이 조생성물 A-6를 물(2 mL)에 용해시킨후 NaHCO₃ (기포 발생)로 처리하고 역상 HPLC (아세토니트릴:물)로 정제하였다. 용매는 동결건조기로 제거하여 목적 생성물(75 mg)을 수득하였다.

¹H-NMR (DMSO-d₆): δ1.35-2.25 (series of m, 11H), 2.70 (dd, J=10.8, 13.6Hz, 1H), 2.85-3.00 (m, 2H), 3.05-3.20 (m, 2H), 3.25-3.40 (m, 1H), 4.35-4.45 (m, 1H), 7.06 (br s, 1H), 7.10-7.30 (m, 7H), 8.20 (d, J=8.8Hz, 1H), 8.26 (d, J=4.8Hz, 1H); EIMS: 392.5 (MH)+. 분석치　(C₁₉H₂₉N₅O₄·0.28CF₃COOH·0.65H₂O)C,H,N.

4-((S)-1(4-구아니디노부틸카르바모일)-2-(4-(페닐)페닐)에틸카르바모일)부탄산

디클로로메탄 (4 mL)중의 N-FMOC-L-비페닐알라닌 A-1 (0.21 g, 0.46 mmol) 용액에 1-히드록시벤조트리아졸 (0.064 g, 0.48 mmol)을 첨가한후 EDAC·HCl (0.109 g, 0.57 mmol)로 처리하였다. 이 혼합물을 실온에서 30분간 교반시킨후 N,N'-디-t-부톡시카르보닐아그마틴 A-2 (0.47 g, 1.4 mmol)를 첨가하고 이 혼합물을 하룻밤 교반시켰다. 이 반응물을 물(20 mL)로 급냉시킨후 수층을 DCM (3X10 mL)로 추출하였다. 결합된 유기층을 염수(20 mL)로 세정한후 MgSO₄상에서 건조하고 감압하에 여과농축하였다. 조생성물 A-3를 직접 다음 단계에 사용하였다. 생성물 A-3를 DMF (2.8 mL)에 용해시킨후 피페리딘(0.4 mL, 4.0 mmol)으로 처리하고 이 반응 혼합물을 실온에서 4시간동안 교반한후 용매를 감압하에 제거하여 A-4를 수득하였다. 조 아민 A-4를 DCM (7.5 mL)에 용해시킨후 글루타르산 무수물 (0.11 g, 0.99 mmol)으로 처리하고, 이 반응 혼합물을 하룻밤 교반시켜 중간체 A-5를 얻고, 이를 TFA (1.3 mL)로 처리하고 하룻밤 교반시켰다. 용매는 감압하에 제거하고 조 생성물 A-6을 역상 HPLC(아세토니트릴:물:TFA)에 의해 정제하였다. 용매를 동결건조기로 제거하여 목적 생성물(70 mg)을 수득하였다. EIMS: 468.6 (MH)+.

4-((R)-1-(4-구아니디노부틸카르바모일)-2-(4-(페닐)페닐)에틸카르바모일)부탄산

일반 절차 방법 A2에 따라 N-FMOC-D-비페닐알라닌(0.21 g, 0.46 mmol)로부터 목적 생성물(57 mg)을 수득하였다. EIMS: 468.6 (MH)+.

방법 A1 또는 A2를 사용하여 합성된 화합물의 예는 다음과 같다:

방법 B1

Boc-D-Bip-(4-아미노부탄산 벤질 에스테르)(B-3)

Boc-D-Bip(4,4) 페닐알라닌 (0.682 g, 2.0 mmol)을 DCM (20 mL)에 용해시킨후 트리에틸아민(0.84 mL)을 첨가하고 PyBOP (1.14 g, 2.2 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 10분동안 교반한 후 벤질 4-아미노부타노에이트 (0.77 g, 2.1 mmol)의 pTsOH 염을 첨가하였다. 반응 혼합물을 4시간 동안 교반한후, 이 반응물을 물(40 mL)로 급냉시켰다. 수층을 DCM (3X20 mL)로 추출하였다. 결합된 유기층을 포화 중탄산 나트륨(80 mL), 물(80 mL), 그리고 염수(80 mL)로 세정한후 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 감압하에 여과농축시켰다. 조 혼합물을 컬럼 크로마토그래피(실리카겔, DCM 내지 DCM:MeOH 45:1)로 정제하여 90% 수율로 목적 생성물(0.92 g, 1.8 mmol)을 수득하였다.

NH ₂ -D-Bip-(4-아미노부탄산 벤질 에스테르)(B-4)

Boc 보호된 아미노아미드(0.92 g, 1. 8 mmol)를 함유한 플라스크를 얼음조에서 냉각시킨후 TFA(4.5 mL)를 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 실온으로 만들고 1시간동안 교반시킨후 과량의 TFA를 감압하에 제거하여 잔류물을 수득하였다. 에테르를 조 잔류물에 첨가한후 -20 ℃에서 밤새 보관한후, 이 혼합물을 초음파처리하여 여과에 의해 수집된 백색 고체(TFA 염)으로 목적 생성물(0.76 g)을 수득하였다.

Bis-Cbz-5-구아니디노펜탄산 아미드-D-Bip-(4-아미노부탄산 벤질 에스테르)(B-6)

비스-Cbz-5-구아니디노펜탄산(0.735 g, 1.72 mmol)을 THF (3 mL)에 용해시킨후 CDI(0.279, 1.72 mmol)에 첨가시켰다. 수분후에 기포가 발생되는 것을 볼수 있었다. 기포 발생이 중지된 후 이 반응 혼합물을 20분 동안 교반시켰다. 상기 기술된 TFA 아미노 아미드 염(0.76 g, 1.44 mmol)을 상기 반응 혼합물에 첨가한지 수분후에 용액이 투명하게되었다. 더 이상의 교반이 불가능한 침전물을 형성할때까지 반응 혼합물을 교반하였다. 고체를 여과 수집하여 에테르와 물로 세정하였다. 생성물 (1.16 g, 1.4 mmol)을 고진공하에 두어 잔류 용매를 제거하였다.

5-구아니디노펜탄산 아미드-D-Bip-(4-아미노부탄산)(B-7)

최종 생성물 전구체(1.16 g, 1.40 mmol)을 DMF (7 mL)에 현탁시킨 후 10% Pd/C(0.175 mg)을 첨가하고 이후에 메탄 술폰산(0.095 mL)을 첨가하였다. 교반된 현탁액을 수소 대기(발룬)하에 위치시키고 20 시간동안 교반시켰다. 고체를 여과제거하고 용매를 제거하였다. 조 생성물을 역상 HPLC (MeCN:물; 5:95 내지 85:15 15분간에 걸쳐, 동결건조기로 용매제거)로 정제하여 목적 생성물(0.30 g)을 수득하였다.

방법 B2

4-〔(R)-3-비페닐-4-일-2-(5-구아니디노-펜타노일아미노)-프로피오닐아미노〕-부티르산

DCM (20 mL)중의 N-Boc-D-비페닐알라닌 B-1(0.68 g, 2.0 mmol)의 용액에 트리에틸아민(0.84 mL, 6.0 mmol)을 첨가한후 PyBOP를 첨가하고 수득한 혼합물을 10분동안 교반시켰다. 이 반응 혼합물을 벤질 4-아미노부티레이트·파라톨루엔술폰산 B-2(0.77 g, 2.1 mmol)로 처리한후 4시간동안 교반시켰다. 이 반응물을 물(40 mL)로 급냉시킨후 수층을 DCM(3X20 mL)로 추출하였다. 결합된 유기층을 포화 NaHCO₃ 수용액(80 mL), 물(80 mL), 그리고 염수(80 mL)로 세정한후 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 감압하에 여과농축시켰다. 조 혼합물 B-3를 플래쉬 크로마토그래피(DCM:MeOH)로 정제하였다. 상기 고체 B-3(0.92 g)를 얼음조로 둥근 바닥 플라스크내에서 냉각시킨후 TFA (4.5 mL)로 처리한 다음 1시간동안 교반시켰다. 과량의 TFA를 제거하고 잔류물을 에테르로 가루화시켰다. 고체 B-4를 -20 ℃에서 밤새 보관한 후 여과수집하였다. TFA 염 B-4를 더 이상의 정제없이 다음단계에 사용하였다. THF (3 mL)중의 5-N,N'-디벤질옥시카르보닐구아니디노펜탄논산 B-5 (0.75 g, 1.76 mmol)을 N,N'-카르보닐디이미다졸 (0. 29 g, 1.76 mmol)로 처리한 다음 30분동안 (기포발생이 중단될때 까지) 교반시켰다. 교반된 용액에 이전에 만들어 둔 B-4를 첨가하고 더 이상의 교반이 필요없을 때까지 2 시간동안 교반시켰다. 고체 B-6를 여과수집하고 에테르로 세정한후 더 이상의 정제없이 다음단계에 사용하였다. 고체 B-6를 DMF (5.9 mL)중에 용해시킨후 질소 대기하에 위치시키고 그후 10% Pd/C를 첨가한후 메탄술폰산(0.085 mL, 1.23 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물을 수소하에 위치시키고 하룻밤 교반시켰다. 이후 수소 대기를 질소로 교체하고 고체를 여과제거하였다. 용매를 감압하에 제거하여 조생성물 B-7를 역상 HPLC (아세토니트릴:물)로 정제하였다. 용매는 동결건조로 제거하여 목적 생성물(214 mg)을 수득하였다. 융점은 269℃에 분해됨. ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ1.30-1.70 (series of m, 6H), 1.85-1.95 (m, 1H), 2.02 (t, J=6.6Hz, 2H), 2.15-2.25 (m, 1H), 2.77 (dd, J=10.2, 13.8Hz, 1H), 2.85-3.35 (series of m, 5H), 4.35-4.45 (m, 1H), 7.06 (br s, 1H), 7.25-7.4 (m, 3H), 7.44 (t, J=8.0Hz, 2H), 7.55 (d, J=8.4Hz, 2H) , 7.64 (d, J=8.4Hz) 8.18 (t, J=5.0Hz, 1H), 8.26 (d, J=8.8Hz, 1H), 9.93 (br s, 1H); EIMS: 468.7 (MH)+. 분석치. (C₂₅H₃₃N₅O₄·2.0H₂O) C, H, N.

4-〔(S)-3-비페닐-4-일-2-(5-구아니디노-펜타노일아미노)-프로피오닐아미노〕-부티르산

일반 절차 방법 B에 따라 N-Boc-L-비페닐알라닌 (0.68 g, 2.0 mmol) 로부터 목적 생성물(303 mg)을 수득하였다.

¹H-NMR (DMSO-d₆): δ1.30-1.70 (series of m, 6H), 1.85-1.95 (m, 1H), 2.02 (t, J=6.6Hz, 2H), 2.15-2.25 (m, 1H), 2.77 (dd, J=10.2, 13.8Hz, 1H), 2.85-3.35 (series of m, 5H), 4.35-4.45 (m, 1H), 7.06 (br s, 1H), 7.25-7.4 (m, 3H), 7.44 (t, J=8.0Hz, 2H), 7.55 (d, J=8.4Hz, 2H), 7.64 (d, J=8.4Hz) 8.18 (t, J=5.0Hz, 1H), 8.26 (d, J=8.8Hz, 1H), 9.81 (br s, 1H); EIMS: 468.7 (MH)+. 분석치. (C₂₅H₃₃N₅O₄·1.8H₂O)C,H,N.

4-〔(R)-3-페닐-2-(5-구아니디노-펜타노일아미노)-프로피오닐아미노〕-부티르산

일반 절차 방법 B에 따라 N-Boc-D-페닐알라닌(0.53 g, 2.0 mmol) 로부터 목적 생성물(152 mg)을 수득하였다. ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ1.25-1.65 (series of m, 6H), 1.85-2.00 (m, 1H), 2.03 (t, J=7.0Hz, 2H), 2.10-2.20 (m, 1H), 2.72 (dd, J=10.0, 13.6Hz, 1 H), 2.85-3.25 (series of m, 6H), 4.33-4.43 (m, 1H), 7.10-7.30 (m, 7H), 8.11 (t, J=5.2Hz, 1H), 8.16 (d, J=8.8Hz, 1H), 9.17 (br s, 1H); EIMS: 392.5 (MH)+. 분석치. (C₁₉H₂₉N₅O₄·0.5MeSO₃H·0.5H₂O)C,H,N.

4-〔(S)-3-페닐-2-(5-구아니디노-펜타노일아미노)-프로피오닐아미노〕-부티르산

일반 절차 방법 B에 따라 N-Boc-L-페닐알라닌 (0.53 g, 2.0 mmol)로부터 목적 생성물(140 mg)을 수득하였다. ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ1.25-1.65 (series of m, 6H), 1.95-2.15 (m, 4H), 2.03 (t, J=7.0Hz, 2H), 2.10-2.20 (m, 1H), 2.72 (dd, J=10.0, 13.6Hz, 1H), 2.90-3.15 (series of m, 6H), 4.35-4.50 (m, 1H), 7.10-7.30 (m, 5H), 7.50 (br s, 1H), 8.07 (t, J=5.4Hz, 1H), 8.13 (d, J=8.4Hz, 1H), 8.60 (br s, 1H); EIMS: 392.5 (MH)+. 분석치. (C₁₉H₂₉N₅O₄·0.55MeSO₃H·0.5H₂O)C,H,N.

방법 B를 사용하여 합성된 화합물의 예는 다음과 같다:

방법 C

4-(2-(4-구아니디노부틸카르바모일)-2,3-디히드로-1H-인덴-2-일카르바모일)부탄산

디클로로메탄(5 mL)중의 N-FMOC-2-아미노인단-2-카르복실산 C-1(0.20 g, 0.50 mmol)의 현탁액에 EDAC·HC1 (0.10 g, 0.52 mmol)을 첨가한후 이 혼합물은 30분간에 걸쳐 투명하게 되었다. 이 용액을 N,N'-디-t-부톡시카르보닐아그마틴 C-2 (0.174 g, 0.53 mmol)로 처리한후 3시간동안 교반하였다. 이 반응물을 물(15 mL)로 급냉시킨후 수층을 DCM (3X5 mL)로 추출하였다. 결합된 유기층을 물(15 mL)과 염수(15 mL)로 세정하고, Na₂SO₄상에서 건조시킨후 감압하에 여과농축시켰다. 조 생성물 C-3을 직접 다음 단계에 사용하였다. 고체 C-3를 DCM(4 mL)에 용해시킨후 4-(아미노메틸)피페리딘, 즉 4-AMP(0.54 g, 4.7 mmol)로 처리하고, 이 반응 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반시킨후 클로로포름(9 mL)으로 희석하였다. 유기층을 pH 5.5 포스페이트 완충액(3X15mL), 물(15 ml), 염수(15 mL)으로 세정한후 Na₂SO₄상에서 건조시키고 감압하에 여과농축시켰다. 조 생성물 C-4를 직접 다음단계에 사용하였다. 아민 C-4(0.172 g, 0.47 mmol)를 DCM (2.5 mL)에 용해시킨후 글루타르산 무수물(0.14 g, 1.2 mmol)로 처리하고 실온에서 4.5시간동안 교반시켰다. 용매를 감압하에 제거하여 잔류물 C-5를 수득하였는데, 이후 TFA로 처리하였다. 이 혼합물을 2시간 동안 교반시킨후 과량의 TFA를 감압하에 제거하였다. 조 생성물 C-6를 DMF와 물에 용해시키고 NaHCO₃ (0.10 g, 기포발생이 일어남)로 처리하였다. 조 생성물 C-6를 역상 정제한후 용매를 동결건조로 제거하여 목적 생성물(46 mg)을 수득하였다. ¹H-NMR (DMSO-d₆): 1.45-1.75 (series of m, 6H), 2.00 (t, J=7.0Hz, 2H), 2.10 (t, J=6.6Hz, 2H), 3.00-3.15 (m, 4H), 3.20(d, J=16.4Hz, 2H), 3.43 (d, J=16.8Hz, 2H), 7.0-7.2 (m, 6H), 8.21 (s, 1H); EIMS: 404.5 (MH)+. 분석치. (C₂₀₁H₂₉N₅O₄·0.5CF₃COOH H₂O·0.5H₂O)C,H,N.

방법 D

3-((S)-1-(4-구아니디노부틸카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)프로판산

0 ℃에서 디클로로메탄(5 mL)중의 N-FMOC-L-페닐알라닌 D-1 (0.387 g, 1.0 mmol) 현탁액에 트리에틸아민(0.15 mL, 1.1 mmol)을 첨가한후 이 용액이 투명하게 되었으며, 이후에 TBTU (0.32 g, 1.0 mmol)로 처리하였다. 이 반응물을 실온으로 만들어 1.5시간동안 교반시켰다. 이 용액을 N,N'-디-t-부톡시카르보닐아그마틴 D-2 (0.330 g, 1.0 mmol)로 처리한후 1시간20분 동안 교반시켰다. 이 반응물을 물(10 mL)로 급냉시킨후 수층을 DCM (3X5 mL)로 추출하였다. 결합된 유기층을 물(15 mL)과 염수(15 mL)로 세정한후 Na₂SO₄상에서 건조시키고 감압하에 여과농축시켰다. 조 생성물 D-3를 다음단계에 직접 사용하였다. 고체 D-3를 DCM(10 mL)에 용해시킨후 4-(아미노메틸)피페리딘 (1.2 g, 10.5 mmol)로 처리하였다. 이 반응 혼합물을 실온에서 2시간동안 교반시킨후 클로로포름(20 mL)으로 추출하였다. 유기층을 염수(2X30 mL), 포스페이트 완충액 pH 5.5 (3X30mL), 염수(30 mL) 로 세정한후, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고 감압하에 여과농축시켰다. 조 생성물 D-4를 다음 단계에 직접 사용하였다. 아민 D-4 (0.228 g, 0.48 mmol)를 THF (1.5 mL)에 현탁시킨 후 숙신산 무수물(0.055 g, 0.48 mmol)로 처리한후 실온에서 1.0 시간동안 교반시켰다. 용매를 감압하에 제거하여 점착성 잔류물 D-5을 수득하였다. 잔류물 D-5를 DCM (2 mL)에 용해시키고, 0 ℃로 냉각시킨후 TFA (2 mL)로 처리하였다. 이 혼합물을 3시간 동안 교반시킨후 용매를 감압하에 제거하였다. 조 생성물 D-6를 물(2 mL)에 용해시킨후 NaHCO₃(0.055 g, 기포가 발생됨)로 처리하였다. 조 생성물을 역상 HPLC (아세토니트릴:물)로 정제한후 용매를 동결건조에 의해 제거하여 목적 생성물(57 mg)을 수득하였다. ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ1.40-1.68 (series of m, 4H), 1.75-1.85 (m, 1H), 2.05-2.40 (series of m, 3H), 2.72 (dd, J=10.8, 14.0Hz, 1H), 2.95-3.25 (series of m, 5H), 4.23-4.35 (m, 1H) , 7.03 (br s, 2H), 7.15-7.30 (m, 5H), 7.90 (t, J=4.6Hz, 1H), 8.20 (d, J=8.4Hz, 1H); EIMS: 378.5 (MH)+. 분석치. (C₁₈H₂₇N₅O₄·0.07 CF₃COOH·2.10 H₂O) C,H,N.

4-((S)-1-(4-구아니디노부틸카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)-2,2-디메틸부탄산

환형 무수물로서 2,2-디메틸글루타르산 무수물을 사용한 일반 절차 방법 D에 따라 N-FMOC-L-페닐알라닌으로부터 목적 생성물(40 mg)을 수득하였다. ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ0.96 (s, 6H), 1.30-2.15 (series of m, 8H), 2.73 (dd, J=9.6, 13.6Hz, 1H), 2.90-3.35 (series of m, 6H), 4.30-4.45 (m, 1H), 7.03 (br s, 2H), 7.10-7.35 (m, 7H), 7.81 (br s, 1H), 8.09 (d, J=8.8Hz, 1H), 9.41 (br s, 1H); EIMS: 420.5 (MH)+. 분석치. (C₂₁H₃₃N₅O₄·0.47CF₃COOH·0.2 H₂O)C,H,N.

3-((S)-1-(4-구아니디노부틸카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)-2,2-디메틸프로판산

환형 무수물로서 2,2-디메틸글루타르산 무수물을 사용한 일반 절차 방법 D에 따라 N-FMOC-L-페닐알라닌으로부터 목적 생성물(54 mg)을 수득하였다. ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ1.01 (s, 3H), 1.15 (s, 3H), 1.40-1.65 (m, 4H), 1.74 (d, J=13.6Hz, 1H), 2.37 (d, J=13.6Hz, 1H), 2.71 (dd, J=10.6, 13.8Hz, 1H), 2.90-3.25 (m, 5H), 4.20-4.21 (m, 1H), 7.01 (br s, 2H), 7.12-7.28 (m, 5H), 8.09 (d, J=8.4Hz, 2H), 9.7(br s, 1H); EIMS: 406.5 (MH)+. 분석치. (C₂₀H₃₁N₅O₄·0.2CF₃COOH·1.0H₂O)C,H,N.

3-((S)-1-(4-구아니디노부틸카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)-3,3-디메틸프로판산

환형 무수물로서 2,2-디메틸글루타르산 무수물을 사용한 일반 절차 방법 D에 따라 N-FMOC-L-페닐알라닌으로부터 목적 생성물(30 mg)을 수득하였다. ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ0.80 (s, 3H), 0.84 (s, 3H), 1.40-1.70 (m, 4H), 2.04 (d, J=14.8Hz, 1H), 2.56 (d, J=14.8Hz, 1H), 2.83 (dd, J=12.0, 13.6Hz, 1H), 2.90-3.35 (series of m, 5H), 4.3-4.4 (m, 1H), 6.90 (s, 2H), 7.1-7.3 (m, 5H), 7.56 (d, J=8.8Hz, 2H), 8.28 (s, 1H), 10.19 (br s, 1H); EIMS: 406.5 (MH)+. 분석치 (C₂₀H₃₁N₅O₄·0.2CF₃COOH·1.0H₂O)C,H,N.

방법 E

3-((R)-1-(4-구아니디노부틸카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)-2,2-디메틸프로판산

0℃에 THF (5 mL)중의 N-FMOC-D-페닐알라닌 펜타플루오로페닐 에스테르 E-1 (0.556 g, 1.0 mmol) 용액에 트리에틸아민(0.14 mL, 1.0 mmol)을 첨가한후 N,N'-디-t-부톡시카르보닐아그마틴 E-2(0.330 g, 1.0 mmol)을 첨가하고 30분동안 교반시켰다. 이 반응 혼합물을 실온으로 만든후 4시간동안 교반시켰다. 이 반응물을 물(15 mL)로 급냉시킨후 수층을 DCM(3X10 mL)으로 추출하였다. 결합된 유기층을 물(30 mL)과 염수(30 mL)로 세정한 후 Na₂SO₄상에서 건조하고 감압하에 여과농축하여 고체 E-3를 수득하였다. 이 고체를 헥산중에 현탁시키고 -20 ℃로 냉각시킨후 여과수집하였다. 생성물 E-3는 다음단계에 직접 사용하였다. 고체 E-3를 DCM (8 mL)에 용해시킨 후 4-(아미노메틸)피페리딘 (1.2 g, 10.5 mmol)로 처리하고, 이 반응 혼합물을 실온에서 1시간동안 교반시킨후 클로로포름(17 mL)으로 희석시켰다. 유기층을 염수(35 mL), 포스페이트 완충액 pH 5.5(3X30mL), 염수(24 mL)로 세정한 후 Na₂SO₄상에서 건조시키고 감압하에 여과농축하였다. 아민 E-4 (0.35 g, 0.73 mmol)을 THF (1.0 mL)에 현탁시킨후 2,2-디메틸숙신산 무수물(0.118 g, 0.92 mmol)로 처리하고 실온에서 1.5시간동안 교반시켰다. 용매를 감압하에 제거하여 백색 잔류물 E-5를 수득하였는데, 이를 정제하지 않고 직접 다음단계에 사용하였다. 이 잔류물을 이소프로필 알콜(5 mL)에 용해시켰다. 이 혼합물을 얼음조에 냉각시킨 후 HCl 기체를 용액중에 5분간 불어넣은 후 동일 온도에서 추가적으로 45분동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 실온으로 만들어 15분동안 교반시킨후 용매를 감압하에 제거하였다. 조 생성물 E-6을 물(2.5 mL)에 용해시킨후 NaHCO₃ (0.065 g, 기포가 발생됨)로 처리하였다. 조 생성물 E-6를 역상 HPLC (아세토니트릴:물)로 정제한후 용매를 동결건조로 제거하여 목적 생성물(56 mg)을 수득하였다. ^lH-NMR (DMSO-d₆): δ1.00 (s, 3H), 1.13(s, 3H), 1.40-1.65(m, 4H), 1.78 (d, J=13.6Hz, 1H), 2.37 (d, J=13.6Hz, 1H), 2.71 (dd, J=10.6, 13.8Hz, 1H), 2.90-3.25 (m, 5H), 4.20-4.21 (m, 1H), 7.06 (br s, 2H), 7.12-7.28 (m, 5H), 8.05-8.14 (m, 2H); EIMS: 406.5 (MH)+. 분석치. 　　　(C₂₀H_3lN₅O₄·2.0H₂O)C,H.N.

4-((R)-1-(4-구아니디노부틸카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)부탄산

0℃에서 THF (4.5 mL)중의 N-FMOC-D-페닐알라닌 펜타플루오로페닐 에스테르 E-1(0.56 g, 1.0 mmol) 용액에 트리에틸아민(0.14 mL, 1.0 mmol)을 첨가한후 N,N'-디-t-부톡시카르보닐아그마틴 E-2(0.343 g, 1.0 mmol)로 처리하였다. 상기 반응 혼합물을 0℃에서 1시간동안 교반시킨후 이 반응물을 물(15 mL)로 급냉시켰다. 수층을 DCM(3X10 mL)로 추출하였다. 결합된 유기층을 물(25 mL), 염수(25 mL)로 세정하고 Na₂SO₄상에서 건조한후 감압하에 여과농축하였다. 잔류물 E-3를 에테르로 침전시킨후 에테르를 제거하고 잔류 고체를 헥산으로 가루화시켰다. 이 고체를 여과수집하여 더 이상 정제하지 않고 다음 단계에 직접 사용하였다. 고체 E-3를 DCM(10 mL)에 용해시킨후 4-(아미노메틸)피페리딘 (1.0 g, 8.8 mmol)으로 처리하고, 이 반응 혼합물을 실온에서 1시간동안 교반시킨후 클로로포름(18 mL)으로 희석하였다. 유기층을 염수(30 mL), 포스페이트 완충액 pH 5.5(3X30mL), 염수(30 mL)로 세정한후 Na₂SO₄상에서 건조시키고 감압하에 여과농축하였다. 조 생성물 E-4의 일부를 다음 단계에 직접 사용하였다. 조 아민 E-4(0.22 g, 0.46 mmol)를 THF (2.5 mL)에 용해시킨 후 글루타르산 무수물(0.11 g, 0.99 mmol)로 처리하고 실온에서 2시간동안 교반시켰다. 용매를 감압하에 제거하여 유리상 잔류물 E-5를 수득하였다. 이 잔류물을 에테르와 초음파로 처리하여 고체를 수득하였는데, 이를 -20℃에서 하룻밤 보관하였다. 에테르를 제거한후 고체 E-5를 DCM (2 mL)에 용해시키고, 0 ℃로 냉각시킨후 TFA로 처리하였다. 이 혼합물을 실온으로 만들어 1시간동안 교반시켰다. 용매를 감압하에 제거하고 수득한 잔류물 E-6를 물(2 mL)에 용해시킨후 NaHCO₃ (기포가 발생됨)로 처리하였다. 조 생성물 E-6를 역상 HPLC (아세토니트릴:물)로 정제한후 용매는 동결건조기에 의해 제거하여 목적 생성물(81 mg)을 수득하였다. ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ1.35-2.25 (series of m, 11H), 2.70 (dd, J=10.8, 13.6Hz, 1H), 2.85-3.00 (m, 2H), 3.05-3.20 (m, 2H), 3.25-3.40 (m, 1H), 4.35-4.45 (m, 1H), 7.10-7.30 (m, 7H), 8.15-8.25 (m, 2H), 9.57 (br s, 1H); EIMS: 392.5 (MH)+. 분석치. (C₁₉H₂₉N₅O₄·2.0 H₂O) C,H,N.

3-((R)-1-(4-구아니디노부틸카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)프로판산

환형 무수물로서 숙신산 무수물을 사용한 일반 절차 방법 E에 따라 N-FMOC-D-페닐알라닌 펜타플루오로페닐 에스테르로부터 목적 화합물 90 mg을 수득하였다. ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ1.40-1.85 (series of m, 5H), 2.05-2.40 (series of m, 3H), 2.71 (dd, J=11.6, 14.0Hz, 1H), 2.95-3.35 (series of m, 6H), 4.20-4.35 (m, 1H), 6.95 (br s, 2H), 7.10-7.30 (m, 5H), 7.89 (t, J=4.4Hz, 1H), 8.22 (d, J=8.4Hz, 1H), 10.0 (s, 1H); EIMS: 378.5 (MH)+. 분석치. (C₁₈H₂₇N₅O₄·0.11CF₃COOH·1.44H₂O)C,H,N.

4-((R)-1-(4-구아니디노부틸카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)-2,2-디메틸부탄산

환형 무수물로서 2,2-디메틸글루타르산 무수물을 사용하여 일반 절차 방법 E에 따라 N-FMOC-D-페닐알라닌 펜타플루오로페닐 에스테르로부터 목적 화합물(72 mg)을 수득하였다. MP 169℃; ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ0.939 (s, 3H), 0.942 (s, 3H), 1.25-2.15 (series of m, 8H), 2.73 (dd, J=9.6, 13.6Hz, 1H), 2.85-3.35 (series of m, 6H), 4.30-4.45 (m, 1H), 7.03 (br s, 2H), 7.0-7.3 (m, 8H), 7.74 (s, 1H), 8.09 (d, J=8.8Hz, 1H), 10.02 (s, 1H); EIMS: 420.5 (MH)+. 분석치. (C₂₁H₃₃N₅O₄·2.0H₂O)C,H,N.

4-((R)-1-(4-구아니디노부틸카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)-3,3-디메틸부탄산

환형 무수물로서 3,3-디메틸글루타르 무수물을 사용하여 일반 절차 방법 E에 따라 N-FMOC-D-페닐알라닌 펜타플루오로페닐 에스테르로부터 목적 화합물(46 mg)을 수득하였다. ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ0.85 (s, 3H), 0.99 (s, 3H), 1.35-1.65 (m, 4H), 1.93 (s, 2H), 2.02 (d, J=12.8, 1H), 2.13 (d, J=12.8Hz, 1H), 2.70-3.20 (series of m, 5H), 2.56 (d, J=14.8Hz, 1H), 2.83 (dd, J=12.0, 13.6Hz, 1H), 2.90-3.35 (series of m, 5H), 4.40 (dd, J=7.8, 13.8Hz, 1H), 7.0 (br s, 2H), 7.1-7.3 (m, 5H), 8.10 (d, J=4.8Hz, 1H), 9.23 (d, J=8.0Hz, 1H), 10.1 (br s, 1H); EIMS: 420.5 (MH) +. 분석치. (C₂₁H₃₃N₅O₄·0.25CF₃COOH·2.04H₂O)C,H, N.

4-((S)-1-(4-구아니디노부틸카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)-3,3-테트라메틸렌부탄산

환형 무수물로서 3,3-테트라메틸글루타르산 무수물을 사용하여 일반 절차 방법 E에 따라 N-FMOC-L-페닐알라닌 펜타플루오로페닐 에스테르로부터 목적 화합물(64 mg)을 수득하였다. ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ1.10-1.70 (series of m, 12H), 1.97 (dd, J=11.4, 19.8Hz, 2H), 2.04 (d, J=13.6Hz, 1H), 2.22 (d, J=13.6Hz, 1H), 2.77 (dd, J=8.8, 13.6Hz, 1H), 2.80-3.20 (series of m, 4H), 4.35-4.45 (m, 1H), 6.95 (s, 2H), 7.1-7.3 (m, 5H), 8.26 (d, J=5.6Hz, 1H), 8.77 (d, J=8.4Hz, 1H), 10.0 (br s, 1H); EIMS: 446.5 (MH)+. 분석치. (C₂₃H₃₅N₅O₄·2.0H₂O)C,H,N.

4-((S)-1-(4-구아니디노부틸카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)-3,3-펜타메틸렌부탄산

환형 무수물로서 1,1-시클로헥산디아세트산 무수물을 사용한 일반 절차 방법 E에 따라 N-FMOC-L-페닐알라닌 펜타플루오로페닐 에스테르로부터 목적 화합물(24 mg)을 수득하였다. ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ1.10-1.60 (series of m, 14H), 1.95-2.10 (m, 3H), 2.19 (d, J=13.2Hz, 1H), 2.70-3.15 (series of, 5H), 4.40 (dd, J=7.8, 14.2Hz, 1H), 6.96(s, 2H), 7.1-7.3 (m, 5H), 8.13 (d, J=5.2Hz, 1H), 9.24 (d, J=7.6Hz, 1H), 10.0 (br s, 1H); EIMS: 460.6 (MH)+. 분석치. (C₂₄H₃₇N₅O₄·2.0H₂O)C,H,N.

4-((S)-1-(4-구아니디노부틸카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)-3,3-디메틸부탄산

무수물로서 3,3-디메틸 글루타르산 무수물을 사용한 일반 절차 방법 E에 따라 N-FMOC-L-페닐알라닌 펜타플루오로페닐 에스테르로부터 목적 화합물(76 mg)을 수득하였다. ¹H-NMR (DMSO-d₆): 0.85 (s, 3H), 0.99 (s, 3H), 1.35-1.60 (m, 4H), 1.93 (s, 2H), 2.02 (d, J=13.2Hz, 1H), 2.12 (d, J=13.2Hz, 1H), 2.70-3.15 (series of, 5H), 4.40 (dd, J=8.0, 14.0Hz, 1H), 6.95 (s, 2H), 7.1-7.3 (m, 5H), 8.05-8.15 (m, 1H), 9.22 (d, J=8.0Hz, 1H), 10.09 (s, 1H); EIMS: 420.5 (MH)+. 분석치. (C₂₁H₃₃N₅O₄·1.3H₂O)C,H,N

방법 F

4-((S)-1-(4-(2,3-디-t-부톡시카르보닐구아니디노)부틸카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)부탄산

0℃에서 THF (1.5 mL)중에 N-FMOC-L-페닐알라닌 펜타플루오로페닐 에스테르 F-1 (0.185 g, 0.33 mmol) 용액에 트리에틸아민(0.05 mL, 0.36 mmol)을 첨가한후 N,N'-디-t-부톡시카르보닐아그마틴 F-2 (0.111 g, 0.34 mmol)로 처리하였다. 이 반응 혼합물을 0℃에서 15분 동안 교반한후 반응물을 실온으로 만들고 2시간동안 교반시켰다. 이 반응물을 물(5 mL)로 급냉시키고 수층을 DCM (3X5 mL)로 추출하였다. 결합된 유기층을 물(10 mL), 염수(10 mL)로 세정하고 Na₂SO₄상에서 건조시킨후 감압하에 여과농축하여 다음단계에 직접 사용되는 중간체 F-3를 수득하였다. 고체 F-3를 DCM(3 mL)에 용해시킨후 4-(아미노메틸)피페리딘 (0.29 g, 2.5 mmol)로 처리하고, 이 반응 혼합물을 실온에서 3시간동안 교반한후 클로로포름(8 mL)으로 희석하였다. 유기층을 염수(2X10 mL), 포스페이트 완충액 pH 5.5 (3XlOmL), 염수(10 mL)로 세정한후 Na₂SO₄상에서 건조시키고 감압하에 여과농축시켰다. 조 생성물 F-4를 다음 단계에 직접 사용하였다. 아민 F-4를 THF(1.0 mL)에 용해시킨 후 글루타르산 무수물(0.03 g, 0.26 mmol)로 처리하고 실온에서 1시간동안 교반하였다. 용매를 감압하에 제거하여 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물 F-5를 역상 HPLC (아세토니트릴:물)로 정제하여 백색 고체로 목적 생성물(17 mg)을 수득하였다. MP 86℃; ^lH-NMR (DMSO-d₆): 1.35-1.45 (m, 4H), 1.38 (s, 9H), 1.47 (s, 9H), 1.50-1.65 (m, 2H), 2.00-2.15 (m, 4H), 2.60-3.35 (series of, 7H), 4.40-4.45 (m, 1H), 6.95 (s, 2H), 7.1-7.3 (m, 5H), 7.96 (t, J=5.6Hz, 1H), 8.06 (d, J=8.4Hz, 1H), 8.26 (t, J=5.4Hz, 1H); EIMS: 592.7 (MH)+. 분석치. (C₂₉H₄₅N₅O₈·0.55H₂O)C,H,N.

방법 G

N-(4-(4,5- 디히드로 -1H- 이미다졸 -2- 일아미노 )부틸)-2-(4- 포르밀 -4- 메틸펜탄아미도 )-2,3-디히드로- lH - 인덴 -2- 카르복사미드

디클로로메탄(20 mL)중의 N-Boc-2-아미노인단-2-카르복실산 G-1 (0.55 g, 2.0 mmol) 현탁액에 EDAC·HCl (0.39 g, 2.0 mmol)을 첨가하였는데, 이 혼합물은 30분간에 걸쳐 투명하게 되었다. 이 용액을 N-카르보벤족시-1,4-디아미노부탄 히드로클로라이드 G-2 (0.52 g, 2.0 mmol)으로 처리한 후 트리에틸아민(0.28 mL, 2.0 mmol)으로 처리하고 하룻밤 교반시켰다. 이 반응물을 물(60 mL)로 급냉시킨후 수층을 DCM (3X20 mL)로 추출하였다. 결합된 유기층을 물(50 mL)과 염수(50 mL)로 세정한 후 Na₂SO₄상에서 건조하고 감압하에 여과농축하였다. 조 생성물 G-3은 더 이상 정제하지 않고 다음 단계에 사용하였다. 고체 G-3를 에틸아세테이트(10 mL)와 에탄올(10 mL)에 용해시킨 후 질소 대기하에 위치시키고 이후 10% Pd/C (0.44 g)를 첨가하였다. 이 혼합물을 수소(발룬)하에 위치시키고 6시간동안 교반시켰다. 수소 대기는 질소로 교체하고 고체를 여과제거하였다. 용매를 감압하에 제거하고, 잔류물을 헥산:에테르로 초음파처리하여 다음 단계에 더 이상 정제하지 않고 사용하는 백색 고체 G-4를 수득하였다. 중간체 아민 G-4 (0.42 g, 1.2 mmol)를 아세토니트릴(8.5 mL)에 용해시킨후 2-메틸티오-2-이미다졸린히드로클로라이드 G-5(0.30 g, 1.2 mmol)로 처리하고 3시간 동안 환류시켰다. 용매를 감압하에 제거하고 에테르를 첨가한후 다시 감압하에 제거하여 백색 거품으로서 G-6를 수득하였다. 수득한 백색 거품 G-6를 이소프로필 알콜(8 mL)에 용해시켰다. 수득한 용액을 얼음조에 냉각시킨 후 HCl 기체를 용액에 5분간 불어넣고, 그 혼합물을 교반한후 추가적으로 15분간 교반한 후 용매를 감압하에 제거하였다. 잔류물 G-7을 DMF (8.5 mL)에 용해시킨후 트리에틸아민(0.18 mL, 1.29 mmol)을 첨가한 후 2,2-디메틸글루타르산 무수물을 첨가하고, 이 혼합물을 하룻밤 교반시켰다. 용매를 감압하에 제거하고 잔류물 G-8을 물(1 mL)에 용해시킨 후 NaHCO₃(0.2 g)로 처리하였다. 조 생성물 G-8을 역상 HPLC (아세토니트릴:물)로 정제한 후 용매를 동결건조기상에서 제거하여 목적 생성물(79 mg)을 수득하였다. ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ0.95 (s, 6H), 1.40 (br s, 4H), 1.59 (t, J=7.8Hz, 2H), 2.07 (t, J=7.8Hz, 2H), 3.06 (br s, 4H), 3.13 (d, J=16.8Hz, 2H), 3.43 (d, J=16.8Hz, 2H), 3.54 (br s, 4H), 7.05-7.20 (m, 4H), 7.56 (t, J=5.4Hz, 1H), 7.96 (s, 1H), 8.09 (br s, 1H), 11.0 (br s, 1H), 11.1 (br s, 1H); EIMS: 458.5 (MH)+. 분석치. (C₂₄H₃₅N₅O₄·2.l2H₂O) C,H,N.

방법 H

N-((R)-1-(4-(4,5-디히드로-1H-이미다졸-2-일아미노)부틸카르바모일)-2-페닐에틸)-4-포르밀부탄아미드

0 ℃에서 DCM (10 mL)중의 N-Boc-D-페닐알라닌 H-1 (0.27 g, 1.0 mmol) 용액에 PyBOP (0.52 g, 1.0 mmol)을 첨가한후 수득한 혼합물을 5분간 교반하고 이후 실온으로 만든후 다시 추가적으로 30분간 교반하였다. 이 반응 혼합물을 N-카르보벤족시-1,4-디아미노부탄 히드로클로라이드 H-2 (0.26 g, 1.0 mmol)으로 처리한후 트리에틸아민(0.44 mL, 3.2 mmol)으로 처리하고 4시간동안 교반하였다. 이 반응물을 물(20 mL)로 급냉한 후 수층을 DCM (3X10 mL)로 추출하였다. 결합된 유기층을 물(30 mL), 염수(30 mL)로 세정한후 Na₂SO₄상에서 건조하고 감압하에 여과농축하였다. 잔류물을 에테르:헥산으로 가루화시키고 고체 H-3를 여과수집하였다. 수득한 고체 H-3를 에틸아세테이트(2 mL)와 에탄올(4 mL)의 혼합물에 용해시키고 질소 대기하에 위치시킨 후 10% Pd/C (0.10 g)을 첨가하였다. 이 혼합물을 수소(발룬)하에 위치시키고 6시간동안 교반시켰다. 수소 대기를 이후에 질소로 교체하고 고체를 여과에 의해 제거하였다. 용매를 감압하에 제거하고 잔류물을 헥산:에테르로 초음파처리하여 여과에 의해 수집되어 다음단계에 더 이상의 정제없이 사용되는 백색 고체 H-4를 수득하였다. 중간체 아민 H-4 (0.145 g, 0.43 mmol)를 아세토니트릴(3.0 mL)에 용해시키고 2-메틸티오-2-이미다졸린 히드로클로라이드 H-5 (0.10 g, 0.43 mmol)로 처리한후 2시간동안 환류시켰다. 이 혼합물을 실온으로 냉각시킨후 용매를 감압하에 제거하였다. 잔류물을 에테르로 처리한후 에테르를 감압하에 제거하여 백색 거품으로 H-6를 수득하였다. 중간체 H-6를 메틸 알콜(5 mL)에 용해시키고 0℃로 냉각시킨 후 HCl 기체를 5분동안 용액을 통해 불어넣었다. 용매를 감압하에 제거하고 조 생성물 H-7을 다음 단계에 직접 사용하였다. 잔류물 H-7를 THF (2.5 mL), DMF (3.0 mL) 및 DCM (2 mL)의 혼합물에 용해시킨 후 트리에틸아민(0.12 mL, 0.86 mmol)을 첨가한후 글루타르산 무수물을 첨가하였다.

이 혼합물을 4시간 동안 교반한 후 용매를 감압하에 제거하였다. 잔류물을 물(2 mL)과 DMSO(여러 방울)에 용해시킨후 NaHCO₃(0.088 g, 기포가 발생됨)로 처리하였다. 조 생성물 H-8를 역상 HPLC (아세토니트릴:물)에 의해 정제한후 용매를 동결건조에 의해 제거하여 목적 생성물(22 mg)을 수득하였다. ¹H-NMR (DMSO-d₆): 1.25-2.25 (series of m, llH), 2.69 (dd, J=10.8, 13.6Hz, 1H), 2.85-3.20 (series of m, 5H), 3.54 (s, 4H), 4.35-4.45 (m, 1H), 7.1-7.3 (m, 5H), 8.09 (d, J=4.8Hz, 1H), 8.19 (d, J=8.8Hz, 1H), 10.8 (br s, 1H), 10.9 (br s, 1H); EIMS: 418.5 (MH)+. 분석치. (C_2lH_3lN₅O₄·2.0H₂O)C,H,N.

방법 I

4-(2-(4-아미노부틸카르바모일)-2,3-디히드로-1H-인덴-2-일카르바모일)부탄산

디클로로메탄 (20 mL)중의 N-Boc-2-아미노인단-2-카르복실산 I-1 (0.55 g, 2.0 mmol) 현탁액에 EDAC·HCl (0.40 g, 2.1 mmol)을 첨가하였으며, 이 혼합물을 30분간에 걸쳐 투명하게 되었다. 이 용액을 N-카르보벤족시-1,4-디아미노부탄 히드로클로라이드 I-2(0.53 g, 2.0 mmol)로 처리한후 트리에틸아민(0.28 mL, 2.0 mmol)으로 처리하고 하룻밤 교반시켰다. 이 반응물을 물(40 mL)로 냉각시킨 후 수층을 DCM (3X15 mL)로 추출하였다. 결합된 유기상을 물(40 mL)과 염수(40 mL)로 세정한 후 Na₂SO₄상에 건조시키고 감압하에 여과농축시켰다. 수득한 잔류물을 에틸아세테이트:헥산으로 처리하여 여과에 의해 수집되어 더 이상의 정제없이 다음단계에 사용되는 백색 고체 I-3를 수득하였다. 고체 I-3를 DCM (10 mL)에 용해시키고 0℃로 냉각시켜 TFA (10 mL)로 처리하였다. 이 반응 혼합물을 30분간 교반시킨 후 실온으로 만들어 3시간동안 교반시키고 용매는 이후 감압하에 제거하였다. 잔류물을 클로로포름(30 mL)에 용해시킨 후 유기 용액을 포화 수용액NaHCO₃ (20 mL), 염수(20 mL)로 세정한 후, Na₂SO₄상에서 건조시키고 감압하에 여과농축하였다. 조 생성물 I-4를 다음 단계에 직접 사용하였다. 아민 I-4 (0.62, 1.63 mmol)를 THF (6.6 mL)에 용해시킨 후 글루타르산 무수물(0.186 g, 1.63 mmol)로 처리하고 실온에서 하룻밤 건조시켰다. 추가적인 글루타르산 무수물(0.009 g, 0.08 mmol)과 트리에틸아민(0.05 mL, 0.34 mmol)을 첨가하고 이 혼합물을 하룻밤 교반시킨 후 용매를 감압하에 제거하였다. 이 잔류물을 DCM (15 mL)에 용해시키고 1 M HCl (15 mL)로 분배시켰다. 수층을 DCM (2X10 mL)로 추출하였다. 결합된 유기층을 물(25 mL), 염수(20 mL)로 세정한 후 Na₂SO₄상에서 건조시키고 감압하에 여과농축시켰다. 조 생성물 I-5을 다음 단계에 직접 사용하였다. 중간체 I-5를 질소하에 THF에 용해시키고 10% Pd/C을 첨가한후 메탄올을 첨가하였다. 이 혼합물을 수소(발룬)하에 위치시키고 하룻밤 교반시켰다. 이 혼합물을 질소하에 위치시킨 후 고체를 여과제거하였다. 용매를 감압하에 제거하였다. 조 생성물 I-6를 역상 HPLC (아세토니트릴:물)로 정제하여 백색 고체로서 목적 화합물(151 mg)을 수득하였다. MP 132℃; ¹H-NMR (DMSO-d₆): 1.40-1.50 (m, 2H), 1.50-1.60 (m, 2H), 1.60-1.70 (m, 2H), 1.98 (t, J=6.8Hz, 2H), 2.08 (t, J=6.6Hz, 2H), 2.71 (t, J=7.4Hz, 2H), 3.07 (dd, J=5.4, 11.0Hz, 2H), 3.17 (d, J=16.8Hz, 2H), 3.43 (d, J=16.8Hz, 2H), 7.1-7.2 (m, 4H), 8.17 (t, J=5.2Hz, 1H), 8.30-8.40 (m, 1H); EIMS: 362.7 (MH)+. 분석치. (C₁₉H₂₇N₃O₄·3.75H₂O)C,H,N.

방법 J

4-(2-(4-(2-시아노구아니디노)부틸카르바모일)-2,3-디히드로-1H-인덴-2-일카르바모일)부탄산

이소프로필 알콜(5 mL)중의 I-8 (0.140 g, 0.39 mmol) 용액을 디페닐 시아노카르본이미데이트 J-1(0.093 g, 0.39 mmol)으로 처리하고 가열하여 3시간동안 환류시켰다. 이 혼합물을 실온으로 냉각시킨 후 용매를 감압하에 제거하였다. 조 물질 J-2를 다음 단계에 직접 사용하였다. 잔류물 J-2를 에틸 알콜(6 mL)에 용해시킨 후 0℃로 냉각시키고 암모니아 가스를 용액중에 불어넣었다. 반응 용기를 밀봉하고 이 혼합물을 실온에서 17시간동안 교반시켰다. 용기를 이후 후드에서 배기시키고 용매를 감압하에 제거하였다. 조 생성물 J-3를 역상 HPLC (아세토니트릴:물)로 정제하여 백색 고체로서 목적 화합물(22 mg)을 수득하였다. MP 105℃; ¹H-NMR (DMSO-d₆): 1.38 (s, 4H), 1.60-1.70 (m, 2H), 2.05-2.20 (m, 4H), 2.95-3.08 (m, 4H), 3.13 (d, J=16.8Hz, 2H), 3.44 (t, J=16.8Hz, 2H), 6.75 (br s, 2H), 7.05-7.20 (m, 5H), 7.78 (br s, 1H), 8.20 (s, 1H) ; EIMS: 429.5 (MH)+. 분석치. (C₂₁H₂₈N₆O₄·1.00H₂O) C,H,N.

방법 K

4-((S)-1-(4-아미노부틸카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)부탄산

0℃에서 THF (4.5 mL)중의 N-FMOC-L-페닐알라닌 펜타플루오로페닐 에스테르 K-1 (0.56 g, 1.0 mmol)의 용액에 트리에틸아민(0.14 mL, 1.0 mmol)을 첨가한후 N-(4-아미노부틸)카르밤산 t-부틸 에스테르 K-2 (0.195 mL, 1.0 mmol)로 처리하였다. 반응 혼합물을 실온으로 만든 후 3시간동안 교반시켰다. 이 반응물을 물(15 mL)로 급냉시키고 수층을 DCM (3X15 mL)로 추출하였다. 결합된 유기층을 물(50 mL), 염수(50 mL)로 세정하고 Na₂SO₄상에서 건조시킨 후 감압하에 여과농축시켰다. 잔류물을 에테르로 침전시킨 후 에테르를 제거하고 잔류 고체를 에틸 아세테이트:헥산으로 가루화시켰다. 고체 K-3를 여과수집하고 더 이상 정제하지 않고 다음 단계에 직접 사용하였다. 고체 K-3를 DCM (11 mL)에 용해시킨 후 4-(아미노메틸)피페리딘 (1.0 g, 8.8 mmol)로 처리하고, 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반시킨 후 클로로포름(25 mL)으로 희석시켰다. 유기층을 염수(2X30 mL), 포스페이트 완충액 pH 5.5 (3X30mL), 염수(30 mL)로 세정한 후 Na₂SO₄상에서 건조시키고 감압하에 여과농축시켰다. 조 생성물 K-4를 다음 단계에 직접 사용하였다. 아민 K-4 (0.30 g, 0.89 mmol)를 THF (3.5 mL)에 용해시킨 후 글루타르산 무수물(0.11 g, 0.99 mmol)로 처리한 후 실온에서 3시간동안 교반시켰다. 생성물 K-5를 에테르와 에틸아세테이트를 첨가하여 침전시켰다. 고체 K-5를 여과 수집하였다. 고체 K-5를 DCM (3.5 mL)에 현탁시키고 0 ℃로 냉각시킨 후 TFA (3.5 mL)로 처리하였다. 이 혼합물을 0℃에서 30분간 교반시킨 후 실온으로 만들고 2시간동안 교반시켰다. 용매를 감압하에 제거하였다. 조 생성물 K-6를 물(1 mL)과 DMF (1 mL)에 용해시킨 후 NaHCO₃ (0.063 g, 기포가 발생됨)로 처리하고 역상 HPLC (아세토니트릴:물)로 정제하여 백색 고체로서 목적 화합물(12 mg)을 수득하였다. MP 192-206℃; ¹H-NMR (DMSO-d₆ 및 D₂O): 1.25-1.60 (series of m, 6H), 1.92 (t, J=7.6Hz, 2H), 2.00-2.10 (m, 2H), 2.65-2.80 (m, 3H), 2.90-3.05 (m, 3H), 4.31 (dd, J=5.6, 9.6Hz, 1H), 7.10-7.30 (m, 5H); EIMS: 350.5 (MH)+. 분석치. 　(C₁₈H₂₇N₃O₄·0.55CF₃COOH·0.45H₂O)C,H,N

방법 L

4-((R)-1-(4-(2-시아노구아니디노)부틸카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)부탄산

일반 절차 방법 K에 따라 N-FMOC-D-페닐알라닌 펜타플루오로페닐 에스테르로부터 중간체 K-6를 수득하였다. 중간체 K-6(0.192 g, 0.55 mmol)를 이소프로필알콜(8 mL)과 트리에틸아민(0.08 mL, 0.57 mmol)에 용해시킨 후 디페닐 시아노카르본이미데이트 L-1 (0.13 g, 0.55 mmol)를 첨가하고 교반 혼합물을 가열하여 환류시켰다. 이 혼합물을 하룻밤 환류교반시켜 실온으로 냉각시켰다. 부가적인 양의 디페닐 시아노카르본이미데이트 L-1 (0.072 g, 0.30 mmol)와 트리에틸아민(0.05 mL, 0.36 mmol)을 반응 혼합물에 첨가한 후 혼합물을 하룻밤 환류가열시켰다. 이 혼합물을 실온으로 냉각시켜 용매를 감압하에 제거하였다. 조 물질 L-2를 다음 단계에 직접 사용하였다. 잔류 L-2를 에틸 알콜(8.5 mL)에 용해시킨 후 0℃로 냉각시키고 암모니아 가스를 3분간 용액을 통해 불어넣었다. 반응 용기를 밀봉시키고 이 혼합물을 실온에서 22시간동안 교반시켰다. 용기를 후드에서 배기시키고 용매를 감압하에 제거하였다. 조 생성물 L-3를 역상 HPLC (아세토니트릴:물)로 정제하여 백색 고체로서 목적 생성물 (10 mg)을 수득하였다. MP 63℃; ¹H-NMR (DMSO-d₆): 0.9-1.0 (m, 3H), 1.2-1.4 (m, 5H), 1.5-1.7 (m, 2H), 1.9-2.2 (m, 4H), 2.6-2.8 (m, 1H), 2.85-3.15 (m, 6H), 4.3-4.5 (m, 1H), 6.82 (br s, 2H), 7.1-7.3 (m, 6H), 7.95-8.15 (m, 2H); EIMS: 417.5 (MH)+. 분석치. (C₂₀H₂₈N₆O₄·0.4 EtOH·1.20H₂O)C,H,N.

방법 M

4-((S)-1-(4-(피리미딘-2-일아미노)부틸카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)부탄산

디클로로메탄 (15 mL)중의 N-Boc-L-페닐알라닌 M-1 (0.53 g, 2.0 mmol) 용액에 1-히드록시벤조트리아졸(0.27 g, 2.0 mmol)을 첨가한 다음 EDAC·HCl (0.39 g, 2. 0 mmol)을 첨가한 후 이 혼합물은 30분간에 걸쳐 투명하게 되었다. 이 용액을 N-카르보벤족시-1,4-디아미노부탄 히드로클로라이드 M-2 (0.52 g, 2.0 mmol)로 처리한 후 트리에틸아민 (0.3 mL, 2.0 mmol)을 첨가하고 5시간동안 교반시켰다. 이 반응물을 물(30 mL)로 급냉시킨 후 수층을 DCM (3X10 mL)로 추출하였다. 결합된 유기상을 물(50 mL)과 염수(30 mL)로 세정하고 Na₂SO₄상에서 건조시킨후 감압하에 여과농축하였다. 조 생성물 M-3을 에틸아세테이트:헥산으로 가루화시켜 여과수집되는 백색 고체를 수득하였다. 생성물 M-3는 더 이상 정제하지 않고 다음 단계에 사용하였다. 고체 M-3를 질소 대기하에 THF(4.5 mL)에 용해시킨 후 10% Pd/C (0.084 g)를 첨가한 후 메탄올(8.5 mL)을 첨가하였다. 이 혼합물을 수소(발룬)에 위치시킨 후 하룻밤 교반시켰다. 수소대기를 이후 질소로 교체한 후 고체를 여과제거하였다. 용매를 감압하에 제거하여 다음단계에서 더 이상 정제하지 않고 사용하는 고체 M-4를 수득하였다. 중간체 M-4 (0.285 g, 0.85 mmol)를 에틸알콜(4 mL)에 용해시킨후 2-클로로피리미딘 M-5 (0.196 g, 1.7 mmol)와 디이소프로필에틸아민(0.3 mL, 1.7 mmol)으로 처리하였다. 이 반응 혼합물을 22 시간동안 환류시킨후 실온으로 냉각시켰다. 용매를 감압하에 제거하여 생성물 M-6를 수득하였다. 잔류물을 DCM(20 mL)에 용해시킨후 물(25 mL)에 분배시켰다. 수층을 DCM(3X15 mL)로 추출하였다. 결합된 유기층을 물(25 mL)과 염수(25 mL)로 세정하고 Na₂SO₄상에서 건조시킨 후, 감압하에 여과농축하였다. 조 생성물 M-6을 더 이상 정제하지 않고 다음단계에 사용하였다. 고체 M-6를 DCM (3.5 mL)에 용해시키고, 0℃로 냉각시킨 후 TFA(3.5 mL)로 처리하였다. 이 반응 혼합물을 30분간 교반시킨후 실온으로 만들고 2시간동안 교반시킨후 용매는 감압하에 제거하였다. 조 생성물 M-7를 다음단계에 직접 사용하였다. 아민 M-7를 THF(3.5 mL)와 트리에틸아민 (0.22 mL) 혼합물에 용해시킨 후 글루타르산 무수물(0.094 g, 0.82 mmol)로 처리하고 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 조 생성물 M-8을 역상 HPLC (아세토니트릴:물)로 정제하여 백색 고체로서 목적 화합물(45 mg)을 수득하였다. MP 186℃; ¹H-NMR (DMSO-d₆): 1.30-1.70 (series of m, 6H), 1.95-2.15 (m, 4H), 2.71 (br t, J=11.8Hz, 1H), 2.85-3.15 (m, 3H), 3.21 (br d, J=6.0Hz, 2H), 4.35-4.50 (m, 1H), 6.45-6.55 (m, 1H), 7.10-7.30 (m, 6H), 7.96(br s, 1H), 8.05(d, J=8.0Hz, 1H), 8.23(br d, J=4.4Hz, 2H); EIMS: 428.5 (MH)+. 분석치 (C₂₂H₂₉N₅O₄)C,H,N.

4-{(S)-2-비페닐-4-일-1-〔4-(피리미딘-2-일아미노)-부틸카르바모일〕-에틸카르바모일}-부티르산

일반 절차 방법 M에 따라 N-Boc-L-비페닐알라닌로부터 백색 고체로서 목적 화합물(56 mg)을 수득하였다. MP 228℃; ¹H-NMR (DMSO-d₆): 1.35-1.50 (m, 4H), 1.55-1.65 (m, 2H), 2.00-2.15 (m, 4H), 2.77 (dd, J=9.6, 13.6Hz, 1H), 2.90-3.15 (m, 4H), 3.21 (dd, J=6.6, 12.6Hz, 2H), 4.40-4.55 (m, 1H), 6.51 (t, J=4.8Hz, 1H), 7.11 (t, J=5.8Hz, 1H), 7.25-7.35 (m, 3H), 7.43 (t, J=7.6Hz, 2H), 7.54 (d, J=8.4Hz, 2H), 7.62 (d, J=7.2Hz, 2H), 8.01 (t, J=5.4Hz, 1H), 8.11 (d, J=8.4Hz, 1H), 8.2-8.3 (m, 2H); EIMS: 504.3 (MH)+. 분석치. 　　　　(C₂₈H₃₃N₅O₄)C,H,N.

4-{(R)-2-비페닐-4-일-1-〔4-(피리미딘-2-일아미노)-부틸카르바모일〕-에틸카르바모일} -부티르산

일반절차 방법 M에 따라 N-Boc-D-비페닐알라닌로부터 백색고체로서 목적 화합물(50 mg)을 수득하였다. MP 227℃; ¹H-NMR (DMSO-d₆): 1.30-1.70 (series of m, 6H), 2.00-2.15 (m, 4H), 2.77 (dd, J=9.6, 13.2Hz, 1H), 2.90-3.15 (m, 3H), 3.21(q, J=6.4Hz, 2H), 4.40-4.55 (m, 1H), 6.51 (t, J=4.8Hz, 1H), 7.12 (t, J=5.8Hz, 1H), 7.25-7.40 (m, 3H), 7.43 (t, J=7.6Hz, 2H), 7.54 (d, J=8.0Hz, 2H), 7.62 (d, J=7.2Hz, 2H), 8.00 (t, J=5.6Hz, 1H), 8.10 (d, J=8.8Hz, 1H), 8.23 (d, J=4.8Hz, 2H); EIMS: 504.3 (MH)+. 분석치. (C₂₈H₃₃N₅O₄·0.20H₂O)C,H,N.

4-((R)-1-(4-(피리미딘-2-일아미노)부틸카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)-2,2-디메틸부탄산

일반 절차 방법 M에 따라 N-Boc-D-페닐알라닌로부터 목적 화합물(60 mg)을 수득하였다. ¹H-NMR (DMSO-d₆) : 1.01 (s, 6H), 1.30-1.60 (m, 6H), 1.90-2.10 (m, 2H), 2.71 (dd, J=9.6, 13.6Hz, 1H), 2.80-3.15 (series of m, 3H), 3.21 (q, J=6.6Hz, 2H), 4.35-4.45 (m, 1H), 6.51 (t, J=4.6Hz, 1H), 7.05-7.25 (m, 6H), 7.95 (t, J=5.6Hz, 1H), 8.08 (d, J=8.4Hz, 1H), 8.23 (d, J=4.8Hz, 1H); EIMS: 456.5 (MH)+. 분석치. (C₂₄H₃₃N₅O₄·0.08CF₃COOH)C,H,N.

4-((R)-1-(4-(피리미딘-2-일아미노)부틸카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)-3,3-디메틸부탄산

일반 절차 방법 M에 따라 N-Boc-D-페닐알라닌로부터 목적 화합물(64 mg)을 수득하였다. ¹H-NMR (DMSO-d₆): 0.83 (s, 3H), 0.86 (s, 3H), 1.30-1.50 (m, 4H), 2.05-2.20 (m, 4H), 2.71 (dd, J=9.8, 13.8Hz, 1H), 2.85-3.15 (series of m, 3H), 3.21 (q, J=6.4Hz, 2H), 4.40-4.55 (m, 1H), 6.51 (t, J=4.6Hz, 1H), 7.05-7.30 (m, 6H), 7.96 (t, J=5.6Hz, 1H), 8.08 (d, J=8.4Hz, 1H), 8.23 (d, J=4.8Hz, 1H); EIMS: 456.5 (MH)+. 분석치. (C₂₄H₃₃N₅O₄·0.08CF₃COOH.0.02 MeCN)C,H,N.

N-{(S)-2-비페닐-4-일-1-[4-(피리미딘-2- 일아미노 )- 부틸카르바모일] -에틸}-숙신암산( succinamic acid)

일반 절차 방법 M에 따라 N-Boc-L-비페닐알라닌으로부터 출발하여 목적 화합물(72 mg)을 수득하였다. MP 200-205℃; ¹H-NMR (DMSO-d₆): 1.30-1.60 (m, 4H), 2.20-2.40 (m, 4H), 2.70-3.15 (series of m, 4H), 3.21 (q, J=6.2Hz, 2H), 4.40-4.50 (m, 1H), 6.51 (t, J=4.6Hz, 1H), 7.12 (t, J=5.6Hz, 1H), 7.29 (d, J=8.4Hz, 2H), 7.34 (d, J=7.2Hz, 1H), 7.44 (t, J=7.6Hz, 2H), 7.55 (d, J=8.0Hz, 2H), 7.63 (d, J=7.6Hz, 2H), 7.93 (t, J=5.4Hz, 1H), 8.15-8.30 (m, 3H); EIMS: 490.6 (MH)+. 분석치. (C₂₇H₃₁N₅O₄)C,H,N.

4-{(S)-2-비페닐-4-일-1-〔4-(피리미딘-2-일아미노)-부틸카르바모일]-에틸카르바모일}-3,3-테트라메틸렌부티르산

일반 절차 방법 M에 따라 N-Boc-L-비페닐알라닌로부터 목적 화합물(72 mg)을 수득하였다. MP 95-102℃; ¹H-NMR (DMSO-d₆): 1.10-1.60 (m, 12H), 2.10-2.40 (m, 4H), 2.76 (dd, J=10, 13.6Hz, 1H), 2.90-3.15 (m, 3H), 3.22 (q, J=6.4Hz, 2H), 4.45-4.60 (m, 1H), 6.51 (t, J=4.8Hz, 1H), 7.12 (t, J=5.8Hz, 1H), 7.25-7.40 (m, 3H), 7.44 (t, J=7.6Hz, 2H), 7.54 (d, J=8.4Hz, 2H), 7.61 (d, J=8.4Hz, 2H), 7.99 (t, J=5.6Hz, 1H), 8.13 (d, J=8.4Hz, 1H), 8.15-8.30 (m, 2H); EIMS: 558.5 (MH)+. 분석치. (C₃₂H₃₉N₅O₄0.25 H₂O)C,H,N.

4-{(S)-2-비페닐-4-일-1-〔4-(피리미딘-2-일아미노)-부틸카르바모일〕-에틸카르바모일}-3,3-펜타메틸렌부티르산

일반절차 방법 M에 따라 N-Boc-L-비페닐알라닌로부터 목적 화합물(97 mg)을 수득하였다. MP 96-110℃; ¹H-NMR (DMSO-d₆): 1.00-1.60 (m, 14H), 2.10-2.40 (m, 4H), 2.76 (dd, J=10.4, 13.6Hz, 1H), 2.95-3.15 (m, 3H), 3.22 (q, J=6.4Hz, 2H), 4.50-4.60 (m, 1H), 6.51 (t, J=4.8Hz, 1H), 7.12 (t, J=5.6Hz, 1H), 7.25-7.40 (m, 3H), 7.44 (t, J=7.6Hz, 2H), 7.54 (d, J=8.4Hz, 2H), 7.61 (d, J=7.6Hz, 2H), 8.01 (t, J=5.6Hz, 1H), 8.17 (d, J=8.4Hz, 1H), 8.20-8.30 (m, 2H); EIMS: 572.8 (MH)+. 분석치. (C₃₃H₄₁N₅O₄·0.30 H₂O)C,H,N.

4-{(S)-2-비페닐-4-일-1-〔4-(피리미딘-2- 일아미노 )- 부틸카르바모일 〕- 에틸카르바모일 }-3,3-디메틸부티르산

일반 절차 방법 M에 따라 N-Boc-L-비페닐알라닌로부터 목적 화합물(72 mg)을 수득하였다. MP 66-89℃; ¹H-NMR (DMSO-d₆): 0.84 (s, 3H), 0.87 (s, 3H), 1.30-1.60 (m, 4H), 2.0-2.2 (m, 4H), 2.77 (dd, J=10.0, 13.6Hz, 1H), 2.90-3.15 (m, 3H), 3.22 (q, J=6.4Hz, 2H), 4.40-4.60 (m, 1H), 6.53 (t, J=4.8Hz, 1H), 7.15-7.25 (m, 1H), 7.28-7.37 (m, 3H), 7.43 (t, J=7.6Hz, 2H), 7.54 (d, J=8.4Hz, 2H), 7.57-7.65 (m, 2H), 8.00 (t, J=5.6Hz, 1H), 8.10 (d, J=8.4Hz, 1H), 8.27 (d, J=4.8Hz, 2H); EIMS: 532.5 (MH)+ . 분석치. (C₃₀H₃₇N₅O₄·1.00 H₂O)C,H,N.

4-{(S)-2-비페닐-4-일-1-〔4-(피리미딘-2-일아미노)-부틸카르바모일〕-에틸카르바모일}-2,2-디메틸부티르산

일반 절차 방법 M에 따라 N-Boc-L-비페닐알라닌으로부터 목적 화합물(91 mg)을 수득하였다. MP 76-101℃; ¹H-NMR (DMSO-d₆): 1.01 (s, 6H), 1.30-1.70 (series of m, 6H), 1.95-2.10 (m, 2H), 2.76 (dd, J=9.6, 13.6Hz, 1H), 2.90-3.15 (m, 3H), 3.21 (q, J=6.2Hz, 2H), 4.40-4.50 (m, 1H), 6.51 (t, J=4.8Hz, 1H), 7.11 (t, J=5.8Hz, 1H), 7.25-7.37 (m, 3H), 7.44 (t, J=7.6Hz, 2H), 7.54 (d, J=8.4Hz, 2H), 7.63 (d, J=7.2Hz, 2H), 7.99 (t, J=5.6Hz, 1H), 8.12 (d, J=8.4Hz, 1H), 8.26 (d, J=4.6Hz, 2H); EIMS: 532.5 (MH)+. 분석치. (C₃₀H₃₇N₅O₄·0.5H₂O)C,H,N.

4-{(R)-2-비페닐-4-일-1-〔4-(피리미딘-2-일아미노)-부틸카르바모일〕-에틸카르바모일}-3,3-펜타메틸렌부티르산

일반 절차 방법 M에 따라 N-Boc-D-비페닐알라닌으로부터 목적 화합물(97 mg)을 수득하였다. MP 88-105℃; ¹H-NMR (DMSO-d₆): 1.00-1.60 (series of m, 14H), 2.10-2.40 (m, 4H), 2.74 (dd, J=10.2, 13.8Hz, 1H), 2.90-3.15 (m, 3H), 3.20 (q, J=6.2Hz, 2H), 4.50-4.60 (m, 1H), 6.49 (t, J=4.6Hz, 1H), 7.11 (t, J=5.8Hz, 1H), 7.25-7.35 (m, 3H), 7.42 (t, J=7.6Hz, 2H), 7.53 (d, J=8.0Hz, 2H), 7.60(d, J=7.2Hz, 2H), 7.99 (t, J=5.6Hz, 1H), 8.15 (d, J=8.4Hz, 1H), 8.20-8.30 (m, 2H); EIMS: 572.7 (MH) +. 분석치. (C₃₃H₄₁N₅O₄·0.50 H₂O)C,H,N.

N-{(R)-2-비페닐-4-일-1-〔4-(피리미딘-2- 일아미노 )- 부틸카르바모일 〕-에틸}- 숙신암산

일반절차 방법 M에 따라 N-Boc-D-비페닐알라닌로부터 목적 화합물(70 mg)을 수득하였다. MP 200-207℃; ¹H-NMR (DMSO-d₆): 1.30-1.60 (m, 4H), 2.20-2.40 (m, 4H), 2.74 (dd, J=9.2, 13.6Hz, 1H), 2.90-3.15 (m, 3H), 3.21 (q, J=6.4Hz, 2H), 4.40-4.50 (m, 1H), 6.51 (t, J=4.8Hz, 1H), 7.11 (t, J=5.8Hz, 1H), 7.25-7.35 (m, 3H), 7.44 (t, J=7.6Hz, 2H), 7.55 (d, J=8.4Hz, 2H), 7.63 (d, J=7.2Hz, 2H), 7.94 (t, J=5.6Hz, 1H), 8.18 (d, J=8.4Hz, 1H), 8.20-8.30 (m, 2H); EIMS: 490.6 (MH)+. 분석치. (C₂₇H₃₁N₅O₄·0.50 H₂O)C,H,N.

4-{(R)-2-비페닐-4-일-1-〔4-(피리미딘-2-일아미노)-부틸카르바모일〕-에틸카르바모일}-3,3-테트라메틸렌부티르산

일반 절차 방법 M에 따라 N-Boc-D-비페닐알라닌로부터 목적 화합물(85 mg)을 수득하였다. MP 85-98℃; ¹H-NMR (DMSO-d₆): 1.10-1.60 (series of m, 12H), 2.10-2.40 (m, 4H), 2.76 (dd, J=10.0, 13.6Hz, 1H), 2.95-3.15 (m, 3H), 3.22 (q, J=6.2Hz, 2H), 4.45-4.60 (m, 1H), 6.51 (t, J=4.8Hz, 1H), 7.11 (t, J=5.8Hz, 1H), 7.25-7.40 (m, 3H), 7.44 (t, J=7.6Hz, 2H), 7.54 (d, J=8.0Hz, 2H), 7.61 (d, J=6.8Hz, 2H), 7.99 (t, J=5.6Hz, 1H), 8.13 (d, J=8.4Hz, 1H), 8.20-8.30 (m, 2H); EIMS: 490.6 (MH)+. 분석치. (C₂₇H₃₁N₅O₄·0.50 H₂O)C,H,N.

4-{(R)-2-비페닐-4-일-1-〔4-(피리미딘-2-일아미노)-부틸카르바모일〕-에틸카르바모일}-3,3-디메틸부티르산

일반절차 방법 M에 따라 N-Boc-D-비페닐알라닌으로부터 목적 화합물(85 mg)을 수득하였다. MP 77-95℃; ¹H-NMR (DMSO-d₆): 0.84 (s, 3H), 0.87 (s, 3H), 1.30-1.60 (m, 4H), 2.00-2.20 (m, 4H), 2.77 (dd, J=9.6, 13.6Hz, 1H), 2.90-3.15 (m, 3H), 3.21 (q, J=6.4Hz, 2H), 4.45-4.60 (m, 1H), 6.51 (t, J=4.8Hz, 1H), 7.11 (t, J=5.8Hz, 1H), 7.25-7.40 (m, 3H), 7.43 (t, J=7.6Hz, 2H), 7.54 (d, J=8.0Hz, 2H), 7.61 (d, J=7.2Hz, 2H), 7.99 (t, J=5.6Hz, 1H), 8.12 (d, J=8.4Hz, 1H), 8.20-8.30 (m, 2H); EIMS: 532.5 (MH)+. 분석치. (C₃₀H₃₇N₅O₄·0.50H₂O)C,H,N.

4-(2-(4-(피리미딘-2-일아미노)부틸카르바모일)-2,3-디히드로-1 H-인덴-2-일카르바모일)-3,3-테트라메틸렌부탄산

일반절차 방법 M에 따라 N-Boc-2-아미노인단-2-카르복실산으로부터 목적 화합물(85 mg)을 수득하였다. MP 77-95℃; ¹H-NMR (DMSO-d₆): 1.30-1.60 (m, 12H), 2.23 (s, 2H), 2.29 (s, 2H), 3.06 (q, J=6.2Hz, 2H), 3.12 (d, J=16.4Hz, 2H), 3.22 (q, J=6.6Hz, 2H), 3.43 (d, J=16.8Hz, 2H), 6.52 (t, J=4.8Hz, 1H), 7.05-7.20 (m, 5H), 7.64 (t, J=5.8Hz, 1H), 8.20-8.30 (m, 3H); EIMS: 532.5 (MH)+. 분석치. (C₃₀H₃₇N₅O₄·0.50H₂O)C,H,N.

4-(2-(4-(피리미딘-2-일아미노)부틸카르바모일)-2,3-디히드로-1H-인덴-2-일카르바모일)-3,3-디메틸부탄산

일반 절차 방법 M에 따라 N-Boc-2-아미노인단-2-카르복실산으로부터 목적 화합물(21 mg)을 수득하였다. MP 70-83℃; ¹H-NMR (DMSO-d₆): 0.93 (s, 6H), 1.30-1.60 (m, 4H), 2.07 (s, 1H), 2.11 (s, 2H), 2.16 (s, 2H), 3.06 (q, J=6.8Hz, 2H), 3.13 (d, J=16.4Hz, 2H), 3.22 (q, J=6.4Hz, 2H), 3.43 (d, J=16.8Hz, 2H), 6.52 (t, J=4.8Hz, 1H), 7.05-7.20 (m, 5H), 7.64 (t, J=6.0Hz, 1H), 8.20-8.30 (m, 3H); EIMS: 468.6 (MH)+. 분석치. (C₂₅H₃₃N₅O₄·1.10H₂O)C,H,N.

4-{(R)-2-비페닐-4-일-1-〔4-(피리미딘-2-일아미노)-부틸카르바모일〕-에틸카르바모일}-2,2-디메틸부티르산

일반 절차 방법 M에 따라 N-Boc-D-비페닐알라닌로부터 목적 화합물(62 mg)을 수득하였다. MP 85-98℃; ¹H-NMR(DMSO-d₆): 1.01 (s, 6H), 1.30-1.70 (series of m, 6H), 1.90-2.10 (m, 2H), 2.76 (dd, J=9.6, 13.6Hz, 1H), 2.90-3.15 (m, 3H), 3.21 (q, J=6.2Hz, 2H), 4.40-4.50 (m, 1H), 6.51 (t, J=4.8Hz, 1H), 7.11 (t, J=5.8Hz, 1H), 7.25-7.40 (m, 3H), 7.44 (t, J=7.6Hz, 2H), 7.54 (d, J=8.4Hz, 2H), 7.62 (d, J=8.0Hz, 2H), 7.98 (t, J=5.4Hz, 1H), 8.12 (d, J=8.4Hz, 1H), 8.26 (d, J=4.8Hz, 2H); EIMS: 532.5 (MH)+. 분석치. (C₃₀H₃₇N₅O₄·0.75H₂O)C,H,N.

4-(2-(4-(피리미딘-2- 일아미노 ) 부틸카르바모일 )-2,3- 디히드로 -1H- 인덴 -2- 일카르바모일 )-3,3- 펜타메틸렌부탄산

일반 절차 방법 M에 따라 N-Boc-2-아미노인단-2-카르복실산으로부터 목적 화합물(40 mg)을 수득하였다. MP 89-98℃; ¹H-NMR (DMSO-d₆): 1.20-1.55 (m, 15H), 2.21 (s, 2H), 2.27 (s, 2H), 3.06 (q, J=6.4Hz, 2H), 3.13 (d, J=16.4Hz, 2H), 3.22 (q, J=6.4Hz, 2H), 3.42 (d, J=16.8Hz, 2H), 6.52 (t, J=4.6Hz, 1H), 7.05-7.20 (m, 5H), 7.65 (t, J=5.8Hz, 1H), 8.20-8.30 (m, 3H) ; EIMS: 508.6 (MH)+. 분석치. (C₂₈H₃₇N₅O₄·0.80H₂O)C,H,N.

방법 N

펜탄디오산{(S)-2-비페닐-4-일-1-〔4-(피리미딘-2- 일아미노 )- 부틸카르바모일 〕-에틸}-아미드( lH - 테트라졸 -5일)-아미드

THF (3 mL)중의 M-8 (0.203 g, 0.40 mmol) 현탁액을 N,N'-카르보닐디이미다졸(0.071 g, 0.44 mmol)로 처리하고 30분동안 60℃로 가열하였다. 이 혼합물을 실온으로 냉각한 다음 DMF (0.5 mL)를 첨가하여 투명한 용액을 수득하였다. 이 용액을 15분간 60℃로 가열하여 실온으로 냉각시키고 트리에틸아민(0.063 mL, 0.45 mmol)로 처리한 후 5-아미노테트라졸(0.035 g, 0.40 mmol)로 처리하였다. 이 혼합물을 5시간동안 환류가열한 후 실온으로 냉각시켰다. 용매를 감압하에 제거한후 10% 시트르산을 첨가하고 수득한 침전물을 여과수집하였다. 조 생성물 N-1을 역상 HPLC로 정제하여 백색 고체로서 목적 화합물(23 mg)을 수득하였다. MP 237℃ 분해; ¹H-NMR(DMSO-d₆): 1.3-1.5 (m, 4H), 1.65-1.80 (m, 2H), 2.05-2.15 (m, 2H), 2.20-2.40 (m, 2H), 2.77 (dd, J=9.6, 13.6Hz, 1H), 2.90-3.15 (m, 4H), 3.21 (dd, J=6.4, 12.8Hz, 2H), 4.40-4.55 (m, 1H), 6.51 (t, J=4.8Hz, 1H), 7.11 (t, J=5.8Hz, 1H), 7.25-7.35 (m, 3H), 7.39 (t, J=7.4Hz, 2H), 7.54 (d, J=8.0Hz, 2H), 7.58 (d, J=7.2Hz, 2H), 8.02 (t, J=5.6Hz, 1H), 8.13 (d, J=8.4Hz, 1H), 8.2-8.3 (m, 2H); EIMS: 571.5 (MH)+. 분석치. (C₂₉H₃₄N₁₀O₃·0.21 시트르산) C,H,N.

방법 O

(R)-4-(2-(4-(피리미딘-2-일아미노)부틸카르바모일)-2,3-디히드로-1H-인덴-2-일카르바모일)-4-아세트아미도부탄산

디클로로메탄(20 mL)중의 N-Boc-2-아미노인단-2-카르복실산 O-1(0.56 g, 2.0 mmol) 현탁액에 EDAC·HCl (0.38 g, 2.0 mmol)을 첨가한후, 이 혼합물은 30분간에 걸쳐 투명하게되었다. 이 용액을 N-카르보벤족시-1,4-디아미노부탄 히드로클로라이드 O-2 (0.52 g, 2.0 mmol)로 처리한 후 트리에틸아민(0.3 mL, 2.0 mmol)으로 처리하고 하룻밤 교반시켰다. 이 반응물을 물(30 mL)로 급냉시킨 후 수층을 DCM (3X10 mL)로 추출하였다. 결합된 유기층을 물(50 mL)과 염수(30 mL)로 세정하고, Na₂SO₄상에서 건조시킨 후 감압하에 여과농축하였다. 조 생성물 0-3을 더 이상 정제하지 않고 다음단계에 사용하였다. 고체 0-3를 THF(8.8 mL)에 용해시키고 10% Pd/C (0.44 g)을 질소 대기하에 첨가한 다음, 메탄올(17.5 mL)을 첨가하였다. 이 혼합물을 수소(발룬)하에 위치시키고 하룻밤 교반시켰다. 수소 대기를 이후 질소로 교체하고 고체를 여과제거하였다. 용매를 감압하에 제거하여 다음단계에 더 이상 정제하지 않고 사용하는 백색 고체 0-4를 수득하였다. 중간체 0-4(0.653 g, 1.88 mmol)를 에틸 알콜(8.8 mL)에 용해시킨 다음 2-클로로피리미딘 0-5 (0.42 g, 3.6 mmol)과 디이소프로필에틸아민(0.63 mL, 3.6 mmol)으로 처리하였다. 이 반응 혼합물을 하룻밤 환류시킨 후 실온으로 냉각시켰다. 용매를 감압하에 제거하였다. 잔류물을 DCM (40 mL)에 용해시키고 물(50 mL)로 분배시켰다. 수층을 DCM (3X25 mL)로 추출하였다. 결합된 유기층을 물(50 mL)과 염수(50 mL)로 세정하고, Na₂SO₄상에서 건조시킨 후 감압하에 여과농축하였다. 조 생성물 0-6를 더 이상 정제하지 않고 다음단계에 사용하였다. 고체 0-6를 DCM (7.5 mL)에 용해시키고 0 ℃로 냉각시켜 TFA(7.5 mL)로 처리하였다. 이 반응 혼합물을 30 분간 교반시킨후 실온으로 만들고 3시간동안 교반시킨 다음, 용매를 감압하에 제거하였다. 조 혼합물을 클로로포름(40 mL)에 용해시키고 이 용액을 포화 수용액 NaHCO₃(50 mL)으로 분배시켰다. 수층을 클로로포름(2X40 mL)으로 추출하였다. 결합된 유기층을 염수(60 mL)로 세정하고, Na₂SO₄상에서 건조시킨 후 감압하에 여과농축하였다. 조 생성물 0-7을 다음 단계에 사용하였다. 디클로로메탄(3.5 mL)중의 N-FMOC-D-글루탐산 5-t-부틸 에스테르 0-8(0.30 g, 0.71 mmol)에 1-히드록시벤조트리아졸 (0.095 g, 0.71 mmol)을 첨가하고, EDAC·HCl(0.14 g, 0.71 mmol)을 첨가한후 이 혼합물은 30분간에 걸쳐 투명하게되었다. 이 용액을 캐뉼라을 통해 DCM (2 mL)의 상기 아민 0-7(0.23 g, 0.71 mmol)으로 처리하고 하룻밤 교반시켰다. 이 반응물을 물(10 mL)로 급냉시킨 후 수층을 DCM(3X15 mL)로 추출하였다. 결합된 유기층을 물(20 mL)과 염수(20 mL)로 세정하고 Na₂SO₄상에서 건조시킨 후, 감압하에 여과농축하였다. 조 생성물 O-9을 다음 단계에 사용하였다. 조 물질 O-9을 DCM (5mL)에 용해시킨 다음 피페리딘(0.7 mL)으로 처리하였다. 이 반응 혼합물을 2시간동안 교반시킨 후 용매를 감압하에 제거하였다. 조 물질 O-10을 DCM (3 mL)에 용해시킨 후 아세트산 무수물(0.15 mL, 1.6 mmol)로 처리하였다. 이 혼합물을 2시간동안 교반시킨 후 추가적인 양의 아세트산 무수물(0.05 mL, 0. 53 mmol)과 트리에틸아민(0.1 mL, 0.72 mmol)으로 처리하였다. 이 혼합물을 하룻밤 교반시킨후 클로로포름(7 mL)으로 희석시켰다. 유기 용액을 수성 포화 NaHCO₃(10 mL)로 세정하고 Na₂SO₄상에서 건조시킨 후, 감압하에 여과농축하였다. 수득한 잔류물을 에테르:헥산으로 가루화시키고 조 물질 O-11을 다음 단계에 직접 사용하였다. 중간체 O-11를 DCM (2 mL)에 용해시킨후 0 ℃로 냉각시키고 TFA(2 mL)로 처리하였다. 이 반응 혼합물을 실온으로 만들고 1시간 15분동안 교반시켰다. 용매를 감압하에 제거하여 조 생성물 0-12을 수득하였다. 조 생성물 0-12을 물(2.5 mL) 과DMSO (0.5 mL)에 용해시킨 후 버블 발생이 중단할 때 까지 NaHCO₃을 첨가하였다. 조 생성물 0-12을 역상 HPLC (아세토니트릴:물)로 정제하여 목적 화합물(41 mg)을 수득하였다. ¹H-NMR(DMSO-d₆): 1.35-1.75 (series of m, 6H), 1.79 (s, 3H), 1.80-2.00 (m, 2H), 3.00-3.30 (series of m, 7H), 3.44 (d, J=3.2Hz, 2H), 3.80-3.90 (m, 1H), 6.51 (t, J=4.6Hz, 1H), 7.05-7.25 (m, 5H), 7.86 (t, J=5.6Hz, 1H), 8.24 (d, J=4.8Hz, 2H), 8.66 (s, 1H); EIMS: 497.6 (MH)+. 분석치. (C₂₅H₃₂N₆O₅·1.0Na·0.1CF₃COOH·2.0H₂O)C,H,N.

(S)-4-(2-(4-(피리미딘-2-일아미노)부틸카르바모일)-2,3-디히드로-1H-인덴-2-일카르바모일)-4-아세트아미도부탄산

일반 절차 방법 O에 따라 N-FMOC-L-글루탐산 5-t-부틸 에스테르로부터 목적 화합물(20 mg)을 수득하였다. MP 75℃; ¹H-NMR(DMSO-d₆): 1.35-1.55 (m, 4H), 1.60-1.80 (m, 2H), 1.82 (s, 3H), 2.00-2.25 (m, 2H), 3.05 (q, J=6.0Hz, 2H), 3.10-3.30 (m, 5H), 3.52 (d, J=16.8Hz, 2H), 3.95-4.05 (m, 1H), 6.54 (t, J=4.8Hz, 1H), 7.10-7.30 (m, 5H), 7.53 (t, J=5.8Hz, 1H), 8.18 (d, J=6.0Hz, 1H), 8.26 (d, J=4.4Hz, 2H), 8.51 (s, 1H); EIMS: 497.6 (MH)+. 분석치. (C₂₅H₃₂N₆O₅·2.0H₂O)C,H,N.

방법 P

펜탄디오산{(S)-2- 페닐 -1-〔4-(피리미딘-2- 일아미노 )- 부틸카르바모일 〕-에틸}-아미드(1H- 테트라졸 -5일)-아미드

DMF(4.2 mL)중의 4-(lH-테트라졸-5-일카르바모일)부탄산 P-1에 DIC(0.12 mL, 0. 77 mmol)을 첨가한후 l-히드록시벤조트리아졸(0.10 g, 0.75 mmol)을 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 5분간 교반시킨후 캐뉼라를 통해 DMF(4.2 mL)중의 M-7로 처리하였다. 이 반응 혼합물을 하룻밤 교반시킨 후 용매를 감압하에 제거하였다. 조 생성물 P-2을 물에 현탁시킨 후 1M NaOH (0.8 mL)으로 처리하고, 잔류 고체를 여과제거하였다. 수용액을 산성화시키고 고체를 여과제거하였다. 조 생성물 P-2를 역상 HPLC(아세토니트릴:물)로 정제하여 목적 화합물(18 mg)을 수득하였다. ¹H-NMR(DMSO-d₆): δ 1.30-1.5 (m, 4H), 1.65-1.75 (m, 2H), 2.00-2.15 (m, 2H), 2.33 (t, J=7.4Hz, 1H), 2.72 (dd, J=9.2, 13.6Hz, 1H), 2.85-3.15 (m, 3H), 3.20 (q, J=6.6Hz, 2H), 4.40-4.50 (m, 1H), 6.51 (t, J=4.6Hz, 1H), 7.05-7.25 (m, 6H), 7.97 (t, J=5.8Hz, 1H), 8.07 (d, J=8.4Hz, 1H), 8.23 (d, J=4.4Hz, 2H); EIMS: 495.6 (MH)+.

방법 Q

(S)-4-(2-(4-( 구아니디노 ) 부틸카르바모일 )-2,3- 디히드로 -1H- 인덴 -2- 일카르바모일 )-4-아 세트아미도부 탄 아미드

디클로로메탄 (3 mL)중의 N-FMOC-L-N^δ-트리틸-글루타민 Q-1 (0.305 g, 0.50 mmol) 용액에 1-히드록시벤조트리아졸 (0.070 g, 0.5 mmol)을 첨가하고 EDAC·HCl(0.098 g, 0.5 mmol)을 첨가한 후 이 혼합물이 30분간에 걸쳐 투명하게 되었다. 이 용액을 캐뉼라를 통해 DCM (2 mL)중의 C-4 (0.24 g, 0.5 mmol)로 처리하고 이 반응 혼합물을 3시간 동안 교반시켰다. 이 반응물을 물(10 mL)에 급냉시킨 후 수층을 DCM(3X5 mL)로 추출하였다. 결합된 유기층을 물(15 mL)과 염수(15 mL)로 세정하고 Na₂SO₄상에서 건조시킨 후, 감압하에 여과농축하였다. 조 생성물 Q-2를 다음 단계에 직접 사용하였다. 고체 Q-2를 DCM(5 mL)에 용해시킨 후 4-(아미노메틸)피페리돈(0.57 g, 5.0 mmol)으로 처리한 후 이 반응 혼합물을 2시간동안 교반시키고 DCM (15 mL)로 희석하였다. 유기층을 염수(2X15 mL), 포스페이트 완충액 pH 5.5 (2X15mL), 염수(25 mL)로 세정하고 Na₂SO₄상에서 건조시킨 후, 감압하에 여과농축하여 Q-3를 수득하였다. 조 물질 Q-3을 DCM(4 mL)에 용해시킨 후 트리에틸아민(0.11 mL, 0.79 mmol)으로 처리하고 아세트산 무수물(0.09 mL, 0.95 mmol)로 처리하였다. 이 반응 혼합물을 하룻밤 교반시킨 후 DCM (10 mL)로 희석시켰다. 유기 용액을 포화 수용액 NaHCO3 (10 mL)로 분배시켰다. 수층을 DCM (5 mL)로 추출하였다. 결합된 유기층을 염수(15 mL)로 세정하고, Na₂SO₄상에서 건조시킨 후 감압하에 여과농축하였다. 조 물질 Q-4을 다음단계에 직접 사용하였다. 중간체 Q-4를 DCM (4 mL)에 용해시킨 후 트리이소프로필실란을 첨가하였다. 혼합물을 이후 0℃로 냉각시키고 TFA (1 mL)로 처리하였다. 이 반응 혼합물을 실온으로 만들어 3시간동안 교반시켰다. 용매를 감압하에 제거하여 Q-5를 수득하였는데, 이를 물, DMF, 그리고 DMS에 용해시키고 이후 NaHCO₃(32 mg, 기포가 발생됨)을 첨가하였다. 조 생성물 Q-5을 역상 HPLC (아세토니트릴:물)로 정제하여 목적 화합물(89 mg)을 수득하였다. ¹H-NMR(DMSO-d₆): 1.42 (br s, 5H), 1.60-1.80 (m, 3H), 1.83 (s, 3H), 1.90-2.10 (m, 2H), 3.00-3.60 (series of m, 10H), 3.90-4.00 (m, 1H), 6.80 (br s, 3H), 7.10-7.40 (m, 8H), 7.49 (t, J=5.2Hz, 1H), 7.59 (t, J=5.8Hz, 1H), 8.21 (d, J=5.8Hz, 1H), 8.56 (s, 1H); EIMS: 460.5 (MH)+. 분석치. (C₂₅H₃₂N₆O₅·1.04CF₃COOH·1.50 H₂O)C,H,N.

(R)-4-(2-(4-(구아니디노)부틸카르바모일)-2,3-디히드로-1H-인덴-2-일카르바모일)-4-아세트아미도부탄 아미드

일반 절차 방법 Q에 따라 N-FMOC-D-N^δ-트리틸-글루타민을 사용하여 목적 화합물 95 mg을 수득하였다. ¹H-NMR(DMSO-d₆): 1.42 (br s, 5H), 1.60-1.80 (m, 2H), 1.79 (s, 1H), 1.83 (s, 3H), 1.90-2.10 (m, 2H), 3.00-3.60 (series of m, 10H), 3.90-4.00 (m, 1H), 6.80 (br s, 3H), 7.10-7.40 (m, 9H), 7.50 (t, J=5.4Hz, 1H), 7.59 (t, J=5.6Hz, 1H), 8.21 (d, J=5.6Hz, 1H), 8.56 (s, 1H); EIMS: 460.5 (MH)+. 분석치. (C₂₅H₃₂N₆O₅·l.20CF₃COOH·0.7H₂O)C,H,N.

방법 R

4-((S)-1-(3-(디메틸아미노)프로필카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)-3,3-테트라메틸렌부탄산

0℃에서 THF(9 mL)중의 N-FMOC-L-페닐알라닌 펜타플루오로페닐 에스테르 R-1 (1.11 g, 2.0 mmol)의 용액에 3-디메틸아미노-1-프로필아민 R-2 (0.26 mL, 2.1 mmol)을 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 15분간 교반시킨 후 실온으로 만들고 2시간동안 교반시켰다. 이 반응물을 포화 수용액 NaHCO₃ (25 mL)으로 급냉시켰다. 수층을 DCM(3X15 mL)로 추출하였다. 결합된 유기층을 물(50 mL), 염수(50 mL)로 세정하고 Na₂SO₄상에서 건조시킨 후, 감압하에 여과농축하였다. 조 생성물 R-3을 더 이상 정제하지 않고 다음 단계에 사용하였다. 잔류물 R-3를 DCM (20 mL)에 용해시킨 후 피페리딘(2.0 mL, 20 mmol)으로 처리하고, 이 반응 혼합물을 실온에서 2시간동안 교반시킨 후 용매를 제거하였다. 조 생성물 R-4의 일부를 다음단계에 사용하였다. 조 아민 R-4 (0.1 g, 0.4 mmol)를 THF (1.5 mL)에 용해시킨 후 3,3-테트라메틸렌글루타르산 무수물(0.067 g, 0.40 mmol)로 처리하고 2시간동안 교반시킨 후 추가적인 양의 3,3-테트라메틸렌글루타르산 무수물 (0.067 g, 0.40 mmol)을 첨가하고 이 혼합물을 하룻밤 교반시켰다. 용매를 감압하에 제거하고 조 생성물 R-5를 역상 HPLC (아세토니트릴:물)으로 정제하였다. 용매를 동결건조기상에서 제거하여 목적 생성물(58 mg)을 수득하였다. ¹H-NMR (DMSO-d₆): 0.93 (s, 6H), 1.20-1.60 (series of m, 11H), 2.12 (dd, J=6.6, 13.8Hz, 2H), 2.19 (s, 6H), 2.20-2.40 (m, 4H), 2.72 (dd, J=9.8, 13.8Hz, 1H), 2.95-3.15 (m, 3H), 4.28 (br s, 2H), 4.40-4.50 (m, 1H), 7.10-7.30 (m, 5H), 8.04 (t, J=5.8Hz, 1H), 8.26 (d, J=8.4Hz, 1H); EIMS: 418.5 (MH)+. 분석치. (C₂₃H₃₅N₃O₄·0.75H₂O)C,H,N.

4-((S)-1-(3-(디메틸아미노)프로필카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)-3,3-펜타메틸렌부탄산

무수물로서 1,1-시클로헥산디아세트산 무수물을 사용하여 일반 절차 방법 R에 따라 N-FMOC-L-페닐알라닌 펜타플루오로페닐 에스테르로부터 목적 화합물(78 mg)을 수득하였다. MP 59-75℃; ¹H-NMR (DMSO-d₆): 1.10-1.60 (series of m, 13H), 2.0-2.4 (series of m, 7H), 2.18 (s, 6H), 2.72 (dd, J=10.2, 13.8Hz, 1H), 2.90-3.20 (m, 3H), 4.40-4.50 (m, 1H), 7.10-7.30 (m, 5H), 8.03 (t, J=5.6Hz, 1H), 8.28 (d, J=8.0Hz, 1H); EIMS: 432.5 (MH)+. 분석치. (C₂₄H₃₇N₃0₄·1.75H₂O)C,H,N.

방법 S

4-{(R)-2-비페닐-4-일-1-〔3-(디메틸아미노)-프로필카르바모일〕-에틸카르바모일}-3,3-테트라메틸렌부티르산

디클로로메탄 (10 mL)중의 N-Cbz-D-비페닐알라닌 S-1(0.375 g, 1.0 mmol)용액에 l-히드록시벤조트리아졸(0.135 g, 1.0 mmol)을 첨가하고 EDAC·HCl(0.192 g, 1.0 mmol)을 첨가한후 이 혼합물을 30분간에 걸쳐 투명하게 되었다. 이 용액을 3-디메틸아미노-1-프로필아민 S-2 (0.13 mL, 1.0 mmol)으로 처리하고 이 반응 혼합물을 2시간 동안 교반시켰다. 이 반응물을 물(20 mL)로 급냉시킨 후 수층을 DCM (3X15 mL)로 추출하였다. 결합된 유기층을 물(50 mL)과 염수(25 mL)로 세정하고 Na₂SO₄상에서 건조시킨 후, 감압하에 여과농축하였다. 조 생성물 S-3을 더 이상 정제하지 않고 다음단계에 사용하였다. 수득한 고체 S-3를 질소대기하에 THF(5.0 mL)에 용해시키고 10% Pd/C (0.065 g)을 첨가한후 메탄올(10.0 mL)을 첨가하였다. 이 혼합물을 수소(발룬)하에 위치시키고 하룻밤 교반시켰다. 수소 대기를 질소로 교체한 후 고체를 여과제거하였다. 용매를 감압하에 제거하고 조 생성물 S-4을 더 이상 정제하지 않고 다음 단계에 사용하였다. 조 아민 S-4 (0.11 g, 0.33 mmol)를 THF (1.5 mL)에 용해시킨 후 3,3-테트라메틸렌글루타르산 무수물 (0.061 g, 0.36 mmol)로 처리하고 하룻밤 교반시켰다. 용매를 감압하에 제거하고 조 생성물 S-5을 역상 HPLC(아세토니트릴:물)로 정제하였다. 용매를 동결건조기상에서 제거하여 목적 생성물(62 mg)을 수득하였다.

MP 62-73℃; ¹H-NMR (DMSO-d₆): 1.20-1.60 (series of m, 12H), 2.1-2.2 (m, 2H), 2.20 (s, 6H), 2.25-2.40 (m, 4H), 2.77 (dd, J=10.0, 13.6Hz, 1H), 3.00-3.15 (m, 4H), 4.45-4.55 (m, 1H), 7.25-7.40 (m, 3H), 7.44 (t, J=7.6Hz, 2H), 7.55 (d, J=8.4Hz, 2H), 7.62 (d, J=7.2Hz, 2H), 8.04 (t, J=5.6Hz, 1H), 8.12 (d, J=8.4Hz, 1H), 8.17 (d, J=8.4Hz, 1H) ; EIMS: 494.8 (MH)+. 분석치. (C₂₉H₃₉N₃O₄·2.05H₂O)C,H,N.

4-{(R)-2-비페닐-4-일-1-〔3-(디메틸아미노)-프로필카르바모일〕-에틸카르바모일}-3,3-펜타메틸렌부티르산

환형 무수물로서 1,1-시클로헥산디아세트산 무수물을 사용하여 일반 절차 방법 S에 따라 N-Cbz-D-비페닐알라닌로부터 목적 화합물(76 mg)을 수득하였다. MP 85-95℃; ¹H-NMR (DMSO-d₆₎: 1.10-1.60 (series of m, 13H), 2.1-4.2 (series of m, 7H), 2.17 (s, 6H), 2.25-2.40 (m, 4H), 2.77 (dd, J=10.0, 13.6Hz, 1H), 3.00-3.15 (m, 3H), 4.45-4.55 (m, 1H), 7.25-7.40 (m, 3H), 7.44 (t, J=7.6Hz, 2H), 7.55 (d, J=8.4Hz, 2H), 7.62 (d, J=7.2Hz, 2H), 8.05 (t, J=5.4Hz, 1H), 8.29 (d, J=8.0Hz, 1H); EIMS: 508.6 (MH)+. 분석치. (C₃₀H₄₁N₃O₄·2.0H₂O)C,H,N.

4-{(R)-2-비페닐-4-일-1-〔3-(디메틸아미노)-프로필카르바모일〕-에틸카르바모일}-3,3-디메틸부티르산

무수물로서 3,3-디메틸글루타르산 무수물을 사용하여 N-Cbz-D-비페닐알라닌 으로부터 (50 mg)을 수득하였다. MP 84-92℃; ¹H-NMR (DMSO-d₆): 0.87 (s, 3H), 0.89 (s, 3H), 1.40-1.60 (m, 2H), 2.06 (d, J=13.6Hz, 2H), 7H), 2.14 (s, 6H), 2.15-2.35 (m, 4H), 2.78 (dd, J=9.6, 13.6Hz, 1H), 2.95-3.10 (m, 3H), 4.45-4.55 (m, 1H), 7.25-7.40 (m, 3H), 7.44 (t, J=7.6Hz, 2H), 7.55 (d, J=8.4Hz, 2H), 7.62 (d, J=6.8Hz, 2H), 8.02 (t, J=5.4Hz, 1H), 8.22 (br d, J=8.4Hz, 1H); EIMS: 468.5 (MH)+. 분석치. (C₂₇H₃₇N₃O₄·0.25HCl·0.5H₂O)C,H,N.

방법 T

4-{(S)-2-페닐-1-〔4-(디에틸아미노)-부틸카르바모일〕-에틸카르바모일}-3,3-테트라메틸렌부티르산

디클로로메탄 (20 mL)중의 N-Cbz-L-페닐알라닌 T-1 (0.598 g, 2.0 mmol) 용액에 1-히드록시벤조트리아졸 (0.27 g, 2.0 mmol)을 첨가하고 EDAC·HCl (0.384 g, 2.0 mmol)을 첨가한 후 이 혼합물이 30분간에 걸쳐 투명하게 되었다. 이 용액을 4-디에틸아미노-1-부틸아민 T-2 (0.35 mL, 2.0 mmol)으로 처리하고 이 반응 혼합물을 2.5시간 동안 교반시켰다. 이 반응물을 물(40 mL)로 급냉시킨후 수층을 DCM (3X20 mL)로 추출하였다. 결합된 유기층을 물(100 mL)과 염수(50 mL)로 세정하고 Na₂SO₄상에서 건조시킨 후, 감압하에 여과농축하였다. 조 생성물 T-3를 더 이상 정제하지 않고 다음단계에 사용하였다. 수득한 고체 T-3를 질소대기하에 THF (10 mL)에 용해시킨 후 10% Pd/C (0.10 g)를 첨가한 뒤 메탄올(20 mL)을 첨가하였다. 이 혼합물을 수소(발룬)하에 위치시키고 하룻밤 교반시켰다. 수소 대기를 이후 질소로 교체한 후 고체를 여과제거하였다. 용매를 감압하에 제거하고 조 생성물 T-4를 더 이상 정제하지 않고 다음 단계에 사용하였다. 조 아민 T-4 (0.18 g, 0.60 mmol)를 THF (3.0 mL)와 DMF (0.5 mL)에 용해시킨 후 3,3-테트라메틸렌글루타르산 무수물 (0.10 g, 0.6 mmol)로 처리하고 하룻밤 교반시켰다. 용매를 감압하에 제거하고 조 생성물 T-5를 역상 HPLC (아세토니트릴:물)로 정제하였다. 용매를 동결건조기상에서 제거하여 목적 생성물(32 mg)을 수득하였다. MP 62-68℃; ¹H-NMR (DMSO-d₆): 1.01 (t, J=7.2Hz, 6H), 1.20-1.60 (series of m, 13H), 2.05-2.30 (series of m, 4H), 2.45-2.55 (m, 4H), 2.62 (q, J=7.2Hz, 4H), 2.73 (dd, J=9.4, 13.8Hz, 1H), 2.90-3.20 (series of m, 3H), 4.12 (br s), 4.40-4.50 (m, 1H), 7.10-7.30 (m, 5H), 8.02 (t, J=5.6Hz, 1H), 8.43 (d, J=8.4Hz, 1H); EIMS: 460.6 (MH)+. 분석치. (C₂₆H₄₁N₃O₄·1.10H₂O)C,H,N.s

방법 U

(S)-4-(2-(4-(피리미딘-2-일아미노)부틸카르바모일)-2,3-디히드로-1H-인덴-2-일카르바모일)-4-아세트아미도부탄 아미드

디클로로메탄 (11 mL)중의 N-FMOC-L-N^δ-트리틸-글루타민 U-1 (1.12 g, 1.84 mmol) 용액에 1-히드록시벤조트리아졸 (0.25 g, 1.84 mmol)을 첨가하고 EDAC·. HCl(0.353 g, 1.85 mmol)을 첨가한 뒤 이 혼합물은 30분간에 걸쳐 투명하게 되었다. 이 용액을 캐뉼러를 통해 DCM (7 mL)중의 아민 I-4 (0.70 g, 1.84 mmol)로 처리하고 하룻밤 교반시켰다. 이 반응물을 물(25 mL)로 급냉시키고 수층을 DCM (3X10 mL)로 추출하였다. 결합된 유기층을 물(50 mL), 염수(50 mL)로 세정하고, Na₂SO₄상에서 건조시킨 후 감압하에 여과농축하였다. 조 생성물 U-2를 직접 다음단계에 사용하였다. 고체 U-2를 DCM (20 mL)에 용해시킨 후 4-(아미노메틸) 피페리딘(2.1 g, 18.4 mmol)으로 처리하고, 이 반응 혼합물을 2시간동안 교반시킨 뒤 클로로포름(40 mL)으로 희석하였다. 유기층을 염수(60 mL), 포스페이트 완충액 pH 5.5 (3X60mL), 포화 수용액 NaHCO₃(60 mL), 염수(60 mL)로 세정하고, Na₂SO₄상에서 건조시킨 후 감압하에 여과농축하였다. 조 물질 U-3를 DCM (20 mL)에 용해시킨 후 트리에틸아민 (0.53 mL, 3.8 mmol)으로 처리하고 아세트산 무수물(0.44 mL, 4.7 mmol)로 처리하였다. 이 반응 혼합물을 하룻밤 교반시킨후 DCM (10 mL)로 희석하였다. 유기 용액을 포화 수용액 NaHCO₃ (50 mL)으로 분배시켰다. 수층을 DCM (10 mL)로 추출하였다. 결합된 유기층을 염수(50 mL)로 세정하고, Na₂SO₄상에서 건조시킨 후, 감압하에 여과농축하였다. 조 물질 U-4을 다음 단계에 직접 사용하였다. 중간체 U-4를 DCM (10 mL)에 용해시킨 후 트리이소프로필실란(0.26 mL, 1.27 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물을 0 ℃로 냉각시킨 후 TFA (4 mL)로 처리하였다. 이 반응 혼합물을 실온으로 만들어 2시간동안 교반시켰다. 조 물질을 컬럼 크로마토그래피(실리카겔, 구배 10:0.5:0.1 내지 10:1:0.2; DCM:MeOH:트리에틸아민)로 정제하여 다음단계를 위한 중간체 U-5를 수득하였다. 잔류 U-5 (0.59 g, 1.07 mmol)를 질소대기하에 THF (5 mL)에 용해시킨 후 10% Pd/C (0.065 g) 이어서 메탄올(10 mL)을 첨가하였다. 이 혼합물을 수소(발룬)하에 위치시키고 하룻밤 교반시켰다. 수소대기를 질소로 교체한 후 고체를 여과제거하였다. 용매를 감압하에 제거하여 다음 단계에 더 이상 정제하지 않고 사용하는 고체 U-6를 수득하였다. 중간체 U-6(0.18 g, 0.42 mmol)를 에틸알콜(3 mL)에 용해시킨 후 2-클로로피리미딘 U-7 (0.096 g, 0.84 mmol)과 디이소프로필에틸아민 (0.15 mL, 0.86 mmol)으로 처리하였다. 이 반응 혼합물을 하룻밤 교반시킨 후 실온으로 냉각하였다. 용매를 감압하에 제거하고 조 생성물 U-8을 역상 HPLC (아세토니트릴:물)로 정제하였다. 용매를 동결건조기상에서 제거하여 목적 생성물(61 mg)을 수득하였다. MP 76-89℃; ¹H-NMR (DMSO-d₆): 1.3-1.6 (m, 4H), 1.6-1.80 (m, 2H), 1.82 (s, 3H), 1.90-2.10 (m, 2H), 3.05 (q, J=5.8Hz, 2H), 3.10-3.30 (m, 4H), 3.53 (d, J=16.8Hz, 1H), 3.90-4.05 (m, 1H), 6.52 (t, J=4.8Hz, 1H), 6.77 (br s, 1H), 7.05-7.30 (m, 6H), 7.53 (t, J=5.8Hz, 1H), 8.15-8.35 (m, 3H), 8.54 (s, 1H); EIMS: 496.6 (MH)+. 분석치. (C₂₅H₃₃N₇O₄·0.25HCl·0.05EtOH·1.15H₂O)C,H,N.

방법 V

(S)-4-(2-(4-(2-시아노구아니디노)부틸카르바모일)-2,3-디히드로-1H-인덴-2-일카르바모일)-4-아세트아미도부탄 아미드

이소프로필 알콜 (20 mL)에 U-6 (0.192 g, 0.55 mmol)를 용해시킨 후 디페닐 시아노카르본이미데이트 V-1 (0.22 g, 0.92 mmol)을 첨가하고 환류가열하였다. 이 혼합물을 하룻밤동안 교반시켰다. 추가적인 양의 디페닐 시아노카르본이미데이트(0.072 g, 0.30 mmol)와 트리에틸아민 (0.05 mL, 0.36 mmol)을 상기 반응 혼합물에 첨가한 후 이 혼합물을 1.5시간 환류가열시켰다. 이 혼합물을 실온으로 냉각하고 용매를 감압하에 제거하였다. 조 물질 V-2을 다음단계에 직접 사용하였다. 에틸 알콜(20 mL)에 잔류물 V-2를 용해시킨 후 0℃로 냉각시키고 1분간 용액을 통해 암모니아 가스를 불어넣었다. 반응 용기를 밀봉시키고 이 혼합물을 50 ℃에서 5시간동안 교반시켰다. 용기를 후드에서 배기시키고 용매를 감압하에 제거하였다. 조 생성물 V-3를 역상 HPLC (아세토니트릴:물)로 정제하여 백색 고체로서 목적 화합물(27 mg)을 수득하였다. MP 122-133℃; ¹H-NMR (DMSO-d₆): 1.37 (br s, 4H), 1.6-1.80 (m, 2H), 1.83 (s, 3H), 1.90-2.10 (m, 2H), 2.95-3.10 (m, 4H), 3.19 (t, J=15.4Hz, 2H), 3.53 (d, J=16.4Hz, 1H), 3.90-4.05 (m, 1H), 6.52 (t, J=4.8Hz, 1H), 6.78 (br s, 2H), 7.10-7.30 (m, 5H), 7.55 (t, J=5.8Hz, 1H), 8.19 (d, J=6.0Hz, 1H), 8.54 (s, 1H); EIMS: 485.5 (MH)+. 분석치. (C₂₃H₃₂N₈O₄·0.16 CF₃COOH·0.5H₂O)C,H,N.

여기에 기술된 양태의 다양한 개질과 변형은 당업자에게 명백한 바와 같이 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다. 여기에 기술된 양태는 다만 실시예로 제공된 것이다.

인용된 참조문헌:(참고로 본 발명에 포함된다)

Claims

하기 구조를 포함하는 역 콜레스테롤 수송 매개제:

여기에서, A, B, 및 C는 임의의 순서일 수 있으며

A는 산성 기와 그의 바이오이소스테레(bioisostere)를 함유하는 아미노산과 그의 유사체를 함유하고,

B는 친지질성 기를 함유하는 아미노산과 그의 유사체를 함유하고, 그리고

C는 염기성 기와 그의 바이오이소스테레를 함유하는 아미노산과 그의 유사체를 함유하며,

상기에서 알파 아미노 또는 알파 카르복시기중의 하나 이상은 그의 각 아미노 또는 카르복시 말단 아미노산 또는 그의 유사체로부터 제거된다.
제 1 항에 있어서, 만약 제거되지 않는다면, 상기의 알파 아미노기는 아세틸, 페닐아세틸, 벤조일, 피볼릴, 9-플루오레닐메틸옥시카보닐, 2-나프틸산, 니코틴산, CH₃-(CH₂)n-CO-[여기서, n은 1 내지 20이다], 디-t-부틸-4-히드록시-페닐, 나 프틸, 치환된 나프틸, FMOC, 비페닐, 치환된 페닐, 치환된 헤테로사이클, 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 사이클로알킬, 융합 사이클로알킬, 포화 헤테로아릴, 및 치환된 포화 헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택된 보호기로 캡핑되는 매개제.
제 1 항에 있어서, 만약 제거되지 않는다면, 상기의 알파 카르복시는 아민, 예를 들면, RNH (여기서 R은 H, 디-t-부틸-4-히드록시-페닐, 나프틸, 치환된 나프틸, FMOC, 비페닐, 치환된 페닐, 치환된 헤테로사이클, 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 사이클로알킬, 융합 사이클로알킬, 포화 헤테로아릴, 및 치환된 포화 헤테로아릴이다)로 구성된 군에서 선택된 보호기로 캡핑되는 매개제.
제 1 항에 있어서, 상기의 산성 기의 바이오이소스테레는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 매개제:
제 1 항에 있어서, 상기의 염기성 기의 바이오이소스테레가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 매개제:
제 1 항에 있어서, 상기의 매개제가 하프-디누디드(half-denuded)이며 하기 구조를 가지는 매개제:

상기에서 X₁은

이고

상기에서 X₂는 F, Cl, Br, I, C₀ _-6 알킬, OCH₃, CF₃ 또는 OCF₃이고,

상기에서 X₃는 Cl, C₀ _- ₆알킬, OCH₃이며

상기에서 n는 1 또는 2이다.
제 1 항에 있어서, 상기의 매개제가 하프-디누디드(half-denuded)이며 하기로 구성된 군에서 선택되는 매개제: 글루타릭(Glutaric)-BIP-R-NH₂, 글루타릭-bip-r-NH₂, Ac-E-BIP-아그마틴(Agmatine), Ac-e-bip-아그마틴, Ac-R-BIP-GABA, Ac-r-bip-GABA, 4-구아니디노부타닉(butanoic)-BIP-E-NH₂, 4-구아니디노부타닉-bip-e- NH₂, 글루타릭-BIP-K-NH₂, 및 글루타릭-bip-k-NH₂.
제 1 항에 있어서, 상기의 매개제가 하프-디누디드(half-denuded)이며 하기로 구성된 군에서 선택되는 매개제: 2,2-디메틸글루타릭-f-r-NH₂, 2,2-디메틸글루타릭-F-R-NH₂, 글루타릭-F-R-NH₂, 글루타릭-f-r-NH₂, 숙시닉(Succinic)-bip-r-NH₂, 숙시닉-BIP-R-NH₂, 숙시닉-F-R-NH₂, 숙시닉-f-r-NH₂, 2,2-디메틸글루타릭-bip-r-NH₂, 2,2-디메틸글루타릭-BIP-R-NH₂, 디메틸숙시닉-bip-r-NH₂, 디메틸숙시닉-BIP-R-NH₂, 글루타릭-F-K-NH₂, 숙시닉-F-K-NH₂, 숙시닉-f-k-NH₂, 2,2-디메틸글루타릭-F-K-NH₂, 2,2-디메틸글루타릭-f-k-NH₂, 디메틸숙시닉-f-k-NH₂, 디메틸숙시닉-F-K-NH₂, 디메틸숙시닉-Aic-r-NH₂, 2,2-디메틸글루타릭-Aic-r-NH₂, 글루타릭-Aic-r-NH₂, 숙시닉-Aic-r-NH₂, 글루타릭-Aic-R-NH₂, 테트라졸아미드글루타릭-BIP-R-NH₂, 3,3-디메틸글루타릭-Aic-R-NH₂, 디메틸숙시닉-Aic-R-NH₂, 및 2,2-디메틸글루타릭-Aic-R-NH₂.
제 1 항에 있어서, 상기의 매개제가 완전 디누디드(Fully-denuded)이며 하기로 구성된 군에서 선택되는 매개제:
하기로 구성된 군에서 선택되는 화합물을 함유한 역 콜레스테롤 수송 매개제: 글루타릭-bip-r, E-BIP-아그마틴, (4-카르바모일부틸)구아니딘-BIP-E, 글루타릭-bip-k, (4-카르바모일부틸)구아니딘-bip-GABA, (4-카르바모일부틸)구아니딘-BIP-GABA, 글루타릭-Aic-아그마틴, (4-카르바모일부틸)구아니딘-phe-GABA, 4,4-디메틸글루타릭-phe-아그마틴, Dimet.글루타릭-F-R, 글루타릭-F-R, 글루타릭-f-r, 숙시닉-bip-r, 숙시닉-BIP-R, 숙시닉-f-r, Dimet.글루타릭-bip-r, Dimet.글루타릭-BIP-R, Dimet.숙시닉-BIP-R, 숙시닉-phe-k, Dimet.숙시닉-phe-k, Dimet.숙시닉-Phe-K, 3,3-디메틸글루타릭-phe-아그마틴, Dimet.숙시닉-Aic-r, 글루타릭-f-(에타노)아그마틴, 글루타릭-Aic-r, 숙시닉-Aic-r, 글루타릭-Aic-R, (lH-테트라졸-5-5-일)글루타르아미드-BIP-R, 2,2-디메틸숙시닉-Phe-아그마틴, Dimet.숙시닉-Aic-R, 3,3-스피로시클로펜틸글루타릭-Phe-아그마틴, 3,3-디메틸글루타릭-F-아그마틴, 글 루타릭-Phe-아그마틴(Bis-Boc), 글루타릭-f-시아노아그마틴, 글루타릭(테트라졸아미드)-BIP-아그마틴(피리미딘), 숙시닉-BIP-아그마틴(피리미딘), 3,3-스피로시클로헥실글루타릭-bip-아그마틴(피리미딘), 3,3-디메틸글루타릭-bip-아그마틴(피리미딘), 3,3-스피로시클로펜틸글루타릭-Aic-아그마틴(피리미딘), 3,3-디메틸글루타릭-Aic-아그마틴(피리미딘), 3,3-스피로시클로펜틸글루타릭-Phe-3-(디메틸아미노)부탄, 4,4-디메틸글루타릭-bip-아그마틴(피리미딘), 및 3,3-스피로시클로펜틸글루타릭-bip-3-(디메틸아미노)프로판(여기에서 임의의 미유도화된 아미노 및/또는 카르복시 말단 아미노산은 보호기로 캡핑된다).
k가 보호기를 추가로 갖는 Dimet.숙시닉-phe-k 화합물
R이 추가로 보호기를 갖는 Dimet.글루타릭-F-R 화합물.
R이 추가로 보호기를 갖는 글루타릭-F-R 화합물.