KR20070043711A - 고콜레스테롤혈증과 관련 질환의 치료를 위한 소분자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 포유류의 역 콜레스테롤 수송을 증진하는데 채택되는 조성물을 제공한다. 본 조성물은 경구 투여에 적합하며, 고콜레스테롤혈증, 아테롬성 동맥경화증 및 관련 심혈관계 질환의 치료 및/또는 예방에 유용하다.

Description

고콜레스테롤혈증과 관련 질환의 치료를 위한 소분자{SMALL MOLECULES FOR THE TREATMENT OF HYPERCHOLESTEROLEMIA AND RELATED DISEASES}

관련 출원의 상호 참고

본 출원은 2004년 6월 9일에 출원된 미국 임시특허출원 60/578,228을 35 U.S.C. § 119(e)하에 우선권으로 주장하며, 참고로 그의 내용 모두 본 출원에 포함된다.

본 발명의 배경

본 발명은 고콜레스테롤혈증 (hypercholesterolemia) 및 이와 관련된 심혈관계 질환과 다른 질환을 치료하기 위한 역 콜레스테롤 수송(Reverse Cholesterol Transport; RCT)의 소분자 매개제에 관한 것이다.

혈청내 콜레스테롤치 상승 ("고콜레스테롤혈증")이, 동맥벽 내에 콜레스테롤의 진행성 축적인 아테롬성 동맥경화증 (atherosclerosis)을 발생시키는 원인이 되는 인자라는 것은 현재 널리 정립되어 있다. 고콜레스테롤혈증과 아테롬성 동맥경화증은 고혈압, 관상 동맥 질환, 심장 마비 및 발작을 포함한 심혈관계 질환의 주요 원인이다. 미국 내에서만도 매년 약 백십만명이 심장 마비로 고통받고 있으며, 이에 소용되는 비용은 1,170억 달러를 초과하는 것으로 추정되고 있다. 혈중 콜레스테롤 수준을 낮추기 위한 수많은 약제학적 전략이 있긴 하지만, 이들 중의 상당 수가 바람직하지 못한 부작용을 유발시키고, 안전성 측면에서 우려를 야기시킨다. 더욱이, 시판중인 약물 치료법 중의 어떠한 것도, 신체로부터 콜레스테롤을 제거시키는 데 있어 중요한 대사 경로인 역 콜레스테롤 수송을 적절히 자극하지 못하였다.

순환되고 있는 콜레스테롤은, 혈중 지질을 수송하는 복합 지질 및 단백질 조성물의 입자인 혈장 지단백질에 의해 운반된다. 저밀도 지단백질 (LDL)과 고밀도 지단백질 (HDL)이 주요 콜레스테롤 운반체이다. LDL은 콜레스테롤을 간 (여기서 콜레스테롤이 합성되거나 또는 식이 공급원으로부터 수득된다)으로부터 신체 내의 간외 조직으로 전달하는데 책임이 있는 것으로 여겨진다. 용어 "역 콜레스테롤 수송"은 콜레스테롤을 간외 조직으로부터 콜레스테롤이 대사되고 제거되는 간으로 수송하는 것을 의미한다. 혈장 HDL 입자가 역 수송 과정에 있어 중요한 역할을 하여, 조직 콜레스테롤의 스캐빈저로서 작용하는 것으로 여겨진다.

아테롬성 동맥경화증 병변에 침착된 지질이 주로 혈장 LDL로부터 유래된다는 개념을 뒷받침해주는 설득력있는 증거가 제시되었기 때문에, LDL이 대중적으로 "나쁜" 콜레스테롤으로서 공지되어 왔다. 이와는 달리, 혈장 HDL 수준은 관상 심장질환과 역상관 관계이므로, 실제로 혈장 HDL 수준이 높다는 것은 마이너스 (negative) 위험 요인으로서 간주되고 있다. 고수준의 혈장 HDL이 관상 동맥 질환으로부터 보호해줄 뿐만 아니라 실제적으로 아테롬성 동맥경화증 플라크(plaque)의 퇴행을 유도시킬 수 있는 것으로 가정되었다 [참조: Badimon과 공동 연구자들 1992, Circulation 86 (Suppl. III) :86-94]. 따라서, HDLs는 대중적으로 "좋은" 콜레스테롤으로서 공지되어 왔다.

LDLs로부터 방출된 세포내 콜레스테롤의 양이 세포성 콜레스테롤 대사를 제어한다. LDLs로부터 유도된 세포성 콜레스테롤의 축적이 다음 3가지 과정을 제어한다: (1) 콜레스테롤 생합성 경로에 있어 중요한 효소인 HMGCoA 리덕타제의 합성을 중지시킴으로써 세포성 콜레스테롤 합성을 저하시키고; (2) 유입되는 LDL-유도된 콜레스테롤이, 콜레스테롤을 콜레스테릴 에스테르로 전환시켜 이를 저장 비말(droplets) 내에 침착시키는 세포성 효소인 LCAT를 활성화시킴으로써 콜레스테롤의 저장을 증진시키며; 그리고 (3) 콜레스테롤을 세포 내에 축적시키는 것이, 새로운 LDL 수용체의 세포성 합성을 억제시키는 피드백 메카니즘을 구동시킨다. 따라서, 세포는 LDL 수용체의 보체를 조정함으로써, 과부하없이 상기 수용체의 대사적 필요량을 충족시키기에 충분한 콜레스테롤이 생성되도록 한다 [참조: Brown & Goldstein, In: The Pharmacological Basis Of Therapeutics, 8th Ed., Goodman & Gilman, Pergamon Press, NY, 1990, Ch. 36, pp. 874-896].

역 콜레스테롤 수송 (RCT)은 말초 세포 콜레스테롤을 간외 조직으로 재순환하기 위해 간으로 복귀시킬 수 있거나, 또는 담즙으로서 장 내로 배출시킬 수 있는 경로이다. RCT 경로는 대부분의 간외 조직으로부터 콜레스테롤을 제거시키는 유일한 수단을 나타낸다. RCT는 주로 다음 3가지 단계로 이루어진다: (1) 콜레스테롤을 말초 세포로부터 초기 제거시키는 콜레스테롤 유출 단계; (2) 유출된 콜레스테롤이 말초 세포 내로 재유입되는 것을 방지시켜 주는, 레시틴:콜레스테롤 아 실트랜스퍼라제 (LCAT)의 작용에 의한 콜레스테롤 에스테르화 단계; 및 (3) HDL 콜레스테릴 에스테르를 간 세포에 흡수/전달하는 단계. LCAT는 RCT 경로에 있어 중요한 효소이고, 이는 주로 간에서 생성되며, HDL 분획과 연관된 혈장에서 순환된다. LCAT는 세포 유도된 콜레스테롤을 콜레스테릴 에스테르로 전환시키는데, 이는 제거될 것으로 예정된 HDL에 격리되어 있다. 이러한 RCT 경로는 HDLs에 의해 매개된다.

HDL은 고밀도를 특징으로 하는 지단백질 입자에 대한 일반 명칭이다. HDL 복합체의 주요 지질 구성분은 각종 인지질, 콜레스테롤 (에스테르) 및 트리글리세라이드이다. 가장 두드러진 아포지단백질 (apolipoprotein) 구성분은 HDL의 기능적 특징을 결정짓는 A-I 및 A-II이다.

각 HDL 입자는 아포지단백질 A-1 (ApoA-I)의 하나 이상의 복사물 (및 통상적으로는 2 내지 4개의 복사물)을 함유한다. ApoA-I은 신속하게 절단되어 243개 아미노산 잔기를 갖는 성숙한 폴리펩티드를 생성시키는 프로단백질 (proprotein)로서 분비되는 프레프로아포지단백질 (preproapolipoprotein)로서 간과 소장에 의해 합성된다. ApoA-I은 링커 부분 (이는 종종 프롤린이다)에 의해 떨어져 있는 6 내지 8개의 상이한 22개 아미노산 반복체로 주로 이루어지고, 몇몇 경우에는 여러 개의 잔기로 구성된 직선물(stretch)로 이루어진다. ApoA-I은 지질과 다음 3가지 유형의 안정한 복합체를 형성한다: 프레-베타(pre-beta)-1 HDL로서 지칭된, 지질-불충분한 작은 복합체; 프레-베타-2 HDL로서 지칭된, 극성 지질 (인지질 및 콜 레스테롤)을 함유하는 편평한 원반형 입자; 및 구형 또는 성숙한 HDL (HDL₃ 및 HDL₂)로서 지칭된, 극성 지질과 비극성 지질을 둘 다 함유하는 구형 입자. 순환시 대부분의 HDL이 ApoA-I과 ApoA-II를 함유하긴 하지만, ApoA-I 만을 함유하는 HDL 분획 (AI-HDL)이 RCT에 있어 보다 유효한 것으로 여겨진다. 역학 조사는 AI-HDL이 항동맥경화성 (anti-atherogenic)이라는 가설을 뒷받침해준다[참조: Parra과 공동연구자들, 1992, Arterioscler. Thromb. 12: 701-707; Decossin과 공동연구자들, 1997, Eur. J. Clin.Invest. 27: 299-307].

생체 내에서 수득된 데이터를 근거로 한 몇 가지 증거는 HDL 및 이의 주요 단백질 구성분인 ApoA-I이 아테롬성 동맥경화증 병변을 예방하고, 잠재적으로는 플라크를 퇴행시키는데 밀접한 영향을 끼치게 하여, 이들을 치료적 개재를 위해 매력있는 표적물로 만든다. 첫째, 사람에게서 아테로마생성 (atherogenesis)과 혈청 ApoA-I (HDL) 농도 간에는 역상관 관계가 존재한다 [참조: Gordon & Rifkind, 1989, N. Eng. J. Med. 321: 1311-1316; Gordon과 공동연구자들, 1989,Circulation 79: 8-15]. 실제로, 특정 아집단의 HDL이 사람에게서 아테롬성 동맥경화증에 대한 위험 감소와 연관이 있었다 [참조: Miller, 1987, Amer. Heart 113: 589-597; Cheung과 공동연구자들, 1991, Lipid Res. 32: 383-394; Fruchart & Ailhaud, 1992, Clin. Chem. 38: 79].

둘째, 동물 연구 결과는 ApoA-I (HDL)의 보호 역할을 뒷받침해준다. 콜레스테롤-공급된 토끼를 ApoA-I 또는 HDL로 처리하면, 콜레스테롤-공급된 토끼에게 서 플라크 (지방 줄무늬)의 발생과 진행이 저하되었다 [참조: Koizumi과 공동연구자들, 1988, J. Lipid Res. 29: 1405-1415; Badimon과 공동연구자들, 1989, Lab. Invest. 60: 455-461; Badimon과 공동연구자들, 1990, J. Clin. Invest. 85: 1234-1241]. 그러나, 효능은 HDL의 공급원에 따라서 다양하였다 [참조: Beitz과 공동연구자들, 1992, Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids 47: 149-152; Mezdour과 공동연구자들, 1995, Atherosclerosis 113: 237-246].

세째, ApoA-I의 역할에 대한 직접적인 증거는 형질전환성 동물이 참여한 실험으로부터 획득하였다. 유전적으로 식이-유도된 아테롬성 동맥경화증에 걸리기 쉬운 마우스에게 전이된 ApoA-I에 대한 사람 유전자의 발현은, 대동맥 병변이 발생하지 못하도록 보호해주었다 [참조: Rubin과 공동연구자들, 1991, Nature 353: 265-267]. ApoA-I 형질전환된 유전자는 ApoE-결핍성 마우스 및 Apo(a) 형질전환성 마우스에서 아테롬성 동맥경화증을 억제시키는 것으로 또한 밝혀졌다 [참조: Paszty와 공동연구자들, 1994, J. Clin. Invest. 94: 899-903; Plump와 공동연구자들, 1994, PNAS. USA 91: 9607-9611; Liu와 공동연구자들, 1994, J. Lipid Res. 35: 2263-2266]. 유사한 결과가 사람 ApoA-I을 발현하는 형질전환성 토끼에서 관찰되었고 [참조: Duverger,1996, Circulation 94: 713-717; Duverger와 공동연구자들, 1996, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16: 1424-1429], 증가된 수준의 사람 ApoA-I이 아테롬성 동맥경화증 발생으로부터 보호시켰고 발룬 혈관형성술 이후의 재발 협착증을 억제시킨 형질전환성 랫트에서 관찰되었다 [참조: Burkey와 공동연구자들, 1992, Circulation, Supplement I, 86:I-472, Abstract No.1876; Burkey와 공동연구자들, 1995, J. Lipid Res. 36: 1463-1473].

고콜레스테롤혈증 및 다른 고지질혈증에 대한 현 치료법

과거 20여년간, 콜레스테롤혈증 화합물을 HDL 조절제와 LDL 조절제로 분리시키고 혈중 LDL 수준을 감소시키는 것이 바람직하다는 인식에 근거하여, 수 많은 약물을 개발하게 되었다. 그러나, 이들 약물 중의 상당 수는 바람직하지 못한 부작용을 나타내고/내거나 특정 환자에게는 금기시되는데, 특히 기타 약물과 조합하여 투여되는 경우에 금기된다. 이들 약물과 치료적 전략에는 다음이 포함된다:

(1) 담즙산이 장으로부터 간으로 재순환되는 것을 차단시켜 주는 담즙산-결합성 수지 [예를 들면, 콜레스티라민(QUESTRAN LIGHT, Bristol-Myers Squibb), 및 콜레스티폴 하이드로클로라이드 (COLESTID, Pharmacia & Upjohn Company)];

(2) 콜레스테롤 생합성에 관여하는 주요 효소인 HMGCoA 리덕타제를 차단시킴으로써 콜레스테롤 합성을 억제하는 스타틴(statin) [예를 들면, 아스퍼질루스 (Aspergillus) 균주로부터 유래된 천연 산물인 로바스타틴 (MEVACOR, Merck & Co., Inc.), 프라바스타틴 (PRAVACHOL, Bristol-Myers Squibb Co.), 및 아토르바스타틴 (LIPITOR, Warner Lambert)];

(3) 니아신(niacin)은 VLDL의 생성을 감소시키는 수용성 비타민 B-복합체이고 LDL을 저하시키는데 유효하고;

(4) 피브레이트( fibrate )는 VLDL 분획을 감소시킴으로써 혈청 트리글리세라이드를 저하시키기 위해 사용되고, 이는 몇몇 환자 집단에서 동일한 메카니즘으로 통하여 혈장 콜레스테롤을 적당한 수준으로 감소시킬 수 있으며 [예를 들면, 클로 피브레이트 (ATROMID-S, Wyeth-Ayerst Laboratories), 및 젬피브로질 (gemfibrozil) (LOPID, Parke-Davis)];

(5) 에스트로겐 대체 요법은 갱년기 후의 여성에게서 콜레스테롤 수준을 저하시킬 수 있고;

(6) 장쇄 알파,오메가-디카르복실산은 혈청 트리글리세라이드 및 콜레스테롤을 저하시키는 것으로 보고되었으며 [참조: Bisgaier와 공동연구자들, 1998, J. Lipid Res. 39: 17-30; WO 98/30530; 미국 특허 제4,689,344호; WO 99/00116; 미국 특허 제5,756,344호; 미국 특허 제3,773,946호; 미국 특허 제4,689,344호; 미국 특허 제4,689,344; 미국 특허 제4,689,344호;및 미국 특허 제3,930,024호];

(7) 에테르 [참조: 미국 특허 제4,711,896호; 미국 특허 제5,756,544호; 미국 특허 제6,506,799호], 돌리콜의 포스페이트 [참조: 미국 특허 제4,613,593호], 및 아졸리딘디온 유도체 [참조: 미국 특허 제4,287,200호]를 포함한 기타 화합물이 혈청 트리글리세라이드 및 콜레스테롤 수준을 저하시키는 것으로 개시되었다.

콜레스테롤을 저하시키기 위해 현재 이용되고 있는 약물 중 어떠한 것도 HDL 수준을 안전하게 상승시키고 RCT를 자극하지 못하였다. 실제로, 이들 현 치료 전략의 대부분은 콜레스테롤 수송 경로, 식사 흡수 조정, 재순환, 콜레스테롤 합성, 및 VLDL 집단에 대해서 작동하는 것으로 여겨진다.

고콜레스테롤혈증을 치료하기 위한 ApoA -I 효능제( Agonist )

아테롬성 동맥경화증으로부터 보호하는데 있어서의 HDL, 즉 ApoA-I 및 이와 연관된 인지질 둘 다의 잠재적 역할 측면에서 보면, 재조합적으로 생성된 ApoA-I을 활용하는 사람 임상 시도는 UCB Belgium [참조: Pharmaprojects, Oct. 27, 1995; IMS R & D Focus, Jun. 30, 1997; Drug Status Update, 1997, Atherosclerosis 2 (6): 261-265; M. Eriksson at Congress, "The Role of HDL in Disease Prevention," Nov. 7-9, 1996, Fort Worth; Lacko & Miller, 1997, J. Lip. Res. 38: 1267-1273; and WO 94/13819]에 의해 시작되었고, 중단되었으며 외견상 다시 개시되었고, Bio-Tech (Pharmaprojects, Apr. 7, 1989)에 의해 시작되고 중단되었다. 패혈성 쇽(shock)을 치료하기 위해 ApoA-I을 사용하는 시도가 또한 수행되었다 [참조: Opal,"Reconstituted HDL as a Treatment Strategy for Sepsis," IBC's 7th International Conference on Sepsis, Apr. 28-30, 1997, Washington, D.C.; Gouni 와 공동연구자들, 1993, J. Lipid Res. 94: 139-146; Levine, WO 96/04916]. 그러나, ApoA-I의 생성 및 사용과 연관된 뜻하지 않은 많은 위험이 있기 때문에, 이를 약물로서 사용하기에는 이상적이지 못하였는데: 예를 들어, ApoA-I은 생산하기가 곤란하고 비용이 많이 드는 큰 단백질이므로, 저장 동안의 안정성, 활성 생성물의 전달 및 생체내 반감기 측면에서 상당한 제작 및 재현성 문제점을 극복해야만 한다.

이러한 단점들을 고려하여, ApoA-I을 모방하는 펩티드를 제조하기 위한 시도가 수행되었다. ApoA-I의 주요 활성이 단백질 내의 독특한 이차 구조상 특징의 다중 반복체 - 부류 A 양친매성 α-나선 [참조: Segrest, 1974, FEBS Lett. 38: 247-253; Segrest와 공동연구자들, 1990, PROTEINS: Structure, Function and Genetics 8: 103-117]의 존재에 기인된 것이기 때문에, ApoA-I의 활성을 모방하는 펩티드를 고안하고자 하는 대부분의 노력들은 부류 A-유형 양친매성 α-나선을 형성하는 펩티드를 고안하는데 집중되었다 [참조: 미국 특허 제6,376,464호 및 제6,506,799호에서의 배경 기술; 이들의 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입되어 있다].

한 연구에서, 푸쿠시마 (Fukushima)등과 공동연구자들은 동등한-친수성 면과 소수성 면을 갖는 양친매성 α-나선을 형성하도록 주기적으로 배열된 Glu, Lys 및 Leu 잔기로만 전적으로 구성된 22-잔기 펩티드 ("ELK 펩티드")를 합성하였다 [참조: Fukushima와 공동연구자들, 1979, J. Amer. Chem. Soc. 101(13): 3703-3704; Fukushima와 공동연구자들, 1980, J. Biol. Chem. 255:10651-10657]. ELK 펩티드는 ApoA-I의 198-219 단편과 41% 서열 상동성을 공유한다. ELK 펩티드는 인지질과 효과적으로 회합하고, ApoA-I의 물리적 및 화학적 특성 중의 일부를 모방하는 것으로 밝혀졌다 [참조: Kaiser와 공동연구자들, 1983,PNAS USA 80: 1137-1140; Kaiser와 공동연구자들, 1984, Science 223: 249-255; Fukushima와 공동연구자들, 1980, 상기 참조;Nakagawa와 공동연구자들, 1985, J. Am. Chem. Soc. 107: 7087-7092]. 이러한 22-잔기 펩티드의 이량체가 단량체 보다 ApoA-I를 보다 근접하게 모방하는 것으로 나중에 밝혀졌으며; 이러한 결과를 근거로 하여, 나선 절단기 (Gly 또는 Pro)에 의해 중심부에서 중단된 44량체가 ApoA-I에서 최소한의 기능적 도메인을 나타내었다고 제안되었다 [Nakagawa와 공동연구자들, 1985,상기 참조].

또 다른 연구는 "LAP 펩티드"로 불리우는 모델 양친매성 펩티드를 수반하였다 [참조: Pownall과 공동연구자들, 1980, PNAS USA 77 (6):3154-3158; Sparrow와 공동연구자들, 1981, In: Peptides: Synthesis-Structure-Function, Roch and Gross, Eds., Pierce Chem. Co., Rockford, IL, 253-256]. 본래의 아포지단백질의 단편을 이용한 지질 결합성 연구를 기준으로 하여, 몇 가지 LAP 펩티드, 즉 LAP-16, LAP-20 및 LAP-24 (각각 16, 20 및 24개 아미노산 잔기를 함유함)를 고안하였다. 이들 모델 양친매성 펩티드는 아포지단백질과 서열 상동성을 전혀 공유하지 않았으며, 아포지단백질과 회합된 부류 A-유형 양친매성 나선형 도메인과는 다른 방식으로 조직된 친수성 면을 갖도록 고안되었다 [참조: Segrest와 공동연구자들, 1992, J. Lipid Res. 33: 141-166]. 이들 연구로부터, 상기 저자는 모델 양친매성 펩티드에게 지질-결합성 특성을 부여하기 위해서는, 최소 20개 잔기 길이가 필요하다고 결론지었다.

서열 내의 상이한 위치에 프롤린 잔기를 함유하는 LAP20의 돌연변이체를 이용한 연구 결과는, 지질 결합과 LCAT 활성화간에는 직접적인 관계가 존재하지만, 펩티드 단독의 나선형 전위는 LCAT 활성화를 유발시키지 못한다는 것을 지시해주었다 [참조: Ponsin와 공동연구자들, 1986, J. Biol. Chem. 261(20): 9202-9205]. 더욱이, 펩티드의 중앙에 근접한 상기 나선 절단기 (Pro)의 존재가, 인지질 표면에 대한 친화성을 저하시킬 뿐만 아니라 LCAT를 활성화시키는 능력도 저하시켰다. 특정의 LAP 펩티드가 인지질과 결합하는 것으로 밝혀지긴 하였지만 [Sparrow와 공동연구자들, 상기 참조], LAP 펩티드가 지질의 존재하에 나선형인 정도에 관해서는 논쟁의 여지가 있다 [참조: Buchko와 공동연구자들, 1996, J. Biol. Chem. 271(6): 3039-3045; Zhong과 공동연구자들, 1994, Peptide Research 7(2): 99- 106].

세그레스트 (Segrest) 등 공동연구자들은, ApoA-I의 나선과의 서열 상동성을 전혀 공유하지 않는 18 내지 24개 아미노산 잔기로 구성된 펩티드를 합성하였다 [참조: Kannelis와 공동연구자들, 1980, J. Biol. Chem. 255 (3): 11464-11472; Segrest 와 공동연구자들, 1983, J.Biol. Chem. 258: 2290-2295]. 이들 서열은 소수성 모멘트 [참조: Eisenberg와 공동연구자들, 1982, Nature 299: 371-374] 및 전하 분포도 [참조: Segrest와 공동연구자들, 1990, Proteins 8: 103-117; 미국 특허 제4,643,988호] 측면에서 부류 A 교환 가능한 아포지단백질의 양친매성 나선형 도메인을 모방하도록 특수하게 고안되었다. 하나의 18-잔기 펩티드인 "18A" 펩티드가 모델 부류-A α-나선이 되도록 고안되었다 [Segrest와 공동연구자들, 1990, 상기 참조]. 이들 펩티드, 및 "18R" 펩티드와 같이,역 전하 분포를 지닌 기타 펩티드를 이용한 연구 결과는, 전하 분포가 활성에 있어 결정적이란 사실을 일관되게 제시해 주었으며; 역 전하 분포를 지닌 펩티드가 18A 부류-A 모방체에 비해 저하된 지질 친화성을 나타내고 지질의 존재 하에서 보다 낮은 나선 함량을 나타낸다 [참조: Kanellis와 공동연구자들, 1980, J. Biol. Chem: 255: 11464-11472; Anantharamaiah와 공동연구자들, 1985, J. Biol. Chem. 260: 10248-10255; Chung과 공동연구자들, 1985, J. Biol. Chem. 260: 10256-10262; Epand와 공동연구자들, 1987, J. Biol. Chem. 262: 9389-9396; Anantharamaiah와 공동연구자들, 1991, Adv. Exp. Med. Biol. 285: 131-140].

사람 ApoA-I의 나선 서열을 기준으로 하여 22개 아미노산 잔기를 함유하는 " 컨센서스(consensus)" 펩티드가 또한 고안되었다 [참조: Anantharamaiah와 공동연구자들, 1990, Arteriosclerosis 10(1): 95-105; Venkatachalapathi와 공동연구자들, 1991, Mol. Conformation and Biol. Interactions, Indian Acad. Sci. B: 585-596]. 이 서열은 사람 ApoA-I의 가정된 나선 각 위치에서 가장 우세한 잔기를 식별함으로써 작성되었다. 상기 언급된 펩티드와 마찬가지로, 상기 펩티드에 의해 형성된 나선은 친수성-소수성 계면에 군집된 양 전하를 띤 아미노산 잔기, 친수성 면의 중앙에 군집된 음 전하를 띤 아미노산 잔기, 및 180°미만의 소수성 각을 갖는다. 이러한 펩티드의 이량체가 LCAT를 활성화시키는데 있어서 다소 유효하긴 하지만, 단량체는 불량한 지질 결합 특성을 나타내었다 [Venkatachalapathi와 공동연구자들, 1991, 상기 참조].

상기 언급된 펩티드를 이용한 시험관내 연구를 주로 근거로 하여, ApoA-I의 기능을 모방하는 펩티드를 고안하는데 있어 일종의 "법칙"이 생겨났다. 중요하게는, 친수성-소수성 계면에 군집된 양 전하를 띤 아미노산 잔기와, 친수성 면의 중앙에 군집된 음 전하를 띤 아미노산 잔기를 갖는 양친매성 α-나선이 지질 친화성과 LCAT 활성화에 요구되는 것으로 여겨진다[Venkatachalapathi와 공동연구자들, 1991, 상기 참조]. Anantharamaiah와 공동연구자들은 또한, α-나선의 소수성 면 내에 위치한, 컨센서스 22량체 펩티드의 위치 13에서의 음 전하를 띤 Glu 잔기가 LCAT 활성화에 있어 중요한 역할을 한다고 언급하였다[Anantharamaiah와 공동연구자들, 1991, 상기 참조]. 더욱이, Brasseur은 180° 미만의 소수성 각 (pho angle)이, 최적의 지질-아포지단백질 복합체 안정성을 위해 요구되고, 또한 지질 이층 가장자리 주변에 펩티드를 갖는 원반형 입자가 형성되는 것의 원인이 되기도 한다고 언급하였다 [참조: Brasseur, 1991, J. Biol. Chem. 66 (24): 16120-16127]. Rosseneu 등 공동연구자들은 또한, 180° 미만의 소수성 각이 LCAT 활성화에도 요구된다고 보고하였다 (WO 93/25581).

그러나, ApoA-I 효능제를 고안하기 위한 "법칙"을 설명하는데 있어서의 진전 사항에도 불구하고, 현재 가장 우수한 ApoA-I 효능제는 본래 ApoA-I 활성의 40% 미만을 보유하고 있는 것으로 보고되었다. 당해 분야의 문헌에 보고된 펩티드 효능제 중의 어떠한 것도 약물로서 유용한 것으로 입증된 것은 없었다. 따라서, ApoA-I의 활성을 모방하고 생산하기가 비교적 간단하며 비용 면에서 효과적인 안정한 분자를 개발할 필요가 있다. 바람직하게는, 후보 분자가 간접 및 직접 RCT 둘 다를 매개하는 것이다. 이러한 분자는 기존의 펩티드 효능제 보다 작고, 보다 광범위한 기능적 스펙트럼을 지닐 것이다. 그러나, 효능있는 RCT 매개제를 고안하기 위한 "법칙"은 충분히 밝혀지지 않았으며, ApoA-I의 기능을 갖는 유기 분자를 고안하기 위한 원리 역시 공지되어 있지 않다.

발명의 요약

하기 구조를 포함하는 역 콜레스테롤 수송 매개제가 개시되어 있다.

여기에서, A, B, 및 C는 임의의 순서일 수 있으며

A는 산성 아미노산 또는 그의 바이오이소스테레(bioisostere)를 함유하고,

B는 방향족 또는 친지질성 아미노산 또는 그의 유사체를 함유하고, 그리고

C는 염기성 아미노산과 그의 바이오이소스테레를 함유하며,

A 또는 C중의 적어도 하나는 그의 바이오이소스테레를 함유한다.

한 양태에서, A 또는 C중의 하나만 바이오이소스테레를 함유한다. 알파 아미노 또는 알파 카르복시기는 미유도화된 아미노 또는 카르복시 말단 아미노산으로부터 제거될 수 있다.

다른 양태에서, 존재한다면, 아미노 말단으로부터 알파 아미노기는 포르밀, 아세틸, 페닐아세틸, 벤조일, 피볼릴, 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐, 2-나프틸산, 니코틴산, CH₃-(CH₂)_n-CO-[여기서, n은 1 내지 20이다], 디-t-부틸-4-히록시-페닐, 나프틸, 치환된 나프틸, Fmoc, 비페닐, 치환된 페닐, 치환된 헤테로사이클, 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 사이클로알킬, 융합 사이클로알킬, 포화 헤테로아릴, 및 치환된 포화 헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택된 보호기로 캡핑될 수 있다.

다른 양태에서, 존재한다면, 카르복시 말단으로부터 알파 카르복시기는 아민, 예컨대, RNH2 (여기서 R은 H, 디-t-부틸-4-히드록시-페닐, 나프틸, 치환된 나프틸, Fmoc, 비페닐, 치환된 페닐, 치환된 헤테로사이클, 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 사이클로알킬, 융합 사이클로알킬, 포화 헤테로아릴, 및 치환된 포화 헤테로아릴이다)로 구성된 군에서 선택된 보호기로 캡핑될 수 있다.

산성 기의 바이오이소스테레는 하기로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다:

염기성 기의 바이오이소스테레는 하기로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다:

A의 바이오이소스테레는 하기로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다:

C의 바이오이소스테레는 하기로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다:

본 매개제는 하기로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다:

바람직한 양태에서, 본 매개제는 BenOMe-bip-아닐린, 4-((R)-1-(4-(디메틸아미노)페닐카르바모일)-2- 페닐에틸카르바모일)부탄산, 4-((R)-1-(4-(디메틸아미노)페닐카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)-3,3-디메틸부탄산, 4-((R)-1-(4-(디메틸아미노)페닐카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)-3,3-(펜타메틸렌)부탄산, 4-((S)-1-(4-구아니디노페닐카르바모일)-2-(비페닐)에틸카르바모일)벤조산, 3-((R)-1-(4-(디메틸아미노)벤질카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)프로판산, 4-((R)-1-(4-(디메틸아미노)벤질카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)부탄산, 그리고 4-((R)-1-(4-(디메틸아미노)벤질카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)-3,3-디메틸부탄산으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.

다른 바람직한 양태에서 본 매개제는 4-((R)-1-(4-(디메틸아미노)페닐카르바 모일)-2-페닐에틸카르바모일)부탄산 또는 4-((R)-1-(4-(디메틸아미노)페닐카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)-3,3-디메틸부탄산로부터 선택될 수 있다.

바람직한 양태의 상세한 설명

바람직한 양태에서 RCT 매개제는 ApoA-I 기능과 활성을 모방한다. 광범위한 측면에서, 이러한 매개제는 3가지 영역, 즉 산성 영역, 친지질성 (예: 방향족) 영역 및 염기성 영역을 포함하는 분자이다. 이들 분자는 바람직하게는, 양전하를 띤 영역, 음전하를 띤 영역 및 전하를 띠지 않는 친지질성 영역을 함유한다. 서로에 대한 이들 영역의 위치는 분자들 간에 다양할 수 있으므로, 따라서 바람직한 양태에서는, 상기 분자가 각 분자 내의 3가지 영역의 상대적 위치에 상관없이 RCT를 매개한다. 반면, 일부 바람직한 양태에서는, 분자 주형(template) 또는 모델이, RCT의 매개제를 형성하기 위해 어떠한 순서로든 연결되어 있는, "산성" 아미노산-유도된 잔기, 친지질성 부분, 및 염기성 아미노산-유도된 잔기를 포함하고, 다른 바람직한 양태에서는, 분자 모델이 산성, 친지질성 및 염기성 영역을 갖는 단일 잔기, 예를 들면, 아미노산인 페닐알라닌에 의해 구현될 수 있다.

일부 바람직한 양태에서, RCT 분자 매개제는 직접적 및/또는 간접적 RCT 경로를 증강시켜 혈청 콜레스테롤 수준을 저하시키는(즉, 콜레스테롤 유출을 증가시킴) 공통점, LCAT를 활성화시킬 수 있는 능력 그리고 혈청 HDL 농도를 증가시킬 수 있는 능력을 공유하고 있다.

역 콜레스테롤 수송 매개제는 바람직하게는 염기성 기, 산성 기 및 친지질성 기를 함유하는 3개 이하의 아미노산 잔기, 그의 바이오이소스테레 또는 임의의 비 펩티드 화합물을 가진다. 서열은 X1-X2-X3, X1-X2-Y3, Y1-X2-X3 또는 Y1-X2-Y3(X1는 산성 아미노산 또는 그의 바이오이소스테레이고, X2는 방향족 또는 친지질성 아미노산 또는 그의 유사체이며, X3는 염기성 아미노산 또는 그의 바이오이소스테레이며, Y1은 알파 아미노기를 가지지 않은 아미노산 잔기 또는 그의 바이오이소스테레이고 그리고 Y3는 알파 카르복시기를 가지지 않는 염기성 아미노산 또는 그의 바이오이소스테레이다)을 함유할 수 있다. 아미노 또는 카르복시 말단기중의 적어도 하나는 산성 또는 염기성 아미노산의 바이오이소스테레를 함유한다. 아미노 말단에 알파 아미노기가 존재할 경우 제1보호기를 함유할 수 있으며, 카르복시 말단에 알파 카르복시기가 존재할 경우 제2보호기를 함유할 수 있다. 제1 및 제2보호기는 독립적으로 포르밀, 아세틸, 페닐아세틸, 벤질, 피볼릴, 2-나프틸산, 니코틴산, CH₃-(CH₂)n-CO- [여기서, n은 1 내지 20이다], 그리고 아세틸, 페닐아세틸, 디-t-부틸-4-히드록시-페닐, 나프틸, 치환된 나프틸, Fmoc, 비페닐, 치환된 페닐, 치환된 헤테로사이클, 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 사이클로알킬, 융합 사이클로알킬, 포화 헤테로아릴, 치환된 포화 헤테로아릴의 아미드 등으로 이루어진 군으로부터 선택된다. C 말단은 아민, 예를 들면, RNH₂ (여기서, R은 H, 디-t-부틸-4-히드록시-페닐, 나프틸, 치환된 나프틸, Fmoc, 비페닐, 치환된 페닐, 치환된 헤테로사이클, 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 사이클로알킬, 융합 사이클로알킬, 포화 헤테로아릴, 치환된 포화 헤테로아릴 등이다)로 구성된 군에서 선택된다. 서열은 분자 모델의 기본적인 기능을 보유하는 화합물을 제공하도록 하는 어떤 모 든 가능한 방법으로 조합될 수 있다.

다른 양태에서, 매개제는 약 1 내지 10개 아미노산의 펩티드와 같은 큰 실체 혹은 분자에 삽입될 수 있다.

여기에서 사용된 것과 같은 "바이오이소스테레(bioisostere)", "바이오이소스테레 치환(bioisostere replacement)", "바이오이소스테이즘(bioisostereism)" 용어 및 이와 밀접하게 관련된 용어는 당 분야에 통상적으로 인식되는 동일한 의미를 가지고 있다. 바이오이소스테레는 외곽 전자층이 실질적으로 동일하다고 간주되는 원자, 이온, 또는 분자이다. 바이오이소스테란 용어는 전체 분자 그 자체에 반대되는 전체 분자의 일부를 의미하는데 사용된다. 바이오이소스테레 치환은 첫번째 바이오이소스테레의 생화학적인 활성을 유지하거나 약간 변형시키는 예측에 의해 하나의 바이오이소스테레를 다른 것으로 대체하는 것을 포함한다. 이 경우에는 바이오이소스테레는 따라서 유사한 크기, 형태, 및 전자밀도를 가지고 있는 원자 또는 원자의 기이다. 바이오이소스테이즘은 제안된 바이오이소스테레 치환이 유사한 생화학적 성질을 유지할 것이라는 합리적인 예측으로부터 나타난 것이다. 그러한 합리적인 예측은 구조적인 유사성만을 기초로 한 것일 수 있다. 이것은 특히 바이오이소스테레가 결합되거나 일부 경우에 상기 바이오이소스테레에 작용하는 수용체의 특징적인 영역에 관해 알려진 경우에 사실이다.

카르복실산과 구아니딘기를 위한 바이오이소스테레의 예는 다음과 같다:

여기에서 사용된 용어 "아미노산"은 또한 일반식 NH₂-CHR-COOH(R은 다수의 상이한 측쇄중의 하나이다)의 분자 또는 모 아미노산을 함유하는 펩티드내 잔기를 지칭한다. "R"은 20개의 유전적으로 암호화된 아미노산중의 하나인 것을 지칭하는 치환기일 수 있다. "R"은 또한 20개의 유전적으로 암호화된 아미노산이 아닌 치환기가 될 수 있다. 여기에서 사용된, "아미노산 잔기"는 다른 아미노산과 연결될 때 물 분자를 잃어버린 후 남아 있는 아미노산의 부분을 말한다. 여기 에서 사용된, "아미노산 유사체"는 하나의 요소에 의해 종종 아미노산 모화합물과 차이가 있는 구조적 유사체를 말한다. "개질된 아미노산"이란 용어는 20개의 유전적으로 암호화된 아미노산중의 하나에 상응하지 않는 "R" 치환기를 갖는 아미노산을 말한다

아미노산 말단 및 카르복시 말단의 보호기는 독립적으로 포르밀, 아세틸, 페닐아세틸, 피볼릴, 2-나프틸산, 니코틴산, CH₃-(CH₂)n-CO-[여기서, n은 1 내지 20이다], 그리고 아세틸, 페닐아세틸, 디-t-부틸-4-히드록시-페닐, 나프틸, 치환된 나프틸, Fmoc, 비페닐, 치환된 페닐, 치환된 헤테로사이클, 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 사이클로알킬, 융합 사이클로알킬, 포화 헤테로아릴, 치환된 포화 헤테로아릴의 아미드 등으로 이루어진 군에서 선택된다. C말단은 아민, 예컨대, RNH2 (여기서 R은 H, 디-t-부틸-4-히드록시-페닐, 나프틸, 치환된 나프틸, Fmoc, 비페닐, 치환된 페닐, 치환된 헤테로사이클, 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 사이클로알킬, 융합 사이클로알킬, 포화 헤테로아릴, 및 치환된 포화 헤테로아릴 등이다)로 캡핑될 수 있다.

특정 화합물이 토우토머 형태로 존재할 수 있다. 거울상 이성질체와 입체 이성질체를 함유하는 모든 그러한 이성질체는 본 양태에 포함된다. 특정 화합물이 토우토머 형태 또는 그의 혼합물로 존재하는 것으로 가정된다.

특정 화합물은 다량체성 형태(polymorphic forms)로 존재할 수 있다. 다량체성 형태는 적어도 두개의 뚜렷한 형태로 화합물을 결정화시킴으로써 얻어진다. 그러한 다량체성 형태 모두는 본 양태에 포함된다. 특정 화합물은 특정의 다량체성형태 혹은 그의 혼합물로 존재하는 것으로 가정된다.

RCT 매개

현재, ApoA-I 효능제(Agonist)를 고안하고자 하는 노력들은 22-량체 단위 구조, 예를 들면, 지질의 존재 하에 양친매성 α-나선을 형성할 수 있는 "컨센서스 22-량체(consensus 22-mer)" [참조: Anantharamaiah와 공동연구자들, 1990, Arteriosclerosis 10(1):95-105; Venkatachalapathi와 공동연구자들, 1991, Mol. Conformation and Biol. Interactions, Indian Acad. Sci. B: 585-596]에 중점을 두었다 [참조, 미국 특허 제6,376,464호는 컨센서스 22-량체의 변형으로부터 유도된 펩티드 모방체에 관한 것이다]. 비교적 짧은 펩티드를 사용할 경우에는 보다 긴 22-량체를 사용한 경우와 비교해서 몇 가지 이점이 있다. 예를 들어, 보다 짧은 RCT 매개제는 제조하기가 보다 용이하고 비용이 덜 들며, 화학적 및 입체 형태적으로 보다 안정하며, 바람직한 입체 형태가 비교적 강건하게 유지되고, 펩티드 쇄 내에서 세포내 상호 작용이 거의 없거나 전혀 없으며, 보다 짧은 펩티드는 경구 이용 효율이 보다 높다. 보다 짧은 이들 펩티드의 다중 복사물은 HDL 또는 LDL과 결합할 수도 있어, 보다 제한된 큰 펩티드의 동일한 효과를 가져다 준다. ApoA-I 다기능성이 이의 다중 α-나선형 도메인에 기인된 것일 수 있긴 하지만, 심지어 ApoA-I의 단일 기능, 예를 들면, LCAT 활성화 조차도, α-나선형 도메인 중의 하나 이상에 의해 반복적 방식으로 매개될 수도 있다. 따라서, 양태의 바람직한 국면에서는, ApoA-I의 다중 기능이, 단일 서브-도메인에 관해 언급된 RCT의 매개제에 의해 모방될 수 있다.

ApoA-I의 3가지 기능적 특징이 ApoA-I 효능제 고안에 대한 중요한 기준으로서 널리 허용되고 있다: (1) 인지질과 회합할 수 있는 능력; (2) LCAT를 활성화시킬 수 있는 능력; 및 (3) 세포로부터의 콜레스테롤 유출을 증진시킬 수 있는 능력. 바람직한 양태의 일부 모델에 따른 RCT의 분자 매개제는 마지막 기능적 특징, 즉 RCT를 증가시킬 수 있는 능력만을 나타낼 수도 있다. 그러나, 종종 간과되기도 하는 ApoA-I의 꽤 많은 다른 특성들이 ApoA-I를 치료적 개재를 위해 특히 매력있는 표적물로 만든다. 예를 들어, ApoA-I은 콜레스테롤이 수용체-매개된 과정을 통하여 간 내로 유출되도록 지시하고, PLTP 구동된 반응을 통하여 프레-β-HDL (말초 조직으로부터 콜레스테롤의 일차 수용체) 생성을 매개한다. 그러나, 이러한 특징들은 ApoA-I 모방 분자의 잠재적 유용성을 확대시켜 준다. 이와 같이, ApoA-I 모방 기능을 바라보는 전적으로 새로운 접근법은 본원에 기재된 펩티드 또는 아미노산-유도된 소분자를 사용할 수 있게 하여, 직접적인 RCT (HDL 경로를 통함) 뿐만 아니라 간접적인 RCT (즉, 간으로의 유출을 다시 지시함으로써, LDLs가 순환되지 못하게 방해하기 위함)을 촉진시킬 것이다. 간접적 RCT를 증강시킬 수 있도록 하기 위해, 바람직한 양태의 분자 매개제는 바람직하게는, 인지질과 회합하고, 간과 결합할 수 있을 것이다 (즉, 간 지단백질 결합성 부위에 대한 리간드로서 작용하기 위함).

따라서, 바람직한 양태를 선도하는 연구 조사의 목표는 우선적인 지질 결합성 입체 형태를 나타내고, 직접적 및/또는 간접적 역콜레스테롤 수송을 촉진시킴으 로써 간으로의 콜레스테롤 유출을 증가시키며, 혈장 지단백질 구배를 개선시키고, 그 결과로서 아테롬성 동맥경화증 병변의 진행을 후속 방지시키고/시키거나 이러한 병변의 퇴행을 증진시키는, 안정한 소분자 RCT 매개제를 확인, 고안 및 합성하는 것이었다.

바람직한 양태의 RCT의 매개제는 안정한 벌크 또는 단위 투여 형태, 예를 들면, 동결건조된 생성물로 제조할 수 있는데, 이는 생체 내에서 사용하기 전에 재구성하거나 또는 다시 제형화할 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에는 고지질혈증, 고콜레스테롤혈증, 관상 심장 질환, 아테롬성 동맥경화증, 당뇨병, 비만, 알쯔하이머 질환, 다발성 경화증, 감염과 같은 고지질혈증과 관련된 증상, 및 기타 질환, 예를 들면, 패혈성 쇽을 유발시키는 내독소혈증을 치료하는데 있어서의 약제학적 제형, 및 상기 제제의 용도가 포함된다.

바람직한 양태의 RCT의 매개제가 혈장의 HDL 및 LDL 성분과 회합하고, HDL 및 프레-β-HDL 입자의 농도를 증가시켜 줄 수 있으며, LDL의 혈장 수준을 저하시킨다는 것을 입증해 주는 작동 실시예에 의해 예시되었다. 따라서, 직접적 및 간접적 RCT가 증진된다. RCT의 매개제는 사람 간세포 (HepG2 세포)에서 사람 LDL 매개된 콜레스테롤 축적을 증가시켜준다. RCT의 매개제는 또한, PLTP를 활성화시키는데 효율적이므로, 프레-β-HDL 입자의 형성을 증진시켜 준다. HDL 콜레스테롤의 증가는, RCT에서의 LCAT 연루성 (LCAT 활성화가 직접적으로 (시험관내에서) 제시되지는 않았다)의 간접적 증거로서 제공되었다. 동물 모델의 생체 내에서 바람직한 양태의 RCT 매개제를 사용하면, 혈청 HDL 농도가 증가한다.

바람직한 양태들은 RCT 매개제의 구조내에 사용될 수 있는 바이오이소스테레 그리고 그의 보호된 버전, 하프 디누디드 버전 및 디누디드 버전을 포함하는 RCT의 매개제의 조성과 구조; 구조적 및 기능적 특성 확인; 벌크 및 단위 투여 제형의 제조 방법; 및 사용 방법에 관해 서술된, 하기 세부 항목에서 보다 상세히 제시된다.

구조와 기능

바람직한 양태에서 RCT의 매개제는 일반적으로 ApoA-I의 활성을 모방하는 펩티드 또는 이의 유사체이다. 일부 양태에서는, 펩티드 내의 하나 이상의 아미드 결합을 치환된 아미드, 아미드의 이소스테레, 또는 아미드 모방체로 대체된다. 부가적으로, 하나 이상의 아미드 결합을, 펩티드의 구조 또는 활성을 실질적으로 방해하지 않는 펩티드 모방 또는 아미드 모방 부분으로 대체시킬 수 있다. 적합한 아미드 모방 부분은, 예를 들어, 문헌 [참조: Olson과 공동연구자들, 1993, J. Med. Chem. 36: 3039-3049]에 기재되어 있다.

본원에 사용된 바와 같은, 유전적으로 암호화된 L-에난티오머성 아미노산에 대한 약어는 통상적이며 다음과 같다. D-아미노산은 소문자로 명명되는데, 예를 들면, D-알라닌 = a 등이다:

아미노산	1 문자 약호	통상 약호
알라닌	A	Ala
아르기닌	R	Arg
아스파라긴	N	Asn
아스파라트산	D	Asp
시스테인	C	Cys
글루타민	Q	Gln
글루탐산	E	Glu
글리신	G	Gly
히스티딘	H	His
이소루이신	I	Ile
루이신	L	Leu
라이신	K	Lys
페닐알라닌	F	Phe
프롤린	P	Pro
세린	S	Ser
트레오닌	T	Thr
트립토판	W	Trp
타이로신	Y	Tyr
발린	V	Val

RCT의 펩티드 매개제 중의 특정의 아미노산 잔기는, 이러한 펩티드의 활성에 상당히 불리한 영향을 미치지 않으면서, 많은 경우에는 심지어 이러한 활성을 증강시키면서 기타 아미노산 잔기로 대체시킬 수 있다. 따라서, 해당 구조 내의 하나 이상의 규정된 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기 또는 유도체 및/또는 이의 유사체로 치환시킨, RCT의 펩티드 매개제의 변형 또는 돌연변이된 형태가 또한 바람직한 양태로 고려된다. 바람직한 양태에서는 이러한 아미노산 치환이 보존적이라는 것, 즉 대체하는 아미노산 잔기가 대체되는 아미노산 잔기와 유사한 물리적 및 화학적 특성을 지니고 있다는 것을 인지해야 할 것이다.

보존적 아미노산 치환을 결정하기 위해서는, 아미노산을 주로 아미노산 측쇄의 물리적-화학적 특징에 따라서 2가지 주요 카테고리, 즉 친수성 및 소수성으로 분류하는 것이 편리할 수 있다. 이들 2가지 주요 카테고리는 아미노산 측쇄의 특징을 보다 명료하게 규정시켜 주는 서브-카테고리로 더욱더 분류될 수 있다. 예를 들어, 친수성 아미노산 부류는 산성, 염기성 및 극성 아미노산으로 추가로 재분류될 수 있다. 소수성 아미노산 부류는 비극성 및 방향족 아미노산으로 추가로 재분류될 수 있다. ApoA-I을 규정하는 아미노산의 각종 카테고리의 정의는 다음과 같다:

용어 "친수성 아미노산"은 문헌 [Eisenberg와 공동연구자들, 1984, J. Mol. Biol. 179: 125-142]의 규정화된 컨센서스 소수성 등급에 따라서 0 미만의 소수성을 나타내는 아미노산을 지칭한다. 유전적으로 암호화된 친수성 아미노산에는 Thr (T), Ser (S), His (H), Glu (E), Asn (N), Gln (Q), Asp (D), Lys(K) 및 Arg (R)이 포함된다.

용어 "소수성 아미노산"은 문헌 [참조: Eisenberg, 1984, J. Mol. Biol. 179: 125-142]의 규정화된 컨센서스 소수성 등급에 따라서 0 초과의 소수성을 나타내는 아미노산을 지칭한다. 유전적으로 암호화된 소수성 아미노산에는 Pro (P), Ile (I), Phe (F), Val(V), Leu (L), Trp (W), Met (M), Ala (A), Gly (G) 및 Tyr (Y)가 포함된다.

용어 "산성 아미노산"은 측쇄 pK 값이 7 미만인 친수성 아미노산을 지칭한다. 산성 아미노산은 전형적으로, 수소 이온의 상실로 인해 생리적 pH에서 음전하를 띤 측쇄를 갖는다. 유전적으로 암호화된 산성 아미노산에는 Glu (E) 및 Asp(D)가 포함된다.

용어 "염기성 아미노산"은 측쇄 pK 값이 7 초과인 친수성 아미노산을 지칭한다. 염기성 아미노산은 전형적으로, 하이드로늄 이온과의 회합으로 인해 생리적 pH에서 양전하를 띤 측쇄를 갖는다. 유전적으로 암호화된 염기성 아미노산에는 His (H), Arg (R) 및 Lys (K)가 포함된다.

용어 "극성 아미노산"은 생리적 pH에서는 전하를 띠지 않지만, 2개 원자에 의해 공통으로 공유된 전자 쌍이 이들 원자 중의 하나에 의해 보다 밀접하게 유지되는 하나 이상의 결합을 갖는 측쇄를 지닌 친수성 아미노산을 지칭한다. 유전적으로 암호화된 극성 아미노산에는 Asn (N), Gin (Q), Ser (S) 및 Thr (T)가 포함된다.

용어 "비극성 아미노산"은 생리적 pH에서 전하를 띠지 않고, 2개 원자에 의해 공통으로 공유된 전자 쌍이 2개 원자 각각에 의해 일반적으로 동등하게 유지되는 결합을 갖는 측쇄를 지닌 소수성 아미노산을 지칭한다 (즉, 상기 측쇄는 극성이 아니다). 유전적으로 암호화된 비극성 아미노산에는 Leu (L), Val (V), Ile (I), Met (M), Gly (G) 및 Ala (A)가 포함된다.

용어 "방향족 아미노산"은 하나 이상의 방향족 또는 헤테로방향족 환을 갖는 측쇄를 수반한 소수성 아미노산을 지칭한다. 방향족 또는 헤테로방향족 환은 -OH, -SH, -CN, -F, -Cl, -Br, -I, -NO₂, -NO, -NH₂, -NHR, -NRR, -C(O)R, -C(O)OH, -C(O)OR, -C(O)NH₂, -C(O)NHR, -C(O)NRR 등과 같은 하나 이상의 치환체를 함유할 수 있고, 여기서 각 R은 독립적으로, (C_l-C₆)알킬, 치환된 (C_l-C₆)알킬, (C_l-C₆)알케닐, 치환된 (C_l-C₆)알케닐, (C_l-C₆)알키닐, 치환된 (C_l-C₆)알키닐, (C₅-C₂₀)아릴, 치환된 (C₅-C₂₀) 아릴, (C₆-C₂₆) 알카릴, 치환된 (C₆-C₂₆) 알카릴, 5 내지 20원의 헤테로아릴, 치환된 5 내지 20원의 헤테로아릴, 6 내지 26원의 알크헤테로아릴 또는 치환된 6 내지 26원의 알크헤테로아릴이다. 유전적으로 암호화된 방향족 아미노산에는 Phe (F), Tyr (Y) 및 Trp (W)가 포함된다.

용어 "지방족 아미노산"은 지방족 탄화수소 측쇄를 갖는 소수성 아미노산을 지칭한다. 유전적으로 암호화된 지방족 아미노산에는 Ala (A), Val (V), Leu (L) 및 Ile (I)가 포함된다.

아미노산 잔기 Cys (C)는 다른 Cys (C) 잔기 또는 다른 설파닐-함유 아미노산과 디설파이드 브릿지를 형성할 수 있다는 점에서 특이하다. 환원된 유리 -SH 또는 산화된 디설파이드-브릿지 형태로 펩티드 내에 존재할 수 있는 Cys (C) 잔기 (및 -SH 함유 측쇄를 수반한 다른 아미노산)의 능력은, Cys (C) 잔기가 특정 펩티드에 알짜 소수성 형질을 부여하는지 알짜친수성 형질을 부여하는지에 대해 영향을 미친다. Cys (C)가 문헌 [Eisenberg, 1984, 상기 참조]의 규정화된 컨센서스 등급에 따라서 0.29의 소수성을 나타내긴 하지만, 바람직한 양태의 목적상 Cys (C)는 상기 규정된 일반적인 분류법에도 불구하고, 극성 친수성 아미노산으로서 분류된다는 것을 인지해야 한다.

당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 상기 규정된 카테고리는 상호 배타적이지 않다. 따라서, 2가지 이상의 물리-화학적 특성을 나타내는 측쇄를 갖는 아미노산은 다중 카테고리에 포함될 수 있다. 예를 들어, 극성 치환체, 예를 들면, Tyr (Y)에 의해 추가로 치환되는 방향족 잔기를 갖는 아미노산 측쇄는 방향족 소수성 특성과, 극성 또는 친수성 특성 둘 다를 나타낼 수 있으므로, 방향족 카테고리와 극성 카테고리 둘 다에 포함될 수 있다. 모든 아미노산의 적당한 분류화는 특히 본원에 제공된 상세한 설명을 비추어 당업자에게 명백할 것이다.

상기 규정된 카테고리가 유전적으로 암호화된 아미노산 관점에서 예시되긴 하였지만, 아미노산 치환이 반드시 이러한 유전적으로 암호화된 아미노산일 필요는 없고, 바람직한 특정 양태에서는 상기 유전적으로 암호화된 아미노산으로만 제한되지 않는다. 실제로, RCT의 바람직한 펩티드 매개제의 상당 수가 유전적으로 암호화되지 않은 아미노산을 함유한다. 따라서, 천연의 유전적으로 암호화된 아미노산 이외에도, RCT의 펩티드 매개제 내의 아미노산 잔기는 천연의 암호화되지 않은 아미노산 및 합성 아미노산으로 치환시킬 수 있다.

RCT의 펩티드 매개제에 대해 유용한 치환을 제공해 주는, 흔히 직면하는 특정의 아미노산에는 β-알라닌 (β-Ala) 및 기타 오메가-아미노산, 예를 들면, 3-아미노프로피온산, 2,3-디아미노프로피온산(Dpr), 4-아미노부티르산 등; α-아미노이소부티르산(Aib); ε-아미노헥사노산(Aha); δ-아미노발레르산(Ava); N-메틸글리신 또는 사르코신(MeGly); 오르니틴(Orn); 시트룰린(Cit); t-부틸알라닌(t-BuA); t-부틸글리신(t-BuG); N-메틸이소루이신(MeIle); 페닐글리신(Phg); 사이클로헥실알라닌 (Cha); 노르루이신(NIe); 나프틸알라닌(Nal); 4-페닐페닐알라닌, 4-클로로페닐알라닌(Phe(4-Cl)); 2-플루오로페닐알라닌(Phe(2-F)); 3-플루오로페닐알라닌(Phe(3-F)); 4-플루오로페닐알라닌(Phe(4-F)); 페니실라민(Pen); 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-카르복실산(Tic); β-2-티에닐알라닌(Thi); 메티오닌 설폭사이드(MSO); 호모아르기닌(hArg); N-아세틸 라이신(AcLys); 2,4-디아미노부티르산(Dbu); 2,3-디아미노부티르산(Dab); p-아미노페닐알라닌(Phe(pNH₂)); N-메틸 발린(MeVal); 호모시스테인(hCys), 호모페닐알라닌(hPhe) 및 호모세린(hSer); 히드록시프롤린(Hyp), 호모프롤린(hPro), N-메틸화 아미노산 및 펩토이드 (N-치환된 글리신)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

본원에 구체적으로 언급되지 않은 다른 아미노산 잔기는 본원에 제공된 정의를 고려하여, 관찰된 물리적 및 화학적 특성을 근거로 하여 용이하게 분류할 수 있다.

상기 규정된 카테고리에 따라서 유전적으로 암호화된 아미노산과, 통상의 암호화되지 않은 아미노산으로 분류한 것이 다음 표 2에 요약되어 있다. 표 2는 단지 예시 목적이며, 본원에 기재된 RCT의 매개제를 치환시키기 위해 사용될 수있는 아미노산 잔기 및 유도체의 배타적 목록을 의미하지는 않는다.

보통 접하게 되는 아미노산의 종류
분류	유전적으로 암호화됨	유전적으로 암호화되지 않음
소수성
방향족	F,Y,W	Phg, Nal, Thi, Tic, Phe(4-Cl), Phe(2-F), Phe(3-F), Phe(4-F), hPhe
비극성	L,V,I,M,G,A,P	t-BuA, t-BuG, MeIle, Nle, MeVal, Cha, McGly,Aib
지방족	A,V,L,I	b-Ala, Dpr, Aib, Aha, MeGly, t-BuA, t-BuG, MeIle, Cha, Nle, MeVal
친수성
산성	D,E
염기성	H,K,R	Dpr, Orn, hArg, Phe(p-NH2), Dbu, Dab
극성	C,Q,N,S,T	Cit, AcLys, MSO, bAla, hSer
나선-파단	P,G	D-Pro 및 다른 D-아미노산(L-펩티드에서)

본원에 구체적으로 언급되지 않은 기타 아미노산 잔기는 본원에 제공된 정의를 고려하여, 관찰된 물리적 및 화학적 특성을 근거로 하여 용이하게 분류할 수 있다.

대부분의 경우에, RCT의 매개제의 아미노산이 D-에난티오머성 아미노산으로 치환될 것이긴 하지만, 이러한 치환이 D-에난티오머성 아미노산으로 제한되지 않는다. 따라서, "돌연변이"되거나 또는 "변형된" 형태의 정의에는, D-아미노산을 동일한 L-아미노산으로 대체시키거나 (예를 들면, D-Arg→L-Arg) 또는 동일한 카테고리 또는 서브카테고리의 L-아미노산으로 대체시킨 (예를 들면, D-Arg D-Lys) 상황 및 이와 반대의 상황이 포함된다. 상기 매개제는 유리하게는, 하나 이상의 D-에난티오머성 아미노산으로 구성될 수 있다. 이러한 D-아미노산을 함유하는 매개제는 L-아미노산으로만 배타적으로 구성된 분자 보다 구강, 소화관 또는 혈청내에서의 분해에 대해 보다 안정적인 것으로 여겨진다.

링커

RCT의 매개제는 헤드-대-테일 방식 (즉, N-말단 대 C-말단), 헤드-대-헤드 방식 (즉, N-말단 대 N-말단), 테일-대-테일 방식 (즉, C-말단 대 C-말단), 또는 이들의 조합 방식으로 접속 또는 연결시킬 수 있다. 링커는 2개의 펩티드를 서로 공유적으로 연결할 수 있는 모든 이작용기성 분자일 수 있다. 따라서, 적합한 링커는 작용기가 펩티드의 N- 및/또는 C-말단에 공유적으로 부착될 수 있는 이작용기성 분자이다. 펩티드의 N- 또는 C-말단에 부착시키기에 적합한 작용기는, 이러한 공유 결합 형성에 영향을 미치기에 적합한 화학분야로서 당해 분야에 널리 공지되어 있다.

충분한 길이와 가요성의 링커에는 Pro(P), Gly(G), Cys-Cys, Gly-Gly, H₂N-(CH₂)n-COOH [여기서, n은 1 내지 12, 바람직하게는 4 내지 6이다]; H₂N-아릴-COOH 및 탄수화물이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 그러나, 일부 양태에서, 그자체 분리된 링커가 전혀 사용되지 않는다. 대신 산성, 친지질성 및 염기성 부분이 단일 분자의 모든 부분이다.

한 양태에서, 3가지 독립적인 영역, 즉 산성 영역, 방향족 또는 친지질성 영역 및 염기성 영역을 갖는 아미노산-기재 조성물을 함유하는 분자가 있다. 서로에 대한 이들 영역의 위치는 분자 매개제들 간에 다양할 수 있으므로, 상기 분자는 각 분자 내의 3가지 영역의 상대적 위치에 상관없이 RCT를 매개한다. 삼량체 영역의 펩티드는 천연 D- 또는 L-아미노산, 아미노산 유사체 및 아미노산 유도체를 포함한다.

다른 바람직한 변형에서, 아미노산-기재 삼량체 구조를 함유하는 분자 매개제는 분자 매개제 RCT의 물리화학적 특성을 개선하고 신체내 지방 또는 친지질성 물질의 천연 또는 활성 수송(흡수)의 이점을 가지기위해 아미노 또는 카르복시 말단중 어느 한 말단에 친지질성기로 캡핑될 수 있다. 캡핑기는 D 또는 L 거울상 이성질체 혹은 비거울상 이성질체 분자 또는 기이다. 바람직한 양태에서, N-말단 캡핑기는 포르밀, 아세틸, 페닐아세틸, 디-t-부틸-4-히드록시-페닐, 나프틸, 치환된 나프틸, Fmoc, 비페닐, 치환된 페닐, 치환된 헤테로사이클, 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 사이클로알킬, 융합 사이클로알킬, 포화 헤테로아릴, 치환된 포화 헤테로아릴 등으로 이루어진 군으로부터 선택된다. C-말단은 바람직하게는 아민, 예를 들면, RNH₂ (R은 H, 디-t-부틸-4-히드록시-페닐, 나프틸, 치환된 나프틸, Fmoc, 비페닐, 치환된 페닐, 치환된 헤테로사이클, 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 사이클로알킬, 융합 사이클로알킬, 포화 헤테로아릴, 치환된 포화 헤테로아릴 등이다)로 캡핑된다.

RCT매개제의 구조내에 사용된 바이오이소스테레

바람직한 RCT 매개제내에 사용될 수 있는 바람직한 분자 바이오이소스테레의 예가 하기에 나타나있다. 구아니디늄 또는 아미디노기를 함유한 바이오이소스테레는 아르기닌과 같은 아미노산을 치환시킨다. 카르복실산을 함유한 바이오이소스테레는 글루타메이트와 같은 아미노산을 치환시킨다. 염기성 아미노산, 즉 아르기닌, 라이신, 혹은 히스타틴, 그리고 산성 아미노산, 즉 글루타메이트와 아스파라테이트를 치환시킬수 있는 다른 바이오이소스테레가 고려될 수 있다. 원은 비방향족과 방향족 구조를 포함하는 비고리 또는 고리 구조를 나타낸다.

바람직한 분자 바이오이소스테레 버전의 RCT 매개제는 하기에 나타나 있다:

바이오이소스테레 시리즈:

L-아미노산 서열 D-아미노산 서열

구조 및 기능 분석

상기 언급된 다량체성 형태를 포함한, 바람직한 양태의 RCT의 매개제의 구조와 기능을 검정하여, 활성 화합물을 선별할 수 있다. 예를 들어, 펩티드 또는 펩티드 유사체를 대상으로 하여, 지질과 결합할 수 있는 능력, 지질과 복합체를 형성할 수 있는 능력, LCAT를 활성화시킬 수 있는 능력, 및 콜레스테롤 유출을 증진시킬 수 있는 능력 등에 대해 검정할 수 있다.

펩티드의 구조 및/또는 기능을 분석하는 방법 및 검정은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 바람직한 방법이 아래의 작동 실시예에 제공되어 있다. 예를 들어, 하기에 기술된 핵자기 공명(NMR) 검정을 사용하여 펩티드 또는 펩티드 유사체의 구조를 분석할 수 있는데, 특히 지질의 존재 하에서의 나선도를 분석할 수 있다. 지질과 결합할 수 있는 능력은 아래에 기재된 형광 분광측정 검정을 이용하여 결정할 수 있다. LCAT를 활성화시킬 수 있는 펩티드 및/또는 펩티드 유사체의 능력은 아래에 기재된 LCAT 활성화 방법을 이용하여 용이하게 결정할 수 있다. 아래에 기재된 시험관내 및 생체내 검정을 사용하여 RCT에 대한 반감기, 분포도, 콜레스테롤 유출 및 효과를 평가할 수 있다.

한 가지 바람직한 양태에서는, 3가지 독립적인 영역, 즉 산성 영역, 방향족 또는 친지질성 영역, 및 염기성 영역을 갖는 아미노산-기재 조성물을 포함하는 분자가 존재한다. 서로에 대한 이들 영역의 상대적 위치는 분자 매개제들 간에 다양할 수 있으며, 이러한 분자는 각 분자 내의 3가지 영역의 위치에 상관없이 RCT를 매개한다.

다른 바람직한 양태에서는, 삼량체의 방향족 영역이 산성 또는 염기성 측쇄(들)를 수반한 니코틴산으로 이루어질 수 있다.

다른 바람직한 양태에서는, 삼량체의 방향족 영역이 4-페닐 페닐알라닌으로 이루어질 수 있다.

유전적으로 암호화된 아미노산의 D-에난티오머에 대해 사용된 약어는 표 1에 제시된 1-문자 부호의 소문자 등가물이다. 예를 들어, "R"은 L-아르기닌을 지칭하고 "r"은 D-아르기닌을 지칭한다. 달리 규정되지 않는 한 (예: "OH"), N-말단은 아세틸화시키고 C-말단은 아미드화시킨다. PhAc는 페닐아세틸화를 의미하고, BIP는 비페닐알라닌을 의미한다.

아미노산 치환이 반드시 유전적으로 암호화된 아미노산일 필요는 없고, 바람직한 특정 양태에서는 유전적으로 암호화된 아미노산으로만 제한되지 않는다. 따라서, 천연의 유전적으로 암호화된 아미노산 이외에도, RCT의 펩티드 매개제 내의 아미노산 잔기는 천연의 암호화되지 않은 아미노산 및 합성 아미노산으로 치환시킬 수 있다.

바람직한 매개제

바람직한 양태에서, 본 매개제는 BenOMe-bip-아닐린, 4-((R)-1-(4-(디메틸아미노)페닐카르바모일)-2- 페닐에틸카르바모일)부탄산, 4-((R)-1-(4-(디메틸아미노)페닐카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)-3,3-디메틸부탄산, 4-((R)-1-(4-(디메틸아미노)페닐카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)-3,3-(펜타메틸렌)부탄산, 4-((S)-1-(4-구아니디노페닐카르바모일)-2-(비페닐)에틸카르바모일)벤조산, 3-((R)-1-(4-(디메틸아미노)벤질카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)프로판산, 4-((R)-1-(4-(디메틸아미노)벤질카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)부탄산, 그리고 4-((R)-1- (4-(디메틸아미노)벤질카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)-3,3-디메틸부탄산으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.

합성 방법

바람직한 양태의 매개제는 펩티드를 제조하는 것으로 당해 분야에 공지된 거의 모든 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 통상적인 단계별 용액 또는 고체 상 펩티드 합성을 사용하여 제조할 수 있다.

RCT의 매개제는 통상적인 단계별 용액 또는 고체 상 펩티드 합성법을 사용하여 제조할 수 있다 [참조: Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams와 공동연구자들, Eds., 1997, CRC Press, Boca Raton Fla., 및 이에 인용된 참조문헌; Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, Atherton & Sheppard, Eds., 1989, IRL Press, Oxford, England, 및 이에 인용된 참조문헌] .

통상적인 고체-상 합성에서는, 제1 아미노산을 부착시키면, 이의 카르복실-말단 (C-말단)이 유도체화 수지와 화학적으로 반응하여 올리고펩티드의 카르복실 말단을 형성시킨다. 아미노산의 알파-아미노 말단은 전형적으로, t-부톡시-카르보닐기(Boc) 또는 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐 (Fmoc) 기로 차단시켜, 반응할 지도 모르는 아미노 기가 커플링 반응에 참여하지 못하게 한다. 아미노산의 측쇄기가 반응성일 경우에도, 이를 에테르, 티오에테르, 에스테르 및 카바메이트 형태의 각종 벤질-유도된 보호기에 의해 차단 (또는 보호)시킨다.

다음 단계 및 후속 반복 주기는 아미노-말단 (N-말단) 수지-결합된 아미노산 (또는 펩티드 쇄의 말단 잔기)를 탈차단시켜 알파-아미노 차단기를 제거시킨 다음, 그 다음 차단된 아미노산을 화학적으로 부가 (커플링)시키는 것을 포함한다. 그러나, 관심이 있는 전체 펩티드 쇄를 합성하기위해 이러한 공정을 많은 주기 동안 반복한다. 각각의 커플링 및 탈차단 단계 후, 수지-결합된 펩티드를 철저히 세척하여 모든 잔류성 반응물을 제거한 다음, 다음 단계를 진행한다. 고체 지지체 입자는 소정의 어떠한 단계에서도 시약 제거를 촉진시키는데, 이는 수지와 수지-결합된 펩티드가 다공성 개구를 갖는 칼럼 또는 장치 내에 유지되는 동안 용이하게 여과 및 세척될 수 있기 때문이다.

합성된 펩티드는 펩티드를 수지로부터 절단시켜 이의 C-말단 아미노산에 아미드 또는 카르복실 기를 잔존시키는 산 촉매 작용 (전형적으로, 불화수소산 또는 트리플루오로아세트산을 이용함)에 의해 수지로부터 방출시킬 수 있다. 산분해적 절단은 또한, 합성된 펩티드 중의 아미노산의 측쇄로부터 보호기를 제거하는 역할을 한다. 이어서, 마무리된 펩티드를 각종 크로마토그래피 방법 중의 어느 한 방법에 의해 정제할 수 있다.

바람직한 양태에 따르면, RCT의 펩티드 및 펩티드 유도체 매개제는 N^a-Fmoc 화학을 이용하는 고체-상 합성 방법에 의해 합성하였다. N^a-Fmoc 보호된 아미노산 및 링크 (Rink) 아미드 MBHA 수지는 공급처[Novabiochem (San Diego, CA) 또는 Chem-Impex Intl (Wood Dale, IL)]로부터 그리고 사스린(Sasrin) 수지는 Aldrich (Milwaukee, WI)로부터 구입하였다. 기타 화학물질 및 용매는 다음 공급처로부터 구입하였다: 트리플루오로아세트산 (TFA), 아니솔, 1,2-에탄디티올, 티오아니솔, 피페리딘, 아세트산 무수물, 2-나프토산 및 피발로산 (Aldrich, Milwaukee, WI), HOBt 및 NMP (Chem-Impex Intl, Wood Dale, IL), 디클로로메탄, 메탄올 및 HPLC 등급 용매 (Fischer Scientific, Pittsburgh, PA). 펩티드의 순도는 LC/MS에 의해 체크하였다. 펩티드의 정제는 C₁₈-결합된 실리카 칼럼 (Tosoh Biospec 분취 칼럼, ODS-80TM, Dim: 21.5 mm x 30 cm) 상에서 분취 HPLC 시스템 (Agilent technologies, 1100 Series)을 이용하여 달성하였다. 펩티드를 구배 시스템 [50% 내지 90%의 B 용매 (아세토니트릴:물 60:40; 0.1% TFA를 수반함)]으로 용출시켰다.

링크 아미드 MBHA 수지 (0.5-0.66 mmol/g) 또는 사스린 수지 (0.6-1.1 mmol/g)를 사용하여, 고체 상 방법을 통하여 단계별 방식으로 모든 펩티드를 합성하였다. 측쇄의 보호기는 Arg (Pbf), Glu (OtBu) 및 Asp (OtBu)이었다. 각 Fmoc-보호된 아미노산을, 1.5 내지 3배 과량의 보호된 아미노산을 사용하여 상기 수지에 커플링시켰다. 커플링 시약은 N-히드록시벤조트리아졸 (HOBt) 및 디이소프로필 카르보디이미드 (DIC)이고, 커플링 반응은 닌히드린 시험에 의해 모니터하였다. Fmoc기를 NMP 중의 20% 피페리딘을 사용하여 30 내지 60분간 처리함으로써 제거한 다음, CH₂Cl₂, CH₂Cl₂ 중의 10% TEA,메탄올 및 CH₂Cl₂로 연속해서 세척하였다. 커플링 단계에 이어 아세틸화시키거나 또는 필요에 따라 기타 캡핑기를 사용하였다.

TFA, 티오아니솔, 에탄디티올 및 아니솔의 혼합물 (90:5:3:2, v/v)을 사용하여 (실온에서 4 내지 5시간 동안) 펩티드-수지로부터 펩티드를 절단시키고, 모든 측쇄 보호기를 제거하였다. 조 펩티드 혼합물을 소결 펀널로부터 여과시키고, 이를 TFA로 세척하였다 (2 내지 3회). 여액을 진한 시럽으로 농축시키고 찬 에테르에 부가하였다. 냉장고내에서 밤새 유지시키고 원심분리시킨 후에, 펩티드가 백색 고체로서 침전되었다. 용액을 기울려 따르고 고체를 에테르로 철저히 세척하였다. 이로써 생성된 조 펩티드를 완충액 (아세토니트릴:물 60:40; 0.1% TFA를 수반함)에 용해시키고 건조시켰다. 조 펩티드를 40분 동안 구배 시스템 50-90% B [완충액 A: 0.1% (v/v) TFA를 함유하는 물, 완충액 B: 0.1% (v/v) TFA를 함유하는, 아세토니트릴:물 (60:40)]을 갖는 분취 C-18 칼럼 (역상)을 이용하여 HPLC함으로써 정제하였다. 순수한 분획을 Speedvac 상에서 농축시켰다. 수율은 5 내지 20%로 다양하였다.

또 다르게는, 바람직한 양태의 펩티드는 예를 들어, 다음 문헌에 기재된 바와 같은, 세그먼트 축합을 통하여, 즉 보다 큰 펩티드 쇄를 형성하기 위해 작은 구성분 펩티드 쇄를 함께 연결시킴으로써 제조할 수 있다 [참조: Liu와 공동연구자들, 1996, Tetrahedron Lett. 37(7):933-936; Baca와 공동연구자들, 1995, J. Am. Chem. Soc. 117:1881-1887; Tam과 공동연구자들, 1995, Int. J. Peptide Protein Res. 45:209-216; Schnolzer and Kent, 1992, Science 256:221-225; Liu and Tam, 1994, J.Am. Chem. Soc. 116(10):4149-4153; Liu and Tam, 1994, PNAS USA 91:6584-6588; Yamashiro and Li, 1988, Int. J. Peptide Protein Res. 31:322-334; Nakagawa와 공동연구자들, 1985, J. Am Chem. Soc. 107:7087-7083; Nokihara와 공동연구자들, 1989, Peptides 1988:166-168; Kneib-Cordonnier와 공동연구자들, 1990, Int. J. Pept. Protein Res. 35:527-538; 이들 전문이 본원에 참조문헌으로서 삽입되어 있다]. 본 발명의 펩티드를 합성하는데 유용한 기타 방법이 문헌 [참조: Nakagawa와 공동연구자들, 1985, J. Am. Chem. Soc. 107:7087-7092]에 기재되어 있다.

세그먼트 축합에 의해 생성된 펩티드의 경우에는, 이러한 축합 단계의 커플링 효율은 커플링 시간을 연장시킴으로써 상당히 증가될 수 있다. 전형적으로, 커플링 시간을 연장시키면, 생성물의 라세미화가 증가된다 [참조: Sieber와 공동연구자들, 1970, Helv. Chim. Acta 53:2135-2150]. N- 및/또는 C-말단 차단기를 함유하는 RCT의 매개제는 표준 유기 화학 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 특정 펩티드의 N-말단을 아실화하거나, 또는 C-말단을 아미드화 또는 에스테르화하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어있다. N- 및/또는 C-말단에서의 기타 변형을 수반하는 방식은 당업자에게 명백할 것이며, 이는 말단 차단기를 부착시키는데 필요할 수 있는 바와 같이 모든 측쇄 작용기를 보호하는 방식과 같을 것이다.

마찬가지로 예컨대 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에서 보호기의 탈보호 방법은 당해 분야에 널리 공지되어있다. N- 및/또는 C-말단에서의 기타 변형을 수반하는 방식은 당업자에게 명백할 것이며, 이는 말단 차단기를 제거시키는데 필요할 수 있는 바와 같이 모든 측쇄 작용기를 탈보호하는 방식과 같을 것이다.

약학적으로 허용되는 염 (반대 이온)은 편리하게는, 이온-교환 크로마토그래피 또는 당해 분야에 널리 공지된 바와 다른 기타 방법에 의해 제조할 수 있다.

RCT 매개제의 구조내에 사용된 바이오이소스테레

하기 합성 스킴은 바이오이소스테레를 갖는 RCT 매개제를 합성하는데 사용될 수 있는 방법의 예를 보여준다.

약제학적 제형 및 치료 방법

바람직한 양태의 RCT의 매개제는 동물, 특히 사람을 포함하는 포유류에게서, 혈청 콜레스테롤 수치를 저하시키는 것이 이로운 모든 장애를 치료하는데 사용할 수 있는데, 이러한 장애에는 혈청 HDL 농도를 증가시키고, LCAT를 활성화시키며 콜레스테롤 유출과 RCT를 증진시키는 것이 이로운 질환이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 질환으로는 고지질혈증, 및 특히 고콜레스테롤혈증, 및 심혈관계 질환, 예를 들면, 아테롬성 동맥경화증 (아테롬성 동맥경화증의 치료 및 예방 포함) 및 관상 동맥 질환; 재발 협착증 (예: 의학적 처치, 예를 들면, 발룬 혈관형성술의 결과로서 발생하는 아테롬성 동맥경화성 플라크의 예방 또는 치료); 및 기타 장애, 예를 들면, 허혈증, 및 종종 패혈성 쇽을 야기시키는 내독소혈증이 있지만, 이에 제한되지 않는다. RCT의 매개제는 단독으로 사용하거나 또는 전술된 질환을 치료하기 위해 사용되어 온 기타 약물과의 조합 요법으로 사용될 수 있다. 이러한 치료법에는 관련 약물을 동시에 투여하거나 순차적으로 투여하는 것이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

예를 들어, 고콜레스테롤혈증 또는 아테롬성 동맥경화증을 치료하는데 있어서, RCT의 분자 매개제 제형을, 현재 사용되고 있는 콜레스테롤 저하 요법들, 예를 들면, 담즙산 수지, 니아신 및/또는 스타틴 중의 한 가지 이상과 함께 투여할 수 있다. 이러한 조합 치료 처방은 특히 이로운 치료 효과를 가져다줄 수 있는데, 이는 각 약물이 콜레스테롤 합성과 수송에 있어 상이한 표적에 대해 작용하기 때문이며, 즉 담즙산 수지는 콜레스테롤 재순환, 킬로미크론 (chylomicron) 및 LDL 집단에 영향을 미치고; 니아신은 VLDL 및 LDL 집단에 주로 영향을 미치며; 스타틴은 콜레스테롤 합성을 억제시켜, LDL 집단을 저하시키고 (아마도, LDL 수용체 발현은 증가시키며); 반면, RCT의 매개제는 RCT에 영향을 미치고, HDL을 증가시키며, LCAT 활성을 증가시키고 콜레스테롤 유출을 증진시킨다.

RCT의 매개제를 피브레이트와 연계해서 사용하여, 고지질혈증, 고콜레스테롤혈증 및/또는 심혈관계 질환, 예를 들면, 아테롬성 동맥경화증을 치료할 수 있다.

RCT의 매개제를, 내독소에 의해 유발된 패혈성 쇽을 치료하기 위해 현재 사용되고 있는 항미생물제 및 소염제와 조합하여 사용할 수 있다.

RCT의 매개제는, 각종 방식, 바람직하게는 경구 투여를 통하여 대상체에게 투여하여 RCT의 매개제를 순환 전달시킬 수 있는 분자-기재 조성물로서 또는 분자-지질 복합체로서 제형화할 수 있다. 제형 및 치료 처방의 예가 아래에 언급되어 있다.

다른 바람직한 양태에서는, 고콜레스테롤혈증 및/또는 아테롬성 동맥경화증의 한 가지 이상의 증상을 완화 및/또는 예방하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 바람직하게는, 유기체, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 사람에게 바람직한 양태의 하나 이상의 화합물(또는 이러한 화합물의 모방체)를 투여하는 것을 포함한다. 이러한 화합물(들)는 본원에 기재된 바와 같이, 주사, 좌제, 비내 분무, 시간-방출(서방성) 이식체, 경피용 패치 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 수 많은 표준 방법에 따라서 투여할 수 있다. 한 가지 특히 바람직한 양태에서는, 매개제는 경구 투여된다 (예를 들면, 시럽, 캅셀제 또는 정제로서 투여한다).

상기 방법은 바람직한 양태의 단일 화합물을 투여하거나 2가지 이상의 상이한 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 화합물은 단량체로서, 또는 이량체성, 올리고머성 또는 중합체성 형태로 제공될 수 있다. 특정 양태에서는, 다량체성 형태가 연합된 단량체 (예: 이온적 또는 소수성으로 연결됨)를 포함할 수 있지만, 특정의 기타 다량체성 형태는 공유적으로 연결된 단량체 (직접 연결되거나 링커를 통하여 연결됨)를 포함한다.

바람직한 양태는 사람에게서의 사용과 관련하여 기재되긴 하였지만, 동물에게 사용하는 것 (예를 들면, 수의용) 역시 적합하다. 따라서, 바람직한 유기체에는 사람, 사람이 아닌 영장류, 개과, 말과, 고양이과, 돼지과, 유제류 (ungulate), 라고모르프(largomorph) 등이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

바람직한 양태의 방법은 고콜레스테롤혈증 및/또는 아테롬성 동맥경화증의 한 가지 이상의 증상 (예를 들면, 고혈압; 플라크 형성 및 파열; 심장 마비, 협심증 또는 발작과 같은 임상 사건의 저하, 고수준의 저밀도 지단백질; 고수준의 극히 저밀도 지단백질, 또는 염증성 단백질 등)을 나타내는 사람 또는 사람이 아닌 동물로 제한되지 않고, 예방 차원에서도 유용하다. 따라서, 바람직한 양태의 매개제 (또는 이의 모방체)는 고콜레스테롤혈증 및/또는 아테롬성 동맥경화증의 한 가지 이상의 증상의 발병/전개를 예방하기 위해 유기체에게 투여할 수 있다. 이와 관련하여 특히 바람직한 대상체는 아테롬성 동맥경화증에 대한 한가지 이상의 위험 인자 (예: 가족력, 고혈압, 비만, 고알코올 소모, 흡연, 고 혈중 콜레스테롤, 고 혈중 트리글리세라이드, 상승된 혈중 LDL, VLDL, IDL, 또는 낮은 HDL, 당뇨병, 또는 당뇨병 가족력, 고 혈중 지질, 심장 마비, 협심증 또는 발작 등)을 나타내는 대상체이다. 바람직한 양태는 고지질혈증, 고콜레스테롤혈증, 및 관상동맥 질환심, 아테롬성 동맥경화증, 당뇨병, 비만, 알쯔하이머병, 다발성 경화증, 감염과 같은 고지질혈증과 관련된 질환 그리고 패혈성 쇽을 야기시키는 내독소혈증의 치료에서 약학 제제와 그러한 제제의 사용을 포함한다

한 바람직한 양태에서, RCT의 매개제는 RCT의 매개제의 합성 및 정제에 관한 앞서의 섹션에 기재된 모든 기술을 사용하여 합성 또는 제작할 수 있다. 반감기가 긴 안정한 제제는 화합물을 동결건조시킴으로써 만들 수 있는데, 재제형화하기 위한 벌크로 제조하거나, 또는 대상체에게 투여하기에 앞서 멸균수 또는 적당한 멸균 완충 용액으로 재수화시킴으로써 재구성될 수 있는 개개 분취량 또는 투여 단위로 제조할 수 있다.

다른 바람직한 양태에서는, RCT의 매개제를 분자-지질 복합체에서 제형화 및 투여할 수 있다. 이러한 접근법은 몇가지 이점을 지니는데, 이는 특히 상기 복합체가 HDL, 특히 프레-β-1 또는 프레-β-2 HDL 집단과 유사한 크기와 밀도를 갖는 경우에, 상기 복합체는 순환 동안 증가된 반감기를 가져야 하기 때문이다. 분자-지질 복합체는 편리하게는, 아래에 기재된 수 많은 방법들 중의 어느 것에 의해서도 제조할 수 있다. 반감기가 긴 안정한 제제는 동결건조시킴으로써 제조할 수 있는데, 아래에 기재된 공동-동결건조 과정이 바람직한 접근법이다. 이와 같이 동결건조된 분자-지질 복합체를 사용하여, 약제학적 재제형화를 위한 벌크로 제조하거나, 또는 대상체에게 투여하기에 앞서 멸균수 또는 적당한 완충 용액으로 재수화시킴으로써 재구성될 수 있는 개개 분취량 또는 투여 단위로 제조할 수 있다.

당업자에게 널리 공지된 각종 방법을 사용하여 분자-지질 소포 또는 복합체를 제조할 수 있다. 이를 위해, 리포솜 또는 프로테오리포솜을 제조하기 위해 이용 가능한 수 많은 기술을 사용할 수 있다. 예를 들어, 화합물을 적당한 지질로 공동-초음파처리하여 (욕조 또는 프로브 초음파 처리기를 사용함) 복합체를 형성시킬 수 있다. 또 다른 한편, 화합물을 미리형성한 지질 소포와 합하면, 분자-지질 복합체가 자발적으로 형성될 수 있다. 또 다른 대체 방안에서는, 분자-지질 복합체가 세정제 투석 방법에 의해 형성될 수 있는데, 예를 들어, 화합물, 지질 및 세정제의 혼합물을 투석시켜 세정제를 제거하고, 분자-지질 복합체를 재구성 또는 형성시킨다 [참조: Jonas와 공동연구자들, 1986, Methods in Enzymol. 128:553-582].

전술된 접근법이 실행 가능하긴 하지만, 각 방법은 비용, 수율, 재현성 및 안전성 측면에서 자체 특유의 생산 상의 문제점을 나타낸다. 한 가지 바람직한 방법에 따르면, 화합물과 지질을 용매 시스템에서 조합하는데, 이러한 용매 시스템은 각 성분을 동시에 가용화시키고 동결건조 과정에 의해 완전히 제거될 수 있다. 이를 위해, 양친매성 화합물과 지질 둘 다를 동시에 가용화시킬 수 있도록 용매 쌍을 조심스럽게 선택해야 한다. 한 양태에서는, 입자 내로 혼입될 단백질(들), 화합물(들) 또는 이의 유도체/유사체를 수성 또는 유기 용매 또는 용매 혼합물 (용매 1)에 용해시킬 수 있다. (인)지질 성분은 용매 1과 혼화성인, 수성 또는 유기 용매 또는 용매 혼합물 (용매 2)에 용해시키고, 두 용액을 혼합한다. 또 다른 한편, 화합물과 지질을 공용매 시스템, 즉 혼화성 용매의 혼합물 내로 혼입시킬 수 있다. 지질에 대한 화합물의 적합한 비율은 먼저, 생성된 복합체가 적당한 물리적 및 화학적 특성을 보유하도록, 즉 HDL과 크기면에서 통상 유사하도록 (그러나, 반드시 그렇지는 않다) 실험적으로 결정한다. 이로써 생성된 혼합물을 동결건조시킨다. 동결건조를 촉진시키기 위해서는 종종 부가의 용매를 상기 혼합물에 부가해야만 한다. 이와 같이 동결건조된 생성물을 장기간 동안 저장할 수 있으며, 이는 안정된 채로 유지될 것이다.

분자-지질 복합체의 용제 또는 현탁제를 수득하기 위해 상기 동결건조된 생성물을 재구성할 수 있다. 이를 위해, 동결건조된 분말을 수용액으로 재수화시켜 적합한 용적으로 만들 수 있다 (정맥내 주사하기 위해서는 종종 5 mgs 펩티드/ml가 편리하다). 바람직한 양태에서는, 동결건조된 분말을 포스페이트 완충 식염수 또는 생리 식염수로 재수화시킨다. 혼합물을 진탕 또는 와동시켜 재수화를 촉진시킬 수도 있으며, 대부분의 경우에는 재구성 단계를 복합체의 지질 성분의 상 전이 온도이상의 온도에서 수행해야 한다. 수분 내에, 재구성된 지질-단백질 복합체의 투명한 제제가 생성된다.

수득한 재구성된 제제의 분취량에 대해 특성 평가함으로써 이러한 제제 중의 복합체가 목적하는 크기 분포도, 예를들면, HDL의 크기 분포도를 나타내는지를 확인할 수 있다. 이를 위해, 겔 여과 크로마토그래피를 사용할 수 있다. 예를 들어, 파마시아 (Pharmacia) 슈퍼로스 6 FPLC 겔 여과 크로마토그래피 시스템을 사용할 수 있다. 사용된 완충액은 50 mM 포스페이트 완충액 (pH 7.4) 중의 150 mM NaCl를 함유한다. 전형적인 샘플 용적은 5 mgs 화합물/ml를 함유하는 20 내지 200 마이크로리터의 복합체이다. 칼럼 유속은 0.5 mls/분이다. 공지된 분자량 및 스토크스 (Stokes) 직경의 단백질 시리즈 뿐만 아니라 사람 HDL이, 칼럼을 교정하기 위한 표준물로서 바람직하게 사용된다. 단백질 및 지단백질 복합체는 파장 254 또는 280 nm의 흡광도 또는 광 산란에 의해 모니터한다.

바람직한 양태의 본 RCT의 매개제는 포화, 불포화, 천연 및 합성 지질 및/또는 인지질을 포함한 각종 지질과 복합체를 형성할 수 있다. 적합한 지질에는 다음이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다: 작은 알킬 쇄 인지질, 난 (egg) 포스파티딜콜린, 대두 포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디미리스토일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 1-미리스토일-2-팔미토일포스파티딜콜린, 1-팔미토일-2-미리스토일포스파티딜콜린, 1-팔미토일-2-스테아로일포스파티딜콜린, 1-스테아로일-2-팔미토일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린, 디올레오포스파티딜에탄올아민, 디라우로일포스파티딜글리세롤 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 스핑고지질, 포스파티딜글리세롤, 디포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티딜글리세롤, 디팔미토일포스파티딜글리세롤, 디스테아로일포스파티딜글리세롤, 디올레오일포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티드산, 디팔미토일포스파티드산, 디미리스토일포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜에탄올아민, 디미리스토일 포스파티딜세린, 디팔미토일포스파티딜세린, 뇌 포스파티딜세린, 뇌 스핑고미엘린, 디팔미토일스핑고미엘린, 디스테아로일스핑고미엘린, 포스파티드산, 갈락토세레브로시드, 강글리오시드, 세레브로시드, 디라우릴포스파티딜콜린, (1,3)-D-만노실-(1,3)디글리세라이드, 아미노페닐글리코시드, 3-콜레스테릴-6'-(글리코실티오)헥실 에테르 글리코지질, 및 콜레스테롤 및 이의 유도체.

본 발명의 약제학적 제형은 생체내에서 투여 및 전달하기에 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 중에, 활성 성분으로서 RCT의 분자 매개제 또는 분자-지질 복합체를 함유한다. 본 화합물은 산성 및/또는 염기성 말단 및/또는 측쇄를 함유할 수 있기 때문에, 이러한 혼합물은 유리 산 또는 염기 형태, 또는 약제학적으로 허용되는 염 형태로 제형 내에 포함될 수 있다.

주사용 제제에는 수성 또는 오일상 비히클 중의 활성 성분의 멸균 현탁제, 용제 또는 유제가 포함된다. 이러한 조성물은 제형화제, 예를 들면, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수도 있다. 주사용 제형은 단위 투여 형태, 예를 들면, 앰풀 또는 다용량 용기로 표시할 수 있고, 부가된 방부제를 함유할 수도 있다.

또 다른 한편, 주사용 제형은, 사용하기 전에 멸균성 발열원 유리 수, 완충제, 덱스트로스 용액 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 적합한 비히클로 재구성하기 위한 분말 형태로 제공될 수 있다. 이를 위해, RCT의 매개제를 동결건조시키거나, 또는 공동-동결건조된 분자-지질 복합체를 제조할 수 있다. 저장된 제제는 단위 투여 형태로 공급될 수 있으며, 생체내에서 사용하기에 앞서 재구성할 수 있다.

장기간 전달하기 위해서는, 활성 성분을 체내 이식 투여용, 예를 들면, 피하, 피내 또는 근육내 주사용 데포 제제로서 제형화할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 활성 성분을 적합한 중합체성 또는 소수성 물질 (예: 허용되는 오일 중의 유제로서) 또는 이온 교환 수지와 함께 제형화하거나, 또는 거의 불용성인 유도체로서, 예를 들면, 거의 불용성인 염 형태의 RCT의 매개제로서 제형화할 수 있다.

또 다른 한편, 경피 흡수를 위해 활성 성분을 서서히 방출시키는 접착성 원반 또는 패치로서 제작된 경피 전달 시스템을 사용할 수 있다. 이를 위해, 투과 증강제를 사용하여 활성 성분의 경피 투과를 촉진시킬 수 있다. 허혈성 심장 질환 및 고콜레스테롤혈증이 있는 환자에게서 사용하기 위해 니트로글리세린 패치 내로 바람직한 양태의 RCT 매개제 또는 분자-지질 복합체를 혼입시킴으로써 특별한 이익을 달성할 수 있다.

경구 투여의 경우에는, 약제학적 조성물이 약제학적으로 허용되는 부형제, 예를 들면, 결합제 (예: 예비젤라틴화 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로스); 충전제 (예: 락토스, 미세결정성 셀룰로스 또는 인산수소칼슘); 윤활제 (예: 마그네슘 스테아레이트, 탈크 또는 실리카); 붕해제 (예: 감자 전분 또는 나트륨 전분 글리콜레이트); 또는 습윤제 (예: 나트륨 라우릴 설페이트)를 이용한 통상적인 방법에 의해 제조된 정제 또는 캅셀제 형태를 취할 수 있다. 정제는 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 피복시킬 수 있다. 경구 투여용 액상 제제는 예를 들어, 용제, 시럽 또는 현탁제 형태를 취할 수 있거나, 또는 이들 제제는 사용하기 전에 물 또는 기타 적합한 비히클과 구성하기 위한 무수 생성물일 수 있다. 이러한 액상 제제는 약제학적으로 허용되는 첨가제, 예를 들면, 현탁제 (예: 솔비톨 시럽, 셀룰로스 유도체 또는 수소화 식용 지방); 유화제 (예: 레시틴 또는 아카시아); 비-수성 비히클 (예: 아몬드 오일, 오일상 에스테르, 에틸 알코올 또는 분획 식물성 오일); 및 방부제 (예: 메틸 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 소르브산)를 이용한 통상적인방법에 의해 제조할 수 있다. 상기 제제는 경우에 따라, 완충 염, 향미제, 착색제 및 감미제를 함유할 수도 있다. 경구 투여용 제제는 활성 성분을 제어 방출하도록 적합하게 제형화할 수 있다.

구강(buccal) 투여의 경우에는, 조성물이 통상적인 방식으로 제형화된 정제 또는 로젠지 형태를 취할 수 있다. 직장 및 질내투여 경로의 경우에는, 활성 성분을 용제 (정체 관장용), 좌제 또는 연고로서 제형화할 수 있다.

흡입 투여의 경우에는, 활성 성분을, 적합한 추진체, 예를 들면, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 기타 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 분무기로부터 에어로솔 분무 표시형태로 편리하게 전달할 수 있다. 가압 에어로솔의 경우에는, 계량 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 투여 단위를 결정할 수 있다. 해당 화합물과 적합한 분말 기제, 예를 들면, 락토스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하는, 흡입기 또는 취분기에 사용하기위한, 예를 들어, 젤라틴의 카트릿지 및 캡슐을 제형화할 수 있다.

조성물은 경우에 따라, 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여 형태를 함유할 수 있는 팩 또는 투약기 내에 존재할수 있다. 이러한 팩은, 예를 들어, 금속 또는 플라스틱 박막, 예를 들면, 블리스터 팩을 포함할 수 있다. 상기 팩 또는 투약기에는 투여에 대한 지시사항이 수반될 수 있다.

바람직한 양태의 RCT의 분자 매개제 및/또는 분자-지질 복합체는 순환시 생체내 이용 효율을 보장해 주는 적합한 어떠한 경로로든 투여할 수 있다. 이는 정맥내 (IV), 근육내 (IM), 피내, 피하 (SC) 및 복강내 (IP) 주사를 포함한 비경구 투여 경로에 의해 달성할 수 있다. 그러나, 기타 투여 경로를 사용할 수도 있다. 예를 들어, 위장관을 통한 흡수는 경구 투여 경로 (이에는 섭취, 구강 및 설하 경로가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다)에 의해 달성될 수 있는데, 단 예를 들어, 구강 점막, 위 및/또는 소장의 거친 환경 하에서 활성 성분의 분해를 피하거나 최소화시키는데 적당한 제형 (예: 장내 피복물)을 사용해야 한다. 경구 투여는 사용하기가 용이하므로, 치료 순응도를 증강시키는 이점을 지니고 있다. 또 다른 한편, 점막 조직을 통한 투여, 예를 들면, 질 및 직장 투여 방식을 활용하여, 위장관 내에서의 분해를 피하거나 최소화시킬 수 있다. 또 다른 대체 방안에서는, 바람직한 양태의 제형을 경피 또는 흡입 투여할 수 있다. 바람직한 경로는 수용자의 상태, 연령 및 치료 순응도에 따라 다양할 수 있다는 것을 인지해야 할 것이다.

사용된 RCT의 분자 매개제 또는 분자-지질 복합체의 실제 용량은 투여 경로에 따라 다양할 것이며, 이는 1.0 mg/l 내지 2 g/l의 혈장 농도 순환을 달성시키도록 조정되어야 한다. 본원에 언급된 동물 모델 시스템에서 수득된 데이터는, 바람직한 양태의 ApoA-I 효능제가 HDL 성분과 회합되고, 사람에게서 약 5일의 계획된 반감기를 갖는다는 것을 보여준다. 따라서, 한 양태에서는, RCT의 매개제를 1주에 한번씩 0.5 mg/kg 내지 100 mg/kg의 용량으로 주사 투여할 수 있다. 또 다른 양태에서는, 약 0.1 mg/kg/hr 내지 100 mg/kg/hr을 제공하는 지속적 주입 또는 간헐적 주입에 의해 목적하는 혈청 수준을 유지시킬 수 있다.

각종 RCT 매개제의 독성 및 치료학적 효능은, LD₅₀ (집단의 50%를 치사시키는 용량) 및 ED₅₀ (집단의 50%에게서 치료학적으로 유효한 용량)을 결정하기 위한 세포 배양물 또는 실험 동물에서의 표준 약제학적 과정을 이용하여 결정할 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 간의 용량 비가 치료 지수이고, 이는 LD₅₀/ED₅₀ 비로서 나타낼 수 있다. 치료 지수가 큰 ApoA-I 분자 효능제가 바람직하다.

기타 용도

바람직한 양태의 RCT 효능제의 매개제는, 예를 들어, 진단 목적을 위해 혈청 HDL를 측정하는 시험관내 검정에 사용할 수 있다. RCT의 매개제는 혈청의 HDL 및 LDL 성분과 회합하기 때문에, 효능제가 HDL 및 LDL 집단에 대한 "마커"로서 사용될 수 있다. 더욱이, 효능제는 RCT에 효과적인 HDL의 아집단에 대한 마커로서 사용될 수 있다. 이를 위해, 효능제를 환자 혈청 샘플에 부가하거나 이와 혼합할 수 있으며; 적당한 항온 배양 시간 후, 혼입된 RCT 매개제를 탐지함으로써 HDL 성분을 검정할 수 있다. 이는 표지된 효능제 (예를 들면, 방사성 표지물, 형광 표지물, 효소 표지물, 염료 등)를 사용하여 달성하거나, 또는 효능제에 대해 특이적인 항체 (또는 항체 단편)을 사용하여 면역검정함으로써 달성할 수 있다.

또 다른 한편, 표지된 효능제를 영상화 과정 (예를 들면, CAT 스킨, MRI 스캔)에 사용하여 순환계를 가시화하거나, RCT를 모니터하거나, 또는 지방 줄무늬, 아테롬성 동맥경화증 병변 등에서의 HDL의 축적을 가시화할 수 있다 (여기서, HDL은 콜레스테롤 유출에 있어 활성이어야 한다).

역 콜레스테롤 수송 매개제 분석검정

LCAT 활성화 검정

바람직한 양태에 따르는 RCT의 매개제는 각종 시험관내 검정, 예를 들면, 시험관 내에서 LCAT를 활성화시킬 수 있는 능력에 의해 잠재적 임상 효능에 대해 평가할 수 있다. LCAT 검정에서는, 난 포스파티딜콜린 (EPC) 또는 1-팔미토일-2-올레일-포스파티딜-콜린 (POPC) 및 방사성 표지된 콜레스테롤로 구성된 기질 소포 (작은 단층 소포 또는 "SUVs")를 등가 질량의 화합물 또는 ApoA-I (사람 혈장으로부터 분리됨)과 함께 예비항온 배양한다. LCAT (사람 혈장으로부터 정제됨)를 부가함으로써 상기 반응을 개시한다. 양성 대조군으로서 사용된 본래의ApoA-I은 100% 활성화 활성을 나타낸다. 분자 매개제의 "특이 활성" (즉, 활성 (LCAT 활성화) 단위/질량 단위)는 최대 LCAT 활성화를 달성시켜 주는 매개제의 농도로서 산정될 수 있다. 예를 들어, 일련의 화합물 농도 (예를 들면, 제한 희석)를 대상으로 검정하여, 화합물에 대한 "특이 활성" - 검정 중의 특정 시점 (예를 들면, 1시간)에서 최대 LCAT 활성화를 달성시켜 주는 농도 (즉, 콜레스테롤의 콜레스테롤 에스테르로의 전환률)를 결정할 수 있다. 예를 들어, 1시간에서의 콜레스테롤의 전환률을, 사용된 펩티드의 농도에 대해 플롯팅한 경우, 이러한 "특이 활성"은 플롯팅된 곡선 상의 안정기를 달성시켜 주는 펩티드의 농도로서 확인될 수 있다.

기질 소포의 제조

LCAT 검정에 사용된 소포는 난 포스파티딜콜린 (EPC) 또는 1-팔미토일-2-올레일-포스파티딜콜린 (POPC) 및 콜레스테롤이 20:1의 몰 비로 구성된 SUVs이다. 40회 검정에 충분한 소포 원액을 제조하기 위해, 7.7 mg EPC (또는 7.6 mg POPC; 10 μmol), 78 ㎍ (0.2 μmol) 4-¹⁴C-콜레스테롤, 116 ㎍ 콜레스테롤 (0.3 μmol)을 5 ml 크실렌에 용해시키고 동결건조시킨다. 그 후, 4 ml의 검정용 완충액을 무수 분말에 가하고, 4℃의 질소 대기 하에 초음파 처리한다. 초음파 처리 조건: 브란손 (Branson) 250 초음파 처리기, 10 mm 팁, 6 x 5 분; 검정용 완충액: 10 mM Tris, 0.14 M NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.4. 초음파 처리된 혼합물을 매회 14,000 rpm (16,000 x g)으로 5분 동안 6회 원심분리시켜 티타늄 입자를 제거한다. 수득한 투명 용액을 효소 검정에 사용한다.

LCAT의 정제

LCAT 정제를 위해, 사람 혈장을 덱스트란 설페이트/Mg²+ 처리하여 지단백질 결핍성 혈청 (LPDS)을 수득하고, 이를 페닐세파로스, 아피겔블루 (Affigelblue), 콘카나발린 (Concanavalin) A 세파로스 및 항-ApoA-I 친화 크로마토그래피 상에서순차적으로 크로마토그래피한다.

LPDS의 제조

LPDS를 제조하기 위해, 500 ml 혈장을 50 ml 덱스트란 설페이트 (MW=500,000) 용액에 가한다. 20분 동안 교반시킨다. 4℃에서 3000 rpm (16,000 x g)로 30분 동안 원심분리시킨다. 상등액 (LPDS)을 추가로 정제하기 위해 사용한다 (약 500 ml).

페닐세파로스 크로마토그래피

다음 물질과 조건을 페닐세파로스 크로마토그래피에 사용하였다. 고체 상: 페닐세파로스 고속 유동, 고 기질 등급, 파마시아칼럼: XK26/40, 겔 상 높이: 33 cm, V = 약 175 ml 유속: 200 ml/hr (샘플) 세척: 200 ml/hr (완충액) 용출: 80 ml/hr (증류수) 완충액: 10 mM Tris, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 7.4, 0.01% 나트륨 아지드.

상기 칼럼을 Tris-완충액에서 평형시키고, 29 g NaCl을 500 ml LPDS에 가하고, 칼럼에 적용한다. 280 nm 파장에서의 흡광도가 대략 기준선에 도달할 때까지 여러 용적의 Tris 완충액으로 세척한 다음, 증류수로의 용출을 시작한다. 단백질을 함유하는 분획을 모으고 (풀 크기: 180 ml)를 아피겔블루 크로마토그래피에 사용한다.

아피겔블루 크로마토그래피

페닐세파로스 풀을 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.01% 나트륨 아지드에 대해 4℃ 하에 밤새 투석한다. 한외여과 (Amicon YM30)시킴으로써 풀 용적이 50 내지 60 ml가 되도록 감소시키고 아피겔블루 칼럼 상에 부하한다. 고체 상: 아피겔블루, 바이오래드 (Biorad), 153-7301 칼럼, XK26/20, 겔 상 높이: 대략 13 cm; 칼럼 용적: 대략 70 ml. 유속: 부하: 15 ml/h 세척: 50 ml/h. 칼럼을 Tris-완충액에서 평형시킨다. 페닐세파로스 풀을 칼럼에 적용한다. 이와 동시에 분획을 수집하기 시작한다. Tris-완충액으로 세척한다. 모은 분획 (170 ml)을 ConA 크로마토그래피에 사용하였다.

ConA 크로마토그래피

아피겔블루 풀을 Amicon (YM30)을 통하여 30 내지 40 ml가 되도록 감소시키고 ConA 출발 완충액 (1 mM Tris HC1 pH 7.4; 1 mM MgCl₂, 1 mM MnCl₂, 1 mM CaCl₂, 0.01% 나트륨 아지드)에 대해 4℃ 하에 밤새 투석하였다. 고체 상: ConA 세파로스 (Pharmacia) 칼럼: XK26/20, 겔 상 높이: 14 cm (75ml). 유속: 부하: 40ml/h 세척 (출발 완충액을 이용함): 90ml/h 용출: 50 ml/h, 1 mM Tris, pH 7.4 중의 0.2M 메틸-α-D-만노시드. 만노시드 용출의 단백질 분획을 수집하고 (110ml), 한외여과 (YM30)시킴으로써 용적이 44 ml가 되도록 감소시켰다. ConA 풀을 2 ml 분취량으로 나누고, -20℃ 하에 저장하였다.

항-ApoA-I 친화 크로마토그래프

항-ApoA-I 친화 크로마토그래피는, 항-ApoA-I abs를 공유적으로 커플링시킨 아피겔-Hz 물질 (Biorad) 상에서 수행하였다. 칼럼: XK16/20, V = 16 ml. 이 칼럼을 PBS pH 7.4로 평형시켰다. 2 ml의 ConA 풀을 2시간 동안 PBS에 대해 투석시킨 후에 칼럼 상에 부하하였다. 유속: 부하: 15 ml/hr 세척 (PBS) 40ml/hr. 모은 단백질 분획 (V=14 ml)을 LCAT 검정에 사용한다. 이 칼럼을 0.1 M 시트레이트 완충액 (pH 4.5)으로 재생시켜 결합된 A-I (100 ml)를 용출시키고, 이러한 과정 직후에 PBS로 재평형시킨다.

RCT의 매개제의 약동학

다음 실험 프로토콜을 사용하여, RCT 매개제가 순환 동안 안정적이고 혈장의 HDL 성분과 회합된다는 것을 입증할 수 있다.

화합물 효능제의 합성 및/또는 방사성 표지화

500 내지 900 cpm/ng의 특이 활성에 대한 요오드 모노클로라이드 과정에 의해 ^l25I-표지된 LDL을 제조하였다 [참조: Goldstein and Brown 1974 J. Biol. Chem. 249:5153-5162]. 배양된 사람 섬유아세포에 의한 저밀도 지단백질의 결합 및 분해는 문헌 [참조: Goldstein and Brown 1974 J. Biol. Chem. 249:5153-5162]에 기재된 바와 같이 500 내지 900 cpm/ng의 최종 특이 활성에서 결정하였다. 모든 경우에 있어, 상기 지단백질을 4℃에서 10% (wt/vol) 트리클로로아세트산 (TCA)과 함께 항온 배양함으로써, >99% 방사능이 침전 가능하였다. Tyr 잔기를 각 화합물의 N-말단에 부착시켜 이의 방사성 요오드화를 가능케 하였다. 요오도-비드 (Pierce Chemicals)를 사용하여, 상기 화합물을 Na¹²⁵I (ICN)으로 방사성 요오드화시키고, 제조업자의 프로토콜을 수행한 후, 800 내지 1000 cpm/ng의 특이 활성이 되도록 하였다. 투석 후, 화합물의 침전 가능한 방사능 (10% TCA)은 항상 > 97%였다.

또 다른 한편, 방사성 표지된 화합물은 N-말단 아미노산으로서 ¹⁴C-표지된 Fmoc-Pro를 커플링시킴으로써 합성할 수 있었다. 특이 활성이 9.25 GBq/mmol인 L-[U-¹⁴C]X를, X를 함유하는 표지된 효능제의 합성에 사용할 수 있다. 이러한 합성은 문헌 [참조: Lapatsanis, Synthesis, 1983, 671-173]에 따라서 수행할 수 있다. 간략하게 언급하면, 250 μM (29.6 mg)의 표지되지 않은 L-X를 225 ㎕의 9% Na₂C0₃ 용액에 용해시키고, 9.25 MBq (250 μM) ¹⁴C-표지된 L-X의 용액(9% Na₂C0₃)에 가한다. 이 액체를 0℃로 냉각시키고, 0.75 ml DMF 중의 600 μM (202 mg) 9-플루오레닐메틸-N-숙신이미딜카르보네이트 (Fmoc-OSu)와 혼합한 다음, 실온에서 4시간 동안 진탕시킨다. 그 후, 상기 혼합물을 디에틸에테르 (2 x 5 ml) 및 클로로포름 (1 x 5 ml)으로 추출하고, 나머지 수성 상을 30% HC1로 산성화시킨 다음, 클로로포름 (5 x 8 ml)으로 추출한다. 유기 상을 Na₂S0₄ 상으로 건조시키고, 여과 제거한 다음, 질소 유동 하에 용적을 5 ml로 감소시킨다. 순도는 UV 탐지 예를 들어, 방사화학 순도: 선형 분석기 (Berthold, Germany)에 의해 TLC (CHC1₃:MeOH:Hac, 9:1:0.1 v/v/v, 정지 상 HPTLC 실리카겔 60, Merck, Germany)로 평가하였으며, 반응 수율은 대략 90% (LSC에 의해 측정된 바와 같음)일 수 있다.

¹⁴C-화합물 X를 함유하는 클로로포름 용액을 합성에 직접 사용한다. 아미노산 2 내지 22개를 함유하는 수지는 상기 언급된 바와 같이 자동으로 합성할 수 있고, 이를 합성에 사용할 수 있다. 펩티드의 서열은 에드만(Edman) 분해에 의해 결정된다. TBTU 대신 HATU (0-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-l,1,3,3-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트)를 바람직하게 사용하는 것을 제외하고는, 커플링 반응을 앞서 기재된 바와 같이 수행한다. 표지되지 않은 Fmoc-L-X와의 제2 커플링을 수동으로 수행한다.

마우스에서의 약동학

각 실험에서, 300 내지 500 ㎍/kg (0.3 내지 0.5 mg/kg) [또는 예를 들어, 2.5 mg/k]의 방사성 표지된 화합물을, 정상적인 마우스 음식물 또는 동맥경화성 토마스-하르크로프트 (Thomas-Harcroft) 조절 식이 (이로써 VLDL 및 IDL 콜레스테롤이 심각하게 상승됨)가 공급된 마우스에게 복강내 주사할 수 있다. 혈장 내의 방사능을 평가하기 위해 수 차례 간격으로 혈액 샘플을 채취한다.

사람 혈청에서의 안정성

100 ㎍의 표지된 화합물을 2 ml의 신선한 사람 혈장과 혼합하고 (37℃에서), 즉시 (대조군 샘플) 또는 37℃ 하에 항온 배양한 지 8일 후에 (시험용 샘플) 탈지시킬 수 있다. 탈지는 지질을 등용적의 2:1 (v/v) 클로로포름:메탄올로 추출시킴으로써 수행한다. 이들 샘플을 역상 C_l8 HPLC 칼럼 상에 부하하고 선형 구배 (33분에 걸쳐 25 내지 58%)의 아세토니트릴 (0.1% w TFA를 함유함)로 용출시킨다. 용출 프로필에 이어 흡광도 (220nm) 및 방사능을 측정한다.

프레-β유사 입자의 형성

사람 HDL은 밀도 d = 1.21 g/ml에서 KBr 밀도 초원심 분리시킴으로써 분리하여 상부 분획을 수득한 다음, 슈퍼로스 6 겔 여과 크로마토그래피하여 HDL를 다른 지단백질로부터 분리시킬 수 있다. 분리된 HDL은, 브래드포드 (Bradford) 단백질 검정에 의해 결정된 단백질 함량을 근거로 하여 생리 식염수를 사용하여 1.0 mg/ml의 최종 농도가 되도록 조정한다. 300 ㎕ 분취량을 상기 분리된 HDL 제제로부터 제거하고, 100 ㎕의 표지된 화합물(0.2 내지 1.0 ㎍/㎕)와 함께 37℃ 하에 2시간 동안 항온 배양한다. 100 ㎕ 생리 식염수를 함유하는 블랭크와, 표지된 화합물의 4가지 희석물을 포함한, 별개의 다중항온 배양물을 분석한다. 예를 들면: (i) 0.20 ㎍/㎕ 화합물:HDL 비 = 1:15; (ii) 0.30 ㎍/㎕ 화합물:HDL 비 = 1:10; (iii) 0.60 ㎍/㎕ 화합물:HDL 비 = 1:5; 및 (iv) 1.00 ㎍/㎕ 화합물:HDL 비 = 1:3. 2시간 동안 항온 배양한 후, 200 ㎕ 분취량의 샘플 (총 용적 = 400 ㎕)을, 지단백질 분리와 분석을 위해 슈퍼로스 6 겔 여과 칼럼 상에 부하하고, 100 ㎕를 사용하여 부하된 총 방사능을 결정하였다.

매개제와 사람 지단백질과의 회합

분자 매개제와 사람 지단백질 분획과의 회합은 표지된 화합물을 각 지단백질 부류 (HDL, LDL 및 VLDL), 및 상이한 지단백질 부류의 혼합물과 함께 항온 배양함으로써 결정할 수 있다. HDL, LDL 및 VLDL은 d = 1.21 g/ml에서 KBr 밀도 구배 초원심분리시킴으로써 분리시키고, 슈퍼로스 6B 칼럼 크기 배제 칼럼 상에서 FPLC에 의해 정제한다 (크로마토그래피는 0.7 ml/분의 유속을 이용하고, 1 mM Tris (pH 8), 115 mM NaCl, 2 mM EDTA 및 0.0% NaN₃의 수행 완충액을 이용하여 수행한다). 표지된 화합물을 37℃ 하에 2시간 동안 1:5 (질량 비)의 화합물:인지질 비로 HDL, LDL 및 VLDL과 함께 항온 배양한다. 요구되는 양의 지단백질 (1000 ㎍을 생성시키는데 필요한 양을 기준으로 한 용적)을 0.2 ml의 펩티드 원액 (1 mg/ml)과 혼합하고, 이 용액을 0.9% NaCl을 사용하여 2.2 ml로 만들었다.

37℃ 하에 2시간 동안 항온 배양한 후, 총 방사능을 결정하기 위해 (예를 들면, 표지 동위원소에 따라서 액상 신틸레이션 계수 또는 감마 계수에 의함) 일정 분취량 (0.1 ml)을 꺼내고, 나머지 항온 배양 혼합물의 밀도를 KBr로 1.21 g/ml가 되도록 조정한 다음, 벡크만 타블레탑 (Beckman tabletop) 초원심분리기를 사용하여 TLA 100.3 회전자 내에서 샘플을 4℃하에 24시간 동안 100,000 rpm (300,000 g)으로 원심분리시킨다. 수득한 상등액을 대상으로 하여, 총 5 분획에 대해 각 샘플의 상부로부터 0.3 ml 분취량을 꺼냄으로써 분획화하고, 각 분획 0.05 ml를 계수에 사용한다. 상부의 2개 분획은 부유 지단백질을 함유하고 있고, 다른 분획 (3-5)은 용액 중의 화합물에 상응한다.

HDL 지질에 대한 선택적 결합

사람 혈장 (2 ml)을 37℃ 하에 2시간 동안 20, 40, 60, 80, 및 100 ㎍의 표지된 펩티드와 함께 항온 배양한다. 밀도를 1.21 g/ml로 조정하고 4℃ 하에 36시간 동안 TLA 100.3 회전자에서 100,000 rpm (300,000 g)으로 원심분리시킴으로써 지단백질을 분리시킨다. 분석을 위해 상부 900 ㎕ (300 ㎕ 분획중)를 취한다. 각 300 ㎕ 분획으로부터의 50 ㎕를 대상으로 하여, 방사능에 대해 계수하고, 각 분획으로부터의 200 ㎕을 FPLC (슈퍼로스 6/슈퍼로스 12 조합 칼럼)에 의해 분석한다.

동물 모델 시스템에서 역 콜레스테롤 수송 매개제의 용도

바람직한 양태의 RCT 매개제의 효능을 토끼 또는 기타 적합한 동물 모델에서 입증할 수 있다.

인지질/화합물 복합체의 제조

인지질 (DPPC)과 화합물로 이루어진 작은 원반형 입자를 콜레이트 투석 방법에 따라서 제조한다. 인지질을 클로로포름에 용해시키고, 질소 기류 하에 건조시킨다. 화합물을 1 내지 2 mg/ml의 농도로 완충액 (식염수)에 용해시킨다. 지질막을, 콜레이트를 함유하는 완충액 (43℃)에 재용해시키고, 화합물 용액을 3:1 인지질/화합물 중량비로 가한다. 이 혼합물을 43℃ 하에 밤새 항온 배양하고, 43℃ (24시간), 실온 (24시간) 및 4℃ (24시간) 하에 투석시키는데, 이러한 온도에서 완충액 (대용적)을 3번 변화시켰다. 상기 복합체를 주사용으로 사용하기 위해 필터 멸균시키고 (0.22 ㎛) 4℃ 하에 저장할 수 있다.

화합물/인지질 입자의 분리 및 특성 확인

입자를 겔 여과 칼럼 (슈퍼로스 6 HR) 상에서 분리시킬 수 있다. 이러한 입자를 함유하는 피크의 위치는 각 분획 내의 인지질 농도를 측정함으로써 동정한다. 용출 용적으로부터, 스토크스 반경을 결정할 수 있다. 복합체 내의 화합물 농도는 페닐 알라닌 함량을 측정한 다음 (HPLC에 의함) 16시간 동안 산 가수분해시킴으로써 결정한다.

토끼 내에서의 주사

뉴질랜드산 숫컷 백색 토끼 (2.5 내지 3 kg)에게, 10 내지 15 ml를 초과하지 않는 단일 거환(single bolus) 주사제로 일정용량의 인지질/화합물 복합체 (5 또는 10 mg/체중 kg, 화합물로서 표시됨)를 복강내 주사한다. 이 동물을 조작하기 전에 약간 진정시켰다. 주사하기 전, 및 주사한 후 5, 15, 30, 60, 240 및 1440분째에 혈액 샘플 (EDTA 상에 수집됨)을 취한다. 각 샘플에 대한 적혈구 용적율 (Hct)을 결정한다. 샘플을 등분하고, 분석하기 전에 -20℃ 하에 저장한다.

토끼 혈청의 분석

총 혈장 콜레스테롤, 혈장 트리글리세라이드 및 혈장 인지질을, 시판용 검정, 예를 들면, 제조업자의 프로토콜(Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany and Biomerieux, 69280, Marcy-L'etoile, France)에 따라서 효소적으로 결정한다. 혈장을 지단백질 분획 내로 분리시킨 후에 수득된 분획의 혈장 지단백질 구배는 슈크로스 밀도 구배로 방사함으로써 결정할 수 있다. 예를 들어, 분획을 수집하고, VLDL, ILDL, LDL 및 HDL 지단백질 밀도에 상응하는 분획에서 통상적인 효소 분석함으로써 인지질과 콜레스테롤 수준을 측정할 수 있다.

바이오이소스테레를 갖는 RCT매개제의 합성

이들 화합물은 사스린 수지(4-히드록시-2-메톡시벤질 알콜, Aldrich)와 링크 아미드 MBHA 수지를 사용한 표준 SPPS 프로토콜을 사용하여 제조되었다.

합성된 화합물의 예는 다음을 포함한다:

바이오이소스테레 서열:

L-아미노산 서열 D-아미노산 서열

일반적인 분석 방법

모든 시약은 공업용 품질이다. 용매를 건조하고 표준 방법으로 정제하였다. 아미노산 유도체를 시판 공급처로부터 얻었다. 분석 TLC는 머크사 실리카겔 60 F₂₅₄의 0.2 mm층으로 코팅된 알루미늄 시트에서 수행하였고, 분취 TLC는 머크사 실리카겔 PF₂₅₄의 2 mm층으로 코팅된 20 cm X 20 cm 유리 시트에서 수행하였다. 머크사 실리카겔 60(230-400 메쉬)를 플래쉬 크로마토그래피에 사용하였다. 마이크로 핫스테이지 장치에서 융점을 측정하였으며 보정하지 않았다. ¹H NMR 스펙트럼은 기준으로 TMS 또는 용매를 사용하여 400 MHz에서 작동되는 Brucker 400 분광기에서 기록하였다. 원소분석은 미국 샌디에고 소재 NuMega Resonance Laboratories에서 실시하였다. 최종 생성물의 분취 역상 HPLC(Glison)는 유속 15 ml/분의 페노메넥스 루나 5μ C₁₈(2)(60 mm X 21.2 mm)에서 254 nm로 설정된 조정가능한 UV 검출기를 사용하여 수행하였다. CH₃CN과 H₂O의 혼합물을 구배모드(CH₃CN = 5% - 95%)의 이동상으로 사용하였다. LC/UV/ELSD/MS에 의한 분석은 PE Sciex의 API 150 EX를 사용하여 수행하였다. ESI-MS 실험은 포지티브 모드로 수행하였다.

일반 절차 A (아미드 커플링)

무수 CH₂C1₂ (20 mL)중의 산(1.05 당량), 아민 (1.00 당량), 및 HOBt(1.05 당량)의 혼합물에 Et₃N(1.5 당량)을 첨가하였다. EDCI(1.05 당량)을 첨가하고 질소하 실온에서 하룻밤 (16시간) 동안 교반시켰다. 이후 물(15 mL)을 첨가하고 실온에서 5분간 교반시켰다. 층을 분리하고 수층을 CH₂C1₂ (2 x 15 mL)로 추출하였다. 결합된 유기층을 물(15 mL), 염수 (15 mL)로 연속적으로 세정하고 건조(Na₂S0₄) 시켰다. 여과후 용매를 회전 증발기에서 제거하고 감압하에 건조하여 예측 생성물을 수득하였다.

몇몇 경우에, 휘발성 물질을 반응 완결후 회전증발기에서 제거하고, 잔류물을 실온에서 15분동안 물(25 mL)로 교반하였다. 불균일한 혼합물을 여과, 물(3 x 25 mL)로 세정하고 건조한후 목적 아미드를 수득하였다.

일반 절차 B (Fmoc 탈보호)

CH₂C1₂ (20 mL)중의 N-Fmoc 유도체(1.0 mmol)에 4-아미노메틸피페리딘(4-AMP) (5 mL)을 첨가하고 실온에서 16시간동안 교반시켰다. 휘발성 물질을 회전 증발기에서 제거하였다. 조물질을 CH₂C1₂(50 mL)에 흡수시키고 포스페이트 완충액 pH5.5 (4 x 25 mL), 물 (25 mL), 염수 (25 mL)로 연속적으로 세정하고 건조(Na₂S0₄)시켰다. 여과후 용매를 회전 증발기에서 제거하고 감압하에 건조하여 예측한 아민 생성물을 수득하였다.

일반 절차 C (아민과 산 무수물의 반응)

THF (25 mL)중의 아민 (1.0 mmol)에 산 무수물 (1.5 to 2.0 mmol)을 첨가하고 질소하 실온에서 24시간동안 교반시켰다. 휘발성 물질을 회전 증발기에서 제거하였다. 조 물질을 다음 반응에 사용하거나 역상 HPLC 컬럼으로 정제하였다.

일반 절차 D (N-Boc 기의 탈보호)

질소하 실온에서 N-Boc 유도체 (1.0 mmol)를 1:1 트리플루오로아세트산(TFA) /CH₂Cl₂ (10 mL)중에 4시간동안 교반시켰다. 휘발성 물질을 회전증발기에서 제거하였다. 조 물질을 수성 NaHC0₃ (15 mL) (주의! C0₂ 가스 발생)으로 1시간동안 교반시켰다. 일부 경우에, 고체를 수득하기위해, 보다 긴 교반시간이 할수도 있었다. 고체를 여과하고 물(3 x 25 mL)로 세정한후 건조하여 유리아민을 수득하였다.

NaHC0₃에 의한 교반시 고체가 형성되지 않거나 물질이 점착성일 경우, 생성물을 CH₂Cl₂ (2 x 25 mL)로 추출하고 결합된 유기물질을 이후 물 (25 mL), 염수 (25 mL)로 세정하고 건조(Na₂S0₄)하였다. 여과후 용매를 회전 증발기에서 제거하고 감압하에 건조하여 예측한 아민 생성물을 수득하였다.

일반 절차 E (에스테르 가수분해)

MeOH-THF (3:2,15 mL)중의 에스테르 (1.0 mmol)의 교반 용액에 수성 1 N NaOH (4.0 mL, 4.0 mmol)을 첨가하고 질소하에 실온에서 하룻밤동안(16 h) 교반시켰다. 이후 휘발성 물질을 회전 증발기에서 제거하고 2M NaHS0₄ (2 mL)을 첨가하여 염기를 중화시켰다. 산을 EtOAc (3 x 15 mL)로 추출하였다. 결합된 유기추출물을 물 (20 mL), 염수(20 mL)로 연속적으로 세정하고 건조(Na₂S0₄)시켰다. 여과후 용매를 회전 증발기에서 제거하고 감압하에 건조하여 산 생성물을 수득하였다.

일반 절차 F (아민의 구아니디닐화)

CHC1₃ (15 mL)중의 아민 (1.0 mmol) 용액에 Et₃N(1.5 mmol)을 첨가한후 1,3-디-Boc-2-(트리플루오로메틸술포닐)구아니딘(Goodman 시약)(1.5 mmol)을 첨가하였다. 균일 반응물을 질소하 실온에서 3일간 교반시킨후, 추가적인 양의 Et₃N (1.5 mmol)와 1,3-디-Boc-2-(트리플루오로술포닐)구아니디닌(1.5 mmol)을 첨가하고 3일이상 교반시켰다. 이 반응 내용물을 2 M NaHS0₄ (10 mL), 수성 NaHC0₃ (10 mL) 및 염수 (10 mL)로 연속적으로 세정하였다. 용매를 증발건조시켜 비스-Boc-구아니딘 유도체를 수득하였다.

일반 절차 G (니트로기의 환원)

아르곤하 MeOH (25 mL) 또는 MeOH-THF (2:1, 25 mL)중의 니트로 화합물(1.0 mmol)의 용액에 10 % Pd/C (0.075 g)을 첨가하였다. 이 반응물을 수소 발룬으로 하룻밤 (16 h)동안 교반시켰다. 이후 반응물을 탈기, 아르곤으로 퍼지, 셀라이트® 545 패드를 통해 여과시켰다. 반응 플라스크를 MeOH로 헹구고 필터 케이크를 통해 통과시켰다. 결합된 세정물을 농축하여 아민 생성물을 수득하였다.

4-(1-(4-구아니디노부틸카르바모일)-2-(1-메틸-lH-인돌-3-일)에틸카르바모일)부탄산

175 mL H₂0-디옥산 (1: 2)중의 라세미성 2-아미노-3-(l-메틸-lH-인돌-3-일) -프로판산(2.10 g, 9.62 mmol)과 NaHC0₃의 교반 현탁액에 Fmoc-OSu을 첨가하고 실온에서 교반시켰다(스킴 5). 휘발성 물질을 회전 증발기에서 제거시키고 잔류물을 100 mL 얼음-물에 흡수시키고 5N HCI (수성)으로 pH ~ 3.0으로 산성화시켰다. 침전물을 여과하고 물(3 x 50 mL)로 세정, 건조 및 에테르로 가루화시켜 황색 또는 회색을 띤 백색(off-white)의 보풀보풀한 (fluffy) 고체로서 2-(Fmoc-아미노)-3-(l-메틸-lH-인돌-3-일)-프로판산(3.40 g, 80 %)을 수득하였다.

일반절차 A에 따라 2-(Fmoc-아미노)-3-(l-메틸-lH-인돌-3-일)-프로판산 (0.463 g, 1.05 mmol)을 (N^2,3-디-t-부톡시카르보닐)아그마틴(0.331 g, 1.00 mmol), EDCI (0.23 g, 1.20 mmol), HOBt (0.142 g, 1.05 mmol) 및 Et₃N (0.152 g, 1.50 mmol)과 반응시켰다. N-Fomc-(1-(4-(N^2,3-디-t-부톡시카르보닐)구아니디노부틸카르바모일)-2-(1-메틸-lH-인돌-3-일)에틸아민)이 81 % 수율(0.64 g)로 분리되었다.

일반 절차 B에 따라 상기 N-Fmoc 유도체(1.10 g, 1.46 mmol)을 피페리딘 (5 mL)으로 처리하여 조 물질 1.28 g을 수득하였다. 이것은 Fmoc-유도된 부생성물로 오염되어 있으며, 더 이상 정제하지 않고 다음 단계에 사용하였다.

일반 절차 C에 따라 THF (10 mL)중의 상기 조 아민[1-(4-(N^2,3-디-t-부톡시카르보닐)구아니디노부틸카르바모일)-2-(1-메틸-1H-인돌-3-일)에틸아민)] (0.36 g, 0.68 mmol)을 글루타르산 무수물 (0.116 g, 1.02 mmol)로 반응시켰다. 일반 절차 D에 따라 조 물질 (비스-Boc 유도체)을 TFA로 처리하였다. 휘발성 물질을 회전 증발기에서 제거하였다. 조 물질을 DMSO에 흡수시키고 1시간동안 NaHC0₃ (0.15 g)로 처리시켰다. 이후, 최소량의 물 (0.7 mL)을 첨가하고 주사기 필터-디스크(Whatman, PTFE, 0.45 ㎛, 13 mm)를 통해 통과시킨후 역상 HPLC 컬럼으로 정제하였다. 순수한 물질의 분획을 결합시키고 동결건조시켜 백색 고체로서 0.03 g의 4-(1-(4-구아디노부틸카르바모일)-2-(1-메틸-1H-인돌-3-일)에틸카르바모일)부탄산을 수득하였다. Mp 291 ℃ HPLC [페노메넥스 루나 5μ C₁₈ (2) (구배,CH₃CN/H₂0), φ = 15 mL/분] t_R = 7.53 분 (CH₃CN-H₂0 = 45: 55). ¹H NMR (DMSO-d₆, δ in ppm) : 9.97 (s, 1 H), 8.12 (d, J = 4.0 Hz, 1 H), 8.02 (d, J =8. 8 Hz, 1 H), 7.58 (d, 8.4 Hz, 1 H), 7.35 (d, J = 7.2 Hz, 1 H), 7.04 (t, J = 7.4 Hz, 1 H), 7.00 (s, 1 H), 6.92 (d, J = 7.4 Hz, 2 H), 4.37 (dt, J = 8.8, 4.0 Hz, 1 H), 3.63 (s, 3 H), 3.30 - 3.00 (m, 3 H), 2.95 - 2.85 (m, 3 H), 2.15 - 2.08 (m, 1 H), 1.94 - 1.85 (m, 2 H), 1.81 - 1.74 (m, 1 H), 1.68 - 1.52 (m, 3 H), 1.42 - 1.34 (m, 3 H). MS: [EI] m/e 445.5[M+H]⁺. 분석치:: (C₂₂H₃₂N₆0₄ + 1.89 H₂0 + 0.18 CF₃C0₂H) C, H, N.

(R)-N-[1-(4-아미노- 페닐카르바모일 )-2- 페닐 -에틸]- 테레프탈암산 메틸 에스테르｝

일반 절차 A에 따라 Fmoc-D-Phe-OH (3.50 g, 9.0 mmol)을 무수 CH₂C1₂ (50 mL)중의 N- Boc-p-페닐렌디아민 (1.79 g, 8.6 mmol), HOBt (1.22 g, 9.0 mmol), Et₃N (1.04 g, 10.3 mmol), 및 EDCI (1.73 g, 9.0 mmol)에 반응시켰다(스킴 6). 휘발성 물질을 회전 증발기에서 제거시키고 실온에서 잔류물을 물(25 mL)로 15분간 교반시켰다. 황색 또는 회색을 띤 백색의 고체를 여과하고 물(3 x 25 mL)로 세정시키고 건조하여 85.6 % (4.47 g) 수율로 (R)-｛2-벤질-N-(4-t- 부톡시카르보닐아미노-페닐)-말로남산 9H-플루오렌-9-일메틸 에스테르｝를 수득하였다.

일반 절차 B에 따라 상기 Fmoc-유도체(2.1 g, 3.63 mmol)를 4-AMP (2.07 g, 18.2 mmol)로 60시간동안 처리하였다. 추출작업과 증발시, 담황색 고체로서 (R)-｛[4-(2-아미노-3-페닐-프로피오닐아미노)-페닐]-카르밤산 t-부틸 에스테르｝(1.1 g, 85 %)를 수득하였다.

이후, 일반 절차 A에 따라 모노-메틸 테레프탈레이트(0.51 g, 2.8 mmol)를 무수 CH₂C1₂ (20 mL)중의 (R)-｛[4-(2-아미노-3-페닐-프로피오닐아미노)-페닐]-카르밤산 t-부틸 에스테르｝(1.00 g, 2.8 mmol), HOBt (0.38 g, 2.8 mmol), Et₃N (0.34 g, 3.4 mmol), 및 EDCI (0.54 g, 2.8 mmol)와 반응시켰다. 휘발성 물질을 회전 증발기에서 제거시키고 실온에서 잔류물을 물(15 mL)로 15분간 교반시켰다. 불균일한 혼합물을 여과시키고 물(3 x 25 mL)로 세정한후 건조시켜 담황색 고체로서 목적하는 아미드(R)-｛N-[1-(4-t-부톡시카르보닐아미노-페닐카르바모일)-2-페닐-에틸]-테레프탈암산 메틸 에스테르｝(1.38 g, 94.8 %)을 수득하였다.

일반 절차 D에 따라 3시간동안 (R)-｛N-[1-(4-t-부톡시카르보닐아미노-페닐카르바모일)-2-페닐-에틸]-테레프탈암산 메틸 에스테르｝(1.0 g, 1.93 mmol)의 N-Boc기를 탈보호시켰다. 고체를 여과, 물(3 x 25 mL)로 세정하고 건조시켜 유리 아닐린(0,76 g, 94 %)을 수득하였다. 이 아민을 또한 스킴 7에 나타난 바와 같이 니트로 화합물의 환원에 의해 제조하였다. 조 물질 0.075 g을 최소부피의 DMSO (1.2 mL)에 용해시키고 주사기 필터-디스크(Whatman, PTFE, 0.45 ㎛, 13 mm)를 통과시킨후 역상 HPLC 컬럼〔HPLC [페노메넥스 루나 5μ C₁₈ (2) (구배,CH₃CN/H₂0), φ= 15 mL/분] t_R = 9.10 분 (CH₃CN-H₂0 = 55: 45)〕으로 정제하였다. 순수한 물질을 함유한 분획을 결합시키고 동결건조시켜 담황색 고체로서 0.048 g의 (R)-｛N-[1-(4-아미노-페닐카르바모일)-2-페닐-에틸]- 테레프탈암산 메틸 에스테르｝를 수득하였다. Mp 240-2 ℃ ¹H NMR(CDC1₃, δ in ppm) : 8.03 (d, J = 8.4 Hz, 2 H), 7.72 (d, J = 8.0 Hz, 2 H), 7.28 - 7.15 (m, 7 H), 6.93 (d, J = 8.8 Hz, 2 H), 4.91 - 4.82 (m, 1 H), 3.88 (s, 3 H), 3.29 (dd, J = 14.0,6.4 Hz, 1 H), 3.14 (dd, J = 14.0,8.0 Hz, 1 H). MS: [EI] m/e 418.5[M+H]⁺. 분석치: (C₂₄H₂₃N₃0₄ + 0.25 H₂0) C, H, N.

(R)-｛N-[1-(4-아미노-페닐카르바모일)-2-페닐-에틸]-테레프탈암산｝

일반 절차 E를 사용하여, 메틸(R)-｛N-[1-(4- 아미노-페닐카르바모일)-2-페닐-에틸]-테레프탈암산 메틸 에스테르｝(0.25 g, 0.60 mmol)의 에스테르를 가수분해시켰다(스킴 6). 조 반응 혼합물을 DMSO (1.5 mL)에 용해시키고 주사기 필터-디스크(Whatman, PTFE, 0.45 ㎛, 13 mm)를 통과시킨후 역상 HPLC 컬럼〔HPLC [페노메넥스 루나 5μ C₁₈ (2) (구배,CH₃CN/H₂0), φ= 15 mL/분] t_R = 3.47 분 (CH₃CN-H₂0 = 25: 75)〕으로 정제하였다. 순수한 물질을 함유한 분획을 결합시키고 동결건조시켜 표제 화합물의 Na-염 0.06 g을 수득하였다. Mp 220 ℃(분해). ¹H NMR (DMSO-d₆, δ in ppm): 9.88 (s, 1 H), 8.61 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.85 (d, J = 9.2 Hz, 2 H), 7.73 (d, J = 8.8 Hz, 2 H), 7.44 (d, J = 7.6 Hz, 2 H), 7.26 - 7.18 (m, 4 H), 7.11 (d, J= 7.4 Hz, 2 H), 6.54 (d, J= 7.6 Hz, 2 H), 4.82 (br. s, I H), 4.73 - 4.68 (m, 1 H), 3.07 - 3.01 (m, 2 H). MS: [EI] m/e 404.5 [M(상응하는 산)+H]⁺. 분석치:(C₂₃H₂₀N₃Na0₄ + 2.4 H₂0 + 0.06 CF₃C0₂Na) C, H, N.

(R)-｛(N-〔 l -(4-구아니디노-페닐카르바모일)-2-페닐-에틸〕-테레프탈암산｝

일반 절차 F에 따라, (R)-｛N-[1-(4-아미노- 페닐카르바모일)-2-페닐-에틸]-테레프탈암산 메틸 에스테르｝(0.30 g, 0.72 mmol)중의 아민을 1,3-디-Boc-2-(트리플루오로메틸술포닐)구아니딘 및 Et₃N과 반응시켜 90% 수율(0.427 g)로 (R)-｛N-[1-(4-(N^2,3-디-t-부톡시카르보닐)구아니디노-페닐카르바모일)-2-페닐-에틸]-테레프탈암산 메틸 에스테르｝를 수득하였다. 이것을 다음 반응에 사용하였다(스킴 6).

일반 절차 E에 따라 (R)-｛N-[1-(4-(N^2,3-디-t-부톡시카르보닐)구아니디노-페닐카르바모일) -2-페닐-에틸]-테레프탈암산 메틸 에스테르｝(0.40 g, 0.61 mmol)의 에스테르기를 가수분해시켰다. N^2,3-디-t-부톡시카르보닐기를 함유한 조 반응 혼합물(0.45 g)을 일반 절차 D에 따라 5시간동안 진행하였다. 농축된 조 물질을 DMSO (1.5 mL)에 용해시키고 주사기 필터-디스크(Whatman, PTFE, 0.45 ㎛, 13 mm)를 통과시킨후 역상 HPLC 컬럼으로 정제하였다. 순수한 물질을 함유한 분획을 결합시키고 동결건조시켜 백색 고체로서 0.095 g의 (R)-｛N-[1-(4-구아니디노-페닐카르바모일)-2-페닐-에틸]-테레프탈암산｝을 수득하였다. HPLC [페노메넥스 루나 5μ C₁₈ (2) (구배,CH₃CN/H₂O), φ = 15 mL/분] t_R = 6.20 분 (CH₃CN-H₂0 = 25:75). Mp 242 ℃(분해). ¹H NMR (DMSO-d₆, δ in ppm) : 10.92 (br. s, 1 H), 10.39 (s, 1 H), 8.55 (d, J= 7.6 Hz, 1 H), 7.91 (d, J = 8.4 Hz, 2 H), 7.79 (d, J= 8.4 Hz, 2 H), 7.77 (br. s, 3 H), 7.67 (d, J= 8.8 Hz, 2 H), 7.39 (d, J = 7.2 Hz, 2 H), 7.27 (t, J = 7.6 Hz, 2 H), 7.18 (d, J = 8.8 Hz, 2 H), 7.17 (t, J = 7.2 Hz, 1 H), 4.82 (겉보기 q, J= 6.0 Hz, 1 H), 3.15 - 3.04 (m, 2 H). MS: [EI] m/e 446.4[M+H]⁺ . 분석치:(C_24.6H_27.6F_0.9N₅Na_0.3O_6.9) C, H, N.

(S)-｛N-[1-(4-아미노-페닐카르바모일)-2-비페닐-4-일-에틸]-테레프탈암산}

일반 절차 A에 따라 Boc-L-Bip-OH (3.00 g, 8.8 mmol)를 무수 CH₂C1₂ (50 mL)중의 p-니트로아닐린 (1.34 g, 9.7 mmol), HOBt (1.19 g, 8.8 mmol), Et₃N (1.07 g, 10.5 mmol), 및 EDCI (1.68 g, 8.8 mmol)과 반응시켰다(스킴 8). 휘발성 물질을 회전 증발기에서 제거하고 실온에서 잔류물을 물(50 mL)로 15분간 교반시켰다. 고체를 여과하고, 물(2 x 25 mL)로 세정하고 건조시켜 84 % 수율(4.4 g)로 (S)-{[1-(4-니트로-페닐카르바모일)-2-비페닐-4-일-에틸]- 카르밤산 t-부틸 에스테르}를 수득하였다.

일반 절차 D에 따라 상기 Boc-유도체 (2.1 g, 3.63 mmol)를 TFA로 처리하였다. 여과, 물 세정 및　건조시, 담황색 고체로서 (S)-{2-아미노-3-비페닐-4-일-N- (4-니트로-페닐)-프로피온아미드｝(1.75 g, 97 %)를 수득하였다.

이후, 일반절차 A에 따라 모노-메틸 테레프탈레이트 (0.90 g, 5.02 mmol)를 무수 CH₂C1₂(20 mL)중의 상기 아민 (1.65 g, 4.56 mmol), HOBt (0.68 g, 5.02 mmol), Et₃N (0.55 g, 5.48 mmol), 및 EDCI (0.96 g, 5.02 mmol)과 반응시켰다. 휘발성 물질을 회전 증발기에서 제거하고 실온에서 잔류물을 물(15 mL)로 15분간 교반시켰다. 불균일한 혼합물을 여과하고, 물(3 x 25 mL)로 세정한후 건조하여 담황색 고체로서 (S)-{N-[l-(4-니트로-페닐카르바모일)-2-비페닐-4-일-에틸]-테레프탈암산 메틸 에스테르} (2.23 g, 93 %)를 수득하였다.

일반 절차 G에 따라 상기 니트로 화합물(0.90 g, 1.72 mmol)을 MeOH-THF (2: 1, 25 mL)중에 환원시켜 (S)-{N-[1-(4-아미노-페닐카르바모일) -2-비페닐-4-일-에틸]-테레프탈암산 메틸 에스테르} (0.81 g, 95 %)을 수득하였다.

일반 절차 E를 사용하여, (S)-{N-[1-(4-아미노- 페닐카르바모일)-2-비페닐-4-일-에틸]-테레프탈암산 메틸 에스테르} (0.12 g, 0.24 mmol)를 가수분해시켰다. 조 반응 혼합물을 DMSO (1.5 mL)에 용해시키고 주사기 필터-디스크(Whatman, PTFE, 0.45 ㎛, 13 mm)를 통과시킨후 역상 HPLC 컬럼에 의해 정제하였다. 순수한 물질을 함유한 분획을 결합시키고 동결건조시켜 황색 또는 회색을 띤 백색의 고체로서 표제 화합물의 Na-염 0.03 g을 수득하였다. HPLC [페노메넥스 루나 5μ C₁₈ (2) (구배,CH₃CN/H₂O), φ= 15 mL/분] t_R = 8.92 분 (CH₃CN-H₂0 = 55: 45). Mp 251℃ (분해). ¹H NMR (DMSO-d₆,δin ppm) : 9.98 (s, 1 H), 8.97 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 8.00 (d, J = 8.8 Hz, 2 H), 7.97 (d, J = 8.4 Hz, 2 H), 7.61 (d, J =8.8 Hz, 2 H), 7.58 (d, J = 7.2 Hz, 2 H),7.48 (d, J = 8.0 Hz, 2 H), 7.40 (d, J = 8.2 Hz, 2 H), 7.32 (t, J= 7.6 Hz, 1 H), 7.30 (d, J= 7.0 Hz, 2 H), 6.68 (d, J= 8.4 Hz, 2 H), 4.89 - 4.83 (m, 1 H), 3.16 - 3.06 (m, 2 H). MS: [EI] m/e 480.4 [M(상응하는 산)+H]⁺. 분석치: (C₂₉H_27.2N₃NaO_5.6) C, H, N.

(S)-{N-〔2-비페닐-4-일-l-(4-구아니디노-페닐카르바모일)-에틸〕-테레프탈암산}

일반 절차 F에 따라, (S)-{N-[1-(4-아미노-페닐카르바모일) -2-비페닐-4-일-에틸]-테레프탈암산 메틸 에스테르} (0.23 g, 0.466 mmol)를 1,3-디-Boc-2- (트리플루오로메틸술포닐)구아니디닌〔2x (0.54 g, 1.4 mmol) ] 및 Et₃N [2 x (0.14 g, 1.4 mmol) ]과 반응시켜 87.5 % 수율 (0.30 g)로 (S)-{N-[1-(4-(N^2,3-디-t-부톡시카르보닐)구아니디노-페닐카르바모일)-2-비페닐-4-일-에틸]-테레프탈암산 메틸 에스테르}을 수득하였다. 이것을 다음 반응에 사용하였다(스킴 8).

일반 절차 E에 따라 (S)-{N-[1-(4-(N^2,3-디-t-부톡시카르보닐)구아니디노-페닐카르바모일)-2-비페닐-4-일-에틸]-테레프탈암산 메틸 에스테르} (0.29 g, 0.39 mmol)중의 에스테르기를 가수분해시켰다. N-Boc 기를 함유한 조 반응 혼합물을 이후 5시간동안 일반 절차 D에 따라 진행시켰다. 농축된 조 물질을 DMSO (1.5 mL)에 용해시키고 주사기 필터-디스크(Whatman, PTFE, 0.45 ㎛, 13 mm)를 통과시킨후 역상 HPLC 컬럼에 의해 정제하였다. 순수한 물질을 함유한 분획을 결합시키고 동결건조시켜 백색 고체로서 표제 산 0.06 g을 수득하였다. HPLC [페노메넥스 루나 5μ C₁₈ (2) (구배,CH₃CN/H₂0), φ = 15mL/분] t_R = 6.92 분 (CH₃CN-H₂0 = 40:60). Mp 238-40℃ (분해). ¹H NMR (DMSO-d₆, δ in ppm) : 10.85 (br. s, 1 H), 10.47 (s, 1 H), 9.05 (d, J= 6.4 Hz, 1 H), 8.02 (d, J = 7.2 Hz, 2 H), 7.94 (d, J = 7.6 Hz, 2 H), 7.79 (s, 3 H), 7.78 (d, J = 7.2 Hz, 2 H), 7.70 (t, J = 8.4 Hz, 4 H), 7.58 (d, J = 7.2 Hz, 2 H), 7.50 (t, J = 7.2 Hz, 2 H), 7.39 (t, J = 8.0 Hz, 1 H), 7.27 (d, J = 7.6 Hz, 2 H), 4.96 (q, J = 6.8 Hz, 1 H), 3.24 (d, J = 5.6 Hz, 2 H). MS: [EI] m/e 522.8[M+H]⁺. 분석치: (C₃₀H_35.2N₅O_8.1) C, H, N.

3-((R)-1-(4-(디메틸아미노)페닐카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)프로판산

일반 절차 A에 따라 Boc-D-Phe-OH (2.00 g, 7.54 mmol)를 무수 CH₂C1₂ (50 mL)중의 N,N-디메틸-p-페닐렌디아민 (0.98 g, 7.18 mmol), HOBt (1.02 g, 7.54 mmol), Et₃N (1.09 g, 10.77 mmol), 및 EDCI (1.44 g, 7.54 mmol)과 반응시켜 회색 고체로서 t-부틸(R)-1-(4-(디메틸아미노)페닐카르바모일)-2-페닐에틸카르바메이트 (2.85 g, 98.6 %)를 수득하였다(스킴 9).

일반 절차 D에 따라 상기 Boc-유도체(1.85 g, 4.82 mmol)를 TFA로 처리하였다. 여과, 물 세정 및 건조시 회색 고체로서 (R)-2-아미노-N-(4-(디메틸아미노)페닐)-3-페닐프로판아미드(1.29 g, 94 %)를 수득하였다.

일반 절차 C에 따라 THF (5 mL)중의 상기 아민 (0.12 g, 0.42 mmol)을 숙신산 무수물(0.051 g, 0.51 mmol)과 반응시켰다. 조 물질을 DMSO (1.5 mL)에 흡수시키고 주사기 필터-디스크(Whatman, PTFE, 0.45 ㎛, 13 mm)를 통과시킨후 역상 HPLC 컬럼에 의해 정제하였다. 순수한 물질을 함유한 분획을 결합시키고 동결건조시켜 회백색 고체로서 0.105 g의 3-((R)-1-(4-(디메틸아미노)페닐카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)프로판산을 수득하였다. HPLC[페노메넥스 루나 5μ C₁₈ (2) (구배,CH₃CN/H₂O), φ= 15mL/분] t_R = 8.32 분(CH₃CN-H₂0 = 45: 55). Mp 197-8℃. ¹H NMR (DMSO-d₆,δin ppm): 12.21 (br. s, 1 H), 9.86 (s, 1 H), 8.42 - 8.25 (m, 1 H), 7.50 - 7.25 (m, 9 H), 6.89 (br. s, 1 H), 4.69 - 4.61 (m, 1 H), 3.16-3.04 (m, 2 H), 2.95 (s, 6 H), 2.45 - 2.33 (m, 4 H). MS: [EI] m/e 384.4[M+H]⁺. 분석치: (C₂₁H_25.5N₃O_4.25) C, H, N.

4-((R)-1-(4-(D-디메틸아미노)페닐카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)부탄산

일반 절차 C에 따라 제조되었다. 0.12 g (0.42 mmol)의 (R) -2-아미노-N-(4-(디메틸아미노)페닐)-3-페닐프로판아미드와 글루타르산 무수물(0.058 g, 0.51 mmol)로부터 0.089 g의 4-((R)-1-(4-(D-디메틸아미노)페닐카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)부탄산을 회백색 고체로서 수득하였다(스킴 9). HPLC [페노메넥스 루나 5μ C₁₈ (2) (구배,CH₃CN/H₂0), φ = 15 mL/분] t_R = 8.81 분 (CH₃CN-H₂0 = 48:52). Mp 205-7℃. ¹H NMR(DMSO-d₆, δ in ppm) : 12.21 (br. s, 1 H), 9.86 (s, 1 H), 8.42 - 8.25 (m, 1 H), 7.50 - 7.25 (m, 9 H), 6.84 (br. t, J = 8.2 Hz, 1 H), 4.69 - 4.61 (m, 1 H), 3.16-2.95 (m, 2 H), 2.93 (s, 6 H), 2.15 (t, J= 6.6 Hz, 4 H), 1.68 (t, J= 6.6 Hz, 2 H). MS: [EI] m/e 398.5[M+H]⁺. 분석치: (C₂₂H_27.5N₃0_4.25) C, H, N.

4-((R)-1-(4-(디메틸아미노)페닐카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)-3,3-디메틸부탄산

일반 절차 C에 따라 제조하였다. 0.12 g의 (R) -2-아미노-N-(4-(디메틸아미노)페닐)-3-페닐프로판아미드와 3,3-(디메틸)글루타르산 무수물(0.072 g, 0.51 mmol)로부터 0.10 g의 목적하는 산을 회백색 고체로서 수득하였다(스킴 9). HPLC [페노메넥스 루나 5μ C₁₈ (2) (구배,CH₃CN/H₂0), φ = 15 mL/분] t_R = 9.60 분 (CH₃CN-H₂0 = 55: 45). Mp 85-6℃. ¹H NMR (DMSO-d₆,δin ppm) : 12.21 (br. s, 1 H), 9.86 (s, 1 H), 8.42 - 8.25 (m, 1 H), 7.50 - 7.25 (m, 9 H), 6.84 (br. t, J= 8.2 Hz, 1 H), 4.69 - 4.61 (m, 1 H), 3.16-2.95 (m, 2 H), 2.93 (s, 6 H), 2.26 - 2.14 (m, 4 H), 0.92 (s, 6 H). MS: [EI] m/e 426.5[M+H]⁺. 분석치: (C_24.2H_32.3N_3.1O_4.5) C, H, N.

4-((R)-1-(4-(디메틸아미노)페닐카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)-3,3- (테트라메틸렌)부탄산의 합성

일반 절차 C에 따라 제조하였다. 0.12 g의 (R)-2-아미노-N-(4-(디메틸아미노)페닐)-3-페닐프로판아미드 및 3,3-(테트라메틸렌)글루타르산 무수물(0.085 g, 0.51 mmol)로부터, 0.076 g의 목적하는 산을 회색 고체로서 수득하였다(스킴 9). HPLC [페노메넥스 루나 5μ C₁₈ (2) (구배,CH₃CN/H₂0), φ = 15mL/분] t_R = 9.54 분 (CH₃CN-H₂0 = 62: 38). Mp 91-2℃. ¹H NMR (DMSO-d₆,δin ppm) : 12.21 (br. s, 1 H), 9.86 (s, 1 H), 8.42 - 8.25 (m, 1 H), 7.50 - 7.25 (m, 9 H), 6.84 (br. s, 1 H), 4.83 (겉보기 q, J = 7.4 Hz, 1 H), 3.20-3.02 (m, 2 H), 2.91 (s, 6 H), 2.27 (s, 2 H), 2.23 (d, J= 13.2 Hz, 1 H), 2.09 (d, J= 13.2 Hz, 1 H), 1.55 - 1.30 (m, 8 H). MS: [EI] m/e 452.4[M+H]⁺. 분석치: (C₂₆H3_3.5N₃O_4.25) C, H, N.

4-((R)-1-(4-(디메틸아미노)페닐카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)-3,3-(펜타메틸렌)부탄산

일반 절차 C로부터 제조하였다. 0.12 g의 (R)-2-아미노-N-(4-(디메틸아미노)페닐)-3-페닐프로판아미드와 3,3-(펜타메틸렌) 글루타르산 무수물(0.092 g, 0.51 mmol)로부터 0.119 g의 목적하는 산을 회백색 고체로서 수득하였다(스킴 9). HPLC [페노메넥스 루나 5μ C₁₈ (2) (구배,CH₃CN/H₂0), φ = 15mL/분] t_R = 11.02 분 (CH₃CN-H₂0 = 66: 34). Mp 110-1℃. ¹H NMR (CDCl₃+DMSO-d₆,δin ppm) : 12.21 (br. s, 1 H), 9.86 (s, 1 H), 8.42 - 8.25 (m, 1 H), 7.50 - 7.25 (m, 9 H), 6.84 (br. s, 1 H), 4.83 (겉보기 q, J = 7.4 Hz, 1 H), 3.20-3.02 (m, 2 H), 2.83 (s, 6 H), 2.27 (s, 2 H), 2.32 - 2.11 (m, 4 H), 1.32 (br. s, 6 H), 1.21 (br. s, 2 H), 1.11 (br. s, 2 H). MS: [EI] m/e 466.6[M+H]⁺. 분석치: (C_27.12H_35.4F_0.18N₃Na_0.06O_4.32) C, H, N.

3-((R)-1-(4-(디메틸아미노)벤질카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)프로판산

일반 절차 A에 따라 Boc-D-Phe-OH (2.00 g, 7.54 mmol)를 무수 CH₂C1₂ (50 mL)중의 4-N,N-디메틸아미노벤질아민 디히드로클로라이드(1.60 g, 7.18 mmol), HOBt (1.02 g, 7.54mmol), Et₃N (2.54 g, 25.1 mmol), 및 EDCI (1.44 g, 7.54 mmol)과 반응시켜 황색 또는 회색을 띤 백색의 고체로서 t-부틸(R)-l-(4-(디메틸 아미노) 벤질카르바모일)-2-페닐에틸카르바메이트 (2.79 g, 95.5 %)을 수득하였다(스킴 10).

일반 절차 D에 따라, 상기 t-부틸(R)-1-(4-(디메틸아미노)벤질카르바모일)-2-페닐에틸카르바메이트(1.80 g, 4.53 mmol)를 TFA로 처리하였다. 여과, 물 세정 및 건조후, 담황색 고체로서 유리 아민[(R)-N-(4- (디메틸아미노)벤질) )-2-아미노-3-페닐프로판아미드](1.30 g, 96.5%)을 수득하였다.

일반 절차 C에 따라, THF (5 mL)중의 (R)-N-(4-(디메틸아미노)벤질-2-아미노-3-페닐프로판아미드(0.12 g, 0.40 mmol)를 숙신산 무수물(0.048 g, 0.48 mmol)과 반응시켰다. 조 물질을 DMSO (1.5 mL)에 흡수시키고 주사기 필터-디스크(Whatman, PTFE, 0.45 ㎛, 13 mm)를 통과시킨후 역상 HPLC 컬럼에 의해 정제하였다. 순수한 물질을 함유한 분획을 결합시키고 동결건조시켜 백색 고체로서 0.10 g의 3-((R)-l-(4-(디메틸아미노)벤질카르바모일)-2- 페닐에틸카르바모일) 프로판산을 수득하였다. HPLC [페노메넥스 루나 5μ C₁₈ (2) (구배,CH₃CN/H₂0), φ = 15 mL/분] t_R = 8.03 분 (CH₃CN-H₂0 = 45: 55). Mp 194-6℃. ¹H NMR(DMSO-d₆, δ in ppm) : 12.18 (br. s, 1 H), 8.36 (br. s, 1 H), 8.10 (d, J= 8.0 Hz, 1 H), 7.25 - 7.15 (m, 5 H), 6.95 (d, J= 7.2 Hz, 2 H), 6.67 (br. s, 1 H), 4.44 - 4.28 (m, 1 H), 4.08 (s, 2 H), 3.00 (d, J = 12.4 Hz, 1 H), 2.69 (dd, J = 12.4,7.8 Hz, 1 H), 2.91 (s, 6 H), 2.45 - 2.22 (m, 4 H). MS: [EI] m/e 398.5 [M+H]⁺. 분석치: (C₂₂H_28.56N₃0_4.78) C, H, N.

4-((R)-1-(4-(디메틸아미노)벤질카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)부탄산

일반절차 C에 따라 제조하였다. 0.12 g의 (R)-N-(4-(디메틸아미노)벤질)-2-아미노-3-페닐프로판아미드 및 글루타르산 무수물(0.055 g, 0.48 mmol)로부터 백색 고체로서 목적하는 산 0.086 g을 수득하였다(스킴 10).

HPLC [페노메넥스 루나 5μ C₁₈ (2) (구배,CH₃CN/H₂0), φ = 15mL/분] t_R = 7.97 분 (CH₃CN-H₂0 = 47:53). Mp 208-9℃. ¹H NMR (DMSO-d₆, δ in ppm) : 12.18 (br. s, 1 H), 8.42 (br. s, 1 H), 8.04 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.25 - 7.15 (m, 5 H), 6.95 (d, J = 7.6 Hz, 2 H), 6.65 (br. s, 1 H), 4.44 (겉보기 q, J = 8.4 Hz, 1 H), 4.19 (d, J = 4.4 Hz, 2 H), 2.90 (dd, J = 13.6, 4.4 Hz, 1 H), 2.91 (s, 6 H), 2.65 (dd, J= 12.6,10.8 Hz, 1 H), 2.16 (겉보기 t, J= 7.0, 4 H), 1.54 (겉보기 t, J = 7.0,2 H). MS: [EI] m/e 412.5[M+H]⁺. 분석치:(C₂₃H_29.66N₃0_4.33) C, H, N.

4-((R)-1-(4-(디메틸아미노)벤질카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)-3,3- 디메틸부탄산

상기 물질을 일반절차 C에 따라 제조하였다. 0.12 g 의 (R)-N-(4-(디메틸아미노)벤질)-2-아미노-3-페닐프로판아미드와 3,3-(디메틸)글루타르산 무수물(0.069 g, 0.48 mmol)로부터, 백색 고체로서 목적하는 산 0.097 g을 수득하였다(스킴 10). HPLC [페노메넥스 루나 5μ C₁₈ (2) (구배,CH₃CN/H₂0), φ= 15 mL/분] t_R = 9.55 분 (CH₃CN-H₂0 = 55: 45). Mp 76-7℃. ¹H NMR(CDC1₃, δin ppm) : 7.48 (d, J= 7.6 Hz, 1 H), 7.18 - 7.11 (m, 6 H), 6.92 (d, J = 8.4 Hz, 2 H), 6.67 (br. s, 2 H), 6.43 (br. s, 1 H), 4.44 (겉보기 q, J= 7.6 Hz, 1 H), 4.16 (d, J= 4.8 Hz, 2 H), 3.05 - 2.95 (m, 2 H); 2.85 (s, 6 H), 2.18 (d, J = 2.4 Hz, 2 H), 2.16 (d, J = 13.0, 1 H), 2.04 (d, J = 13.0,1 H), 0.92 (s, 3 H), 0.87 (s, 3 H). MS: [EI] m/e 440.6[M+H]⁺. 분석치: (C₂₅H₃₃N₃0₄) C, H, N.

4-((R)-1-(4- (디메틸아미노) 벤질카르바모일 )-2- 페닐에틸카르바모일 )-3,3- ( 테트라메틸렌 )부탄산

상기 물질을 일반 절차 C에 따라 제조하였다. 0.12 g의 (R)-N-(4-(디메틸아미노)벤질)-2-아미노-3-페닐프로판아미드와 3,3-(테트라메틸렌)글루타르산 무수물(0.081 g, 0.48 mmol)로부터, 백색 고체로서 0.105 g의 목적하는 산을 수득하였다(스킴 10). HPLC [페노메넥스 루나 5μ C₁₈ (2) (구배,CH₃CN/H₂0), φ = 15mL/분] t_R = 9.56 분 (CH₃CN-H₂0 = 62: 38). Mp 88-90℃. ¹H NMR (CDCl₃,δin ppm) : 7.60 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 7.18 - 7.13 (m, 6 H), 6.91 (d, J = 8.4 Hz, 2 H), 6.62 (d, J = 8.0 Hz, 2 H), 4.66 (겉보기 q, J = 7.8 Hz, 1 H), 4.15 (two sets of dd, J = 14.4, 5.6 Hz, 2 H), 3.05 - 2.94 (m, 2 H), 2.84 (s, 6 H), 2.29 (d, J= 13.6 Hz, 1 H), 2.18 (겉보기 t, J = 12.2,2 H), 2.04 (d, J = 13.6,1 H), 1.53 (br. s, 4 H), 1.40 (br. s, 2 H), 1.31 (br. s, 2 H). MS: [EI] m/e 466.6[M+H]⁺. 분석치:(C₂₇H_35.5N₃O_4.25) C, H, N.

4-((R)-1-(4-(디메틸아미노)벤질카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)-3,3- (펜타메틸렌)부탄산

상기 물질을 일반 절차 C에 따라 제조하였다. 0.12 g의 (R)-N-(4-(디메틸아미노)벤질)-2-아미노-3-페닐프로판아미드와 3,3-(펜타메틸렌) 글루타르산 무수물(0.088 g, 0.48 mmol)로부터 백색 고체로서 0.12 g의 목적하는 산을 수득하였다(스킴 10). HPLC [페노메넥스 루나 5μ, C₁₈ (2) (구배, CH₃CN/H₂O), φ= 15 mL/분] t_R = 9.57 분 (CH₃CN-H₂0 = 66:34). Mp 100-2℃. ¹H NMR (CDC1₃, δ in ppm) : 7.37 (br., 1 H), 7.18 - 7.11 (m, 6 H), 6.95 (br. t, J= 6.8 Hz, 2 H), 6.68 (br. s, 2 H), 6.43 (br. s, 1 H), 4.66 (겉보기 t, J= 7.2 Hz, 1 H), 4.17 (br. s, 2 H), 3.05 - 2.95 (m, 2 H), 2.86 (s, 6 H), 2.25 - 2.12 (m, 4 H), 1.32 (br. s, 6 H), 1.21 (br. s, 2 H), 1.11 (br. s, 2 H). MS: [EI] m/e 480.5[M+H]⁺. 분석치: (C₂₈H_37.5N₃O_4.25) C, H, N.

(S)-｛4-[2-(9H-플루오렌-9-일옥시카르보닐아미노)-2-페닐-아세틸아미노]-페닐｝-카르밤산 t-부틸 에스테르(7B)

DMF (20 mL)중의 Fmoc-L-Phe-OH (7A, 2 g, 5 mmol) 용액에 HOBt (800 mg, 5 mmol), EDCI (1.1 g, 5.7 mmol)을 첨가하고 이 혼합물을 실온에서 20분동안 교반시켰다. N-Boc-1,4-페닐렌 디아민(1.1 g, 5 mmol)을 첨가한후 TEA (525 mg, 724 uL)을 첨가하고 이 혼합물을 실온에서 5시간동안 교반시켰다. 이 용액을 감압하에 농축하고 물을 첨가하여 이 혼합물을 초음파처리하여 침전시켜 여과수집하고 건조하여 황색 또는 회색을 띤 백색의고체(2.9 g, 5 mmol)를 수득하였다.

(S)-〔4-(2-아미노-2-페닐-아세틸아미노)-페닐]-카르밤산 t-부틸 에스테르(7C)

DMF (50 mL)중의 {4-[2-(9H-플루오렌-9-일옥시카르보닐아미노)-2-페닐-아세틸아미노]-페닐}-카르밤산 t-부틸 에스테르(7B) (2.8 g, 5 mmol) 용액에 4-아미노메틸 피페리딘(10 x, 5.7 g, 50 mmol)을 첨가하고 이 용액을 실온에서 18시간동안 교반시켰다. 이 혼합물을 여과하여 고체를 제거하고 여액을 감압하에 농축하였다. 잔류물을 DCM에 흡수시키고 포화 NaCl, 5.5 포스페이트 완충액 (3 x 25 mL), 포화 NaCl로 세정하고 건조(Na₂S0₄), 여과농축후 그대로 사용되는 고체 생성물(3.48 mmol, 1.24 g)을 수득하였다.

(S)-{N-[(4-아미노-페닐카르바모일)-페닐-메틸〕-테레프탈암산} (7D)

건조 DCM (50 mL)중의 테레프탈산 모노메틸 에스테르(133 mg, 0.74 mmol) 용액에 EDCI (142 mg, 0.74 mmol)과 HOBt (114 mg, 0.74 mmol)를 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 3시간동안 교반시켰다. [4-(2-아미노-2-페닐- 아세틸아미노)-페닐]-카르밤산 t-부틸 에스테르(7C) (288 mg, 0.67 mmol)을 첨가한후 TEA (75 mg, 103 uL)를 첨가하고 이 혼합물을 실온에서 15시간동안 교반시켰다. DCM를 물과 포화 NaCl 용액으로 추출하고 건조하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 DCM(3 mL)에 용해시키고 TFA (2 mL)를 첨가하여 이 혼합물을 실온에서 3시간동안 교반시켰다. 이 용액을 농축하여 갈색 오일 잔류물을 수득하였다. 이 오일을 MeOH (5 mL)에 용해시키고 10% KOH (3 mL)을 첨가하여 이 혼합물을 실온에서 3시간동안 교반시켰다. 이 용액을 pH~5로 조정하고 메탄을을 농축하여 수득한 고체를 수집하고 건조하여 고체 150 mg을 수득하였다. 조 물질을 ACN/H₂0 (5-95 % ACN)을 사용한 역상HPLC로 정제하고 동결건조하여 백색 고체로서 생성물(42 mg)을 수득하였다. MP151℃. ¹H NMR (400 MHz)δ9.83 (s, 1H), 8.87 (d, J=8.4Hz, 1H), 7.98 (d, J=8.4Hz, 2H), 7.90 (d, J=8.8Hz, 2H), 7.39 (d, J=7.2Hz, 2H), 7.22 (m, 5H), 6.5 (m, 2H), 4.80 (m, 1H), 3.10 (m, 4H). M⁺¹ 404.5. 분석치: C₂₃H₂₁N₃0₄ + 1H₂0

(S)-{4-[2-(4-시아노-벤조일아미노)-3-페닐-프로피오닐아미노]-카르밤산 t-부틸 에스테르(7E)

DMF (15 mL)중의 4-시아노벤조산(1.54 mmol, 227 mg) 용액에 EDCI (296 mg, 1.54 mmol)와 HOBt (236 mg, 1.54 mmol)을 첨가하고 이 용액을 실온에서 30분동안 교반시켰다. [4-(2-아미노-2-페닐-아세틸아미노)-페닐]-카르밤산 t-부틸 에스테르(7C) (500 mg, 1.4 mmol)을 첨가한후 TEA (214 uL)를 첨가하고 이 혼합물을 실온에서 4시간동안 교반시켰다. 이 용액을 물 (250 mL)에 붓고 고체를 여과수집하고 감압하에 건조하여 그대로 사용되는 백색 고체인 생성물(638 mg, 1.32 mmol)을 수득하였다.

(S)-(4-{3-페닐-2-〔4-(1H-테트라졸-5-일)-벤조일아미노｝-프로피오닐아미노｝-페닐)-카르밤산 t-부틸 에스테르(7F)

DMF (2 mL)중의 ｛4-[2-(4-시아노-벤조일아미노)-3-페닐-프로피오닐아미노] -카르밤산 t-부틸 에스테르 (7E) (100 mg, 0.21 mmol)의 용액에 NaN₃ (3 x, 40 mg, 0.62 mmol)와 NH₄C1 (0.68 mmol, 38 mg)을 첨가하고 이 혼합물을 90℃에서 18시간동안 가열하였다. DMF를 감압하에 제거하고 잔류물을 ACN/H₂0 (20 %-95 % ACN)을 사용한 C18에 의해 역상 HPLC로부터 정제하여 동결건조후 백색 분말의 고체인 생성물을 수득하였다 (31 mg).

(S)-{N-[1-(4-아미노-페닐카르바모일)-2-페닐-에틸]-4-(1H-테트라졸-5-일)벤자미드｝(7G)

DCM (4 mL)중의 (4-{3-페닐-2-[4-(1H-테트라졸-5-일)-벤조일아미노]- 프로피오닐아미노} -페닐)-카르밤산 t-부틸 에스테르(7F) (31 mg, 0.06mmol)의 현탁액에 TFA (1 mL)를 첨가하고 이 혼합물을 실온에서 1.5시간동안 교반시켰다. 이 용액을 농축하고 ACN/H₂0 (20 %-95 % ACN)을 사용한 C18에 의해 역상 HPLC로부터 정제하여 동결건조후 백색 분말의 생성물을 수득하였다(4.5 mg). MP 137℃. ¹H NMR (400 MHz) δ9.88 (s, 1H), 8.86 (d, J=8.0Hz, 1H), 8.06 (d, J=8.0Hz, 2H), 7.97 (d, J=8.4Hz, 2H), 7.36 (d, J=7.6Hz, 2H), 7.24 (m, 4H), 7.14 (m, 1H), 6.56 (d, J=8.4Hz, 2H), 5.70 s, 1H) 4.78 (m, 1H), 3.07 (m, 6H). M⁺¹ 428.5. 분석치. C₂₃H₂₁N₇O₂ + 2 H₂0 0.4TFA

(N-[1-(4-아미노-페닐카르바모일)-2-D-비페닐-4-일-에틸]-테레프탈암산 메틸 에스테르(8E)

스킴 8에 나타난 바와 같이 D-비페닐알라닌(8A)를 치환시키고 비누화 단계를 진행함으로써 N-[(4-아미노-페닐카르바모일)-페닐-메틸)-테레프탈암산 (7D)과 유사하게 상기 화합물을 제조하였다(32 mg). Mp 289℃. ¹H NMR (400 MHz) δ9.88 (s, 1H), 8.86 (d, J=8.0Hz, 1H), 8.02 (m, 2H), 7.95 (m, 2H), 7.62 (m, 4H), 7.49 (d, J=8.0Hz, 2H), 7.43 (m, 2H), 7.32 (m, 1H), 7.24 (m, 2H) 6.51 (m, 2H), 4.85 (m, 3H), 3.86 (s, 3H), 3.14 (m, 2H) . M+1 494.6. 분석치:C₃₀H₂₇N₃0₄

N-[1-(4-아미노-페닐카르바모일)-2-D-비페닐-4-일-에틸]-테레프탈암산(8F)

MeOH중의 N-[1-(4-아미노-페닐카르바모일)-2-D-비페닐-4-일-에틸]-테레프탈암산 메틸 에스테르(8E)의 용액에 10% KOH을 첨가하고 이 용액을 실온에서 7일간 교반시켰다. MeOH를 감압하에 제거시키고 20% HCl로 수성 혼합물을 pH 5~7로 조정하였다. 수득한 고체를 수집하고 ACN/H₂0 (5-95 % ACN)로 용출되는 C18을 사용하여 역상 HPLC로부터 정제하고 적절한 분획을 동결건조하여 백색 고체로서 생성물(13 mg)을 수득하였다. Mp 282℃. ¹H NMR (400 MHz) δ9.87 (s, 1H), 9.92 (d, J=8.0Hz, 1H), 7.99 (d, J=8.4Hz, 2H), 7.92 (d, J=8.4Hz, 2H), 7.61 (m, 2H), 7.48 (m, 1H), 7.43 (m, 1H), 7.32 (m, 1H), 7.24 (d, J=8.8Hz, 1H) 6.51 (d, J=8.4Hz, 1H), 4.84 (m, 1H), 3.15 (m, 3H). M⁺¹ 480.3. 분석치. C₂₉H₂₅N₃0₂

여기에 기술된 양태의 다양한 개질과 변형은 당업자에게 명백한 바와 같이 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다. 여기에 기술된 양태는 다만 예시를 위해 제공된 것이다.

인용된 참조문헌:(참고로 본 발명에 포함된다)

Claims (17)

1. 하기 구조를 포함하는 역 콜레스테롤 수송 매개제:

   

   여기에서, A, B, 및 C는 임의의 순서일 수 있으며

   A는 산성 아미노산 또는 그의 분자 바이오이소스테레(bioisostere)를 함유하고,

   B는 방향족 또는 친지질성 아미노산 또는 그의 유사체를 함유하고, 그리고

   C는 염기성 아미노산과 그의 분자 바이오이소스테레를 함유하며,

   A 또는 C중의 적어도 하나는 그의 분자 바이오이소스테레를 함유한다.
2. 제 1 항에 있어서, A 또는 C중의 하나만 바이오이소스테레를 함유하며, 알파 아미노 또는 알파 카르복시기는 바이오이소스테레를 함유하지 않는 A 또는 C아미노산으로부터 제거되는 매개제.
3. 제 1 항에 있어서, 존재한다면, 아미노 말단으로부터 알파 아미노기는 포르 밀, 아세틸, 페닐아세틸, 벤조일, 피볼릴, 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐, 2-나프틸산, 니코틴산, CH₃-(CH₂)n-CO-[여기서, n은 1 내지 20이다], 디-t-부틸-4-히록시-페닐, 나프틸, 치환된 나프틸, Fmoc, 비페닐, 치환된 페닐, 치환된 헤테로사이클, 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 사이클로알킬, 융합 사이클로알킬, 포화 헤테로아릴, 및 치환된 포화 헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택된 보호기로 캡핑되는 매개제.
4. 제 1 항에 있어서, 존재한다면, 카르복시 말단으로부터 알파 카르복시기는 아민, 예컨대, RNH2 (여기서 R은 H, 디-t-부틸-4-히드록시-페닐, 나프틸, 치환된 나프틸, Fmoc, 비페닐, 치환된 페닐, 치환된 헤테로사이클, 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 사이클로알킬, 융합 사이클로알킬, 포화 헤테로아릴, 및 치환된 포화 헤테로아릴이다)로 구성된 군에서 선택된 보호기로 캡핑되는 매개제.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 A의 산성 기는 하기식으로 구성된 군으로부터 선택되는 바이오이소스테레를 함유하는 매개제:

   
6. 제 1 항에 있어서, 상기 C의 염기성 기는 하기식으로 구성된 군으로부터 선택되는 바이오이소스테레를 함유하는 매개제:

   
7. 제 1 항에 있어서, 상기 A의 바이오이소스테레가 하기식으로 구성된 군으로부터 선택되는 매개제:

   
8. 제 1 항에 있어서, 상기 C의 바이오이소스테레가 하기식으로 구성된 군으로부터 선택되는 매개제:

   
9. 제 1 항에 있어서, 상기의 매개제는 하기식으로 구성된 군으로부터 선택되는 매개제:

   

   
10. BenOMe-bip-아닐린의 화합물 .
11. 4-((R)-1-(4-(디메틸아미노)페닐카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)부탄산의 화합물.
12. 4-((R)-1-(4-(디메틸아미노)페닐카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)-3,3-디메틸부탄산의 화합물.
13. 4-((R)-1-(4-(디메틸아미노)페닐카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)-3,3-(펜타메틸렌)부탄산의 화합물.
14. 4-((S)-1-(4-구아니디노페닐카르바모일)-2-(비페닐)에틸카르바모일)벤조산의 화합물.
15. 3-((R)-1-(4-(디메틸아미노)벤질카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)프로판산의 화합물.
16. 4-((R)-1-(4-(디메틸아미노)벤질카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)부탄산의 화합물.
17. 4-((R)-1-(4-(디메틸아미노)벤질카르바모일)-2-페닐에틸카르바모일)-3,3-디메틸부탄산의 화합물.