JP4361809B2 - アテローム性硬化症を改善するｇ−タイプペプチド - Google Patents

Description

関連出願の相互引用
本出願は、ＵＳＳＮ１０／１２０，５０８（２００２年４月５日出願）（前記出願は援用または参照されて本明細書に含まれる）について優先権を主張する。

連邦政府支援研究開発によりなされた発明の権利に関する記述
本研究の一部分はアメリカ合衆国衛生研究所の心臓血管肺研究所（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｒｔ Ｂｌｏｏｄ Ｌｕｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）のグラント（Ｎｏ． ＨＬ３０５６８）によって助成された。アメリカ合衆国政府は本発明に関して一定の権利を有する。

発明の技術分野
本発明はアテローム性硬化症の分野に関する。特に、本発明は、経口投与が可能で、アテローム性硬化症の症状または炎症性反応によって特徴づけられる他の病理変化の１つ以上を改善するあるクラスのペプチドの特定に関する。

スタチン［例えばメヴァコール（Ｍｅｖａｃｏｒ（商品名））、リピトール（Ｌｉｐｉｔｏｒ（商品名））］の導入によって心臓発作および脳卒中の死亡率は約３分の１に減少した。しかしながら、特に米国および西欧諸国においては心臓発作および脳卒中は今だに死亡および身体障害の主要原因である。心臓発作および脳卒中は、アテローム性硬化症と称される慢性炎症状態の結果である。

いくつかの原因因子が心臓血管系疾患の発生に深い関係があるとされている。病気に対する遺伝的素因、性別、喫煙および食事のような生活スタイルに関する因子、年齢、高血圧および高脂血症（高コレステロール血症を含む）が含まれる。これらの因子のうちいくつか、特に高脂血症および高コレステロール血症（高血中コレステロール濃度）はアテローム性硬化症と関連する重要な危険因子を提供する。

コレステロールは、リポ蛋白質粒子（カイロミクロンとして一般的に知られている）、超低比重リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）、低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）および高比重リポ蛋白質（ＨＤＬ）内に遊離コレステロールおよびエステル化コレステロールとして血中に存在する。血中の総コレステロール濃度は、（１）消化管からのコレステロールの吸収、（２）炭水化物、蛋白質、脂肪およびエタノールのような食事構成成分からのコレステロールの合成、および（３）組織、特に肝臓による血液からのコレステロールの除去、それに続くコレステロールの胆汁酸、ステロイドホルモンおよび胆汁コレステロールへの変換によって影響を受ける。

血中コレステロールの濃度維持は遺伝的および環境的因子の両者の影響を受ける。遺伝的因子には、肝臓におけるコレステロール生合成律速酵素濃度、低比重リポ蛋白質レセプター濃度、コレステロールの胆汁酸への変換律速酵素濃度、リポ蛋白質の合成および分泌速度、並びに個人の性別などが含まれる。ヒトの血中コレステロール濃度の恒常性に影響する環境的因子には、食事の組成、喫煙率、運動量、種々の医薬物質の使用などが含まれる。食事に関する変動因子には、脂肪の量およびタイプ（飽和脂肪酸およびポリ不飽和脂肪酸）、コレステロールの量、繊維の量およびタイプ、並びにおそらくビタミンＣおよびＤのようなビタミン類およびカルシウムのようなミネラルの量が含まれる。

低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）の酸化はアテローム性硬化症の病因と強い関係があるとされてきた。高比重リポ蛋白質（ＨＤＬ）はＬＤＬの酸化を防ぐことができることが見出されたが、いくつかの事例では、ＬＤＬの酸化を促進することが見出されている。アテローム性硬化症の重要な開始因子にはＬＤＬ由来する酸化リン脂質の生成が含まれている。

正常のＨＤＬはこれらの酸化リン脂質の形成を阻害する能力および酸化リン脂質がいったん形成されたらそれらを不活化する能力を有する。しかしながら、ある条件下ではＨＤＬは抗炎症性分子から酸化リン脂質の形成を実際に促進する前炎症性分子に変換され得る。

ＨＤＬおよびＬＤＬは固有の免疫系の一部分であると提唱されている。（Ｎａｖａｂ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｖａｓｃ． Ｂｉｏｌ． ２１：４８１−４８８）。抗炎症性ＨＤＬの生成は、ＨＤＬの主要蛋白質、アポリポプロテインＡ−Ｉ（アポＡ−Ｉ）擬似のクラスＡ両親媒性ヘリックス蛋白質を用いて達成された（例えばＷＯ０２／１５９２３参照）。

発明の要旨
本発明は、アテローム性硬化症および他の炎症状態、例えば関節リウマチ、紅斑性狼瘡、結節性多発性動脈炎、骨粗しょう症、アルツハイマー症およびインフルエンザＡのようなウイルス性疾患の症状を改善する新規な組成物および方法を提供する。

ある実施態様では、本発明は、アテローム性硬化症または炎症性反応と関連する他の病理変化の症状を改善する“単離された”ポリペプチドおよび／またはそのようなポリペプチドを含む組成物を提供する。典型的には、前記ポリペプチドは両親媒性ヘリックスポリペプチドを含み、前記ヘリックスポリペプチドは、そのペプチドの極性面上に荷電残基を有し且つ広い非極性面を備えている。前記ポリペプチドは典型的には、長さが少なくとも約１０個のアミノ酸および／または長さが約４０個またはそれ未満のポリペプチドである。好ましいポリペプチドは典型的にはＧ^*両親媒性ヘリックスを含む。ある実施態様では、前記ポリペプチドは、アポＪ（例えば問題のポリペプチドと同じ長さのドメインに対して）と約５０％より大きい、好ましくは約７５％より大きい、より好ましくは約８５％より大きい配列同一性を示す。本発明の好ましいポリペプチドは、酸化物質（例えば、１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥ、１５（Ｓ）−ＨＰＥＴＥ、ＨＰＯＤＥ、ＨＰＥＴＥ、ＨＰＯＤＥおよびＨＥＴＥ）による酸化からリン脂質（例えば１−パルミトイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＰＡＰＣ）、１−ステアロイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＳＡＰＣ）、１−ステアロイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン（ＳＡＰＥ））を保護する。特に好ましいポリペプチドは、以下のアミノ酸配列の１つ以上を含むかまたは、それらから成る：ＬＬＥＱＬＮＥＱＦＮＷＶＳＲＬＡＮＬＴＱＧＥ（配列番号：１）、ＬＬＥＱＬＮＥＱＦＮＷＶＳＲＬＡＮＬ（配列番号：２）、ＮＥＬＱＥＭＳＮＱＧＳＫＹＶＮＫＥＩＱＮＡＶＮＧＶ（配列番号：３）、ＩＱＮＡＶＮＧＶＫＱＩＫＴＬＩＥＫＴＮＥＥ（配列番号：４）、ＲＬＴＬＬＳＮＬＥＥＡＫＫＫＫＥＤＡＬＮＥＴＲＥＳＥＴＫＬＫＥＬ（配列番号：５）、ＰＧＶＣＮＥＴＭＭＡＬＷＥＥＣＫ（配列番号：６）、ＰＣＬＫＱＴＣＭＫＦＹＡＲＶＣＲ（配列番号：７）、ＥＣＫＰＣＬＫＱＴＣＭＫＦＹＡＲＶＣＲ（配列番号：８）、ＬＶＧＲＱＬＥＥＦＬ（配列番号：９）、ＭＮＧＤＲＩＤＳＬＬＥＮ（配列番号：１０）、ＱＱＴＨＭＬＤＶＭＱＤ（配列番号：１１）、ＦＳＲＡＳＳＩＩＤＥＬＦＱＤ（配列番号：１２）、ＰＦＬＥＭＩＨＥＡＱＱＡＭＤＩ（配列番号：１３）、ＰＴＥＦＩＲＥＧＤＤＤ（配列番号：１４）、ＲＭＫＤＱＣＤＫＣＲＥＩＬＳＶ（配列番号：１５）、ＰＳＱＡＫＬＲＲＥＬＤＥＳＬＱＶＡＥＲＬＴＲＫＹＮＥＬＬＫＳＹＱ（配列番号：１６）、ＬＬＥＱＬＮＥＱＦＮＷＶＳＲＬＡＮＬＴＥＧＥ（配列番号：１７）、ＤＱＹＹＬＲＶＴＴＶＡ（配列番号：１８）、ＰＳＧＶＴＥＶＶＶＫＬＦＤＳ（配列番号：１９）、ＰＫＦＭＥＴＶＡＥＫＡＬＱＥＹＲＫＫＨＲＥ（配列番号：２０）、ＷＤＲＶＫＤＬＡＴＶＹＶＤＶＬＫＤＳＧＲＤＹＶＳＱＦ（配列番号：２１）、ＶＡＴＶＭＷＤＹＦＳＱＬＳＮＮＡＫＥＡＶＥＨＬＱＫ（配列番号：２２）、ＲＷＥＬＡＬＧＲＦＷＤＹＬＲＷＶＱＴＬＳＥＱＶＱＥＥＬ（配列番号：２３）、ＬＳＳＱＶＴＱＥＬＲＡＬＭＤＥＴＭＫＥＬＫＥＬＫＡＹＫＳＥＬＥＥＱＬＴ（配列番号：２４）、ＡＲＬＳＫＥＬＱＡＡＱＡＲＬＧＡＤＭＥＤＶＣＧＲＬＶ（配列番号：２５）、ＶＲＬＡＳＨＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲＤＡＤＤＬＱＫＲＬＡ（配列番号：２６）、ＰＬＶＥＤＭＱＲＱＷＡＧＬＶＥＫＶＱＡ（配列番号：２７）、ＭＳＴＹＴＧＩＦＴＤＱＶＬＳＶＬＫ（配列番号：２８）、およびＬＬＳＦＭＱＧＹＭＫＨＡＴＫＴＡＫＤＡＬＳＳ（配列番号：２９）

ある実施態様では、前記ポリペプチドは、これらアミノ酸配列の２つ以上のコンカテマ−、および／またはこれらアミノ酸配列の１つ以上およびアポＡ−Ｉ配列またはその擬似物質のコンカテマ−である（アポＡ−Ｉ関連ポリペプチド／擬似物質については例えばＰＣＴ公開ＷＯ０２／１５９２３を参照）。本発明のポリペプチドは保護基（例えばアミノおよび／またはカルボキシル末端の保護基）を含むことができる。好ましい保護基には、アセチル、アミド、３から２０炭素のアルキル基、Ｆｍｏｃ、ｔ−ｂｏｃ、９−フルオレンアセチル基、１−フルオレンカルボン酸基、９−フルオレンカルボン酸基、９−フルオレン−１−カルボン酸基、ベンジルオキシカルボニル、キサンチル（Ｘａｎ）、トリチル（Ｔｒｔ）、４−メチルトリチル（Ｍｔｔ）、４−メトキシトリチル（Ｍｍｔ）、４−メトキシ−２，３，６−トリメチル−ベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）、メシチレン−２−スルホニル（Ｍｔｓ）、４，４−ジメトキシベンゾヒドリル（Ｍｂｈ）、トシル（Ｔｏｓ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）、４−メチルベンジル（ＭｅＢｚｌ）、４−メトキシベンジル（ＭｅＯＢｚｌ）、ベンジルオキシ（ＢｚｌＯ）、ベンジル（Ｂｚｌ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル（Ｎｐｙｓ）、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジアキソシクロヘキシリデン）エチル（Ｄｄｅ）、２，６−ジクロロベンジル（２，６−ＤｉＣｌ−Ｂｚｌ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−Ｃｌ−Ｚ）、２−ブロモベンジルオキシカルボニル（２−Ｂｒ−Ｚ）、ベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、シクロヘキシルオキシ（ｃＨｘＯ）、ｔ−ブトキシメチル（Ｂｕｍ）、ｔ−ブトキシ（ｔＢｕＯ）、ｔ−ブチル（ｔＢｕ）、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル基、カルボベンゾキシ基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基およびトリフルオロアセチル（ＴＦＡ）が含まれるが、これらに限定されていない。ある実施態様では、前記ポリペプチドはアミノ末端に連結した保護基を含み、前記アミノ末端保護基は、ベンゾイル基、アセチル、プロペオニル、カルボベンゾキシ、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、または３から２０炭素のアルキルのような保護基である。ある実施態様では、前記ポリペプチドはカルボキシ末端に連結した保護基を含み、前記カルボキシ末端保護基はアミドである。

特に好ましい実施態様では、本発明のポリペプチドは１個以上のデキストロ“Ｄ”アミノ酸を含む。ある実施態様では、本発明のポリペプチドは、少なくとも２個、好ましくは少なくとも４個の“Ｄ”アミノ酸を含み、もっとも好ましくは全てが“Ｄ”アミノ酸である。

ある実施態様では、本明細書で述べる単数または複数のポリペプチドはリン脂質（例えばリソホスファチジルコリン）と共有結合される。特に好ましい実施態様では、単数または複数のポリペプチドはリン脂質［例えばプロピオノイル、ブタノイル、ペンタノイル、カプロイル、ヘプタノイル、カプリロイル、ノナノイル、カプリル、ウンデカノイル、ラウロイル、トリデカノイル、ミリストイル、ペンタデカノイル、パルミトイル、ヘプタデカノイル、ステアロイル、ノナデカノイル、アラキドイル、ヘニエコサノイル、ベヘノイル、トルシサノイル、リグノセロイル、ミリストレオイル（９−シス）、ミリステライドイル（９−トランス）、パルミトレオイル（９−シス）、パルミテライドイル（９−トランスなど）］のｓｎ−１またはｓｎ−２位に連結される。

本発明のポリペプチドは、薬理学的に許容できる賦形剤と共に製剤化することができる（例えば経口投与、直腸投与、鼻腔投与、注射などのためのユニットドーズ製剤）。

別の実施態様では、本発明は、アテローム性硬化症または炎症性反応によって特徴づけられる他の病理変化の症状を改善する経口投与用に適した組成物を提供する。組成物は、本明細書で述べる両親媒性ヘリックス（例えばＧ^*ヘリックス）を含むポリペプチドを含み、この場合ポリペプチドは、本明細書で述べるように１個以上の“Ｄ”アミノ酸を含み、且つポリペプチドは、本明細書で述べるようにアミノ末端およびカルボキシル末端でブロックされている。

ある種の実施態様では、本発明は、医薬製剤（組成物）を提供する。前記医薬は、医薬として許容できる賦形剤中に本明細書で述べるポリペプチドを含んでいる。前記薬剤はしばしばユニットドーズ製剤製剤（例えば、ヒトのような哺乳類への経口、経直腸、経鼻または注射投与用）である。

本発明はまた、哺乳類におけるアテローム性硬化症または炎症性反応によって特徴づけられる他の病理変化の症状を改善する方法の方法を提供する。前記方法は、本明細書で述べるように、ポリペプチドの極性面上に荷電残基を有し且つ広い非極性面を備えた両親媒性ヘリックスポリペプチドを含むポリペプチドまたはポリペプチドのコンカテマ−を哺乳類(例えばヒト)に投与することを伴う。ある種の実施態様では、前記哺乳類はヒト（例えばアテローム性硬化症、脳卒中または炎症性反応と関連する他の病理変化を有するかまたはその危険性があると診断されたヒト）である。ある種の実施態様では、前記哺乳類はヒト以外の哺乳類（例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタなど）である。

また別の実施態様では、本発明は、炎症性反応によって特徴づけられる病理変化の症状（例えば関節リウマチ、紅斑性狼瘡、結節性多発性動脈炎、骨粗しょう症、アルツハイマー症およびインフルエンザＡのようなウイルス性疾患などの症状）を改善する方法を提供する。前記方法は、本明細書で述べるように、ポリペプチドの極性面上に荷電残基を有し且つ広い非極性面を備える両親媒性ヘリックスポリペプチドを含むポリペプチドまたはポリペプチドのコンカテマ−を哺乳類（例えばヒト）に投与することを伴う。

本発明はまた、アテローム性硬化症または炎症性反応によって特徴づけられる別の病理変化の症状を改善するためのキットを提供する。前記キットは、典型的には本明細書で述べるポリペプチドの１つ以上を収納する容器を含む。単数または複数の前記ポリペプチドは、医薬として許容できる賦形剤（例えば経口、経鼻、経直腸、注射投与用のユニットドーズ製剤において）と組み合わされることができる。前記キットは追加的に、アテローム性硬化症または炎症性反応によって特徴づけられる病理変化の症状の１つ以上を改善するための前記ポリペプチドの用法説明書を含み得る。

また別の実施態様では、本発明は、哺乳類において、炎症に対する急性期反応と関連する冠状動脈合併症を改善または予防する方法を提供し、ここで前記冠状動脈合併症はアテローム性硬化症の一症状である。前記方法は、急性期反応を有するかまたは急性期反応の危険性を有する哺乳類に、本明細書で述べる１つ以上のポリペプチドを投与することを伴っている。前記投与は、経口投与、経鼻投与、経直腸投与、腹腔内注射および静脈内注射、皮下注射、経皮投与、筋肉内注射などのような投与経路によることができる。ある種の実施態様では、前記ポリペプチドは、すべてＬ型の同一ポリペプチドと組み合わせて投与される。ある種の実施態様では、前記ポリペプチドは、医薬として許容できる賦形剤中ユニットドーズ製剤として提供される。前記急性期反応は、再発性炎症性疾患と関連する炎症性反応であることができる。ある種の実施態様では、前記急性期反応は、癩、結核、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ性多発性筋痛、結節性多発性動脈炎、強皮症、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、アルツハイマー症、エイズ、冠状動脈石灰化、石灰化大動脈狭窄症、骨粗しょう症および慢性関節リウマチを含む 疾患と関連するが、ただしこれらに限定されない。ある種の実施態様では、前記急性期反応は、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、器官移植、創傷、インプラント人工器官、寄生虫感染、敗血症、内毒素ショック症候群およびバイオフィルム形成のような状態と関連する炎症性反応である。

本発明はまた、哺乳類において、炎症に対する急性期反応と関連する関連する冠状動脈合併症を改善または予防する方法を提供し、ここで前記冠状動脈合併症はアテローム性硬化症の一症状である。前記方法は、前記哺乳類（例えばヒト）を急性期反応または急性期反応の有意な危険性の指標となる急性期蛋白質（ＡＰＰ）レベルについてアッセイすること；そして、急性期反応を示す急性期蛋白質（ＡＰＰ）レベルを示した哺乳類に本明細書で述べるポリペプチドを投与することを伴う。前記急性期蛋白質（ＡＰＰ）は、血清アミロイドＡ、ｃ−反応性蛋白質、血清アミロイドＰ成分、Ｃ２補体蛋白質、Ｃ３補体蛋白質、Ｃ４補体蛋白質、Ｃ５補体蛋白質、Ｃ９補体蛋白質、Ｂ補体蛋白質、Ｃ１インヒビター、Ｃ４結合蛋白質、フィブリノゲン、フォン ヴィルブラント因子、α１−アンチトリプシン、α１−アンチキモトリプシン、α２アンチプラスミン、ヘパリン補因子ＩＩ、プラスミノゲン活性化因子インヒビターＩ、ハプトグロビン、ヘモペキシン、セルロプラスミン、過酸化マンガンジスムターゼ、α１−酸糖蛋白質、ヘムオキシゲナーゼ、マンノース結合蛋白質、白血球蛋白質Ｉ、リポ蛋白質（ａ）およびリポ多糖類結合蛋白質のような陽性ＡＰＲおよび／またはアルブミン、プレアルブミン、トランスフェリン、アポＡＩ、アポＡＩＩ、α２−ＨＳ糖蛋白質、インター−α−トリプシンインヒビター、高ヒスチジン糖蛋白質から成るもののような陰性APRとすることができる。

定義
“単離された”、“精製された” または“生物学的に純粋な”という用語が単離されたペプチドを指すときは、その自然の状態で見出されたときに通常、附随する成分を実質的にまたは本質的に含まないものを指す。核酸および／またはポリペプチドに関して、前記用語は、自然界において典型的にフランキングする配列によって、もはやフランキングされていない核酸またはポリペプチドを指すことができる。化学的に合成されたポリペプチドは、それらは自然状態（例えば血液中、血清中）では見出されないので“単離された”と表記する。ある実施態様では、“単離された”という用語は、そのポリペプチドが自然界で見出されないことを示す。

“ポリペプチド”、“ペプチド”および“蛋白質”という用語は本明細書では互換的に用いられ、アミノ酸残基ポリマーを指す。前記用語は、天然に存在するアミノ酸と対応する１つ以上のアミノ酸残基が人工的な化学的類似体であるアミノ酸ポリマーに適用され、同様に天然に存在するアミノ酸ポリマーにも適用される。

“両親媒性ヘリックスペプチド”という用語は、少なくとも１つの両親媒性ヘリックス（両親媒性ヘリックスドメイン）を含むペプチドを指す。本発明におけるある種の両親媒性ヘリックスペプチドは、２つ以上（例えば３、４、５など）の両親媒性ヘリックスを含むことができる。

“クラスＡ両親媒性ヘリックス”という用語は、極性−非極性界面に存在する陽性荷電残基および極性面の中央に存在する陰性荷電残基とともに極性および非極性面の分離を生じるα−ヘリックスを形成する蛋白質構造を指す（例えばＳｅｇｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８：１０３−１１７参照）。

“アポリポプロテインＪ”（アポＪ）は、クラステリン、ＴＲＰＭ２、ＧＰ８０およびＳＰ４０，４０（Ｆｒｉｔｚ （１９９５） ｐｐ１１２， "Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ： Ｒｏｌｅ ｉｎ Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ （Ｈａｒｍｏｎｙ ＪＡＫ ｅｄ．）， Ｒ．Ｇ． Ｌａｎｄｅｓ， Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ， ＴＸ）を含む種々の名称で知られる。前記は最初ヘテロダイマー糖蛋白質として、培養ラットセルトリ細胞の分泌蛋白質の一成分として報告された（Ｋｉｓｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８２） Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ２７：２３３−２４０）。前記翻訳生成物は単鎖前駆体で、細胞内で切断を受けてジスルフィドで連結された３４ｋＤａのαサブユニットおよび４７ｋＤａのβサブユニットを生じる（Ｃｏｌｌａｒｄ ａｎｄ Ｇｒｉｓｗｏｌｄ （１９８７） Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６：３２９７−３３０３）。前記は、細胞の損傷、脂質の輸送、アポトーシスと関連し、また、細胞の損傷または死によって生じる細胞屑の除去と関わっている可能性がある。クラステリンは多様な分子（脂質、ペプチドおよび蛋白質並びに疎水性プローブ１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネートを含む）と高い親和性で結合することが示された（Ｂａｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｂｉｏｃｈｅｍ． ４０：１１８２８−１１８４０）。

クラスＧ両親媒性ヘリックスは球形蛋白質であることが判明し、それゆえクラスＧと称される。このクラスの両親媒性ヘリックスの特色は、狭い非極性面を含む極性面上に陽性荷電残基および陰性荷電残基がランダムに分布することである。前記狭い非極性面のために、このクラスはリン脂質と容易には結合しない（例えば以下を参照：Ｓｅｇｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８：１０３−１１７； Ｅｒｒａｔｕｍ （１９９１） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ９：７９）。いくつかの互いに交換可能なアポリポプロテインは、Ｇ両親媒性ヘリックスと類似するが同一ではない特徴を有する。クラスＧ両親媒性ヘリックスと同様に、この別のクラスのＧ両親媒性ヘッリクスはその極性面に陽性荷電および陰性荷電残基のランダム分布を有する。しかしながら、狭い非極性面を有するクラスＧ両親媒性ヘリックスとは対照的に、このクラスは広い非極性面を有し、それによってこのクラスはリン脂質と容易に結合し、このクラスはＧクラスの両親媒性ヘリックスと区別するためにＧ^*と称される（Ｓｅｇｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．， ３３：１４１−１６６； Ａｎａｎｔｈａｒａｍａｉａｈ ｅｔ ａｌ． （１９９３） ｐｐ． １０９−１４２， "Ｔｈｅ Ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ Ｈｅｌｉｘ"， Ｒ．Ｍ． Ｅｐａｎｄ， ｅｄ．， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌｏｒｉｄａ参照）。両親媒性ヘリックスドメインを特定し分類するコンピュータプログラムがＪｏｎｅｓら（Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ． ３３：２８７−２９６ （１９９２））によって報告されている。前記にはヘリックスホイールプログラム（ＷＨＥＥＬまたはＷＨＥＥＬ／ＳＮＯＲＫＥＬ）、ヘリックスネットプログラム（ＨＥＬＮＥＴ、ＨＥＬＮＥＴ／ＳＮＯＲＬＥＬ、ＨＥＬＮＥＴ／Ａｎｇｌｅ）、ヘリックスホイールの追加のためのプログラム（ＣＯＭＢＯまたはＣＯＭＢＯ／ＳＮＯＲＫＥＬ）、ヘリックスネットの追加のためのプログラム（ＣＯＭＮＥＴ、ＣＯＭＮＥＴ／ＳＮＯＲＫＥＬ、ＣＯＭＢＯ／ＳＥＬＥＣＴ、ＣＯＭＢＯ／ＮＥＴ）、コンセンサスホイールプログラム（ＣＯＮＳＥＮＳＵＳ、ＣＯＮＳＥＮＳＵＳ／ＳＮＯＲＫＥＬ）など含まれるが、ただしこれらに限定されない。

“改善する”という用語は、“アテローム性硬化症の１つ以上の症状を改善する”ということに関して用いられるときは、アテローム性硬化症および／または関連する病理変化に特徴的な１つ以上の症状の緩和、予防または除去を指す。そのような緩和には、酸化されたリン脂質の減少または除去、アテローム性硬化プラーク形成および破裂の減少、臨床症状（例えば心臓発作、アンギナまたは脳卒中）の減少、高血圧の緩和、炎症性蛋白質合成の減少、血漿コレステロールの減少などが含まれるが、これらに限定されない。

“鏡像異性体アミノ酸”という用語は、互いに重ね合わすことができない鏡像である少なくとも２つの形態として存在することができるアミノ酸を指す。ほとんどのアミノ酸（グリシンを除く）には鏡像異性体があり、いわゆるＬ型（Ｌアミノ酸）またはＤ型（Ｄアミノ酸）として存在する。天然に存在するほとんどのアミノ酸は“Ｌ”アミノ酸である。“Ｄアミノ酸”および“Ｌアミノ酸”という用語は、平面偏光の特定の回転方向ではなく絶対配置を指すために用いられる。本明細書での用い方は、当業者の標準的な用い方と一致する。本明細書では、例えば"Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ"のスタンダードＳＴ．２５で示されているように、アミノ酸は標準的な一文字コドンまたは三文字コドンを用いて指定される。

“保護基”という用語は、化学基がアミノ酸の官能基（例えば側鎖、α−アミノ基、α−カルボキシル基など）に付属しているときには、前記官能基の特性をブロックまたは隠蔽する化学基を指す。好ましいアミノ末端保護基には、アセチルまたはアミノ基が含まれるが、ただしこれらに限定されない。その他のアミノ末端保護基には、脂肪酸の場合のようなアルキル鎖、プロペニル、ホルミル、その他が含まれるが、ただしこれらに限定されない。好ましいカルボキシル末端保護基にはアミドまたはエステルを形成する基が含まれるが、ただしこれらに限定されない。

“酸化物質による酸化からリン脂質を保護する”という語句は、前記リン脂質を酸化物質（例えば過酸化水素、１３−（Ｓ）−ＨＰＯＤＥ、１５−（Ｓ）−ＨＰＥＴＥ、ＨＰＯＤＥ、ＨＰＥＴＥ、ＨＯＤＥ、ＨＥＴＥなど）と接触させたとき、リン脂質の酸化速度（または生成される酸化リン脂質の量）を低下させる化合物の能力を指す。

“低比重リポ蛋白質”または“ＬＤＬ”という用語は当業者に共通の用法に従って定義される。一般的には、ＬＤＬは、超遠心分離によって単離されたときｄ＝１．０１９から１．０６３の比重範囲で見出される脂質−蛋白質複合体を指す。

“高比重リポ蛋白質”または“ＨＤＬ”という用語は当業者に共通の用法に従って定義される。一般的には、ＨＤＬは、超遠心分離によって単離されたときｄ＝１．０６３から１．２１の比重範囲で見出される脂質−蛋白質複合体を指す。

“Ｉ群ＨＤＬ”という用語は、酸化された脂質（例えば低比重リポ蛋白質中の脂質）を還元するかまたは酸化物質による酸化から酸化された脂質を保護する高比重リポ蛋白質またはその成分（例えばアポＡ−Ｉ、パラオキソナーゼ、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼなど）を指す。

“ＩＩ群ＨＤＬ”という用語は、酸化からの脂質保護または酸化された脂質の修復（例えば還元）において活性が低いかまたは活性をもたないＨＤＬを指す。

“ＨＤＬ成分”という用語は、高比重リポ蛋白質（ＨＤＬ）を構成する成分（例えば分子）を指す。脂質を酸化から保護するか、または修復する（例えば酸化した脂質を還元する）ＨＤＬについてのアッセイにはそのような活性を示すＨＤＬの成分（例えばアポＡ−Ｉ、パラオキソナーゼ、血小板活性化因子アセチルヒドラーゼなど）についてのアッセイもまた含まれる。

“ヒトアポＡ−Ｉペプチド”という用語は完全長のヒトアポＡ−ＩペプチドまたはクラスＡ両親媒性ヘリックスを含むそのフラグメントもしくはドメインを指す。

本明細書で用いられる“単球反応”は、アテローム性硬化症プラーク形成と関連する“炎症性反応”に特有の単球の活性を指す。前記単球反応は、血管壁細胞（例えば血管内皮細胞）への単球の付着、および／または内皮下腔への走化性、および／または単球のマクロファージへの分化を特徴とする。

“変化がない”という用語は、酸化されたリン脂質の量についていう場合は、検出可能な変化がないこと、より好ましくは統計的に有意な変化がないこと（例えば少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、もっとも好ましくは少なくとも９８％または９９％の信頼度）をいう。検出可能な変化がないとは、酸化されたリン脂質レベルが変化するが、本明細書記載の蛋白質が存在しない場合または他の陽性もしくは陰性コントロールと同程度であるアッセイもまた指している。

本明細書では以下の略語が用いられる。ＰＡＰＣ：Ｌ−α−１−パルミトイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；ＰＯＶＰＣ：１−パルミトイル−２−（５−オキソバレリル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；ＰＧＰＣ：１−パルミトイル−２−グルタリル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；ＰＥＩＰＣ：１−パルミトイル−２−（５，６−エポキシイソプロスタンＥ₂）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；ＣｈＣ１８：２：コレステリルリノレート；ＣｈＣ１８：２−ＯＯＨ：コレステリルリノレートヒドロペルオキシド；ＤＭＰＣ：１，２−ジテトラデカノイル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホコリン；ＰＯＮ：パラオキソナーゼ；ＨＰＦ：標準化高倍率野（ｈｉｇｈ ｐｏｗｅｒ ｆｉｅｌｄ）；ＰＡＰＣ：Ｌ−α−１−パルミトイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；ＢＬ／６：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ；Ｃ３Ｈ：Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ。

“保存的置換”という用語は、該当分子の活性［特異性（例えばリポ蛋白質に対する）］または結合親和性（例えば脂質またはリポ蛋白質に対する）を実質的に変化させないアミノ酸置換を示すために蛋白質またはペプチドについて用いられる。典型的には、保存的アミノ酸置換は、１個のアミノ酸を別の類似する化学的特性（例えば荷電または疎水性）を有するアミノ酸と置換することを意味する。以下の６群はそれぞれ互いに典型的保存的置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｌ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。

２つ以上の核酸またはポリペプチド配列について、“同一”またはパーセント“同一性”という用語は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いるかまたは目視的精査による測定にしたがって比較し、最大一致となるアラインメントを実施したとき、同じである２つ以上の配列またはサブ配列、または特定の割合の同じアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する２つ以上のサブ配列を指す。本発明のペプチドについては、配列同一性はペプチドの完全長に対して決定される。

配列比較の場合、テスト配列と比較するために、典型的には１つの配列がリファレンス配列として機能する。配列比較アルゴリズムを用いるときは、テスト配列およびリファレンス配列をコンピュータにインプットし、必要ならば、サブ配列コーデイネ−トを指定し、配列比較アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。それから配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターを基にして、リファレンス配列に対してテスト配列のパーセント配列同一性を計算する。

比較に最適な配列のアラインメントは、例えばＳｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２ （１９８１））によって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３ （１９７０））によって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４ （１９８８））の類似性探索方法によって、これらアルゴリズムのコンピュータによる実施によって［ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）］、または目視的精査によって実施できる（一般的には上掲書を参照：Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．）。

有用なアルゴリズムの一例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、関連性とパーセント配列同一性を示すために、漸進的ペアアラインメントを用いて関連する配列群から複数の配列アラインメントを創造する。それはアラインメントを作製するために用いられるクラスタリング関係を示す系統図または樹状図もまたプロットする。ＰＩＬＥＵＰはＦｅｎｇ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８７）（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ３５：３５１−３６０ ）の漸進的アラインメント法の平易化したものを用いている。使用される方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ（１９８９）（ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３）が記載した方法と類似する。プログラムは、その各々の最大の長さが５０００ヌクレオチドまたはアミノ酸である最大３００配列のアラインメントを実施することができる。マルチアラインメント方法は、２つのもっとも類似する配列のペアーアラインメントから始まって、アラインメントされた配列のクラスターが産出される。それからこのクラスターを次のもっとも関連する配列またはアラインメントされた配列のクラスターに対してアラインメントを実施する。２つの配列クラスターは２つの個々の配列のペアアラインメントとして単純に伸長するこによってアライメントされる。最後的なアラインメントは、一連の漸進的ペアアラインメントによって得られる。プログラムは、特定の配列およびそれらのアミノ酸またはヌクレオチド対等物を配列比較領域のために指定し、プログラムのパラメーターを指定することによって実施される。例えば以下のパラメーターを用いて、リファレンス配列を他のテスト配列と比較してパーセント配列同一性関係を決定することができる：デフォルトギャップ重（３．００）、デフォルトギャップ長重（０．１０）および加重エンドギャップ。

パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適したアルゴリズムの別の例はＢＬＡＳＴアルゴリズムである。前記は以下の文献に記載されている：Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０。ＢＬＡＳＴ分析を実施するソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公に入手することができる。このアルゴリズムは、クエリー配列中の長さがＷの短いワードを識別することによって高スコアをもつ配列ペア（ＨＳＰ）を先ず初めに識別する。そのワードは、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインしたときある正の値をもつ閾値スコアＴとマッチするかまたはそれを満足させるものである。Ｔは近傍ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．上掲書）。これらの最初の近傍ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるために検索開始核として機能する。続いて前記ワードヒットを各配列の両方向に、累積アラインメントスコアが増加する限り伸長する。累積スコアは、ヌクレオチド配列についてはパラメーターＭ（マッチする残基のペアーの場合の褒賞スコアで常に０より大きい）およびＮ（ミスマッチ残基の場合のペナルティースコアで常に０より小さい）を用いて計算される。アミノ酸配列については、累積スコアを計算するためにスコア付与マトリックスを用いる。各方向のワードヒットの伸長は以下の場合に停止する：累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下したとき；その累積スコアが、１つ以上の負のスコアを与える残基アラインメントの蓄積のために０またはそれより小さくなったとき；またはどちらかの配列の末端に達したとき。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸはアラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）はデフォルトとして、ワード長（Ｗ）：１１、期待値（Ｅ）：１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムはデフォルトとして、ワード長（Ｗ）：３、期待値（Ｅ）：１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア付与マトリックスを用いる（以下を参照）：Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５）。

パーセント配列同一性の計算に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた２つの配列間の類似性の統計解析を実施する（例えば以下を参照：Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の測定の１つは最少合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチド間またはアミノ酸配列間の適合が偶然によって生じる確率を示す。例えば、ある核酸は、テスト核酸とリファレンス核酸の比較で最少合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、もっとも好ましくは約０．００１未満である場合、リファレンス配列と類似すると考えられる。

発明の詳細な説明
Ｉ．アテローム性硬化症の症状の緩和
本発明は、ペプチドの極性面上に分散した（ランダム分散または無秩序分散など）荷電残基をもつ両親媒性ヘリックスペプチドの類似体が抗炎症特性を有し、アテローム性硬化症または炎症性反応によって特徴づけられる病理症状（例えば慢性関節リウマチ、紅斑性狼瘡、結節性多発性動脈炎および骨粗しょう症）を緩和することができるという驚くべき発見に関する。本発明の好ましいペプチドは一般的に、アポリポプロテインＪ（アポＪ）の両親媒性ヘリックスドメインに擬似する。

ある種の好ましい実施態様では、前記ペプチドは、ペプチドの極性面上に分布した荷電残基（陽性および／または陰性荷電残基）を有し且つ広い非極性面を備える（球状蛋白質様、Ｇ^*両親媒性ヘリックスドメインと称される）両親媒性ヘリックスペプチドの類似体である。そのような両親媒性ヘリックスＧ^*ドメインはアポＪおよび他のある種のアポプロテインの特徴である（例えばアポＡＩ、アポＡＩＶ、アポＥ、アポＣＩＩ、アポＣＩＩＩなどであるがアポＡ−ＩＩまたはアポＣ−Ｉではない）。本発明のペプチドは好ましくは長さが約１０から約１００個アミノ酸、より好ましくは長さが約１０から約６０または８０個アミノ酸、もっとも好ましくは長さが約１０、１５、または２０個アミノ酸から約４０または５０個アミノ酸の範囲である。ある種の実施態様では、前記ペプチドは長さが約１０から約４０個アミノ酸の範囲である。特に好ましい本発明のペプチドはアポＪまたはそのフラグメントと（長さが約１０から約４０個アミノ酸の範囲で、例えば問題のペプチドと同じ長さに対して）、約４０％を超える、好ましくは約５０％または６０％を超える、より好ましくは約７０％または８０％を超える、もっとも好ましくは約９０％または９５％を超える配列同一性を示す。

そのようなペプチドは、特に１個以上のＤ型アミノ酸を含むときに、対応するＬ型ペプチドの生物学的活性を保持するということは本発明の驚くべき発見であった。更にこれらのペプチドは経口的に投与されたときですらｉｎ ｖｉｖｏ活性を示す。前記ペプチドは血中半減期の増加、およびアテローム性硬化症の１つ以上の症状の緩和もしくは予防／抑制能力の増加を示す。

我々は、正常ＨＤＬは軽度酸化ＬＤＬ形成の３つのステップを阻害することを見出した。これらの研究において（例えばＷＯ０２／１５９２３を参照）、我々はヒトＬＤＬをｉｎ ｖｉｔｒｏでアポＡ−ＩまたはアポＡ−Ｉ擬似ペプチド（３７ｐＡ）で処理すると、ＬＤＬからＨＰＯＤＥおよびＨＰＥＴＥを含めたシーディング分子が除去されることを立証した。これらのシーディング分子は、ヒト動脈壁細胞の共培養がＬＤＬを酸化することができるようになるために、また、ＬＤＬが動脈壁細胞において単球走化性活性を誘発させるために必要とされた。我々はまた、アポＡ−Ｉをマウスに注射するか、またはヒトに輸液した後、前記マウスまたはテスト志願者から単離されたＬＤＬはヒト動脈壁細胞による酸化に対して抵抗性を示し、動脈壁細胞共培養において単球の走化性活性を誘発しないことを立証した。

特定の理論に拘束ることなく、我々は、本発明のペプチドはＰＣＴ公開公報ＷＯ０２／１５９２３に記載されたアポＡ−Ｉ擬似物質の活性と類似する態様で機能すると考えている。特に我々は、本発明のペプチドは部分的にＨＤＬの抗炎症特性を高めることによって機能すると考えている。特に、我々は、本発明のペプチドはＬＤＬの酸化に必要なＬＤＬ中のシーディング分子と結合し、続いて前記シーディング分子を最終的にそれらが排出される場所へ運び去ると考えている。

我々は、アポリポプロテインＪの両親媒性ヘリックスドメインに擬似するペプチドは、動脈壁細胞による酸化に対してＬＤＬを保護すること、およびヒト動脈壁細胞によるＬＤＬ酸化の結果として生ずるＬＤＬ誘発性単球走化性活性（ヒト動脈壁細胞によるＬＤＬの酸化から生じる）の低下に特に有効であることを見出した。アポＪは、球状蛋白質様（またはＧ^*）両親媒性ヘリックスドメインと称される広い非極性面を有する。クラスＧ両親媒性ヘリックスは球状蛋白質として見出され、それゆえクラスＧの名称をもつ。前記クラスの両親媒性ヘリックスの特色は、狭い非極性面を含む極性面上にランダム／無計画に分布している陽性荷電と陰性荷電残基を有することである。前記狭い非極性面のために、このクラスはリン脂質と容易には結合しない（例えば以下を参照：Ｓｅｇｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８：１０３−１１７； Ｅｒｒａｔｕｍ （１９９１） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ９：７９）。いくつかの互いに交換可能なアポリポプロテインは、Ｇ両親媒性ヘリックスと類似するが同一でない特徴を有する。クラスＧ両親媒性ヘリックスと同様に、この別のクラスはその極性面に陽性および陰性に荷電した残基のランダム分布を有する。しかしながら、狭い非極性面を有するクラスＧ両親媒性ヘリックスとは対照的に、このクラスは広い非極性面を有し、それによってこのクラスはリン脂質と容易に結合し、このクラスはＧクラスの両親媒性ヘリックスと区別するためにＧ^*と称される（以下を参照：Ｓｅｇｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．， ３３：１４１−１６６； Ａｎａｎｔｈａｒａｍａｉａｈ ｅｔ ａｌ． （１９９３） ｐｐ． １０９−１４２， "Ｔｈｅ Ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ Ｈｅｌｉｘ"， Ｒ．Ｍ． Ｅｐａｎｄ， ｅｄ．， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌｏｒｉｄａ）。

動脈壁細胞とプレインキュベーションした場合、ヒト動脈壁細胞がＬＤＬを酸化できなくさせるために必要な本発明の両親媒性ヘリックスペプチドは、Ｄ４ＦのようなアポＡＩ擬似ペプチドよりも実質的に少なくてできたということは本発明の驚くべき発見であった。

我々は、Ｄアミノ酸から合成したアポＡＩ擬似ペプチドの経口投与によって、マウスのアテローム性硬化症は血中ＨＤＬコレステロール濃度の変化と無関係に劇的に減少することを示した。アポＡ−Ｉ擬似物質の作用と同様に、Ｄアミノ酸から合成される、アポＪの両親媒性ヘリックスドメインに擬似する合成ペプチドは経口的にまたは注射を含む他のルートによって投与することができ、アテローム性硬化症および他の慢性炎症状態を改善するであろうと考える。

本発明のペプチドは全てがＬ型であるアミノ酸を含むことができる。しかしながら、本発明者らは、１個以上のＤ型アミノ酸を含むペプチドおよび、好ましくは全てがＤ型であるアミノ酸を含む（全ての鏡像異性体アミノ酸がＤ型である）ペプチドは経口投与によってより効果的にデリバリーされ、血液循環中でより安定であろうと考える。特に好ましいペプチドは一方の端または両端が（例えばアセチル化Ｎ末端およびアミド化Ｃ末端により）ブロックされている。

本発明のペプチドの保護機能は実施例１で示される。ヒト動脈壁細胞によるＬＤＬ誘発性単球走化性活性を阻害するために必要な前記新規クラスのペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ濃度は、アポＡ−Ｉ擬似物質（Ｄ４Ｆ）で要求される濃度よりも１０から２５倍低い（図１でＤＪ３３６とＤ４Ｆを比較）。同様に、プレインキュベーションでは、本発明のペプチドは、動脈壁細胞によるＬＤＬ酸化防止作用において１０から２５倍強力であった（図２でＤＪ３３６とＤ４Ｆを比較）。図３に示すように、ＤＪ３３５を経口的にＬＤＬレセプターヌルマウスに投与したとき、前記ペプチドは、ＬＤＬ誘発性単球走化性活性の阻害においてＨＤＬを保護することにおいてＤ４Ｆと本質的に同程度に有効であった。

図４は、飲料水に添加したとき、本発明のペプチド（ＤＪ３３６）はアポＥヌルマウスのＨＤＬ保護能力強化においてＤ４Ｆと同程度に強力であることを示している。図５は、飲料水に添加したとき、本発明のペプチドＤＪ３３６は、アポＥヌルマウス由来のＬＤＬをヒト動脈壁細胞による酸化対する抵抗性において、単球の走化活性誘発により測定したとき、Ｄ４Ｆよりもわずかに強力であることを示している。図６は、飲料水に添加したとき、ＤＪ３３６は、ヒト動脈壁共培養細胞中での酸化物質ＨＰＯＤＥによるリン脂質ＰＡＰＣの酸化抑制をＨＤＬに引き起こさせることにおいて、単球走化活性の発生により測定したとき、Ｄ４Ｆと同程度に強力であることを示している（試験系の説明については以下を参照：Ｎａｖａｂ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ． ４２：１３０８−１３１７）。図７は、飲料水に添加したとき、ＤＪ３３６は、アポＥヌルマウスのパラオキソナーゼ活性の増加において少なくともＤ４Ｆと同程度に強力であることを示している。

多くの炎症性症状が少なくとも部分的には酸化脂質によって介在されると推定されているので、我々は、本発明もまた酸化脂質の生成によることが知られているかまたは疑われている症状の改善に効果があると考える。前記症状には慢性関節リウマチ、紅斑性狼瘡、結節性多発性動脈炎および骨粗しょう症が含まれるが、ただしこれらに限定されない。

特定の理論に拘束されないが、我々は、本発明の１つ以上のペプチドの投与（例えば注射）はインフルエンザＡの徴候および症状を改善するであろうと考える。更に、前記ペプチドはマクロファージの動脈壁への流入を劇的に低下させるであろう。このことは、インフルエンザおよび他のウイルス感染後に高率で発症する心臓発作を低下させるために高い有用性があるであろう。したがって、本発明のペプチドを用いて、インフルエンザおよび種々の他のウイルス性疾患の徴候および症状を改善し、これらのウイルス性疾患にしばしば続いて生ずる心臓発作および脳卒中の発生率を低下させるために用いることができる。

前述の記載から、ある実施態様では、本発明は、アテローム性硬化症および／または炎症性反応と関連する（炎症性反応によって特徴づけられる）病理変化の１つ以上の症状を改善および／または予防する方法を提供する。前記方法は、典型的には生物に、好ましくは哺乳類に、より好ましくはヒトに、本発明のペプチド（またはそのようなペプチドの擬似物質）の１つ以上を投与することを伴っている。前記ペプチドは、本明細書に記載したように標準的な多数の方法（注射、座薬、鼻内スプレー、経時放出移植物、経皮パッチなどを含むが、ただしこれらに限定されない）のいずれかにしたがって投与することができる。特に好ましい実施態様では、前記ペプチドは経口的に投与される（例えばシロップ、カプセルまたは錠剤）。

前記方法は、本発明の１つのポリペプチドの投与または２つ以上の異なるポリペプチドの投与を含む。前記ポリペプチドはモノマーとして、またはダイマー、オリゴマーもしくはポリマーで提供することができる。ある種の実施態様では、前記マルチマーは連結モノマー（例えばイオン的または疎水結合による）を含み、ある種のまた別のマルチマーは共有結合モノマー（直接的にまたはリンカーを介した連結）を含む。

本発明はヒトでの使用に関して記載されているが、動物（例えば獣医）の使用にも前記は適している。したがって、好ましい生物にはヒト、ヒト以外の霊長類、イヌ、ウマ、ネコ、ブタ、有蹄類、ラルゴモルフ（ｌａｒｇｏｍｏｒｐｈ）などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。

本発明の方法は、アテローム性硬化症の１つ以上の症状［例えば高血圧、プラーク形成および破裂、心臓発作、アンギナ、または脳卒中のような臨床症状の減少、血中コレステロール高値、低比重リポ蛋白質高値、超低比重リポ蛋白質高値または炎症性蛋白質など］を示しているヒトまたはヒト以外の動物に限定されず、予防としても有用である。したがって、本発明のペプチド（またはその擬似物質）は、アテローム性硬化症の１つ以上の症状の開始／進行の予防のために生物に投与することができる。本発明の特に好ましい対象者は、アテローム性硬化症の１つ以上の、以下の危険因子を示している者である（例えば高血圧、肥満、高アルコール摂取、喫煙、高血中コレステロール、高血中トリグリセリド、高血中ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、または低ＨＤＬの家族歴、糖尿病、または糖尿病、高脂血症、心臓発作、アンギナもしくは脳卒中の家族歴など）。

本発明のアテローム性硬化症抑制ペプチドを使用する方法に加えて、本発明はペプチドそのもの、特に経口デリバリー用医薬として製剤化されたペプチド、およびアテローム性硬化症の１つ以上の症状の治療および／または予防用キットもまた提供する。

ＩＩ．急性期炎症性反応と関連するアテローム性硬化症の症状の緩和
本発明のアテローム性硬化症抑制ペプチドは多数の他の目的でもまた有用である。特に我々は、心臓血管系合併症（例えばアテローム性硬化症、脳卒中など）は、しばしば急性期炎症性反応を伴ってあるいはそれに続いて発症することを観察した。このような急性炎症性反応はしばしば、再発性炎症性性疾患（例えば癩、結核、全身性紅斑性狼瘡および慢性関節リウマチ）、ウイルス感染症（例えばインフルエンザ）、細菌感染、真菌感染、臓器移植、創傷または他の外傷、移植人工器官、バイオフィルムなどと関連している。

本明細書に記載されているペプチドの１つ以上の投与によって急性期反応時またはその後の酸化リン脂質の形成を低下または予防し、それによってそのような症状と関連する心臓血管系合併症を緩和または排除することができるということは本発明の驚くべき発見であった。

したがって、例えば、我々は、インフルエンザ感染の結果はＨＤＬにおけるパラオキソナーゼおよび血小板活性化アセチルヒドロラーゼ活性の減少であることを示した。特定の理論に拘束されないが、我々は、これらＨＤＬ酵素活性の低下の結果として、また、急性期炎症性反応中にプロオキシダント蛋白質とＨＤＬが結合する結果として、ＨＤＬはもはやＬＤＬの酸化を阻害することができず、内皮細胞によるＬＤＬ誘発性単球走化性活性の産生を阻害できなかったと考えている。

我々は、非常に低用量のアポＡ−Ｉ擬似物質（たとえばマウスに対し２０μｇ）をインフルエンザＡウイルス感染後に毎日注射した被験動物では、パラオキソナーゼレベルは下降せず、生物学的に活性な酸化リン脂質はバックグラウンドを越えて生成されないことを観察した（例えばＷＯ０２／１５９２３、ＰＣＴ／ＵＳ０１／２６４９７を参照）。

本明細書に記載されるクラスのペプチドはＷＯ０２／１５９２３に記載されたアポ−Ｉ擬似物質と同様な態様で作用することができるということは本発明の驚くべき発見であった。この発見の見地から、本発明のペプチドを既知の冠状動脈疾患をもつ患者に、インフルエンザに感染している間に、または急性期炎症性反応を生じる他の症状（例えばウイルス感染による、細菌感染、外傷、移植、種々の自己免疫症状など）の間に（例えば経口的または注射によって）投与することができ、それゆえこのような短期間処置によって、そのような炎症状態を生じる病理変化と関連する心臓発作および脳卒中の発生率の増加を防ぐことができると考えている。

したがって、ある種の実施態様では、本発明は、本発明のペプチドの１つ以上を急性期炎症性反応の危険性のある患者または前記反応を起している患者に、および／またはアテローム性硬化症の危険性のある患者またはアテローム性硬化症の症状を起している患者に投与することを意図する。

例えば、冠状動脈疾患があるかまたはその危険性のある者に予防的にインフルエンザのシーズン中に本発明のポリペプチドを投与することができる。再発性炎症性症状（例えば慢性関節リウマチ、種々の自己免疫疾患など）の対象者（または対象動物）を本発明のポリペプチドで処置し、アテローム性硬化症の発生または脳卒中を緩和もしくは予防することができる。外傷（例えば急性損傷、組織移植など）を受けた人または動物は本発明のポリペプチドで処置して、アテローム性硬化症の進行または脳卒中を緩和することができる。

ある種の事例では、前記のような方法は急性炎症性反応の発生またはその危険性があるとの診断を必要とするであろう。前記急性炎症性反応は典型的には代謝および肝の遺伝子調節の変化を伴っている。前記は動的ホメオスタシスのプロセスであって、免疫系、心臓血管系および中枢神経系に加えて、身体の主要システムの全てを伴っている。通常は、急性期反応は数日続くだけであるが、慢性または再発性炎症の場合には、急性期反応のいくつかの局面の異常な持続は疾患を伴う重要な組織損傷の一因となり、そして合併症（例えば心臓血管系疾患またはアミロイドーシスのような蛋白質沈着疾患）もまたもたらすことがあるであろう。

急性期反応の重要な局面は激甚に変化する肝の生合成プロフィールである。正常な環境下では、肝は固有の範囲の血中蛋白質を定常的濃度で合成する。これら蛋白質の多くは重要な機能を有し、炎症性刺激に続く急性期反応中にはこれら急性期反応物質（ＡＰＲ）または急性期蛋白質（ＡＰＰ）の高い血中レベルが要求される。ほとんどのＡＰＲは肝細胞によって合成されるが、いくつかは、単球、内皮細胞、線維芽細胞および脂肪細胞を含む他の細胞タイプによって産生される。ほとんどのＡＰＲは正常レベルに対して５０％と数倍の間のレベルで誘導される。対照的に主要ＡＰＲは正常レベルに対して１０００倍増加する。この群には血清アミロイド（ＳＡＡ）およびヒトのＣ−反応性蛋白質（ＣＲＰ）またはそのマウス相同体、血清アミロイドＰ成分（ＳＡＰ）が含まれる。いわゆる負のＡＰＲは急性反応期中には血中濃度が減少し、肝臓の誘導性ＡＰＲの産生能力を高めることを可能にする。

ある種の実施態様では、急性期反応またはその危険性は１つ以上のＡＰＰを測定することによって判定される。そのようなマーカーの測定は当業者には周知であり、そのような測定方法を提供する会社が存在する（例えばＣａｒｄｉｏｔｅｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ， ＫＹ）によって測定されるＡＧＰ）。

ＩＩＩ．冠状動脈石灰化および骨粗しょう症と関連するする症状の緩和
我々はまた冠状動脈石灰化および骨粗しょう症の原因として酸化脂質を特定した。更に、特に理論に拘束されないが、我々は同じメカニズムが石灰化大動脈狭窄症の病因に関与すると考える。

したがってある種の実施態様では、本発明は、例えばリウマチ性多発性筋痛、結節性多発性動脈炎、強皮症、特発性肺線維症、慢性塞栓性肺疾患、アルツハイマー病、エイズ、冠状動脈石灰化、石灰化大動脈狭窄症、骨粗しょう症などのような疾患の症状を抑制または予防のために本発明に記載したペプチドを使用することを意図している。

ＩＶ．好ましいペプチドおよびその調製
好ましいペプチド
アポＪの両親媒性ヘリックスドメインに擬似するペプチドは、アテローム性硬化症および／または炎症性反応によって特徴づけられる他の病理変化の１つ以上の症状を緩和することができるということは本発明の発見であった。アポリポプロテインＪは、球状蛋白質様（またはＧ^*）両親媒性ヘリックスドメインと称される広い非極性面を有する。クラスＧ両親媒性ヘリックスは球状蛋白質として見出され、したがってクラスＧの名称を有する。このクラスの両親媒性ヘリックスは、狭い非極性面を含む極性面上に陽性または陰性荷電残基のランダム分布によって特徴づけられる。その狭い非極性面のためにこのクラスはリン脂質と容易には結合しない。Ｇ^*の両親媒性ヘリックスは、Ｇ両親媒性ヘリックスと同様な、しかし同一ではない特徴を有する。クラスＧ両親媒性ヘリックスと同様に、Ｇ^*クラスのペプチドはその極性面上に陽性および陰性荷電残基ランダム分布を有する。しかしながら、狭い非極性面を有するクラスＧ両親媒性ヘリックスとは対照的に、このクラスは広い非極性面を有し、これによってこのクラスはリン脂質と容易に結合することができ、このクラスはＧクラス両親媒性ヘリックスと区別するためにＧ^*と称される。

アポＪのＧ^*両親媒性ヘリックスドメインと関連する本発明の適切な種々のペプチドは表１に示される。

本発明のペプチドはしかしながらアポＪのＧ^*変種に限られない．一般的にいえば、本質的に他の任意の蛋白質（好ましくはアポプロテイン）のＧ^*ドメインもまた適切である。そのような蛋白質の個々の適切性は、例えば本明細書の実施例で示されているように保護活性（例えば酸化からＬＤＬを保護する活性など）についてのアッセイを用いて容易に決定することができる。いくつかの特に好ましい蛋白質は、アポＡＩ、アポＡＩＶ、アポＥ、アポＣＩＩ、アポＣＩＩＩなどを含む蛋白質（ただしこれらに限定されない）のＧ^*両親媒性ヘリックスドメインまたはその変種（例えば保存的置換など）を含む。

アポＪ以外のアポプロテインと関係を有するＧ^*両親媒性ヘリックスドメインと関連するある種の好ましいペプチドは表２に示される。

表１および表２に挙げた種々のペプチドは保護基無しで示されているが、ある種の実施態様では（例えば特に経口投与の場合）、それらは１つまたは２つの保護基、より好ましくは末端保護基を有する。したがって、例えばある種の実施態様では、本明細書に記載したペプチドのいずれも、例えばアミノ末端を保護するアセチル基および／またはカルボキシル末端を保護するアミド基をもつことができる。そのような“二重保護”ペプチドの一例は、Ａｃ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−Ｑ−Ｌ−Ｎ−Ｅ−Ｑ−Ｆ−Ｎ−Ｗ−Ｖ−Ｓ−Ｒ−Ｌ−Ａ−Ｎ−Ｌ−Ｔ−Ｑ−Ｇ−Ｅ−ＮＨ₂（ブロック基をもつ配列番号：１）であり、これら保護基のどちらか一方または両方は除去してもよく、そして／または本明細書に記載した別の保護基で置換してもよい。特に好ましい実施態様では、前記ペプチドは、本明細書に記載したように１つ以上のＤ型アミノ酸（左旋性よりはむしろ右旋性）を含む。ある種の実施態様では、少なくとも２個の鏡像異性体アミノ酸、より好ましくは少なくとも４個の鏡像異性体アミノ酸、もっとも好ましくは少なくとも８または１０個の鏡像異性体アミノ酸が“Ｄ”型アミノ酸である。ある種の実施態様では、本明細書に記載されたペプチドの全てのアミノ酸（例えばすべての鏡像異性体アミノ酸）がＤ型アミノ酸である。

表１および表２に挙げたペプチドは完全に包括的なものではないこともまた特記される。本明細書で提供した教示を用いて、他の適切なペプチドを容易に製造することができる（例えば保存的もしくは半保存的置換（例えばＥによるＤの置換）、伸長、欠失などによって）。したがって、例えばある実施態様は、配列番号：１−２９で特定されるペプチドのいずれか１つ以上の切端形を利用する。

より長いペプチドもまた適切である。そのような長いペプチドは完全なクラスＧまたはＧ^*両親媒性ヘリックスを形成し、またはＧ両親媒性ヘリックスは１つ以上の前記ペプチドのドメインを形成してもよい。更に、本発明は前記ペプチドのマルチマー型も意図する。したがって、例えば表１または表２に記載されたペプチドを一緒に連結させてもよい［直接またはリンカー（例えば炭素リンカー、または１個以上のアミノ酸）を介して］。適切なリンカーにはプロリン（−Ｐｒｏ−）、Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ₃（配列番号：３０）などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。したがって本発明のマルチマーペプチドの１つを例示すれば、（Ｄ−Ｊ３３６）−Ｐ−（Ｄ−Ｊ３３６）、すなわち、以下の通りである。

本発明はまた、１つ以上のＧまたはＧ^*両親媒性ヘリックスドメインおよび１つ以上のクラスＡ両親媒性ヘリックスを含む“ハイブリッド”ペプチドの使用も意図する。適切なクラスＡ両親媒性ヘリックスペプチドはＰＣＴ公開公報ＷＯ０２／１５９２３に記載されている。したがって、例示としてはそのような“ハイブリッド”ペプチドは（Ｄ−Ｊ３３６）−Ｐｒｏ−（４Ｆ）、すなわち以下に示した1例などである。

上記に示したように、本発明のペプチドは好ましくは１個以上のＤアミノ酸、より好ましくは本明細書に記載したように全てのアミノ酸がＤアミノ酸であるペプチドを含み、および／またはその一端または両端が保護されている。好ましくは少なくとも５０％の鏡像異性体アミノ酸が“Ｄ”型であり、より好ましくは少なくとも８０％の鏡像異性体アミノ酸が“Ｄ”型であり、もっとも好ましくは少なくとも９０％の鏡像異性体アミノ酸が“Ｄ”型アミノ酸である。

本発明の両親媒性ヘリックスペプチド（例えば図３、４、５、６、７、８および９に示されている）がＤアミノ酸を取り込んだとき、それらは経口的に投与されたときでさえその活性を保持していたということは本発明の驚くべき発見であった。更に、この経口投与は比較的効果的な取り込みおよび顕著な血清半減期をもたらし、それによってアテローム性硬化症および／または炎症性反応によって特徴づけられる他の状態の１つ以上の症状を軽減する効果的な方法を提供する。

本明細書で提供する技術を用いて、例示した両親媒性ヘリックスペプチドを当業者は機械的に改変し、適切な他のアポＪ変種および／または本発明の両親媒性Ｇヘリックスペプチドを製造することができる。例えば、機械的な保存または半保存置換物（例えばＥによるＤの置換）を現存のアミノ酸から生成することができる。得られたペプチドの脂質親和性に対する種々の置換の影響は、Ｐａｌｇｕｎａｃｈａｒｉら（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ， Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ＆ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １６：３２８−３３８ （１９９６））が記載したコンピュータによる方法を用いて予測することができる。本ペプチドは、当該クラスのヘリックス構造が保存される限り延長または短縮することができる。更に、置換を実施して、得られたペプチドを対象種によって内因性に生成されるペプチドにいっそう類似させることができる。

新規なペプチドはコンピュータによる方法を用いてデザインし、および／または評価することができる。両親媒性ヘリックスドメインを特定し分類するコンピュータプログラムは当業者には周知で、多くのものがＪｏｎｅｓら（Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ． ３３：２８７−２９６ （１９９２））によって記述されている。そのようなプログラムには、ヘリックスホイールプログラム（ＷＨＥＥＬまたはＷＨＥＥＬ／ＳＮＯＫＥＬ）、ヘリックスネットプログラム（ＨＥＬＮＥＴ、ＨＥＬＮＥＴ／ＳＮＯＲＬＥＬ、ＨＥＬＮＥＴ／Ａｎｇｌｅ）、ヘリックスホイールの追加のためのプログラム（ＣＯＭＢＯまたはＣＯＭＢＯ／ＳＮＯＲＫＥＬ）、ヘリックスネットの追加のためのプログラム（ＣＯＭＮＥＴ、ＣＯＭＮＥＴ／ＳＮＯＲＫＥＬ、ＣＯＭＢＯ／ＳＥＬＥＣＴ、ＣＯＭＢＯ／ＮＥＴ）、コンセンサスホイールプログラム（ＣＯＮＳＥＮＳＵＳ、ＣＯＮＳＥＮＳＵＳ／ＳＮＯＲＫＥＬ）などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。

好ましい実施態様では、本発明のペプチドは、天然に存在するアミノ酸または天然に存在するアミノ酸のＤ型を利用する一方、天然には存在しないアミノ酸による置換物（例えばメチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム、ノルロイシン、エプシロン−アミノカプロン酸、４−アミノブタン酸、テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、８−アミノカプリル酸、４−アミノブチル酸、Ｌｙｓ（Ｎ（エプシロン）−トリフルオロアセチル）、α−アミノイソブチル酸など）もまた意図される。

本明細書に記載したＧ^*両親媒性ヘリックスペプチドの他に、ペプチドミメティクスもまた本明細書で意図される。ペプチド類似体は製薬工業では、テンプレートペプチドの特性に類似する特性を有する非ペプチド医薬として一般的に用いられる。これらのタイプの非ペプチド化合物は“ペプチド擬似物質”または“ペプチドミメティクス”と称され（Ｆａｕｃｈｅｒｅ （１９８６） Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ． １５：２９； Ｖｅｂｅｒ ａｎｄ Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ （１９８５） ＴＩＮＳ ｐ．３９２； Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３０：１２２９）、通常コンピュータ分子モデリングの補助により開発される。治療的に有用なペプチドに構造的に類似するペプチド擬似物質は等価の治療効果または予防効果を得るために使用することができるであろう。

一般的には、ペプチドミメティクスは典型ポリペプチド（例えば表１に示される配列番号：１）と構造的に類似するが、１つ以上のペプチド結合が場合によって−ＣＨ₂ＮＨ−、ＣＨ₂Ｓ−、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ₂−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₂−、などから成る群から選択される連結によって置換されている。前記置換は当技術分野で周知であり、更に以下の参考文献に記載されている。：Ｓｐａｔｏｌａ （１９８３） ｐ．２６７， "Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｂ． Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ， ｅｄｓ．， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ ｙｏｒｋ； Ｓｐａｔｏｌａ （１９８３） Ｖｅｇａ Ｄａｔａ １（３） Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．（全般的概説）；Ｍｏｒｌｅｙ（１９８０）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ｐｐ４６３−４６８（全般的概説）；Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９７９） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔ． Ｐｒｏｔ． Ｒｅｓ． １４：１７７−１８５（−ＣＨ₂ＮＨ−、ＣＨ₂ＣＨ₂−）；Ｓｐａｔｏｌａ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ３８：１２４３−１２４９（−ＣＨ₂−Ｓ）；Ｈａｎｎ， （１９８２） Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ Ｉ ３０７−３１４（−ＣＨ−ＣＨ−、シスおよびトランス）；Ａｌｍｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９８０） Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２３：１３９２−１３９８（−ＣＯＣＨ₂−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ． （１９８２） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ２３：２５３３（−ＣＯＣＨ₂−）；Ｓｚｅｌｋｅ ｅｔ ａｌ． 欧州特許出願ＥＰ４５６６５ （１９８２）ＣＡ：９７：３９４０５ （１９８２）（−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₂−）；Ｈｏｌｌａｄａｙ ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ２４：４４０１−４４０４（−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ₂−）；およびＨｒｕｂｙ （１９８２） Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ３１：１８９−１９９（−ＣＨ₂−Ｓ−）。

特に好ましい非ペプチド結合は−ＣＨ₂ＮＨ−である。そのようなペプチド擬似物質はポリペプチド実体に対して、より経済的な製造、より高い化学的安定性、薬理学的特性の強化（半減期、吸収、効能、有効性など）、抗原性の減少などを含む重要な利点を有するであろう。

更に、本明細書に記載したペプチドの環状変異、またはコンセンサス配列もしくは実質的に同一なコンセンサス配列変種を含む拘束ペプチド（環状化ペプチドを含む）も当技術分野で周知の方法（Ｒｉｚｏ ａｎｄ Ｇｉｅｒａｓｃｈ （１９９２） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６１：３８７）によって（例えば前記ペプチドを環状化させる分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を添加することによって）生成することができる。

ペプチドの製造
本発明で用いられるペプチドは、標準的な化学的ペプチド合成技術を用いて化学的に合成するかまたは、特に前記ペプチドが“Ｄ”アミノ酸残基を含まない場合は遺伝子組換えで発現させてもよい。ある種の実施態様では、“Ｄ”アミノ酸残基を含むペプチドでさえも遺伝子組換えにより発現させることができる。。前記ポリペプチドを遺伝子組換えにより発現させる場合は、ホスト生物（例えば細菌、植物、真菌細胞など）は、１個以上のアミノ酸がもっぱらＤ型で提供される環境下で培養される。前記のような系で遺伝子組換えにより発現されるペプチドはしたがってそのようなＤアミノ酸を取り込む。

好ましい実施態様では、前記ペプチドは、当業者に周知の多数の液相または固相ペプチド合成技術のいずれかによって化学的に合成される。前記配列のＣ−末端アミノ酸が不溶性支持体に結合され、続いて配列中の残余のアミノ酸が連続的に付加される固相合成が、本発明のポリペプチドの化学合成に好ましい方法である。固相合成のための技術は当業者に周知であり、例えば以下の文献に記載されている：Ｂａｒａｎｙ ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ （１９６３） Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ； ｐｐ．３−２８４ "Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｖｏｌ．２：Ｓｐｅｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｐａｒｔ Ａ； Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ． （１９６３） Ｊ． Ａｍ．Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ８５：２１４９−２１５６； Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ２ｎｄ ｅｄ． Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ． Ｃｏ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， Ｉｌｌ。

もっとも好ましい実施態様では、前記ペプチドは、固相支持体としてベンゾヒドリルアミン樹脂（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ， ０．５９ｍｍｏｌＮＨ₂／ｇ樹脂）を用いる固相ペプチド合成方法で合成される。ＣＯＯＨ末端アミノ酸（例えばｔ−ブチルカルボニル−Ｐｈｅ）が固相支持体に４−（オキシメチル）フェナセチル基を介して結合される。前記は通常のベンジルエステル結合よりも安定な結合である、しかし完成ペプチドは水素添加によって切断することができる。水素ドナーとしてギ酸を使用する水素転移がこの目的に用いられる。ペプチド合成および合成されたペプチドの分析に用いられる詳細なプロトコ−ルは、Ａｎａｎｔｈａｒａｍａｉａｈら（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０（１６）：１０２４８−１０２５５ （１９８５））の文献に添付されたミニプリント補遺に記載されている。

ペプチド（特にＤアミノ酸を含むペプチド）の化学合成では、通常所望の完全長生成物の他に多数の切端形ペプチドが生成されることが特記される。精製プロセス（例えばＨＰＬＣ）は典型的には顕著な量の完全長生成物の損失をもたらす。

Ｄペプチド（例えばＤ−４）の合成で、最長形の精製での損失を防ぐために、混合物を透析しこれを用い、したがって最後のＨＰＬＣ精製を排除することができることは本発明の発見であった。そのような混合物は高度に精製された生成物の効能の約５０％（例えば蛋白質生成物の重量当たり）を失うが、前記混合物は約６倍のペプチドを含み、したがってより高い総活性を有する。

Ｄ型アミノ酸
Ｄアミノ酸は、化学合成でＤ型由来アミノ酸残基を用いることによって前記ペプチドの１つ以上の位置に簡単に取り込まれる。固相ペプチド合成のためのＤ型残基は多数の供給元から市販されている（例えばＡｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍ Ｔｅｃｈ， Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ； Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ； Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ； Ｂａｃｈｅｍ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｉｎｃ．， Ｔｏｒｒａｎｃｅなど）。Ｄ型アミノ酸は所望のようにペプチドの任意の位置に取り込ませることができる。したがって、例えばある実施態様では前記ペプチドはただ１個のＤ−アミノ酸を含み、一方、他の実施態様では前記ペプチドは少なくとも２個、一般的には少なくとも３個、より一般的には少なくとも４個、もっとも一般的には少なくとも５個、好ましくは少なくとも６個、より好ましくは少なくとも７個、もっとも好ましくは少なくとも８個のＤアミノ酸を含む。特に好ましい実施態様では、本質的に全ての（鏡像異性体）アミノ酸がＤ型アミノ酸である。ある種の実施態様では、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の鏡像異性体アミノ酸がＤ型アミノ酸である。特に好ましい実施態様では、本質的に全ての鏡像異性体アミノ酸がＤ型アミノ酸である。

保護基
ある種の実施態様では、構成アミノ酸および／または末端アミノ酸の１つ以上のＲ基が保護基でブロックされる。特定の理論に拘束されないが、前記ブロック、特に本発明のペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシ末端のブロックは、経口デリバリーを大いに改善し、血中半減期を有意に増加させるということは本発明の発見であった。

この目的には広く多数の保護基が適している。そのような基にはアセチル、アミド、およびアセチルをもつアルキル基が含まれ（ただしこれらに限定されない）、Ｎ−末端保護にはアルキル基が特に好ましく、カルボキシル末端保護にはアミド基が特に好ましい。特に好ましいある実施態様では、保護基には脂肪酸の場合のようなアルキル鎖、プロペオニル、ホルミル、および他のものが含まれるが、ただしこれらに限定されない。特に好ましいカルボキシル保護基にはアミド、エステル、およびエーテル形成保護基が含まれる。ある好ましい実施態様では、アミノ末端の保護にアセチル基が用いられ、カルボキシル末端の保護にはアミド基が用いられる。これらのブロック基は前記ペプチドのヘリックス形成傾向を強化する。ある種の特に好ましいブロック基には種々の長さのアルキル基、例えば式ＣＨ₃−（ＣＨ₂）_n−ＣＯ−をもつ基が含まれる。前記式中、ｎは約１から約２０、好ましくは約１から約１６または１８、より好ましくは約３から約１３、もっとも好ましくは約３から約１０の範囲である。

ある種の特に好ましい実施態様では、保護基には脂肪酸の場合のようなアルキル鎖、プロペオニル、ホルミルおよび他のものが含まれるが、ただしこれらに限定されない。特に好ましいカルボキシル保護基にはアミド、エステル、およびエーテル形成保護基が含まれる。ある好ましい実施態様では、アセチル基がアミノ末端の保護に用いられ、アミド基がカルボキシル末端の保護に用いられる。これらのブロック基は前記ペプチドのヘリックス形成傾向を強化する。ある種の特に好ましいブロック基には種々の長さのアルキル基、例えば式ＣＨ₃−（ＣＨ₂）_n−ＣＯ−をもつ基が含まれる。前記式中、ｎは約３から約２０、好ましくは約３から約１６または１８、より好ましくは約３から約１３、もっとも好ましくは約３から約１０の範囲である。

その他の保護基には以下が含まれるが、ただしこれらに限定されない：Ｆｍｏｃ、ｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）、９−フルオレンアセチル基、１−フルオレンカルボン酸基、９−フルオレンカルボン酸基、９−フルオレノン−１−カルボン酸基、ベンジルオキシカルボニル、キサンチル（Ｘａｎ）、トリチル（Ｔｒｔ）、４−メチルトリチル（Ｍｔｔ）、４−メトキシトリチル（Ｍｍｔ）、４−メトキシ−２，３，６−トリメチル−ベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）、メシチレン−２−スルホニル（Ｍｔｓ）、４，４−ジメトキシベンゾヒドリル（Ｍｂｈ）、トシル（Ｔｏｓ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）、４−メチルベンジル（ＭｅＢｚｌ）、４−メトキシベンジル（ＭｅＯＢｚｌ）、ベンジルオキシ（ＢｚｌＯ）、ベンジル（Ｂｚｌ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル（Ｎｐｙｓ）、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジアキソシクロヘキシリデン）エチル（Ｄｄｅ）、２，６−ジクロロベンジル（２，６−ＤｉＣｌ−Ｂｚｌ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−Ｃｌ−Ｚ）、２−ブロモベンジルオキシカルボニル（２−Ｂｒ−Ｚ）、ベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）、シクロヘキシルオキシ（ｃＨｘＯ）、ｔ−ブトキシメチル（Ｂｕｍ）、ｔ−ブトキシ（ｔＢｕＯ）、ｔ−ブチル（ｔＢｕ）、アセチル（Ａｃ）、およびトリフルオロアセチル（ＴＦＡ）。

保護基／ブロック基は、本発明のペプチドを含む適切な残基にそのような基をカップリングする方法と同様に当業者には周知である（例えば以下を参照：Ｇｒｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． Ｓｏｍｅｒｓｅｔ， ＮＪ）。ある好ましい実施態様では、例えばアセチル化は、前記ペプチドが樹脂上にあるときに無水酢酸を用いて合成中に実施される。アミド保護は合成に適切な樹脂を選択することによって達成することができる。本明細書に記載したペプチドの実施例での合成ではリンク（ｒｉｎｋ）アミド樹脂が用いられた。合成の完了後に、酸性二官能性アミノ酸（例えばＡｓｐおよびＧｌｕ）および塩基性アミノ酸Ｌｙｓ、Ｔｙｒのヒドロキシル基の半永久的保護基を全て同時に除去する。前記のような酸で処理された樹脂から遊離されたペプチドは、Ｎ−末端がアセチルとして保護され、カルボキシル末端がＮＨ₂として保護され、また、同時に、他の全ての保護基が除去された状態で得られる。

Ｖ．ペプチド取り込みの強化
全てがＬアミノ酸であるペプチド（例えばその他の点では本発明のペプチドの配列を有する）をＤ型（すなわち本発明のペプチド）と一緒に投与したとき、Ｄ型ペプチドの取り込みが増加するということもまた本発明の驚くべき発見であった。したがって、ある種の実施態様では、本発明は、Ｄ型ペプチドおよびＬ型ペプチドを組み合わせて本発明の方法で使用することを意図する。Ｄ型ペプチドおよびＬ型ペプチドは異なるアミノ酸配列をもつことができるが、好ましい実施態様では、それらは両者とも本明細書に記載したペプチドのアミノ酸配列を有し、より好ましい実施態様では、それらは同じアミノ酸配列を有する。

本発明の両親媒性ヘリックスペプチドコンカテマ−もまたアテローム性硬化症の１つ以上の症状の緩和に効果的であることもまた本発明の発見であった。前記コンカテマ−を構成するモノマーは直接一緒に、またはリンカーによって連結させることができる。ある種の実施態様では、前記リンカーは、アミノ酸リンカー（例えばプロリン）またはペプチドリンカー（例えばＧｌｙ₄Ｓｅｒ₃、配列番号：３０）である。ある種の実施態様では、前記コンカテマ−は２量体、より好ましくは３量体、更に好ましくは４量体、もっとも好ましくは５、８、または１０量体である。上記に示したように、前記コンカテマ−は、ＰＣＴ公開公報ＷＯ０２／１５９２３に記載されたアポＡ−Ｉ変種と本明細書に記載のＧ^*関連両親媒性ヘリックスと組み合わせて含むことができる。

ＶＩ．医薬製剤：
本発明の方法を実施するために、本発明の１つ以上のペプチドまたはペプチド擬似物質が、例えばアテローム性硬化症の１つ以上の症状を有すると診断された、またはアテローム性硬化症の危険性があると診断された個体に投与される。前記ペプチドまたはペプチド擬似物質は、その“本来の形態”または、所望の場合には塩、エステル、アミド、プロドラッグ、誘導体などの形態で投与することができるが、塩、エステル、アミド、プロドラッグまたは誘導体が薬理学的に適切であり、すなわち本発明の方法では有効である。活性物質の塩、エステル、アミド、プロドラッグおよび他の誘導体は、有機合成化学分野の当業者に公知の標準的な方法を用いて製造でき、その方法は例えば以下に記載されている：Ｍａｒｃｈ （１９９２） Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ； Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ， Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ４ｔｈ Ｅｄ． ＮＹ， Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ。

例えば、酸付加塩は、典型的には適切な酸との反応を含む通常の方法を用いて遊離塩基から製造される。一般的には前記薬剤の塩基型を極性有機溶媒（例えばメタノールまたはエタノール）に溶解し、前記に酸を添加する。生成された塩を沈澱させるか、または極性の小さい溶媒を添加して溶液から取り出すことができる。酸付加塩を製造するために適切な酸には有機酸（例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸など）および無機酸（例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など）の両酸が含まれる。酸付加塩は適切な塩基で処理することによって再度遊離塩基に変換することができる。本明細書における活性物質の特に好ましい酸付加塩は、塩酸または臭化水素酸を用いて製造できるハロゲン化塩である。逆に、本ペプチドまたは擬似物質の塩基性塩の調製は、医薬として許容できる塩基（例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、トリメチルアミンなど）を用いて同様な態様で製造される。特に好ましい塩基性塩にはアルカリ金属塩、例えばナトリウム塩および銅塩が含まれる。

エステルの製造は、典型的には前記薬剤の分子構造内に存在するヒドロキシルおよび／またはカルボキシル基を官能基化することを伴っている。前記エステルは、典型的には遊離アルコール基［すなわち式ＲＣＯＯＨ（Ｒはアルキル、好ましくは低級アルキル）のカルボン酸に由来する分子］のアシル基置換誘導体である。エステルは、所望の場合は通常の水素添加分解または加水分解方法によって遊離酸に再変換することができる。

アミドおよびプロドラッグはまた、当業者に公知の技術または関連文献に記載の技術を用いて製造することができる。例えばアミドは適切なアミン反応物質を用いてエステルから製造するか、またはそれらは酸無水物または酸塩化物からアンモニアまたは低級アルキルアミンとの反応によって製造することができる。プロドラッグは典型的には、個体の代謝系によって改変されるまでは治療的に不活性な化合物にしておく分子を共有結合させることによって製造される。

本明細書で特定したペプチドまたは擬似物質は、アテローム性硬化症および／またはその症状の予防的および／または治療的処置のために非経口、局所、経口、経鼻（またさもなければ吸入）、直腸または局所投与（例えばエアロゾルによるかまたは経皮的に投与）に有用である。本医薬組成物は、投与方法に応じて多様なユニットドーズ製剤で投与することができる。適切なユニットドーズ製剤には、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、口内錠、座薬、パッチ剤、経鼻スプレー剤、注射用剤、インプラント徐放製剤、脂質複合体などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。

本発明のペプチドおよび／またはペプチド擬似物質は、典型的には医薬として許容できる担体（賦形剤）と組み合わせて薬理組成物が形成される。医薬として許容できる担体は、例えば組成物の安定化または活性物質の吸収を増加または減少させる機能する１つ以上の生理学的に許容できる化合物を含むことができる。生理学的に許容できる化合物には、例えば炭水化物（例えばグルコース、シュクロースまたはデキストラン、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸またはグルタチオン）、キレート剤、低分子量蛋白質、保護および取り込み強化物質（例えば脂質）、活性物質の排泄や加水分解を減少させる組成物や、賦形剤または他の安定剤および／または緩衝液が含まれる。

他の生理学的に許容できる化合物には、湿潤剤、乳化剤、分散剤、または微生物の生育もしくは作用を阻害するために特に有用な保存料が含まれる。種々の保存料が周知で、これらには例えばフェノールおよびアスコルビン酸が含まれる。医薬として許容できる担体の選択（生理学的に許容できる化合物を含む）は、例えば活性物質の投与経路および前記活性物質の生理化学的特性に依存することは当業者には理解されよう。

賦形剤は好ましくは滅菌済みで、一般的には望ましくない物質を含まない。これらの組成物は通常の周知の滅菌技術によって滅菌される。

治療適用においては、本発明の組成物はアテローム性硬化症の１つ以上の症状があるか、またはアテローム性硬化症の危険性がある患者に前記疾患および／またはその合併症を治癒または少なくとも部分的に予防もしくは停止させるために十分な量で投与される。前記を達成するために適切な量は“治療的有効用量”と定義される。このための有効量は疾患の重篤度および患者の健康の全般的状態に依存するであろう。本組成物の単回または複数回投与は、患者に必要で、また患者が耐えることができる用量および頻度に依存して実施することができる。どの場合にも、前記組成物は、患者を効果的に治療する（１つ以上の症状を改善する）ために十分量の本発明の活性物質製剤を提供しなければならない。

ペプチドまたは擬似物質の濃度は幅広く変動し、選択される個々の投与態様および患者の必要度に従い、最初は液体の容積、粘度、体重などを基準に選択されるであろう。しかしながら、濃度は典型的には、約０．１または１ｍｇ／ｋｇ／日から約５０ｍｇ／ｋｇ／日および、ときにはそれより高い範囲の用量を提供するように選択されるであろう。典型的な用量は約３ｍｇ／ｋｇ／日から約３．５ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは約３．５ｍｇ／ｋｇ／日から約７．２ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは約７．２ｍｇ／ｋｇ／日から約１１．０ｍｇ／ｋｇ／日、もっとも好ましくは約１１．０ｍｇ／ｋｇ／日から約１５．０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。ある種の好ましい実施態様では、用量は約１０ｍｇ／ｋｇ／日から約５０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。ある種の実施態様では、用量は１日に２回経口的に約２０ｍｇ／ｋｇ／日から約５０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲で投与される。前記のような用量は、個々の対象者または対象者群における治療計画の最適化のために変動させることができることは理解されよう。

ある種の好ましい実施態様では、本発明のペプチドまたはペプチド擬似物質は、経口的に（例えば錠剤により）または注射可能物質として、当業者に周知の標準的な方法にしたがって投与される。他の好ましい実施態様では、前記ペプチドは、通常の経皮薬剤デリバリー系（すなわち経皮“パッチ”）を用いて皮膚からデリバリーすることもまたできる。前記経皮パッチでは活性物質は典型的には薄層構造内に含まれ、前記薄層構造は皮膚に接着される薬剤デリバリー装置として機能する。そのような構造では、前記薬剤組成物は典型的には上部支持層の下に存在する層または“貯臓器”内に含まれる。この状況においては“貯臓器”という用語は、皮膚の表面にデリバリーするために究極的に利用可能なある分量の“活性成分”を指すことは理解されよう。したがって、例えば“貯臓器”は、パッチの背部支持層上の接着物質、または当技術分野で公知の多様な種々のマトリックス製剤のいずれかの中に存在する活性成分を含むことができる。前記パッチはただ１つの貯臓器を含むことができるが、前記はまた複数の貯臓器を含むことができる。

ある実施態様では、前記貯臓器は、ドラッグデリバリー中に前記の系を皮膚に付着させるために機能する医薬的に許容できる接触粘着性物質のポリマーマトリックスを含む。適切な皮膚接触粘着性物質の例には、ポリエチレン、ポリシロキサン、ポリイソブチレン、ポリアクリレート、ポリウレタンなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない。また代替的に、薬剤含有貯臓器および皮膚接触粘着剤は分離した別個の層として存在し、前記粘着剤は前記貯臓器の下に存在し、この場合には、前記貯臓器は上記に記載したようなポリマーマトリックスであるか、または液体もしくはヒドロゲル貯臓器であるか、または他の何らかの形態をとることができる。これらの薄層における支持層（前記装置の上部表面として機能する）は好ましくは“パッチ”の主要な構造成分として機能し、前記装置にその可撓性の多くを提供する。前記支持層として選択される材料は、好ましくは前記活性成分および含有される他のいずれの物質についても実質的に非浸透性である。

薬剤の局所デリバリーのための他の好ましい製剤は軟膏およびクリームであるが、ただしこれらに限定されない。軟膏は半固形調製物であり、典型的にはワセリンまたは他の石油誘導体を基剤とする。選択した活性物質を含むクリームは典型的には粘稠な液体または半固形乳液であり、しばしば水中油または油中水である。クリーム基剤は典型的には水洗可能であり、油相、乳化剤および水相を含む。油相（時に“内”相とも称される）は一般的にはワセリンおよび脂肪酸アルコール（例えばセチルまたはステアリルアルコール）を含み、水相は通常（必ずしもそうではないが）容積において油相よりも多く、一般的には保湿剤を含む。クリーム製剤中の乳化剤は一般的には非イオン性、陰イオン性、陽イオン性または両性界面活性剤である。当業者に認められ、使用される特別な軟膏またはクリーム基剤は、最適なドラッグデリバリーを提供するものである。他の担体または賦形剤に関しては、軟膏基剤は不活性で、安定性があり、非刺激性で、感作性がないものであるべきである。

典型的なペプチド製剤とは異なり、Ｄ型アミノ酸を含む本発明のペプチドは、胃酸などによる蛋白質分解に対する防御無しに、経口的にでも投与することができる。にもかかわらず、ある種の実施態様では、ペプチドデリバリーは保護性賦形剤を用いることによって強化することができる。前記は典型的には、前記ポリペプチドを酸および酵素による加水分解に対して耐性にさせる組成物と前記ポリペプチドとの複合体を形成させるか、または適切な耐性をもつ担体（例えばリポソーム）中に前記ポリペプチドを被包化（パッケージング）することによって達成される。経口デリバリーのためにポリペプチドを保護する手段は当業界で周知である（例えば、治療薬の経口デリバリーのための脂質組成物について記載している米国特許５，３９１，３７７を参照）。

血中半減期の延長は徐放性蛋白質“パッケージング”系によって維持することができる。そのような徐放系は当業者に周知である。ある好ましい実施態様では、単独でまたは他の薬剤とともに乾燥製剤として調合することができるポリマーマトリックス中に前記蛋白質を含む生物分解性ポリマー微小球で構成された乾燥粉末が、蛋白質およびペプチドのためのプロリース（ＰｒｏＬｅａｓｅ）生物分解性微小球デリバリー系（Ｔｒａｃｙ （１９８８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ． １４：１０８； Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ２：７９５； Ｈｅｒｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ． Ｒｅｓ． １５：３５７）で用いられる。

前記プロリース微小球の製造プロセスは、蛋白質の完全性を維持しながら高い蛋白質被包化効率を達成できるように特に考案された。前記プロセスは以下のから成る：（ｉ）薬剤溶液を安定化剤とともにスプレーフリーズドライすることによって原料蛋白質から凍結乾燥蛋白質粒子を調製し、（ｉｉ）薬剤粒子のサイズを減少させるために薬剤−ポリマー懸濁物を調製した後、超音波処理またはホモジナイズし、（ｉｉｉ）液体窒素中へ噴霧することによって凍結薬剤−ポリマー微小球を生成し、（ｉｖ）前記ポリマー溶媒をエタノールで抽出し、そして（ｖ）最終乾燥粉末生成物を製造するためにろ過および真空乾燥する。結果的に得られた粉末は前記固体の蛋白質を含み、前記蛋白質は多孔性のポリマー粒子内に均一および厳密にに分散される。前記プロセスでもっとも一般的に用いられるポリマー、ポリ（ラクタイド−コ−グリコライド）（ＰＬＧ）は生体適合性および生物分解性の両性質を有している。

被包化は低温（例えば−４０℃）で実施できる。被包化の間、蛋白質は水の不存在下で固体で維持される。そうすることにより、水によって誘導される蛋白質の立体配座移動を最小限にし、反応物質として水が関与する蛋白質の分解反応を防止し、且つ蛋白質を変性させる有機相−水相境界面を回避することができる。好ましいプロセスでは、ほとんどの蛋白質不溶性溶媒が用いられ、それゆえ高い被包化効率が得られる（例えば９５％以上）。

別の実施態様では、溶液の１つ以上は、希釈できるように準備された保存容器中に入れられた“濃縮物”として（前もって容量が測定された）、またはある容量の水をを添加するように準備された水溶性カプセルとして提供することができる。

前述の製剤および投与方法は例示を意図し、前記に限定されない。本明細書に提供した教示を用いて、他の適切な製剤および投与態様を容易に考案できよう。

ＶＩＩ．脂質基剤製剤

ある種の実施態様では、本発明のペプチドは１つ以上の脂質と一緒に投与される。前記脂質は、前記ペプチドの保護および／または前記ペプチドの輸送／取込みの強化のために賦形剤として製剤化することができるかまたは、それらは別々に投与することもできる。

特定の理論に拘束されないが、ある種のリン脂質の投与（例えば経口投与）はＨＤＬ／ＬＤＬ比を有意に高めることができるということは本発明の発見であった。更に、ある長さが中等度のリン脂質は、一般的な脂質輸送に関与する輸送とは異なるプロセスで輸送されると考えられている。それゆえ、本発明のペプチドとある長さが中等度のリン脂質との併用投与は多くの利点を与える：それらは消化や加水分解からリン脂質を保護し、それらはペプチドの取り込みを改善し、それらはＨＤＬ／ＬＤＬ比を改善する。

前記脂質を用いて本発明のポリペプチドを被包化するリポソームを形成するか、および／または前記脂質を本発明のポリペプチドと複合体化するか／混合するか、および／または前記脂質を本ポリペプチドと共有結合させることができる。リポソームの製造方法および被包化試薬は当業者には周知である（例えば以下等を参照：ｍＭａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ （１９８２） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５７：２８６−２８８； Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８：１１４６０−１１４６４； Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５２：６７７４−６７８１； Ｌａｓｉｃ ｅｔ ａｌ． （１９９２） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ３１２：２５５−２５８）。

これらの方法で用いられる好ましいリン脂質は、ｓｎ−１およびｓｎ−２位に約４から約２４の範囲の炭素鎖脂肪酸を有する。ある種の好ましい実施態様では、前記脂肪酸は飽和されている。他の好ましい実施態様では前記脂肪酸は不飽和でもよい。種々の好ましい脂肪酸は表３に示されている。

前記の位置の脂肪酸は同じでも異なっていてもよい。特に好ましいリン脂質はそのｓ−３位にホスホリルコリンを有する。

ＶＩＩＩ．付加的薬理学的活性物質
付加的薬理学的活性物質を主要活性物質（例えば本発明のペプチド）とともにデリバリーすることができる。ある実施態様では、そのような物質には、アテローム性硬化症の症状および／またはその合併症の危険性を減少させる物質が含まれるが、ただしそれらに限定されない。前記物質にはβ‐ブロッカー、β‐ブロッカーとチアジド系利尿薬の組合せ、スタチン、アスピリン、ＡＣＥ阻害薬（アンギオテンシン変換酵素阻害剤）、ＡＣＥ受容体阻害薬（ＡＲＢ）などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。

適切なβ‐ブロッカーには心選択性ブロッカー（選択性β１ブロッカー）、例えばアセブトロール（Ｓｅｃｔｒａｌ（商品名））、アテノロール（Ｔｅｎｏｒｍｉｎ（商品名））、ベタキソロール（Ｋｅｒｌｏｎｅ（商品名））、ビソプロロール（Ｚｅｂｅｔａ（商品名））、メトプロロール（Ｌｏｐｒｅｓｓｏｒ（商品名））などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。適切な非選択性遮断薬（β１およびβ２を等しく遮断する）にはカルテオロール（Ｃａｒｔｒｏｌ（商品名））、ナドロール（Ｃｏｒｇａｒｄ（商品名））、ペンブトロール（Ｌａｖａｔｏｌ（商品名））、ピンドロール（Ｖｉｓｋｅｎ（商品名））、プロパノロール（Ｉｎｄｅｒａｌ（商品名））、チモロール（Ｂｌｏｃｋａｄｒｅｎ（商品名））、ラベタロール（Ｎｏｒｍｏｄｙｎｅ（商品名）、Ｔｒａｎｄａｔｅ（商品名））などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。

適切なβ‐ブロッカーとチアジド系利尿薬の併用には、ロプレッサーＨＣＴ、ＺＩＡＣ、テノレティック、コルジド、チモリド、インデラルＬＡ４０／２５、インデリド、ノルモジドなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない。

適切なスタチンにはプラバスタチン（Ｐｒａｖａｃｈｏｌ／Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｅｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、シムバスタチン（Ｚｏｃｏｒ／Ｍｅｒｃｋ）、ロバスタチン（Ｍｅｖａｃｏｒ／Ｍｅｒｃｋ）などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。

適切なＡＣＥ阻害薬には、カプトプリル（例えばＣａｐｏｔｅｎ（商品名）／Ｓｑｕｉｂｂ）、ベナゼプリル（例えばＬｏｔｅｎｓｉｎ（商品名）／Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、エナラプリル（例えばＶａｓｏｔｅｃ（商品名）／Ｍｅｒｃｋ）、フォシノプリル（例えばＭｏｎｏｐｒｉｌ（商品名）／Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ）、リシノプリル（例えばＰｒｉｎｉｖｉｌ（商品名）／ＭｅｒｃｋまたはＺｅｓｔｒｉｌ（商品名）／Ａｓｔｒａ−Ｚｅｎｅｃａ）、キナプリル（例えばＡｃｃｕｐｒｉｌ（商品名）／Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ）、ラミプリル（例えばＡｌｔａｃｅ（商品名）／Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｍａｒｉｏｎ Ｒｏｕｓｓｅｌ， Ｋｉｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、イミダプリル、ペリンドプリルエルブミン（例えばＡｃｅｏｎ（商品名）／Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ）、トランドラプリル（例えばＭａｖｉｋ（商品名）／Ｋｎｏｌｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｒｕｔｉｃａｌ）などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。適切なＡＲＢＳ（ＡＣＥ受容体阻害薬）にはロザルタン（例えばＣｏｚａａｒ（商品名）／Ｍｅｒｃｋ）、イルベサルタン（例えばＡｖａｐ（商品名）／Ｓａｎｏｆｉ）、カンデサルタン（例えばアタカンド（商品名）／Ａｓｔｒａ Ｍｅｒｃｋ）、バルサルタン（例えばＤｉｏｖａｎ（商品名）／Ｎｏｖａｒｔｉｓ）などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。

ＩＸ．アテローム性硬化症の１つ以上の症状の改善用キット
別の実施態様では、本発明はアテローム性硬化症の１つ以上の症状の改善のため、またはアテローム性硬化症の危険性のある対象者（ヒトまたは動物）の予防的処置のためのキットを提供する。前記キットは好ましくは本発明の１つ以上のペプチドまたはペプチド擬似物質を収納する容器を含む。前記ペプチドまたはペプチド擬似物質はユニットドーズ製剤（例えば座薬、錠剤、カプレット、パッチなど）として提供することができ、および／または場合によっては１つ以上の医薬として許容できる賦形剤と組み合わせることができる。

前記キットは場合によって、心疾患および／またはアテローム性硬化症の治療で用いられる１つ以上の他の薬剤を更に含むことができる。そのような薬剤にはβ‐ブロッカー、血管拡張剤、アスピリン、スタチン、ＡＣＥ阻害薬またはＡＣＥ受容体阻害薬（ＡＲＢ）など（例えば上記に記載したようなもの）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。

その他に、前記キットはラベルおよび／または、本方法の実施または本発明の“治療薬”もしくは“予防薬”の使用についての指示（すなわちプロトコル）を提供するインストラクションマテリアルを含む。好ましいインストラクションマテリアルには、アテローム性硬化症の１つ以上の症状を軽減させるため、および／またはアテローム性硬化症の危険性のある個体でそのような症状の１つ以上の発症または増加を予防するため、および／または炎症性反応によって特徴づけられる病理変化の１つ以上の症状を軽減させるために本発明の１つ以上のポリペプチドの使用について記載する。前記インストラクションマテリアルには、場合によっては、望ましい用量／与薬治療方法、解毒方法などもまた記載されよう。

前記インストラクションマテリアルは典型的には手書きまたは印刷物を含むが、それらに限定されない。そのようなインストラクションを保存し、またそれらを末端の使用者に伝達することができる任意の媒体が本発明では意図される。そのような媒体には電子的保存媒体（例えば磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えばＣＤＲＯＭ）などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。そのような媒体は、前記のインストラクションマテリアルを提供するインターネットサイトへのアドレスを含むことができる。

以下の実施例は、本請求の発明を説明するために提供されているが、発明を制限するためのものではない。

［実施例１］
アテローム性硬化症の症状緩和のためのアポＪ関連ペプチドの使用
ＬＤＬ誘発性単球走化性活性の阻害
図１は、コインキュベーションにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＬＤＬ誘発性単球走化性活性の阻害に対するＤ−４Ｆ（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ （２００２） １０５：２９０−２９２）の効果とＤアミノ酸から生成されたアポＪペプチド（Ｄ−Ｊ３３６、Ａｃ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−Ｑ−Ｌ−Ｎ−Ｅ−Ｑ−Ｆ−Ｎ−Ｗ−Ｖ−Ｓ−Ｒ−Ｌ−Ａ−Ｎ−Ｌ−Ｔ−Ｑ−Ｇ−Ｅ−ＮＨ₂、配列番号：１）の効果との比較を示す。ヒト大動脈内皮細胞を、培養液のみ（添加無し）、コントロールヒトＬＤＬ（２００μｇ蛋白質／ｍＬ）またはコントロールヒトＬＤＬ＋コントロールヒトＨＤＬ（３５０μｇ蛋白質／ｍＬ）とともにインキュベートした。Ｄ−Ｊ３３６またはＤ−４Ｆを表示された濃度範囲でコントロールヒトＬＤＬ（２００μｇ蛋白質／ｍＬ）に加えて、他のウェルに添加した。一晩インキュベートした後、上清を単球走化性活性についてアッセイした。図１に示したように、ヒト大動脈壁細胞によるＬＤＬ誘発性単球走化性活性を阻害するアポＪ変種ペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ濃度は、Ｄ−４Ｆペプチドについて必要とされる濃度よりも１０から２５倍低い。

動脈壁細胞をＤ−Ｊ３３６で前処置することによるＬＤＬ誘発性単球走化性活性の阻害
図２は、プレインキュベーションにおけるＬＤＬ誘発性単球走化性活性の阻害に対するＤ−４Ｆの効果とＤ−Ｊ３３６の効果との比較を示す。ヒト大動脈内皮細胞を、ＤＪ−３３６については４、２および１μｇ／ｍＬ、Ｄ−４Ｆについては１００、５０、２５および１２．５μｇ／ｍＬでＤ−Ｊ３３６またはＤ−４Ｆとともに６時間プレインキュベ−トした。続いて前記培養物を洗浄し、アッセイコントロールとして、培地のみ（添加無し）またはコントロールヒトＬＤＬ（２００μｇ蛋白質／ｍＬ）またはコントロールヒトＬＤＬ＋コントロールヒトＨＤＬ（３５０μｇＨＤＬ蛋白質／ｍＬ）とともにインキュベートした。前記ペプチドで前処置したウェルには、コントロールヒトＬＤＬを２００μｇ蛋白質／ｍＬで添加した。一晩インキュベートした後、その上清を単球走化性活性についてアッセイした。

図２に示したように、アポＪ変種ペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて動脈壁細胞によるＬＤＬ酸化の阻止について１０−２５倍強力であった。

ＬＤＬ受容体ヌルマウスにおけるＨＤＬの防御能力に対するアポＪペプチド擬似物質の効果
Ｄ−４Ｆ（Ｆと表示）またはＤアミノ酸から生成されたアポＪペプチド（Ｄ−Ｊ３３６、Ｊと表示）をＬＤＬ受容体ヌルマウス（各群４匹）の飲み水に飲料水１ｍＬにつき０．２５または０．５ｍｇで添加した。２４または４８時間後に前記マウスから血液を採集し、それらのＨＤＬを単離して、そのＬＤＬ誘発性単球走化性活性に対する防御能力について試験した。アッセイコントロールは、リポ蛋白質無し（添加無し）、またはコントロールヒトＬＤＬのみ（ＬＤＬと表示、２００μｇコレステロール／ｍＬ）、またはコントロールＬＤＬ＋コントロールヒトＨＤＬ（＋ＨＤＬと表示、３５０μｇＨＤＬコレステロール／ｍＬ）を添加したウェルを含む。マウスＨＤＬを試験する場合、コントロールＬＤＬを動脈壁細胞培養物にマウスＨＤＬと一緒に添加した（＋Ｆ ＨＤＬまたは＋Ｊ ＨＤＬ）。マウスＨＤＬはそれぞれ１００μｇコレステロール／ｍＬで添加した。Ｄ−４ＦまたはＤ−Ｊ３３６のどちらかで処理後、マウスＨＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）は、コントロールＬＤＬ誘発性動脈壁細胞単球走化性活性を阻害することにおいてコントロールヒトＨＤＬ（３５０μｇ／ｍＬ）と同じ活性を示した。Ｄ−４Ｆに対してＤ−Ｊ３６６ペプチドが必要とされるｉｎ ｖｉｔｒｏでの相対的用量とｉｎ ｖｉｖｏでの相対的用量の間に矛盾が存在する理由は、前記ペプチドの水への溶解性とおそらく関係があり、等しい溶解性を達成するように測定が行われるとき、Ｄ−Ｊペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性よりも、ｉｎ ｖｉｖｏで高い活性を示すであろうと我々は考えている。

経口ペプチドを投与されたアポＥヌルマウスから得たＨＤＬによるＬＤＬ誘発性単球走化性活性に対する防御作用
図４は経口アポＡ−１ペプチド擬似物質およびアポＪペプチドのＨＤＬの防御能力に対する影響を示す。アポＥヌルマウス（各群４匹）に飲料水１ｍＬにつき５０、３０、２０、１０、５μｇでＤ−４Ｆ（Ｆと表示）を、または飲料水１ｍＬにつき５０、３０、２０μｇでアポＪペプチド（Ｊと表示）を与えた。２４時間後に血液を採集し、ＦＰＬＣによって血漿を分画し、ＬＤＬ含有分画（マウスＬＤＬについてはｍＬＤＬと表示）およびＨＤＬ含有分画（ｍＨＤＬと表示）を別々にプールし、ＬＤＬ誘発性単球走化性活性によって測定される場合のＬＤＬ酸化に対するＨＤＬ防御能力を測定した。アッセイコントロールとして、培養ウェルにリポ蛋白質を添加しないか（添加無し）、ｍＬＤＬのみ（２００μｇコレステロール／ｍＬ）、またはｍＬＤＬ＋標準正常ヒトＨＤＬ（Ｃｏｎｔ．ｈＨＤＬと表示、３５０μｇＨＤＬコレステロール／ｍＬ）を添加した。

マウスＨＤＬを試験するために、マウスＨＤＬとともにｍＬＤＬ（＋ＦｍＨＤＬまたは＋ＪｍＨＤＬ）を動脈壁細胞培養物に添加した。飲料水でいずれのペプチドも与えられなかったマウスから得たＨＤＬはペプチド無しのｍＨＤＬと表示した。マウスＨＤＬは１００μｇコレステロール／ｍＬで用いた。Ｄ−４ＦまたはＤ−Ｊ３３６を与えられた後、１００μｇ／ｍＬのマウスＨＤＬは３５０μｇ／ｍＬ正常ヒトＨＤＬと同じ活性を示した。図４に示したように、飲料水に添加したとき、Ｄ−Ｊペプチドは、アポＥヌルマウスにおいてＨＤＬの防御能力を高めることにおいてＤ−４Ｆとと同程度に強力であった。

経口ペプチドを与えられたアポＥヌルマウスから得たＬＤＬの単球走化性活性を誘発する能力
図５は、ＬＤＬの酸化感受性における経口アポＡ−１ペプチド擬似物質およびアポＪペプチドの影響を示す。アポＥヌルマウス（各群４匹）に、Ｄ−４Ｆ（Ｆと表示）を５０、３０、２０、１０、５μｇ／ｍＬ飲料水で、またはアポＪペプチド（Ｄアミノ酸から生成、Ｊと表示）を５０、３０または２０μｇ／ｍＬ飲料水で与えた。２４時間後に図４に示したマウスから血液を採集し、血漿をＦＰＬＣによって分画し、ＬＤＬ含有分画（マウスＬＤＬについてはｍＬＤＬと表示）をプールし、酸化に対するＬＤＬの感受性を単球走化性活性の誘発によって測定した。アッセイコントロールとして培養ウェルに、リポ蛋白質無し（添加無し）、またはｍＬＤＬのみ（２００μｇコレステロール／ｍＬ）、もしくはｍＬＤＬ＋標準正常ヒトＨＤＬ（Ｃｏｎｔ．ｈＨＤＬと表示、３５０μｇＨＤＬコレステロール／ｍＬ）を添加した。

Ｄ−４Ｆを与えられたマウスから得たマウスＬＤＬ（ＦｍＬＤＬ）またはアポＪペプチドを与えられたマウスから得たマウスＬＤＬ（ＪｍＬＤＬ）を動脈壁細胞培養物に添加した。飲料水にいずれのペプチドも与えられなかったマウスのＬＤＬはペプチド無しＬＤＬと表示されている。

図５に示したように、飲料水に添加したとき、Ｄ−Ｊ３３６は、単球走化性活性の誘発によって測定した場合、アポＥヌルマウスから得られたＬＤＬをヒト動脈壁細胞による酸化に対して抵抗性にさせることにおいてＤ−４Ｆよりもわずかに強力であった。

経口ペプチドを投与されたアポＥヌルマウスから得られたＨＤＬのリン脂質酸化および単球走化性活性誘発に対する防御
図６は経口アポＡ−１ペプチド擬似物質およびアポＪペプチドのＨＤＬの防御能力に対する影響を示す。アポＥヌルマウス（各群４匹）に５０、３０、２０、１０、５μｇ／ｍＬ飲料水でＤ−４Ｆ（Ｆと表示）を、または５０、３０、２０μｇ／ｍＬ飲料水でアポＪペプチド（Ｄアミノ酸から生成されたＤ−Ｊ３３６であり、Ｊと表示）を与えた。２４時間後に血液を採集し、ＦＰＬＣによって血漿を分画し、ＨＤＬ含有分画（ｍＨＤＬと表示）をプールし、単球走化性活性の誘発によって測定される場合の、ＰＡＰＣの酸化に対するＨＤＬの防御能力を測定した。アッセイコントロールとして、培養ウェルにリポ蛋白質を添加しないか（添加無し）、２０μｇ／ｍＬのリン脂質ＰＡＰＣ＋ＨＰＯＤＥ（１．０μｇ／ｍＬ）、またはＰＡＰＣ＋ＨＰＯＤＥと標準正常ヒトＨＤＬ（濃度３５０μｇＨＤＬコレステロール／ｍＬで、＋Ｃｏｎｔ．ｈＨＤＬと表示）を添加した。

マウスＨＤＬを試験するために、マウスＨＤＬとともにＰＡＰＣ＋ＨＰＯＤＥ（＋ＦｍＨＤＬまたは＋ＪｍＨＤＬ）を動脈壁細胞培養物に添加した。飲料水中でいずれのペプチドも与えられなかったマウスから得たＨＤＬは“ペプチド無しのｍＨＤＬ”と表示されている。マウスＨＤＬは１００μｇコレステロール／ｍＬで用いた。

図６に示されたデータは、飲料水に添加したとき、単球走化性活性の発生によって測定したとき、ヒト動脈壁共培養物で、酸化剤ＨＰＯＤＥによるリン脂質ＰＡＰＣの酸化抑制をＨＤＬに生じさせることにおいて、Ｄ−Ｊ３３６は、Ｄ−４Ｆと同じように強力であったことを示している。

経口アポＡ−１ペプチド擬似物質およびアポＪペプチドのマウスにおける血漿パラオキソナーゼ活性に対する影響
図７は、経口アポＡ−１ペプチド擬似物質およびアポＪペプチドのマウスにおける血漿パラオキソナーゼ活性に対する影響を示す。アポＥヌルマウス（各群４匹）に、Ｄ−４Ｆ（Ｆと表示）を５０、１０、５または０μｇ／ｍＬ飲料水で、またはアポＪペプチド（Ｄアミノ酸から生成されたＤ−Ｊ３３６であり、Ｊと表示）を５０、１０または５μｇ／ｍＬ飲料水で与えた。２４時間後に血液を採集し、血漿をＰＯＮ１活性についてアッセイした。これらのデータは、飲料水に添加したとき、アポＥヌルマウスのパラオキソナーゼ活性を増加させることにおいて、Ｄ−Ｊ３３６は、Ｄ−４Ｆと少なくとも同程度に強力であったことを示している。

［実施例２］
経口Ｇ^*ペプチドはアポＥ欠損マウスでＨＤＬの防御能力を増加させる。
４ヶ月齢の雌のアポＥ欠損マウス（各群ｎ＝４）を以下のアミノ酸配列を有するＧ^*ペプチドで処理した：ペプチド１１３−１２２＝Ａｃ−ＬＶＧＲＱＬＥＥＦＬ−ＮＨ₂（配列番号：９）、ペプチド３３６−３５７＝Ａｃ−ＬＬＥＱＬＮＥＱＦＮＷＶＳＲＬＡＮＬＴＱＧＥ−ＮＨ₂（配列番号：１７）、およびペプチド３７７−３９０＝Ａｃ−ＰＳＧＶＴＥＶＶＶＫＬＦＤＳ−ＮＨ₂（配列番号：１９）。

各マウスは２００μｇの前記ペプチドを胃管により与えられた。４時間後に血液を得て、血漿を分離してリポ蛋白質を分画し、ＨＤＬ（２５μｇ／ｍＬ）を、ヒト動脈壁細胞の培養物においてＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）酸化に対する防御能力についてアッセイした。データは図８に示されている。 このペプチドはマウスで有意なＨＤＬの防御能力を与えた。
別の実験では、４ヶ月齢の雌のアポＥ欠損マウス（１群ｎ＝４）を以下の配列を有する１１アミノ酸のＧ^*ペプチド１４６−１５６で処理した：Ａｃ−ＱＱＴＨＭＬＤＶＭＱＤ−ＮＨ₂（配列番号：１１）。マウスは飲料水中のペプチドを表示の濃度で与えられた（図９参照）。１８時間後、血液を得て、血漿を分離してリポ蛋白質を分画し、ＨＤＬ（５０μｇコレステロール／ｍＬ）をヒト動脈壁細胞の培養物においてでＰＡＰＣ（２５μｇ／ｍＬ）＋ＨＰＯＤＥ（１．０μｇ／ｍＬ）の酸化に対する防御能力についてアッセイした。アッセイコントロールは、添加無し、ＰＡＰＣ＋ＨＰＯＤＥおよびＰＡＰＣ＋ＨＰＯＤＥ＋コントロールＨＤＬ（＋ＨＤＬと表示）を含んでいた。データは、３連の培養細胞について高倍率視野９視野当たりにおける遊走単球数の平均±ＳＤで表わされている。星印は水コントロール（０μｇ／ｍＬ）に対してｐ＜０．０５のレベルで有意であることを示している。

本明細書で記載された実施例および実施態様は単に説明を目的としており、種々の改変または変更が前記実施例および実施態様から当業者に示唆され、そして本出願の意図と範囲および添付された請求の範囲に包含される。本明細書に挙げられた全ての刊行物、特許および特許出願は、あらゆる目的のためにその全体を援用されて本明細書の一部となる。

Ｄ−４Ｆ（Ｎａｖａｂ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， １０５：２９０−２９２）とＤアミノ酸から生成されたアポＪペプチド（Ｄ−Ｊ３３６＊）のコインキュベーション実験におけるｉｎ ｖｉｔｒｏＬＤＬ誘発性単球走化性活性阻害の効果の比較を示す。データは、４連の培養について高倍率視野９視野当たりにおける遊走単球数の平均±ＳＤで表わされている。（Ｄ−Ｊ３３６＝Ａｃ−ＬＬＥＱＬＮＥＱＦＮＷＶＳＲＬＡＮＬＴＱＧＥ−ＮＨ₂、配列番号：１） Ｄ−Ｊ３３６との動脈壁細胞のプレインキュベーションによるＬＤＬ誘発性単球走化性活性阻害をＤ−４Ｆと比較して示す。データは、４連の培養細胞について高倍率野９視野当たりの遊走単球数の平均±ＳＤ表わされている。 ＬＤＬレセプターヌルマウスにおけるＨＤＬの防御能力に対するアポＪペプチド擬似物質の影響を示す。数値は、４連のアッセイウェルの各々について高倍率視野９視野当たりにおける遊走単球数の平均±ＳＤである。 経口ペプチドを投与されたアポＥヌルマウスから得られたＨＤＬのＬＤＬ誘発性単球走化性活性に対する防御を示す。数値は、４連のアッセイウェルの各々からの高倍率視野９視野当たりにおける遊走単球数の平均±ＳＤである。星印はペプチド無しのｍＨＤＬと比較したとき有意差があることを示す（ｐ＜０．０５）。 ＬＤＬの酸化感受性に対する経口アポＡ−１ペプチド擬似物質およびアポＪペプチドの影響を示す。数値は、４連のアッセイウェルの各々からの高倍率視野９視野当たりにおける遊走単球数の平均±ＳＤである。星印はペプチド無しのＬＤＬと比較したとき有意差があることを示す（ｐ＜０．０５）。 経口アポＡ−１ペプチド擬似物質およびアポＪペプチドのＨＤＬの防御能力に対する影響を示す。数値は、４連のアッセイウェルの各々からの高倍率視野９視野当たりにおける遊走単球数の平均±ＳＤである。星印はペプチド無しのｍＨＤＬと比較したとき有意差があることを示す（ｐ＜０．０５）。 経口アポＡ−１ペプチド擬似物質およびアポＪペプチドの血漿パラオキソナーゼ活性に対する影響を示す。数値は、４連の血漿標本から読み取られた数値の平均±ＳＤである。星印はペプチド無しのコントロール血漿と比較して有意差があることを示す（ｐ＜０．０５）。 アポＥ−／−マウスにおけるＨＤＬの防御能力に対する経口Ｇ^*ペプチドの影響を示す。数値は、４連の血漿標本から読み取られた数値の平均±ＳＤである。星印はペプチド無しのコントロール血漿と比較したとき有意差があることを示す（ｐ＜０．０５）。 アポＥ−／−マウスにおけるＨＤＬの防御能力に対する経口Ｇ^*ペプチド（１４６−１５６）の影響を示す。

配列表

Claims (16)

1. アテローム性硬化症の症状を改善するポリペプチドであって、ＬＬＥＱＬＮＥＱＦＮＷＶＳＲＬＡＮＬＴＱＧＥ（配列番号：１）、ＬＶＧＲＱＬＥＥＦＬ（配列番号：９）、ＱＱＴＨＭＬＤＶＭＱＤ（配列番号：１１）、ＬＬＥＱＬＮＥＱＦＮＷＶＳＲＬＡＮＬＴＥＧＥ（配列番号：１７）、および、ＰＳＧＶＴＥＶＶＶＫＬＦＤＳ（配列番号：１９）から成る群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
2. 前記ポリペプチドが、ＬＶＧＲＱＬＥＥＦＬ（配列番号：９）のアミノ酸配列からなる請求項１のポリペプチド。
3. 前記ポリペプチドが、ＬＬＥＱＬＮＥＱＦＮＷＶＳＲＬＡＮＬＴＥＧＥ（配列番号：１７）のアミノ酸配列からなる請求項１のポリペプチド。
4. 前記ポリペプチドが、更に保護基を含む請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
5. 前記ポリペプチドが、更にそのアミノ末端および／またはカルボキシル末端に連結した保護基を含む請求項４のポリペプチド。
6. 前記保護基が、以下から成る群から選択される保護基である請求項４または５のポリペプチド：アセチル、アミド、３から２０個の炭素のアルキル基、Ｆｍｏｃ、ｔ−ｂｏｃ、９−フルオレンアセチル基、１−フルオレンカルボン酸基、９−フルオレンカルボン酸基、９−フルオレノン−１−カルボン酸基、ベンジルオキシカルボニル、キサンチル（Ｘａｎ）、トリチル（Ｔｒｔ）、４−メチルトリチル（Ｍｔｔ）、４−メトキシトリチル（Ｍｍｔ）、４−メトキシ−２，３，６−トリメチル−ベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）、メシチレン−２−スルホニル（Ｍｔｓ）、４，４−ジメトキシベンゾヒドリル（Ｍｂｈ）、トシル（Ｔｏｓ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）、４−メチルベンジル（ＭｅＢｚｌ）、４−メトキシベンジル（ＭｅＯＢｚｌ）、ベンジルオキシ（ＢｚｌＯ）、ベンジル（Ｂｚｌ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル（Ｎｐｙｓ）、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジアキソシクロヘキシリデン）エチル（Ｄｄｅ）、２，６−ジクロロベンジル（２，６−ＤｉＣｌ−Ｂｚｌ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−Ｃｌ−Ｚ）、２−ブロモベンジルオキシカルボニル（２−Ｂｒ−Ｚ）、ベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、シクロヘキシルオキシ（ｃＨｘＯ）、ｔ−ブトキシメチル（Ｂｕｍ）、ｔ−ブトキシ（ｔＢｕＯ）、ｔ−ブチル（ｔＢｕ）、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル基、カルボベンゾキシ基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基およびトリフルオロアセチル（ＴＦＡ）。
7. 前記ポリペプチドが、そのアミノ末端に連結した保護基を含み、更に前記アミノ末端保護基がベンゾイル基、アセチル、プロペオニル、カルボベンゾキシ、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシルおよび３から２０個の炭素のアルキルから成る群から選択される請求項５のポリペプチド。
8. 前記ポリペプチドが、そのカルボキシル末端に連結した保護基を含み、更に前記カルボキシル末端保護基がアミドである請求項５または７のポリペプチド。
9. 前記ポリペプチドが、そのアミノ末端にアセチル基を含む請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
10. 前記ポリペプチドが、そのカルボキシル末端に−ＮＨ₂を含む請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
11. 前記ポリペプチドが、そのアミノ末端にアセチル基、およびそのカルボキシル末端に−ＮＨ₂を含む請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
12. 前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の鏡像異性体アミノ酸が全て“Ｄ”アミノ酸である請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
13. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが、薬理学的に許容できる賦形剤と混合されている、医薬製剤。
14. 前記薬理学的に許容できる賦形剤が、哺乳類への経口投与に適している、請求項１３に記載の医薬製剤。
15. アテローム性硬化症の症状の治療のために用いられる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
16. アテローム性硬化症の症状の治療のために用いられる医薬の製造における、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。

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