JP2006312650A - アテローム性動脈硬化症を改善する経口投与ペプチド - Google Patents
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Abstract
【解決手段】前記ペプチドは少なくとも1つのクラスA両親媒性らせんおよび少なくとも1つのD−アミノ酸を含む。前記ペプチドは高度に安定であり、経口ルートにより容易に投与することができる。
【選択図】図23
Description
)。クラスA両親媒性らせんの特徴には、極性−非極性境界に陽性荷電残基および極性表面の中心に陰性荷電残基が存在することである(Segrest et al. (1974) FEBS Lett. 38:247-253;
Segrest et al. (1990) Proteins: Structure, Function and Genetics 8:103-117)。
アポA−Iはリン脂質に強く結合し、複合体を形成しコレステロールに富む細胞からコレステロールの流出を促進させることが示された。アポA−Iの配送および血清レベルの維持が、なぜ1つまたは2つ以上のアテローム性硬化症の症状を効果的に緩和するのかは、これまで明らかではなかった。
ウィルソンら、アーテリオスクレロシス(1988)、8巻737−741ページ(Wilson et al.(1988) Arteriosclerosis 8:737-741) セグレストら、プロテインズ:ストラクチャーファンクションアンドジェネティクス(1990)8巻103−117ページ(Segrest et al. (1990) Proteins: Structure, Function and Genetics 8:103-117)
本出願は、USSN09/896841号(2001年6月29日出願)の部分継続出願であ
り、前記はさらにUSSN09/645454号(2000年8月24日出願)の部分継続出願
である。前記両出願は参照により本明細書に含まれる。
本研究は米国公衆衛生局および米国立循環器研究所(National Heart, Lung and Blood
Institute)のグラントHL30568およびHL34343により補助を受けた。米国政府は本発明に関して一定の権利を有する。
メチル(Bom)、t−ブトキシカルボニル(Boc)、シクロヘキシルオキシ(cHxO)、t−ブトキシメチル(Bum)、t−ブトキシ(tBuO)、t−ブチル(tBu)、アセチル(Ac)およびトリフルオロアセチル(TFA)。特に好ましいある種の実施態様では、前記ペプチドはさらに、アミノ末端に結合された第一の保護基およびカルボキシル末端に結合された第二の保護基を含む。特に好ましいペプチドは、ヒトまたはマウスのアポA−IのクラスA両親媒性らせんに極めて類似している。ある種の実施態様では、好ましいペプチドは、ヒトまたはマウスのアポA−IのクラスA両親媒性らせんをコードするエクソンによってコードされるポリペプチドと約50%を越えるアミノ酸配列同一性を含む。ある種の好ましい実施態様では、鏡像異性アミノ酸の少なくとも約10%、好ましくは少なくとも20%、より好ましくは少なくとも約30%、さらに好ましくは少なくとも約50%、さらにまた好ましくは少なくとも約75%、もっとも好ましくは少なくとも90%および100%すらが“D”アミノ酸である。前記ペプチドは、薬学的に許容できる賦形剤(例えば哺乳類への経口投与に適した賦形剤)と結合させてもよい。
D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F- (配列識別番号2), D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L,K-E-A-F- (配列識別番号3), D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F- (配列識別番号4), D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F- (配列識別番号5), D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号6), D-W-L-K-A-F-Y-D-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号7), D-W-F-K-A-F-Y-D-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号8), D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F- (配列識別番号9), D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-A-F- (配列識別番号10), D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-L-K-E-F-F- (配列識別番号11), D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号12), D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F- (配
列識別番号13), E-W-L-K-L-F-Y-E-K-V-L-E-K-F-K-E-A-F- (配列識別番号14), E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F- (配列識別番号15), E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F- (配列識別番号16), E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-A-F- (配列識別番号17), E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-L-K-E-F-F- (配列識別番号18), E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号19), E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号20), A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F- (配列識別番号21), A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F- (配
列識別番号22), A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F- (配列識別番号23), A-F-Y-D-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号24), A-F-Y-D-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号25), A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(配列識別番号26), A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F- (配列識別番号27), A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-A-F- (配列識別番号28), A-F-Y-D-K-V-F-E-K-L-K-E-F-F- (配列識別番号29), A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号30), K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F- (配列識別番号31), L-F-Y-E-K-V-L-E-K-F-K-E-A-F-
(配列識別番号32), A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F- (配列識別番号33), A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F- (配列識別番号34), A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-A-F-(配列識別番号35), A-F-Y-D-K-V-F-E-K-L-K-E-F-F- (配列識別番号36), A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号37), A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号38), D-W-L-K-A-L-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-L- (配列識別番号39), D-W-F-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-(配列識別番号40), D-W-F-K-A-F-Y-E-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号41), E-W-L-K-A-L-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-L- (配列識別番号42), E-W-L-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F- (配
列識別番号43), E-W-F-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F- (配列識別番号44), E-W-L-K-A-F-Y-E-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号45), E-W-L-K-A-F-Y-E-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号46), E-W-F-K-A-F-Y-E-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号47), D-F-L-K-A-W-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-W- (配列識別番号48), E-F-L-K-A-W-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-W- (配列識別番号49), D-F-W-K-A-W-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-W-W- (配列識別番号50), E-F-W-K-A-W-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-W-W- (配列識別番号51), D-K-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-W-A-K-E-A-F-(配列識別番号52), D-K-W-K-A-V-Y-D-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L- (配列識別番号53), E-K-L-K-A-F-Y-E-K-V-F-E-W-A-K-E-A-F- (配列識別番号54), E-K-W-K-A-V-Y-E-K-F-A
-E-A-F-K-E-F-L-(配列識別番号55), D-W-L-K-A-F-V-D-K-F-A-E-K-F-K-E-A-Y- (配列識別
番号56), E-K-W-K-A-V-Y-E-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L- (配列識別番号57), D-W-L-K-A-F-V-Y-D-K-V-F-K-L-K-E-F-F-(配列識別番号58), E-W-L-K-A-F-V-Y-E-K-V-F-K-L-K-E-F-F- (配列識別番号59), D-W-L-R-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F- (配列識別番号60), E-W-L-R-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(配列識別番号61), D-W-L-K-A-F-Y-D-R-V-A-E-K-L-K-E-A-F- (配列識別番号62), E-W-L-K-A-F-Y-E-R-V-A-E-K-L-K-E-A-F- (配列識別番号63), D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(配列識別番号64), E-W-L-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F- (配列識別番号65), D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F- (配列識別番号66), E-W-L-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F-(配列識別番号67), D-W-L-K-A-F-Y-D-R-V-A-E-R-L-K-E-A-F- (配列識別番号68), E-W-L-K-A-F-Y-E-R-V-A-E-R-L-K-E-A-F- (配列識別番号69), D-W-L-R-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F- (配列識別番号70), E-W-L-R-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F- (配列識別番号71), D-W-L-R-A-F-Y-D-R-V-A-E-K-I-K-E-A-F- (配列識別番号72), E-W-L-R-A-F-Y-E-R-V-A-E-K-L-K-E-A-F- (配列識別番号73), D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-R-L-R-E-A-F- (配列識別番号74), E-W-L-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-R-L-R-E-A-F- (配列識
別番号75), D-W-L-R-A-F-Y-D-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F- (配列識別番号76), E-W-L-R-A-F-Y-E-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F- (配列識別番号77), D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-P-D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F- (配列識別番号78), D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-P-D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F- (配列識別番号79), D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-P-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F- (配列識別番号80),D-K-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-W-A-K-E-A-F-P-D-K-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-W-L-K-E-A-F- (配列
識別番号81), D-K-W-K-A-V-Y-D-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L-P-D-K-W-K-A-V-Y-D-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L- (配列識別番号82), D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-P-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F- (配列識別番号83), D-W-L-K-A-F-V-Y-D-K-V-F-K-L-K-E-F-F-P-D-W-L-K-A-F-V-Y-D-K-V-F-K-L-K-E-F-F- (配列識別番号84), D-W-L-K-A-F-Y-D-K-F-A-E-K-F-K-E-F-F-P-D-W-L-K-A-F-Y-D-K-F-A-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号85) から選ばれる、1つまたは2つ以上の以下のアミノ酸配列、その切端形、その多量体(例えば好ましくは2量体から3量体、4量体、5量体、8量体または10量体の範囲である)、その配列の保存的置換、および/またはアミノ酸類似体を含む前記配列を含む。
トイル−2−アラキドノイル−sn−グリセロ−3−ホスホリルコリン(Ox−PAPC)、1−パルミトイル−2−オキソバレロイル−sn−グリセロ−3−ホスホリルコリン(POVPC)、1−パルミトイル−2−グルタロイル−sn−グリセロ−3−ホスホリルコリン(PGPC)、1−パルミトイル−2−エポキシイソプロスタン−sn−グリセロ−3−ホスホリルコリン(PEIPC)、酸化1−ステアロイル−2−アラキドノイル−sn−グリセロ−3−ホスホリルコリン(Ox−SAPC)、1−ステアロイル−2−オキソバレロイル−sn−グリセロ−3−ホスホリルコリン(SOVPC)、1−ステアロイル−2−グルタロイル−sn−グリセロ−3−ホスホリルコリン(SGPC)、1−ステアロイル−2−エポキシイソプロスタン−sn−グリセロ−3−ホスホリルコリン(SEIPC)、酸化1−ステアロイル−2−アラキドニル−sn−グリセロ−3−ホスホリルエタノールアミン(Ox−SAPE)、1−ステアロイル−2−オキソバレロイル−sn−グリセロ−3−ホスホリルエタノールアミン(SOVPE)、1−ステアロイル−2−グルタロイル−sn−グリセロ−3−ホスホリルエタノールアミン(SGPE)および1−ステアロイル−2−エポキシイソプロスタン−sn−グリセロ−3−ホスホリルエタノールアミン(SEIPE)。
文献(Arteriosclerosis and Thrombosis, 12:886-894(1992))に開示されたいずれのペ
プチドも除外する。ある種の実施態様では、本発明は、米国特許第4,643,988号および/
またはGarberら(1992)の文献に開示されたペプチドであって、全ての鏡像異性アミノ酸がLアミノ酸であるものから合成されたもの、またはDアミノ酸であるものから合成されたものをいずれも除外する(ここで前記ペプチドは封鎖基である)。ある種の実施態様では、本発明は、式A1−B1−B2−C1−D−B3−B4−A2−C2−B5−B6−A3−C3−B7−C4−A4−B8−B9(配列識別番号:87)を有するペプチドを除外する。前記式
中、A1、A2、A3およびA4はそれぞれ別個にアスパラギン酸もしくはグルタミン酸、またはその同族体もしくは類似体であり、B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8およびB9はそれぞれ別個にトリプトファン、フェニルアラニン、アラニン、ロイシン、チロシ
ン、イソロイシン、バリンもしくはα−ナフチルアラニン、またはその同族体もしくは類似体であり、C1、C2、C3およびC4はそれぞれ別個にリジンまたはアルギニンであり、Dはセリン、スレオニン、アラニン、グリシン、ヒスチジンまたはその同族体もしくは類似体であるが、ただし、A1およびA2がアスパラギン酸であるときは、A3およびA4はグルタミン酸であり、B2およびB9はロイシンであり、B3およびB7はフェニルアラニンであり、B4はチロシンであり、B5はバリンであり、B6、B8およびDはアラニンであり、さらにC1、C2、C3およびC4はリジンであり、B1はトリプトファンではないことを条
件とする。
“ポリペプチド”、“ペプチド”および“タンパク質”という用語は、本明細書ではアミノ酸残基ポリマーを指すために互換的に用いられる。前記用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマーと同様に、1つまたは2つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学的類似体であるアミノ酸にも適用される。
(1990) Proteins: Structure, Function, and Genetics 8:103-117)。
リン;ChC18:2=コレステリルリノレート;ChC18:2−OOH=コレステリルリノレートヒドロペルオキシド;DMPC=1,2−ジテトラデカノイル−rac−グリセロール−3−ホスホコリン;PON=パラオキソナーゼ;HPF=標準化高倍率視野;PAPC=L−α−1−パルミトイル−2−アラキドノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン;POVPC=1−パルミトイル−2−(5−オキソバレリル)−sn−グリセロ−3−ホスホコリン;PGPC=1−パルミトイル−2−グルタリル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン;PEIPC=1−パルミトイル−2−(5,6−エポキシイソプロスタンE2)−sn−グリセロ−3−ホスホコリン;PON=パラオキソナーゼ;BL
/6=C57BL/6J;C3H=C3H/HeJ。
下の配列比較アルゴリズムの1つを用いるか、または直接目視で測定したとき、同じであるか、または一定のパーセンテージのアミノ酸残基またはヌクレオチドが同じである2つ以上の配列またはサブ配列を指す。本発明のペプチドについては、配列同一性はペプチドの全長にわたって決定された。
USA 85:2444(1988))、これらアルゴリズムのコンピューターによる実行(GAP,
BESTFIT, FASTAおよびTFASTA(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI))、または目視による精査(一般的には上
掲書(Ausubel et al.)を参照されたい)。
for Biotechnology Information( HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/" http://www.ncbi.nlm.nih.gov/))を介して一般に利用可能である。前記アルゴリズムは、先ず初めに問題の配列中に存在する、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントを実施したとき、いくつかの正の値をもつ閾値スコアTと適合するか、またはこれを満
たす長さがWの短いワードを特定することによって高いスコアをもつ配列対(HSP)を特定する。前記高スコアの配列対は、。Tは近縁ワードスコア閾値と呼ばれる(Altschul
et al. 上掲書)。前記の最初の近縁ワードヒットは検索開始の種子として機能し、前記近縁ワードを含むより長いHSPを発見することができる。続いて前記ワードヒットを各配列の両方向に、累積アラインメントが増加するかぎり伸長する。ヌクレオチド配列の場合、パラメーターM(適合対に対する褒賞スコア、常に>0)およびパラメーターN(非適合対に対する罰則スコア、常に<0)を用いて累積スコアを計算する。アミノ酸配列の場合は、累積スコアを計算するためにスコアリングマトリックスを用いる。各方向におけるワードヒットの伸長は以下の時に停止させる:累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Xだけ減少したとき;累積スコアが、1つまたは2つ以上の負のスコアをもつ残基のアラインメントのために0または0未満になったとき;またはいずれかの配列の末端に達したとき。BLASTアルゴリズムパラメーターW、TおよびXは前記アルゴリズムの感度および速度を決定する。ヌクレオチド配列用BLASTNプログラムは、デフォルトとしてワード長(W)に11、期待値(E)に10、M=5、N=−4および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列用BLASTPプログラムは、デフォルトとしてワード長(W)に3、期待値(E)に10、およびBLOSUM62スコアリングマトリックスを用いる(例えば以下の文献を参照されたい:Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915(1989))。
よって提供される測定値は、最少合計確率(P(N))であり、これは2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の適合が偶然生じる確率の指標を提供する。例えば、リファレンス核酸とテスト核酸の比較で前記最少合計確率が約0.1未満、より好ましくは約0.01未満、もっとも好ましくは0.001未満ならば、核酸はリファレンス配列と類似であると考えられる。
本発明は、クラスA両親媒性らせんモチーフに類似するようにデザインした合成ペプチド(Segrest et al. Proteins: Structure, Function, and Genetics 8:103-117(1990))はリン脂質と結合し、ヒトアポA−Iと同様な多くの生物学的特性を示すことができるという発見に関する。特に、前記ペプチドがDアミノ酸を用いて製剤化されるとき、前記ペプチドは劇的な血中半減期の増加を示し、特にアミノ末端および/またはカルボキシ末端を封鎖されたときは経口的にすら投与することができるというのが、本発明の発見である。
実験は、経口による効果的な薬剤送達、血中半減期の増加およびアテローム性硬化症の1つまたは2つ以上の症状の緩和または防止/抑制能力を示した。
出願)を参照されたい)では、ヒトLDLをin vitroでアポA−IまたはアポA−I類似ペプチド(37pA)で処理することによって、HPODEおよびHPETEを含むLD
Lからシーディング(seeding)分子が除去されることを我々は示した。これらのシーデ
ィング分子は、ヒト動脈壁細胞混合培養がLDLを酸化することを可能にするために、およびLDLが動脈壁細胞に単球走化性活性を産生させるために必要である。我々はまた、アポA−Iのマウスへの注射またはヒトへの輸液の後、マウスまたは実験協力者から単離されたアポA−I注射/輸液後単離LDLは、ヒト動脈壁細胞による酸化に対して耐性を示し、さらに動脈壁細胞の混合培養において単球の走化性活性を誘発しないことを見出した。
よびDは、アポE欠損マウスにおける血液成分と14C−D−5Fの結合を示している。本明細書ではまた、アテローム誘発性食餌を与えたマウスおよびPBSを注射したマウスのHDLは、ヒトHDLの酸化を抑制することができず、さらにヒトの動脈壁混合培養でLDL誘発単球走化性活性を抑制することができないことが示されている。対照的に、アテローム誘発性食餌を与え、さらに本明細書に記載するペプチドを毎日注射したマウスのHDLは、正常なヒトHDLと同じように、ヒトLDLの酸化の抑制および混合培養でのLDL誘発単球走化性活性の防止に有効であった(図2Aおよび2B)。さらにまた、アテローム誘発性食餌を与え、さらにPBSを毎日注射したマウスから採取したLDLは、同じ食餌を与えたが日量20μgのペプチド5Fを注射したマウスから採取したLDLよりも容易に酸化され、さらに容易に単球走化性活性を誘発した。前記Dペプチドは免疫原性を有しないようであった(図4)。
LDL−コレステロールレベルが同じで、HDL−コレステロールの総コレステロールに対するパーセントが低いにもかかわらず、アテローム誘発性食餌を与えられ、さらに前記ペプチドを注射された動物は顕著に低い病巣スコアを有していた(図5)。したがって、本発明のペプチドは、アテローム誘発性食餌を与えられたマウスでアテローム性硬化症病巣の進行を防止した。
本発明のアテローム性硬化症抑制ペプチドはまた他の多くの場合に有用である。特に、我々は心脈管系合併症(例えばアテローム性硬化症、卒中発作など)はしばしば急性期炎症反応の開始を伴い、またはこれに付随することを見出した。前記のような急性炎症反応はしばしば、再発性炎症疾患(例えば癩、結核、全身性紅斑性狼瘡および慢性関節リウマチ)、ウイルス感染(例えばインフルエンザ)、細菌感染、真菌感染、器官移植、創傷もしくは他の外傷、人工器官、バイオフィルムなどに付随する。
我々はまた、冠状動脈石灰沈着および骨粗しょう症の原因として酸化脂質を特定した。さらにまた、特定の理論に拘束されないが、我々は、石灰化大動脈狭窄の病理発生に同じメカニズムが存在すると考えている。
好ましいペプチド
クラスAペプチドはアテローム性硬化症の1つまたは2つ以上の症状を緩和することができるということは本発明の発見であった。クラスAペプチドは、極性残基および非極性残基の分離をもたらすα−らせんを形成し、それによって極性−非極性境界に陽性に荷電
した残基を位置し、さらに極性表面の中心に陰性に荷電した残基を位置する極性および非極性表面を形成することを特徴とする(例えば以下を参照されたい:Anantharamaiah, Meth. Enzymol., 128:626-668(1986))。アポA−Iの4番目のエクソンは、3.667残
基/ターンに折り畳まれるときクラスA両親媒性らせん構造を生じることは特筆されよう。
らにアテローム性硬化症の1つまたは2つ以上の症状の抑制または防止に極めて有効なペプチドを製造した。特定の理論に拘束されないが、LDLの酸化を緩和する本発明のペプチドは、おそらくシーディング分子を摘み取ることによってin vivoで機能すると考えら
れる。
で食餌誘発性アテローム性硬化症の抑制効果についてマウスのアポA−I(MoA−I)と比較された。
96))が記載したコンピュータによる方法を用いて予測することができる。クラスAαら
せん構造が保存されるかぎり、前記ペプチドは長くしても短くしてもよい。さらに、得られるペプチドを対象の種自身によって産生されるペプチドにいっそう類似させるために置換を施すことができる。
プチドの“D”型を含み、より好ましくは一端または両端が保護基と結合した“D”型を含む。そのようなペプチドには、式A1−B1−B2−C1−D−B3−B4−A2−C2−B5
−B6−A3−C3−B7−C4−A4−B8−B9(配列識別番号:86)をもつペプチドが含まれる。式中、A1、A2、A3およびA4はそれぞれ別個にアスパラギン酸もしくはグルタミン酸またはその同族体もしくは類似体であり;B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、
B8およびB9はそれぞれ別個にトリプトファン、フェニルアラニン、アラニン、ロイシン、チロシン、イソロイシン、バリンもしくはα−ナフチルアミンまたはその同族体もしくは類似体であり;C1、C2、C3およびC4はそれぞれ別個にリジンまたはアルギニンであり;さらにDはセリン、スレオニン、アラニン、グリシン、ヒスチジンまたはその同族体もしくは類似体であり(ただし、A1およびA2がアスパラギン酸であるときは、A3およ
びA4はグルタミン酸、B2およびB9はロイシン、B3およびB7はフェニルアラニン、B4はチロシン、B5はバリン、B6、B8およびDはアラニン、C1、C2、C3およびC4はリ
ジンであり、B1はトリプトファンではないことを条件とする)、さらに式中、少なくと
も1つの鏡像異性アミノ酸は“D”型アミノ酸である。好ましくは前記鏡像異性アミノ酸の少なくとも50%が“D”型であり、より好ましくは前記鏡像異性アミノ酸の少なくとも80%が“D”型であり、もっとも好ましくは前記鏡像異性アミノ酸の少なくとも90%が“D”型アミノ酸である。
に有用なペプチドと構造的に類似するペプチド摸倣体を用いて、同等な治療効果または予防効果を得ることができる。
される結合によって置換される。前記置換は、当業者に公知の方法および以下の文献に記載されている方法によって実施される: Spatola (1983) p.267 "Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins", B. Weinstein, eds., Marcel Dekker,
New York; Spatola (1983) Vega Data 1(3) Peptide Backbone Modifications(一般的
解説);Morley (1980) Trends Pharm Sci. pp.463-468(一般的解説);hudson et al.(1979) Int. J. Pept. Prot. Res., 14:177-185(−CH2NH−,CH2CH2−);Spato
la et al.(1986) Life Sci., 38:1243-1249(−CH2−S);Hann (1982) J. Chem. Soc. Perkin. Trans. I307-314(−CH−CH−、シスおよびトランス);Almquist et al.(1980) J. Med. Chem. 23:1392-1398(−COCH2−);Jennings-White et al.(1982) Tetrahedron Lett. 23:2533(−COCH2);M. Szelke et al.欧州特許出願EP45665(1982)CA:97:39405(1982)(−CH(OH)CH2−);Holladay et al.(1983) Tetrahedron
Lett. 24:4401-4404(−C(OH)CH2−);およびHruby (1982) Life Sci., 31:189-199(−CH2−S−)。
ポリペプチドよりも顕著な利点を有するであろう。前記利点には、例えばより経済的な製造、より高い化学的安定性、薬理学的特性の強化(半減期、吸収性、高い性能、有効性など)、抗原性の減少などが含まれる。
& Gierasch (1992) Ann. Rev. Biochem. 61:387)によって、例えばペプチドを環状化させる分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基の付加によって生成することができる。
本発明で用いられるペプチドは、標準的な化学的ペプチド合成技術を用いて化学的に合成するか、または、特にペプチドが“D”アミノ酸残基を含まない場合は組換えによって発現される。ポリペプチドが組換えによって発現される場合、1つまたは2つ以上のアミノ酸がもっぱらD型で前記生物に提供される環境下で、ホスト生物(例えば細菌、植物、真菌細胞など)を培養すると、組換えによって発現されたペプチドはしたがって前記Dアミノ酸を含んでいる。
Peptide Synthesis, Part A.;Merrifield et al.(1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156;Stewart et al.(1984) Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed.
Pierce Chem. Co., Rockford, Ill.。
補充ミニプリントに記載されている。
に合成によって通常末端が切り縮められた多数のペプチドが生成されることは特筆されよう。精製過程(例えばHPLC)で、典型的には顕著な量の完全長の生成物が失われる。
Dアミノ酸は、化学合成でD型誘導アミノ酸残基を用いることによってペプチド内の1つまたは2つ以上の位置に簡単に取り込まれる。固相ペプチド合成のためのD型アミノ酸残基は多数の供給元から市販されている(例えば、Advanced Chem Tech, Louisville; Nova Biochem, San Diego; Sigma, St Louis; Bachem California Inc., Torranceなど)。D型アミノ酸はペプチド内の任意の位置に所望のように取り込ませることができる。したがって例えば、ある実施態様では、ペプチドはただ1つのD−アミノ酸を含み、一方、別の実施態様では、ペプチドは少なくとも2つ、一般的には少なくとも3つ、より一般的には少なくとも4つ、もっとも一般的には少なくとも5つ、好ましくは少なくとも6つ、より好ましくは少なくとも7つ、さらにもっとも好ましくは少なくとも8つのDアミノ酸を含む。特に好ましい実施態様では、実質的に(鏡像異性)アミノ酸1つおきにD型アミノ酸が存在する。ある種の実施態様では、少なくとも90%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%の鏡像異性アミノ酸がD型アミノ酸である。特に好ましいある実施態様では、基本的に全ての鏡像異性アミノ酸がD型アミノ酸である。
ある種の実施態様では、構成アミノ酸および/または末端アミノ酸の1つまたは2つ以上のR基は保護基で封鎖されている。特定の理論に拘束されないが、本発明のペプチドの特にアミノ末端および/またはカルボキシル末端の封鎖は経口投与による薬剤送達を極めて改善し、さらに血中半減期を顕著に高めるということは本発明の発見であった。
約1から約16または18、より好ましくは約3から約13、もっとも好ましくは約3から約10の範囲である。
約3から約16、より好ましくは約3から約13、もっとも好ましくは約3から約10の範囲である。
全ての他の保護基が同時に除去されて得られる。
全てがLアミノ酸のペプチド(例えばその他の点では本発明のペプチドの配列を有するもの)をD型(すなわち本発明のペプチド)と一緒に投与したとき、前記D型ペプチドの取り込みが増加するということもまた、本発明の驚くべき発見であった。したがって、ある種の実施態様では、本発明は、D型およびL型ペプチドを組み合わせて本発明の方法で用いることを含む。前記D型ペプチドおよびL型ペプチドは異なるアミノ酸配列を有することができるが、好ましい実施態様では、それらはともに本明細書に記載するペプチドのアミノ酸配列を有し、さらに好ましい実施態様では、それらは同じアミノ酸配列を有する。
本発明の方法を実施するために、本発明の1つもしくは2つ以上のペプチドまたはペプチド摸倣体を、例えばアテローム性硬化症の1つまたは2つ以上の症状を有すると診断されたか、またはアテローム性硬化症のおそれがあると診断された個体に投与する。前記ペプチドまたはペプチド摸倣体はその“元々の形態”で投与してもよいし、所望の場合には塩、エステル、アミド、プロドラッグ、誘導体などの形態で投与してもよい。ただし、前記塩、エステル、アミド、プロドラッグまたは誘導体は薬理学的に適切であること、すなわち本方法で有効であることを条件とする。活性物質の塩、エステル、アミド、プロドラッグ、および他の誘導体は、合成有機化学分野の業者にとって周知であり、さらに例えば下記文献に記載されている標準的な方法を用いて製造することができる:March (1992) Advanced Organic Chemistry; Reactions, Mechanism and Structure, 4th Ed. NY. Wiley-Interscience。
つまたは2つ以上の生理学的に許容される化合物、例えば組成物を安定化させるか、活性物質の吸収を増加もしくは低下させるために機能するものを含むことができる。生理学的に許容される化合物には、例えば炭水化物(例えばグルコース、シュクロースまたはデキストラン)、抗酸化物質(例えばアスコルビン酸またはグルタチオン)、キレート剤、低分子量タンパク質、保護および取り込み増進剤(例えば脂質)、活性物質のクリアランスおよび加水分解を減少させる組成物、または賦形剤もしくは他の安定化剤および/または緩衝物質が含まれる。
/日から約50mg/kg/日の範囲で、さらに時にはそれよりも多い。典型的な用量は、約3mg/kg/日から約3.5mg/kg/日、好ましくは約3.5mg/kg/日から約7.2mg/kg/日、より好ましくは約7.2mg/kg/日から約11.0mg/kg/日、もっとも好ましくは約11.0mg/kg/日から約15.0mg/kg
/日の範囲である。ある種の好ましい実施態様では、用量は約10mg/kg/日から約
50mg/kg/日の範囲である。前記の用量は、個々の対象者または対象群の治療計画を最適化させるために変動しうることは理解されよう。
系が用いられる(Tracy (1998) Biotechnol. Prog. 14:108; Johnson et al.(1996) Nature Med. 2:795; Herbert et al.(1998) Pharmaceut. Res. 15:357)。前記は、ポリマー
マトリックス内にタンパク質を含む生物分解性ポリマー微小球で構成された乾燥粉末で、前記ポリマーマトリックスは、他の薬剤とともにまたは他の薬剤を含まずに乾燥製剤として混ぜ合わせることができる。
生成物を製造する。得られた粉末は固形のタンパク質を含み、前記タンパク質は多孔質のポリマー粒子内に均一に固定されて分散している。前記方法でもっとも一般的に使用されるポリマー、ポリ(ラクチド−コ−グリコリド)(PLG)は生体適合性および生物分解性の両方を有する。
ある種の実施態様では、本発明のペプチドは1つまたは2つ以上の脂質と一緒に投与される。前記脂質は、ペプチドの保護および/または輸送/取込みの強化のための賦形剤として製剤化してもよいし、または前記脂質は別々に投与してもよい。
et al.(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88:11460-11464; Huang et al.(1992) Cancer Res., 52:6774-6781; Lasic et al.(1992) FEBS Lett., 312:255-258など)。
表2:Dポリペプチドの投与に好ましいリン脂質のsn−1および/またはsn−2位の好ましい脂肪酸
追加的な薬理学的に活性な物質は、前記主要活性物質、例えば本発明のペプチドとともに送達することができる。ある実施態様では、そのような活性な物質にはアテローム性硬化症および/またはその合併症発生のおそれを減少させる物質が含まれるが、ただしこれに限定されない。前記物質には、ベータブロッカー、ベータブロッカーとチアジド利尿剤の組み合わせ、スタチン、アスピリン、ACEインヒビター、ACEレセプターインヒビター(ARB)などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
標)(Tenormin))、ベータキソロール(カーロン(登録商標)(Kerlone))、ビソプ
ロロール(ゼベタ(登録商標)(Zebeta))、メトプロロール(ロプレッサー(登録商標)(Lopressor))などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。適切な非選択性ブ
ロッカー(ベータ1およびベータ2を等しく遮断する)には、カーテオロール(カルトロール(登録商標)(Cartrol))、ナドロール(コルガード(登録商標)(Corgard))、ペンブトロール(レバトール(登録商標)(Levatol))、ピンドロール(ビスケン(登
録商標)(Visken))、プロプラノロール(インデラール(登録商標)(Inderal))、
チモロール(ブロッカドレン(登録商標)(Blockadren))、ラベタロール(ノルモダイン(登録商標)(Normodyne)、トランデート(登録商標)(Trandate))などが含まれ
るが、ただしこれらに限定されない。
フォシノプリル(例えばモノプリル(登録商標)(Monopril)、Bristol-Meyersから)、リシノプリル(例えばプリニビル(登録商標)(Prinivil)、Merckから、またはゼスト
リル(登録商標)(Zestril)、Astra-Zenecaから)、キナプリル(例えばアキュプリル
(登録商標)(Accupril)、Parke-Davisから)、ラミプリル(例えばアルテース(登録
商標)(Altace)、Hoechst Marion Roussel、King Pharmaceuticalsから)、イミダプリル、ペリンドプリルエルブミン(例えばアセオン(登録商標)(Aceon)、Rhone-Poulenc
Rorerから)、トランドラプリル(例えばメービック(登録商標)(Mavik)、Knoll Pharmaceuticalから)などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。適切なARBS(
ACEレセプターブロッカー)には、ロサルタン(例えばコザール(登録商標)(Cozaar)、Merckから)、イルベサルタン(例えばアバプロ(登録商標)(Avapro)、Sanofiか
ら)、カンデサルタン(例えばアタカンド(登録商標)(Atacand)、Astra Merckから)、バルサルタン(例えばジオバン(登録商標)(Diovan)、Novartisから)などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
別の実施態様では、本発明は、アテローム性硬化症の1つまたは2つ以上の症状を改善するか、またはアテローム性硬化症のおそれがある対象(ヒトまたは動物)を予防的に処置するキットを提供する。前記キットは、好ましくは、本発明の1つまたは2つ以上のペプチドまたはペプチド摸倣体を収納した容器を含む。前記ペプチドまたはペプチド摸倣体は個別投薬形態(例えば座薬、錠剤、カプセル、パッチなど)で提供することができ、および/または場合によって1つまたは2つ以上の医薬的に許容できる賦形剤と結合させてもよい。
で述べたようなベータブロッカー、血管拡張剤、アスピリン、スタチン、ACEインヒビターまたはACEレセプターインヒビター(ARB)などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
いくつかの合成クラスAペプチド類似体が、ヒトアポA−Iの多くの特性と類似する特性をin vitroで提示することが示された。本実施例では、両親媒性が強化された新規なペプチド(5F)が、アテローム性硬化症誘発飼料を与えたC57BL/6Jマウスに20μg/日で16週間腹腔内に注射された。マウスアポA−I(MoAI)(50μg/日)またはリン酸緩衝食塩水(PBS)注射をコントロールとして他のマウスに実施した。総血中コレステロールレベルおよびリポタンパク質プロフィルは前記処置群とコントロール群とで顕著には相違しなかったが、ただし5FまたはMoAIを投与したマウスでは、高密度リポタンパク質(HDL)−コレステロールは、総コレステロールのパーセントとして計算したとき低かった。
ペプチド
ペプチド5F(Ac−18A[AspTrpLeuLysAlaPheTyrAspLysValPheGluLysPheLysGluPhePhe]−NH2)を固相ペプ
チド合成によって合成した(例えば以下を参照されたい:Anantharamaiah & Garber (1996) Meth. Enzymol. 263:267-282; Palgunachari et al.(1996) Arteriosclerosis, Throm
bosis & Vascular Biology 16:328-338)。前記合成ペプチドの純度は分析用HPLCお
よびイオンスプレー質量分析法によって確定した。前記ペプチドは蒸留水に対して透析し、使用前に凍結乾燥させた。
脂した。ペレットはGn:DTT:トリス溶液(3M塩酸グアニジン、1mMジチオスレイトールおよび10mMトリス;pH=8.0)に溶解し、続いて同じ溶液に対して12000MWカットオフ透析チューブを用いて透析し、サンプルからアポA−IIおよびCアポリポタンパク質の大半を除去した。続いて前記サンプルを水に対して透析し凍結乾燥させた。ペレットは新鮮なGn:DTT:トリス溶液に溶解し、タンパク質をサイズ排除カラムクロマトグラフィーによって分離した。カラムはXK26/100カラム(2.6×100cm)を使用し、バルクフェース・スーパーロース12(Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)を充填し、Gn:DTT:トリス溶液で平衡化させた。流速は0.5m
L/分で、2.5mLで分画を採集した。アポA−Iピークに一致する分画をSDS−PAGEで分析し、さらに調製用C−18逆相HPLCによって精製した(Anantharamaiah
& Garber (1996)
Meth. Enzymol. 263:267-282)。
雌のC57BL/6Jマウス(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)を用いて全実験を行った。マウスは6週齢で購入し、食餌実験は8週齢のマウスを用いて開始した。代謝回転実験では体重が20から22グラムのマウスを用いた。全ての動物実験は、当該大学(University of Alabama, Birmingham)の動物管理および使用委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)の事前検査を受け承認された。
5Fペプチド、MoAIおよびヒトアポA−Iを文献(Bilheimer et al.(1972) Biochim. Biophys. Acta 260:212-221)の方法によって125Iで標識した。マウスに改変トーマス・ハートロフト(Thomas-Hartroft)アテローム性硬化症誘発飼料(#TD88051; Teklad,
Madison, WI)を4週間与え、この時点で200μLのリン酸緩衝食塩水(PBS)に溶解したペプチドまたはタンパク質の毎日の腹腔注射を開始した。MoAIまたはヒトアポA−I(50μg/動物)を注射した動物、5F(20μg/動物)を注射した動物は本消長動態実験では絶食させず、血液サンプルはキシラジン:ケタミン麻酔下で後眼窩洞から注射後15、30、45分後、および1、1.5、2、3、4、6、8、12および24時間後に採取した。
血漿容積を体重の4.2%として計算した。各サンプルは、全血漿中の注射されたCPMのパーセントとして表した。遊離125Iはトリクロロ酢酸(TCA)沈澱によって決定し
た(10μLの血漿サンプルにつき10%TCAを1mL)。消長動態モデルへの当てはめは、各時点での平均ではなく、全てのデータポイントを用いて実施した(PKアナリス
ト(PKAnalyst)、MicroMath Scientific Software, Salt Lake City, UT)。
マウスは6週齢で入手し、任意に20匹の群に分け(ただし処置を与えられないネガティブコントロール群は10匹)、標準的なげっ歯類の固形飼料を与えた。8週齢で、処置群に改変トーマス・ハートロフトアテローム性硬化症誘発飼料(#TD88051; Teklad, Madison, WI)を与え、注射を開始した。前記飼料は4℃で保存し、脂質の酸化を最小限にす
るために製造日より3ヶ月を過ぎないものを使用した。動物に毎日16週間腹腔内注射を施した(週末および休日を含む)。各群の20匹のマウスに200μLのPBS(ポジティブコントロールとして)または200μLのPBS中の5F(20μg)または200μLのPBS中のMoAI(50μg)を毎日注射した。
注射容積を200μL/マウス/日で維持した。
組織学的評価は文献の方法(Paigen et al.(1990) Arteriosclerosis 10:316-323)に
いくつかの改変を加えて実施した。簡単に記せば、心臓をリン酸緩衝ホルムアルデヒド溶液中で少なくとも1週間固定した。心臓の下部2/3を除去し、残りの組織をOCT媒質体(Tissue-Tek, Miles Inc., Elkhart, IN)中で凍結し、−20℃で低温槽中で切片を
作製した。大動脈根の開始部について20μm毎の切片をスライド上に確保し、観察した。続いて切片をさらに600μm分採集するか、または大動脈の横断切片が円形化し弁の尖頭がもはや明瞭でなくなるまで切片を採集した。スライドをオイルレッドOで染色し、さらにヘマトキシリンで対比染色した。染色した病巣の横断面積を80μm離れた連続切片で画像分析(SigmaScan Pro, SPSS Scientific, Chicago, IL)で測定し、平均病巣面
積を各大動脈洞について400μm(5枚のスライド)の長さにわたって決定し、最大平均病巣面積を示した。
ヒト動脈壁細胞の混合培養、単球の単離、健常なヒトドナーの血漿から超遠心沈澱によるリポタンパク質の単離およびマウス血漿からFPLCによるリポタンパク質の単離、並びに脂質過酸化水素および単球走化性活性の測定は、標準的な方法にしたがって実施した。全ての参加対象者は、UCLAヒト対象保護委員会(UCLA Human Subjects Protection
Committee)によって承認されたインフォームドコンセントを示した。マウスリポタンパク質を混合培養でテストするためのプロトコルはまた以下のように実施した:簡単に記せば、アテローム性硬化症誘発飼料を与え、さらに賦形剤(PBS)またはペプチド5F(20μg/マウス/日)を注射したマウスの血漿からLDLおよびHDLをFPLCによって単離した。混合培養は、ヒトLDL(200μg/mLのLDLタンパク質)、またはマウスLDL(200μg/mL)、またはヒトLDL(200μg/mL)+ヒトHDL(350μg/mLのHDLタンパク質)もしくはマウスHDL(300μg/mL)、またはマウスHDL(300μg/mL)単独で処理した。前記混合培養を上記添加
物とともにまたは上記添加物を含まずに8時間37℃で10%のリポタンパク質欠損血清(LPDS)の存在下でインキュベートした。上清を採集し、アウエルバッハ脂質過酸化水素同等物について分析した。続いて混合培養を洗浄し、血清またはLPDSを含まない新しい培養液でさらに8時間インキュベートした。この調整培養液を採集し、単球走化性活性について分析した。
血漿コレステロールリポタンパク質プロフィルは、我々が最近開発したCLiP法(Garber et al.(2000) J. Lipid Res. 41:1020-1026)を用いて測定した。簡単に記せば、5から10μLの血漿を1回のスーパーローズ(Superose)6(Pharmacia, Piscataway NJ)カラムを用いて分析した。カラムの直ぐ後でコレステロール試薬をT字型混合装置から導入し、溶出剤:試薬混合物はポストカラム反応コイルに入れた。溶出剤混合物中のコレステロール含有量は分光光度法によって500nmで検出し、検出値はコンピュータに採集した。得られたプロフィルは成分ピークに分解し、ピークフィット(PeakFit, SPss Science, Chicago, IL)を用いて相対面積を分析した。総コレステロールに対する絶対コレステロール値および各成分ピークは、既知の値をもつコントロールサンプルとの比較によって決定した。いくつかの事例では、分画を採集し放射能活性の分布を決定した。CLip法は、プールしたサンプルを使用することなく個々のマウスサンプルを分析することを可能にした。
ペプチドを毎日注射することによって何らかの免疫反応をマウスで誘発するか否かを決定するために、器官採集時にマウスから採取した血漿(16日間の毎日の注射の後)を用いて間接ELISA力価測定(Engvall (1980) Meth. Enzymol. 70:419-439)を実施した。注射に用いたペプチドまたはMoAI(10μg/mL)でプレートを被覆し、一晩インキュベートした。0.05%のTween20を含むホウ酸緩衝食塩水(pH8.2)で完全に洗浄し、緩衝液(ホウ酸緩衝液中の0.1%ゼラチンおよび0.1%BSA)で1時間ブロックした後、200μLの希釈マウス血漿(1:100希釈)サンプルをホウ酸緩衝食塩水で段階的に1:1で希釈した。マウスIgGに対するビオチン付加ヤギ抗体(0.1μg/mL)を続いてウェルに添加し、さらにSA−HRP(ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ)で1時間処理し、さらにABTSおよび過酸化物を基質として用いて反応を進行させた。抗原/抗体のそれぞれの添加後には、プレートを一晩室温でインキュベートし、さらに0.05%のTween20を含むホウ酸緩衝食塩水(pH8.2)で完全に洗浄し、次の添加の前に1時間緩衝液(ホウ酸緩衝液中の0.1%ゼラチンおよび0.1%BSA)でブロックした。
処置群を2テール(two-tailed)t−検定または変数の一方向分析(この場合データは正常に分布していた)によって比較するか、または階層上の変数(variance on ranks)
の一方向分析(SigmaStat; SPSS Science, Chicago, IL)によって比較した。インプット速度およびアウトプット速度が等しくないと仮定するファーストオーダー・ワンコンパートメント・キネティックモデル(PKAnalyst;
MicroMath Scientific Software, Salt Lake City, UT)へのあてはめによって、ペプチドまたはタンパク質の代謝回転の消長動態を分析した。
消長動態実験
腹腔内注射の後、マウスの血漿からペプチド5F並びにヒトおよびマウスのアポA−Iが浄化除去される動態は表3に要約されている。
ヒトおよびマウスアポA−Iは、5Fペプチドと比較して非常に長いクリアランスを示した。ヒトアポA−Iおよび5Fは、マウスアポA−Iよりもピーク血漿レベルまでの時間が長かったが、ただし達成されたピークレベルはほぼ類似していた(ヒトアポA−Iは他の物質よりも高いピークレベルに達した)。カラムクロマトグラフィーによる血漿サンプルの分析によって、ペプチド5FおよびアポA−I(ヒトおよびマウスの両方)は血漿リポタンパク質(特にHDLサイズ領域の粒子)と結合することが示された(図6)。5Fの注射後1.5時間のペプチド放射能活性のHDL:VLDL比は4.19±0.58(n=3、p<0.05)であった。同様な結果が5Fの注射後5時間で見出された(6.44±1.10、p<0.02)。注射されたペプチドは開始時3%未満の遊離125I
をTCA沈澱によって示した。しかしながら注射後1.5時間で、全溶出放射能活性のパーセントとして表される血漿中の遊離125Iの放射能活性は5Fについて増加し26.9
±9.4%で、5時間で34.4±4.8%であった。これは、リポタンパク質およびリポタンパク質結合ペプチドの予想されたクリアランスを示している。遊離ヨウ素による1.5時間から5時間の放射能活性の増加速度は、注射から1.5時間までのそれよりも小さく、おそらく腹腔内での開始時の顕著なペプチド分解を示唆しているのであろう。
長期間の食餌実験中に理由が不明の原因によって死亡したマウスは3匹のみであった。前記動物のうち2匹はMoAIを与えられ、1匹は5Fペプチドを与えられた。器官採取時には全体的な形態学的相違は群の間で認められなかった。肝臓はアテローム性硬化症誘発飼料を与えられた全ての動物で増大したが、肝重量においても体重の百分率として表される肝重量においても群間で相違は認められなかった(表4)。アテローム性硬化症誘発飼料を与えた全動物(PBS注射動物を含む)の体重は、固形飼料を与えたコントロールよりも軽かった(表4)。
についてはp<0.05;2テールt検定。
前記ペプチドに対する抗体の存在について、16週の注射期間の終了時に採取した血液サンプルを調べた。ペプチド5FまたはMoAI(データは示されていない)に対する抗体は検出されなかった。一連の動物に注射していないペプチドでELISAプレートを被覆した交差実験で得られた結果は、抗体の有無について前記直接的測定で示された結果と本質的に同一であった(データは示していない)。
CLip法で決定した総コレステロール値およびリポタンパク質コレステロール値は表3に示されている。総コレステロール値の正確さは手作業でのコレステロールアッセイ(Cholesterol 1000; Sigma, St.Louis, MO)によって確認された(データは示されていな
い)。総コレステロール値またはリポタンパク質分画コレステロール値について処置群の間に顕著な相違は認められなかった。しかしながら、リポタンパク質分画を総コレステロールのパーセントとして表した場合(表5)、HDL−コレステロールは、PBS群と比較して5F群およびMOAI群で極めて低い百分率を構成した。
*2テールt検定によりPBS群と比較した場合p<0.05またはそれ未満。
我々は最近、正常なHDLは穏やかに酸化されたLDLの生成で3つの工程を抑制することを発見した。これらの実験(同時係属出願USSN09/541,468; 2000年3月31日出願)で
、我々は、ヒトLDLをin vitroでアポA−IまたはアポA−I摸倣ペプチド(37pA)で処理することによって、LDLからHPODEおよびHPETEを含むシーディング分子が除去されることを示した。これらのシーディング分子は、ヒト動脈壁細胞の混合培養がLDLを酸化する能力をもつために、さらにLDLに動脈壁細胞の単球走化性活性の産生を誘発させるために必要であった。我々はまた、アポA−Iのマウスへの注射後またはヒトへの輸液後に前記マウスまたはヒト実験協力者から単離したLDLはヒト動脈壁細胞による酸化に抵抗性を有し、さらに動脈壁細胞混合培養で単球の走化性活性を誘発しないことを示した。図7は、アテローム性硬化症誘発飼料を与え、さらにPBSを注射した本実験のマウスから得たHDLは、ヒトLDLの酸化を抑制することができず(図7A)、さらにヒト動脈壁混合培養でLDL誘発単球走化性活性を抑制できない(図7B)ことを示している。対照的に、アテローム性硬化症誘発飼料を与え、さらにペプチド5Fを注射したマウスのHDLは、正常なヒトHDLと同程度に、ヒトLDLの酸化の抑制および混合培養でのLDL誘発単球走化性活性の防止に有効であった。図7はまた、アテローム性硬化症誘発飼料を与え、さらにPBSを毎日注射したマウスから採取したLDLは、同じ飼料を与えたが20μgのペプチド5Fを毎日注射したマウスから採取したLDLよりも容易に酸化され、より容易に単球走化性活性を誘発することを示している。いずれのリポタンパク質で処理した動脈壁細胞にも細胞毒性は観察されなかった(データは示されていない)。同様な結果が3つの別個の実験(データは示されていない)の全てで得られた。
平均病巣横断面面積は図8に提示されている。予想したように、通常のマウスの固形飼料を与えた群では病巣は観察されなかった(データは示されていない)。以前に報告されたように(Paigen et al.(1990) Arteriosclerosis 10:316-323)、病巣面積における顕
著なばらつきがアテローム性硬化症誘発飼料を与えた全ての群で観察された。しかしながら、2テールt−検定(p<0.002)で解析するか、または階層上の変数(variance
on ranks)の一方向分析(p<0.001;平均病総面積の分布が正常でないために決
定した)で解析するかに関係なく、5Fを注射した動物は、PBS注射動物よりも顕著に小さな平均病巣を有していた。MoAI注射では、PBS注射と比較して病巣面積に相違は出現せず、病巣面積は、t−検定(p<0.002)および階層上の変数の一方向分析(p<0.001)の両方で5F注射動物の場合よりも顕著に大きかった。
クラスA両親媒性らせんモチーフに類似するようにデザインした合成ペプチドはリン脂質と結合することができ、ヒトアポA−Iに類似する多くの生物学的特性を示すことを以前に我々は明らかにした(3、8、10、14、15、20)。我々はまた、前記ペプチドが動物の静脈内に投与されたとき、それらは血漿リポタンパク質と結合することを示した(11)。本実験は、理論的脂質親和性が高められた新規なペプチド5Fは、抗アテローム性硬化症の特性を有するという仮説を立証するために考案した。
はまた、アポA−Iのマウスへの注射後またはヒトへの輸液後に、前記マウスまたはヒト実験協力者からアポA−Iの注射/輸液後に単離したLDLは、ヒト動脈壁細胞による酸化に抵抗性を有し、さらに動脈壁細胞混合培養で単球の走化性活性を誘発しないことを示した。本実験では、アテローム性硬化症誘発飼料を与え、さらにPBSを注射したマウスから得たHDLは、ヒトLDLの酸化を抑制することができず(図7A)、さらにヒト動脈壁混合培養でLDL誘発単球走化性活性を抑制できなかった(図7B)。全く対照的に、同じアテローム性硬化症誘発飼料を与えたが、ペプチド5Fを注射したマウスのHDLは、正常なヒトHDLと同程度に、ヒトLDLの酸化の抑制および混合培養でのLDL誘発単球走化性活性の防止に有効であった(図7)。アテローム性硬化症誘発飼料を与え、さらに5Fを注射したマウスから採取したLDLは、同じ飼料を与えたがPBSを注射したマウスから採取したLDLよりも酸化は容易ではなく、さらに単球走化性活性の誘発も
容易ではなかった(図7)。血液循環で5FはLDLと相互作用し(HDLと結合する前または結合後に)、LDLの酸化およびLDL誘発単球走化性活性に必要なシーディング分子を、関連するペプチド37pAについて記載されたin vitroでの態様と同様な態様で除去するということが可能である(同時係属出願USSN09/541,468; 2000年3月31日出願を
参照されたい)。
と一致する。総コレステロール、LDL−コレステロール、IDL+VLDL−コレステロールレベルの類似性、および総コレステロールのパーセントとしてのHDL−コレステロールの低さにもかかわらず、アテローム性硬化症誘発飼料を与え5Fを注射した動物は、顕著に低い病巣スコアを示した(図8)。これらの結果は他の研究者の結果(Shah et al.(1998) Circulation 97:780-785)といくぶん類似する。前記研究者らは、高コレステロール血症が続いているにもかかわらず、アポA−IMilanoは、アポE欠損マウスでアテローム性硬化症病巣の進行を防止することを見出した。
et al.(1994) J. Clin. Onvest. 94:899-903; Plump et al.(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9607-9611; Shah et al.(1998) Circulation 97:780-785)が、前記実験で
一日50μgの用量のMoAIの注射では成功しなかった理由は明らかではない。MoAIは、ヒトアポA−Iのように安定なタンパク質:脂質複合体を形成しないことが示されている(Gong et al.(1994) Biochim. Biophys. Acta 1213:335-342)。マウスHDLは
また、ヒトHDLよりもいっそう容易に塩酸グアニジンによって変性することが示され(Gong et al.(1994) Biochim. Biophys. Acta 1213:335-342)、両親媒性らせんペプチド
は、ヒトHDLからヒトアポA−Iを除去するよりもいっそう容易にマウスHDLからMoAIを除去する可能性が示唆される。これらの相違は、MoAIが本実験で病巣を顕著には減少させなかったことの説明になるかもしれない。さらにまた、我々が用いた条件下ではさらに高用量のMoAIが必要である可能性もある。いずれの場合にも、5Fペプチドはこれらの条件下で非常に有効であったが、MoAIは有効ではなかった。
Dペプチドの有効性
本実施例は本発明のDペプチドの有効性を明示する。ヒト大動脈壁混合培養を、培養液単独(図では、LDL、無細胞または細胞有り、LDL無し)、健常対象者由来コントロ
ールLDL250μg/mL(図ではLDL)およびLDL+健常対象者由来コントロールHDL350μg/mL(図では+HDL)とともにインキュベートした。他の混合培養はコントロールLDLと、種々の量の(横座標に示したμg)のD−2FもしくはL−2F(左から3番目の図、2F)、またはD−37pAもしくはL−37pA(右側の最後の図、37pA)とともにインキュベートした。データは4つの混合培養から得た値の平均±SDを示す。HDLおよびペプチド添加の値は、p<0.01のレベルでLDL単独(左側の最初の図)の場合といずれも顕著な相違を示した。
に酸化されたLDLを生じた。続いて上清を廃棄し、混合培養を洗浄し、血清またはLPDSを含まない培養液でさらに4時間インキュベートした。この調整培養液を集め、単球
の走化性活性について分析した。図9に示したように、LDLをDペプチドでin vitroで
処理することによって、動脈壁細胞によるそれらの酸化が防止された。
vivoで経管投与によって与えられる本実験の結果における相違は、Dアミノ酸から合成
された2Fは完全なままで胃から吸収され、一方、我々の仮説のとおり、天然のLアミノ酸から合成された2Fペプチドは、消化過程において胃でおよび/または血漿中で分解されたことによると思われる。別の実験で、D−2Fペプチドに対する抗体生成の証拠は認められなかった。
6時間後に採血し、そのHDL、LDL、およびVLDL/IDLを単離した。グラフに示したように、経管投与後1.5時間で採取したHDLはコントロールLDLを改変から保護しなかったが、経管投与の3時間後および6時間後より少し前に採取したHDLは、コントロールHDLと同じ程度でヒト動脈壁細胞によるLDL誘発単球走化性活性の産生に対して保護能力を示した(図13A)。別のグラフ(図13B)では、50μgのD−5Fの経管投与後1.5、3または6時間でマウスLDLおよびVLDL/IDLを単離した。左の図では、コントロールLDLをヒト動脈壁細胞にコントロールHDLとともにまたはコントロールHDLを伴わずに添加し、動脈壁細胞によって生成される単球走化性活性を測定した。中央の図では、50μgのD−5Fの経管投与後1.5、3または6時間で採取したマウスLDLが動脈壁細胞に添加された。結果は、3時間および6時間後のLDLが誘発した単球走化性活性は顕著に低いことを示した。グラフの右側では、リポタンパク質のVLDL/IDL分画(図ではV/ILDL)が添加され、図に示されているように3時間では単球走化性活性の誘発は顕著に低かった。
クラスA両親媒性らせんペプチドの物理化学的および生物学的特性に対する疎水性増加の影響
略語リスト
Ac2O=無水酢酸;アポA−I=アポリポたんぱく質A−I;BSA=ウシ血清アル
ブミン;CAD=冠状動脈疾患;CD=円偏光二色性;DMPC=ジミリストイルホスファチジルコリン;DiPoPE=ジ(16:1)パルミトオレオイルホスファチジルエタノールアミン;DSC=示差走査熱分析(Differential Scanning Calorimetry);ED
TA=エチレンジアミンテトラ酢酸;EPC=卵黄ホスファチジルコリン;FMOC=フルオリニルメチルオキシカルボニル;GdnHCl=塩酸グアニジン;HAEC=ヒト大動脈内皮細胞;HASMC=ヒト大動脈平滑筋細胞;HBTU=2−(H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート;HDL=高密度リポタンパク質;HPLC=高速液体クロマトグラフィー;LCAT=レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ;MCP−1=単球走化性タンパク質−1;M−CSF=マクロファージコロニー刺激因子;MLV=多層(multilamellar)小胞;NMM=N−メチルモルフォリン;PBS=リン酸緩衝食塩水;PIPES=
ピペラジン−N,N’−ビス[2−エタンスルホン酸];RP−HPLC=逆相高速液体クロマトグラフィー;TFA=トリフルオロ酢酸
要約
我々は最近、両親媒性が増強されたクラスA両親媒性ペプチド5Fは、食餌誘発性アテローム性硬化症からマウスを防御することを示した。我々は、現に存在する極性アミノ酸を系統的にフェニルアラニンで置換することによって、アテローム性硬化症抑制に関する物理的および機能的特性に対する一連のクラスA両親媒性ペプチド同族体(5Fを含む)の疎水性増強の影響を調査した。前記ペプチドは、配列Ac−D−W−L−K−A−F−Y−D−K−V−A−E−K−L−K−E−A−F−NH2(配列識別番号:1、Ac−
18A−NH2または2F)を基にして以下のとおりであった:3F3(Ac−F318A
−NH2)、3F14(Ac−F1418A−NH2)、4F(Ac−F3,1418A−NH2)
、5F(Ac−F11,14,1718A−NH2)、6F(Ac−F10,11,14,1718A−NH2
)、および7F(Ac−F3,10,11,14,1718A−NH2)。水への溶解度、HPLC保持時間、卵黄PC単層膜中への浸透に対する排除圧(exclusion pressure)、および卵黄PC可溶化速度の測定によってペプチド4Fと5Fの間で突然疎水性が増加することが明らかになった。これは、リン脂質との結合能力増加を伴った。ペプチド6Fと7Fは影響がより少なく、これらのペプチドで脂質との相互作用の促進に対する疎水性増強の限界を示唆した。脂質親和性における前記の顕著な増強にもかかわらず、これらのペプチドは、血漿酵素、レシチン:コレステロールアシルトランスフェラーゼ(LCAT)の活性化にお
いてアポA−Iよりも有効性は低かった。すなわち、5FがLCATをもっとも強く活性化し、それはアポA−Iの80%であった。ペプチド4F、5Fおよび6Fは、LDL誘発単球走化性活性の抑制に等しく有効であった。これらの実験は、ペプチド−ペプチドおよびペプチド−脂質相互作用間の適切なバランスが、両親媒性ペプチドの最適な生物学的活性に要求されることを示している。これらの実験は、アテローム性硬化症抑制能力が強化された小型アポA−I摸倣体のデザインのための理論的根拠を提供する。
高密度リポタンパク質およびアポA−I(HDLの主要なタンパク質構成成分)の血漿レベルは、冠状動脈疾患と反比例する(Sprecher et al.(1993) Arterioscler. Thromb. 13:495-504; Philips et al.(1993) Circulation 88:2762-2770)。ヒトアポA−Iは2
43残基のタンパク質で、22量体の両親媒性らせんリピートを8つ含み、前記リピートの大半はクラスAモチーフを有することが示された(Segrest et al.(1990) Proteins 8:103-117; Anantharamaiah et al.(1993) pp.109-142, "The Amphipathic Helix (R.M. Epand ed.), CRC Press, Boca Raton, FL)。クラスA両親媒性らせんは特徴的な電荷分布
を有する。すなわち、それらは、αらせんの極性/非極性境界に陽性荷電アミノ酸集団を、さらに極性面の中心に陰性荷電残基を有する(Segrest et al.(1990) Proteins 8:103-117; Anantharamaiah et al.(1993) pp.109-142, "The Amphipathic Helix (R.M. Epand ed.), CRC Press, Boca Raton, FL; Segrest et al.(1992) J. Lipid Res. 33:141-166)。前記ユニークな二次構造モチーフは、アポA−Iの脂質結合特性に寄与していると説明されている(Segrest et al.(1990) Proteins 8:103-117)。クラスA両親媒性らせんの
合成類似体に関する多くの実験が前記の考えを支持した(Segrest er al.(1994) Adv. Prot. Chem., 45:303-369; Brouillette & Anantharamaiah (1995) Biochim. Biophys. Acta 1256:103-129)。
アポA−Iのエクソン4(44−243残基)のX線結晶構造および分子モデリング研究によって、全長のアポA−I分子同士の結合状態が脂質の結合に必要であることが示唆された(Borhani et al.(1999) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 94:12291-12296; Segrest et al.(2000) Current Opin. Lipidol. 11:105-115)。このモデルでは、アポA−Iの2つの分子は頭−尾結合のダイマー形
で配列され、1つのモノマーが互いに相互作用してアポA−Iの脂質結合構造を安定化させる。
る以下の3つの工程の合算である:a)xx細胞からのコレステロールの流出(Johnson et al.(1991) Biochim. Biophys. Acta.1085:273-298; Oram & Yokoyama (1996) J. Lipid Res. 37:2473-2491)、b)HDL結合コレステロールのLCATによるエステル化(Fielding et al.(1972) Biochem. Biophys. Res. Comm. 46:1493-1498; Jonas (1991) Biochim. Biophys. Acta 1084:205-220)およびc)肝臓へのコレステロールエステルのレセプター介在輸送(Kreiger (1991) Ann. Rev. Biochem. 68:523-558)。In vivo実験によ
って、ヒトアポA−IおよびクラスA合成両親媒性らせんペプチドは、両方とも逆コレステロール輸送とは独立したメカニズムによって、血漿コレステロールレベルを変化させることなくアテローム性硬化症を抑制することが示された(Shah et al.(1998) Circulation 97:780-785)。最近我々は、動脈壁細胞内へのLDL誘発単球走化性の抑制は、アテロ
ーム性硬化症の防止においてアポA−IおよびHDLが演じるまた別の主要な役割であることを示唆した(Navab et al.(2000) J. Lipid Res. 41:1481-1494; Navab et al.(2000) J. Lipids Res. 41:1495-1508)。
ミノ酸配列のいくつかの改変が、そのアポA−I類似特性を改善するために実施された(Brouillette & Anantharamaiah (1995) Biochim Biophys. Acta 1256:103-1291; Mishra et al.(1994) J. Biol. Chem. 269:7185-7191; Mishra et al.(1995)
J. Biol. Chem. 270:1602-1611)。
Acta 1256:103-1291; Epand et al.(1987) J. Biol. Chem. 262:9389-9396)は、このペプチドの疎水性の増加は、その脂質親和性およびアポA−I類似特性を増加させることを示した。合成ペプチド5F(両親媒性が増強されたAc−18A−NH2の類似体)は食
餌誘発性アテローム性硬化症をマウスで抑制することが示された(例えば実施例1および2を参照されたい)。しかしながら、ペプチド2Fは、C57BL6マウスでは食餌誘発病巣形成を顕著には抑制しなかった(Garber et al.(1999) Circulation 100:I538)。18Aダイマーペプチドの実験は、ペプチド−ペプチド結合の増加はペプチド:脂質結合を低下させることを示した(Mishra et al.(1995) J. Biol. Chem. 270:1602-1611)。
相から膜内への最大の分配を示すという意味でもっとも疎水性のアミノ酸である。膜活性ペプチドにおいてPheがもっとも耐酸性疎水性アミノ酸であり、さらにPhe含有ペプチドはTrp含有ペプチドよりも容易に合成できるので、我々はPheをペプチドの疎水性の増加に用いた。物理的特性および脂質結合特性、並びにアポA−Iに類似する生物学的特性(例えばLCAT活性化およびLDL誘発走化性活性の抑制)に対する前記疎水性増加の影響を調べた。
ペプチド合成
ペプチドは、自動固相合成装置(PS3 Protein Technologies, Woburn, MA)を用いて固相法によって合成した。FMOC−アミノ酸をリンクアミド樹脂(0.536mEq/g)(Peninsula Laboratories, Inc. Belmont, CA)とHBTUおよびNMMの存在下で結合させ、N−末端を無水酢酸でアセチル化した。アニソール(1%)、メルカプトエタノール(0.1%)およびトリプトファン(ペプチド樹脂の重量の20%)の存在下で、ジクロロメタン中の70%のTFAを用いてペプチドを固相支持体から切断し、VYDACC−4(22mm×25cm、粒子サイズ10μm)逆相HPLC(RP−HPLC)カラム上で、水に25%から58%の0.1%TFA含有アセトニトリルのグラディエント(22分)を用い4.8mL/分の流速で66分かけて精製した。ペプチドの純度は、C
18カラム(VYDAC、4.6mm×25cm、5μm)およびアセトニトリル−水(0.1%TFA含有)の25%から58%の直線グラディエントを用い33分かけて分析用RP−HPLCによって確認し、さらに質量分析によって確認した。
CDスペクトルはAVIV・62DS分光偏光計で文献(Mishra et al.(1994) J. Biol. Chem. 269:7185-7191)にしたがって記録した。簡単に記せば、通過窓の長さが0.1cmのセルを用いてスペクトルを得て、測定値は、260nmから190nmまで1nm毎に25℃で採取した。全てのCDスペクトルは4つのスキャンを合算することによって平均化したシグナルであった。基準線は修正し凹凸を無くした。PBS(pH7.4)中のペプチド溶液は11μMの濃度で用いた。ペプチド−DMPC複合体(1:20 mo
l:mol)を用いて、これらペプチドのらせんに対するペプチド結合の影響を決定した。これら複合体は、適切な容積のペプチド溶液をDMPC多層小胞に添加することによって調製した。DMPC多層小胞は以下のようにして調製した:既知量の脂質をエタノールに溶解し、希薄な窒素流の下でゆっくり蒸発させることによって溶媒を除去した。残留溶媒は脂質フィルムを真空下に一晩保存することによって除去した。適切な容積のPBS(pH7.4)を薄い脂質フィルムに添加して、要求される最終濃度のDPMCを得た。脂質−ペプチド複合体は必要な容積のペプチド溶液を添加することによって調製し、20:1の脂質:ペプチドモル比を得た。これらペプチドの溶解度が小さいので、11μMのペプチド濃度を用いた。222nmの平均残基楕円率、[θ]MRE(deg.cm2.dmol-1)は以下の等式を用いて計算した:
[θ]MRE=MRW[θ]/10cl
式中、MRWはペプチドの平均残基重量であり、θは度で表した観察された楕円率であり、cはg/mLで表したペプチドの濃度であり、lはセンチメートルで表したセルの観察窓の長さである。ペプチドのパーセントらせん度は、Morrisettら(Biochemistry 12:1290-1299(1973))が記載した以下の等式から概算した:
%αらせん度=([θ]222+3000)/(36000+3000)
式中、[θ]222は222nmでの平均残基楕円率である。
DSC実験は、マイクロカルMC−2走査熱分析計(MicroCal, Inc., Amherst, MA)
を用い、DMPCについては走査速度20℃/時間で、DiPoPEについては走査速度37℃/時間で文献(Mishra et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:7185-7191)に記載さ
れた方法を用いて実施した。既知量のリン脂質をクロロホルムに溶解した。サンプル1組について、ペプチドをメタノールに溶解し、クロロホルム/メタノール(2:1、v:v)中のDiPoPEの溶液に添加した。純粋な脂質サンプルおよび脂質とペプチドの有機溶液の両方について、溶媒をゆっくりとした窒素流の下で除去した。残留溶媒は真空下で除去した。緩衝液(DMPC用はpH7.4、PBS、DiPoPE用はpH7.4、20mMPIPES,1mMEDTA,150mMNaClおよび0.002%NaN3)
単独、または固有の脂質/ペプチドモル比を提供するために緩衝溶液中の既知濃度のペプチドを前記乾燥フィルムに添加し、さらに室温で30分ボルテックスミキサーで水和させた。DMPCの場合は、スキャンの間に60分の平衡化時間を含む4つの連続スキャンを実施した。DSCサーモグラムは、マイクロカル社(MicroCal Inc., Amherst, MA)が提供するソフトおよびオリジン(Origin)バージョン5.0を用いて分析した。
単層排除圧(monolayer exclusion pressure)測定は、脂質−水境界面に対するペプチドの親和性を提供し、PhillipsとKrebsの方法(Phillips & Krebs (1986) Methods Enzymol. 128:387-403; Ibdah et al.(1989) Biochim. Biophys. Acta 1004:300-308)に従っ
た。卵黄ホスファチジルコリン(EPC)の不溶性単層膜をテフロン(登録商標)皿内の
空気−水境界面に室温で広げて5−45dyn/cmの最初の表面圧(πi)を提供した
。1.5Mの塩酸グアニジンを含むPBS中のペプチド溶液を下相に注意深く注入し、50μg/dLの最終濃度を提供した。塩酸グアニジンをサブフェース中で1mM以下の最終濃度に希釈して、ペプチドを再生させた。サブフェースを持続的に攪拌しEPC単層膜の表面圧の増加(Δπ)を定常値が得られるまで記録した。ペプチドがもはやEYPC単層膜に進入しない最初の表面圧(πi),すなわち排除圧(πe)は、πi対Δπ直線回帰
適合をΔπ=0dyn/cmに外挿することによって計算した。
これらペプチドと卵黄ホスファチジルコリンとの結合は、文献(Mishra et al.(1994) J. Biol. Chem. 269:7185-7191)に記載されたように、SLM8000C光子計測スペクトロフルオロメーターを用いて直角光散乱により、EPC多層小胞の分解を追跡することによって決定した。EPCMLVは、EPC(Avanti
Polar, AL)の溶液を窒素下で蒸発させ、さらに脂質フィルムをリン酸緩衝食塩水(pH7.4)で水和させることによって調製した。105μMのEPCおよび等モル量のペプチドを含むサンプルを25℃で維持し、持続的に攪拌した。濁り度の清澄化を30分モニターした。EPC小胞の完全な溶解は、最終濃度1mMのTritonX−100の添加によって達成された。
LCATを新鮮な血中脂肪値正常血漿から文献(Albers et al.(1986) MethodsEnzymol. 129:763-783)の方法にいくつかの改変を加えて単離した。血漿密度を1.21g/m
Lに調節し、175000gで24時間遠心した。LCAT含有分画をアフィ−ゲル(Affi-Gel)ブルークロマトグラフィーに、続いてDE−52クロマトグラフィーに付した。トリス緩衝液(10mM、pH7.6)中の75から200mMのNaClグラディエントを用いてLCATをDE−52カラムから溶出させた。SDS−PAGEの結果、ヒトアポA−Iが夾雑していない90%を越える純度の酵素であると分かった。
微量の7α−3Hコレステロールを含む卵黄PC/コレステロール(90:20モル/
モル)をブランソン250ソニケーターで12分超音波処理し、小さい単層小胞を作製して基質を調製した。前記基質(50μL)を5μgのペプチドまたはヒトアポA−Iおよび50μLのBSA(40μg/mL)とともに1時間37℃でインキュベートした。総容積を150μLまで増やした。1時間インキュベートした後、100μLのLCATを添加し、37℃で1時間インキュベートし、さらにシリカ片上に10μLを滴下することによって反応を停止させた。ヘキサン:クロロホルム(2:1v/v)混合物中でシリカ片の薄層クロマトグラフィーによって、コレステロールとコレステリルエステルを分離させた。コレステロールおよびコレステリルオレエート標準物は、3%の酢酸第二銅、8%のリン酸緩衝液中にTLCプレートを浸漬し加熱することによって可視化した。標準物の位置を用いて前記プレートを2つに切断し、この2つの部分をパッカードトリカーブ(Tri Carb)4530中でシンチレーション液で計測した。全反応を3組ずつ実施した。ペプチドによるLCATの活性化は、アポA−Iによる全活性化の百分率で表される。
非変性PAGEおよびSDS−PAGEはLaemmliの方法(Nature 227:680-685(1970)
)を用いて実施した。プリメードノベックス(Premade Novex)ゲルを用い、さらにゲル
はクーマシーブルーで染色してタンパク質バンドを特定した。
ヒト動脈壁細胞の混合培養、単球の単離、健常者ドナー血漿からの超遠心沈澱による、
またはマウス血漿からのFPLCによるリポタンパク質の単離、並びに脂質ペルオキシドおよび単球走化性活性の測定は、文献の記載にしたがって実施した(Navab et al.(1991)
J. Clin. Invest. 88:2039-2046; Navab et al.(1977) J. Clin. Invest. 99:2005-2019)。簡単に記せば、LDLおよびHDLをヒト血漿からHavelら(J. Clin. Invest. 43:1345-1353(1955))の方法によって単離した。ヒト大動脈内皮細胞(HAEC)および平滑筋細胞(HASMC)を文献(Navab et al.(1991) J. Clin. Invest. 88:2039-2046)に記載にされたように単離した。マイクロタイタープレートを0.1%のゼラチンで37℃で一晩処理した。HASMCを1×105細胞/cm2の密集成長した密度で添加した。細胞を2日間培養し、このとき細胞はウェルの表面全体を覆い、かなりの量の細胞外マトリックスを産生していた。続いてHAECを2×105細胞/cm2で添加して増殖させ、2日間で密集成長したHAECの完全な単層培養が形成された。全ての実験で、HAECおよび同一個体由来のHASMCを4代から6代の継代レベルで用いた。単球は健常なドナーから文献(Fogelman et al.(1988) J. Lipid Res. 29:1243-1247)に記載されたように単離した。混合培養は天然のLDL(250μgタンパク質/mL)で処理するか、またはHDL(350μgタンパク質/mL)もしくはペプチドの存在下で8時間処理した。続いて前記混合培養を洗浄し、メディウム199でさらに8時間インキュベートした。得られた混合培養上清を文献(Navab et al.(1997) J. Clin. Invest. 99:2005-2019)の記載にしたがって単球走化性活性についてアッセイした。
ペプチドの分析
表6は、合成した種々の18A類似体の配列を示す。ペプチドAc−18A−NH2(
前記は2つのPhe残基を6位および18位(境界面のリジン残基の近く)に有する)は2Fと称される。2つの3Fペプチド、3F3または3F14を合成した。前記ペプチドで
は、3位および14位のLeu(両方とも非極性面の中心に存在する)がそれぞれPheによって置換されている。ペプチド4Fは、非極性面の中心に2つのPheを有し、これは2つの中心部のLeu残基が置換された結果である。ペプチドの置換(3Fから7F)は表6に示されている。Phe残基の数が増加するにつれて、非極性面上の残基当たりの理論的疎水性が、ペプチド2Fに対する2.05から7Fに対する3.15に増加する。
2疎水性は非極性面上の残基当たりの疎水性として表されている。
3理論的脂質親和性は文献(Palgunachari et al.(1996) Arterioscler. Thromb.
Vasc. Biol. 16:328-338)の記載に示されているように計算した。
1%トリフルオロ酢酸含有)とアセトニトリル(0.1%トリフルオロ酢酸含有)を用いて精製した。ペプチドの純度および保持時間は、分析用VydacC18カラムで水にアセトニトリル25%−58%のグラディエント(0.1%TFA含有)を用いて決定した。前記ペプチドの純度はまた質量分析法によって確認した。前記質量は計算によって得られた分子量と一致した。ペプチドの保持時間は表7に示されている。3Fペプチドおよび4Fペプチドはともに2Fと比較して付加されたPhe残基を有するが、C18カラムにおけるこれらペプチドの保持時間は大きくは相違しない(〜22分)。保持時間における突然の増加は5F、6Fおよび7Fで明白である(〜26分)。Phe残基の数が増すにつれ、これらペプチドのPBS中の溶解度は減少する。表7から明らかなように、2F、3F3,3F14および4Fの溶解度(1.25から1.4mg/mL)は、5F、6Fおよび
7Fの溶解度(0.03から0.1mg/mL)よりも顕著に高い。
2保持時間は、水にアセトニトリル25%−58%(33分)のグラディエント(0.1
%TFA含有)を用いVydacC18カラムから溶出したペプチドについて得られた時間である。
3溶解度はPBS中で決定された。
4これらの測定の再現性は±1dyn/cmである。
ペプチドの二次構造は円偏光二色性分光分析によって決定した。表8は、PBS中およびDMPC存在下でのペプチドのパーセントらせんを示している。PBS中では、同族体2F、4F、5F、6Fおよび7Fは、3F3および3F14よりも高いらせんパーセント
を有する(表8)。5F、6Fおよび7FはPBSに難溶であるので、CD実験は11μMのペプチド(それらが完全に溶解する濃度)を用いて実施した。ペプチド2Fは、溶液中の5Fに匹敵する55%らせんを示した。6Fおよび7Fは両方ともわずかに高いらせん(それぞれ67%および58%)を示し、4Fはわずかに低かった(45%)。3Fペプチドは両方ともはるかに低いらせんを示した(〜20%)。しかしながら、DMPCへの結合は、6Fを除いて全てのペプチドのらせんを顕著に増加させた(表8)。脂質環境下では、2F、5Fおよび7Fは高いらせん含有量(68%から76%)を示した。ペプチド3F3および3F14はPBS中ではらせん含有量は非常に少ないが、脂質環境下では
顕著ならせんの増加があった(3F3については約22%から42%に、3F14について
は19%から55%に増加)。ペプチド6Fおよび4Fのらせんは、脂質の存在下でもそれほど変化しなかった。しかしながら、これらのペプチドはなお2Fおよび5Fペプチドよりもらせん的でなかった。CDの結果は、Pheによる置換の増加に関してペプチドのらせん形成に系統的な変化は存在しないことを示唆している。ペプチド2Fおよび5Fは溶液中およびリン脂質の存在下で最大らせんを示した。
表8:水性環境および脂質環境下でのFペプチドのらせん形成
mol)であった。3回の測定を実施し、±10%の誤差を得た。
DMPC及びDiPoPEを用いたDSCの研究
DMPCの多層小胞の鎖溶融遷移に対するこれら18A類似体の影響をペプチド−脂質混合物(脂質/ペプチドモル比100:1)を用いて調べた。表9は、ペプチドの存在下および非存在下でのDMPCの鎖溶融遷移の遷移温度並びにエンタルピーを示す。純粋な脂質は13℃で予備遷移を、23℃で主要な鎖溶融遷移を示す。DMPCへのペプチドの添加は、ゲルから液晶への遷移の拡大、および遷移エンタルピーの低下をもたらした(表9)。予備遷移はいずれのペプチドの存在下でも認められなかった。調べたペプチドの中で2F、3F3、5Fおよび6Fが遷移エンタルピーを最も大きく減少させた(表9)。
いずれのペプチドも遷移温度の変化は0.2℃を越えなかった。
た(Tytler et al.(1993) J. Biol. Chem. 268:22112-22118)。これまでの実験で我々は2つの方法でペプチド−脂質混合物を調製した。1つは、有機溶媒中のペプチドを有機溶媒中の脂質に添加し、続いて前記物質をフィルムとして沈積させ、さらに緩衝液で水和させる方法である。他の方法では、ペプチドおよび脂質を別々に水和させた後でそれらを混合する。混合物がDSC分析の前に平衡化すれば、ペプチドと脂質が最初にどのようにして混合されたかは重要ではない。しかしながら、膜系はゆっくりと平衡化させることができ、その場合には、ペプチドが脂質フィルムに高濃度で取り込まれるときはより多くのペプチドが脂質中に存在することができる。一般に、両方法によるサンプル調製の結果は同様であるが(結果は示されていない)、THのシフトは、脂質とペプチドで構成されたフ
ィルムにペプチドが取り込まれたサンプルでより大きい傾向がある。ペプチドのモル濃度分画に関するTHのばらつきは、種々のペプチドおよびアポA−Iについて示されている
(図15)。THにおける直線状の増加が2Fおよび5Fについて観察されるが、4Fは
、より迅速な増加が低いペプチド濃度で観察されるという点においてアポA−Iに類似する態様を示す。他方、2つの3F類似体は、6Fおよび7Fと同様にTHに顕著な影響を
与えない。
単層の排除圧(πe)は、ペプチドがもはやEPC単層膜に侵入できない表面圧である
。πeの値はペプチドの理論的脂質親和性を反映する。Fペプチドの排除圧はPhe残基
の数が増加するにつれ増加する(表7)。ここで調べた全てのペプチドが、アポA−Iおよび親ペプチド18Aよりも高い排除圧を有していた。πeの値は2Fから4Fへと(3
8から40dyn/cm)徐々に増加した。これは37pA(プロリンが間に入った18Aのタンデムリピート)について観察された範囲内である。排除圧値は5F、6Fおよび7Fについて顕著に増加した(40から45dyn/cm)。排除圧によって決定されたように、5F、6Fおよび7F同族体は、EPC単層膜と類似の相互反応能力を有することは明白である。表7に挙げたFペプチドは、HPLC保持時間および単層膜排除圧について類似傾向を有し、4Fと5Fの間で急激な増加を示すことは興味深い。
図16で認められるように、アポA−I(EPCMLVを清澄化できない)と異なり、全てのペプチドがEPCMLVを清澄化することができた。3Fの2つの同族体ペプチドはEPCMLVの清澄化でもっとも有効性が低かった。同族体ペプチド2F、5F、6Fおよび7Fは全てEPCMLVを同程度に清澄化した。ペプチド4Fは、EPCMLVをもっとも効果的に清澄化し、活性はTritonX−100のそれと類似していた。EPCMLVの濁り度の50%クリアランスのための時間もまた4F同族体でもっとも短かった。ペプチド7Fは50%クリアランスの達成のためにもっとも長時間を要し、これは、最初のラグ時間(〜300秒)のためであった(図16)。前記はおそらく、EPCMLVと相互作用する前に自己結合した7F分子が分解し、それらを可溶化させる必要性があるからであろう。同族体2F、5Fおよび6Fによって示されたより遅いクリアランス速度もまた、これらペプチドの高い自己結合が原因であるかもしれない。
これらのペプチドの血漿酵素LCATを活性化する能力を、基質として卵黄PC−コレステロール小胞を用いLCAT反応の最初の粘度を測定することによって決定した(図17)。LCAT活性化は、アポA−Iによる活性化(これを100%とする)との比較で表される。20μg/mLのペプチドおよびアポA−IによるLCATの活性化は図4に示されている。この濃度では、アポA−Iはいずれのペプチドよりも良好にLCATを活性化する。ここで調べたペプチドの中では、しかしながら5Fが最良の活性化物質である(アポA−Iの80%)。LCAT活性化に関するかぎり、3F3および3F14は同様な
活性化能力を有している。したがって、それらは1本の棒線で表した(図17)。
LDLをヒト動脈壁混合培養系とともにインキュベートしたとき、LDLは内皮下腔に捕捉され、酸化されて生物学的に活性な脂質を生じる。これらの脂質は単球走化性を誘発する。したがって、混合培養単球走化性は、生物学的に活性な脂質の生成についての十分に確立されたアッセイである。走化性の抑制は “シーディング分子”の除去と正比例す
ることが示された。前記シーディング分子は、単球走化性タンパク質1(MCP−1)の分泌(Navab et al.(2000) J. Lipid Res. 41:1481-1494; Navab et al.(2000) J. Lipid
Res. 41:1495-1508)および分化因子、マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)の分泌に必要である。図18は、ペプチドとインキュベートした後のLDLが作用の変動を表すことを示し、LDLの走化性特性は同族体4F、5Fおよび6Fによりもっとも減少する。ペプチド3Fは、2Fおよび7Fと比較して全く有効性がなく、2Fおよび7Fは、4F、5Fおよび6Fよりも有効性は低かった。
クラスA両親媒性らせんペプチド類似体の疎水性増加によるその物理化学的特性および脂質結合特性に対する影響
本明細書で調べたペプチドは親ペプチド18Aの同族体である。非極性面上の残基当たりの計算による疎水性(改変GESスケールによる(Palgunachari et al.(1996) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16:328-338))は、Phe残基の数が増すにつれ増加する。疎水性におけるこの増加(表6)は、理論的な脂質親和性、Λにおいて再現される(上掲書)。しかしながら、Λ値は、2Fから4Fまで徐々に増加し(13.03から14.59)、さらに突然14.59(4Fの場合)から19.07(5Fの場合)の値に増加する。Λが徐々に増加するのが5Fの後に6Fおよび7Fに対する値で再び観察される(表6)。これは、Ac−18A−NH2の3位および14位のLeuがPheで置換され
たことによる。Pheは、非極性面の疎水性のわずかな増加をもたらし、したがって2つの3F類似体および4FのΛ値にわずかな増加が生じる。同族体5F、6Fおよび7Fで
は、しかしながら、LeuからPheへの置換の他に、11位および17位のAlaもまたPheで置換され、Λ値の顕著な増加がもたらされる(表6)。AlaはLeuよりも疎水性が小さく、さらにLeuはPheよりも疎水性が小さいので、AlaからPheへの置換は、LeuからPheへの置換よりも、得られたペプチドにおいて疎水性および理論的脂質親和性に大きな変化をひき起こす。
ら22分)、5F、6Fおよび7F(これらは第二の群を構成する)の値(26から27分)よりも顕著に小さい。ペプチド2Fから4Fは、同族体5Fから7F(これらは難溶性である)よりも水への溶解度は顕著に高い。排除圧が2Fから4Fまで徐々に増加するのが観察され、その後40dyn/cmから45dyn/cmへ急激に増加する。ペプチド5F、6Fおよび7Fの場合の排除圧は互いに大きな相違をもたず、アポA−Iのそれよりも顕著に高い(表7)。親ペプチド18A(30dyn/cm)および18Aのダイマー、37pA(40dyn/cm)さえもまた、空気−水境界面に広げた卵黄PC単層膜への侵入の効率は顕著に低かった。上記の物理的特性を基にして、Fペプチドは2つの群に分けることができる。すなわち2F、3F3、3F14、4Fの群I並びに5F、6F
および7Fの群IIである。
LCATの活性化は複雑な過程であり、脂質の親和性に左右されるだけではなく、両親媒性らせんタンパク質と酵素LCATとの相互作用にも依存する(Jonas (2000) Biochim. Biophys. Acta 1529:245-256)。前記の記述と合致して、LCATを活性化する能力は同族体ペプチドについて異なることが見出された。ペプチド5Fは最大のLCAT活性化能を示し、これは、表7に示した物理的特性と一致する(表7では、卵黄PC−水境界面での排除圧値を含む急激な増加が4Fから5Fで認められた)。ペプチド6Fおよび7Fは5Fほど効果的ではないという事実は、これらペプチドの水への低い溶解度によって反映されるように、ペプチド:ペプチド相互作用の増加(前記増加はペプチド:脂質またはペプチド:LCAT相互作用を許容しない)によって説明することができるであろう。こ
れらの結果は、18Aダイマーに関する我々の以前の観察と合致する。以前の観察では、ダイマー18A−18A(36A)におけるペプチドの自己結合の強化は、18A−Pro−18Aペプチドと比較して脂質と相互作用する能力を低下させた(Jonas (2000) Biochim. Biophys. Acta 1529:245-256)。前記ペプチドによるLCATの活性化はアポA−Iのそれと匹敵したが、アポA−Iと前記の全てのペプチドはEPCに対して異なる反応性を有するので(図16)、それらは違った態様で基質と相互作用するということは留意されねばならない。同様な観察がChungらによって報告された。彼らは、合成ペプチド1
8A−Pro−18AおよびアポA−Iは異なる態様でEPCと相互作用することを示した(Chung et al.(1985) J. Biol. Chem. 260:10256-10262)。
我々が報告したように(Navab et al.(2000) J. Lipid Res. 41:1481-1494; Navab et al.(2000) J. Lipid Res. 41:1495-1508)、“シーディング分子”の除去はペプチドの両親媒性度に左右されるので、我々はこれらペプチドのLDL誘発単球走化性抑制能力を調べた。このアッセイでは、一方向変数分析を基にして、ペプチド4F、5Fおよび6F(100μg/mLレベル)は、顕著かつ類似するLDL誘発走化性の抑制を示した。同族体2Fはある程度の抑制活性を示し、(その理由は不明であるが)、類似体ペプチド3Fは抑制を示さずLDL単独と類似していた。これらの結果は、ペプチド3Fは脂質過酸化水素を除去できない(データは示されていない)という事実およびEPCMLVを清澄化する能力が低いことと一致した。ペプチド7Fは、ペプチド4F、5Fおよび6Fより顕著に有効性が低かった(P<0.001)。7Fの能力の低下はまた前記ペプチドの自己結合の増強によって説明できる(自己結合の増強はEPCMLVの清澄化実験で観察されたように脂質との相互作用能力を低下させる)。これらの結果はあらためて、ペプチドの疎水性が自己結合に与える影響間に存在する微妙なバランスがアポA−I摸倣特性に決定的な影響を与えることを示している。
対照的に、2F(LCAT活性化能力は4Fと同様であるが、“シーディング分子”をLDLから除去する能力は4Fおよび5Fよりも低い)の投与は、C57BL6マウスにおける食餌誘発性病巣の形成を顕著には抑制しなかった(PBSを投与したコントロールマウスの平均病巣面積は14.7±1.8μm2×10-3に対して、2F投与マウスでは1
3.2±1.7μm2×10-3、n=15)。したがって、前記のマウスモデルでは、L
DL誘発単球走化性の抑制が、LCAT活性よりもアテローム性硬化症誘発に対してより強い対抗力を示す。ペプチド2Fおよび4FはLCATの活性化においては類似し、4Fおよび5FはLDLから“シーディング分子”を除去する能力において類似しているので、ペプチド4Fは、異なるアテローム性硬化症感受性マウスモデルでLCAT活性化とLDL誘発単球走化性の抑制の重要性を識別する試薬として機能するかもしれない。LDL誘発走化性の抑制がLCAT活性化能力よりも重要であるならば、4Fは5F、6Fおよび7Fよりもより可溶性であるのでアテローム性硬化症の抑制として用いることができるより優れたペプチドであるはずである。
ペプチドD−4Fは、急性炎症性反応時にパロキシナーゼレベルを維持し、酸化リン脂質生成を阻害する
我々は、インフルエンザAウイルスのマウス鼻腔内点滴によって惹起されるHDLの抗炎症性特性の時間依存性低下は接種後7から9日で最大に達することを観察した。選択した接種量はウイルス血症をひき起こさない量で、したがって、惹起される変化はウイルスによって直接ひき起こされるものではなく、ウイルス感染に対するホストの全身反応によ
って誘発される炎症状態によるものであった。前記の反応は生来の免疫系の一部分であり、急性期反応として知られている。
D−アミノ酸から合成されたアポA−I摸倣ペプチドの経口投与はマウスのアテローム性硬化症を劇的に減少させる
DまたはLアミノ酸から合成されたアポA−I摸倣ペプチドは、動脈壁細胞による酸化に対して低密度リポタンパク質(LDL)を防御するためにin vitroで有効であった。しかしながら、前記ペプチドをLDLレセプター欠損マウスに経口的に与え、そのHDLを単離し、LDLを酸化から保護する能力をin vitroで調べたとき、D−アミノ酸から合成されたペプチドのみが有効であった。D−アミノ酸から合成されたペプチドは血液循環中で安定であり、高密度リポタンパク質(HDL)の分画から見出された。Lアミノ酸から合成されたペプチドは急速に分解され尿中に排泄された。D−4Fとして知られるD−アミノ酸から合成されたペプチドを1日に2回経口的に、西洋風食餌を与えたLDLレセプター欠損マウスに投与したとき、病巣は79%減少した。アポE欠損マウスの飲料水に添加したとき、D−4Fは病巣を84%以上減少させた。我々は、D−アミノ酸から合成したアポA−I摸倣ペプチドの経口投与は、アテローム性硬化症および酸化脂質によってひき起こされる他の慢性炎症性疾患の予防および治療に有用であると結論した。
HDL−コレステロール濃度はアテローム性硬化を示す冠状動脈疾患の危険性と反比例する(Miller & Miller (1975) Lancet, 1:16-19)。アポA−I(HDLの主要なアポリポタンパク質)の輸液(Badimon et al.(1990) J. Clin. Invest. 85:1234-1241)または遺伝子導入による発現(Plump et al.(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:9607-9611)は、動物モデルでアテローム性硬化症を防御できることが示された。アポA−Iがア
テローム性硬化症の進行を防御するメカニズムは、逆コレステロール輸送(Shah et al.(
2001) Circulation, 103:3047-3050)およびLDLの酸化に必要な低レベルの酸化脂質(“シーディング分子”)の除去(Navab et al.(2000) J. Lipid Res. 41:1481-1494; Navab et al.(2000) J. Lipid Res. 41:1495-1508; Navab et al.(2001) Arteriosclerosis Thromb. Vasc. Biol. 21:481-488)を含むのではないかと考えられている。クラスA両親媒性らせんペプチド類似体は、LDLの酸化に必要な“シーディング分子”の除去(Navab et al.(2000) J. Lipid Res. 41:1481-1494; Navab et al.(2000) J. Lipid Res. 41:1495-1508)を含むアポA−Iのいくつかのin vitroでの特性に類似する特性を有することが示された。前記には、。クラスA両親媒性らせんペプチドの腹腔内投与は、血漿コレステロールレベルに変化を生じないで食餌誘発アテローム性硬化症からマウスを保護することが最近示された(Garber
et al.(2001) J. Lipid Res. 42:545-552)。病巣の減少に、in vitroでのLDLの酸化を抑制するHDLの能力の顕著な改善が付随していた(上掲書)。これまで、アポA−IおよびアポA−I摸倣ペプチドを薬理的物質として用いる場合の主要な制限は、非経口ルートによる投与の必要性であった。
マウス
C57BL/6J系の雌のLDLレセプター欠損マウスまたはアポE欠損マウスをジャクソンラボラトリー(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)から購入した。LDLレセプター欠損マウスは、プリナ固形飼料(Purina chow diet, Ralston Purina Co.)で4週齢まで飼育し、その時点で西洋風食餌(Western diet, Tekland, Madison, WI, diet#88137)に切り替え6週間用いた。アポE欠損マウスは実験を通してプリナ固形飼料で飼育した。LDLレセプター欠損マウスは、経管投与によって1日に2回テストペプチドまたは担体コントロールを、図の説明文に示された期間投与された。4週齢で、アポE欠損マウスの幾匹かの飲料水に図の説明文に示した濃度でテストペプチドを添加し、アポE欠損マウスには固形飼料を続けた。
たプロトコルにしたがって麻酔下で後眼窩静脈叢から採血した。アテローム性硬化症病巣は以前に記載したように測定した(9)。
LDLおよびHDLは、インフォームド・コンセントを得た後で実験協力者から、および上記に記したようにマウスから文献(Navab et al.(2000) J. Lipid Res. 41:1481-1494; および本明細書実施例)の記載にしたがって単離した。
以前に述べたように(上掲書)、ヒト大動脈内皮細胞および平滑筋細胞を単離し培養した。HDLの存在下および非存在下でのLDLの細胞性酸化は以前に述べたように(上掲書)決定した。ヒト血液単球はインフォームド・コンセントを得た後で単離し、単球走化性活性は以前に記載(5)されたように決定した。
アポA−I摸倣体ペプチドは以前に記載(11)されたように合成したが、ただしいくつかの事例では、ペプチドの各アミノ酸は該当アミノ酸のD型立体異性体であった。前記
ペプチドは、Ac−D−W−L−K−A−F−Y−D−K−V−A−E−K−L−K−E−A−F−NH2(配列識別番号:1)(Ac−18A−NH2または2F)をベースにしている。2Fまたは2Fの類似体を用いてここに報告する実験に用いた。前記2F類似体の一次アミノ酸配列は以下のとおりであった:Ac−D−W−F−K−A−F−Y−D−K−V−A−E−K−F−K−E−A−F−NH2(配列識別番号:5、4Fとも称され
る)。L−アミノ酸から合成したペプチドはL(例えばL−4F)と称され、D−アミノ酸から合成したペプチドはD(例えばD−4F)と称される。いくつかの事例では、前記ペプチドはIODO−BEAD試薬(Pierce, Rockford, IL)を用い、製造元の推奨にしたがってヨウ素化した。D−4FとともにまたはD−4Fを用いないで、L−α−1−パルミトイル−2−オレイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(Avanti Polar Lipids,
Alabaster, AL)から作製したリポソームは、製造元の推奨にしたがって製造した。完全なペプチドのマウス血漿からの抽出および検出は、逆相HPLCを用い文献(Garber et al.(1992) Arterioscler. Thromb. 12:886-894)の記載にしたがって実施した。
リポタンパク質のタンパク質(Navab et al.(2000) J. Lipid Res. 41:1481-1494)お
よびコレステロール(Van Lenten et al.(2000) Circulation 103:2283-2288)の含有量
、並びに統計分析は、P<0.05と規定される有意差で、文献(Van Lenten et al.(2001) Circulation 103:2283-2288)の記載にしたがって実施した。
In vitroでは、L−2FおよびD−2Fは、両者とも等しくLDLの酸化およびヒト
大動脈壁細胞混合培養でのLDL誘発単球走化性活性をブロックすることができた(データは示していない)。しかしながらin vivoでは図22Aに示したように、経口投与の後
、D−4Fのみが血液循環中で無傷のままであり、HDL保護能力を強化し(図22B)、LDL誘発単球走化性活性を低下させることができた(図22C)。125I−L−4F
または125I−D−4Fの経口投与後2時間で、L−4Fを投与されたマウスの尿は、D
−4Fを与えられたマウスの場合の約15倍の放射能活性を示した(データは示されていない)。
9±4.6mg/dL)。平均HDL−コレステロールは、D−4Fを投与されたマウスで軽度に増加したが、その相違は統計的な有意差に達しなかった(ペプチドを含まない水を投与したマウスで32.2±7mg/dL、D−4Fを2.5mg/マウス/日で投与されたマウスで38.7±5mg/dL、D−4Fを5.0mg/マウス/日で投与されたマウスで43.4±6mg/dL)。
これまではアポA−IおよびアポA−I摸倣体ペプチドを薬剤として使用することには非経口的投与の必要性から制限があった。本実験でのアテローム性硬化症病巣の目ざましい減少は、血中総コレステロールに顕著な変化が存在しないにもかかわらず生じた。D−4Fを投与されたマウスではHDL−コレステロールレベルはわずかに高くなったが、この相違は統計的な有意差に達しなかった。本明細書に提示した実験は、D−アミノ酸で合成したアポA−I摸倣体ペプチドの経口投与は、アテローム性硬化症および他の酸化脂質によって惹起される慢性炎症性疾患の予防および治療に有用であろうということを示唆している。
Claims (71)
- アテローム性動脈硬化症の症状を改善するペプチドであって、前記ペプチドが、配列番号2乃至4および6乃至85から選択される配列を含み、少なくとも1つの“D”アミノ酸残基を含み、酸化物質による酸化からリン脂質を保護する、
前記アテローム性動脈硬化症の症状を改善するペプチド。 - 前記ペプチドがさらに保護基を含む請求項1に記載のペプチド。
- 前記ペプチドがさらにアミノ末端またはカルボキシル末端に結合した保護基を含む請求項1に記載のペプチド。
- 前記保護基が、
アセチル、アミド、3から20個の炭素のアルキル基、Fmoc、t−boc、9−フルオレンアセチル基、1−フルオレンカルボン酸基、9−フルオレンカルボン酸基、9−フルオレノン−1−カルボン酸基、ベンジルオキシカルボニル、キサンチル(Xan)、トリチル(Trt)、4−メチルトリチル(Mtt)、4−メトキシトリチル(Mmt)、4−メトキシ2,3,6−トリメチル−ベンゼンスルホニル(Mtr)、メシチレン−2−スルホニル(Mts),4,4=−ジメトキシベンゾヒドリル(Mbh)、トシル(Tos)、2,2,5,7,8−ペンタメチルクロマン−6−スルホニル(Pmc)、4−メチルベンジル(MeBzl)、4−メトキシベンジル(MeOBzl)、ベンジルオキシ(BzlO)、ベンジル(Bzl)、ベンゾイル(Bz)、3−ニトロ−2−ピリジンスルフェニル(Npys)、1−(4,4−ジメンチル−2,6−ジアキソシクロヘキシリデン)エチル(Dde)、2,6−ジクロロベンジル(2,6−DiCl−Bzl)、2−クロロベンジルオキシカルボニル(2−Cl−Z)、2−ブロモベンジルオキシカルボニル(2−Br−Z)、ベンジルオキシメチル(Bom)、t−ブトキシカルボニル(Boc)、シクロヘキシルオキシ(cHxO)、t−ブトキシメチル(Bum)、t−ブトキシ(tBuO)、t−ブチル(tBu)、アセチル(Ac)、ベンゾイル基、カルボベンゾキシ基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基およびトリフルオロアセチル(TFA)
から成る群から選択される保護基である請求項2に記載のペプチド。 - 前記ペプチドがさらに、前記アミノ末端に結合した第一の保護基および前記カルボキシル末端に結合した第二の保護基を含む請求項1に記載のペプチド。
- 全鏡像異性アミノ酸が“D”アミノ酸である請求項1に記載のペプチド。
- 前記ペプチドが、ヒトまたはマウスのアポA−Iと約50%を越えるアミノ酸配列同一性を有する請求項1に記載のペプチド。
- 前記ペプチドが薬理学的に許容できる賦形剤と混合される請求項1に記載のペプチド。
- 前記ペプチドが、哺乳類への経口投与に適した薬理学的に許容できる賦形剤と混合される請求項1に記載のペプチド。
- 前記ペプチドがそのアミノ末端に結合した保護基を含み、さらに前記アミノ末端の保護基が、ベンゾイル基、アセチル、プリペオニル、カルボベンゾキシ、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシルおよび3から20個の炭素のアルキルから成る群から選択される保護基である請求項3に記載のペプチド。
- 前記ペプチドがそのカルボキシル末端に結合した保護基を含み、さらに前記カルボキシル末端の保護基がアミドである請求項3に記載のペプチド。
- 前記ペプチドがさらに、前記アミノ末端に結合した第一の保護基および前記カルボキシル末端に結合した第二の保護基を含み、前記第一の保護基が、ベンゾイル基、アセチル、プリペオニル、カルボベンゾキシ、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシルおよび3から20個の炭素のアルキルから成る群から選択される保護基であり、前記第二の保護基がアミドである請求項5に記載のペプチド。
- 全鏡像異性アミノ酸が“D”アミノ酸である請求項3に記載のペプチド。
- 前記酸化物質が、過酸化水素、13(S)−HPODE、15(S)−HPETE、HPODE、HPETE、HODEおよびHETEから成る群から選択される請求項1に記載のペプチド。
- 前記リン脂質が、1−パルミトイル−2−アラキドノイル−sn−グリセロ−3−ホスホリルコリン(PAPC)、1−ステアロイル−2−アラキドノイル−sn−グリセロ−3−ホスホリルコリン(SAPC)、1−ステアロイル−2−アラキドニル−sn−グリセロ−3−ホスホリルエタノールアミン(SAPE)から成る群から選択される請求項1に記載のペプチド。
- アテローム性動脈硬化症の症状を改善する、経口投与に適した組成物であって、前記組成物が、ヒトアポA−IペプチドまたはヒトアポA−Iペプチド類似体であるペプチドを含み、前記ペプチドがアミノ末端に結合した第一の保護基およびカルボキシル末端に結合した第二の保護基を有し、さらに前記ペプチドが複数のDアミノ酸残基を含む、前記経口投与に適した組成物。
- 前記第一の保護基および前記第二の保護基が、それぞれ別個に
アセチル、アミド、3から20個の炭素のアルキル基、Fmoc、t−boc、9−フルオレンアセチル基、1−フルオレンカルボン酸基、9−フルオレンカルボン酸基、9−フルオレノン−1−カルボン酸基、ベンジルオキシカルボニル、キサンチル(Xan)、トリチル(Trt)、4−メチルトリチル(Mtt)、4−メトキシトリチル(Mmt)、4−メトキシ2,3,6−トリメチル−ベンゼンスルホニル(Mtr)、メシチレン−2−スルホニル(Mts),4,4=−ジメトキシベンズヒドリル(Mbh)、トシル(Tos)、2,2,5,7,8−ペンタメチルクロマン−6−スルホニル(Pmc)、4−メチルベンジル(MeBzl)、4−メトキシベンジル(MeOBzl)、ベンジルオキシ(BzlO)、ベンジル(Bzl)、ベンゾイル(Bz)、3−ニトロ−2−ピリジンスルフェニル(Npys)、1−(4,4−ジメンチル−2,6−ジアキソシクロヘキシリデン)エチル(Dde)、2,6−ジクロロベンジル(2,6−DiCl−Bzl)、2−クロロベンジルオキシカルボニル(2−Cl−Z)、2−ブロモベンジルオキシカルボニル(2−Br−Z)、ベンジルオキシメチル(Bom)、t−ブトキシカルボニル(Boc)、シクロヘキシルオキシ(cHxO)、t−ブトキシメチル(Bum)、t−ブトキシ(tBuO)、t−ブチル(tBu)、アセチル(Ac)、ベンゾイル基、カルボベンゾキシ基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基およびトリフルオロアセチル(TFA)
から成る群から選択される請求項16に記載の組成物。 - 前記第一の保護基がアセチルである請求項16に記載の組成物。
- 前記第二の保護基がアミドである請求項16に記載の組成物。
- 前記ペプチドを構成する鏡像異性アミノ酸の半分を超えるものがDアミノ酸である請求項16に記載の組成物。
- 前記ペプチドを構成する全ての鏡像異性アミノ酸がDアミノ酸である請求項16に記載の組成物。
- 前記組成物がさらに医薬的に許容できる賦形剤を含む請求項16に記載の組成物。
- 前記賦形剤が経口投与に適した賦形剤である請求項22に記載の組成物。
- 前記賦形剤が注射に適した賦形剤である請求項22に記載の組成物。
- 前記ペプチドが酸化物質による酸化からリン脂質を保護する請求項16に記載の組成物。
- 前記酸化物質が、過酸化水素、13(S)−HPODE、15(S)−HPETE、HPODE、HPETE、HODEおよびHETEから成る群から選択される請求項25に記載の組成物。
- 前記リン脂質が、1−パルミトイル−2−アラキドノイル−sn−グリセロ−3−ホスホリルコリン(PAPC)、1−ステアロイル−2−アラキドノイル−sn−グリセロ−3−ホスホリルコリン(SAPC)、1−ステアロイル−2−アラキドニル−sn−グリセロ−3−ホスホリルエタノールアミン(SAPE)から成る群から選択される請求項25に記載の組成物。
- 哺乳類におけるアテローム性動脈硬化症の症状を改善する薬剤の製造における、
配列番号2乃至4および6乃至85から選択されるアミノ酸配列を含み、
少なくとも1つの“D”アミノ酸残基を含み、
酸化物質による酸化からリン脂質を保護するペプチドまたはペプチドのコンカテマー、の使用。 - 前記薬剤は経口投与される請求項28に記載の使用。
- 前記哺乳類がアテローム性動脈硬化症の1つまたは2つ以上の症状を有すると診断された哺乳類である請求項28に記載の使用。
- 前記生物がアテローム性動脈硬化症のおそれがあると診断された哺乳類である請求項28に記載の使用。
- 前記哺乳類がヒトである請求項28に記載の使用。
- 前記哺乳類がヒト以外の哺乳類である請求項28に記載の使用。
- 前記ペプチドがさらにアミノ末端またはカルボキシ末端に結合した保護基を含む請求項28に記載の使用。
- 前記保護基が、
アセチル、アミド、3から20個の炭素のアルキル基、Fmoc、t−boc、9−フルオレンアセチル基、1−フルオレンカルボン酸基、9−フルオレンカルボン酸基、9−フルオレノン−1−カルボン酸基、ベンジルオキシカルボニル、キサンチル(Xan)、トリチル(Trt)、4−メチルトリチル(Mtt)、4−メトキシトリチル(Mmt)、4−メトキシ2,3,6−トリメチル−ベンゼンスルホニル(Mtr)、メシチレン−2−スルホニル(Mts),4,4=−ジメトキシベンゾヒドリル(Mbh)、トシル(Tos)、2,2,5,7,8−ペンタメチルクロマン−6−スルホニル(Pmc)、4−メチルベンジル(MeBzl)、4−メトキシベンジル(MeOBzl)、ベンジルオキシ(BzlO)、ベンジル(Bzl)、ベンゾイル(Bz)、3−ニトロ−2−ピリジンスルフェニル(Npys)、1−(4,4−ジメンチル−2,6−ジアキソシクロヘキシリデン)エチル(Dde)、2,6−ジクロロベンジル(2,6−DiCl−Bzl)、2−クロロベンジルオキシカルボニル(2−Cl−Z)、2−ブロモベンジルオキシカルボニル(2−Br−Z)、ベンジルオキシメチル(Bom)、t−ブトキシカルボニル(Boc)、シクロヘキシルオキシ(cHxO)、t−ブトキシメチル(Bum)、t−ブトキシ(tBuO)、t−ブチル(tBu)、アセチル(Ac)、ベンゾイル基、カルボベンゾキシ基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基およびトリフルオロアセチル(TFA)
から成る群から選択される保護基である請求項34に記載の使用。 - 前記ペプチドがさらに、前記アミノ末端に結合した第一の保護基および前記カルボキシル末端に結合した第二の保護基を含む請求項28に記載の使用。
- 前記ペプチドが、ヒトまたはマウスのアポA−Iと約50%を越えるアミノ酸配列同一性を有する請求項28に記載の使用。
- 前記ペプチドが薬理学的賦形剤と混合される請求項28に記載の使用。
- 前記ペプチドが、哺乳類への経口投与に適した薬理学的賦形剤と混合される請求項28に記載の使用。
- 前記ペプチドを構成する全鏡像異性アミノ酸が“D”アミノ酸である請求項28に記載の使用。
- 前記保護基が、アセチル、CH3(CH2)n−CO−(式中nは1から20の範囲である)およびアミドから成る群から選択される保護基である請求項34の使用。
- 前記酸化物質が、過酸化水素、13(S)−HPODE、15(S)−HPETE、HPODE、HPETE、HODEおよびHETEから成る群から選択される請求項28に記載の使用。
- 前記リン脂質が、1−パルミトイル−2−アラキドノイル−sn−グリセロ−3−ホスホリルコリン(PAPC)、1−ステアロイル−2−アラキドノイル−sn−グリセロ−3−ホスホリルコリン(SAPC)、1−ステアロイル−2−アラキドニル−sn−グリセロ−3−ホスホリルエタノールアミン(SAPE)から成る群から選択される請求項28に記載の使用。
- アテローム性動脈硬化症の症状を改善する薬剤の製造における、ヒトアポA−IペプチドまたはヒトアポA−Iペプチド類似体であるペプチドを含む組成物の使用であって、前記ペプチドがアミノ末端に結合した第一の保護基およびカルボキシル末端に結合した第二の保護基を有し、さらに前記ペプチドが複数のDアミノ酸残基を含む、前記使用。
- アテローム性動脈硬化症の症状を改善するキットであって、前記キットが、
配列番号2乃至4および6乃至85から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドであって、少なくとも1つの“D”アミノ酸残基を含み、酸化物質による酸化からリン脂質を保護するペプチド、
を収納した容器を含む、前記アテローム性動脈硬化症の症状を改善するキット。 - 前記ペプチドを構成する全鏡像異性アミノ酸が“D”アミノ酸である請求項45に記載のキット。
- 前記ペプチドが医薬的に許容できる賦形剤と個別投薬形態において組み合わされている請求項45に記載のキット。
- 前記個別投薬形態が経口投与用である請求項47のキット。
- さらに、アテローム性動脈硬化症の1つまたは2つ以上の症状を改善するために前記ペプチドの使用を説明する指示物を含む請求項45に記載のキット。
- アテローム性動脈硬化症の症状を改善するキットであって、前記キットが、アテローム性動脈硬化症の症状を改善する経口投与に適した組成物を収納する容器を含み、前記組成物が、ヒトアポA−IペプチドまたはヒトアポA−Iペプチド類似体であるペプチドを含み、前記ペプチドがアミノ末端に結合した第一の保護基およびカルボキシル末端に結合した第二の保護基を有し、さらに前記ペプチドが複数のDアミノ酸残基を含む、前記アテローム性動脈硬化症の症状を改善するキット。
- 前記ペプチドが医薬的に許容できる賦形剤と個別投薬形態で結合されてある請求項50に記載のキット。
- さらに、アテローム性動脈硬化症の1つまたは2つ以上の症状を改善するために前記ペプチドの使用を説明する指示物を含む請求項50に記載のキット。
- 炎症に対する急性期反応に付随する冠状動脈合併症を哺乳類で改善または防止する薬剤の製造における、請求項1から15のいずれかの項に記載のポリペプチドの使用であって、前記冠状動脈合併症がアテローム性動脈硬化症の症状である、前記使用。
- 前記薬剤の投与が、経口投与、経鼻投与、直腸投与、腹腔内注射、および静脈内注射、皮下注射、経皮投与および筋肉内注射から成る群から選択されるルートで実施される請求項53に記載の使用。
- 前記ポリペプチドが全てL型の同じポリペプチドと組み合わせて投与される請求項53に記載の使用。
- 前記ポリペプチドが、医薬的に許容できる賦形剤中の個別投薬形態として提供される請求項53に記載の使用。
- 前記急性期反応が、再発性炎症反応疾患に付随する炎症反応である請求項53に記載の使用。
- 前記急性期反応が、らい、結核、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ性多発性筋痛、結節性多発性動脈炎、強皮症、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、アルツハイマー病およびエイズ、冠状動脈石灰沈着、石灰沈着大動脈狭窄、骨粗しょう症、および慢性関節リウマチから成る群から選択される疾患に付随する請求項54に記載の使用。
- 前記急性期反応が、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、または器官移植、創傷、移植人工器官、寄生虫感染、敗血症、内毒素ショック症候群およびバイオフィルム形成から成る群から選択される状況に付随する炎症性反応である請求項53に記載の使用。
- 前記生物がアテローム性動脈硬化症の1つまたは2つ以上の症状を有すると診断された生物である請求項53に記載の使用。
- 前記生物がアテローム性動脈硬化症のおそれがあると診断された生物である請求項53に記載の使用。
- 前記生物がヒトである請求項53に記載の使用。
- 前記生物がヒト以外の哺乳類である請求項53に記載の使用。
- 前記第一の保護基および前記第二の保護基が、それぞれ別個に、アセチル、CH3(CH2)n−CO−(式中nは3から20の範囲である)およびアミドから成る群から選択される請求項53の使用。
- 前記第一の保護基がアセチルである請求項53に記載の使用。
- 前記第二の保護基がアミドである請求項53に記載の使用。
- 前記組成物がさらに医薬的に許容できる賦形剤を含む請求項53に記載の使用。
- 前記賦形剤が経口投与に適した賦形剤である請求項67に記載の使用。
- 前記ペプチドが酸化物質による酸化からリン脂質を保護する請求項53に記載の使用。
- 前記酸化物質が、過酸化水素、13(S)−HPODE、15(S)−HPETE、HPODE、HPETE、HODEおよびHETEから成る群から選択される請求項69に記載の使用。
- 前記リン脂質が、1−パルミトイル−2−アラキドノイル−sn−グリセロ−3−ホスホリルコリン(PAPC)、1−ステアロイル−2−アラキドノイル−sn−グリセロ−3−ホスホリルコリン(SAPC)、1−ステアロイル−2−アラキドニル−sn−グリセロ−3−ホスホリルエタノールアミン(SAPE)から成る群から選択される請求項69に記載の使用。
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