JP6159029B2 - オーロラａキナーゼ阻害剤 - Google Patents

Description

本発明は、オーロラＡを阻害し、がんを治療するのに有用であり得る、アミノピリジン化合物、またはその薬学的に許容可能な塩に関する。

オーロラキナーゼは、セリン／トレオニンキナーゼのファミリーであり、有糸分裂の重要な調節因子である。オーロラキナーゼＡ、ＢおよびＣの３種のヒト相同体が存在し、そのうちオーロラＡは、多様な組織学的起源のがんに関与しており、過剰発現した場合、発がん性を有する場合がある。

異数性またはゲノムの不安定性は、がんの最も普及している特徴のうちの１つである。より具体的には、オーロラＢ阻害により誘導される核内倍加およびその後の倍数性がゲノムの不安定性についての主要経路のうちの１つである。さらに、ＤＮＡ核内倍加／倍数性表現型は、がん細胞を完全に死滅させずに複数の細胞分裂を持続し得る。あるいは、オーロラＡ選択的阻害は多くのがん細胞において有糸分裂停止をもたらす。有糸分裂停止はしばしばがん細胞アポトーシスまたは死にさらにつながり、これは、オーロラＢまたはオーロラＡ／Ｂ二重阻害剤によるＤＮＡ核内倍加／倍数性よりがんの医薬にとって非常に望ましい特質である。

さらに、臨床開発における特定のオーロラＢ阻害剤およびオーロラＡ／Ｂ二重阻害剤が患者において好中球および骨髄細胞毒性を提示すると報告されているが、臨床開発において特定の比較的選択的なオーロラＡ阻害剤はこれらの傷害を示さなかった。従って、オーロラＡを選択的に阻害し、オーロラＢまたはオーロラＡ／Ｂ二重阻害を低減または回避することが望ましい。このように、選択的オーロラＡ阻害はがん療法に有用であり得る。

オーロラＡ阻害剤は当該分野において公知である。国際公開第２００８／０２６７６８号、欧州特許第２０６２８８７号および国際公開第２００９／１０４８０２号は、オーロラＡ選択的阻害活性を有する特定のアミノピリジン化合物を開示している。国際公開第２０１３／１２９４４３号は、オーロラＡ選択的阻害活性を有する特定のピペリジン化合物を開示している。

がんを治療するための代替のオーロラＡ阻害剤を提供する必要性が存在したままである。また、オーロラＢまたはオーロラＡ／Ｂ二重阻害を低減させるか、または回避する選択的オーロラＡ阻害剤を提供する必要性が存在したままである。従って、本発明は、がんを治療するのに有用であり得るオーロラＡの特定の阻害剤を提供する。さらに、本発明はオーロラＢまたはオーロラＡ／Ｂ二重阻害を低減させ得る特定の選択的オーロラＡ阻害剤を提供する。

本発明は、１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−４−［［３−フルオロ−６−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−２−ピリジル］メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボン酸：

またはその薬学的に許容可能な塩である化合物を提供する。

好ましくは、本発明は、（２Ｓ，４Ｓ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−４−［［３−フルオロ−６−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−２−ピリジル］メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボン酸：

および
（２Ｒ，４Ｒ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−４−［［３−フルオロ−６−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−２−ピリジル］メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボン酸：

またはこれらの薬学的に許容可能な塩からなる群から選択される化合物を提供する。

より好ましくは、本発明は、（２Ｒ，４Ｒ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−４−［［３−フルオロ−６−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−２−ピリジル］メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボン酸：

またはその薬学的に許容可能な塩である化合物を提供する。

特定の実施形態として、本発明は、（２Ｒ，４Ｒ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−４−［［３−フルオロ−６−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−２−ピリジル］メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボン酸である化合物を提供する。

特定の実施形態として、本発明はまた、（２Ｓ，４Ｓ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−４−［［３−フルオロ−６−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−２−ピリジル］メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボン酸である化合物を提供する。

本発明は、（２Ｒ，４Ｒ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−４−［［３−フルオロ−６−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−２−ピリジル］メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボン酸またはその薬学的に許容可能な塩と、薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。本発明は、（２Ｒ，４Ｒ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−４−［［３−フルオロ−６−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−２−ピリジル］メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボン酸と、薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。

本発明は、有効量の（２Ｒ，４Ｒ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−４−［［３−フルオロ−６−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−２−ピリジル］メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボン酸、またはその薬学的に許容可能な塩を、それを必要とする患者に投与することを含む、がんを治療する方法を提供する。本発明は、有効量の（２Ｒ，４Ｒ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−４−［［３−フルオロ−６−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−２−ピリジル］メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボン酸を、それを必要とする患者に投与することを含む、がんを治療する方法を提供する。

本発明は、療法における使用のための、（２Ｒ，４Ｒ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−４−［［３−フルオロ−６−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−２−ピリジル］メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボン酸またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。本発明は、がんの治療における使用のための（２Ｒ，４Ｒ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−４−［［３−フルオロ−６−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−２−ピリジル］メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボン酸、またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。本発明は、がんの治療における使用のための医薬組成物であって、（２Ｒ，４Ｒ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−４−［［３−フルオロ−６−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−２−ピリジル］メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボン酸またはその薬学的に許容可能な塩を含む、医薬組成物を提供する。本発明は、がんの治療における使用のための医薬組成物であって、（２Ｒ，４Ｒ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−４−［［３−フルオロ−６−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−２−ピリジル］メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボン酸を含む、医薬組成物を提供する。

本発明はまた、療法における使用のための（２Ｒ，４Ｒ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−４−［［３−フルオロ−６−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−２−ピリジル］メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボン酸も提供する。本発明は、がんの治療における使用のための（２Ｒ，４Ｒ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−４−［［３−フルオロ−６−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−２−ピリジル］メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボン酸を提供する。

本発明は、がんを治療するための医薬の製造における（２Ｒ，４Ｒ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−４−［［３−フルオロ−６−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−２−ピリジル］メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボン酸またはその薬学的に許容可能な塩の使用を提供する。本発明はまた、がんを治療するための医薬の製造における（２Ｒ，４Ｒ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−４−［［３−フルオロ−６−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−２−ピリジル］メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボン酸の使用を提供する。

本発明は、結晶形の（２Ｒ，４Ｒ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−４−［［３−フルオロ−６−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−２−ピリジル］メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボン酸のｔｅｒｔ−ブチルアミン塩を提供する。本発明はまた、１１．５°、２３．２°および１５．０°からなる群から選択されるピークのうちの１つ以上と組み合わせて１７．０°において生じる、２θ±０．２°において、特徴的なピークを有する粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる結晶形の（２Ｒ，４Ｒ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−４−［［３−フルオロ−６−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−２−ピリジル］メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボン酸のｔｅｒｔ−ブチルアミン塩を提供する。

本発明は、結晶形の（２Ｒ，４Ｒ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−４−［［３−フルオロ−６−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−２−ピリジル］メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボン酸のアンモニウム塩を提供する。本発明はまた、１３．８°、１７．２°および１５．９°からなる群から選択されるピークのうちの１つ以上と組み合わせて４．６°において生じる、２θ±０．２°において、特徴的なピークを有する、粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる結晶形の（２Ｒ，４Ｒ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−４−［［３−フルオロ−６−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−２−ピリジル］メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボン酸のアンモニウム塩も提供する。

さらに、本発明は、がんが、小細胞肺がん、大腸がん、胃がん、前立腺がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、子宮頸がん、頭頸部がん、食道がん、卵巣がん、非小細胞肺がん、および非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される、本明細書に記載される方法および使用の好ましい実施形態を提供する。好ましいがんは、小細胞肺がん、前立腺がん、トリプルネガティブ乳がん、子宮頸がんおよび頭頸部がんである。

本発明はまた、がんの治療における１種以上の化学療法剤と組み合わせた同時、個別または連続投与における使用のための（２Ｒ，４Ｒ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−４−［［３−フルオロ−６−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−２−ピリジル］メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボン酸またはその薬学的に許容可能な塩も提供する。

上記および本発明の説明全体を通して使用される場合、以下の用語は、他に示されない限り、以下の意味を有すると理解される：

「薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤」は、哺乳動物、例えばヒトへの生物学的に活性な薬剤の送達のために一般に当該分野において許容される媒体である。

「薬学的に許容可能な塩（複数または単数）」とは、本発明の化合物の比較的無毒性の無機および有機塩（単数または複数）を指す。

「有効量」とは、研究者、獣医、医師または他の臨床医が求める組織、系、動物、哺乳動物またはヒトの生物学的もしくは医学的反応またはそれらに対する所望の治療効果を引き起こす、本発明の化合物もしくはその薬学的に許容可能な塩の量、または本発明の化合物もしくはその薬学的に許容可能な塩を含有する医薬組成物を意味する。

「治療」、「治療する」、「治療している」などという用語は、傷害の進行を遅延または反転させることを含むことを意味する。これらの用語はまた、たとえ傷害または状態が実際に排除されないとしても、また、傷害または状態の進行がそれ自体、遅延または反転していないとしても、傷害または状態の１つ以上の症状を軽減、改善、減衰、排除または低減させることを含む。

本発明の化合物は、例えば、多くの無機および有機酸および塩基と反応して、薬学的に許容可能な塩を形成できる。このような薬学的に許容可能な塩およびそれらを調製するための一般的な方法は当該分野において周知である。例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌら、ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＡＬＴＳ：ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，ＳＥＬＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＵＳＥ、（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、２００２）；Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅら、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｖｏｌ ６６、Ｎｏ．１、１９７７年１月を参照のこと。

本発明の化合物は、好ましくは、薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を使用して医薬組成物として製剤化され、様々な経路によって投与される。好ましくは、このような組成物は経口投与用である。このような医薬組成物およびそれらを調製するためのプロセスは当該分野において周知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏら、ｅｄｓ．、２１ｓｔ ｅｄ．、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、２００５）を参照のこと。

実際に投与される本発明の化合物の量は、治療される状態、選択される投与経路、投与される本発明の実際の化合物、個々の患者の年齢、体重および反応、ならびに患者の症状の重症度を含む、関連状況下で医師によって決定される。１日当たりの投薬量は、通常、約１〜約１０００ｍｇの範囲内である。一部の場合、上述の範囲の下限値未満の投薬レベルが十分であってもよく、一方、他の場合、さらにより多くの用量が利用されてもよい。投薬レベルは当業者によって決定され得る。

本発明の化合物またはその薬学的に許容可能な塩は、当該分野において公知の様々な手順ならびに以下の調製例および実施例に記載されるものによって調製され得る。記載される経路の各々についての特定の合成工程は、本発明の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を調製する異なる手段で組み合わされてもよい。

試薬および出発物質は一般に当業者にとって容易に入手可能である。その他は、有機および複素環化学の標準的な技術、当業者に公知である技術、および以下の任意の新規手順を含む実施例に記載される手順によって作製され得る。以下の調製例および実施例はさらに本発明を例示する。反対に示されない限り、本明細書に例示される化合物は、Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｄｒａｗ ４．１を使用して命名され、番号付けされる。

個々の異性体、鏡像異性体またはジアステレオマーは、選択的結晶化技術またはキラルクロマトグラフィーなどの方法によって化合物の合成における任意の都合のよい点で当業者によって分離または分割され得る（例えば、Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，Ｒａｃｅｍａｔｅｓ，ａｎｄ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｊ．Ｊａｃｑｕｅｓら、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９８１）を参照のこと）。

当業者は、本発明の化合物が少なくとも１つのキラル中心を含有することを理解するであろう。より具体的には、本発明の化合物は２つのキラル中心を含有する。本発明は、ラセミ体を含む前記化合物の全ての個々の鏡像異性体またはジアステレオマーおよび鏡像異性体とジアステレオマーの混合物を意図する。本発明の化合物は単一の鏡像異性体またはジアステレオマーとして存在することが好ましい。単一の鏡像異性体またはジアステレオマーは、キラル試薬から開始して、または立体選択的もしくは立体特異的合成技術によって調製され得る。あるいは、単一の鏡像異性体またはジアステレオマーは、標準的なキラルクロマトグラフまたは結晶化技術によって混合物から単離され得る。

また、ピラゾリル環を有する化合物が、水素がピラゾリル環上の２つの窒素間で移動できる互変異性体の対として存在し得ることは当業者に公知である。

本発明の化合物は、当該分野において周知で、理解されている合成方法に従って調製され得る。これらの反応の工程のための適切な反応条件は当該分野において周知であり、溶媒および共試薬の適切な置換は当業者の範囲内である。同様に、合成中間体は、必要または所望される場合、様々な周知の技術によって単離および／または精製され得、頻繁に、ほとんどまたは全く精製せずに後の合成工程において直接様々な中間体を使用することができることは当業者によって理解されるであろう。さらに、当業者は、一部の状況において、部分が導入される順序は重要ではないことを理解するであろう。本発明の化合物を生成するのに必要とされる工程の特定の順序は、熟練した化学者によって十分に理解されているように、合成される特定の化合物、出発化合物、および置換部分の相対的傾向に応じる。他に示されない限り、全ての置換基は以前に定義されている通りであり、全ての試薬は当該分野において周知であり、理解されている。

本明細書に使用される場合、以下の用語は示される意味を有する：「ＡＤＰ」はアデノシン５’−二リン酸を指し、「ＡＴＰ」はアデノシン５’−三リン酸を指し、「ＢＳＡ」はウシ血清アルブミンを指し、「ＤＮＡ」はデオキシリボ核酸を指し、「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドを指し、「ＤＴＴ」はジチオスレイトールを指し、「ＥＤＴＡ」はエチレンジアミン四酢酸を指し、「ＥＧＴＡ」はエチレングリコール四酢酸を指し、「ＦＢＳ」はウシ胎仔血清を指し、「ＩＶＴＩ」はインビボ標的阻害を指し、「ＨＥＰＥＳ」は４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸を指し、「ＭＥＭ」は最小必須培地を指し、「ＭＳ」は質量分析を指し、「ＮＭＲ」は核磁気共鳴を指し、「ＰＢＳ」はリン酸緩衝生理食塩水を指し、「ＭＳＲ」は最小有意比を指し、「ＰＭＳＦ」はフェニルメチルスルホニルフルオリドを指し、「ＰＮＰＰ」は４−ニトロフェニルホスフェート二ナトリウム塩六水和物を指し、「ｐｓｉ」はポンド／平方インチを指し、「ＳＣＬＣ」は小細胞肺がんを指す。「ＴＡＭＥ」はＮα−４−トシル−Ｌ−アルギニンメチルエステル塩酸塩を指し、「ＴＥＤ」は閾値有効量を指し、「ＴＰＣＫ」はトシルフェニルアラニルクロロメチルケトンを指す。

調製例１
メチル２−メチルピペリジン−４−カルボキシレート塩酸塩

ＰｔＯ_２（１１．５ｇ）を反応容器に入れる。次いで容器をＮ_２でパージし、酢酸（２２５ｍｌ）で湿らす。メチル２−クロロ−６−メチル−ピリジン−４−カルボキシレート（１２５ｇ）および酢酸（１０００ｍｌ）をスラリーに加える。反応容器を密閉し、それをＮ_２でパージし、次いでそれをＨ_２でパージし、Ｈ_２で加圧する。反応混合物を６０ｐｓｉの水素下で６０℃にて７時間加熱する。同じスケールおよび同じ条件下で２つの別個の反応を実施する。各反応の反応混合物を濾過し、濾液を合わせる。濾液を真空下で濃縮していくらかの酢酸を含有する厚い油を得る。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（２Ｌ）を厚い油に加え、室温にて撹拌する。得られた固体を回収し、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（２×１０００ｍＬ）で洗浄し、３５℃にて真空下で乾燥させて白色固体（４００ｇ）として標題化合物を得る。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ１．５５（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ）；１．８５（ｑ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ，１Ｈ）；２．２３−１．９８（ｍ，３Ｈ）；２．５９−２．４６（ｍ，１Ｈ）；２．８５（ｄｔ，Ｊ＝１３．０，３．５Ｈｚ，１Ｈ）；３．２０−３．０６（ｍ，１Ｈ）；３．５３（ｂｒｄ，Ｊ＝１２．６Ｈｚ，１Ｈ）；３．６９（ｓ，３Ｈ）；９．７（ｂｒｓ，１Ｈ）

調製例２
メチル１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボキシレート

メチル２−メチルピペリジン−４−カルボキシレート塩酸塩（２０５．４ｇ、１．０６ｍｏｌ）、１−（ブロモメチル）−３−クロロ−２−フルオロ−ベンゼン（２６１ｇ、１．１７ｍｏｌ）、アセトニトリル（２０５０ｍＬ）および炭酸カリウム（２９３ｇ、２．１２ｍｏｌ）を、３つ口丸底フラスコ（１Ｌ）に加える。反応混合物を還流にて１８時間撹拌する。次いで加熱を停止し、固体を濾過し、次いで固体をアセトニトリル（２×２５０ｍＬ）ですすぐ。濾液を真空下で濃縮して緑色の粗生成物を得る。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（２５００ｍｌ）に溶解し、ＣＥＬＩＴＥ（登録商標）を加え、撹拌し、次いで濾過する。濾液を水で洗浄する。有機物を１．２５Ｎ塩酸水溶液（２０００ｍｌ）、次いで１Ｍ塩酸水溶液（１０００ｍｌ）で抽出する。水性抽出物を合わせ、４８％水酸化ナトリウム水溶液（２５０ｇ）でｐＨを約１２に塩基性にする。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（３Ｌ）で抽出する。有機物を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濃縮して、茶色の油（２７２．８ｇ）として標題化合物を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３００（Ｍ＋１）。

調製例３
メチル（２Ｒ，４Ｒ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボキシレート

超臨界流体キラルクロマトグラフィーを使用してメチル１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボキシレート（２７２．８ｇ）の鏡像異性体を分離する。固定相：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＩＣ、移動相：３％イソプロピルアルコールおよび０．２％ジメチルエチルアミン。第１の溶出された鏡像異性体（Ｒ_Ｔ＝１．７３分）を回収する。標題化合物（１５８ｇ、４９．７％収率；Ｒ_Ｔ＝２．１９分；ＭＳ（ｍ／ｚ）：３００（Ｍ＋１））として第２の溶出された鏡像異性体を回収する。分析条件：固定相：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＩＣ、移動相：５％イソプロピルアルコール／０．２％イソプロピルアミン、流速３ｍＬ／分、温度：３５℃。

調製例４
メチル（２Ｒ，４Ｒ）−２−メチルピペリジン−４−カルボキシレート塩酸塩

メチル（２Ｒ，４Ｒ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボキシレート（２５０ｇ、０．８３４ｍｏｌ）、１，２−ジクロロエタン（１２００ｍｌ）および１−クロロエチルクロロホルメート（１１２ｍｌ、１．０４ｍｏｌ）を４０００ｍｌの３つ口フラスコに加える。機械的撹拌器により７０℃にて７２時間撹拌する。１−クロロエチルクロロホルメート（３０ｍｌ、０．２２７ｍｏｌ）を加え、還流にて６時間撹拌する。混合物を６０℃に冷却し、添加漏斗を介して３０〜４５分にわたってメタノール（２５０ｍｌ）を加える。６０〜６５℃にて１８時間撹拌する。メタノール（４００ｍｌ）を加え、６５〜６８℃にて５時間撹拌する。混合物を周囲温度に冷却し、一晩撹拌する。真空下で濃縮してスラリーにする。スラリーを酢酸エチル（１５００ｍｌ）で希釈し、０℃で３０分間撹拌する。固体を収集し、酢酸エチル（１０００ｍｌ）で洗浄して、灰色の固体（１３６．５ｇ、８４．５％収率）として標題化合物を得る。Ｈ^１ ＮＭＲ（３９９．８１ＭＨｚ，ｄ_６−ＤＭＳＯ）：δ１．２２（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ），１．５３−１．４３（ｍ，１Ｈ），１．７３−１．６２（ｍ，１Ｈ），１．９９−１．９１（ｍ，２Ｈ），２．７１−２．６３（ｍ，１Ｈ），２．８９−２．８３（ｍ，１Ｈ），３．１５−３．１２（ｍ，１Ｈ），３．２３−３．２０（ｍ，１Ｈ），３．５９（ｓ，３Ｈ），９．０３（ｂｒ，ｓ，１Ｈ），９．４４（ｂｒ，ｓ，１Ｈ）。

調製例５
Ｏ１−ｔｅｒｔ−ブチルＯ４−メチル（２Ｒ，４Ｒ）−２−メチルピペリジン−１，４−ジカルボキシレート

メチル（２Ｒ，４Ｒ）−２−メチルピペリジン−４−カルボキシレート塩酸塩（１３６ｇ、０．７０２ｍｏｌ）およびジクロロメタン（１５００ｍｌ）を、オーバーヘッド撹拌器を備えた４Ｌの３つ口丸底フラスコに加える。ジイソプロピルエチルアミン（２５０ｍｌ）を加え、室温にて数分間撹拌する。４−ピリジンアミン−Ｎ，Ｎ−ジメチル（９．０ｇ、０．７４ｍｏｌ）を加える。氷／水浴中で冷却する。５〜１０℃に温度を維持しながら、約３０分にわたってジクロロメタン（３００ｍｌ）中のジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネート（１９２ｇ、０．８８ｍｏｌ）の溶液をゆっくり加える。混合物を室温に加温し、一晩撹拌する。１０％シュウ酸溶液（２Ｌ）を加え、室温にて４５分間撹拌する。層を分離する。有機物を５％シュウ酸（１Ｌ）で洗浄する。有機物を水、次いで飽和ＮａＣｌで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮する。ジクロロメタン（２５０ｍｌ）中に溶解する。ジクロロメタンで湿らせたシリカプラグ（２５０ｇ）に適用する。ジクロロメタン（３Ｌ）で溶出する。真空下で濾液を濃縮し、数時間真空下に保持して標題化合物（１４６ｇ、８０．８％収率）を淡黄色の油として得る。Ｈ^１ ＮＭＲ（３９９．８０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ１．０５（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），１．４２（ｓ，９Ｈ），１．７６−１．６６（ｍ，１Ｈ），１．９９−１．９４（ｍ，３Ｈ），２．５５（ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ），３．１０−３．０２（ｍ，１Ｈ），３．６７（ｓ，３Ｈ），３．８５−３．７８（ｍ，１Ｈ），４．１８−４．１０（ｍ，１Ｈ）。

調製例６
６−ブロモ−２−（ブロモメチル）−３−フルオロ−ピリジン

６−ブロモ−３−フルオロ−２−メチル−ピリジン（５０ｇ、０．２６３ｍｏｌ）、Ｎ−ブロモスクシンイミド（１００ｇ、０．５６２ｍｏｌ）および四塩化炭素（５００ｍｌ）を、還流冷却器および窒素入口を備えた１０００ｍｌの３つ口丸底フラスコに加える。室温にて撹拌しながら、２，２’−アゾビス（イソブチロニトリル）を少しずつ加える。反応物を７８℃にて７２時間撹拌する。混合物を室温に冷却し、固体を濾過する。固体をトルエン（２×１００ｍｌ）で洗浄する。濾液を約２５０ｍｌに濃縮し、テトラヒドロフラン（３００ｍｌ）で希釈し、０〜５℃に冷却する。窒素雰囲気下で、テトラヒドロフラン（１００ｍｌ）中の亜リン酸ジエチル（３７ｍｌ、０．２８８ｍｏｌ）およびトリエチルアミン（４０ｍｌ、０．２８７ｍｏｌ）の溶液を３０分にわたってゆっくり加える。混合物を室温で１時間にわたってゆっくり加温する。真空下で濃縮する。氷冷水を加え、混合物が室温になるまで撹拌する。固体を回収し、水（２×２００ｍｌ）で洗浄する。固体を真空下で乾燥させる。ジクロロメタン（５００ｍｌ）に溶解し、シリカのプラグで濾過する。プラグをジクロロメタン（２５０ｍｌ）ですすぐ。濾液を真空下で濃縮し、ヘキサン（５００ｍｌ）で希釈し、真空下で約１００ｍｌに濃縮する。固体を回収し、ヘキサン（１００ｍｌ）で洗浄して、標題化合物（４８．０ｇ、６７．８％収率）を白色固体として得る。固体を母液から回収し、真空下で乾燥させて、白色固体として標題化合物（５．２ｇ、７．３５％収率）を得る。Ｈ^１ ＮＭＲ（３９９．８０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ４．５１（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，２Ｈ），７．３１−７．２５（ｍ，１Ｈ），７．４２（ｄｄ，Ｊ＝３．５，８．６Ｈｚ，１Ｈ）。

調製例７
Ｏ１−ｔｅｒｔ−ブチルＯ４−メチル（２Ｒ，４Ｒ）−４−［（６−ブロモ−３−フルオロ−２−ピリジル）メチル］−２−メチル−ピペリジン−１，４−ジカルボキシレート

テトラヒドロフラン（４７０ｍｌ）中のＯ１−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｏ４−メチル（２Ｒ，４Ｒ）−２−メチルピペリジン−１，４−ジカルボキシレート（４８．１ｇ、０．１８７ｍｏｌ）を、３Ｌの３つ口丸底フラスコに加え、混合物を−７８℃に冷却する。内部温度を−７１℃未満に維持しながら、ヘキサン（１１２．２ｍｌ、０．２２４ｍｏｌ）中のリチウムジイソプロピルアミド（１０％質量）を３０分にわたって滴下して加える。−７８℃にて１．５時間撹拌する。内部温度を−７１℃未満に維持しながら、テトラヒドロフラン（４７０ｍｌ）中の６−ブロモ−２−（ブロモメチル）−３−フルオロ−ピリジン（６０．４ｇ、０．２２５ｍｏｌ）の溶液を１時間にわたって滴下して加える。−７８℃にて１時間撹拌する。飽和塩化アンモニウム水溶液（１５０ｍｌ）を添加することによって反応をクエンチする。得られた固体を収集し、水（５００ｍｌ）に溶解し、酢酸エチル（１０００ｍｌ）で抽出する。抽出物を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮する。この反応を同じ反応条件下で５７．２２ｇのＯ１−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｏ４−メチル（２Ｒ，４Ｒ）−２−メチルピペリジン−１，４−ジカルボキシレートで反復し、精製のために得られた物質を合わせる。合わせた物質をシリカゲルクロマトグラフィー（５〜１５％勾配のヘキサン／酢酸エチル）により精製して、淡黄色の油として標題化合物（１６８．２ｇ）を得る。Ｈ^１ ＮＭＲ（３９９．８０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ０．９８（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ），１．４３（ｓ，９Ｈ），１．７６（ｄｄ，Ｊ＝６．０，１３．８Ｈｚ，１Ｈ），２．０２（ｓ，２Ｈ），２．２３（ｄｔ，Ｊ＝１３．９，２．１Ｈｚ，１Ｈ），３．０９−２．９８（ｍ，３Ｈ），３．７１（ｓ，３Ｈ），３．９０−３．８７（ｍ，１Ｈ），４．４０−４．３７（ｍ，１Ｈ），７．１９（ｔ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．２９（ｄｄ，Ｊ＝３．４，８．６Ｈｚ，１Ｈ）。

調製例８
メチル（２Ｒ，４Ｒ）−４−［（６−ブロモ−３−フルオロ−２−ピリジル）メチル］−１−［（３−クロロ−２−フルオロフェニル）メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボキシレート

１，４−ジオキサン（９４５ｍｌ）中のＯ１−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｏ４−メチル（２Ｒ，４Ｒ）−４−［（６−ブロモ−３−フルオロ−２−ピリジル）メチル］−２−メチル−ピペリジン−１，４−ジカルボキシレート（１６８．２ｇ、０．３７８ｍｏｌ）を、４Ｌの３つ口丸底フラスコに加える。塩酸（４７５ｍＬの１，４−ジオキサン中に４Ｍ、１．９ｍｏｌ）を２０分にわたってゆっくり加える。室温にて２１時間、次いで５０℃にて４時間撹拌する。固体を収集し、４５℃にて１時間、真空下で乾燥させる。濾液を固体に濃縮し、完全に乾燥させる。合わせた固体、炭酸カリウム（１０５ｇ、０．７６ｍｏｌ）およびアセトニトリル（１２００ｍｌ）を３Ｌの３つ口丸底フラスコに加える。室温にて２０分間撹拌し、次いで３−クロロ−２−フルオロベンジルブロミド（１０１．３ｇ、０．４５３ｍｏｌ）を加える。室温にて３日間撹拌する。混合物をＣＥＬＩＴＥ（登録商標）で濾過する。濾液を濃縮して黄色の油を得る。油をシリカゲルクロマトグラフィー（７０分にわたってジクロロメタン勾配中の１００％ジクロロメタン〜７％メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル）により精製して、黄色の油として標題化合物（１５３ｇ、０．３１４ｍｏｌ）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４８９（Ｍ＋１）。

調製例９
メチル（２Ｒ，４Ｒ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−４−［（３−フルオロ−６−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−２−ピリジル］メチル］−２−メチルピペリジン−４−カルボキシレート

ｔｅｒｔ−ブチルアルコール（９．４ｍｌ）を電子レンジ用反応容器に加え、５分間、窒素散布により酸素を除去する。酢酸パラジウム（ＩＩ）（０．０４４ｇ、０．１９６ｍｍｏｌ）および２−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィノ−２’，４’，６’−トリイソプロピルビフェニル（ｔｒｉｉｏｓｐｒｏｐｙｌｂｉｐｈｅｎｙｌ）（０．２５１ｇ、０．５８ｍｏｌ）を加える。溶液の表面の下から水（０．０１４ｍｌ）を加える。開始マイクロ波を使用して混合物を１００℃で２分間加熱する。この触媒溶液をシリンジにより以下の混合物に加える。

メチル（２Ｒ，４Ｒ）−４−［（６−ブロモ−３−フルオロ−２−ピリジル）メチル］−１−［（３−クロロ−２−フルオロフェニル）メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボキシレート（９．４ｇ、０．０１９ｍｏｌ）、５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−アミン（２．０７ｇ、０．０２１ｍｏｌ）およびｔｅｒｔ−ブチルアルコール（６５ｍｌ）を、３Ｌの３つ口丸底フラスコに加える。混合物を４０〜４５℃に加熱し、１０分間、窒素を散布する。炭酸セシウム（１４．５ｇ、０．０４５ｍｏｌ）および上記で提供した触媒溶液を混合物に加える。４０〜４５℃にて３．５時間撹拌する。反応は完了しない。酢酸パラジウム（ＩＩ）（０．００８８ｇ、０．０３９ｍｍｏｌ）、２−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィノ−２’，４’，６’−トリイソプロピルビフェニル（０．０５０ｇ、０．１０３ｍｍｏｌ）、水（２．８μＬ）およびｔｅｒｔ−ブチルアルコール（２ｍｌ）のさらなる混合物を調製する。開始マイクロ波を使用してこの混合物を１００℃で２分間加熱し、次いでそれを上記の不完全な反応混合物に加える。反応混合物を４０〜４５℃にて２時間撹拌する。混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ）で希釈し、ＣＥＬＩＴＥ（登録商標）プラグで濾過し、プラグを酢酸エチル（１００ｍＬ）で洗浄する。真空下で濃縮する。反応を上記と同じ反応条件下で１２９．３５ｇのメチル（２Ｒ，４Ｒ）−４−［（６−ブロモ−３−フルオロ−２−ピリジル）メチル］−１−［（３−クロロ−２−フルオロフェニル）メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボキシレートで反復し、精製のために粗物質を合わせる。

２つの粗反応生成物を合わせる。その物質を、１：１のジクロロメタン／ヘキサン中の３０％酢酸エチル〜１００％酢酸エチルのシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、９５ｇのピンク色の固体を得る。固体を、ＳＩＬＩＡＭＥＴＳ（登録商標）チオール（１２０ｇ）およびジクロロメタン（２Ｌ）を有する４Ｌのフラスコに加える。室温にて一晩撹拌する。混合物をＣＥＬＩＴＥ（登録商標）で濾過する。濾液を濃縮乾固して、白色の泡状物として標題化合物（９３．３ｇ）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：５０４（Ｍ＋１）。

実施例１
（２Ｒ，４Ｒ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−４−［［３−フルオロ−６−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−２−ピリジル］メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボン酸

メチル（２Ｒ，４Ｒ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−４−［（３−フルオロ−６−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−２−ピリジル］メチル］−２−メチルピペリジン−４−カルボキシレート（１９．９５ｇ、０．０４０ｍｏｌ）、塩酸（３６．５％質量）および水（１４０ｍｌ、１．６３ｍｏｌ）を、１Ｌの３つ口丸底フラスコに加える。９３〜９６℃にて１７時間撹拌する。室温に冷却し、真空下で濃縮する。残渣を水（１０００ｍｌ）に溶解し、氷浴中で冷却する。５Ｎの水酸化ナトリウムでｐＨを６．５に調整する。得られた固体を収集し、水で洗浄する。水性濾液を１０％イソプロパノール／ジクロロメタン（３×５００ｍｌ）で抽出する。乾燥させ、固体に濃縮する。両方の固体を合わせ、エタノール（２００ｍｌ）に溶解する。酢酸エチル（１５００ｍｌ）で希釈し、室温にて一晩撹拌する。濾過し、真空下で固体に濃縮する。固体を５％メタノール／ジクロロメタンに溶解し、酢酸エチル（５００ｍｌ）で希釈し、３００ｍｌに濃縮する。固体を濾過する。反応を、上記と同じ反応条件下で６１．９ｇのメチル（２Ｒ，４Ｒ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−４−［（３−フルオロ−６−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−２−ピリジル］メチル］−２−メチルピペリジン−４−カルボキシレートで反復する。両方の反応からの濾液を合わせる。合わせた濾液を約６００ｍｌに濃縮し、ヘキサン（６００ｍｌ）で希釈する。固体を収集し、５０℃にて一晩真空下で乾燥させる。母液を真空下で濃縮乾固して、固体を真空下で５０℃にて一晩乾燥させる。固体を合わせて標題化合物（６３．４４ｇ）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４９０（Ｍ＋１）．［α］^２０ _Ｄ＋１７．３°（ｃ１．００，ＥｔＯＨ）。

実施例２
（２Ｒ，４Ｒ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−４−［［３−フルオロ−６−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−２−ピリジル］メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボン酸のｔｅｒｔ−ブチルアミン塩

４ｍＬのアセトン中の（２Ｒ，４Ｒ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−４−［［３−フルオロ−６−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−２−ピリジル］メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボン酸（５８０ｍｇ）を加える。６０℃（プレート温度）／１０００ｒｐｍにて撹拌しながら、固体を溶解して、透明な黄色の溶液を形成させる。ｔｅｒｔ−ブチルアミン（１５０μＬ、１．２０当量、９９．５％）を溶液に加え、沈殿物が観察される。混合物を６０℃にてさらに１０分間スラリーにし、次いでそれを室温に冷却する。固体を真空濾過により濾過し、固体を６０℃にて真空オーブン中で乾燥させて標題化合物（６３５ｍｇ、９５．２６％収率）を得る。

実施例３
（２Ｒ，４Ｒ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−４−［［３−フルオロ−６−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−２−ピリジル］メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボン酸のアンモニウム塩

２ｍＬのアセトン中の（２Ｒ，４Ｒ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−４−［［３−フルオロ−６−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−２−ピリジル］メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボン酸（１５４ｍｇ）を加える。６０℃（プレート温度）／１０００ｒｐｍにて撹拌しながら、固体を溶解して透明な黄色の溶液にする。水酸化アンモニウム（２９．８％、５０μＬ、１．２２当量）を溶液に加え、沈殿物が観察される。混合物を６０℃にてさらに２時間スラリーにし、次いでそれを室温に冷却する。鮮やかな白色固体の厚いスラリーが観察される。固体を真空濾過により濾過し、固体を６０℃にて真空オーブン中で乾燥させて標題化合物（１４５ｍｇ、９０．８１％収率）を得る。

実施例２および３の粉末Ｘ線回折
結晶性固形物のＸＲＤパターンを、３５ｋＶおよび５０ｍＡで作動する、ＣｕＫａ源（λ＝１．５４０６０Å）およびＶａｎｔｅｃ検出器を備えたＢｒｕｋｅｒ Ｄ４ Ｅｎｄｅａｖｏｒ粉末Ｘ線回折装置上で得る。試料を、２θでの４〜４０°で、２θでのステップサイズ０．００９°および走査速度０．５秒／ステップを用い、ならびに０．６ｍｍの発散、５．２８の固定散乱防止、および９．５ｍｍの検出器スリットを用いて走査する。乾燥粉末を石英試料ホルダに詰めて、滑面をスライドガラスを用いて得る。結晶形回折パターンを周囲温度および相対湿度で得る。結晶学技術分野において周知なのは、任意の所与の結晶形に関して、回折ピークの相対強度が、結晶形態および晶癖などの因子から生じる優先配向に起因して異なる可能性があることである。優先配向の効果が存在する場所では、ピーク強度が変化するが、多形体の特徴的ピーク位置は変化しない。例えば、米国薬局方＃２３、国民医薬品集＃１８、１８４３〜１８４４頁、１９９５年を参照のこと。さらに、任意の所与の結晶形に関して、ピーク角度位置が若干変化する場合があるということも結晶学技術分野では周知である。例えば、試料を解析する温度もしくは湿度の変動、試料変位、または内部標準の存在もしくは非存在に起因して、ピーク位置はシフト可能である。本件では、２θでの±０．２のピーク位置変動は、示される結晶形の明白な同定を妨げることなく、これらの潜在的変動を考慮にいれることにする。結晶形の確認は、区別可能なピーク（°２θ単位での）、典型的にはより顕著なピークの任意の特有の組み合わせに基づいてなされ得る。周囲温度および相対湿度で得られる結晶形回折パターンを、８．８５３および２６．７７４°２θでのＮＩＳＴ６７５標準ピークに基づいて調整する。

実施例２の調製した試料を、０．２°の回折角に対する許容度で、ＣｕＫａ放射線を使用して、以下の表１に記載される回折ピーク（２θ値）を有する、特に１１．５°、２３．２°および１５．０°からなる群から選択されるピークの１つ以上と組み合わせて１７．０℃にてピークを有すると、ＸＲＤパターンによって特徴付ける。

実施例３の調製した試料を、０．２°の回折角に対する許容度で、ＣｕＫａ放射線を使用して、以下の表２に記載される回折ピーク（２θ値）を有する、特に１３．８°、１７．２°および１５．９℃からなる群から選択されるピークの１つ以上と組み合わせて４．６°にてピークを有すると、ＸＲＤパターンによって特徴付ける。

実施例３を使用したオーロラＡキナーゼのＸ線結晶構造
オーロラＡキナーゼの触媒ドメイン（配列ＮＰ＿００３５９１の残基１２５〜３９１）を、ＴＥＶプロテアーゼ切断可能Ｎ末端ポリ−ヒスチジンタグを用いてＳｆ９昆虫細胞において発現させる。発現したタンパク質をニッケルキレートカラムに結合させることによって単離する。ヒスチジンタグの切断後、タンパク質を、５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．０、２５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＤＴＴ、および０．１ｍＭのβ，γ−イミドアデノシン５’−三リン酸（ＡＭＰ−ＰＮＰ）を含有する緩衝液中で平衡化したサイズ排除クロマトグラフィーカラム（１６／６００ Ｓ２００；ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）に通すことによってさらに精製する。８．３ｍｇ／ｍｌの濃度にて精製したオーロラＡキナーゼタンパク質にさらなるＡＭＰ−ＰＮＰを追加して２ｍＭの最終濃度にし、２１℃にて蒸気拡散によって結晶化する。結晶化は、０．８μＬのタンパク質を、１００ｍＭのＭＥＳ ｐＨ４．６、２３％のＰＥＧ３３５０および１５０ｍＭの硫酸アンモニウムを含有する０．８μＬのリザーバー溶液と混合し、シッティングドロップトレイ中で同じリザーバーに対して平衡化することによって実施する。ＡＭＰ−ＰＮＰと複合体化するオーロラＡキナーゼの単結晶を、２ｍＭの実施例３を含有する溶液中に一晩浸し、２０％ポリエチレングリコール４００を含有する溶液に移し、液体窒素中で急速凍結する。１．９６Åに対するＸ線回折データを、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ、Ａｒｇｏｎｎｅ、ＩＬにおけるＬｉｌｌｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ａｃｃｅｓｓ Ｔｅａｍ Ｂｅａｍ−Ｌｉｎｅ（ＬＲＬ−ＣＡＴ ＡＰＳ ３１ＩＤ）にて凍結した結晶から収集する。波長０．９７９３ÅのＸ線を使用して、１８５ｍｍの検出器距離を用いて１°振動において１８０フレームを収集する。実施例３を使用したオーロラＡキナーゼの構造を分子置換によって決定し、２０．６％のＲ−ｆａｃｔｏｒおよび２５．６％のＲ−ｆｒｅｅに精緻化する。この結果は実施例３を用いており、立体化学を提供する。それはまた、実施例１および２についての立体化学も提供する。なぜなら実施例１は実施例２および３の調製のための出発物質として使用されるからである。

以下のアッセイの結果は、本発明の実施例１の化合物がオーロラＡ阻害剤であることを実証する。さらに、以下のアッセイの結果は、実施例１の化合物が、オーロラＢまたはオーロラＡ／Ｂ二重阻害を低減させ得る選択的オーロラＡ阻害剤であることを実証する。また、以下のアッセイの結果は、実施例１の化合物がオーロラＡキナーゼ活性の阻害によって細胞周期有糸分裂停止を誘導することを実証する。さらに、実施例１の化合物は、異種移植腫瘍試料を用いたインビボでのオーロラＢではなく、オーロラＡキナーゼ標的阻害、および小細胞肺がんＮＣＩ−Ｈ４４６ヌードマウスモデルにおける顕著な抗腫瘍増殖効果を実証する。

オーロラＡキナーゼアッセイ
このアッセイは、９６ブラックウェルプレートフォーマット（ＣＯＲＮＩＮＧ（登録商標）ＣＯＳＴＡＲ（登録商標）３６９４）におけるＴＲＡＮＳＣＲＥＥＮＥＲ（登録商標）ＡＤＰ−蛍光偏光測定によってインビトロでオーロラＡキナーゼ活性を阻害する化合物を試験する能力を測定する。２０μＭのＡＴＰおよび１５０μＭのオーロラＡキナーゼ活性化ループの最終濃度にてそれぞれアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）およびオーロラＡキナーゼ活性化ループ（ＥＮＯＧＥＮ（登録商標）、＃３２６８６１）を有するキナーゼ緩衝液［５０ｍＭの４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）ｐＨ７．４、４ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．０１％のＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００および２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）］中の溶液を調製する。オーロラＡ酵素を０．０９６ｎｇ／μＬの最終濃度で溶液に加える。試験化合物を２０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で１：３で連続希釈して、２０μＭで開始する最終濃度にて１０点用量反応曲線を作成する。試験化合物を含まないＤＭＳＯ緩衝液のみを陽性対照（阻害剤の非存在下での完全なオーロラＡ活性）として使用する。陰性対照は、アデノシン５’−二リン酸（ＡＤＰ）バックグラウンドレベルを決定するために完全な反応混合物と１００ｎＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。調製したオーロラＡ酵素溶液を、試験化合物ならびに陽性および陰性対照を含有するプレートに加え、２２℃にて３０分間、混合物をプレインキュベートする。ＡＴＰおよびオーロラＡキナーゼ活性化ループ溶液を加えることによって反応を開始し、２２℃にて３０分間継続する。次いでＡＤＰ遠赤色のトレーサーであるＡＤＰ抗体ならびに停止および検出緩衝液（Ｂｅｌｌｂｒｏｏｋ Ｌａｂｓカタログ番号３００３−１０Ｋ）を含有する２５μＬ（１：１ｖ：ｖ）のＡＤＰ検出混合物を加えることによって反応を停止させる。プレートを少なくとも２時間暗所に維持して、キナーゼ反応において産生したＡＤＰによってＡＤＰ Ａｌｅｘａ６３３トレーサー（ＡＤＰ２抗体に結合した）の移動を可能にし、蛍光偏光の減少を決定する（Ｕｌｔｒａ３８４、Ｔｅｃａｎ）。上記のキナーゼ緩衝液中のＡＤＰ／ＡＴＰの標準曲線を使用して、試験化合物についてのＡＤＰ変換を決定する。

陽性および陰性対照の中央値の差を１００％活性とみなす。ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ（商標）ソフトウェア（ＩＤＢＳ、Ａｌａｍｅｄａ ＣＡ）を使用してＩＣ_５０値を生成するために４パラメーターロジスティック曲線フィットを使用する。このアッセイは、３以下の最小有意比（ＭＳＲ）を示す。

本発明の範囲内の化合物を実質的に上記のようにこのアッセイにおいて試験する。実施例１の化合物は１．１２±０．１５ｎＭ（ｎ＝４）のＩＣ_５０を有すると決定される。オーロラＡ生化学アッセイは、報告されるＩＣ_５０がインビトロで絶対的な化合物阻害効力を反映しなくてもよいようにアッセイ検出下限に達するが、アッセイ自体は、このデータが、化合物がアッセイで実証するＩＣ_５０の結果を提供するように統計的に有効である。従って、この結果は、実施例１がインビトロでオーロラＡキナーゼ活性を阻害することを示す。

オーロラＢキナーゼアッセイ
このアッセイは、９６ブラックウェルプレートフォーマット（ＣＯＲＮＩＮＧ ＣＯＳＴＡＲ ３６９４）においてＴＲＡＮＳＣＲＥＥＮＥＲ ＡＤＰ−蛍光偏光測定によってインビトロでオーロラＢキナーゼ活性を阻害する化合物を試験する能力を測定する。オーロラＢ酵素（０．３９ｎｇ／μＬの最終濃度）、０．１μＭのＩＮＣＥＰペプチド（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、＃９２４８０＿１、最終濃度０．１μＭ）、ＡＴＰ（最終濃度１０μＭ）およびヒストンＨ３（Ａｎａｓｐｅｃ、＃ＫＬＨ０８−４、最終濃度５μＭ）を有するキナーゼ緩衝液（３７．５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、６．２５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．０７５％のＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００および２．５ｍＭのＤＴＴ）中のオーロラＢ酵素溶液を調製する。試験化合物を２０％のＤＭＳＯ中で１：３で連続希釈して、２０μＭで開始する最終濃度にて１０点用量反応曲線を作成する。化合物を含まないＤＭＳＯ緩衝液のみを陽性対照（阻害剤の非存在下での完全なオーロラＢ活性）として使用する。陰性対照は、ＡＤＰバックグラウンドレベルを決定するために完全な反応混合物と１００ｎＭのＥＤＴＡである。調製したオーロラＢ酵素溶液を、試験化合物ならびに陽性および陰性対照を含有するプレートに加える。２２℃にて３０分間、混合物をプレインキュベートする。上記のＡＴＰおよびヒストンＨ３溶液を加えて反応を開始し、プレートを２２℃にて４５分間インキュベートする。ＡＤＰ遠赤色のトレーサーであるＡＤＰ抗体ならびに停止および検出緩衝液（Ｂｅｌｌｂｒｏｏｋ Ｌａｂｓカタログ番号３００３−１０Ｋ）を含有する２５μＬ（１：１ｖ：ｖ）のＡＤＰ検出混合物を加えることによって反応を停止させる。プレートを少なくとも２時間暗所に維持して、キナーゼ反応において産生したＡＤＰによってＡＤＰ Ａｌｅｘａ６３３トレーサー（ＡＤＰ２抗体に結合した）の移動を可能にし、その後、蛍光偏光を決定する（Ｕｌｔｒａ３８４、Ｔｅｃａｎ）。上記のキナーゼ緩衝液中のＡＤＰ／ＡＴＰの標準曲線を、試験化合物についてのＡＤＰ変換を決定するために平衡化する。

陽性および陰性対照の中央値の差を１００％活性とみなす。ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ（商標）ソフトウェア（ＩＤＢＳ、Ａｌａｍｅｄａ ＣＡ）を使用してＩＣ_５０値を生成するために４パラメーターロジスティック曲線フィットを使用する。このアッセイは、３以下の最小有意比（ＭＳＲ）を示す。

本発明の範囲内の化合物を実質的に上記のようにこのアッセイにおいて試験する。実施例１の化合物は１５１０±６６８ｎｍ（ｎ＝５）のＩＣ_５０を有すると決定される。この結果は、実施例１が、インビトロでオーロラＡキナーゼ活性を阻害するよりも低く、インビトロでオーロラＢキナーゼ活性を阻害することを示す。

ヒストンＨ３ホスホ−Ｓｅｒ１０およびＤＮＡ含有細胞ベースの表現型多重化アッセイ
このアッセイは、オーロラＡ阻害により誘導される有糸分裂停止を測定する。オーロラＡ阻害により誘導される有糸分裂停止は、Ａｃｕｍｅｎ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（商標）（レーザー走査蛍光マイクロプレート血球計算器（ＴＴＰ ＬａｂＴｅｃｈ ＬＴＤ、ＵＫ））を使用した２４時間の化合物処理による、有糸分裂マーカーヒストンＨ３ホスホ−Ｓｅｒ１０の増加、４Ｎ（Ｇ２／Ｍ）ＤＮＡ含有量の増加、および細胞増殖阻害表現型により測定する。アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）からのＨｅｌａ細胞を、９６ウェルＢＤ ＢＩＯＣＯＡＴ（商標）ポリ−Ｄ−リシンプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ番号３５６６４０）中で５０００細胞／ウェルにて播種し、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（例えば、Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１６０００）、１％の非必須アミノ酸（例えば、Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１１４０）、１％のピルビン酸ナトリウム（例えば、Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１３６０）および１％のペニシリン−ストレプトマイシン（例えば、Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５１４０）を有する最小必須培地（ＭＥＭ）（例えば、Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３１０９５）中で５％ＣＯ_２下で３７℃にて２４時間インキュベートする。試験化合物を培地に加え、２０μＭ〜０．００１μＭの範囲にわたり、０．２５％の最終ＤＭＳＯ濃度で１：３連続希釈を１０点にて投与することによって細胞を処理する。化合物への曝露の２４時間後、細胞をＰＲＥＦＥＲ（商標）（Ａｎａｔｅｃｈ ＬＴＤ．、カタログ番号４１４）で室温にて３０分間固定し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で一回洗浄し、ＰＢＳ溶液中の０．１％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ１００で室温にて１５分間、透過処理する。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、室温にて３０分間、ＰＢＳ（例えば、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ７０３０）中の１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で遮断する。一次抗ヒストンＨ３ホスホ−Ｓｅｒ１０ウサギポリクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号０６−５７０）を、１％のＢＳＡを有するＰＢＳ中で１：１０００にて細胞に加え、４℃にて一晩インキュベートする。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を、室温にて１時間、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ａ１１００８）中でヤギ抗ウサギＩｇＧ Ａｌｅｘａ４８８標識二次抗体１：１０００とインキュベートする。ＰＢＳによる２回より多い洗浄の後、ＰＢＳ中に１０μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｐ３５６６）および５０μｇ／ｍＬのリボヌクレアーゼＡ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｒ−６５１３）を含有する溶液を加えて核を染色する。蛍光プレートを、ＡＣＵＭＥＮ ＥＸＰＬＯＲＥＲ（商標）［レーザー走査蛍光マイクロプレート血球計算器（４８８ｎｍのアルゴンイオンレーザー励起およびＴＴＰ ＬａｂＴｅｃｈ Ｌｔｄ．によって製造された多重光電子倍増管検出を含む）で走査して、ヒストンＨ３ホスホ−Ｓｅｒ１０およびＤＮＡ含有量を測定する。画像解析は異なる亜集団内の細胞を識別するための細胞蛍光シグナルに基づく。アッセイ出力は、細胞増殖阻害のパーセンテージ、ヒストンＨ３ホスホ−Ｓｅｒ１０陽性細胞のパーセンテージ、２Ｎ（Ｇ１細胞周期または２倍体ＤＮＡ含有量（ここでＮは染色体の単一の相補体を指す）、半数体ＤＮＡ含有量）のパーセンテージおよびＤＮＡヒストグラムプロファイルの４Ｎプラス＞４Ｎ（Ｇ２／Ｍ細胞周期およびそれ以降）のパーセンテージである。ＩＣ_５０およびＥＣ_５０値は、ＡＣＴＩＶＩＴＹ ＢＡＳＥ（商標）を使用して各出力についての４パラメーターロジスティックへの曲線適合によって決定する。

本発明の範囲内の化合物を実質的に上記のようにこのアッセイにおいて試験する。実施例１の化合物は、それぞれヒストンＨ３ Ｐ−Ｓｅｒ１０の増加について１０８±１５ｎＭ（ｎ＝４）のＥＣ_５０、４Ｎ−ＤＮＡ含有量の増加について１０８±２７ｎＭ（ｎ＝４）のＥＣ_５０、および細胞増殖阻害について５２．９±２７ｎＭ（ｎ＝４）のＩＣ_５０で有糸分裂停止を示す。

オーロラＢヒストンＨ３ホスホ−Ｓｅｒ１０阻害細胞ベースのアッセイ
このアッセイは、１時間の試験化合物の処理によるオーロラＢ阻害により誘導されるヒストンＨ３ホスホ−Ｓｅｒ１０の減少を測定する。アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）からのＮＣＩ−Ｈ４４６細胞を、９６ウェルＢＤ ＢＩＯＣＯＡＴ（商標）ポリ−Ｄ−リシンプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ番号３５６６４０）中で１２０００細胞／ウェルにて播種し、１０％のＦＢＳ（例えば、Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１６０００）および１％のペニシリン−ストレプトマイシン（例えば、Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５１４０）を追加したＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）培地（例えば、Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号５２４００）中で５％ＣＯ_２下で３７℃にて２４時間インキュベートする。試験化合物を培地に加え、４０μＭ〜０．００２μＭの範囲にわたり、０．２％の最終ＤＭＳＯ濃度で１：３連続希釈を１０点にて投与することによって細胞を処理する。試験化合物への曝露の１時間後、細胞をＰＢＳ中の１６％ホルムアルデヒド（ホルムアルデヒド３７％溶液のストックから最終濃度４％、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｆ１６３５）で室温にて４５分間固定し、ＰＢＳで一回洗浄し、室温にて１５分間、冷メタノールで透過処理する。次いで細胞をＰＢＳ溶液中の０．１％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ１００で一回、ＰＢＳで二回洗浄し、室温にて３０分間、ＰＢＳ中の３％スキムミルク（Ｄｉｆｃｏ、カタログ番号２３２１００）で遮断する。一次抗ヒストンＨ３ホスホ−Ｓｅｒ１０ウサギポリクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号０６−５７０）を、ＰＢＳ中の３％スキムミルク中で１：１０００にて細胞に加え、４℃にて一晩インキュベートする。ＰＢＳ溶液中の０．１％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ１００で一回、ＰＢＳで二回洗浄した後、細胞を、室温にて１時間、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ａ１１００８）中で１：１０００にてヤギ抗ウサギＩｇＧ Ａｌｅｘａ４８８標識二次抗体とインキュベートする。ＰＢＳによる２回より多い洗浄の後、ＰＢＳ中に１０μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｐ３５６６）および５０μｇ／ｍＬのリボヌクレアーゼＡ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｒ−６５１３）を含有する溶液を加えて核を染色する。蛍光プレートを、ＡＣＵＭＥＮ ＥＸＰＬＯＲＥＲ（商標）［レーザー走査蛍光マイクロプレート血球計算器（４８８ｎｍのアルゴンイオンレーザー励起およびＴＴＰ ＬＡＢＴＥＣＨ ＬＴＤによって製造された多重光電子倍増管検出から構成される）で走査して、ヒストンＨ３タンパク質およびＤＮＡ含有量のリン酸化を測定する。画像解析は異なる亜集団内の細胞を識別するために細胞蛍光シグナルに基づく。アッセイ出力は、ヒストンＨ３ホスホ−Ｓｅｒ１０陽性細胞のパーセンテージである。ＩＣ_５０値は、Ｇｅｎｅｄａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ（登録商標）を使用して各出力についての４パラメーターロジスティックへの曲線適合によって決定する。

本発明の範囲内の化合物を実質的に上記のようにこのアッセイにおいて試験する。実施例１の化合物は１４６７±４５６ｎＭ（ｎ＝４）にてオーロラＢ阻害ＩＣ_５０を示す。本明細書以下に提供される、オーロラＡホスホ−Ｔｈｒ２８８ＭＳＤ細胞ベースのアッセイデータと照らし合わせると、実施例１はオーロラＢよりオーロラＡに対して選択性を示す。

細胞溶解物およびヒストン抽出調製物
これは、以下のＥＬＩＳＡ Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）オーロラＡリン酸化阻害アッセイのために使用される細胞溶解上清を調製するためのプロトコルである。小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）Ｈ４４６細胞溶解物を、溶解緩衝液（Ｔｒｉｓ２５ｍＭ、ｐＨ７．５、ロイペプチン１０μｇ／ｍＬ、トリプシン−キモトリプシン１０μｇ／ｍＬ、トシルフェニルアラニルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）１０μｇ／ｍＬ、アプロチニン１０μｇ／ｍＬ、β−グリセロリン酸６０ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １％、ピロリン酸ナトリウム（Ｎａ_２Ｈ_２Ｐ_２Ｏ_７）２．５ｍＭ、ＮａＣｌ１５０ｍＭ、ＥＤＴＡ１５ｍＭ、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）５ｍＭ、Ｎα−４−トシル−Ｌ−アルギニンメチルエステル塩酸塩（ＴＡＭＥ）２ｍＭ、４−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物（ＰＮＰＰ）１５ｍＭ、ベンズアミジン５ｍＭ、バナジウム酸ナトリウム１ｍＭ、フッ化ナトリウム１０ｍＭ、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）５０μｇ／ｍＬ、ＤＴＴ１ｍＭ、オカダ酸１μＭ、ミクロシスチン１μＭ）を使用してＭＳＤ製造業者の仕様書（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｓｏ−ｓｃａｌｅ．ｃｏｍ／ＣａｔａｌｏｇＳｙｓｔｅｍＷｅｂ／Ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／Ｐｈｏｓｐｈｏ＿Ａｕｒｏｒａ＿Ａ＿Ｔｈｒ２８８＿ＷＣＬ．ｐｄｆ）に従って調製する。上清タンパク質濃度をＢｉｏｒａｄ ＤＣ−Ｐｒｏｔｅｉｎアッセイ（＃５００−０１１１、ＢｉｏＲａｄ）によって測定し、２５μＬの１ｍｇ／ｍＬの細胞溶解物をオーロラＡホスホ−Ｔｈｒ２８８ＭＳＤアッセイのために使用する。

オーロラＡホスホ−Ｔｈｒ２８８ＭＳＤ細胞ベースのアッセイ
アッセイの目的は細胞培養中のオーロラＡキナーゼ阻害活性を測定することである。このアッセイは、９６ウェルＥＬＩＳＡ Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プレート（＃Ｋ１５０ ＪＣＤ Ｗｈｏｌｅ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓａｔｅ Ｋｉｔ、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、ＭＤ）を使用して実施する。

ＭＵＬＴＩ−ＳＰＯＴ（登録商標）ホスホ−オーロラＡ Ｓｉｎｇｌｅｐｌｅｘプレートを１５０μＬ／ウェルの遮断溶液−Ａ（最終濃度３％ＢＳＡ）で遮断する。プレートを室温にて１時間振盪し、ＭＳＤ ＴｒｉｓＷａｓｈ緩衝液で３回洗浄する。２５μＬの１ｍｇ／ｍＬ細胞溶解物をＭＵＬＴＩ−ＳＰＯＴ（登録商標）ホスホ−オーロラＭＳＤプレートに分注する。混合物を室温にてさらに３時間インキュベートし、混合物をＭＳＤ ＴｒｉｓＷａｓｈ緩衝液で３回洗浄する。検出抗体（ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧＴＭ抗オーロラＡホスホ−Ｔ２８８）を、１％のＢＳＡ抗体希釈緩衝液（１部の３％ＢＳＡと２部のＭＳＤ洗浄緩衝液、０．０２％のブロッカーＤ−Ｒ）中で５０倍に希釈し、室温にて１時間振盪しながら２５μｌ／ウェルをプレートに加える。プレートをＭＳＤ ＴｒｉｓＷａｓｈ緩衝液で３回洗浄し、その後、１５０μＬ／ウェルの２×ＭＳＤリード緩衝液Ｔをプレートに加え、プレートをＭＳＤ ＳＥＣＴＯＲＴＭ Ｉｍａｇｅｒ６０００機器で読み取る。阻害のパーセンテージを、［（１００−（ＭＳＤ値−ＭＳＤ最大阻害値）／（ＭＳＤ最小阻害値−ＭＳＤ最大阻害値）］^＊１００と定義する。「最大」および「最小」は、２μＭの陽性対照化合物アリセルチブ対ＤＭＳＯ陰性対照のみによって定義する。

本発明の範囲内の化合物を実質的に上記のようにこのアッセイにおいて試験する。実施例１の化合物は、細胞中での１時間の化合物処理により、１．４±１．１ｎＭ（ｎ＝２）のＩＣ_５０でオーロラＡ阻害を示す。このデータは、実施例１が細胞培養中でオーロラＡキナーゼ阻害活性を実証することを示す。

腫瘍タンパク質溶解物およびヒストン抽出調製物
これは、以下のインビボ標的阻害（ＩＶＴＩ）アッセイにおいて使用される異種移植腫瘍溶解物およびヒストン抽出物を調製するプロトコルである。腫瘍試料を液体窒素中で冷却し、ホイルシート上に置き、ドライアイス容器上に乳鉢および乳棒を置く。腫瘍組織試料を乳棒ですりつぶし、粉砕した腫瘍組織を、Ｌｙｓｉｎｇ Ｍａｘｔｒｉｘ Ｄビーズ（＃６９１３−５００；Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ ＭＰ Ｌｙｓｉｎｇ Ｍａｘｔｒｉｘ Ｄ）および０．６ｍＬの溶解緩衝液（Ｔｒｉｓ２５ｍＭ、ｐＨ７．５、ロイペプチン１０μｇ／ｍＬ、トリプシン−キモトリプシン１０μｇ／ｍＬ、ＴＰＣＫ１０μｇ／ｍＬ、アプロチニン１０μｇ／ｍＬ、β−グリセロリン酸６０ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １％、ピロリン酸ナトリウム（Ｎａ_２Ｈ_２Ｐ_２Ｏ_７）２．５ｍＭ、ＮａＣｌ１５０ｍＭ、ＥＤＴＡ１５ｍＭ、ＥＧＴＡ５ｍＭ、Ｎα−４−トシル−Ｌ−アルギニンメチルエステル塩酸塩（ＴＡＭＥ）２ｍＭ、ＰＮＰＰ１５ｍＭ、ベンズアミジン５ｍＭ、バナジウム酸ナトリウム１ｍＭ、フッ化ナトリウム１０ｍＭ、ＰＭＳＦ５０μｇ／ｍＬ、ＤＴＴ１ｍＭ、オカダ酸１μＭ、ミクロシスチン１μＭ）とコンプリートＥＤＴＡフリータブレット（＃１８７３５８０、Ｒｏｃｈｅ）を含有するチューブに移す。チューブを、Ｂｉｏ１０１ ｆａｓｔＰｒｅｐ（＃Ｂｉｏ １０１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｗｅａｎｔ）において速度６．０にて３０秒間激しく振盪する。腫瘍溶解物をＭＳＤ製造業者の仕様書（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｓｏ−ｓｃａｌｅ．ｃｏｍ／ＣａｔａｌｏｇＳｙｓｔｅｍＷｅｂ／Ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／Ｐｈｏｓｐｈｏ＿Ａｕｒｏｒａ＿Ａ＿Ｔｈｒ２８８＿ＷＣＬ．ｐｄｆ）に従って調製する。上清タンパク質濃度をＢｉｏｒａｄ ＤＣ−Ｐｒｏｔｅｉｎアッセイ（＃５００−０１１１）によって決定する。

全ヒストン抽出キット（＃ＯＰ−０００６、ＥｐｉＱｕｉｋ）を使用して、製造業者の仕様書（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｐｉｇｅｎｔｅｋ．ｃｏｍ／ｄｏｃｓ／ＯＰ−０００６．ｐｄｆ）に従って上記の遠心分離工程において腫瘍組織ペレットから全ヒストンを抽出する。タンパク質濃度をＢｉｏｒａｄ ＤＣ−Ｐｒｏｔｅｉｎアッセイ（＃５００−０１１１、ＢｉｏＲａｄ）によって測定し、２５μＬの０．２５ｍｇ／ｍＬのヒストン抽出タンパク質をＩＶＴＩヒストンＨ３ホスホ−Ｓｅｒ１０アッセイのために使用する。

オーロラＡインビボ標的阻害（ＩＶＴＩ）ホスホ−Ｔｈｒ２８８ＭＳＤアッセイ
このアッセイの目的は、異種移植腫瘍試料を用いてインビボでオーロラＡキナーゼ阻害を測定することである。９６ウェルＥＬＩＳＡ Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プレートフォーマットを用いてアッセイを実施する。ＭＵＬＴＩ−ＳＰＯＴ（登録商標）ホスホ−オーロラＡ Ｓｉｎｇｌｅｐｌｅｘプレート（Ｋ１５０ ＪＣＤ Ｗｈｏｌｅ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓａｔｅ Ｋｉｔ、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、ＭＤ）に、１５０μＬ／ウェルの遮断溶液−Ａ（最終濃度３％のＢＳＡ）を入れる。室温にてプレートを１時間振盪し、ＴｒｉｓＷａｓｈ緩衝液で３回洗浄する。上記の腫瘍溶解プロトコルから腫瘍溶解物を１ｍｇ／ｍＬに調製し、２５μＬ／ウェルをＭＵＬＴＩ−ＳＰＯＴ（登録商標）ホスホ−オーロラＭＳＤプレートに分注する。混合物を室温にてさらに３時間インキュベートし、ＴｒｉｓＷａｓｈ緩衝洗浄液で３回洗浄する。２５μＬ／ウェルの量で１％のＢＳＡ抗体希釈緩衝液（１部の３％ＢＳＡと２部の洗浄緩衝液、０．０２％のブロッカーＤ−Ｒを有する緩衝液中で５０倍に希釈した抗体）中の検出ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧＴＭ抗オーロラＡホスホ−Ｔ２８８抗体をプレート内に加え、プレートを室温にて１時間振盪する。プレートをＴｒｉｓＷａｓｈ緩衝液で３回洗浄し、１５０μＬ／ウェルの２×リード緩衝液Ｔをプレートに加え、次いでＭＳＤ ＳＥＣＴＯＲＴＭ Ｉｍａｇｅｒ６０００機器で即座に読み取る。阻害のパーセンテージを、［１００−（化合物処理群平均ＭＳＤ読み取り値／ビヒクル群平均ＭＳＤ読み取り値）］^＊１００と定義する。

本発明の範囲内の化合物を実質的に上記のようにこのアッセイにおいて試験する。実施例１の化合物は、投与の３時間後、用量反応研究において、ヌードマウスにおいてＨ４４６異種移植モデルで２．１３ｍｇ／ｋｇのＴＥＤ_５０（閾値有効量）を示す。このデータは、実施例１が、特定されたＴＥＤにおいて異種移植腫瘍試料を用いて、インビボでオーロラＡキナーゼ阻害を実証することを示す。

オーロラＢインビボ標的阻害（ＩＶＴＩ）ヒストンＨ３ホスホ−Ｓｅｒ１０ ＭＳＤアッセイ
このアッセイの目的は、ヒストンＨ３ホスホ−Ｓｅｒ１０阻害を決定することによって異種移植腫瘍試料を用いてインビボでオーロラＢキナーゼ阻害活性を測定することである。なぜならそれはオーロラＢのすぐ下流のキナーゼ基層であるからである。９６ウェルＥＬＩＳＡ Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プレートフォーマットを用いてアッセイを実施する。遮断溶液−Ａ（最終濃度３％のＢＳＡ）を、１５０μＬ／ウェルにてＭＵＬＴＩ−ＳＰＯＴ（登録商標）ヒストンＨ３ ４−Ｓｐｏｔプレート（カタログ番号Ｋ１５０ ＥＷＤ−３ ＪＣＤ Ｗｈｏｌｅ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓａｔｅ Ｋｉｔ、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、ＭＤ）に加え、プレートを室温にて１時間振盪する。ＭＳＤ ＴｒｉｓＷａｓｈ緩衝液で３回洗浄した後、上記の腫瘍溶解プロトコルを用いて０．２５ｍｇ／ｍＬに調製したヒストン抽出物を２５μＬ／ウェルにてＭＳＤプレートに分注する。混合物を室温にてさらに３時間インキュベートし、ＭＳＤ ＴｒｉｓＷａｓｈ緩衝液で３回洗浄する。検出ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ヒストンＨ３ホスホ−Ｓｅｒ１０抗体を、３ｍＬの１％ＢＳＡ抗体希釈緩衝液（２ｍＬのＭＳＤ洗浄緩衝液を有する１ｍｌの３％ＢＳＡ、０．０１％のブロッカーＤ−Ｍ）中で５０倍に希釈し、２５μＬ／ウェルをプレートに加え、プレートを室温にて１時間振盪する。次いでプレートをＭＳＤ ＴｒｉｓＷａｓｈ緩衝液で３回洗浄する。１５０μＬ／ウェルの２×ＭＳＤリード緩衝液Ｔをプレートに加える。プレートをＭＳＤ ＳＥＣＴＯＲＴＭ Ｉｍａｇｅｒ６０００機器で即座に読み取る。阻害のパーセンテージを、［１００−（化合物処理群平均ＭＳＤ読み取り値／ビヒクル群平均ＭＳＤ読み取り値）］^＊１００と定義する。

本発明の範囲内の化合物を実質的に上記のようにこのアッセイにおいて試験する。実施例１の化合物は、このアッセイにおいて、投与の３時間後３０ｍｇ／ｋｇでの用量反応研究、および投与の１時間後５０ｍｇ／ｋｇでの時間経過研究において、５０％を超えるヒストンＨ３ホスホ−Ｓｅｒ１０阻害を提供しない。結果は、実施例１が、指定される用量にて異種移植腫瘍試料を用いてインビボでオーロラＢを阻害しないことを示唆する。

ＳＣＬＣ ＮＣＩ−Ｈ４４６ヌードマウス異種移植モデルを用いた抗腫瘍成長効果
このアッセイは、ＳＣＬＣ ＮＣＩ−Ｈ４４６およびＳＣＬＣ ＮＣＩ−Ｈ６９ヌードマウス異種移植モデルにおいてインビボで腫瘍成長阻害を測定することである。全てのインビボ研究は動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）に従って実施する。異種移植モデルに関して、ヒト小細胞肺がんＮＣＩ−Ｈ４４６細胞およびヒト小細胞肺がんＮＣＩ−Ｈ６９細胞を供給業者によって推奨されているように維持する。細胞を収集し、洗浄し、無血清培地とマトリゲル（３５４２３４、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の１：１混合物中に再懸濁する。次いで細胞を、５×１０^６細胞／マウスにて無胸腺ヌード雌性マウス（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のひ腹に皮下移植する。式：ｖ＝ｌ×ｗ２×０．５３６（式中、ｌ＝測定直径の長い方であり、ｗ＝垂直直径の短い方である）を使用することによって腫瘍体積を推定する。データをＳＡＳソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ Ｉｎｃ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を用いて解析する。

平均腫瘍体積がヌードマウスにおいて１５０ｍｍ^３に達したとき、動物を腫瘍体積により無作為化し、試験化合物を、１ＮのＮａＯＨでｐＨ９に調整した最終ｐＨで、２０％ヒドロキシプロピルベータシクロデキストリン（ＨＰＢＣＤ）／２５ｍＭリン酸緩衝液 ｐＨ８のビヒクルを使用して、製剤中で投与する。ビヒクルおよび処置群につき１０匹の動物を使用する。得られた各時点について、処置群を対照ビヒクル群と比較する。腫瘍体積を各処置群についての標準誤差と一緒に平均として得る。

本発明の範囲内の化合物を実質的に上記のようにこのアッセイにおいて試験する。実施例１の化合物は、小細胞肺がんＮＣＩ−Ｈ４４６異種移植ヌードマウスモデルおよび小細胞肺がんＮＣＩ−Ｈ６９異種移植ヌードマウスモデルにおいて有意な抗腫瘍成長効果を実証する。

以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］ （２Ｓ，４Ｓ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−４−［［３−フルオロ−６−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−２−ピリジル］メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボン酸：
および
（２Ｒ，４Ｒ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−４−［［３−フルオロ−６−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−２−ピリジル］メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボン酸：
またはこれらの薬学的に許容可能な塩からなる群から選択される化合物。
［２］ （２Ｒ，４Ｒ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−４−［［３−フルオロ−６−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−２−ピリジル］メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボン酸：
またはその薬学的に許容可能な塩である、［１］に記載の化合物。
［３］ （２Ｒ，４Ｒ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−４−［［３−フルオロ−６−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−２−ピリジル］メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボン酸：
である、［２］に記載の化合物。
［４］ ［１］〜［３］のいずれかに記載の化合物または塩と、薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含む、医薬組成物。
［５］ 有効量の［１］〜［３］のいずれかに記載の化合物または塩を、それを必要とする患者に投与することを含む、がんを治療する方法。
［６］ 前記がんが、小細胞肺がん、大腸がん、胃がん、前立腺がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、子宮頸がん、頭頸部がん、食道がん、卵巣がん、非小細胞肺がん、および非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される、［５］に記載の方法。
［７］ 前記がんが、小細胞肺がんである、［６］に記載の方法。
［８］ 前記がんが、前立腺がんである、［６］に記載の方法。
［９］ 前記がんが、トリプルネガティブ乳がんである、［６］に記載の方法。
［１０］ 前記がんが、子宮頸がんである、［６］に記載の方法。
［１１］ 前記がんが、頭頸部がんである、［６］に記載の方法。
［１２］ 療法における使用のための［１］〜［３］のいずれかに記載の化合物または塩。
［１３］ がんの治療における使用のための［１］〜［３］のいずれかに記載の化合物または塩。
［１４］ 前記がんが、小細胞肺がん、大腸がん、胃がん、前立腺がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、子宮頸がん、頭頸部がん、食道がん、卵巣がん、非小細胞肺がん、および非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される、［１３］に記載の使用のための化合物または塩。
［１５］ 前記がんが、小細胞肺がんである、［１４］に記載の使用のための化合物または塩。
［１６］ 前記がんが、前立腺がんである、［１４］に記載の使用のための化合物または塩。
［１７］ 前記がんが、トリプルネガティブ乳がんである、［１４］に記載の使用のための化合物または塩。
［１８］ 前記がんが、子宮頸がんである、［１４］に記載の使用のための化合物または塩。
［１９］ 前記がんが、頭頸部がんである、［１４］に記載の使用のための化合物または塩。

Claims (9)

1. （２Ｒ，４Ｒ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−４−［［３−フルオロ−６−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−２−ピリジル］メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボン酸：
   
   またはその薬学的に許容可能な塩である、化合物。
2. （２Ｒ，４Ｒ）−１−［（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）メチル］−４−［［３−フルオロ−６−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−２−ピリジル］メチル］−２−メチル−ピペリジン−４−カルボン酸：
   
   である、請求項１に記載の化合物。
3. 請求項１または２に記載の化合物または塩と、薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含む、医薬組成物。
4. がんを治療するための組成物であって、前記がんが、小細胞肺がん、大腸がん、胃がん、前立腺がん、乳がん、子宮頸がん、頭頸部がん、食道がん、卵巣がん、非小細胞肺がん、および非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される、請求項３に記載の組成物。
5. 前記がんが、小細胞肺がんである、請求項４に記載の組成物。
6. 前記がんが、前立腺がんである、請求項４に記載の組成物。
7. 前記がんが、トリプルネガティブ乳がんである、請求項４に記載の組成物。
8. 前記がんが、子宮頸がんである、請求項４に記載の組成物。
9. 前記がんが、頭頸部がんである、請求項４に記載の組成物。