TWI693218B

TWI693218B - 極光ａ激酶抑制劑

Info

Publication number: TWI693218B
Application number: TW104135473A
Authority: TW
Inventors: 詹姆士羅伯特亨瑞
Original assignee: 美商美國禮來大藥廠
Priority date: 2014-11-14
Filing date: 2015-10-28
Publication date: 2020-05-11
Also published as: JP2016539942A; CN107108567A; PH12017500881A1; PH12017500881B1; US20160137628A1; CR20170158A; CL2017001209A1; PE20170898A1; EP3218366B1; SI3473619T1; ECSP17029203A; ME03325B; CA2963473C; DOP2017000111A; CY1121334T1; ES2716732T3; US10010540B2; DK3218366T3; NZ730771A; EP3473619B8

Abstract

本發明提供抑制極光A且因此可用於治療癌症之胺基吡啶化合物或其醫藥上可接受之鹽。

Description

極光A激酶抑制劑

本發明係關於抑制極光A且可用於治療癌症之胺基吡啶化合物或其醫藥上可接受之鹽。

極光激酶係絲胺酸/蘇胺酸激酶家族且係有絲分裂之關鍵調節劑。存在極光激酶之三種人類同系物A、B及C，其中極光A涉及不同組織學起源之癌症且可在過度表現時具有致癌性。

非整倍體或基因體不穩定性係癌症之最普遍特徵之一。更特定而言，極光B抑制誘導之核內染色體倍加及後續多倍性係基因體不穩定性之主要途徑之一。此外，DNA核內染色體倍加/多倍性表現型可保持多次細胞分裂而不會完全殺死癌症細胞。另一選擇為，極光A選擇性抑制導致許多癌症細胞中之有絲分裂停滯。有絲分裂停滯常進一步進展至癌症細胞凋亡或死亡，此對於癌症藥劑而言係相比於由極光B或極光A/B雙重抑制劑導致之DNA核內染色體倍加/多倍性更期望之屬性。另外，臨床開發中之某些極光B抑制劑及極光A/B雙重抑制劑已報導為在患者中呈現嗜中性球減少症及骨髓細胞毒性，而臨床開發中之某些相對選擇性極光A抑制劑不顯示該等病症。因此，期望選擇性抑制極光A並減少或避免極光B或極光A/B雙重抑制。由此，選擇性極光A抑制可用於癌症療法。

極光A抑制劑為業內所已知。WO 2008/026768、EP 2062887及WO2009/104802揭示某些具有極光A選擇性抑制作用之胺基吡啶化合物。WO 2013/129443揭示某些具有極光A選擇性抑制活性之六氫吡啶化合物。

業內仍需要提供用於治療癌症之替代極光A抑制劑。同樣，業內仍需要提供減少或避免極光B或極光A/B雙重抑制之選擇性極光A抑制劑。因此，本發明提供可用於治療癌症之某些極光A抑制劑。另外，本發明提供某些可減少極光B或極光A/B雙重抑制之選擇性極光A抑制劑。

本發明提供為1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[[3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸之化合物：

或其醫藥上可接受之鹽。

較佳地，本發明提供選自由以下組成之群之化合物：(2S,4S)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[[3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸

(2R,4R)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[[3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸：

或其醫藥上可接受之鹽。

更佳地，本發明提供為(2R,4R)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[[3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸之化合物：

或其醫藥上可接受之鹽。

作為特定實施例，本發明提供為(2R,4R)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[[3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸之化合物。

作為特定實施例，本發明亦提供為(2S,4S)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[[3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸之化合物。

本發明提供包含(2R,4R)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[[3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸或其醫藥上可接受之鹽及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑之醫藥組合物。本發明提供包含(2R,4R)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[[3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑之醫藥組合物。

本發明提供用於治療癌症之方法，其包含向需要其之患者投與有效量之(2R,4R)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[[3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸或其醫藥上可接受之鹽。本發明提供用於治療癌症之方法，其包含向需要其之患者投與有效量之(2R,4R)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[[3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸。

本發明提供(2R,4R)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[[3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸或其醫藥上可接受之鹽，其用於療法。本發明提供(2R,4R)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[[3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸或其醫藥上可接受之鹽，其用於治療癌症。本發明提供用於治療癌症之醫藥組合物，該醫藥組合物包含(2R,4R)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[[3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸或其醫藥上可接受之鹽。

本發明亦提供(2R,4R)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[[3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸，其用於療法。本發明提供(2R,4R)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[[3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸，其用於治療癌症。本發明提供用於治療癌症之醫藥組合物，該醫藥組合物包含(2R,4R)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[[3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸。

本發明提供(2R,4R)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[[3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於製造用以治療癌症之藥劑。本發明亦提供(2R,4R)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[[3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3- 基)胺基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸之用途，其用於製造用以治療癌症之藥劑。

本發明提供呈結晶形式之(2R,4R)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[[3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸之第三丁基胺鹽。本發明亦提供呈結晶形式之(2R,4R)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[[3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸之第三丁基胺鹽，其特徵在於X射線粉末繞射圖案具有在17.0°處出現之特徵峰(以2θ±0.2°表示)與選自由11.5°、23.2°及15.0°組成之群之峰中之一或多者之組合。

本發明提供呈結晶形式之(2R,4R)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[[3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸之銨鹽。本發明亦提供呈結晶形式之(2R,4R)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[[3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸之銨鹽，其特徵在於X射線粉末繞射圖案具有在4.6°處出現之特徵峰(以2θ±0.2°表示)與選自由13.8°、17.2°及15.9°組成之群之峰中之一或多者之組合。

此外，本發明提供本文所述方法及用途之較佳實施例，其中癌症選自由小細胞肺癌、結腸直腸癌、胃癌、前列腺癌、乳癌、三陰性乳癌、子宮頸癌、頭頸癌、食道癌、卵巢癌、非小細胞肺癌及非霍奇金氏淋巴癌(non-Hodgkin lymphoma)組成之群。較佳癌症係小細胞肺癌、前列腺癌、三陰性乳癌、子宮頸癌及頭頸癌。

本發明亦提供(2R,4R)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[[3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸或其醫藥上可接受之鹽，其用於與一或多種化學治療劑組合同時、單獨或依序投與以治療癌症。

除非另有說明，否則如上文及在本發明說明通篇所用之以下術語應理解為具有以下含義：「醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑」係業內通常接受用於將生物活性劑遞送至哺乳動物(例如人類)之介質。

「醫藥上可接受之鹽(Pharmaceutically acceptable salts或a pharmaceutically acceptable salt)」係指本發明化合物之相對無毒之無機及有機鹽。

「有效量」意指本發明化合物或其醫藥上可接受之鹽或含有本發明化合物或其醫藥上可接受之鹽之醫藥組合物將引發研究員、獸醫、醫學醫生或其他臨床醫生所尋求之組織、系統、動物、哺乳動物或人類之生物或醫學反應或對其之期望治療效應之量。

術語「治療(treatment、treat、treating)」及諸如此類意欲包括減緩或逆轉病症之進展。該等術語亦包括緩解、改善、減弱、消除或減少病症或病狀之一或多種症狀，即使該病症或病狀實際上並未消除且即使該病症或病狀之進展本身並未減緩或逆轉。

本發明化合物能夠與(例如)許多無機及有機酸及鹼反應以形成醫藥上可接受之鹽。該等醫藥上可接受之鹽及其常用製備方法為業內所熟知。例如，參見P.Stahl等人，HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS：PROPERTIES,SELECTION AND USE,(VCHA/Wiley-VCH,2002)；S.M.Berge等人，「Pharmaceutical Salts,」Journal of Pharmaceutical Sciences，第66卷，第1期，1977年1月。

本發明化合物較佳地使用醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑調配為醫藥組合物並藉由各種途徑投與。較佳地，該等組合物係用於經口投與。該等醫藥組合物及其製備方法為業內所熟知。例如，參見Remington：The Science and Practice of Pharmacy(A.Gennaro等人編輯，第21版，Mack Publishing公司，2005)。

本發明化合物之實際投與量將由內科醫師根據包括以下之相關情況來決定：欲治療之病狀、所選投與途徑、實際投與之本發明化合物、個別患者之年齡、體重及反應及患者症狀之嚴重程度。每日劑量通常在約1mg至約1000mg範圍內。在一些情形下，低於前述範圍下限之劑量值可綽綽有餘，而在其他情形下仍可採用較大劑量。劑量值可由熟習此項技術者決定。

本發明化合物或其醫藥上可接受之鹽可藉由業內已知之各種程序以及下文製備及實例中所述之彼等來製備。每一所述途徑之具體合成步驟可以不同方式組合以製備本發明化合物或其醫藥上可接受之鹽。

試劑及起始材料通常可由熟習此項技術者容易地獲得。其他可藉由標準有機及雜環化學技術、熟習此項技術者已知之技術及於下文實例中所述包括任何新穎程序之程序來製得。以下製備及實例進一步闡釋本發明。除非說明相反之情形，否則本文所闡釋之化合物係使用Accelrys Draw 4.1來命名及編號。

可由熟習此項技術者在化合物合成中之任一方便點處藉由諸如選擇性結晶技術或對掌性層析等方法來分離或拆分個別異構物、鏡像異構物或非鏡像異構物(例如，參見Enantiomers,Racemates,and Resolutions(J.Jacques等人，John Wiley and Sons公司，1981))。

熟習此項技術者將瞭解本發明化合物含有至少一個對掌性中心。更特定而言，本發明化合物含有兩個對掌性中心。本發明涵蓋所有個別鏡像異構物或非鏡像異構物以及包括外消旋物之該等化合物之鏡像異構物與非鏡像異構物之混合物。較佳地，本發明化合物以單一鏡像異構物或非鏡像異構物形式存在。單一鏡像異構物或非鏡像異構物可以對掌性試劑開始或藉由立體選擇性或立體特異性合成技術來製備。另一選擇為，單一鏡像異構物或非鏡像異構物可藉由標準對掌性層析或結晶技術自混合物分離。

熟習此項技術者亦已知，具有吡唑基環之化合物可以互變異構物對形式存在，其中氫可在吡唑基環上之兩個氮間遷移。

本發明化合物可根據業內熟知且理解之合成方法製備。該等反應之步驟之適宜反應條件為業內所熟知且溶劑及輔助試劑之適當取代為熟習此項技術者所熟知。同樣，熟習此項技術者應瞭解，可根據需要或期望藉由各種熟知技術分離及/或純化合成中間物，且經常地，將可能經少許純化或未經純化即使用各種中間物直接用於後續合成步驟中。此外，熟習此項技術者應瞭解，在一些情況下，引入各部分之順序並不重要。產生本發明化合物所需步驟之特定順序取決於所合成之特定化合物、起始化合物及經取代部分之相對不穩定性，如為熟習此項技術之化學家所熟知。除非另有說明，否則所有取代者皆如先前所定義，且所有試劑為業內熟知並瞭解。

本文所用之以下術語具有所示含義：「ADP」係指腺苷5’-二磷酸；「ATP」係指腺苷5’-三磷酸；「BSA」係指牛血清白蛋白；「DNA」係指去氧核糖核酸；「DMSO」係指二甲亞碸；「DTT」係指二硫蘇糖醇；「EDTA」係指乙二胺四乙酸；「EGTA」係指乙二醇四乙酸；「FBS」係指胎牛血清；「IVTI」係指活體內標靶抑制；「HEPES」係指4-(2-羥乙基)六氫吡嗪-1-乙烷磺酸；「MEM」係指最小必須培養基；「MS」係指質譜法；「NMR」係指核磁共振；「PBS」係指磷酸鹽緩衝鹽水；「MSR」係指最小顯著比率；「PMSF」係指苯基甲基磺醯氟；「PNPP」係指磷酸4-硝基苯基酯二鈉鹽六水合物；「psi」係指磅/平方英吋；「SCLC」係指小細胞肺癌。「TAME」係指Nα-4-甲苯磺醯基-L-精胺酸甲酯鹽酸鹽；「TED」係指臨限有效劑量；「TPCK」係指甲苯磺醯基苯丙胺醯基氯甲基酮。

製備1 2-甲基六氫吡啶-4-甲酸甲酯鹽酸鹽

將PtO₂(11.5g)裝填至反應容器中。然後用N₂吹掃該容器並用乙酸(225ml)潤濕。將2-氯-6-甲基-吡啶-4-甲酸甲酯(125g)及乙酸(1000ml)添加至漿液中。密封該反應容器，用N₂吹掃其，且然後用H₂吹掃其，並用H₂加壓。在60℃下在60psi之氫下將該反應混合物加熱7小時。在相同規模及相同條件下運行兩個單獨反應。過濾每一反應之反應混合物並合併濾液。在真空下濃縮濾液，以提供含有一些乙酸之濃油狀物。將甲基第三丁醚(2L)添加至該濃油狀物中並在室溫下攪拌。收集所得固體，用甲基第三丁醚(2×1000mL)洗滌並在真空下在35℃下乾燥，以提供呈白色固體之標題化合物(400g)。¹H NMR(CDCl₃)δ 1.55(d,J=6.3Hz,3H)；1.85(q,J=12.3Hz,1H)；2.23-1.98(m,3H)；2.59-2.46(m,1H)；2.85(dt,J=13.0,3.5Hz,1H)；3.20-3.06(m,1H)；3.53(brd,J=12.6Hz,1H)；3.69(s,3H)；9.7(br s,1H)

製備2 1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸甲酯

將2-甲基六氫吡啶-4-甲酸甲酯鹽酸鹽(205.4g,1.06mol)、1-(溴甲基)-3-氯-2-氟-苯(261g,1.17mol)、乙腈(2050mL)及碳酸鉀(293g,2.12mol)添加至三頸圓底燒瓶(1L)中。在回流下將該反應混合物攪拌18小時。然後停止加熱，過濾固體，且然後用乙腈(2×250mL)沖洗固體。在真空下濃縮濾液，以得到綠色粗產物。溶解於甲基第三丁醚(2500ml)中，添加CELITE®，攪拌，然後過濾。用水洗滌濾液。用1.25N鹽酸水溶液(2000ml)、然後用1M鹽酸水溶液(1000ml)萃取有機物。合併水性萃取物並用48%氫氧化鈉水溶液(250g)鹼化至約12之pH。用甲基第三丁醚(3L)萃取。經硫酸鎂乾燥有機物，過濾並濃縮，以得到呈褐色油狀物之標題化合物(272.8g)。MS(m/z)：300(M+1)。

製備3 (2R,4R)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸甲酯

使用超臨界流體對掌性層析分離1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸甲酯(272.8g)之鏡像異構物。固定相：Chiralpak IC，流動相：3%異丙醇及0.2%二甲基乙胺。收集第一溶析之鏡像異構物(R_T=1.73min)。收集為標題化合物之第二溶析之鏡像異構物(158g，49.7%產率；R_T=2.19min；MS(m/z)：300(M+1)。)。分析條件：固定相：Chiralpak IC，流動相：5%異丙醇/0.2%異丙胺，流速3mL/min，溫度：35℃。

製備4 (2R,4R)-2-甲基六氫吡啶-4-甲酸甲酯鹽酸鹽

將(2R,4R)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸甲酯(250g,0.834mol)、1,2-二氯乙烷(1200ml)及氯甲酸1-氯乙酯(112ml,1.04mol)添加至4000ml三頸燒瓶中。在70℃下用機械攪拌器攪拌72小時。添加氯甲酸1-氯乙酯(30ml,0.227mol)並在回流下攪拌6小時。使混合物冷卻至60℃並經30min至45min經由加料漏斗添加甲醇(250ml)。在60℃至65℃下攪拌18小時。添加甲醇(400ml)並在65℃至68℃下攪拌5小時。使混合物冷卻至室溫並攪拌過夜。在真空下濃縮至漿液。用乙酸乙酯(1500ml)稀釋漿液並在0℃下攪拌30min。收集固體並用乙酸乙酯(1000ml)洗滌，以得到呈灰色固體之標題化合物(136.5g,84.5%產率)。¹H NMR(399.81MHz,d₆-DMSO)：δ 1.22(d,J=6.5Hz,3H),1.53-1.43(m,1H),1.73-1.62(m,1H),1.99-1.91(m,2H),2.71-2.63(m,1H),2.89-2.83(m,1H),3.15-3.12(m,1H),3.23-3.20(m,1H),3.59(s,3H),9.03(br,s,1H),9.44(br,s,1H)。

製備5 O4-甲基(2R,4R)-2-甲基六氫吡啶-1,4-二甲酸O1-第三丁酯

將(2R,4R)-2-甲基六氫吡啶-4-甲酸甲酯鹽酸鹽(136g,0.702mol)及二氯甲烷(1500ml)添加至配備有頂置式攪拌器之4L三頸圓底燒瓶中。添加二異丙基乙胺(250ml)並在室溫下攪拌幾分鐘。添加4-吡啶胺-N,N-二甲基(9.0g,0.74mol)。在冰/水浴中冷卻。經約30分鐘緩慢添加二碳酸二-第三丁酯(192g,0.88mol)存於二氯甲烷(300ml)中之溶液，同時維持溫度介於5℃至10℃之間。使該混合物升溫至室溫並攪拌過夜。添加草酸溶液10%(2L)並在室溫下攪拌45min。分離各層。用5%草酸(1L)洗滌有機物。用水、然後飽和NaCl洗滌有機物，經硫酸鈉乾燥，過濾並在真空下濃縮。溶解於二氯甲烷(250ml)中。施加至經二氯甲烷潤濕之二氧化矽塞(250g)。用二氯甲烷(3L)溶析。在真空下濃縮濾液並在真空下保持幾個小時，以得到呈淺黃色油狀物之標題化合物(146g，80.8%產率)。¹H NMR(399.80MHz,CDCl₃)：δ 1.05(d,J=6.8Hz,3H),1.42(s,9H),1.76-1.66(m,1H),1.99-1.94(m,3H),2.55(五重峰，J=5.8Hz,1H),3.10-3.02(m,1H),3.67(s,3H),3.85-3.78(m,1H),4.18-4.10(m,1H)。

製備6 6-溴-2-(溴甲基)-3-氟-吡啶

將6-溴-3-氟-2-甲基-吡啶(50g,0.263mol)、N-溴琥珀醯亞胺(100g,0.562mol)及四氯化碳(500ml)添加至配備有回流冷凝器及氮入口之1000ml三頸圓底燒瓶中。在室溫下攪拌的同時，以份形式添加2,2’-偶氮雙(異丁腈)。在78℃下將反應攪拌72小時。使混合物冷卻至室溫並過濾掉固體。用甲苯(2×100ml)洗滌固體。將濾液濃縮至約250ml，用四氫呋喃(300ml)稀釋並冷卻至0℃至5℃。在氮氛圍下，經30min緩慢添加亞磷酸二乙酯(37ml,0.288mol)及三乙胺(40ml,0.287mol)存於四氫呋喃(100ml)中之溶液。經1小時使該混合物緩慢升溫至室溫。在真空下濃縮。添加冰冷水並攪拌，直至混合物處在室溫下為止。收集固體並用水(2×200ml)洗滌。在真空下乾燥固體。溶解於二氯甲烷(500ml)中，並藉助二氧化矽塞過濾。用二氯甲烷(250ml)沖洗塞。在真空下濃縮濾液，用己烷(500ml)稀釋並在真空下濃縮至約100ml。收集固體並用己烷(100ml)洗滌，以獲得呈白色固體之標題化合物(48.0g，67.8%產率)。自母液收集固體並在真空下乾燥，以獲得呈白色固體之標題化合物(5.2g，7.35%產率)。¹H NMR(399.80MHz,CDCl₃)：δ 4.51(d,J=2.1Hz,2H),7.31-7.25(m,1H),7.42(dd,J=3.5,8.6Hz,1H)。

製備7 O1-第三丁基O4-甲基(2R,4R)-4-[(6-溴-3-氟-2-吡啶基)甲基]-2-甲基-六氫吡啶-1,4-二甲酸酯

將存於四氫呋喃(470ml)之O1-第三丁基-O4-甲基(2R,4R)-2-甲基六氫吡啶-1,4-二甲酸酯(48.1g,0.187mol)添加至3L三頸圓底燒瓶中並將該混合物冷卻至-78℃。經30min逐滴添加存於己烷(112.2ml,0.224mol)中之二異丙基胺基鋰(10%質量)，同時維持內部溫度低於-71℃。在-78℃下攪拌1.5小時。逐滴添加6-溴-2-(溴甲基)-3-氟-吡啶(60.4g,0.225mol)存於四氫呋喃(470ml)中之溶液經1小時，同時維持內部溫度低於-71℃。在-78℃下攪拌1小時。藉由添加氯化銨飽和水溶液使該反應驟冷。收集所得固體，溶解於水(500ml)中並用乙酸乙酯(1000ml)萃取。合併萃取物，經硫酸鈉乾燥，過濾並在真空下濃縮。用57.22g之O1-第三丁基-O4-甲基(2R,4R)-2-甲基六氫吡啶-1,4-二甲酸酯在相同反應條件下重複此反應，並合併所獲得材料用於純化。藉由矽膠層析(5%至15%己烷/乙酸乙酯梯度)純化合併之材料，以獲得呈淺黃色油狀物之標題化合物(168.2g)。¹H NMR(399.80MHz,CDCl₃)：δ 0.98(d,J=7.1Hz,3H),1.43(s,9H),1.76(dd,J=6.0,13.8Hz,1H),2.02(s,2H),2.23(dt,J=13.9,2.1Hz,1H),3.09-2.98(m,3H),3.71(s,3H),3.90-3.87(m,1H),4.40-4.37(m,1H),7.19(t,J=8.5Hz,1H),7.29(dd,J=3.4,8.6Hz,1H)。

製備8 (2R,4R)-4-[(6-溴-3-氟-2-吡啶基)甲基]-1-[(3-氯-2-氟苯基)甲基]-2-甲基 -六氫吡啶-4-甲酸甲酯

將存於1,4-二噁烷(945ml)中之O1-第三丁基-O4-甲基(2R,4R)-4-[(6-溴-3-氟-2-吡啶基)甲基]-2-甲基-六氫吡啶-1,4-二甲酸酯(168.2g,0.378mol)添加至4L三頸圓底燒瓶中。經20分鐘緩慢添加鹽酸(存於475mL之1,4-二噁烷中之4M，1.9mol)。在室溫下攪拌21小時，然後在50℃下攪拌4小時。收集固體並在真空下在45℃下乾燥1小時。將濾液濃縮至固體並完全乾燥。將合併之固體、碳酸鉀(105g,0.76mol)及乙腈(1200ml)添加至3L三頸圓底燒瓶中。在室溫下攪拌20分鐘，然後添加3-氯-2-氟苄基溴(101.3g,0.453mol)。在室溫下攪拌3天。藉助CELITE®過濾該混合物。將濾液濃縮至黃色油狀物。藉由矽膠層析(經70分鐘100%二氯甲烷至存於二氯甲烷中之7%甲基-第三丁基醚梯度)純化該油狀物，以得到呈黃色油狀物之標題化合物(153g,0.314mol)。MS(m/z)：489(M+1)。

製備9 (2R,4R)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[(3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基六氫吡啶-4-甲酸甲酯

將第三丁醇(9.4ml)添加至微波反應容器中並藉由氮鼓泡進行去氧並持續5分鐘。添加乙酸鈀(II)(0.044g,0.196mmol)及2-二-第三丁基膦基-2’,4’,6’-三異丙基聯苯(0.251g,0.58mol)。自該溶液表面下方添加水(0.014ml)。使用Initiator微波爐將該混合物加熱至100℃並持續2分鐘。經由注射器將此觸媒溶液添加至以下混合物中。

將(2R,4R)-4-[(6-溴-3-氟-2-吡啶基)甲基]-1-[(3-氯-2-氟苯基)甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸甲酯(9.4g,0.019mol)、5-甲基-1H-吡唑-3-胺(2.07g,0.021mol)及第三丁醇(65ml)添加至3L三頸圓底燒瓶中。將該混合物加熱至40℃至45℃並用氮鼓泡10分鐘。將碳酸銫(14.5g,0.045mol)及上文所提供之觸媒溶液添加至該混合物中。在40℃至45℃下攪拌3.5小時。該反應不完全。製備乙酸鈀(II)(0.0088g,0.039mmol)、2-二-第三丁基膦基-2’,4’,6’-三異丙基聯苯(0.050g,0.103mmol)、水(2.8μL)及第三丁醇(2ml)之額外混合物。使用Initiator微波爐將此混合物加熱至100℃並持續2min，且然後將其添加至以上不完全反應混合物中。在40℃至45℃下將該反應混合物攪拌2小時。用乙酸乙酯(100mL)稀釋該混合物，藉助CELITE®塞過濾並用乙酸乙酯(100mL)洗滌塞。在真空下濃縮。利用129.35g之(2R,4R)-4-[(6-溴-3-氟-2-吡啶基)甲基]-1-[(3-氯-2-氟苯基)甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸甲酯在與上文所述相同之反應條件下重複該反應，並合併粗材料用於純化。

合併兩個粗反應產物。藉由矽膠層析存於1：1二氯甲烷/己烷中之30%乙酸乙酯至100%乙酸乙酯純化材料，以獲得95g之粉色固體。將固體添加至具有SILIAMETS® THIOL(120g)及二氯甲烷(2L)之4L燒瓶中。在室溫下攪拌過夜。藉助CELITE®過濾該混合物。將濾液濃縮至乾燥，以得到呈白色泡狀物之標題化合物(93.3g)。MS(m/z)：504(M+1)。

實例1 (2R,4R)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[[3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸

將(2R,4R)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[(3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基六氫吡啶-4-甲酸甲酯(19.95g,0.040mol)、鹽酸(36.5%質量)及水(140ml,1.63mol)添加至1L三頸圓底燒瓶中。在93℃至96℃下攪拌17小時。冷卻至室溫，並在真空下濃縮。將殘餘物溶解於水(1000ml)中並於冰浴中冷卻。用5N氫氧化鈉將pH調整至6.5。收集所得固體並用水洗滌。用10%異丙醇/二氯甲烷(3×500ml)萃取水濾液。乾燥並濃縮至固體。合併兩種固體並溶解於乙醇(200ml)中。用乙酸乙酯(1500ml)稀釋並在室溫下攪拌過夜。過濾並在真空下濃縮至固體。將固體溶解於5%甲醇/二氯甲烷中，用乙酸乙酯(500ml)稀釋並濃縮至300ml。過濾掉固體。利用61.9g之(2R,4R)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[(3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基六氫吡啶-4-甲酸甲酯在於上文所述相同之反應條件重複該反應。合併來自兩個反應之濾液。將合併之濾液濃縮至約600ml並用用己烷(600ml)稀釋。收集固體並在真空下在50℃下乾燥過夜。在真空下將母液濃縮至乾燥並在真空下在50℃下將固體乾燥過夜。合併固體，以得到標題化合物(63.44g)。MS(m/z)：490(M+1)。[α]²⁰ _D+17.3°(c 1.00,EtOH)。

實例2 (2R,4R)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[[3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸之第三丁胺鹽

添加存於4mL之丙酮中之(2R,4R)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[[3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸(580mg)。固體溶解以形成澄清黃色溶液，同時以60℃(板溫度)/1000rpm攪拌。將第三丁胺(150μL，1.20當量，99.5%)添加至該溶液中並觀察到沈澱。在60℃下使該混合物再成漿10分鐘且然後使其冷卻至室溫。藉由真空過濾來過濾固體並在真空烘箱中在60℃下乾燥固體，以提供標題化合物(635mg，95.26%產率)。

實例3 (2R,4R)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[[3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸之銨鹽

添加存於2mL之丙酮中之(2R,4R)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[[3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸(154mg)。固體溶解至澄清黃色溶液，同時以60℃(板溫度)/1000rpm攪拌。將氫氧化銨(29.8%，50μL，1.22當量)添加至該溶液中並觀察到沈澱。在60℃下使該混合物再成漿兩個小時且然後使其冷卻至室溫。觀察到亮白色固體之濃漿液。藉由真空過濾來過濾固體並在真空烘箱中在60℃下乾燥固體，以提供標題化合物(145mg，90.81%產率)。

實例2及3之X射線粉末繞射

在於35kV及50mA下操作之配備有CuKa源(λ=1.54060Å)及Vantec檢測器之Bruker D4 Endeavor X射線粉末繞射計上獲得結晶固體之XRD圖案。在4°與40° 2θ之間掃描樣品，其中步長為0.009° 2θ且掃描速率為0.5秒/步，且使用0.6mm發散狹縫、5.28固定防散射狹縫及9.5mm檢測器狹縫。將乾粉末堆積於石英樣品固持器上並使用載玻片獲得光滑表面。在室溫及相對濕度下收集晶形繞射圖案。晶體學領域中已眾所周知，對於任一給定晶形而言，繞射峰之相對強度可由於由諸如晶體形態及習性等因素產生之較佳定向而變化。在存在較佳定向之影響之情形下，峰強度會改變，但多型之特徵峰位置不變。例如，參見The United States Pharmacopeia #23,National Formulary #18，第1843頁至第1844頁，1995。此外，晶體學領域中亦已眾所周知，對於任一給定晶形，角峰位置可略微變化。舉例而言，峰位置可由於分析樣品時之溫度或濕度之變化、樣品位移或存在或不存在內標準而發生移位。在此情形下，±0.2 2θ之峰位置變化性將考慮到該等潛在變化，此並不妨礙所指示晶形之明確鑑別。晶形之證實可基於有區別之峰(通常為更突出之峰，以° 2θ為單位)之任一獨特組合來實施。在8.853°及26.774° 2θ下基於NIST 675標準峰調節於室溫及相對濕度下收集之晶形繞射圖案。

實例2之所製備樣品之特徵在於XRD圖案(使用CuKa放射)具有如下表1中所述之繞射峰(2θ值)，且特定而言具有17.0°處之峰與一或多個選自由11.5°、23.2°及15.0°組成之群之峰之組合；其中繞射角公差為0.2°。

實例3之所製備樣品之特徵在於XRD圖案(使用CuKa放射)具有如下表2中所述之繞射峰(2θ值)，且特定而言具有4.6°處之峰與一或多個選自由13.8°、17.2°及15.9°組成之群之峰之組合；其中繞射角公差為0.2°。

表2：實例3之X射線粉末繞射峰

極光A激酶使用實例3之X射線晶體結構

在Sf9昆蟲細胞中表現具有TEV蛋白酶可裂解之N末端多組胺酸標籤之極光A激酶之催化結構域(序列NP_003591之殘基125至391)。藉由結合至鎳螯合管柱來分離所表現之蛋白質。在裂解組胺酸標籤後，藉由穿過於含有50mM磷酸鈉pH 7.0、250mM NaCl、1mM EDTA、5mM DTT及0.1mM之緩衝液中平衡之粒徑排阻層析管柱(16/600S200；GE Lifesciences)利用β,γ-醯亞胺腺苷5’-三磷酸(AMP-PNP)來進一步純化該蛋白質。向濃度為8.3mg/ml之經純化極光A激酶蛋白補充額外AMP-PNP達2mM之最終濃度，並在21℃下藉由蒸氣擴散來進行結晶。藉由混合0.8μL蛋白質與0.8μL含有100mM MES pH 4.6、23% PEG 3350及150mM硫酸銨之儲積溶液並在坐滴托盤中針對相同儲積溶液進行平衡來實施結晶。將極光A激酶與AMP-PNP複合之單晶體浸泡在含有2mM之實例3之溶液中過夜，並轉移至含有20%聚乙二醇400之溶液中，並於液氮中急驟冷凍。在Advanced Photon Source,Argonne,IL之Lilly Research Laboratories Collaborative Access Team Beam-Line(LRL-CAT APS 31ID)自經冷凍晶體收集1.96Å之X射線繞射數據。使用波長0.9793Å之X射線以1°振盪收集180幀，且檢測器距離為185mm。藉由分子置換測定使用實例3之極光A激酶之結構，並細化為20.6%之R因子(R-factor)及25.6%之自由R因子(R-free)。結果係利用實例3的並提供立體化學。其亦提供實例1及2之立體化學，此乃因使用實例1作為用於製備實例2及3之起始材料。

以下分析之結果證明本發明之實例1化合物係極光A抑制劑。另外，以下分析之結果證明實例1之化合物係可減少極光B或極光A/B雙重抑制之選擇性極光A抑制劑。而且，以下分析之結果證明實例1之化合物藉由抑制極光A激酶活性來誘導細胞週期有絲分裂停滯。另外，實例1之化合物利用異種移植物腫瘤樣品展示極光A(而非極光B)激酶標靶活體內抑制以及在小細胞肺癌NCI-H446裸小鼠模型中展示顯著抗腫瘤生長效力。

極光A激酶分析

此分析藉由TRANSCREENER ®ADP-螢光極化量測在96孔黑板格式(CORNING® COSTAR® 3694)中量測測試化合物活體內抑制極光A激酶活性之能力。製備具有腺苷三磷酸(ATP)及極光A激酶活化環(ENOGEN®,#326861)之存於激酶緩衝液[50mM 4-(2-羥乙基)-1-六氫吡嗪乙烷磺酸(HEPES)pH 7.4、4mM MgCl₂、0.01% TRITON^TM X-100及2mM二硫蘇糖醇(DTT)]中之溶液，且最終濃度分別為20μM ATP及150μM極光A激酶活化環。將極光A酶添加至該溶液中且最終濃度為0.096ng/μL。將測試化合物連續稀釋1：3於20%二甲亞碸(DMSO)中，以在以20μM起始之最終濃度下建立10點劑量反應曲線。使用不含測試化合物之單獨DMSO緩衝液作為陽性對照(在不存在抑制劑之存在下完全為極光A活性)。陰性對照為完全反應混合物加上100nM之乙二胺四乙酸(EDTA)，以測定腺苷5’-二磷酸(ADP)背景值。將所製備之極光A酶溶液添加至含有測試化合物及陽性及陰性對照之板中，並在22℃下將該混合物預培育30分鐘。藉由添加ATP及極光A激酶活化環溶液開始該反應並在22℃下持續30分鐘。然後藉由添加25μL(1：1 v：v)含有ADP遠紅外示蹤劑、ADP抗體及停止及檢測緩衝液(Bellbrook Labs目錄編號3003-10K)之ADP檢測混合物來終止該反應。將該等板保持在黑暗中至少2小時以使得ADP Alexa633示蹤劑(結合至ADP2抗體)經激酶反應中產生之ADP置換，並測定螢光極化之降低(Ultra384,Tecan)。使用ADP/ATP存於以上激酶緩衝液中之標準曲線測定測試化合物之ADP轉化。

將陽性及陰性對照之中位數值之間之差異視為100%活性。使用四參數邏輯曲線擬合並使用ActivityBase^TM軟體(IDBS,Alameda CA)生成IC₅₀值。該分析展示

3之最小顯著比率(MSR)。

在此分析中實質上如上文所述測試屬本發明範圍之化合物。實例1之化合物經測定具有1.12±0.15nM之IC₅₀(n=4)。極光A生物化學分析達到分析檢測下限，從而使得所報告之IC₅₀可能無法反映活體外絕對化合物抑制效能；然而，在統計上驗證該分析本身，從而使得該數據提供在此分析中該化合物所證明之IC₅₀結果。因此，結果顯示實例1活體外抑制極光A激酶活性。

極光B激酶分析

此分析藉由TRANSCREENER ADP-螢光極化量測在96孔黑板格式(CORNING COSTAR 3694)中量測測試化合物活體外抑制極光B激酶活性之能力。製備具有極光B酶(0.39ng/μL之最終濃度)、0.1μM INCEP肽(GenScript，#92480_1，最終濃度0.1μM)、ATP(最終濃度10μM)及組蛋白H3(Anaspec，#KLH08-4，最終濃度5μM)之存於激酶緩衝液(37.5mM HEPES pH 7.4、6.25mM MgCl₂、0.0075% TRITON^TM X-100及2.5mM DTT)中之極光B酶溶液。將測試化合物連續稀釋1：3於20% DMSO中，以在以20μM起始之最終濃度下建立10點劑量反應曲線。使用不含化合物之單獨DMSO緩衝液作為陽性對照(在不存在抑制劑之情況下完全為極光B活性)。陰性對照為完全反應混合物加上100nM EDTA，以測定ADP背景值。將所製備之極光B酶溶液添加至含有測試化合物及陽性及陰性對照之板中。在22℃下將該混合物預培育30分鐘。添加以上ATP及組蛋白H3溶液以開始該反應，並在22℃下將該板培育45分鐘。藉由添加25μL(1：1 v：v)含有ADP遠紅外示蹤劑、ADP抗體及停止及檢測緩衝液(Bellbrook Labs目錄編號3003-10K)之ADP檢測混合物來終止該反應。將該等板保持於黑暗中至少2小時以使得ADP Alexa633示蹤劑(結合至ADP2抗體)經激酶反應中所產生之ADP置換，然後測定螢光極化(Ultra384,Tecan)。建立ADP/ATP存於上述激酶緩衝液中之標準曲線以測定測試化合物之ADP轉化。

將陽性及陰性對照之中位數值之間之差異視為100%活性。使用四參數邏輯曲線並使用ActivityBase^TM軟體(IDBS,Alameda CA)生成IC₅₀值。該分析展示

3之最小顯著比率(MSR)。

在此分析中實質上如上文所述測試屬本發明範圍內之化合物。實例1之化合物經測定以具有1510±668nM之IC₅₀(n=5)。該等結果顯示實例1活體外抑制極光B激酶活性之程度不如其活體外抑制極光A激酶活性之程度。

基於之組蛋白H3磷酸化Ser10及DNA含量細胞表現型多工分析

該分析量測極光A抑制誘導之有絲分裂停滯。利用24小時化合物處理使用Acumen Explorer^TM(雷射-掃描螢光微板細胞儀(TTP LabTech LTD,UK))並利用有絲分裂標記物組蛋白H3磷酸化Ser10增加、4N(G2/M)DNA含量增加及細胞增殖抑制表現型量測極光A抑制誘導之有絲分裂停滯。胞以5000個細胞/孔將來自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)之Hela細平鋪於96孔BD BIOCOAT^TM聚-D-離胺酸板(Becton Dickinson，目錄編號356640)中，並在37℃下在5% CO₂下與具有10%胎牛血清(FBS)(例如Gibco，目錄編號16000)、1%非必需胺基酸(例如Gibco，目錄編號11140)、1%丙酮酸鈉(例如Gibco，目錄編號11360)及1%青黴素-鏈黴素(例如Gibco，目錄編號15140)一起於最小必須培養基(MEM)(例如Gibco，目錄編號31095)中培育24小時。藉由將測試化合物添加至該培養基中來處理細胞，在10個跨越20μM至0.001μM之範圍之1：3連續稀釋點處投予，且最終DMSO濃度為0.25%。在暴露至化合物中24小時後，在室溫下用PREFER^TM(Anatech LTD.，目錄編號414)將細胞固定30分鐘，用磷酸鹽在室溫下緩衝鹽水(PBS)洗滌一次並用存於PBS溶液中之0.1% TRITON® X100透化15分鐘。將細胞用PBS洗滌兩次並在室溫下用存於PBS中之1%牛血清白蛋白(BSA)(例如Sigma，目錄編號A7030)阻斷30分鐘。將一級抗組蛋白H3磷酸化Ser10兔多株抗體(Millipore，目錄編號06-570)以1：1000於具有1% BSA之PBS中添加至細胞中並在4℃下培育過夜。用PBS洗滌兩次後，在室溫下將細胞與山羊抗兔IgG Alexa 488標記之二級抗體一起1：1000於PBS(Invitrogen目錄編號A11008)中培育1小時。用PBS再洗滌兩次後，添加含有10μg/mL碘化丙啶(Invitrogen目錄編號P3566)及50μg/mL核糖核酸酶A(Sigma，目錄編號R-6513)存於PBS中之溶液以對細胞核染色。用ACUMEN EXPLORER^TM[雷射掃描螢光微板細胞儀(包含488nm氬離子雷射激發及多重光電倍增管檢測，由TTP LabTech有限公司製造)]掃描螢光板以量測組蛋白H3磷酸化Ser10及DNA含量。影像分析係基於細胞螢光信號來鑑別不同亞族群中之細胞。分析輸出係細胞增殖抑制百分比、組蛋白H3磷酸化Ser10陽性細胞百分比、2N(G1細胞週期或二倍體DNA含量，其中N係指染色體之單一補體；單倍體DNA含量)百分比及DNA直方圖剖面之4N加上>4N(G2/M細胞週期及以後)之百分比。藉由使用ACTIVITY BASE^TM針對每一輸出曲線擬合至四參數邏輯來測定IC₅₀及EC₅₀值。

在此分析中實質上如上文所述測試屬本發明範圍內之化合物。實例1之化合物顯示，有絲分裂停滯分別地對於組蛋白H3 P-Ser10增加而言具有108±15nM之EC₅₀(n=4)，對於4N-DNA含量增加而言具有108±27nM之EC₅₀(n=4)，且對於細胞增殖抑制而言具有52.9±27nM之IC₅₀(n=4)。

基於極光B組蛋白H3磷酸化Ser10抑制細胞之分析

該分析利用一小時測試化合物處理量測極光B抑制誘導之組蛋白H3磷酸化Ser10降低。將來自美國菌種保存中心(ATCC)之NCI-H446細胞以12000個細胞/孔平鋪於96孔BD BIOCOAT^TM聚-D-離胺酸板(Becton Dickinson，目錄編號356640)中，並在37℃下在5% CO₂下於Roswell Park Memorial Institute(RPMI)培養基(例如Gibco，目錄編號52400)中在添加10% FBS(例如Gibco，目錄編號16000)及1%青黴素-鏈黴素(例如Gibco，目錄編號15140)之情況下培育24小時。藉由將測試化合物添加至該培養基中來處理細胞，在10個跨越40μM至0.002μM範圍之1：3連續稀釋點處投予，且DMSO濃度為0.2%。在暴露至測試化合物中一小時後，在室溫下用存於PBS中之16%甲醛(最終濃度4%，來自甲醛37%儲備溶液，Sigma，目錄編號F1635)將細胞固定45分鐘，用PBS洗滌一次並在室溫下用冷甲醇透化15分鐘。然後用存於PBS溶液中之0.1% TRITON® X100將細胞洗滌一次，用PBS洗滌兩次並在室溫下用存於PBS中之3%脫脂乳(Difco，目錄編號232100)阻斷30分鐘。將一級抗組蛋白H3磷酸化Ser10兔多株抗體(Millipore，目錄編號06-570)以1：1000於存於PBS中之3%脫脂乳中添加至細胞中並在4℃下培育過夜。在用存於PBS溶液中之0.1% TRITON® X100洗滌一次並用PBS洗滌兩次後，在室溫下將細胞與山羊抗兔IgG Alexa 488標記之二級抗體1：1000於PBS(Invitrogen目錄編號A11008)中一起培育一小時。在用PBS再洗滌兩次後，添加含有10μg/mL碘化丙啶(Invitrogen目錄編號P3566)及50μg/mL核糖核酸酶A(Sigma，目錄編號R-6513)存於PBS中之溶液以對細胞核染色。用ACUMEN EXPLORER^TM[雷射掃描螢光微板細胞儀(包含488nm氬離子雷射激發及多重光電倍增管檢測，由TTP LABTECH有限公司製造)掃描螢光板以量測組蛋白H3蛋白之磷酸化及DNA含量。影像分析係基於細胞螢光信號來鑑別不同亞族群中之細胞。分析輸出係組蛋白H3磷酸化Ser10陽性細胞百分比。藉由使用Genedata Screener^®針對每一輸出曲線擬合至四參數邏輯來測定IC₅₀值。

在此分析中實質上如上文所述測試屬本發明範圍內之化合物。實例1之化合物顯示以1467±456nM(n=4)之IC₅₀抑制極光B。連同下文所提供之基於極光A磷酸化Thr288 MSD細胞之分析數據一起，實例1顯示對極光A之選擇性優於極光B。

細胞溶解物及組蛋白萃取製備

此係製備欲用於以下ELISA Meso Scale Discovery(MSD)極光A磷酸化抑制分析之細胞溶解物上清液之方案。根據MSD製造商說明書(http：//www.meso-scale.com/CatalogSystemWeb/Documents/Phospho_Aurora_A_Thr288_WCL.pdf)使用溶解緩衝液(Tris 25mM，pH 7.5；亮抑酶肽10μg/mL；胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶10μg/mL；甲苯磺醯基苯丙胺醯基氯甲基酮 (TPCK)10μg/mL；抑肽酶10μg/mL；β-甘油磷酸酯60mM；吐溫(Triton)X-100 1%；焦磷酸鈉(Na₂H₂P₂O₇)2.5mM；NaCl 150mM；EDTA 15mM；乙二醇四乙酸(EGTA)5mM；Nα-4-甲苯磺醯基-L-精胺酸甲酯鹽酸鹽(TAME)2mM；磷酸4-硝基苯基酯二鈉鹽六水合物(PNPP)15mM；苯甲脒5mM；釩酸鈉1mM；氟化鈉10mM；苯基甲烷磺醯氟(PMSF)50μg/mL；DTT 1mM；岡田酸1μM；微囊藻毒(microcystine)1μM)製備小細胞肺癌(SCLC)H446細胞溶解物。藉由Biorad DC-Protein分析(#500-0111,BioRad)量測上清液蛋白質濃度且使用25μL之1mg/mL細胞溶解物用於極光A磷酸化Thr288 MSD分析。

基於極光A磷酸化Thr288 MSD細胞之分析

該分析之目的係量測在細胞培養物中之極光A激酶抑制活性。使用96孔ELISA Meso Scale Discovery(MSD)板(#K150 JCD全細胞溶解物套組，Meso Scale Discovery，MD)實施該分析。

用150μL/孔之阻斷溶液-A(最終濃度3% BSA)阻斷MULTI-SPOT®磷酸化極光A Singleple板。在室溫下將該板振盪1小時並用MSD Tris洗滌緩衝液洗滌三次。將25μL之1mg/mL細胞溶解物分配至MULTI-SPOT®磷酸化極光MSD板中。在室溫下將該混合物再培育3小時並將該混合物用MSD Tris洗滌緩衝液洗滌三次。將檢測抗體(SULFO-TAGTM抗AuroraA磷酸化T288)稀釋50×於1% BSA抗體稀釋緩衝液(1份之3% BSA與2份之MSD洗滌緩衝液；0.02%之阻斷劑D-R)中，並在室溫下將25μl/孔添加至該板中，同時振盪1小時。用MSDTris洗滌緩衝液將該板洗滌3次，然後將150μL/孔2×MSD讀數緩衝液T添加至該板中，並在MSD SECTORTM Imager 6000儀器上對該等板進行讀數。抑制百分比係定義為[(100-(MSD值-MSD最大抑制值)/(MSD最小抑制值-MSD最大抑制值)]*100。「最大值」及「最小值」係由單獨的2μM陽性對照化合物阿裡色替(alisertib)與DMSO陰性對照界定。

在此分析中實質上如上文所述測試屬本發明範圍內之化合物。化合物實例1顯示在細胞中利用1小時化合物處理以1.4±1.1nM(n=2)之IC₅₀抑制極光A。數據顯示，實例1在細胞培養物中展示極光A激酶抑制活性。

腫瘤蛋白溶解物及組蛋白萃取製備

此係製備用於以下活體內標靶抑制(IVTI)分析中之異種移植物腫瘤溶解物及組蛋白萃取物之方案。將腫瘤樣品於液氮中進行冷凍並置於乾冰容器上之箔片及研缽及研杵上。用研杵研磨腫瘤組織樣品並將磨碎之腫瘤組織轉移至含有Lysing Maxtrix D珠粒(#6913-500；Biomedicals MP Lysing Maxtrix D)及0.6mL之溶解緩衝液(Tris 25mM,pH 7.5；亮抑酶肽10μg/mL；胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶10μg/mL；TPCK 10μg/mL；抑肽酶10μg/mL；β-甘油磷酸酯60mM；吐溫X-100 1%；焦磷酸鈉(Na₂H₂P₂O₇)2.5mM；NaCl 150mM；EDTA 15mM；EGTA 5mM；Nα-4-甲苯磺醯基-L-精胺酸甲酯鹽酸鹽(TAME)2mM；PNPP 15mM；苯甲脒5mM；釩酸鈉1mM；氟化鈉10mM；PMSF 50μg/mL；DTT 1mM；岡田酸1μM；微囊藻毒1μM)加上完全不含EDTA之錠劑(#1873580；Roche)之管中。將該等管於Bio101 fastPrep(#Bio 101；Thermo Seweant)中以速度6.0劇烈振盪30秒。根據MSD製造商說明書(http：//www.meso-scale.com/CatalogSystemWeb/Documents/Phospho_Aurora_A_Thr288_WCL.pdf)製備腫瘤溶解物。藉由Biorad DC蛋白質分析(#500-0111)測定上清液蛋白質濃度。

依照製造商說明書(http：//www.epigentek.com/docs/OP-0006.pdf)使用總組蛋白萃取套組(#OP-0006；EpiQuik)自上一離心步驟中之腫瘤組織沈澱物萃取總組蛋白。藉由Biorad DC蛋白質分析(#500-0111； BioRad)量測蛋白質濃度，並使用25μL之0.25mg/mL組蛋白萃取物蛋白用於IVTI組蛋白H3磷酸化Ser10分析。

極光A活體內標靶抑制(IVTI)磷酸化Thr288 MSD分析

該分析之目的係利用異種移植物腫瘤樣品量測活體內極光A激酶抑制。用96孔ELISA Meso Scale Discovery(MSD)板格式實施該分析。向MULTI-SPOT®磷酸化極光A Singleplex板(K150 JCD全細胞溶解物套組；Meso Scale Discovery，MD)裝填150μL/孔之阻斷溶液-A(最終濃度3% BSA)。在室溫下將該板振盪1小時並用Tris洗滌緩衝液洗滌三次。自上文腫瘤溶解物方案製備腫瘤溶解物達1mg/mL並將25μL/孔分配至MULTI-SPOT®磷酸化極光MSD板中。在室溫下將該混合物再培育3小時，並用Tris洗滌緩衝液洗滌洗滌3次。將存於1% BSA抗體稀釋緩衝液中之檢測SULFO-TAGTM抗AuroraA磷酸化T288抗體(抗體稀釋50×至具有1份之3% BSA加上2份之洗滌緩衝液之緩衝液中；0.02%之阻斷劑D-R)以25μL/孔之量添加至該板中，並在室溫下將該板振盪1小時。用Tris洗滌緩衝液將該板洗滌3次，將150μL/孔2×讀數緩衝液T添加至該板中，且然後在MSD SECTORTM Imager 6000儀器上立即讀數。抑制百分比係定義為[100-(化合物處理群組平均MSD讀數/媒劑群組平均MSD讀數)]*100。

在此分析中實質上如上文所述測試屬本發明範圍內之化合物。利用裸小鼠中之H446異種移植物模型(臨限有效劑量)在劑量反應研究中投予後3小時實例1之化合物顯示2.13mg/kg之TED₅₀。數據顯示，利用異種移植物腫瘤樣品在指定TED下，實例1展示活體內極光A激酶抑制。

極光B活體內標靶抑制(IVTI)組蛋白H3磷酸化Ser10 MSD分析

該分析之目的係利用異種移植物腫瘤樣品藉由測定組蛋白H3磷酸化Ser10抑制來量測活體內極光B激酶抑制活性，此乃因其係極光B 之直接下游激酶受質。用96孔ELISA Meso Scale Discovery(MSD)板格式實施該分析。將阻斷溶液-A(最終濃度3% BSA)以150μL/孔添加至MULTI-SPOT®組蛋白H3 4點滴板(目錄編號K150 EWD-3 JCD全細胞溶解物套組，Meso Scale Discovery，MD)中，並將在室溫下該板振盪1小時。在用MSD Tris洗滌緩衝液洗滌3次後，將用上文腫瘤溶解物方案製備達0.25mg/mL之組蛋白萃取物以25μL/孔分配至MSD板上。在室溫下將該混合物再培育3小時，用MSD Tris洗滌緩衝液洗滌3次。將檢測SULFO-TAG抗組蛋白H3磷酸化Ser10抗體稀釋50×至3mL 1% BSA抗體稀釋緩衝液(1ml 3% BSA與2mL MSD洗滌緩衝液；0.01% 之阻斷劑D-M)中，並將25μL/孔添加至該板中並在室溫下將該板振盪1小時。然後用MSD Tris洗滌緩衝液將板洗滌3次。將150μL/孔之2×MSD讀數緩衝液T添加至該板中。立即用MSD SECTORTM Imager 6000儀器對該板進行讀數。抑制百分比係定義為[100-(化合物處理群組平均MSD讀數/媒劑群組平均MSD讀數)]*100。

在此分析中實質上如上文所述測試屬本發明範圍內之化合物。在該分析中在劑量反應研究中以30mg/kg投予後3小時並在時間進程研究中以50mg/kg投予後1小時，實例1之化合物不提供50%以上組蛋白H3磷酸化Ser10抑制。結果表明，利用異種移植物腫瘤樣品在指定劑量下，實例1在活體內不抑制極光B。

利用SCLC NCI-H446裸小鼠異種移植物模型之抗腫瘤生長效力

該分析係在SCLC NCI-H446及SCLC NCI-H69裸小鼠異種移植物模型中量測活體內腫瘤生長抑制。根據實驗動物照護與使用方案實施所有活體內研究。對於異種移植物模型而言，如供應商所推薦維持人類小細胞肺癌NCI-H446細胞及人類小細胞肺癌NCI-H69細胞。收穫該等細胞，洗滌，並再懸浮於無血清培養基及基質膠(354234,Becton Dickinson)之1：1混合物中。然後將細胞以5×10⁶個細胞/小鼠皮下植入無胸腺裸雌性小鼠(Harlan Laboratories)之後脅中。藉由使用公式估算腫瘤體積：v=l×w2×0.536，其中l=較大量測直徑且w=較小垂直直徑。用SAS軟體(SAS Institutes公司，Cary，NC)分析數據。

當在裸小鼠中平均腫瘤體積達到150mm³時，藉由腫瘤體積將動物隨機分組，並於使用20%羥丙基β環糊精(HPBCD)/25mM磷酸鹽緩衝液pH 8之媒劑之調配物中投與測試化合物，其中用1N NaOH將最終pH調節至pH 9。每個媒劑及處理群組使用十隻動物。對於所獲取之每一時間點，將處理群組與對照媒劑群組比較。每一處理群組之腫瘤體積係以平均值連同標準誤給出。

在此分析中實質上如上文所述測試屬本發明範圍內之化合物。在小細胞肺癌NCI-H446異種移植物裸小鼠模型及在小細胞肺癌NCI-H69異種移植物裸小鼠模型中，實例1之化合物展示顯著抗腫瘤生長效力。

腫瘤體積之分析係基於Log 10及SpatialPower共變異數結構。

*：顯著性(p<0.05)；NA：不適用。

當經處理群組中之腫瘤體積係在基線腫瘤體積下或其以上(第16天)時，在第30天計算△T/C(%)。

公式為100*(T-T0)/(C-C0)，其中T及C分別係經處理或對照群組中之平均終點腫瘤體積。T0及C0係該等群組中之平均基線腫瘤體積。

當終點體積低於基線時，計算退化(%)。公式為100*(T-T0)/T0，其中T0係經處理群組中之平均基線腫瘤體積。

腫瘤體積之分析係基於Log 10及SpatialPower共變異數結構。

*：顯著性(p<0.05)；NA：不適用。

Claims

一種化合物或鹽，其選自由以下組成之群：(2S,4S)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[[3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸：
(2R,4R)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[[3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸：
以及其醫藥上可接受之鹽。
如請求項1之化合物或鹽，其係(2R,4R)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[[3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸：
或其醫藥上可接受之鹽。
如請求項2之化合物或鹽，其係(2R,4R)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[[3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸：
如請求項2之化合物或鹽，其中該醫藥上可接受之鹽係(2R,4R)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[[3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基-六氫吡啶-4-甲酸之第三丁胺鹽。
如請求項1至4中任一項之化合物或鹽，其用於療法。
如請求項1至4中任一項之化合物或鹽，其用於治療癌症。
如請求項6之化合物或鹽，其中該癌症選自由小細胞肺癌、結腸直腸癌、胃癌、前列腺癌、乳癌、子宮頸癌、頭頸癌、食道癌、卵巢癌、非小細胞肺癌及非霍奇金氏淋巴癌(non-Hodgkin lymphoma)組成之群。
如請求項7之化合物或鹽，其中該癌症係小細胞肺癌。
如請求項7之化合物或鹽，其中該癌症係前列腺癌。
如請求項7之化合物或鹽，其中該乳癌係三陰性乳癌。
如請求項7之化合物或鹽，其中該癌症係子宮頸癌。
如請求項7之化合物或鹽，其中該癌症係頭頸癌。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至4中任一項之化合物或鹽及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
一種如請求項1至4中任一項之化合物或鹽之用途，其用於製造用以治療癌症之藥劑。
如請求項14之用途，其中該癌症選自由小細胞肺癌、結腸直腸癌、胃癌、前列腺癌、乳癌、子宮頸癌、頭頸癌、食道癌、卵巢癌、非小細胞肺癌及非霍奇金氏淋巴癌組成之群。
如請求項15之用途，其中該癌症係小細胞肺癌。
如請求項15之用途，其中該癌症係前列腺癌。
如請求項15之用途，其中該乳癌係三陰性乳癌。
如請求項15之用途，其中該癌症係子宮頸癌。
如請求項15之用途，其中該癌症係頭頸癌。