JP6158183B2

JP6158183B2 - 複数の較正曲線を使用した光学機器の連続した非同期的オートフォーカスのためのシステム及び方法

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Publication number: JP6158183B2
Application number: JP2014528329A
Authority: JP
Inventors: クーパー，ジェレミー・アール; グッドウィン，ポール・シー; グッドソン，スティーブン・ジー
Original assignee: Amersham Biosciences Corp
Current assignee: Global Life Sciences Solutions USA LLC
Priority date: 2011-08-30
Filing date: 2012-08-29
Publication date: 2017-07-05
Anticipated expiration: 2032-08-29
Also published as: WO2013032393A1; EP2751607A1; EP2751607A4; US20110309231A1; US8558154B2; JP2014529100A

Description

本発明は光学機器に関し、特に、対物レンズと撮像対象上、内又は近傍の点又は表面との間の光軸に沿った一定の距離を維持する光学機器内の連続して非同期的に動作するオートフォーカスサブシステムに関する。

光学顕微鏡法及び他の光学ベースの方法は、数百年にわたって、科学研究から戦争行為に至るまで、多くの領域の人間の活動に利用されてきたが、マイクロプロセッサ、現代のコンピュータの使用及び分子生物学の出現によって、新規の光学機器類及び光学撮像技術の開発がますます加速してきている。例えば、現代の蛍光顕微鏡機器類に組み込まれた計算機構と組み合わせて、生細胞においてタンパク質の蛍光標識することにより、生細胞の生物学的要素の微細な詳細が、光学顕微鏡法のいわゆる「回折限界」よりも著しく低い分解能において撮像されることができる。

多くの新規の光学機器、光学機器の用途及び光学撮像技術は、光学ｚ軸に直交するｘ−ｙ平面内で長期間にわたって及び／又は撮像対象を走査している間、浅い焦点深度で高性能な光学系を精密に合焦することに依存する。例は、相対的に長い期間にわたって生体試料内の微弱放射蛍光色素分子を撮像することによって回折限界よりも低い分解能を達成するさまざまな光学顕微鏡技法及び、一定のｚ位置を維持しながらこれらの試料を顕微鏡の光路に対してｘ−ｙ平面内で並進させることによってこれらの試料内の平面を撮像するために生細胞及び他の生体試料を走査するための光学顕微鏡技法を含む。光学機器の焦点は、例えば、熱的及び電気機械的に不安定である結果として経時的に変化する場合があり、非常に精密な電気機械顕微鏡ステージでさえ、長い時間にわたって試料を走査している間又は試料からデータを収集している間にステージがｘ−ｙ平面内で並進すると、撮像する光学部品に対して上下する場合がある。精密光学機器類の設計者、製造者及び使用者は、高精度光学機器の焦点を、長時間にわたって及び、電気機械ステージを含む高精度光学機器のさまざまなサブコンポーネントが動作している間、安定させるシステム及び方法を模索し続けている。

米国特許第２０１１／０１０１２０３号

本発明の実施形態は、試料上、内又は近傍の特定の点又は表面における精密かつ安定した光学機器の焦点を維持するために、光学機器の焦点を連続的に監視し、光軸に沿った光学機器内の距離を調整する光学機器内のオートフォーカスサブシステムに関する。本発明の特定の実施形態は、それらが組み込まれている光学機器の他の部品及びサブシステムの動作に対して非同期的に動作し、複数の較正曲線を利用する。

蛍光顕微鏡内の光路を示す図である。蛍光顕微鏡内の光路を示す図である。蛍光顕微鏡内の光路を示す図である。所定期間にわたる試料内の、光軸に対する対物レンズの焦点位置又はｚ位置の望ましくない変動を示す図である。試料がｘ及び／又はｙ並進している間の、試料内の、光軸に対する対物レンズの焦点位置又はｚ位置の望ましくない変動を示す図である。従来の顕微鏡のオートフォーカスサブシステムを示す図である。従来のオートフォーカスモジュールの動作を示す制御フロー図である。従来のオートフォーカスモジュールの動作を示す制御フロー図である。連続的なオートフォーカスを示す制御フロー図である。図１Ａ〜図１Ｃ及び図３を参照して上記で説明した蛍光顕微鏡の電気機械ステージから独立したｚ軸走査を示す図である。図１Ａ〜図１Ｃ及び図３を参照して上記で説明した蛍光顕微鏡の電気機械ステージから独立したｚ軸走査を示す図である。図１Ａ〜図１Ｃ及び図３を参照して上記で説明した蛍光顕微鏡の電気機械ステージから独立したｚ軸走査を示す図である。小開口焦点検出器の動作の原理を示す図である。ピンホール開口ロータを示す図である。ピンホール開口ロータを示す図である。ピンホール開口ロータを示す図である。異なるタイプのオートフォーカスロータを示す図である。異なるタイプのオートフォーカスロータを示す図である。第３のタイプのオートフォーカスロータを示す図である。蛍光顕微鏡の光路内に組み込まれたオートフォーカスモジュールを示す図である。オートフォーカスモジュールのオートフォーカス処理サブコンポーネントによる、顕微鏡の対物レンズとカバースリップ界面との間の現在を距離を計算するための１つの手法を示す図である。オートフォーカスモジュールのオートフォーカス処理サブコンポーネントによる、顕微鏡の対物レンズとカバースリップ界面との間の現在を距離を計算するための１つの手法を示す図である。オートフォーカスモジュールのオートフォーカス処理サブコンポーネントによる、顕微鏡の対物レンズとカバースリップ界面との間の現在を距離を計算するための１つの手法を示す図である。オートフォーカスモジュールのオートフォーカス処理サブコンポーネントによる、顕微鏡の対物レンズとカバースリップ界面との間の現在を距離を計算するための１つの手法を示す図である。オートフォーカスモジュールのオートフォーカス処理サブコンポーネントによる、顕微鏡の対物レンズとカバースリップ界面との間の現在を距離を計算するための１つの手法を示す図である。オートフォーカスモジュールのオートフォーカス処理サブコンポーネントによる、顕微鏡の対物レンズとカバースリップ界面との間の現在を距離を計算するための１つの手法を示す図である。オートフォーカスモジュールのオートフォーカス処理サブコンポーネントによる、顕微鏡の対物レンズとカバースリップ界面との間の現在を距離を計算するための１つの手法を示す図である。オートフォーカスモジュールのオートフォーカス処理サブコンポーネントによる、顕微鏡の対物レンズとカバースリップ界面との間の現在を距離を計算するための１つの手法を示す図である。オートフォーカスモジュールのオートフォーカス処理サブコンポーネントによる、顕微鏡の対物レンズとカバースリップ界面との間の現在を距離を計算するための１つの手法を示す図である。強度値の累積和からの、光学機器の現在のｚ位置の計算を示す図である。一般的なリング開口を示す図である。単一要素のオートフォーカスロータを通じたｚ位置走査を示す図である。１０要素オートフォーカスロータの１０個のオートフォーカスロータ要素に関するオートフォーカス信号強度対ｚ位置曲線を示す図である。ｚ位置曲線のセットを数値的に特性化するための１つの方法を示す図である。図１８に示すｚ位置のいくつかに対応するｚ位置フィンガープリントデータ構造を示す図である。ｚ位置走査によって収集されたｚプリントをいかに較正曲線として使用して、その後光学機器のｚ位置を求めることができるかを示す図である。ｚ位置走査によって収集されたｚプリントをいかに較正曲線として使用して、その後光学機器のｚ位置を求めることができるかを示す図である。ｚ位置走査によって収集されたｚプリントをいかに較正曲線として使用して、その後光学機器のｚ位置を求めることができるかを示す図である。第２のｚ位置決定方法のための基礎を示す図である。ｚ位置走査中に取得されたオートフォーカスロータ要素ａ₁〜ａ₁₀に関するｚ位置曲線群を示す図である。ベクトルベースのオートフォーカスｚ位置調整方法を示す図である。図２３〜図２５を参照して説明したベクトルベースのオートフォーカス方法を使用した、３要素ベクトルに基づくｚ位置調整Δｚの計算を示す図である。光学機器の実際のオートフォーカスモジュールから得られるオートフォーカスロータ要素に対応する試料ｚ位置曲線を示す図である。三次元光学機器試料位置空間内のいくつかの選択点に対してｚ位置走査が行われる、粗調整方法初期化を示す図である。ベクトルベースのオートフォーカス方法の初期化の制御フロー図である。較正走査のセットを示す図である。光学機器のオートフォーカスモジュールに組み込まれる連続オートフォーカス方法の制御フロー図である。図３１の段階３１１０において呼び出されるオートフォーカスルーチンの制御フロー図である。図３２の段階３２１４において呼び出されるルーチン「最初の調整（ｆｉｒｓｔａｄｊｕｓｔ）」の制御フロー図である。ルーチン「２ベクトル調整（ｔｗｏｖｅｃｔｏｒａｄｊｕｓｔ）」の制御フロー図である。

図１Ａ〜図１Ｃは、蛍光顕微鏡内の光路を示す。光路及び光路を含む蛍光顕微鏡は、本発明の実施形態を説明するにあたってのコンテキストとしての役割を果たす。しかしながら、下記にも記載するように、説明する実施形態及びシステムは、多くの場合、特定の用途に使用するために説明する方法及びシステムのさまざまなパラメータ及び較正を調整することによって、広範な種々のタイプの光学機器内に組み込まれてもよい。

蛍光顕微鏡の光路は、励起光源１０２、一般的には可視光又はＵＶ光レーザ、励起光１０６を１つ以上の対物レンズ１０８内に反射させる多色ミラー１０４を含み、当該対物レンズは、励起光が通過する開口１１６を有する機械ステージプラットフォーム１１４上に存在するカバースリップ１１２の遠位面に載った試料内の点１１０上に励起光を合焦させる。励起光は、試料内の蛍光体からの蛍光放出を促す。一般的に励起光よりも長い波長を有する蛍光体からの放出光は、戻って１つ以上の対物レンズ１０８及び多色ミラー１０４を通って１つ以上のチューブレンズ１１８に至り、当該チューブレンズは、蛍光体が放出した光を、光検出器１２０、多くの場合は電荷結合素子（「ＣＣＤ」）検出器上に合焦させる。光検出器が測定した空間強度は、撮像対象の画像を生成するためにコンピューティングサブシステムによって電子的に処理され、画像は、電子メモリ及び大容量記憶デバイスに記憶され、電子表示デバイス上で表示するためにレンダリングされる。

多色ミラー１０４は、励起光を含む短い波長の光を反射し、また、同様に赤外光のような非常に長い波長の光を反射することもできるが、蛍光体標識試料内の蛍光体が放出する光の波長を含む波長範囲内の可視光に対しては透過性である。同様に、励起光１０６の最初の経路上のダイクロイックミラー１２２は、下記により詳細に説明するように、相対的に短い波長の励起光に対しては透過性であるが、長い波長の赤外光を反射する。ステージプラットフォーム１１４と、ステージ駆動部品１２４と、ｘ並進機構１２６、ｙ並進機構１２８及びｚ並進機構１３０とを含む電気機械ステージは、対物レンズ及び機器光路に対してｘ方向、ｙ方向及びｚ方向に試料を移動させるために使用される。なお、光軸又はｚ軸は、図１Ａにおいて、試料点１１０から対物レンズ、多色性ミラー及びチューブレンズを通って検出器１２０上の対応する画像点１３２まで垂直に延在する光経路と平行である。

図１Ｂでは、ｘ並進機構１２６が、ステージプラットフォーム１１４を右に小距離＋Δｘ１４０だけ移動させるために作動されており、その結果として、ｘ方向における、試料内の焦点についての同じ大きさであるが、反対のシフト−Δｘ１４２が生じる。言い換えれば、以前の焦点１１０及び新しい焦点１４４は、ｘ方向において距離＋Δｘだけステージが並進した後は大きさ｜Δｘ｜の距離１４２だけ離れている。図１Ｃは、図１Ｂと同様の様式で、ｚ方向又は光軸方向に小距離−Δｚ１４６だけ機械ステージ１１４を移動させるためにｚ並進装置１３０を作動させていることを示しており、その結果として、逆方向であるが同じ大きさ１４８の距離＋Δｚだけ試料内の焦点が並進している。この説明では、図１Ａに示す、検出器１２０とチューブレンズ１１８との間の距離が、少なくとも、試料から画像収集している間の期間にわたって一定であり、それゆえ、対物レンズの焦点を固定していることが仮定されている。

生細胞撮像を含む多くの蛍光顕微鏡法用途において、高分解能画像の取得は、試料内の蛍光体標識の画像を再構成するための適切な情報を、弱放射蛍光体から収集するのに十分な期間の間、対物レンズに対して固定位置で特定の試料を撮像することに依存する。他の用途では、ｚ方向又は光軸方向において一定の焦点又は対物レンズと試料との間の一定の距離を維持しながら、対物レンズに対してｘ−ｙ平面内で電気機械ステージを移動させることによって、試料が走査される。両方の場合において、対物レンズと試料内の点又は表面との間の距離を、ある期間にわたって及び／又は機械ステージがｘ及びｙ方向に並進する間、精密な固定値に維持する必要がある。

図２Ａ〜図２Ｂは、試料がｘ及び／又はｙ並進している間の、試料内の、光軸に対する対物レンズの焦点位置又はｚ位置の望ましくない変動を示す。両方の図において、対物レンズと試料との間の所望の距離は、点線２０２及び２０４で示される。対物レンズと試料との間の実際の距離は、両方の図において、実線曲線２０６及び２０８として示される。対物レンズと試料内の点又は表面との間で固定距離を維持するために最良の努力をしても、ｚ方向又は光軸方向における対物レンズと試料との間の実際の距離は、所定期間にわたって、また、ｘ及び／又はｙ並進中に変動する。これらの変動には多くの異なる原因がある。顕微鏡環境における熱不安定性の結果として、例えばｚ軸成分を有する方向に光学機器が膨張及び収縮する可能性がある。光学機器は、温度制御チャンバによって囲まれていることが多いが、光源、モータ及び他のそのような部品を含む光学機器の部品は、直ちに補償されることができない熱を発生し消費する場合がある。空気圧及び他の環境パラメータが変動することによっても、対物レンズと試料との間の距離が変動する場合がある。電気機械ステージのｘ−ｙ平面が、ｘ−ｙ平面における並進による走査中に、光軸に対してたとえわずかでも非直交方向に向くと、試料もまた、対物レンズに対してｚ方向に移動する。

図３は、従来の顕微鏡のオートフォーカスサブシステムを示す。オートフォーカスサブシステムは、所定期間にわたって、また、試料がｘ−ｙ平面内で移動する間に、試料内で光軸に対して焦点位置を安定させるために開発された。図３は、図１Ａ〜図１Ｃで使用したのと同じ説明図の慣例を使用する。図３に示すオートフォーカスサブシステムは、励起光源１０２と異なるオートフォーカス光源３０２を使用する。多くのシステムにおいて、オートフォーカス光源３０２は、赤外光３０４を放出し、その一部分は、ビームスプリッタ３０８によって下３０６に反射されてダイクロイックミラー１２２に至り、ダイクロイックミラー１２２は、赤外光を、励起源１０２が放出する光がとる経路と同じ光路に沿って、図３の水平方向１０６に反射し、水平方向から、赤外光は、多色ミラー１０４によって反射され、対物レンズ１０８を通って試料１１０に至る。赤外光は、カバースリップ３１０の遠位面の面と試料媒質との間の界面で散乱し、後方散乱した赤外光の一部分は、対物レンズ１０８及び光路要素１０４、１２２及び３０８を通って戻る。後方散乱した赤外光の一部分は、ビームスプリッタ３０８を通過してオートフォーカスモジュール３２０に至る。加えて、オートフォーカス光源３０２及びオートフォーカス検出器モジュール３２０の位置は、同じ結果でビームスプリッタ３０８の周りで逆にすることができ、照明源及びオートフォーカス光源の相対位置は、さまざまな代替的な構成において、他の光路部品の特性の変化とともに変更してもよい。なお、「カバースリップ」という語句は、顕微鏡で使用されることが多い従来のカバースリップ並びにさまざまな異なるタイプの試料チャンバ及び試料保持デバイスのいずれかの表面を含むことを意図される。試料に対して固定位置を有するさまざまな界面のいずれかは、１つ以上の対物レンズに対して試料平面のｚ位置変位を検出し補正するための、後方散乱したオートフォーカス光用の供給源として使用することができる。

オートフォーカスモジュール３２０は、ステージ駆動部１２４を定期的に制御して、ある範囲のｚ位置３２２にわたって光軸に沿ってステージを並進させ、各ｚ位置において光の強度を記録し、少なくとも概念的に、強度対ｚ位置プロット３２４を生成する。カバースリップの遠位側が対物レンズの焦点と一致するときに、後方散乱光の最大強度が起こるため、対物レンズの焦点がカバースリップの遠位側と一致したところに対応するｚ範囲内のｚ位置は、強度曲線のピーク３２８の下にあるｚ位置３２６によって示される。カバースリップと試料媒質の界面が、そこで光学機器の焦点に一致するステージプラットフォームの現在のｚ位置を求めるために、定期的なｚ軸走査を実効するさまざまな異なるタイプのオートフォーカスモジュールが存在する。オートフォーカスモジュールは、その後、焦点を試料内の所望のｚ軸位置に位置決めし直すために、電気機械ステージを、焦点の求められたｚ軸位置に対して所望のｚ軸位置に駆動することができる。

図４及び図５は、従来のオートフォーカスモジュールの動作を示す制御フロー図を提供する。図４は、従来のオートフォーカス動作の高レベルの制御フロー図を提供する。オートフォーカス動作は、段階４０２及び４０４を含む連続ループである。段階４０２において、オートフォーカス動作は、次のオートフォーカス動作を引き起こすオートフォーカスタイマの満了又は光学機器操作者からの手動入力のような、次のオートフォーカスイベントが起こるまで待つ。その後、段階４０４にて、対物レンズの焦点が、試料媒質を有するカバースリップの遠位界面にそこで一致する現在のｚ位置を求めるために、図３を参照して上記で説明したように、ある範囲のｚ位置にわたる走査を実行するためのルーチン「オートフォーカス（ａｕｔｏｆｏｃｕｓ）」が呼び出される。オートフォーカス動作は、連続ループとして図４に示されるが、ルーチン「オートフォーカス」に対する呼び出しによって表される実際のオートフォーカス動作は、時間的に離散した間隔で行われること及び、オートフォーカス動作は破壊的であり、一般的に、撮像又は電気機械ステージの並進を伴う他の動作を中断することが留意されるべきである。

図５は、図４の段階４０４において呼び出されるルーチン「オートフォーカス」の制御フロー図を提供する。段階５０２〜５０５のｆｏｒループにおいて、オートフォーカスモジュールは、ある範囲のｚ位置を通して走査するようにステージ駆動部を制御する。範囲内の各ｚ位置について、オートフォーカスモジュールは、段階５０３において、機械ステージをｚ位置に駆動し、段階５０４において、後方散乱したオートフォーカス光の強度を測定する。後方散乱したオートフォーカス光の強度が、ｚ位置の範囲内の各位置について測定されると、段階５０２〜５０５のｆｏｒループにおいて、ルーチン「オートフォーカス」は、段階５０６にて、後方散乱光の最大強度に対応するｚ位置を計算し、その後、段階５０８において、段階５０６において計算されたｚ位置に関して計算されたｚ位置に機械ステージを駆動する。例えば、試料内の１０ミクロンの一定ｚ位置に焦点が維持されることが望ましい場合があるため、オートフォーカスは、光学機器が段階５０８においてカバースリップの遠位側で合焦される、１０ミクロンに現在のｚ位置を加えた値に等しいｚ位置を計算し、電気機械ステージをその位置に駆動する。

図３〜５を参照して上記で説明した従来の又は慣例のオートフォーカスサブシステムは、多くの問題及び欠点を伴う。１つの重要な問題は、オートフォーカスサブシステムの動作が、上記で述べたように、光学機器によって実行されるいかなる他の動作をも中断することである。例えば、光学機器が、固定ｚ位置において試料のｘ−ｙ平面走査を行っているとき、各オートフォーカス動作は、走査中のｚ位置の安定性を監視するために、走査を中断する。オートフォーカシングのために利用されるｚ軸走査が、画像を取得するために必要とされる時間に対してかなりの時間を付加する場合がある。従来のオートフォーカスサブシステムに関連する第２の欠点は、オートフォーカス動作が、時間的に離散した間隔で実行されるため、機器のｚ軸位置が、オートフォーカス間隔の間にドリフトする場合があることである。ｚ軸ドリフトを最小限に抑えるにするために、オートフォーカス動作間の間隔を減少させる結果として、データ収集時間がさらに増加することになる。オートフォーカス動作に関連するなお別の問題は、オートフォーカス動作自体が、ある範囲のｚ位置を通して電気機械ステージを移動させることによって所定期間にわたって実行されるため、機器及び環境の不安定性がオートフォーカス動作中に変化し、機器の焦点位置を求め、ｚ軸ドリフトを補正することができる精度が大幅に減少する場合があることである。

本発明の特定の実施形態は、電気機械ステージの並進及び画像採取動作を含む、他の光学機器部品及びサブシステムの動作に対して非同期的に動作する、連続動作する高速オートフォーカスモジュールに関する。図６は連続的なオートフォーカスを示す制御フロー図を提供する。非同期オートフォーカス動作は、段階６０２〜６０４の連続実行ループによって表される。段階６０２において、カバースリップと試料媒質との間の界面のｚ軸位置は、一実施形態では、この界面からの後方散乱光がそこでオートフォーカスモジュール光検出器上の最大強度を生成するｚ軸位置を計算することによって連続して監視される。対物レンズに対する界面のｚ軸位置が変化すると又は、対物レンズに対する別のｚ軸位置が変化すると、段階６０４において、電気機械ステージが小さい補正距離Δｚだけ駆動されて、対物レンズと試料内の特定の地点又は表面との間の一定距離が維持される。オートフォーカスモジュールは、光学機器の他の部品の動作を中断することなく連続して動作するため、データ収集時間は影響を受けず、光学機器の焦点は、従来のオートフォーカスモジュールよりも安定してかつより高い精度で維持することができる。各オートフォーカス動作が必要とする時間量は、従来のオートフォーカスモジュールの場合よりずっと少なく、それゆえ、オートフォーカス動作中に起こる可能性のあるドリフトの最大量は、説明されている実施態様においては従来のオートフォーカスモジュールの場合よりも少ないために、オートフォーカスモジュールが、カバースリップの試料媒質との遠位界面のｚ軸位置を連続かつ高速に再計算するため、カバースリップの界面に対する対物レンズのｚ軸位置は、従来のオートフォーカスモジュールと比較してより高い精度で連続して求めることができる。

図７Ａ〜図７Ｃは、図１Ａ〜図１Ｃ及び図３を参照して上記で説明した蛍光顕微鏡の電気機械ステージから独立したｚ軸走査を示す。図７Ａ〜図７Ｃは、図１Ａ〜１Ｃ及び図３に示すシステムと同様の仮想システムを示し、オートフォーカスモジュール内の検出器は、試料が対物レンズに対してｚ方向に移動すると同時にチューブレンズに対して移動することができる。図７Ａでは、カバースリップの内部界面上の点が、１つ以上の対物レンズ７０６から特定のｚ軸位置ｚ₀７０４に保たれる。カバースリップの内面からの後方散乱光は、合焦レンズ７１４に対して、固定されたｚ軸位置ｚ_d７１２に保たれた検出器７１０上に合焦される。図７Ｂでは、機械ステージは、対物レンズに接近しており、カバースリップの内部界面７０２と対物レンズ７０６との間の距離は、図７Ａに示す初期距離ｚ₀７０４ではなく、現時点ではｚ₀’７２０である。オートフォーカスモジュール内の検出器７１０は、内部カバースリップ界面７０２からの後方散乱光が検出器上に合焦したままになるように、合焦レンズ７１４から対応距離だけ離れるように移動している。同様に、図７Ｃに示すように、ステージが、図７Ａの場合より対物レンズから遠くに、内部カバースリップ界面と対物レンズとの間の距離ｚ₀”７２４だけ移動すると、検出器７１０は、合焦レンズ７１４に向かってより近くに移動する必要があり、その結果、検出器及び合焦レンズは、内部カバースリップ界面からの後方散乱光が検出器７１０上に合焦したままになるように、より短い距離ｚ_d”７２６だけ分離する。

ｚ軸走査は、ステージプラットフォームを対物レンズに対してｚ方向に移動させることによって実行することができるだけでなく、オートフォーカスサブシステムの光軸に沿ってオートフォーカスモジュール合焦レンズに対してオートフォーカスモジュール検出器を移動させることによっても実施することができる。検出器が、オートフォーカスモジュール内で合焦レンズに対してある範囲のｚ位置にわたって移動すると、その範囲内の１つのｚ位置が、オートフォーカスモジュール内の合焦レンズの焦点に対応することになり、それは、光学機器の光軸内の、対物レンズとカバースリップの界面との間のｚ方向の現在の距離に対応する。オートフォーカスモジュールが検出し補正しようとする対物レンズとカバースリップ界面との間の距離の変化は、カバースリップ界面からの後方散乱光がオートフォーカス検出器上のそこに合焦する合焦レンズの焦点距離の変化に反映される。そのため、合焦レンズに対して、オートフォーカスモジュール内でｚ軸方向に物理的又は論理的に移動でき、カバースリップ界面からの後方散乱光が検出器にいつ合焦したかを判定できる検出器は、対物レンズとカバースリップの界面との間の現在の距離ｚ_oに対応する、オートフォーカスモジュール内での、合焦レンズに対する検出器の位置ｚ_dを求めるのに使用することができる。これは、対物レンズとカバースリップの界面との間の距離ｚ₀についての絶対値を、以下の関係によって求めることができる。

比例定数αは、オートフォーカスモジュール及び光学機器が共有する光路の幾何形状並びにオートフォーカスモジュール合焦レンズ及び光学機器の１つ以上の対物レンズの特性から求めることができる。

図８は、小開口焦点検出器の動作の原理を示す。図８では、３つの異なる合焦光ビームに関して不透明材料内の小円形開口を８０２、８０４及び８０６で示している。第１の光ビームは、円形開口８１２の下の点８１０に合焦し、その結果として、光ビームの一部分が、不透明材料の裏側に入り、円形断面８１４を有する光ビームの中心円錐部だけが円形開口を通過する。光ビームが不透明材料によって部分的に遮断されない場合、焦点から円形断面８１４と同じ距離にある、光ビームの円形断面８１６は、より大きな径及び面積を有することになる。そのため、開口を通過した後の光の強度の減少は、円形断面８１４の面積と円形断面８１６の面積との比に比例する。光ビームが、図８の例８０４の場合と同様に、開口に一致する点に合焦するとき、入射光のすべてが、開口を通過し、開口を通過した光の強度は、開口を通過する前の光ビームの強度に等しい。入力光の焦点が、図８の第３の例８０６で示すように開口よりも上にくると、焦点の前の入力光の一部分が、不透明材料の裏側に入り、したがって、事例８０２の場合と同様に、合焦された光ビームの一部分８２０だけが、開口を通過する。そのため、小円形開口の後ろに配置された、小円形開口を通過する光ビームの強度を測定する検出器は、入力合焦光ビームの焦点が開口内に入るときを示すために使用することができる。例えば、光検出器が検出する強度対円形開口に対する合焦レンズのｚ位置のプロットは、プロット８２４の水平軸上の点としての、光が開口内に合焦レンズによって合焦される、合焦レンズに対するピンホール開口のｚ＝０８２６のｚ位置が、測定強度のピーク８２８に対応することを示す。

図８に示すように、検出器がピンホール開口の後ろの適切な距離に配置された光検出器を備える、図７Ａ〜図７Ｃを参照して説明した、合焦レンズに対して検出器を移動させるための機械的駆動部は、カバースリップ界面から後方散乱される光の焦点に対応するピンホール開口と合焦レンズとの間の距離ｚ_dを確定するために使用され得る。しかしながら、機械的に移動可能な検出器は、高価であり、光学機器によるｚ方向における走査に関連する同じ時間遅延を受けることになる。図７Ａ〜図７Ｃの場合と同様にｚ方向において走査することができる焦点検出器を使用するのではなく、本発明の実施形態は、固定された光検出器及び高速に並進するピンホール開口又は高速で増分的に拡大する合焦ビームを利用して、本発明の実施形態を表すオートフォーカスモジュール内でのｚ軸走査を実行する。

図９Ａ〜図９Ｃはピンホール開口ロータを示す。ピンホール開口ロータ９０２は、オートフォーカスモジュールの合焦レンズ９０４と、光検出器に入る光の強度を測定する、オートフォーカスモジュール内の光検出器９０６との間に挿入される。ピンホール開口ロータ９０２は、いくつかの垂直円柱シャフトを含み、垂直円柱シャフトが合焦レンズと光検出器との間である位置まで回転し、図９Ａの垂直円柱シャフト９１８のように合焦レンズ及び光検出器と整列すると、垂直円柱シャフトを通して、合焦レンズ９０４から光検出器９０６へ光が通る。各垂直円柱シャフトは、垂直円柱シャフト９１４内に中心ピンホール開口９２２を有する不透明ディスク９２０のような、中心ピンホールを有する不透明ディスクを含む。不透明ディスクは、異なる垂直円柱シャフトのそれぞれにおいて、ピンホール開口ロータの上部面から異なる距離に位置する。図９Ａに示すように、ロータの上部面とピンホール開口との間の距離は、垂直円柱シャフトの数値ラベルが増大するにつれて直線的に増大し、ピンホール開口ロータ９０２の垂直円柱シャフト内でピンホール開口のある範囲のｚ軸位置を形成する。ピンホール開口ロータ９０２は、合焦レンズ９０４から光検出器９０６に光を伝送するために、特定の垂直円柱シャフトがいつ位置決めされるかを決定するために、オートフォーカスモジュール内のインデックス検出器が読み取ることができる少なくとも１つの物理的インデックス９２６を含む。物理的インデックス９２６の位置の検出及びピンホール開口ロータの回転速度の知識をともに使用して、ピンホール開口ロータが電気モータによって一定速度で回転するときに、合焦レンズから光検出器に光を通すために、各垂直円柱シャフトが整列する時間を計算することができる。物理的インデックスは、磁気ディスク、発光ダイオード、反射板又は他のタイプの物理的インデックスであってもよく、その位置は、物理的インデックスが特定の位置を通って回転するときに、電磁コイル、光検出器又はレーザ／光検出器のようなインデックス検出器によって迅速に求めることができる。

図９Ｂは、ｚ軸に平行な方向で見たピンホール開口ロータを示す。第１の垂直円柱シャフト９４０が、参照位置Ｒ９４２において合焦レンズ及び光検出器と整列すると、残りの垂直円柱シャフトｈ₁〜ｈ_n-1は、整列した垂直円柱シャフト９４０に対して増大する回転角度θ₁〜θ_p+1で位置決めされる。ピンホール開口ロータの回転角度が水平軸９６０に対して０〜３６０°の範囲にわたってプロットされる図９Ｃに提供されるプロットにおいて、黒丸９６２などの黒丸は、左手垂直ｚ位置軸９６４に対してプロットされた、光検出器に対する各ピンホール開口のｚ位置を示し、白丸９６６などの白丸は、右手垂直強度軸９６８に対してプロットされた、光検出器が検出した強度を示す。ピンホール開口ロータが０°（図９Ｃの９７０）から３６０°（図９Ｃの９７２）まで回転するにつれて、現在のところ整列した垂直円柱シャフト内のピンホール開口と光検出器との間の距離は増大し、一方、光検出器における測定強度は、特定のピンホール開口−光検出器距離ｚ_d９７６に対応する特定の回転角度９７６においてピーク９７４を持つ。そのため、回転するピンホール開口ロータ９０２と固定位置の光検出器９０６との組合せを使用して、測定強度が最大になるピンホール開口と合焦レンズとの間の距離ｚ_dを求めるために、オートフォーカスモジュール内で、高速にかつ反復してｚ軸位置を通して走査することができる。その距離は、上述したように、光学機器内の対物レンズとカバースリップの界面との間の距離に関連する。

図１０Ａ〜図１０Ｂは、異なるタイプのオートフォーカスロータを示す。図１０Ａに示すように、図９Ａの場合と同様に、ピンホール開口ロータの垂直円柱シャフト内で異なる距離にピンホールを配置するのではなく、経路延長ロータ１００２は代わりに、経路延長ロータの円柱垂直シャフト内に、さまざまな高さ又は厚さのガラス又は別の透明材料の中実円柱ロッドを含む。代替的に、さまざまな高さを有するのではなく、中実円柱ロッドは、等しい高さを有してもよいが、異なる屈折率を有する異なる材料から構成されてもよい。本質的に、これらは、さまざまな程度の焦点延長又は焦点延長長さを提供するディスク状窓と考えることができる。図１０Ａでは、焦点延長窓は、経路延長ロータ１００２の円柱垂直シャフト１００６内の窓１００４のような平行線模様部で示される。経路延長ロータは、連続する垂直円柱シャフトが、合焦レンズ１０１０と、光検出器１０１４の上に位置決めされたピンホール開口１０１２との間の光路に整列するように回転する。図１０Ｂに示すように、空気の屈折率ｎ₁より大きい屈折率ｎ₂を有する材料の透明円柱ロッドは、透明円柱ロッドがないときにビームが有することになる焦点１０２４から、円柱ロッドの高さ１０２８に比例する距離１０２６だけ、合焦ビームの焦点１０２２の距離を延長するように、入力合焦ビーム１０２０を屈折させる。そのため、経路延長ロッド１００２内に増加する厚さ又は増加する屈折率の窓を含むことによって及び、窓を含む垂直円柱シャフトを通して連続して走査するようにロータを回転させることによって、経路延長ロータは、オートフォーカスモジュール内でｚ軸走査を実行するために、ちょうど図９Ａのピンホール開口ロータ９０２のように使用することができる。経路延長ロータの回転は、図９Ａのピンホール開口ロータ９０２についてのプロット９Ｃと同様の、回転角度に関するｚ軸／強度プロットを生成する。

図１１は、第３のタイプのオートフォーカスロータを示す。このロータは、図９Ａに示すピンホール開口ロータと同様であるが、一連の垂直円柱シャフトを使用するのではなく、ロータ１１０４内のほぼ円形のスロット１１０２が使用され、螺旋スリット開口１１０６及び周囲の不透明な螺旋状に形成された材料が、最大ｚ位置１１０８から最小ｚ位置１１１０までｚ軸位置が連続して下がる連続スリット開口を形成する点が異なっている。さらなる実施形態では、スリット開口ロータの外側部に対してスリット開口ロータの内側部を保持するために、スポーク状の部材が使用される。

図９Ａ〜図１１を参照して上述したさまざまなオートフォーカスロータは、開口のｚ位置を一様に増減させること又は窓厚さを一様に増減させることを特徴とし、経路延長ロータの場合、回転又は変位角度とともに、図９Ａの垂直シャフト９１７と９１８との間のピンホール開口のｚ位置間の不連続性などの単一の不連続性を有する。しかしながら、特に物理的インデックスが各垂直円柱シャフトを識別するために使用されるとき、ｚ位置又は窓厚さは、回転角度とともに任意に変更され、測定される強度は、マッピングテーブル又は関数によってｚ位置にマッピングすることができる。１つだけ又は少数の物理的インデックスが使用される場合でも、ロータの各変位角度における垂直シャフト内の窓厚さ又は開口のｚ位置が分かっており、メモリ内で又は大容量記憶装置上で利用可能であることを条件として、窓厚さ又はｚ位置の任意の配置を、オートフォーカスサブシステムによって計算的に管理することができる。本発明のいくつかの実施態様では、複数の垂直シャフトは、同一の窓又は開口の同一のｚ位置を含んでもよく、場合によっては、ｚ位置又は窓厚さは、ロータ回転に伴って窓厚さ又はｚ位置の不連続性が存在しないように正弦波的に変動してもよい。

図１２は、蛍光顕微鏡の光路内に組み込まれたオートフォーカスモジュールを示す。図１２は、図１Ａ〜図１Ｃ、図３及び図９Ａ〜図１１で使用したのと同じ説明図の慣例を使用する。オートフォーカスモジュールは、合焦レンズ１２０２と、電気モータ１２０６によって回転する軸シャフトに搭載されたオートフォーカスロータ１２０４と、ロータインデックス検出器１２０８と、光検出器１２１０と、合焦レンズ１２０２からロータ１２０４を通って光検出器１２１０上に至る光の測定強度に基づいてｚ軸位置を連続して計算するオートフォーカス処理部品１２１２とを含む。本発明のいくつかの実施態様において、ロータは、１０００回転／分を超える速度で回転することができ、対物レンズとカバースリップ界面との間の距離の計算を、１０回／秒以上のレートで計算することができる。ロータ１２０４は、図９Ａ〜９Ｃを参照して上述したピンホール開口ロータ、図１０Ａ〜図１０Ｂを参照して上述した経路延長ロータ、図１１を参照して上述したスリット開口ロータ又は、単独で若しくはピンホール開口と組み合わせて、合焦レンズ１２０２と光検出器１２１０との間の光路上で光検出器に対して固定距離において、オートフォーカス光源３０２によって生成され、カバースリップ界面３１０から散乱されるオートフォーカス光のｚ軸走査を実行する別のタイプのロータであってもよい。オートフォーカス処理部品１２１２は、対物レンズ１０８とカバースリップ界面３１０との間の距離が一定のままであるように機械ステージを連続して位置決めし直すために、連続してΔｚ補正を計算し、Δｚ並進指令をステージ駆動部１２４に発行する。オートフォーカス処理部品は、マイクロプロセッサ、論理回路又はマイクロプロセッサ及び論理回路並びにオートフォーカスサブシステム動作に関連するデータを記憶する電子メモリの組合せを含む。上述したように、記載のオートフォーカスモジュールは、カバースリップ界面から後方散乱する光又は試料に対して固定位置を有する別の界面から後方散乱した光を使用して、対物レンズとカバースリップ界面との間のｚ方向の距離を計算するが、記載のオートフォーカスモジュールを使用して、光学機器のチューブレンズ及び検出器に対する対物レンズの焦点を、試料内の任意に選択された位置に安定して維持することができる。ここでも、「カバースリップ界面」及び「カバースリップ」という語句は、オートフォーカスシステムが後方散乱オートフォーカス光源として使用することができるさまざまなタイプの界面の一切を幅広くカバーすることを意図される。なお、本発明の一実施形態を示すオートフォーカスモジュールを、さまざまな方法で光学機器に組み込んでもよい。多くの場合、オートフォーカスモジュールは、指定された又は計算された期間、オートフォーカスを実施するように、手動で又は自動で作動することができる。他の場合には、オートフォーカスサブシステムは、特定のタイプの画像取得モードの間にプログラム的に作動されてもよい。すべての場合に、オートフォーカスサブシステムは、光学機器の通常のｚ並進中又は他のときに、手動で又は自動で係合解除することができる。

図１３Ａ〜図１３Ｉは、オートフォーカスモジュールのオートフォーカス処理サブコンポーネントによる、顕微鏡の対物レンズとカバースリップ界面との間の現在を距離を計算するための１つの手法を示す。方法は、シフトレジスタのアレイ１３０２、さらなるレジスタのアレイ１３０４、加算演算子のアレイ１３０６、３つのさらなるレジスタ１３０８〜１３１０、光検出器入力１３１２及びロータインデックス検出器入力１３１４を利用する。レジスタ及びシフトレジスタのレジスタ部品は、記載のコンピューティングサブシステムにおいて、光検出器が報告する最大の値を持つ強度値の３倍に等しい数値を含むために、適切なビットサイズを有する。一般に、１６ビット又は３２ビットレジスタが、正確にｚ位置を計算するために十分なサイズである。

回路及び／又はファームウェア又はソフトウェアにおいて具現化される、図１３Ａ〜１３Ｉに示すｚ位置計算ロジックは、オートフォーカスモジュール内のロータの回転周波数に等しい周波数で、対物レンズに対するカバースリップ界面の相対位置ｚを計算する。光検出器入力１３１２は、特定の時点で光検出器が検出した光の強度を表す数値である。インデックス検出器入力１３１４は、時点と特定のシフトレジスタとの間のマッピングを選択するとともに、並列シフト演算、並列加算演算及び、オートフォーカスモジュール内のロータの回転周波数でｚ位置をともに計算する他の演算を実行する時点を選択する。

計算は、並列性が高く、非同期態様を含む。図１３Ｂ〜１３Ｄに示すように、オートフォーカスモジュール内のロータが回転するとき及び、ロータの特定の円柱穴がオートフォーカスモジュールの光学経路と整列する時点を、インデックス検出器が確定するとき、光検出器の強度値は、各４レジスタ式シフトレジスタの最初のレジスタに入力される。図１３Ｂでは、第１のロータシャフトに対応する強度値α１が、レジスタ１３２０〜１３２３を備える第１のシフトレジスタの第１のレジスタ１３２０内に置かれる。図１３Ｄでは、ロータが完全に一周し、その結果、強度値が、シフトレジスタのアレイの第１のレジスタのすべてに置かれることになる。その後、１回転の完了時に、並列シフトレジスタが、図１３Ｅに示すように、値のすべてを１つの場所だけ右にシフトさせる。こうして、シフトレジスタのアレイ内の値の列１３２４が、並列シフト演算によって、図１３Ｅの列１３２６にシフトされる。レジスタの最終列１３２８内の値は破棄される。図１３Ｆに示すように、次の一連の強度値でシフトレジスタのアレイ内の第１の列１３２４のレジスタを満たすと同時に起こる、図１３Ｅに示す並列シフト演算に続いて、並列加算演算１３０６が作動して、各４レジスタ式シフトレジスタ内の最後の３つのレジスタの和が計算され、その和が、レジスタの列１３０４に置かれる。加算プロセスは、シフトレジスタのアレイ内でのレジスタの第１の列１３２４への新しい光検出器の値の転送と非同期に、並列に実行される。加算が完了すると、レジスタの列１３０４内の最大検出強度に対応する、ある範囲のｚ軸位置内のｚ軸位置を計算するために、マイクロプロセッサ実施ルーチンが呼び出される。なお、このプロセスは、ロータの３つの最新の走査にわたって平均される。計算されたｚ軸位置は、レジスタ１３０８内に置かれて、図１３Ｇに示すように、対物レンズとカバースリップ界面との間の、ｚ方向の現在の距離を示す。その後、図１３Ｈに示すように、現在のｚ位置が、レジスタ１３０９に記憶される所望のｚ位置から減算されて、レジスタ１３１０に記憶されるΔｚ補正が生成され、Δｚ補正が、その後、ステージ駆動部に出力される。なお、Δｚ補正の計算は、光検出器入力から得られる強度値の次のセットが並列シフトレジスタ式レジスタの第１の列１３２４を満たすのと並列に進む。強度値の次のセットが得られると、図１３Ｉに示すように、並列シフトレジスタが作動して、次のΔｚ補正の計算を準備するために、強度値の列を１つの場所だけシフトする。

図１４は、強度値の累積和からの、光学機器の現在のｚ位置の計算を示す。図１４は、現在のｚ位置の計算を示し、この現在のｚ位置は、図１３Ｇを参照して論じた例におけるレジスタ１３０８内に置かれる。図１４において、各円柱シャフト位置における強度値は、黒丸１４０２のような黒丸で表される。強度値は垂直軸１４０４に対してプロットされ、円柱シャフト位置は水平軸１４０６に対してプロットされる。プロットされた黒丸は、図１３Ｇを参照して説明したように、並列加算した後のレジスタの列１３０４の内容に対応する。強度ピークが、特定の円柱シャフトに対応するロータ位置に常に入ることが好都合であるが、また、測定強度に誤差がないことが好都合であるが、これは、一般に当てはまらない。したがって、オートフォーカスモジュールのオートフォーカス処理部品は、理想化された強度曲線１４０８をプロットされた点に当てはめるために、多くの異なる曲線当てはめアルゴリズムのうちの１つを利用することができる。このとき、推定ｚ位置を、計算された曲線１４０８のピーク強度１４１２に対応するｚ位置１４１０として計算することができる。計算されたｚ位置は、図１４に示すように、オートフォーカスモジュールによって光強度が測定される回転角度に対応するｚ位置間に入ることができる。そのため、ロータ内のシャフトの数は、オートフォーカスモジュールによって走査されるｚ位置の範囲内で電気機械ステージが駆動され得る位置の数より少なくても、それと同じでも、それより多くてもよい。

図３のグラフ３２４を参照して上述したように、後方反射したオートフォーカス光の強度を解析することによって、対物レンズからカバースリップ界面までの距離を求めることで、オートフォーカス処理部品（図１２の１２１２）による、オートフォーカス光検出器が収集したデータを解析するための１つの基礎を得られるが、他の手法の可能性がある。１つの代替の手法では、後方散乱光の強度が最大であるｚ位置を求めるのではなく、オートフォーカスシステムは、光学システムのユーザによって又は、光学システムの自動プログラム制御が選択するｚ位置において較正動作を行い、較正動作において、ｚ位置走査が、選択されたｚ位置よりわずかに上及びわずかに下で実行される。走査の目的は、カバースリップ界面からの後方散乱光についてのガウス様強度曲線において、ガウス様曲線の急峻な側に対応するｚ位置及び対応するオートフォーカスロータ位置を識別することである。後方散乱オートフォーカス光強度の測定される変化が、カバースリップ界面に対する対物レンズのｚ位置の変化に最も敏感に依存するのは、ガウス曲線のこの位置である。その後、較正に続くデータ収集フェーズ中に、識別されたオートフォーカスロータ位置から測定される強度の変化が連続して監視され、それらの識別されたオートフォーカスロータ位置において較正段階強度を維持するようにｚ位置が制御される。そのため、オートフォーカス光検出器取得データを解析するこの代替の手法において、光学機器のｚ位置は、後方散乱オートフォーカス光が最も強いｚ位置に対する相対オフセットとして制御されるのではなく、代わりに、ｚ位置の変化に最も敏感なオートフォーカスロータ位置で測定される後方散乱光について較正段階確定強度を維持するように制御される。本発明のさらなる実施態様では、より複雑な曲線当てはめアルゴリズムを使用して、光学機器のｚ位置を所望の値に維持するために、測定された後方散乱オートフォーカス光強度を、経験的に確定された又は理論的な後方散乱オートフォーカス光対ｚ位置曲線に精密に当てはめてもよい。

別の実施態様では、平行光線ビームではなく、わずかに収束するか又はわずかに発散するオートフォーカス光ビームを生成するために、さらなる光学部品が、赤外オートフォーカス源３０２とビームスプリッタ３０８との間でオートフォーカスシステムに導入されるか又は、光学経路内に既に入っている光学部品が、調節又は修正される。わずかに収束又は発散するビームを光学系に入力することによって、オートフォーカス光は、最終的に試料内のある点に合焦しない。オートフォーカス光が試料内で精密に合焦されると、高強度のオートフォーカス光が、試料及び光学データ収集に有害な影響を及ぼす場合がある。例えば、赤外オートフォーカス光が使用されると、著しく合焦されたオートフォーカス光は、試料内の温度を高くして生細胞に損傷を与え又は試料の化学組成に温度誘発変化を与える場合がある。

別の具現化実施態様では、リング開口が、赤外オートフォーカス源３０２とビームスプリッタ３０８との間に配置されて、対物レンズによって急峻な角度で集束されることになる光線だけが、リング開口を通してカバースリップ界面に向かって伝えられる。後方反射光の割合は、このような急峻な角度の光線について最大になり、したがって、リング開口を利用して、後方反射の強度にほとんど寄与しない、急峻でない角度の光線をフィルタリング除外することによって、必要な後方反射オートフォーカス光強度を依然として維持しながら、試料への入射光の総量を低減することが可能である。図１５は、一般的なリング開口を示す。リング開口１５０２は、普通なら不透明又は半透明のディスク１５０６内に透明又は中空のリング１５０５を含む。さまざまな実施態様においてさまざまな異なるタイプのリング開口のいずれをも利用することができる。

光学機器ステージのｚ位置の変化及びドリフトを監視し検出された変化及びドリフトを補正するために、下記「オートフォーカスロータ要素」と称するオートフォーカスロータ内の窓又は開口に関連する、下記「オートフォーカス信号」と称する後方散乱オートフォーカス光強度信号を使用するための多くの異なる可能な方法がある。１つの単純な技法において、上述のように、最大オートフォーカス信号を生成するオートフォーカスロータ要素に対するオートフォーカス検出器のｚ_d距離が、光学機器の対物レンズとカバースリップ界面との間の距離の絶対値を計算するために使用される。しかしながら、上述のオートフォーカスモジュールにとってさらなる情報が利用可能である。以下の説明において、光学機器は、上述したタイプのオートフォーカスロータのうちの１つを使用するオートフォーカスモジュールを含むものと仮定する。単純にするために、オートフォーカスロータは、オートフォーカス光がオートフォーカスロータ要素を通じて後方散乱されると各々がオートフォーカス信号を生成する、離散数のオートフォーカスロータ要素を含む。

図１６は、単一要素のオートフォーカスロータを通じたｚ位置走査を示す。図１６にオートフォーカスロータ１６０２の挿入図によって示すように、走査は、特定のオートフォーカスロータ要素１６０４から生成されるオートフォーカス信号のみに関する。この走査は、例えば、オートフォーカスロータの回転数／秒単位の回転速度の逆数に等しい間隔で及び、特定のオートフォーカスロータ要素が検出器にオートフォーカス信号を伝送する固定フェーズで定期的にオートフォーカス信号を検出することによって達成することができる。図１６内の挿入図１６０６に示すように、ｚ走査は、ステージ１６１０をｚ位置「９」における焦点の上下のｚ位置の範囲を通して移動させることを含む、オートフォーカスロータ要素の最大信号ｚ_dを表す機器ｚ位置「９」１６０８あたりを中心とし、ｚ位置の単位は任意である。ｚ位置「９」において、機器対物レンズからカバースリップ界面までの距離は、ｚ_d及び機器ｚ位置「９」が上述の相互関係によって関連するようなものである。機器焦点はｚ位置「９」と一致してもよく又はより可能性が高いことには、ｚ位置「９」からずれていてもよい。上述の実施態様において、任意の機器ｚ位置において１つのオートフォーカスロータ要素のオートフォーカス信号が最大になり、ｚ位置をそのオートフォーカスロータ要素のｚ_dから計算することが可能である。

ｚ位置走査において検出されたオートフォーカス信号は、図１６の下部に示すプロット１６１２内に、ｚ位置に対してプロットされている。このプロットにおいて、垂直軸１６１４はオートフォーカス信号強度を表し、水平軸１６１６はｚ位置を表す。プロット１６１２内のプロット点によって示すように、最大オートフォーカス信号強度１６１８は光学機器ｚ位置「９」１６１８に現れ、このピークｚ位置の両側に対して下がっていく。データ点１６２２と１６２４との間の距離１６２０のような、２つの連続したデータ点間の水平距離は、走査に起因するサンプリング間隔中に発生するｚ位置の変化を表し、現在の例では、走査中のｚ位置の変化の割合は一定であり、オートフォーカスロータの回転速度は一定であると仮定している。特定のオートフォーカスロータ要素１６０４についてオートフォーカス信号が最大である位置にステージがあるとき、対物レンズとカバースリップ界面との間の距離ｚ₀は上述のように以下の等式で表される。

式中、ｚ_dはオートフォーカスロータ要素又はオートフォーカスロータ要素小弟からオートフォーカス検出器までの実効距離である。しかしながら、図１６に示すようなｚ位置走査中にサンプリングされたｚ位置の範囲にわたって、オートフォーカスロータ要素１６０４を通過して検出器に入るオートフォーカス信号の強度はｚ位置に関連し続ける。そのため、特定のオートフォーカス要素に関するオートフォーカス信号の強度は光学機器のｚ位置の関数であり、この関数は、図１６に示すｚ位置曲線に対応する。以下の説明において、任意の所与のオートフォーカスロータ要素に対するｚ位置走査が図１６に示す曲線と同様の曲線を生成するものと仮定する。

図１７は、１０要素オートフォーカスロータの１０個のオートフォーカスロータ要素に関するオートフォーカス信号強度対ｚ位置曲線を示す。オートフォーカスロータ要素ａ₁に対する「ａ₁」の符号を付した曲線１７０２のような、各特定のｚ位置曲線は、上述の相互関係によって光学機器ｚ位置１７０６に関連する、ｚ位置曲線１７０２上のピーク位置

のような、オートフォーカスロータ要素位置において最大強度を有する。各曲線のピークは他の曲線のピークからずれている。所望のｚ位置ｚ_iを中心とするある範囲のｚ位置にわたってｚ位置走査を行うことによって、図１７に示すもののような、重なり合ったｚ位置曲線のセットが生成される。特定の光学機器ｚ位置においてオートフォーカスロータの各要素が生成するオートフォーカス信号強度が、ｚ位置の多信号強度フィンガープリントを構成する。１つの方法例において、各曲線が異なるオートフォーカスロータ要素に対応するｚ位置曲線のセットは、データ収集する前に較正曲線のセットとして収集され、連続オートフォーカスモジュールは、各オートフォーカスロータ要素に対応するオートフォーカス信号強度を定期的にサンプリングして、最初に収集された較正曲線を使用して狭い範囲のｚ位置に一致することができるｚ位置フィンガープリントを生成する。

図１８は、ｚ位置曲線のセットを数値的に特性化するための１つの方法を示す。図１８は図１７に示すものと同じｚ位置曲線のセットを示す。図１７におけるような各曲線は、図１７の挿入図１７０１に示すような特定のオートフォーカスロータ要素に関連付けらている、符号ａ₁〜ａ₁₀の範囲から選択される符号を付してある。ｚ₁、ｚ₂、…ｚ₁₈の符号を付した１８個の等間隔に離間された位置の各々において、垂直破線１８０２のような垂直破線が、ｚ位置からそのｚ位置の上に重なるｚ位置曲線をすべてを通じて上向きに延在している。垂直破線１８０２が重なっているｚ位置曲線の各々と交差している点１８０４〜１８０８は、垂直破線１８０２が表すｚ位置ｚ₁において、それぞれオートフォーカスロータ要素ａ₁、ａ₂、ａ₃、ａ₄及びａ₅が生成したオートフォーカス信号強度を表す。これらの点のセットが、ｚ位置ｚ₁のオートフォーカスフィンガープリントを構成する。残りのｚ位置ｚ₂〜ｚ₁₈の各々は、図１８に示すような対応するフィンガープリントに関連付けられる。

図１８における符号を付したｚ位置の各々に対応するオートフォーカスフィンガープリントは、符号化してｚ位置フィンガープリントデータ構造にすることができる。図１９は、図１８に示すｚ位置のいくつかに対応するｚ位置フィンガープリントデータ構造を示す。図１９におけるｚ位置ｚ₁に対応するｚ位置フィンガープリントデータ構造１９０２のようなｚ位置フィンガープリントデータ構造の各々は、２つの列及び、オートフォーカスロータ要素の数に等しい数の行を有する行列である。第１の列は、オートフォーカス要素を、オートフォーカス信号が減少していく順序でリストしており、第２の列は、要素の対の間の信号強度の相対的な降下を示している。例えば、ｚ位置フィンガープリントデータ構造１９０２及び図１８の垂直破線１８０２に沿った点１８０４〜１８０８を考える。最高の強度を有する点１８０４は、オートフォーカスロータ要素ａ₁に対応するオートフォーカスロータ要素曲線と垂直線１８０２との交差点を表す。ｚ位置フィンガープリントデータ構造１９０２内の第１の列の上端にある数「１」１９０４は、ｚ位置ｚ₁における最高強度のオートフォーカス信号がオートフォーカスロータ要素ａ₁によって生成されることを意味する。第２の列の上端にある数０．４４１９０６は、点１８０４と点１８０５との間の強度の降下が、点１８０４とｚ軸との間の強度の降下の４４パーセントであることを示している。図１８において次に高い強度を有する点１８０５は、オートフォーカスロータ要素ａ₂に対応するｚ位置曲線とｚ位置ｚ₁に対応する垂直線１８０２のオートフォーカスロータ要素ａ₂との交差点を表す。したがって、ｚ位置フィンガープリントデータ構造１９０２内の数「２」１９０８は、オートフォーカスロータ要素ａ₂がｚ位置ｚ₁において２番目に高い強度のオートフォーカス信号を生成することを示している。第２の列の第２の位置にある数「０．３１」１９１０は、点１８０５と点１８０６との間の強度の降下が、点１８０４とｚ軸との間の強度の降下の３１パーセントであることを示している。図１８から分かるように、点１８０４〜１８０８は、強度が下がる順における、オートフォーカスロータ要素ａ₁、ａ₂、ａ₃、ａ₄及びａ₅のｚ位置曲線交差点に対応し、それゆえ、ｚ位置フィンガープリントデータ構造１９０２内の最初の５つのエントリは「１」、「２」、「３」、「４」及び「５」である。オートフォーカスロータ要素ａ₆〜ａ₁₀に対応する残りのｚ位置曲線は図１８に示すプロットのセット内のｚ位置ｚ₁には重なっておらず、それゆえ、これらの位置に関連付けられる強度降下数は、ｚ位置フィンガープリントデータ構造１９０２においては「０」である。

図１９においては、図１８内のｚ位置ｚ₁〜ｚ₁₄に対する最初の１４個のｚ位置フィンガープリントデータ構造が示されている。図１９と図１８を比較することによって分かるように、各ｚ位置フィンガープリントデータ構造の第１の列内の第１の要素は、ｚ位置フィンガープリントデータ構造の対応するｚ位置における最大強度を有するｚ位置曲線を示している。ｚ位置ｚ₃に対応するｚ位置フィンガープリントデータ構造１９２０のような、いくつかの場合において、最高強度点は、２つのｚ位置曲線の交差点を表し、それゆえ、第１の列内の最初の２つの要素は、対応するｚ位置における２つの等しく最高強度のｚ位置曲線を示している。以下の説明において、「ｚ位置フィンガープリントデータ構造」を短縮して「ｚプリント」とする。このように、ｚプリントは、強度が減少する順における、それを通して特定の機器ｚ位置において測定可能なオートフォーカス信号強度が、連続したオートフォーカスロータ要素間の相対強度降下の指示とともに観察されるオートフォーカスロータ要素のリストである。

図２０〜図２２は、ｚ位置走査によって収集されたｚプリントをいかに較正曲線として使用して、その後光学機器のｚ位置を求めることができるかを示す。引き続き図１７〜図１９の例によって、図１８及び図１９に示すｚ位置曲線及び対応するｚプリントがｚ位置走査において得られ、電子メモリ内に記憶されたものと仮定する。その後、機械ステージは図２０内の垂直線２００２に対応する機器ｚ位置に移動しており、この機器ｚ位置は、この垂直線とｚ軸との交差点にある点２００４である。しかしながら、図２０に示すｚ位置は分かっていないが、この点に対応するｚ位置フィンガープリント又はｚプリントをオートフォーカスモジュールによって取得することができるものと仮定する。図２０に示すｚ位置２００４に対応するｚプリント２１０２を図２１に示す。第１の段階において、このｚプリント２１０２を図１９に示すｚプリントのセットと比較する。実験によって確定したｚプリント２１０２内の値を図１９に示すｚプリント内の値と比較することによって、ｚプリント２１０２が、ｚ位置ｚ₇及びｚ₈に対応するｚプリント１９２２及び１９２３に最も近く類似していることが容易に判断される。これらの２つのｚプリントは図２１においてｚプリント２１０２の下に示されており、ｚプリント２１０２に対応するｚ位置を囲んでいる。そのため、図２１に示すように、実験によって確定したｚプリント２１０２と図１９に示すｚプリントのセット内のｚプリントとの類似度照合のみに基づいて、光学機器の現在の機器ｚ位置がｚ位置ｚ₇とｚ₈との間にあることが明らかである。類似度照合のみによって、現在の機器位置を、可能性のあるｚ位置の相対的に狭い範囲内に見つけることができる。

図２２に示すように、図２１に示すｚプリントに基づいて現在の光学機器ｚ位置のさらにより精度の高い決定を行うことができる。１つの手法において、実験によって確定したｚプリント２１０２におけるオートフォーカスロータ要素の順序付けは、プリント１９２２におけるオートフォーカスロータ要素の順序付けと異なっているが、ｚプリント１９２３におけるｚロータ要素の順序付けと同じであることが観察される。そのため、ｚ位置がｚ位置ｚ₇から位置ｚ₈へと連続的に増大するとき、ｚ位置曲線が交差すると、ｚ位置ｚ₇とｚ₈との間の間隔内のｚ位置の右にあるすべてのｚ位置がｚプリント２１０２及び１９２３のオートフォーカスロータ要素順を有することになるような点に達することになる。後述するタイプの線形補間を使用して、そのｚ位置は垂直線２２０１に対応する。

図１８及び図２０に示すように、ｚ位置曲線は直線でない。しかしながら、単純にするために、あるタイプの線形補間を使用して現在の光学機器ｚ位置を求めることができる。図２２において、ｚ位置曲線交差点からの絶対分数強度降下がｚプリント１９２２及び１９２３から計算され、図２２内の列２２０２及び２２０４にプロットされる。これらの絶対分数強度降下値はともに、機器ｚ位置及びその機器ｚ位置に対応するｚプリントの両方に対応する絶対強度降下ベクトルを含む。オートフォーカスロータ要素５に対応するｚ位置曲線はｚ位置ｚ₇に関するｚプリントにおいて最高のオートフォーカス信号強度を呈し、ｚ位置ｚ₈に関するｚプリントにおいてオートフォーカスロータ要素ａ₆に対応する曲線と最高位置を共有するため、オートフォーカスロータ要素５はそれぞれ２２０６及び２２０８の両方の列の上端に位置し、この点からｚ軸までの絶対強度降下はそれぞれ１．０、２２１０及び２２１２である。プロット内の残りの点は、残りのオートフォーカスロータ要素関連ｚ位置曲線からの絶対分数強度降下に対応する。ｚプリントにおける相対強度降下は低い精度までで計算されるため、わずかな数値の差異があり得る。例えば、点２２１４からの絶対分数強度降下は０．９５２２１６として示されており、これは、ｚプリント１９２２内の、一番下からオートフォーカスロータ要素ａ₄に対応するエントリまでのすべての相対強度の合計である。しかしながら、点２２１４からの絶対分数強度は、１．０からｚプリントｚ₇の第１の列の第１の要素に示す相対強度降下「０．０８」を減算するものとしても計算することができ、そのため０．９２となる。図２２に示す線形補間法において、そのようなわずかな数値の差異はほとんど又はまったく重要でない。

次に、２つの列の各々における特定のオートフォーカスロータ要素に対応する点が、ｚプリントｚ₇内のオートフォーカスロータ要素５に対応する点２２２２とｚプリントｚ₈内のオートフォーカスロータ要素５に対応する点２２２４とを相互接続する直線２２２０のような、図２２内の直線によって接続される。これらの線の傾斜が、実験によって観測されたｚプリント２１０２に基づく現在のｚ位置の線形補間の基礎を形成する。例えば、図２２内の線２２２６に対応する、オートフォーカスロータ要素３に関する補間を考える。ｚプリント２１０２の一番下からオートフォーカスロータ要素３に対応する相対強度降下０．１９までの、０．１９を含む相対強度のすべてを合計し、オートフォーカスロータ要素３の絶対強度降下０．４７を得る。０．６４−０．４７対０．６４−０．３７の比が、ｚ₇〜ｚ₈のｚ位置範囲にわたる強度の分数降下を表す。この比の値０．６３（図２２における２２２８）は、ｚプリント２１０２に関連付けられる現在の機器ｚ位置のｚ位置ｚ₇とｚ₈との間の距離の割合にも等しい。図２２において、各オートフォーカスロータ要素に関する補間によって得られるこれらの分数距離は、列２２０２及び２２０４内の線を接続する線上にある点として示されている。これらの分数ｚ位置を合計及び平均して、平均分数ｚ位置０．５８７２２３０を生成することができる。このように、比較的粗い線形補間法によって、ｚ₇＋０．５８７の現在の光学機器ｚ位置が得られる。これは、ｚ₇＋０．５４の実際のｚ位置（図２０内の２００４）から０．０５未満だけ異なっている。このように、実験によって観測されたｚプリントとｚ位置走査において得た較正ｚプリントのセットとの類似度比較を、線形補間とともに組み合わせることによって、現在の光学機器ｚ位置を比較的正確に求めることができる。

上述したｚプリントベースのｚ位置決定方法及び、この決定に基づく機器ｚ位置の補正を、以降、「粗調整」と称する。粗調整又は相対強度法は、一例のオートフォーカスモジュールにおいて、ｚ位置にかなり大きいドリフト又は擾乱が観測されるときに光学機器のｚ位置を調整するために使用される。粗調整方法には多くの可能な変形形態がある。上述のような線形補間を利用するのではなく、精度をより大きくするために、ｚ位置曲線のパラメータ化表現に基づくより複雑なタイプの補間を利用することができる。代替的に、粗調整方法は、データベース内のｚプリントとの類似度照合及び、オートフォーカスロータ要素関連ｚ位置曲線の観測された順序付けが観測されたｚプリントに一致するｚ位置範囲の推定のみに基づいてもよい。類似度照合は、ｚプリント内のオートフォーカスロータ要素の順序付けのみを考慮してもよく又は、付加的に、相対強度降下を考慮してもよい。

図２３は、第２のｚ位置決定方法のための基礎を示す。図２３は、特定のオートフォーカスロータ要素に対応するｚ位置曲線のプロットを示す。曲線には、曲線の急峻な傾斜及びまた曲線のほぼ線形の区画を表す、破線で囲まれた２つの部分２３０２及び２３０４がある。光学機器ｚ位置を求めるためにこの曲線を使用するとすれば、その位置は、曲線のこれらの最も急峻なほぼ線形の部分２３０２及び２３０４内のデータ点から最も正確に求められ得る。曲線の急峻さは、ｚ位置変化に関する信号応答の大きさに比例する。信号応答が大きくなるほど、ｚ位置変化をより正確に求めることができる。

図２３は、特定のオートフォーカスロータ要素に関して観測されるオートフォーカス信号に基づく現在の光学機器ｚ位置の求め方の一例を示す。点ｚ₁２３０６、ｚ₂２３０７、ｚ₃２３０８及びｚ₄２３０９のオートフォーカス信号が、それぞれｓ₁２３１０、ｓ₂２３１１、ｓ₃２３１２及びｓ₄２３１３として既定されているものと仮定する。観測されるオートフォーカス信号強度ｓ₁、ｓ₂、ｓ₃及びｓ₄は較正段階中に求められ、記録され得る。続いて、オートフォーカス信号強度ｓ_u２３１４が観測されるものと仮定する。観測されるオートフォーカス信号強度ｓ_uは、２つの点２３１６及び２３１７においてｚ位置曲線と交差する。図２３において両方ともｚ_uの符号を付したこれらの２つの点２３１８及び２３１９のｚ位置座標は、現在観測されているオートフォーカス信号強度ｓ_u並びに所定のｚ位置ｚ₁〜ｚ₄及び信号強度ｓ₁〜ｓ₄に基づく２つの可能性のある現在の光学機器ｚ位置に対応する。２つのｚ位置２３１８及び２３１９を計算するのに使用される線形補間計算は、図２３内の挿入図２３２０及び２３２１として示されている。これは、図２２に示す粗調整方法において使用するものと同じ線形補間法である。

上述のように、ｚ位置走査中に各オートフォーカスロータ要素についてｚ位置曲線を得ることができる。図２４は、ｚ位置走査中に取得されたオートフォーカスロータ要素ａ₁〜ａ₁₀に関するｚ位置曲線群を示す図である。図２４においてこれらの曲線の急峻でほぼ線形の部分が太線になっており、ｚ軸の下の双頭矢印で示されている水平線分に投影されている。例えば、オートフォーカスロータ要素ａ₂に関するｚ位置曲線の急峻な線形部分２４０２はｚ軸の下のｚ位置範囲２４０４に投影されている。図２４から分かるように、ｚ位置範囲のこれらの投影は一般的に互いに重なり合っており、それによって、ｚ位置曲線群の下にあるほとんどのｚ位置について、対応するオートフォーカスロータ要素関連オートフォーカス信号強度に基づいて現在の光学機器ｚ位置を推定するのに使用することができる、ｚ位置曲線の複数の急峻な線形部分に対応する複数のｚ位置範囲がある。

この例において、精細なオートフォーカス調整に使用され、ベクトルフォーカス方法と称される、オートフォーカスモジュールに組み込まれる１つのｚ位置決定方法において、各々が異なるオートフォーカスロータ要素に対応するオートフォーカス信号強度のベクトルが較正サイクルにおいて計算及び記憶され、続いて、光学機器ｚ位置を所望のｚ位置ｚ_iに置くために光学機器を調整することができる量であるΔｚを求めるために、現在の光学機器ｚ位置を比較的高い精度で求めるのに使用される。

図２５は、ベクトルベースのオートフォーカスｚ位置調整方法を示す。基本的に、重なり合っているｚ位置曲線の急峻なほぼ線形の部分から投影される複数のｚ位置範囲の各々について、ｚ位置範囲の終端部におけるオートフォーカス信号強度が観測され、記録され、それぞれベクトルＳ₁２５０２及びＳ₂２５０４に記憶される。各オートフォーカスロータ要素に関するオートフォーカス信号強度は、特定の関心点について観測され、記録され、ベクトルＳ_i２５０６に記憶される。Ｓ₂２５０８からＳ₁を減算することによってベクトルＣが得られる。続いて、任意の所与の光学機器ｚ位置において、各オートフォーカスロータ要素に対応するオートフォーカス信号強度が観測され、ベクトルＳ_s２５１０として記録される。なお、ベクトルＳ₁、Ｓ₂、Ｓ_i及びＳ_sの各々において、オートフォーカス信号強度は対応するオートフォーカスロータ要素の数字インデックスに関して順序付けされる。その後、光学機器のｚ位置を所望のｚ位置ｚ_iに戻すために光学機器ステージを移動することができる量であるΔｚを以下のように計算することができる。

式中、表記〈Ｃ，Ｃ〉は、ベクトルＣのしれ自体とのドット積又は内積を指し、表記〈Ｓ_i−Ｓ_s，Ｃ〉は、ベクトルＳ_i−Ｓ_sのベクトルＣとのドット積を指す。

図２６は、図２３〜図２５を参照して説明したベクトルベースのオートフォーカス方法を使用した、３要素ベクトルに基づくｚ位置調整Δｚの計算を示す。図２６において、３つのｚ位置曲線２６０１、２６０２及び２６０３の線形部分がプロットされている。垂直軸２６０４は信号強度を表し、水平軸２６０６はｚ位置を表す。所望のｚ位置ｚ_i２６０８が垂直破線２６１０によって表されており、点２６１１〜２６１３においてｚ位置曲線の３つの線形部分と交差している。これらの３つの点、並びに、ｚ位置曲線の線形部分とそれぞれｚ位置ｚ₁、ｚ₂を表す垂直線２６１６及び２６１８ｚ位置曲線との交差点の座標が、図２５を参照して上述した５つのベクトルＳ₁、Ｓ_i、Ｓ₂、Ｓ_C及びＳ_S２６２０を構築するのに使用される。ここで、光学機器が垂直線２６２２が表すｚ位置ｚ_Sにおいて位置決めされると仮定する。上記のベクトル表現を使用して、光学機器のｚ位置が再びｚ_iになるように光学機器のステージを移動させることができる量であるΔｚを計算することができる。最初に、ベクトルＳ_i−Ｓ_S２６２４がベクトル減算によって計算される。次に、このベクトルとベクトルＣとの、並びに、ベクトルＣとそれ自体との内積又はドット積が図２６に示すように計算される。最後に、ｚ位置ｚ₂及びｚ₁並びに内積の比２６３０を使用してΔｚが計算される。

図２３〜図２６を参照して上述したベクトルフォーカス方法は、一般的に使用される記憶データがより少なく、対象のｚ位置ｚ_iについてのデータに加えて、ｚ位置曲線の急峻な線形部分に対応する各ｚ位置範囲の終端部におけるオートフォーカス信号強度及び、ｚ位置範囲端点のｚ位置しか必要としない。さらに、ベクトルフォーカス方法が適用可能であるとき、これは一般的に、前述の粗調整方法よりも正確な位置決めを提供する。これは、ｚ位置曲線の最も敏感な部分しかｚ位置決定に大きく寄与しないという事実に起因し、線形補間法は曲線のほぼ線形の部分に適用されるときに最良に機能するためである。しかしながら、さらに後述するように、ベクトルフォーカス方法は、それに関して続いてデータ収集フェーズ中にデータが収集される、各関心点ｚ_iに対する粗いｚ位置走査を通じて得られるさまざまなベクトルを記憶することを伴う。対照的に、粗調整方法は、関心点付近にある、それについてｚ位置が得られる点を粗調整方法に使用することができるため、機器ｘ，ｙ平面における格子状点配列から観測されるデータから計算されるｚプリントのセットを利用することができる。粗調整方法は、試料内の反射の変化、照明現強度の変化又は他のそのような変化による影響がはるかに少なく、それゆえ、ｚプリント較正セットを収集する必要がある頻度は少ないものであり得、さまざまなデータ収集体制により一般的に適用することができる。

内積〈Ｓ_i−Ｓ_S，Ｃ〉は較正曲線の急峻さに従って自然と項を重み付けするため、ベクトルフォーカス方法は、ｚ位置曲線の急峻な線形部分に対応するオートフォーカス信号強度を選択するだけではなく、関心点ｚ_iの周囲のすべての可能なオートフォーカス信号強度に適用することができる。しかしながら、多くの例において、未加工のｚ走査データは各関心点ｚ_iに関する関連するｚ位置曲線の合理的に急峻な線形区画のみを選択するように処理される。

なお、図１７〜図１８、図２０及び図２４に示すｚ位置曲線のセットは理想化されている。実際には、ｚ位置曲線は均一に離間されておらず、均一な外形を呈するものではない。図２７は、光学機器の実際のオートフォーカスモジュールから得られるオートフォーカスロータ要素に対応する試料ｚ位置曲線を示す。しかしながら、上述の方法は、曲線の間隔の均一性又は均一な外形を有する曲線には依存しない。方法は一般的なものであり、図２７に示すもののような実際のｚ位置曲線のセットに完全に適用可能である。

オートフォーカスモジュールは、上述の粗フォーカス方法及びベクトルフォーカス方法のいずれか又は両方を使用するために実装することができる。以下において、制御フロー図を使用して一例のオートフォーカスモジュール実施態様を説明する。このオートフォーカスモジュール実施態様は、オートフォーカス監視データ収集の間に、相対的に大きいｚ位置調整に取り組むときには粗調整方法を組み込み、より小さい、より漸進的なｚ位置調整にはベクトルフォーカス方法が使用される。

図２８は、三次元光学機器試料位置空間内のいくつかの選択点に対してｚ位置走査が行われる、粗調整方法初期化を示す。段階２８０２において、光学機器三次元位置空間内の選択点の較正ｚ位置走査を通して得られるｚプリントを後に記憶するために１つ以上の電子メモリが初期化される。次に、段階２８０４〜２８０７のｆｏｒループにおいて、各選択点に対して較正ｚ位置走査が実行される。段階２８０５において、いくつかの機器ｚ位置の各々における異なるオートフォーカスロータ要素関連ｚ位置曲線に対応するｚプリントに関するデータを収集するために、ある範囲のｚ位置を通して光学機器のステージが駆動される。次に、段階２８０６において、方法は、ｚ位置走査に基づいてｚプリントを計算し、選択点に関連付けられるｚプリントをメモリ、データベース又は何らかの他の形態の電子記憶装置内に記憶する。

図２９は、ベクトルベースのオートフォーカス方法の初期化の制御フロー図を提供する。段階２９０２において、以下の較正走査中に関心点のベクトルデータを受信するために電子メモリ及び／又は他のタイプの電子データ記憶装置が初期化される。段階２９０４〜２９０９のｆｏｒループにおいて、後にベクトルフォーカスｚ位置調整に使用される各関心点のベクトルのセットが、三次元光学機器位置空間内の各関心点（ｘ_i，ｙ_i，ｚ_i）を中心とする粗い３点ｚ位置走査から計算される。段階２９０６において、光学機器ステージが３つのｚ位置ｚ₁、ｚ_i及びｚ₂に対して駆動され、これらの位置において各オートフォーカスロータ要素についてオートフォーカス信号強度が求められる。段階２９０６及び２９０７の内部ループは、３つのｚ位置ｚ₁、ｚ_i及びｚ₂にわたって反復される。代替的な例では、より正確なｚ位置決定を促進するためのさらなるデータ収集にｚ位置のさらなる較正を使用してもよい。ｚ位置のすべてからデータが収集された後、ベクトルＳ₁、Ｓ₂、Ｓ_i及びＣが計算され、段階２９０８において関心点（ｘ_i，ｙ_i，ｚ_i）に関連する内積〈Ｃ，Ｃ〉、ｚ₁及びｚ₂とともに記憶される。

上述の粗調整初期化及びベクトルフォーカス初期化は、それゆえ、粗フォーカス初期化の場合は選択点における相対的に精度が高いｚ位置走査を含み、ベクトルフォーカス初期化の場合は相対的に精度が低いｚ位置走査を含む。図３０は、較正走査のセットを示す。図３０において、矩形体積３００２は、その中でいくつかの関心点からデータが収集されることになる光学機器三次元位置空間内の体積を表す。粗調整初期化のために、図３０において破線矢印３００４のような、相対的に長い垂直破線矢印が表す、格子の点におけるいくつかの精度が高く相対的に広範なｚ位置走査が行われる。上述のように、粗調整較正データは関心点特有のものではなく、代わりに、三次元位置空間のｘ，ｙ平面内の領域にわたる周期的に離間したパターンの点から収集することができる。粗調整関連較正走査のために選択される近傍点から得られるｚプリントを使用して任意の特定の点（ｘ_i，ｙ_i，ｚ_i）に対して粗調整を実行することができる。対照的に、後にデータ収集フェーズ中にそこにデータが収集されることが意図されている関心点を表す、点３０６のようないくつかの点が、三次元光学機器位置空間の体積内に示されている。これらの点の各々において、ベクトルフォーカス方法を実行するのに必要な、精度が低く狭い３点ｚ位置走査が較正段階において実行される。図３０において、これらの相対的に精度が低く狭いｚ位置走査は、関心点３００６に対して垂直方向に中心を置かれている短い矢印３００８のような、関心点を中心とする短い矢印によって表されている。データ収集フェーズ中、データは関心点の１つ以上から収集することができる。データ収集中、光学機器ｚ位置を関心点のｚ位置に維持するための光学機器ｚ位置の相対的に精細な調整に、ベクトルフォーカス方法が利用される。光学機器のｚ位置がドリフトするか又は大きく動揺し、それによってベクトルフォーカス方法を正確に適用することができない場合において、粗調整初期化中にｚプリントセットが収集されている近傍点が、光学機器ｚ位置の粗調整に選択及び使用され、その後、ベクトルフォーカス方法を使用して光学機器をより正確に位置決めすることができる。

図３１は、光学機器のオートフォーカスモジュールに組み込まれる連続オートフォーカス方法の制御フロー図を提供する。段階３１０２において、連続オートフォーカス方法を使用して入力される関心点のセットに対してベクトルフォーカス初期化が実行される。段階３１０４において、関心点のすべてを包含する光学機器三次元位置空間のｘ，ｙ領域が決定される。その後、段階３１０６において、段階３１０４において決定されたｘ，ｙ領域全体を通じて周期的に離間されたロケーションにおいてｚプリントを準備するために粗調整初期化が実行される。段階３１０６の完了時に、連続オートフォーカス方法は、後続のデータ収集フェーズ中に関心点からデータ収集する間に光学機器の焦点を維持するのに十分な較正データを収集し終わっている。次に、段階３１０８〜３１１１を含むｗｈｉｌｅループ内で、段階３１１０において、データ収集中に焦点を維持するために光学機器のｚ位置を調整するために、連続オートフォーカス方法はルーチン「オートフォーカス」を連続して呼び出す。周期的なオートフォーカス実施態様を実装するために、ｗｈｉｌｅループに待機段階３１０９が導入される。言い換えれば、オートフォーカスモジュールは、離散的な時間間隔をおいてｚ位置を補正する。連続オートフォーカス方法の代替的な例において、オートフォーカスルーチンは待機段階なしに連続して呼び出されてもよい。

図３２は、図３１の段階３１１０において呼び出されるオートフォーカスルーチンの制御フロー図を提供する。段階３２０２において、ローカル変数「セカンドパス（ｓｅｃｏｎｄＰａｓｓ）」がＦＡＬＳＥにセットされる。段階３２０４において、データが収集されている対象の現在位置に関するベクトルフォーカスベクトルデータが、その位置のｚ₁、ｚ₂及び〈Ｃ，Ｃ〉値とともにメモリから取り出される。その後、段階３２０６において、図２５及び図２６を参照して上述したように、ベクトルフォーカス方法によってΔｚが計算される。条件付き段階３２０８において、ルーチン「オートフォーカス」が、ローカル変数「セカンドパス」が現在ＴＲＵＥであるか否かを判定する。この段階を最初に実行するとき、ローカル変数「セカンドパス」はＦＡＬＳＥであり、そのため、制御は段階３２１０へと流れ、ルーチン「オートフォーカス」が、計算されたΔｚの大きさが閾値未満であるか否かを判定する。計算されたΔｚの大きさが閾値未満であるとき、これは段階３２０４及び３２０６において実行されたベクトルフォーカス方法が成功したことを意味するが、制御は段階３２１２へと流れ、光学機器の焦点を調整するために、オートフォーカスルーチンが計算されただけステージを駆動する。しかしながら、段階３２１０において判定されるように、Δｚの大きさが閾値未満でない場合、段階３２１４において、ルーチン「粗調整（ｃｏｕｒｓｅａｄｊｕｓｔ）」が呼び出されて粗調整方法が実行され、その後、段階３２１６においてローカル変数「セカンドパス」がＴＲＵＥにセットされ、そのと、制御は段階３２０４に戻って流れ、別の精細なベクトルフォーカス方法が実行される。最初に計算されたΔｚが有効であるか否かを判定するために、上述の閾値テストの代わりに又はそれに加えて、他のタイプのテストが使用されてもよい。

図３３は、図３２の段階３２１４において呼び出されるルーチン「粗調整」の制御フロー図を提供する。段階３３０２において、ｚプリントが利用可能である現在の関心点に最も近い点についての記憶されているｚプリントがメモリからアクセスされ、段階３３０４において、図３２に示すオートフォーカスルーチンの段階３２０４において得たベクトルＳ_sにおける現在のオートフォーカス信号強度が、対応する現在のｚプリント及び絶対強度降下ベクトルＺ_sを生成するために変換される。その後、ステップ３３０６において、現在のｚプリントに最も近いｚプリントが、段階３３０４において得た、取り出されたｚプリントの中から選択され、それから絶対強度降下ベクトルＺ_cが準備される。段階３３０８において判定されるように、理に適った候補最近ｚプリントが見つかると、制御は段階３３１２へと流れる。しかしながら、適切な最近ｚプリントを見つけることができないとき、段階３３１０においてエラー処理ルーチンが呼び出される。エラー処理ルーチンは、光学機器のマニュアルフォーカスを執行するためにデータ収集を停止することができ又は、光学機器の焦点を、現在説明しているｚ位置調整方法を利用することができるｚ位置範囲内にもっていくことが可能である他のタイプのフォーカス技法を利用することができる。現在の実施態様においてエラーハンドラに対する１回のみの呼び出しが示されているが、エラーはオートフォーカスルーチンの他の段階において発生して、現在のデータ収集フェーズの改善又は停止を必要とする場合がある。段階３３０６において理に適った最も近いｚプリントが見つかると、Ｚ_s及びＺ_cの内積とＺ_c及びそれ自体の内積との比に等しい値ｘが段階３３１２において計算される。段階３３１４において判定されるように、ｘが閾値よりも大きい場合、現在の危機位置が最も近いｚプリントに対応するｚ位置であると仮定され、段階３３１６において、最も近いｚプリントのみに基づいてΔｚを計算することが可能になる。その後、段階３３１８において、ルーチン「粗調整」がステージをｚ方向にΔｚだけ移動させる。ｘが閾値よりも大きくないとき、段階３３２０において、２つのｚプリントに基づいてΔｚを計算するためにルーチン「２ベクトル調整」が呼び出される。

図３４は、ルーチン「２ベクトル調整」の制御フロー図を提供する。段階３４０２及び３４０４において、図２１に示す、図２１を参照して説明したような、１番近いｚプリントとともに現在の機器ｚ位置を囲む２番目の記憶されているｚプリントが識別される。２番目に近いプリントから絶対強度降下ベクトルＺ_dが準備され、最も近いｚプリントの絶対強度ベクトルがｚ位置において順序付けされてＺ₁及びＺ₂として参照され、Ｚ₁はＺ₂に対応するｚ位置よりも小さいｚ位置に対応する。段階３４０６において、中間結果ベクトルＺ”がベクトルＺ_S−Ｚ₁をベクトルＺ₂−Ｚ₁で要素ごとに除算することによって計算される。段階３４０８において、ベクトルＺ”の要素が加算され、要素の数で除算されて平均値ｚ’が生成される。最後に、段階３４１０において、図２２を参照して上述したように、ｚ’−ｚ_iに加算したＺ₁に対応するｚ位置としてΔｚが計算される。段階３４０４、３４０６、３４０８及び３４１０はともに、図２２を参照して説明した線形補間法を実行する。

本発明を特定の実施形態に関して説明したが、本発明がこれらの実施形態に限定されることは意図されていない。変更形態が当業者には明らかである。例えば、上述のように、さまざまな異なるタイプの機械ロータのいずれをも、対物レンズのカバースリップに対する現在のｚ位置を求めるためにカバースリップ界面からの後方散乱オートフォーカス光のピーク強度を見つけるために、光軸方向においてｚ位置走査を実行するために使用することができる。プラグラミング言語、モジュール構造、制御構造、データ構造及び他のパラメータを含む、多くの設計及び実装パラメータのいずれかを変更することによって、オートフォーカスシステムの光検出器から収集される強度データからｚ位置を連続的に計算するために、論理回路又はソフトウェア制御式プロセッサから、さまざまな異なるタイプのオートフォーカス処理サブコンポーネントを実装することができる。

上記の記載は、説明を目的として特定の用語を使用した。しかしながら、本発明を実践するためにこれらの特定の詳細は必要ないことが当業者には明らかであろう。特定の実施形態の上記の記載は、例示及び説明の目的で提示されている。それらは排他的であることも、本発明を開示された正確な形態に限定することも意図されてはいない。上記の教示を考慮して多くの改変及び変更が可能である。実施形態は本発明の原理及びその実際の適用を最良に説明するために、それによって、当業者が、本発明及びさまざまな実施形態を、予期される特定の使用に適するようにさまざまな改変を加えて最良に利用することができるように、図示及び説明されている。本発明の範囲は以下の特許請求の範囲及びそれらの均等物によって画定されることが意図されている。

１０２励起光源
１０４多色ミラー
１０６励起光
１０８対物レンズ
１１０試料点
１１２カバースリップ
１１４機械ステージプラットフォーム
１１６開口
１１８チューブレンズ
１２０光検出器
１２２ダイクロイックミラー
１２４ステージ駆動部品
１２６ｘ並進機構
１２８ｙ並進機構
１３０ｚ並進機構
１３２画像点
１４２距離
１４４焦点
２０２点線
２０６実線曲線
３０２赤外オートフォーカス源
３０４赤外光
３０８ビームスプリッタ
３１０カバースリップ界面
３２０オートフォーカス検出器モジュール
３２２ｚ位置
３２４強度対ｚ位置プロット
３２６ｚ位置
３２８ピーク
７０２内部カバースリップ界面
７０６対物レンズ
７１０検出器
７１４合焦レンズ
８１２円形開口
８１４円形断面
８１６円形断面
８２８ピーク
９０２ピンホール開口ロータ
９０４合焦レンズ
９０６光検出器
９１４垂直円柱シャフト
９１７垂直シャフト
９１８垂直円柱シャフト
９２０不透明ディスク
９２２中心ピンホール開口
９２６物理的インデックス
９４０垂直円柱シャフト
９６０水平軸
９６２黒丸
９６４左手垂直ｚ位置軸
９６６白丸
９６８右手垂直強度軸
９７４ピーク
９７６回転角度
１００２経路延長ロータ
１００４窓
１００６円柱垂直シャフト
１０１０合焦レンズ
１０１２ピンホール開口
１０１４光検出器
１０２０入力合焦ビーム
１０２２焦点
１０２４焦点
１０２６距離
１０２８高さ
１１０２スロット
１１０４ロータ
１１０６螺旋スリット開口
１１０８最大ｚ位置
１１１０最小ｚ位置
１２０２合焦レンズ
１２０４オートフォーカスロータ
１２０６電気モータ
１２０８ロータインデックス検出器
１２１０光検出器
１２１２オートフォーカス処理部品
１３０２アレイ
１３０４アレイ
１３０６アレイ
１３０８レジスタ
１３０９レジスタ
１３１０レジスタ
１３１２光検出器入力
１３１４ロータインデックス検出器入力
１３２０第１のレジスタ
１３２４第１の列
１３２６列
１３２８最終列
１４０２黒丸
１４０４垂直軸
１４０６水平軸
１４０８強度曲線
１４１０ｚ位置
１４１２ピーク強度
１５０２リング開口
１５０５リング
１５０６ディスク
１６０２オートフォーカスロータ
１６０４オートフォーカスロータ要素
１６０６挿入図
１６１０ステージ
１６１２プロット
１６１４垂直軸
１６１６水平軸
１６１８最大オートフォーカス信号強度
１６２０距離
１６２２データ点
１７０１挿入図
１７０２ｚ位置曲線
１７０６光学機器ｚ位置
１８０２垂直線
１８０２垂直破線
１９０２ｚ位置フィンガープリントデータ構造
１９２０ｚ位置フィンガープリントデータ構造
１９２２ｚプリント
１９２３ｚプリント
２００２垂直線
２００４ｚ位置
２１０２ｚプリント
２２０１垂直線
２２０２列
２３０２部分
２３１８ｚ位置
２３２０挿入図
２４０２線形部分
２４０４ｚ位置範囲
２６０１ｚ位置曲線
２６０４垂直軸
２６０６水平軸
２６１０垂直破線
２６１６垂直線
２６２２垂直線
２６３０比
３００２矩形体積
３００４破線矢印
３００６関心点
３００８矢印

Claims

光学機器に内蔵されるオートフォーカスサブシステムであって、当該オートフォーカスサブシステムが、
（ａ）オートフォーカス光路であって、そのオートフォーカス光路を通して光学機器の光学界面から後方散乱した電磁放射をオートフォーカスサブシステムが受け取るオートフォーカス光路と、
（ｂ）２以上のオートフォーカスロータ要素を含むオートフォーカスロータであって、オートフォーカスロータがオートフォーカス光路と整列しているときは、後方散乱電磁放射が、オートフォーカスロータ要素の各々を通して、対応するオートフォーカス信号を生成するオートフォーカス検出器に伝わる、オートフォーカスロータと、
（ｃ）電子メモリ及び処理部品を含むオートフォーカス処理部品であって、光学機器光軸に垂直な座標軸ｘ及びｙ並びに光学機器光軸に沿った座標軸ｚを有する光学機器位置空間における１以上の機器部品の位置を制御し、光学機器位置に関して特定のオートフォーカスロータ要素に関連付けられるオートフォーカス信号の大きさを各々表す２以上の較正曲線を取得してメモリに記憶し、データ収集中に２以上の較正曲線を使用して光軸位置を監視及び調整する、オートフォーカス処理部品と
を含むオートフォーカスサブシステム。
前記オートフォーカスサブシステムが、オートフォーカス初期化フェーズにおいてデータ収集前に光学機器較正を実行し、その間、２以上のオートフォーカスロータ要素の各々に関するある範囲の光学機器ｚ位置を通した走査中にオートフォーカス信号強度データを収集することによって前記２以上の較正曲線が取得され、各オートフォーカスロータ要素は特徴的な光学機器ｚ位置において最も大きいオートフォーカス信号強度を生成する、請求項１記載のオートフォーカスサブシステム。
前記較正曲線が、ある範囲の光学機器ｚ位置にわたって取得され、較正曲線に対応するオートフォーカスロータ要素に関する光学機器ｚ位置の範囲内の２以上の光学機器ｚ位置の各々における相対的なオートフォーカス信号の大きさを求めるために使用され、光学機器ｚ位置の範囲内の２以上の光学機器ｚ位置の各々における相対的なオートフォーカス信号の大きさが、光学機器ｚ位置に各々関連付けられるオートフォーカス信号フィンガープリントを表す、請求項２記載のオートフォーカスサブシステム。
データ収集中、前記オートフォーカスサブシステムが、２以上のオートフォーカスロータ要素に関するオートフォーカス信号強度を取得し、取得したオートフォーカス信号強度から現在のオートフォーカス信号フィンガープリントを構築し、現在の光学機器ｚ位置を、（ｉ）現在のオートフォーカス信号フィンガープリントに対する最大算出類似度を有する、記憶オートフォーカス信号フィンガープリントに関連付けられる光学機器ｚ位置、及び（ｉｉ）現在のオートフォーカス信号フィンガープリントに対する２つの最大算出類似度を有する、２つの記憶オートフォーカス信号フィンガープリントに関連付けられる光学機器ｚ位置から補間された値のうちの一方として求められる、請求項３記載のオートフォーカスサブシステム。
前記オートフォーカスサブシステムが、第１のオートフォーカス信号フィンガープリントと第２のオートフォーカス信号フィンガープリントとの間の類似度を、２つのオートフォーカス信号フィンガープリントの間でオートフォーカス信号の大きさ及び関連するオートフォーカスロータ要素の相対順序を比較することによって計算し、同じ相対順序のオートフォーカス信号の大きさ及び関連するオートフォーカスロータ要素を有する２つのオートフォーカス信号フィンガープリントに、異なる相対順序のオートフォーカス信号の大きさ及び関連するオートフォーカスロータ要素を有する２つのオートフォーカス信号フィンガープリントよりも大きい類似度を割り当てられる、請求項４記載のオートフォーカスサブシステム。
各較正曲線が、対象のｚ位置を含む３以上の光学機器ｚ位置で得られたオートフォーカスロータ要素に関するオートフォーカス信号強度を含み、後にデータが収集される光学機器位置空間内の各関心点について２以上の較正曲線が取得される、請求項２記載のオートフォーカスサブシステム。
データ収集中、前記オートフォーカスサブシステムが、現在の光学機器ｚ位置における２以上のオートフォーカスロータ要素に関するオートフォーカス信号強度を取得し、該取得したオートフォーカス信号強度及び記憶されている較正曲線から光学機器ｚ位置を補間する、請求項６記載のオートフォーカスサブシステム。
前記オートフォーカスサブシステムが、光学機器較正に続いて光学機器位置空間内の関心点においてデータ収集を実行し、較正曲線及び２以上のオートフォーカスロータ要素に関して現在測定されているオートフォーカス信号強度を同時に使用して現在の光学機器位置と関心点との間の有向距離を求め、光学機器を関心点に合焦するために有向距離によって光学機器位置を調整する、請求項２記載のオートフォーカスサブシステム。
光学機器内のオートフォーカスサブシステムによって関心点におけるデータ収集中に光学機器の位置を調整するための方法であって、
データ収集前に、光学機器位置に関して特定のオートフォーカスロータ要素を通じて検出されるオートフォーカス信号の大きさを各々表す２以上の較正曲線を取得するステップと、
２以上の較正曲線に関するデータを電子メモリ内に記憶するステップと、
データ収集中、２以上のオートフォーカスロータ要素を通して現在のオートフォーカス信号の大きさを求めするステップと、
２以上のオートフォーカスロータ要素に関連付けられる２以上の求められた現在のオートフォーカス信号の大きさ、及びメモリ内に記憶された２以上の較正曲線に関するデータを使用して現在の光学機器位置及び関心点からの有向距離を求めるステップと、
求められた有向距離によって光学機器位置を調整するステップと
を含む方法。
前記オートフォーカスサブシステムが、
（ａ）オートフォーカス光路であって、そのオートフォーカス光路を通して光学機器の光学界面から後方散乱した電磁放射をオートフォーカスサブシステムが受け取るオートフォーカス光路と、
（ｂ）２以上のオートフォーカスロータ要素を含むオートフォーカスロータであって、後方散乱電磁放射が、オートフォーカスロータ要素の各々を通して、対応するオートフォーカス信号を生成するオートフォーカス検出器に合焦される、オートフォーカスロータと、
（ｃ）電子メモリ及び処理部品を含むオートフォーカス処理部品であって、光学機器光軸に垂直な座標軸ｘ及びｙ並びに光学機器光軸に沿った座標軸ｚを有する光学機器位置空間における１以上の機器部品の位置を制御し、データ収集前に２以上の較正曲線を取得し、データ収集中に、得られた２以上の較正曲線を使用して光軸位置を監視及び調整する、オートフォーカス処理部品と
を含む、請求項９記載の方法。